Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимераз в реконструированных ансамблях белков и в экстрактах клеток и ядер тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК-ПОЛИМЕР АЗ В РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ АНСАМБЛЯХ БЕЛКОВ И В ЭКСТРАКТАХ

КЛЕТОК И ЯДЕР

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 2003 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН)

Научные руководители: д. х. н., профессор Лаврик Ольга Ивановна

к. х. н. Речкунова Надежда Ивановна

Официальные оппоненты: к.х.н. Бунева Валентина Николаевна

д.х.н., профессор Малыгин Эрнст Георгиевич

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии

им. А.Н. Белозерского (МГУ)

Защита состоится " 5 " ноября_2003 г. в 10°°_часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск - 90, просп. Лаврентьева 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан Л " ОМ 003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета д. х. н.

. Федорова О. С.

'яьгг

< ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейшим направлением биохимии и молекулярной биологии является изучение ансамблей белков, а не только их отдельно взятых компонентов. В последнее время появилось представление о протеомах, обеспечивающих жизненно важные функции клеток и целых организмов, и возникло специальное направление их исследования. Например, протеомными ансамблями являются комплексы белков, обеспечивающие репликацию и репарацию ДНК. Центральную' роль в осуществлении обоих процессов играют матричные ферменты - ' ДНК-полимеразы, взаимодействующие с множеством других ферментов и факторов. В клетках высших эукариот основную роль в репликации и репарации ДНК играют ДНК-полимеразы а, 8, е и ДНК-полимераза р. В последние годы у эукариот открыты новые ДНК-полимеразы X, ц и I, что делает особенно актуальным идентификацию ДНК-полимераз в ансамблях репликации и репарации. Несмотря на значительные усилия, направленные на изучение репликации и репарации ДНК эукариот, детальный механизм белок-бёлковых и белково-нуклеиновых взаимодействий, а также их динамика до сих пор остаются невыясненными.

На протяжении, многих лет для изучения молекулярной организации белковых комплексов репликации и репарации ДНК широко Используется метод аффинной модификации. Для успешного применения данного метода в изучении многокомпонентных систем, в том числе для идентификации определенных белков в клеточных и ядерных экЬтрактах, необходимо повышение селективности и эффективности аффинной модификации. Одним из путей решения этой задачи является фотосенейбйлйзированная модификация, основанная на использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов. Актуальным на сегодняшний день является:

1) создание и применение новых реагентов для селективной модификации ДНК-полимераз и других белков, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНК, в многокомпонентных системах, таких как клеточные и ядерные экстракты;

2) усовершенствование метода фотосенсибилизированной модификации для получения достаточных количеств меченых белков с целью их последующей идентификации.

Целью данной работы являлось совершенствование метода высокоселективной и эффективной модификации ДНК-полимераз, основанного на использовании фотохимической, сенсибилизации, в реконструированных системах на примере ДНК-полимеразы р, ДНК-полимеразы Пе из ТИегтш 1ЪегторЫ1ш В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии факторов репликации ДНК, а также идентификация ДНК-полимераз этим методом в клеточных и ядерных экстрактах.

В ходе исследования решались следующие задачи:

^ проа национальная i библиотека

С.Петербург /д 09 70$ актЛ&З

• повышение селективности модификации различных ДНК-полимераз в присутствии других ДНК-связывающих белков;

• подбор оптимальных структур реагентов и сенсибилизаторов для создания новых, наиболее эффективных пар фотореагент - сенсибилизатор;

• увеличение эффективности модификации ДНК-полимераз в условиях избытка реагента;

• фотосенсибилизированная модификация каталитических субъединиц ДНК-полимераз в многокомпонентных системах, таких как ДНК-полимераза а-праймаза, клеточный экстракт фибробластов мыши и ядерный экстракт семенников крупного рогатого скота.

Научная новизна и практическая ценность. Диссертационная работа посвящена совершенствованию' нового метода, основанного на фотохимической сенсибилизации, с использованием бинарной системы фотореагентов. С помощью фотореакционноспособного праймера, содержащего на З'-конце 4-азидо-2,3,5,6-тётрафторбензоильную группу, и аналога ТТР, содержащего остаток пирена, впервые проведена высокоселективная аффинная модификация термостабильной ДНК-полимеразы из Thermits thermophilus В35, эукариотической ДНК-полимеразы Р и более сложного объекта — ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии репликативного белка А. Показано, что природные dNTP защищают ДНК-полимеразу от модификации, конкурентно вытесняя сенсибилизатор.

Показано увеличение эффективности модификации. ДНК-полимераз с помощью бинарной системы фотореагентов по сравнению с прямым мечением путем варьирования концентрации реагента и сенсибилизатора, а также путем выбора наиболее эффективной пары реагент-сенсибилизатор.

Продемонстрирована возможность применения метода аффинной модификации для выявления белков ядерного экстракта семенников крупного рогатого скота и клеточного экстракта фибробластов мыши, взаимодействующих преимущественно с интермедиатами эксцизионной репарации оснований (BER) ДЙК', полученными in situ. Среди продуктов модификации идентифицированы четыре белка: ДНК-полимераза р, флэп-эндонуклеза-1, АР-эндонуклеаза-1 и поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1.

Впервые для идентификации ДНК-полимераз, взаимодействующих с фотореакционноспосОбными интермедиатами BER в экстрактах клеток и ядер, осуществлена фотосенсибилизированная модификация бинарной системой реагентов. Впервые в качестве фотореагента в бинарной системе был использован аналог dUTP, содержащий 4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридильную группу. В качестве основного продукта модификации, взаимодействующего с интермедиатой BER, выявлена единственная ДНК-полимераза, а именно ДНК-полимераза р.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 5 статьях и 11 тезисах докладов. Результаты работы были

представлены на международных конференциях: "IVth ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on "Basic Science in ISTC Activities", April 23-27, 2001 (Новосибирск, Россия); Conference for Students, PhD Students and Young Scientists (on Molecular Biology and Genetics) dedicated to the establishment of Ukrainian Society of Molecular Biology, September 20-22, 2001 (Kiev, Ukraine); International Conference "RNA as Therapeutic and Genomics Target", August 30 -September 2, 2001 (Новосибирск, Россия); The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, June 21-26, 2001 (Москва, Россия); International Summer School 2002 for Postdoctoral Scientists and Advanced Students "Chemical Probes in Biology", Greece, Island of Spetses, August 18-30, 2002; Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure (BGRS), July 14-20, 2002 (Новосибирск, Россия); III Съезд Биохимического Общества, Июнь 26-Июль 1, 2002, (Санкт-Петербург, Россия).

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Она изложена на 111 стр. и включает 27 рисунков, 2 таблицы и список цитируемой литературы из 141 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Высокоселективная фотоаффинная модификация ДНК-

полимераз

Важнейшими задачами фотоаффинной модификации является повышение ее эффективности и селективности. Одним из подходов, позволяющих решить эти проблемы, является использование бинарной системы фотореагентов. При таком способе модификации ковалентное присоединение реагента к мишени будет происходить только в тройном комплексе реагент*мишень* фотосенсибилизатор и, следовательно, вероятность модификации случайной мишени из раствора резко уменьшается. Предложенный метод также позволяет проводить модификацию биополимеров в условиях, исключающих фотоинактивацию белков и нуклеиновых кислот, что дает возможность повысить выход целевых продуктов (облучение УФ-светом с длиной волны >365 нм).

Для сенсибилизированной фотомодификации ДНК-полимераз была предложена следующая схема. Радиоактивно меченый праймер, несущий фотореакционноспособную арилазидогруппу, синтезированный in situ с помощью ДНК-полимеразы, связывается в ДНК-связывающем центре фермента, а аналог нуклеозид-5-трифосфата, содержащий фотосенсибилизатор, в dNTP-связывающем центре (рис. 1, А). При облучении УФ-светом с длиной волны 365-450 нм энергия первоначально поглощается фотосенсибилизатором и затем переносится на арилазидогруппу, которая в данном диапазоне длин волн практически не поглощает УФ-свет. Перенос

энергии (электрона) происходит только в комплексе фотореагент-•ДНК-полимераза»фото-сенсибилизатор (рис. 1, Б). Возбужденный таким образом реагент активируется и ковалентно присоединяется к

полимеразе (рис. 1, В), при этом другие ДНК-связывающие белки, которые не способны связывать сШТР, не должны метиться реагентом в этих условиях. Эффективность переноса энергии уменьшается с увеличением расстояния между сенсибилизатором и фотореакционно-способной группой,

(%. ">?65 ии)

Рис. 1. Принципиальная схема модификации ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов. (А)

Связывание реагента и сенсибилизатора с мишенью, возбуждение сенсибилизатора (Б) Перенос энергии от сенсибилизатора на фотореагент во время УФ-облучения. (В) Ковалентная пришивка праймера к ферменту. (Г) Замена "непродуктивно" фотолизованного реагента в комплексе с ДНК-полимеразой активным реагентом из раствора во время облучения.

следовательно, реагент в

растворе фотолизуется с меньшей скоростью в данных условиях (рис. 1, Б). Необходимо подчеркнуть, что предлагаемый подход является универсальным, и он применим для селективной модификации любых биополимеров, связывающих несколько лигандов.

Все использованные в работе аналоги dNTP, содержащие различные фотоактивные группы, являются эффективными субстратами исследованных ДНК-полимераз, не терминируют синтез ДНК и имеют каталитические характеристики, близкие к природным dNTP. Химические структуры использованных в работе аналогов представлены на рис. 2. Фотохимические характеристики аналогов позволяют проводить облучение реакционных смесей УФ-светом с длиной волны более 300 нм. При этом не происходит неспецифической деструкции биополимеров.

Первоначально бинарная система фотоаффинных реагентов была опробована на модельных системах, в качестве которых были выбраны ДНК-полимераза из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tte-pol) и эукариотическая ДНК-полимераза ß (Pol ß). Обе ДНК-полимеразы являются привлекательными объектами, поскольку это просто организованные

Pyr-i-dUTP

Rj = OH Pyi-e-dUIP

R, = OH FAB-9-dlJTP

P.-OH ГА1М-(ШГР R, = H FA&4-ddl/1?

F, » OH FAP-8-iflJTP

ooo - v

II ii II

rrnricA

«П«

S4-dl.TP

6

ooo ir^^Nl II II II

nrrrncJ

...» iu.. Гн

"FAB-WCTP

односубъединичные ферменты, принадлежащие к разным семействам ДНК-полимераз.

Фотосенсибилизированная модификаиия ДНК-

полимеразы Tte из Thermus themophilus В35

Фотоактивный праймер был получен in vitro с помощью Tte- pol в присутствии аналога ТТР, содержащего тетрафтор-азидобензоильную группу (FAB-4-dUTP). В качестве фотосенсибилизатора был выбран аналог ТТР, содержащий остаток пирена в 5-ом положении урацила. Из рис. 3 видно, что как в случае Pyr-8-dUTP (дор. 2), так и FAB-4-dUTP (дор. 3) наблюдается встраивание только одного модифицированного нуклеотидного остатка в З'-конец праймера в соответствии со структурой матрицы.

Дальнейшего удлинения праймера после добавления Pyr-8-dUTP не происходило (дор. 4), т. е. фотоаффинное мечение Tte-pol проводилось радиоактивным праймером, несущим единственный остаток и-азидотетрафтор-бензамида на 3'-конце.

<ьГ он н

Рис. 2. Структурные формулы фотореагентов, использованных в работе.

16-мер праймер

FAB-4-dUTP Pyr-8-dUTP

12 3 4

+ +

Рнс. 3. Удлинение праймера в присутствен Руг-8-сШТР и РА&4-(1иТР, катализируемое Г/е-ро1.

Реакционные смеси (20 мкл), содержащие 0,5 мкМ дуплекс матрица-[ПР] праймер, 0,2 мкМ Пе- ро1, стандартные компоненты буфера, а также 1 мкМ аналоги ТТР, инкубировали при

70° в течение 15 мин. I - исходный 5-[,2Р] меченый праймер, 2-4 - продукты удлинения праймера в присутствии 1 мкМ Руг-8-сЮТР (2) или/и 1 мкМ РАВ-4-сШТР (5, 4). После удлинения праймера в присутствии РАВ-4-(ШТР к половине реакционной смеси добавляли 1 мкМ Руг-8чШТР и дополнительно инкубировали в

течение 15 мин при 70° (дорожка 4)

На рис. 4 представлена кинетика модификации 77е-полимеразы фотоактивным прайме-ром в присутствии и в отсутствие Руг-8-<ШТР, а также 1-пиренмас-ляной кислоты при облучении УФ-светом Х=365-450 нм. Начальная скорость модификации в присутствии Руг-8-(ШТР примерно в 10 раз выше, чем в его отсутствие. В присутствии 1-пиренмасляной кислоты начальная скорость фотомодификации только в 2 раза выше, чем в ее отсутствие. Увеличение скорости модификации в этом случае можно объяснить связыванием 1-пиренмасляной кислоты с гидрофобными доменами вблизи активного центра 77е-ро1, что приводит к незначительной активации фотореагента при облучении УФ-светом А.=365-450 нм. Значительное повышение начальной скорости фотомодификации фермента в

20 40 60 80 Время облучения, мин

Рис. 4. Кинетика фотоаффииной модификации ДНК-полимеразы Tie.

Реакционные смеси объемом 20 мкл содержали 0,5 мкМ дуплекс матрица-['2Р] праймер, 0,2 мкМ Tie-pol и 1 мкМ FAB-4-dUTP. После удлинения праймера (15 мин

при 70 ) к реакционным смесям добавляли 1-пиренмасляную кислоту (кривая II) или Pyr-8-dUTP (кривая III) до концентрации 1 мкМ. Контрольная смесь (кривая Г) не содержала сенсибилизатора Все реакционные смеси облучали УФ-светом (А,=365-450 нм) при комнатной температуре. Продукты модификации анализировали электрофорезом в 12%-ном ПААГ с Ds-Na с последующей радиоавтографией. Полосы, соответствующие модифицированной 77е-ро1, вырезали и просчитывали на сцинтилляционном счетчике по методу

Черенкова.

присутствии Руг-8-(ШТР подтверждает предположение о том, что Руг-8-(ШТР связывается более специфично, чем 1-пиренмасляная кислота, так как природная часть молекулы (сШТР) ориентирует остаток пирена вблизи сЮТР-связывающего центра фермента. На основании кинетических данных по модификации 77е-ро1 нами было выбрано время облучения 10 мин (Х=365-450 нм) для всех последующих экспериментов. В этих условиях модификация реагентом, сенсибилизированным пиреном, проходит с образованием почти половины от максимально возможного выхода ковалентных аддуктов, тогда как соответствующий выход в случае прямой модификации незначителен.

Для подтверждения специфичности связывания Руг-8-сШТР в сПЧТР-связывающем центре 77е-ро1 были проведены эксперименты с добавлением 100-кратного избытка каждого из четырех природных ёЫТР. Защита 7>е-ро1 от сенсибилизированной модификации наблюдается только в присутствии <1АТР либо сЮТР. Однако при использовании сЮТР наблюдалось дальнейшее удлинение праймера в соответствии со структурой матрицы, поэтому данные по защите 77е-ро1 от модификации в присутствии сЮТР нельзя однозначно интерпретировать. Добавление других сШТР не приводило к дальнейшему встраиванию нуклеотидов в З'-конец праймера. Защита 77е-ро1 от сенсибилизированной модификации в присутствии ТТР и с1СТР наблюдалась при снижении концентрации Руг-8-сШТР на порядок, то есть при 1000-кратном избытке сИЧТР по отношению к Руг-8-сШТР. Это свидетельствует о разном сродстве пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов к (ЮТР-связывающему центру 7>е-ро1 или к комплексу ДНК-полимеразы с Руг-8-(ШТР. Таким образом, природный субстрат и фотосенсибилизатор конкурируют за связывание в (ШТР-связывающем центре 77е-ро1.

Селективная модификация ДНК-полимеразы 77е в присутствии ЯРА

Для изучения селективности модификации 7>е-ро1 к реакционной смеси был добавлен фактор репликации А человека (ЯРА). Этот белок, состоящий из полипептидов с молекулярной массой 70, 32 и 14 кДа, является важнейшим фактором репликации и репарации, взаимодействующим с ДНК. Поскольку ЯРА способен связывать только фотоактивный праймер в составе ДНК-дуплекса, но не фотосенсибилизатор (аналог сШТР), модификация ЯРА не должна наблюдаться в условиях фотосенсибилизированной модификации. Следовательно, присутствие ЯРА в реакционной смеси для модификации ДНК-полимераз с помощью бинарной системы фотоаффинных реагентов может выявить селективность данного метода. Под "селективностью модификации" подразумевается мечение аффинным реагентом одной специфической мишени (биополимера) из нескольких возможных. На рис. 5 представлены результаты фотоаффинного мечения 7>е-ро1 в отсутствие и в присутствии ЯРА (0,5 мкМ). При проведении сенсибилизированной модификации в присутствии ЯРА

происходит мечение только 77е-ро1 (дор. 4), а при прямой модификации наблюдается также мечение р70 субъединицы ЯРА, протеолити-ческого фрагмента р70 субъединицы и р32 субъединицы ЯРА (дор. 2). Эти данные свидетельствуют о том, что фотосенсибилизированная модификация происходит только в комплексе реагент*ДНК-полимера-за«фотосенсибилизатор. Интересно, что в присутствии фотосенсибилизатора модификация 77е-ро1 также происходит более специфично (дор. 3), тогда как прямая модификация (УФ-облучение при А>280 нм) дает дополнительный продукт с большей подвижностью (дор. 1), что, скорее всего, соответствует ковапентному присоединению праймера к другой аминокислоте 77<?-ро1.

Аналогичные результаты по фотосенсибилизированной модификации были получены в случае ДНК-полимеразы р и более сложного объекта - ДНК-полимеразы а, состоящей из 4 субъединиц: большой каталитической субъединицы (165182 кДа), субъединицы 70 кДа и двух праймазных субъединиц (приблизительно 48-50 и 55-60 кДа). При сенсибилизированной модификации в присутствии ЯРА наблюдалось мечение только каталитической

46 —

• -Г"

зо—

21—

м— (■НВМВ

RW - + - ♦

pyr-8-dutp - - * * 77©-ро( + + ♦ +

Рис. 5. Фоггоаффинное мечение 7¥е-ро1 и RPA праймером, синтезированным in situ. Реакционные смеси содержали 0,2 мкМ Tte-pol, 0,5 мкМ дуплекс матрица-[12Р] праймер, 1 мкМ FAB-4-dUTP. После удлинения праймера

(15 мин при 70°) реакционные смеси охлаждали во льду, добавляли RPA до 0,5 мкМ и Pyr-8-dUTP до 1 мкМ и облучали УФ-светом при комнатной температуре. I - прямая фотомодификация 77е-ро1

фотореакционноспособным праймером при облучении УФ-светом с длиной волны >280 нм в течение 3 мин, 2 - то же в присутствии RPA, 3 - фотомодификация, сенсибилизированная 1 мкМ Pyr-8-dUTP, при облучении УФ-светом с длиной волны 365-450 нм в течение 30 мин, 4 - то же в присутствии RPA.

субъединицы Pol а, тогда как в

условиях прямой модификации успешно модифицируется добавленный в систему RPA: наряду с каталитической и двумя праймазными субъединицами ДНК-полимеразы а видно мечение р70 и р32 субъединиц RPA.

2. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных

реагентов

Для повышения эффективности аффинной модификации ДНК-зависимых ферментов с применением бинарной системы фотореагентов были изучены различные подходы. Использование бинарной системы фотоаффинных реагентов создает целый ряд преимуществ по сравнению с прямым мечением белков (УФ-облучение с А>280 нм). В этом случае для модификации можно использовать более мягкий УФ-свет (А.=365-450 нм), что позволяет избежать фотоинактивации белков и нуклеиновых кислот. При этом сводится к минимуму неспецифическая модификация.

Расстояние между реагентом и используемым сенсибилизатором также может влиять на эффективность мечения, поскольку эффективность резонансного переноса энергии уменьшается с увеличением расстояния между ними. В дополнение к ранее использовавшимся реагентам и сенсибилизаторам были исследованы новые аналоги сЮТР, различающиеся длиной линкера, соединяющего пиренильную или арилазидную группы с азотистым основанием.

Одним из путей повышения эффективности модификации является увеличение избытка реагента по отношению к мишени. Принципиальная схема фотосенсибилизированной модификации, иллюстрирующая основную идею, изображена на рис. 1. В условиях прямого мечения фотолиз реагента в растворе идет с той же скоростью, что и в комплексе с мишенью. Фотолизованный реагент, сохраняя сродство к мишени, является конкурентным ингибитором модификации фермента и, кроме того, является источником неспецифического мечения. При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов фотолиз реагента в растворе происходит значительно медленнее, чем в тройном комплексе реагент*мишень«сенсибилизатор, и реагент в растворе остается интактным. Таким образом, если реакционноспособный праймер не присоединился ковапентно к ДНК-полимеразе за время жизни комплекса, то фермент может связать другую молекулу реагента из раствора (рис. 1, Г). При этом суммарный выход модификации ДНК-полимеразы увеличивается и значительно уменьшается неспецифический фон.

И, наконец, при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов необходимо исключить встраивание в праймер сенсибилизирующего нуклеотидного аналога, впервые был использован терминирующий фотореакционноспособный аналог ТТР дидезокси-ряда (РАВ-4-(1сШТР). Применение аналога дидезокси-ряда также полезно при синтезе фотореакционного субстрата в клеточном либо в ядерном экстрактах, поскольку в них всегда присутствуют сШТР, которые могут удлинять праймерпосле встраивания фотореакционноспособного аналога сММР. При

этом получается спектр праймеров, содержащих фотореакционно способную группу в разных положениях относительно З'-конца праймера, что может привести к снижению эффективности, либо к множественной модификации.

Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность модшЬикаиии ДНК-полимеразы В На рис. 6 представлены кинетические кривые аффинной модификации ДНК-полимеразы р фотоактивными олигонуклеотидами, содержащими на 3'-конце остаток РАВ-4-сШМР (А) либо РАВ-9-(ШМР (Б), в то время как в качестве сенсибилизатора использовали как Руг-8-сШТР, так и Руг-6-сШТР. Видно, что начальная скорость модификации для обоих реагентов в присутствии Руг-6-(ШТР выше по сравнению с Руг-8-<ШТР (ср. кривые 3 и 2, А и Б), при этом наибольший эффект сенсибилизации наблюдается для реагента, содержащего остаток РАВ-4-<ШМР (ср. А и Б). Принимая во внимание небольшое различие в значениях Кт для сенсибилизаторов (0,1 мкМ для Руг-6-<ШТР и 0,2 мкМ для Руг-8-ёиТР) и то, что их концентрации были выше величин Кт, можно сделать вывод, что именно длина линкера, соединяющего пиренильную группу с аффинной частью реагента, влияет на эффективность модификации фермента.

FAB-4-dUTP

Время облучения, мин

Рис. 6. Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность

модификации ДНК-

полимеразы ß.

Фотореакционноспособный дуплекс 5'-[52Р]-праймер матрица был получен в присутствии FAB-4-dUTP (А), либо в присутствии FAB-9-dUTP (Б) с помощью 0,5 мкМ pol р в 20 мкл реакционной смеси. Затем смеси облучали УФ-светом (^.=365-450 им) в присутствии Pyr-8-dUTP

(кривые 2) или Pyr-6-dUTP (кривые J) Контрольные смеси не содержали сенсибилизатора (кривая /) Продукты модификации фермента

разделяли в 12%-ном ПААГ с Ds-Na, вырезали и

просчитывали на сцинтилля-ционном счетчике по методу

Черенкова.

Таким образом, сочетание реакционноспособного праймера с остатком РАВ-4-(ШМР на З'-конце и Руг-6-<ШТР в качестве сенсибилизатора создает наиболее эффективную бинарную систему для модификации ДНК-полимераз. По-видимому, это объясняется тем, что при взаимодействии данной пары реагентов с ферментом РАВ-группа реагента и пиренильная группа сенсибилизатора оказываются наиболее сближенными, что обеспечивает, эффективный перенос энергии (или электронов), что в свою очередь приводит к увеличению эффективности модификации исследованных белков.

фотоаффинное меченые ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях 10-кратного избытка реакиионноспособного праймера

Для того чтобы определить концентрацию Руг-6-сШТР, при которой эффективность модификации ДНК-полимераз максимальна, мечение ДНК-полимеразы р проводили в условиях 10-кратного избытка фотореагента по отношению к ДНК-полимеразе, варьируя концентрацию Руг-б-сШТР.

Максимальный

12 3 4 5 6 7 8 0 10 11

ДНК н

полимерлза Т!е ДНК-малимсраэа

[5- Р]праймер-матрица —I

ВиЗ-4чЯЛТ Руг-бчШТР 365-450 им 334-365 им >280 нм

Рис. 7. Фотоаффинное мечение ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях десятикратного избытка

реакционноспособного праймера.

Фотореакционноспособный праймер был синтезирован ДНК-полимеразой р (1-6) или ДНК-полимеразой Не (7-//) в присутствии РАВ-4-(ШТР. Реакционные смеси облучали УФ-светом при разных длинах волн в присутствии (сенсибилизированная модификация дор 4,8) ив отсутствие (дор 3, 7) Руг-6-<ШТР, "прямая" модификация- дор. 5, б, 10, 11. Дорожка 2 - без облучения.

уровень

модификации (30%)

наблюдался при 50 мкМ концентрации Руг-6-<ШТР. Дальнейшее повышение

концентрации Руг-6-<ШТР не приводило к увеличению уровня модификации ДНК-полимеразы.

Было проведено сравнение эффективности модификации ДНК-полимераз р и 77е в условиях прямого мечения и с использованием бинарной системы фото-аффинных реагентов при 10-кратном избытке реагента по отношению к ферменту. Данные представлены на рис. 7. Электрофоретический анализ продуктов модификации ДНК-полимераз показал, что при облучении светом с А.= 365-450 нм прямого мечения белка практически не происходит (дор. 3,9).

Однако уровень модификации ДНК-полимераз ß и 7*/е с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов в этих условиях был достаточно высоким (дор. 4 и 5, 6; 8 и 10, 11, соответственно) и составлял 30% для ДНК-полимеразы ß и 18% для ДНК-полимеразы Tie. Таким образом, уровень сенсибилизированного мечения в 2 и 1,2 раза соответственно превышал уровень прямого мечения этих белков даже в более жестких условиях облучения (А>280 нм). Следует отметить, что и в данном случае использование бинарной системы фотоаффинных реагентов исключало множественную модификацию ДНК-полимераз.

Э. Идентификация белков в ядерном экстракте методом фотоаффинной модификации с использованием различных

фотореагентов

Метод фотосенсибилизированной модификации с использованием бинарной системы фотореагентов открывает возможность идентификации каталитических субъединиц ДНК-полимераз в клеточных или ядерных экстрактах. На первом этапе был исследован вопрос о том, какие белки ядерного экстракта семенников крупного рогатого скота подвергаются модификации с помощью фотореакционноспособных ДНК-интермедиатов "длиннозаплаточной эксцизионной репарации" оснований, синтезированных in situ. Для сравнения влияния заместителей в ароматическом кольце реагента на эффективность модификации биополимеров были использованы аналоги dNTP, содержащие различные азидогруппы (FAB, FAP), а также широко используемый в практике фотоаффинной модификации 4-тиоуридин (S4). Структурные формулы аналогов представлены на рис. 2. Такое сравнительное исследование необходимо для определения возможности дальнейшего повышения эффективности модификации биополимеров путем варьирования природы фотоактивной группы. Несомненно, это актуально для наработки достаточного количества меченых белков с целью их последующей идентификации, а также для увеличения чувствительности метода при применении его в многокомпонентных системах.

Синтез фотореакционноспособных интермедиатов penavauuu оснований

Для анализа полного комплекса репарации ДНК на уровне экстрактов являются перспективными ДНК-структуры, содержащие фотореакционно-способные группы на З'-конце ника. В качестве исходного субстрата был использован олигонуклеотидный дуплекс, содержащий в раДиоактивно-меченой цепи синтетический АР-сайт (З-гидрокси-2-гидроксиметил-тетрагидрофуран (F), который может быть использован для создания фотореакционноспособного интермедиата эксцизионной репарации оснований.

-r-

-pdA-

Гр1_

APE адерного экстракта

-pdA

ДНК-полимеразы ядерного экстракта

FAP-8-dUTP, FAB-4-dUTP

1лР1_

-pdU"1 —pdA-

введенвя

Олигонуклеотидный дуплекс,

содержащий в радиоактивномеченой цепи синтетический AP-сайт (3-гидрокси-2-гидроксиметилтетра-гидрофуран (F)), был использован для получения фотореакционноспо-собной ДНК in situ. Схема синтеза фотореакционноспособной ДНК показана на рис. 8. Этот дуплекс является удобной моделью для исследования репарации ДНК, так как остаток F, моделирующий АР-сайт, не выщепляется с помощью лиазной активности ДНК-полимеразы ß. В ядерном экстракте данная ДНК-структура подвергается расщеплению АР-эндонуклеазой (АРЕ) с последующим введением в 3'-конец растущей цепи ДНК фотореакционноспособного остатка dNMP ДНК-полимеразами ядерного экстракта. В результате образуется фотореакционноспособный интермедиат длиннозаплаточной эксцизионной репарации оснований, содержащий аналог остатка дезоксирибозофосфата (3-гидрокси-2-гидроксиметилтетра-гидрофуран-5'-фосфат) на 5-конце ника и единственный фотореакционноспособный остаток dNMP на 3'-конце ника.

Согласно условиям реакции и структуре матрицы, при инкубации радиоактивно меченой ДНК в ядерном экстракте в присутствии фотоактивного аналога dNTP должно происходить встраивание только одного фотореакционноспособного остатка dNMP в 3'-конец ника, что и было показано прямыми экспериментами. Почти для всех ДНК-структур степень удлинения 3'-конца праймера фотореакционноспособным остатком dNMP была достаточно высока — 75-80%, за исключением структуры, содержащей протяженный 5'-конец матрицы, и фотореагента FAB-4-ddUTP (33%). Низкая степень удлинения праймера в этом случае может быть объяснена конкуренцией Pol ß с другими ДНК-полимеразами экстракта. Структуры с короткими брешами являются предпочтительными субстратами для Pol ß, а структуры, содержащие протяженный 5'-конец матрицы, являются также субстратами и для репликативных ДНК-полимераз, для которых ddNTP являются плохими субстратами.

Рис. 8. Схема

фотореакционноспособного остатка dNMP в олигонуклеотидный дуплекс, моделирующий интермедиат эксцизионной репарации.

фотомодификация белков ядерного экстракта

Несмотря на то, что в ядерном экстракте присутствует огромное число белков, как показало окрашивание гелей после разделения белков ядерного экстракта в ПААГ с Бв-Иа с помощью кумасси (рис. 9), активация фотоактивной группы в составе интермедиата репарации ДНК УФ-светом с >.=320 нм приводила к последующей модификации ограниченного числа белков ядерного экстракта, что говорит о специфичности взаимодействия белков ядерного экстракта с интермедиатами эксцизи-онной репарации оснований.

Белки эксцизионной репарации оснований, такие как поли-(АОР-рибозо)-полимераза (РА11Р-1), флэп-эндонуклеаза (РЕ>1-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза (АРЕ) и ДНК-полимераза р, взаимодействующие с подобными фотореакционноспособными интермедиатами в клеточном экстракте фибробластов мыши, недавно были идентифицированы методом иммунопреципитации ДНК-белковых аддуктов специфическими антителами. Было предположено, что подобные белки могут взаимодействовать с фотореакционноспособными ВЕЯ интермедиатами и в ядерном экстракте, выделенном из семенников крупного рогатого скота. Чтобы подтвердить данное предположение, к ядерному экстракту добавляли рекомбинантные белки высших эукариот: РАЯР-1, РЕЫ-1, АРЕ, ДНК-полимеразу р и другие белки, принимающие участие в репарации ДНК (ЯРА, ДНК-лигаза I), после удлинения праймера фотореакционноспособным аналогом РАВ-4-сИиТР перед УФ-облучением. Данные разделения продуктов модификации, полученных в таком эксперименте, показаны на рис. 10. Добавление каждого из белков приводит к изменению картины мечения таким образом, что основным продуктом модификации становится ковалентный аддукт, соответствующий по молекулярной массе продукту присоединения добавляемого белка (ДНК-полимераза Р, АРЕ, РЕЫ-1 и РАШМ) к олигонуклеотиду длиной 15 н.о. (дор. 2-5, соответственно). Ковалентное присоединение к белку остатка ДНК такого размера, как правило, увеличивает его подвижность на 6-7 кДа. Кроме того, добавление избытка каждого из белков приводит к уменьшению интенсивности модификации других белков

1 2 3

Рис. 9. Выявление белков ядерного экстракта окраской геля с помощью кумасси. Белки ядерного экстракта (дор I) и очищенные рекомбинантные ДНК-полимеразу (3 (дор 2, 3), АРЕ и РЕЫ-1 (дор. 3) разделяли в 12%-ном ПААГ с Оь-Ыа с последующей окраской геля кумасси

экстракта, что говорит о конкуренции белков исследуемого экстракта за взаимодействие с

фотореакционноспособным интерме-диатом репарации ДНК. Следует отметить при этом, что добавление низкомолекулярных белков (ДНК-полимеразы р, АРЕ и FEN-1) незначительно изменяло уровень модификации PARP-1 (дор. 2-4), что, вероятнее всего, связано с высокой концентрацией этого белка в экстракте и его высоким сродством к данному производному ДНК. Так добавление очищенного препарата PARP-1 к ядерному экстракту практически полностью ингибировало мечение других белков экстракта (дор. 5).

Для подтверждения природы высокомолекулярного продукта

модификации были проведены эксперименты с добавлением NAD+ перед УФ-облучением. Основанием для этого эксперимента служило то, что в присутствии NAD+ происходит поли(АОР)рибозилирование PARP-1 и, следовательно, подвижность продукта его присоединения к ДНК должна

//

FSN-1 М

'ЯдерыЗяхфкг Tdif+ÄTE

Рис. 10. Идентификация белков ядерного экстракта с добавлением

рекомбинаитных белков репарации ДНК.

Фотореакционноспособный 5'-[32Р]-ник-ДНК-дуплекс был получен в присутствии FAB-4-ddUTP с помощью ядерной ДНК-полимеразы (дор. l-б) либо в реконструированной системе Pol ß и АРЕ (дор 7-10) Все реакционные смеси облучали УФ-светом с л=320 нм. Дорожка 1 - без добавления рекомбинантных белков Дорожки 5, б и 9, 10 с добавлением PARP-1 в отсутствие (дор. 5, 9) ив присутствии NAD+ (10° М) (дор. б, 10) Продукты модификации разделяли в 12%-ном ПААГ с Ds-Na с последующей радиоавтографией

измениться.

Как видно из рис. 10, высокомолекулярный продукт мечения («120 кДа) практически исчезает при добавлении NAD+ (ср. дор. 5 и б, 9 и 10). В то же время в зоне старта количество меченых продуктов увеличивается (данные не представлены). Подвижность продуктов ковалентного присоединения ДНК к АРЕ-1, ДНК-полимеразе р и FEN-1 при добавлении NAD+ не изменяется. Следовательно, высокомолекулярный белок способен поли(АОР)рибозили-роваться и соответствует PARP-1, который, как было показано ранее, является главным продуктом ковалентного присоединения к фотореакционно-способному интермедиату BER в клеточном экстракте фибробластов мыши. ДНК-полимераза Р и высокомолекулярный продукт, соответствующий PARP-1, были идентифицированы иммунопреципитацией с использованием специфических антител.

4. Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте

Для идентификации ДНК-полимераз, взаимодействующих с фото-реакционноспособными интермедиатами эксцизионной репарации оснований в ядерном экстракте, была применена бинарная система фотоаффинных реагентов.

Поскольку ранее было показано, что наиболее эффективная модификация ДНК-полимераз происходит при использовании фотореакционноспособного праймера, содержащего тетрафторазидобензоильную группу на З'-конце, и Руг-б-сШГР в качестве сенсибилизатора, эта бинарная система была использована для сенсибилизированной

модификации белков в ядерном экстракте. Как видно из рис. 11, в условиях фотосенсибилизированной модификации с

использованием ник- или флэп-содержащих ДНК-

структур существенно

увеличивается количество ковалентного аддукта с молекулярной массой 46 кДа (ср. дор. 1 и 5, 6 и 10), который соответствует продукту

мечения Pol ß ДНК-праймером. При

использовании ДНК-структуры, содержащей выступающий 5'-конец матрицы, основным продуктом модификации был белок с меньшей электрофоретической подвижностью - М=60 кДа (дор. 11-15). В отсутствие Руг-6-dUTP или в присутствии 1-пиренмасляной кислоты

(потенциального сенсибилизатора) при

облучении светом с Х=365 нм интенсивность мечения была низкой (дор. 3, 4, 8, 9, 13, 14), что говорит о специфичности

¡ 2 3 4 5 6

Pd S ►

S 9 10 И 12 13 ¡41S

365 нм 320нм Pyr-«-<5UTP

- т + т -■г - - - f

.+ + + ..+

h . . . 4- + .

. . - Ь - - -

Рис. 11. Фотоаффииная модификация белков ядерного экстракта с использованием разных ДНК-структур. РЛВ-4ч)1)иМР был введен в ДНК, содержащую флэп-структуру (дор. 1-5), ДНК, содержащую ник-структуру (дор. 6-10) и ДНК с протяженным 5'-концом (дор. 11-15) с помощью активности ядерной ДНК-полимеразы. Дорожки 2, 7, 12-контроль без добавления РАВ-4-с1с1иТР. Реакционные смеси облучали УФ-светом с Я,=320 нм - "прямая" модификация, >.=365 нм в присутствии Руг-б-сШТР -"сенсибилизированная" модификация, в отсутствие Руг-6-сШТР (дор 3, 8, 13) или в присутствии 1-пиренмасляной кислоты (дор 4, 9, 14).

фотосенсибилизированной модификации, зависимой от присутствия Руг-6-dUTP. Продукт с молекулярной массой около 97 кДа обнаруживается и без фотореакционноспособного аналога dNTP в присутствии ник- или флэп-ДНК-структуры и даже без облучения реакционных смесей (дор. 2, 7). Следовательно, этот продукт не является результатом фотоиндуцируемого присоединения белка к фотореакционной ДНК.

Аналогичная картина модификации была получена и с использованием другого фотореагента, содержащего азидо-дифтор-хлорпиридильную группу -FAP-8-dUTP, с той лишь разницей, что в этом случае уровень фотосенсибилизированной модификации ДНК-полимеразы ß был выше. Для сенсибилизированной модификации впервые была применена FAP-rpynna, которая, согласно недавно полученным результатам, наиболее эффективно образует ковалентные сшивки с мишенями белковой природы при облучении УФ-светом в области 300-320 нм.

Следует отметить, что при сенсибилизированной модификации уровень мечения ДНК-полимеразы ß выше, чем при прямой модификации (320 нм) в отсутствие Pyr-6-dUTP. В то же время уровень образования ковалентных адцуктов с другими белками экстракта снижается в случае модификации бинарной системой (ср. дор. 1 и 5, 6 и 10 на рис. 11), что говорит о селективности фотосенсибилизированной модификации.

Относительная селективность и эффективность модификации ДНК-полимеразы в в ядерном экстракте

Была проведена количественная оценка относительной эффективности и селективности модификации ДНК-полимеразы ß в ядерном экстракте по сравнению с модификацией других ДНК-связывающих белков экстракта. Данные по относительной эффективности представлены в таблице 1. Процент удлинения праймера фотореакционноспособным аналогом и последующий уровень индуцируемых сшивок были оценены с помощью фосфоримеджера.

Как ридно из таблицы 1, в условиях фотосенсибилизированной модификации (УФ-облучение с Х=365 нм в присутствии Pyr-6-dUTP) количество меченого продукта Pol ß по отношению к другим модифицированным белкам экстракта увеличивается ~ в 2.5-3 раза по сравнению с "прямой" фотомодификацией при облучении УФ-светом с 320 нм в отсутствие Pyr-6-dUTP. Данный факт говорит о селективности модификации именно ДНК-полимераз с помощью бинарной системы фотореагентов.

Использование 1-пиренмасляной кислоты вместо Pyr-6-dUTP также приводит к модификации Pol ß, однако, этот процесс менее эффективен (см. таблицу 1) и объясняется, скорее всего, связыванием 1-пиренмасляной кислоты с гидрофобными доменами ДНК-полимеразы, что приводит к последующей активации арилазидогруппы фотореагента при облучении.

Таблица 1. Относительная эффективность (%) модификации Pol ß в

ядерном экстракте*

уф. облучение, >,=320 нм УФ-облучение, А,=365 нм

В отсутствие Pyr-6-dUTP В присутствии 1-пиренмасляной кислоты В присутствии Pyr-6-dUTP

ник-ДНК-структура

FAB-4-ddUTP 13 И 12 29

FAP-8-dUTP 12 10 9 32

FAB-dCTP 11 8 13 30

флэп-ДНК-структура

FAB-4-ddUTP 16 15 14 30

FAP-8-dUTP 8 4 9 26

FAB-dCTP 6 3 7 13

ДНК-структура с протяженным 5'-концом

FAB-4-ddUTP 10 8 15 19

FAP-8-dUTP 7 7 8 20

FAB-dCTP 8 4 11 12

Представлены средние значения трех независимых измерений, средние отклонения величин не превышали 5%.

Принимая во внимание все полученные результаты, следует сказать, что использование бинарной системы фотоаффинных реагентов позволило идентифицировать ДНК-полимеразу ß в качестве основного продукта, взаимодействующего в экстрактах клеток и ядер с фотореакционноспособным интермедиатом репарации оснований.

Из данных по эффективности модификации Pol ß в ядерном экстракте была рассчитана относительная селективность модификации Pol ß, как отношение количества меченого продукта, полученного при сенсибилизированной модификации, к количеству продукта "прямой" модификации. Данные представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы, эффективность фотосенсибилизированной модификации зависит не только от структуры интермедиата репарации ДНК, но и от структуры используемого фотореагента. Отличия, наблюдаемые для аналогов dCTP и ТТР, содержащих одну и ту же фотореакционноспособную группу, но присоединенную по разным положениям оснований (см. рис. 2), могут быть объяснены как различием во взаимной ориентации реакционноспособной группы и аминокислотных акцепторов, так и различием во взаимодействии белков с разными структурами ДНК. Причиной повышения уровня ковалентного присоединения фотореакционноспособных ДНК к Pol ß при использовании для их синтеза FAP-8-dUTP является, по-видимому, усиление электроноакцепторного характера ароматического кольца за счет наличия гетероциклического атома азота.

Таблица 2. Относительная селективность модификации Ро1 Р в ядерном

экстракте с использованием бинарной системы фотореагентов

Реагент Коэффициент увеличения эффективности модификации Ро10

РАВ-4-МиТР

ник-ДНК-структура 2,3

флэп-ДНК-структура 1,8

ДНК-структура с протяженным 5'-концом 1,9

РАВ-ИСТР

ник-ДНК-структура 2,8

флэп-ДНК-структура 2,2

ДНК-структура с протяженным 5'-концом 1,5

РАР-Н-йиТР

ник-ДНК-структура 2,7

флэп-ДНК-структура ■ ■ • 3,3

ДНК-структура с протяженным 5'-концом ■ 2,8-

На основании полученных данных сделан вывод о том, что ДНК-полимераза Р взаимодействует с высокой эффективностью с фотореакционноспособными интермедиатами длиннозаплаточной репарации оснований, синтезированными в ядерном экстракте, и является, по-видимому, основным ферментом, участвующим в ресинтезе ДНК в длиннозаплаточной эксцизионной репарации оснований, по крайней мере, на начальной стадии этого синтеза. С помощью бинарной системы фотоаффинных, реагентов можно добиться увеличения не только селективности, но и эффективности модификации ДНК-полимеразы (5 в ядерном экстракте.

В заключение необходимо отметить, что дальнейшее развитие и использование бинарных систем является перспективным с ' целью селективного выявления ферментов в ансамблях репликации и репарации ДНК. Использование методов фотосенсибилизированной модификации в. совокупности с другими подходами открывает новые возможности в понимании структурно-функциональной организации протеомных ансамблей.

выводы

1)^ м . Проведена селективная модификация ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов, состоящей из фотореакционноспособного праймера и аналога сШТР, несущего сенсибилизатор.

Бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет селективно модифицировать каталитическую субъединицу четырехсубъединичной ДНК-полимеразы а-праймазы, в то время как прямая модификация приводит к мечению трех субъединиц этого фермента. Впервые с помощью бинарной системы фотореагентов проведена высокоселективная аффинная модификация термостабильной ДНК-полимеразы из ТЬегтш ¡ЬегторИНи.^ В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии репликативного белка А.

2). Впервые показано, что использование бинарной системы фотоаффинных реагентов позволяет повысить эффективность модификации ДНК-полимераз по сравнению с прямым мечением фермента фотореакциониоспособным праймером. "

Наибольшая эффективность фотопришивки • наблюдается при использовании в качестве фотореагента ДНК-праймера, несущего на З'-конце остаток РАВ-4-ёиМР, а в качестве сенсибилизатора - Руг-6-сШТР. В условиях 10-кратного избытка праймера по отношению к ферменту такая бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет достичь 30%-ого уровня мечения ДНК-полимеразы (3, что в ~2 раза выше уровня прямого мечения, достигаемого в более жестких условиях (>.=334-365 нм).

3). Продемонстрирована возможность селективной модификации ДНК-полимераз в клеточном и ядерном экстрактах с применением бинарной системы фотоаффинных реагентов.

При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов единственным меченым белком в экстрактах клеток и ядер являлась ДНК-полимераза р, тогда как в условиях прямого мечения фотореакционноспо-собные ДНК - интермедйаты эксцизионной репарации оснований ковалентно присоединялись к ДНК-полимеразе р, флэп-эндонуклезе-1, АР-эндонуклеазе-1 и поли-(АОР-рибозо)-полимеразё-1. Таким образом, с помощью предлагаемого подхода, ДНК-полимераза Р выявлена как ключевой фермент в инициации ресинтеза ДНК в длиннозаплаточной репарации оснований.

4). Предложена новая пара реагент — сенсибилизатор для модификации ДНК-полимераз.

Впервые в качестве фотореагента в бинарной системе был использован аналог (ШТР, содержащий 4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридильную группу (РАР-8-сИ_1ТР), а в качестве сенсибилизатора - аналог сШТР, содержащий пиренильную группу (Руг-6-<ШТР), что позволило повысить эффективность модификации ДНК-полимеразы р в экстрактах клеток и ядер.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Речкунова Н.И., Колпащиков Д.М., Лебедева Н.А., Петрусева И О., Добриков М.И., Дегтярев С.Х., Лаврик О.И. Высокоселективная аффинная модификация ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus В35 бинарной системой фотореагентов // Биохимия, 2000, 65 (2), с. 291-297.

2. Lebedeva N.A., Kolpashchikov D.M., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Lavrik O.l. A binary system of photoreagents for highly efficiency labeling of DNA polymerases//Biochem. Biophys. Res. Com., 2001,287, 530-535.

3. Лебедева H.A., Колпащиков Д.M, Речкунова Н.И, Ходырева С.И., Лаврик О.И. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов // Биохимия, 2002, 67 (7), с. 973-981.

4. Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.L Photoaffinity labeling of proteins in nuclear extract by base excision repair intermediates // Biochem. Biophys. Res. Com., 2002, 297, pp. 714-721.

5. Лебедева H.A., Речкунова НИ., Дежуров С.В., Ходырева С.Н., Фавр А., Лаврик О.И. Новая бинарная система для фотосенсибилизированной модификации ДНК-полимераз в ядерном экстракте // Биохимия, 2003, 68 (4), с. 584-591.

Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 396-600. Тираж 100 экз.

goo?-а и 15 613

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ б

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Методы высокоселективной модификации ДНК-связывающих ферментов в реконструированных системах и экстрактах

1.1. Классическая аффинная модификация

1.2. Фотоаффинная модификация

1.3. Каталитически компетентное мечение

1.4. Каталитически компетентное мечение инициирующего комплекса РНК-полимеразы Escherichia coli

1.5. Каталитически компетентное мечение ДНК-полимераз

1.6. Фотомодификация с переносом энергии

1.7. Фотосенсибилизированная модификация белков—переносчиков лекарств

1.8. Бинарная система фотоаффинных реагентов

1.9. Бинарная система фотоаффинных реагентов для селективной модификации ДНК-полимераз

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Введение [32Р]-метки в 5 -конец олигонуклеотида

2.2.2. Подготовка ДНК-дуплекса к синтезу ДНК, катализируемому ДНК-полгшеразами

2.2.3. Электрофорез по Леммли

2.2.4. Количественная обработка гелей

2.2.5. Выделение рекомбинантнойДНК-полимеразы Tte

2.2.6. Синтез ДНК, катализируемыйДНК-полимеразой/3 илиДНК-полимеразои Tte

2.2.7. Определение кинетических параметров

2.2.8. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPA

2.2.9. Фотоаффинная модификация ДНК-полимераз

2.2.10. Условия УФ-облучения

2.2.11. Оценка эффективности и селективности модификации ДНК-полимераз

2.2.12. Выделение ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота

2.2.13. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами ядерного экстракта

2.2.14. Фотоаффинная модификация белков ядерного (клеточного) экстракта

2.2.15. Иммуноанализ антителами против белков репарации

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Высокоселективная фотоаффинная модификация ДНК-полимераз

3.1.1. Структуры и фотохимические характеристики аналогов dNTP

3.1.2. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В

3.1.3. Влияние природных dNTP на фотосенсибилизированную модификацию ДНК-полимеразы Tte

3.1.4. Селективная модификация ДНК-полимеразы Tte в присутствии RPА

3.1.5. Селективная модификация ДНК-полимеразы а-праймазы 3.2. Повышение эффективности модификации ДНК-полимераз при использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов

3.2.1. Субстратные свойства FAB-4-ddUTP

3.2.2. Влияние структуры матрицы на эффективность модификации ДНК-полимеразы Р

3.2.3. Влияние структур реагента и сенсибилизатора на эффективность модификации ДНК-полимеразы (

3.2.4. Фотоаффинное мечение ДНК-полимераз бинарной системой фотоаффинных реагентов в условиях 10-кратного избытка реакционноспособного праймера

3.3. Идентификация белков в ядерном экстракте методом фотоаффинной модификации с использованием различных фотореагентов

3.3.1. Структуры ДНК и фотореагентов, использованных в работе

3.3.2. Синтез фотореакционноспособных интермедиатов репарации оснований

3.3.3. Фотомодификация белков ядерного экстракта

3.4. Применение бинарной системы фотореагентов для модификации белков в ядерном экстракте

3.4.1. Фотоаффинная модификация белков ядерного экстракта с использованием различных ДНК-структур

3.4.2. Сравнение набора продуктов модификации в клеточном и ядерном экстрактах

3.4.3. Относительная селективность и эффективность модификации ДНКф полгшеразы fie ядерном экстракте

ВЫВОДЫ

Важнейшим направлением биохимии и молекулярной биологии является изучение ансамблей белков, а не только их отдельно взятых компонентов. В последнее время появилось представление о протеомах, обеспечивающих жизненно важные функции клеток и целых организмов, и возникло специальное направление их исследования. Например, протеомными ансамблями являются комплексы белков, обеспечивающие репликацию и репарацию ДНК. Центральную роль в осуществлении обоих процессов играют матричные ферменты - ДНК-полимеразы. В клетках высших эукариот основную роль в репликации и репарации ДНК играют ДНК-полимеразы а, 5, 8 и ДНК-полимераза р. В последние годы у эукариот открыты новые ДНК-полимеразы X, ц и i, что делает особенно актуальным идентификацию ДНК-полимераз в ансамблях репликации и репарации. ДНК-полимеразы осуществляют специализированные функции в тесном взаимодействии с множеством других ферментов и факторов, таких как репликативный белок A (RPA), репликативный фактор С (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза-1 (АРЕ1), ДНК-гликозилазы, ДНК-лигазы, поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1 (PARP-1) и другие белковые факторы. Проблема состоит в понимании механизма действия и координации этих ферментов и факторов в процессах репликации и репарации ДНК. Несмотря на значительные усилия, направленные на изучение репликации и репарации ДНК эукариот, детальный механизм белок-белковых и белково-нуклеиновых взаимодействий, а также их динамика до сих пор остаются невыясненными.

Как известно, рентгеноструктурный анализ, ядерный магнитный резонанс и другие физические методы исследования наиболее информативны и эффективны для изучения отдельных белков и некоторых простых комплексов. Например, метод рентгеноструктурного анализа (РСА) предоставляет наиболее детальную информацию о структуре отдельных биополимеров и их комплексов с лигандами. Однако этот метод обладает существенными недостатками: во-первых, он пока малопригоден для изучения сложных многокомпонентных комплексов из-за трудностей получения кристаллов таких структур. Кроме того, РСА не дает представления о динамике взаимодействия компонентов комплекса. И, наконец, всегда остается сомнение, применимы ли данные, полученные для кристаллов, к комплексам в растворе и, тем более, in vivo.

Методом сайт-направленного мутагенеза можно получать информацию о функции конкретной аминокислоты или же о значении фрагментов полипептидной цепи в функционировании белка. В то же время мутантные формы белков могут иметь изменённую третичную структуру и, как следствие, измененные функции по сравнению с природными, что создает проблему в интерпретации полученных результатов. Кроме того, применение данного подхода пока ограничено при изучении многокомпонентных структур и процессов in vivo.

На протяжении многих лет метод аффинной модификации широко используется для изучения молекулярной организации белковых комплексов, таких как системы репликации и репарации ДНК, а также транскрипции и трансляции. Метод основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание их ферментом. Этот подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером с последующим ковалентным присоединением аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр или находящимся в непосредственной близости от него. Эффективность этого подхода проявляется в наибольшей степени при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур.

Для успешного применения аффинной модификации в изучении многокомпонентных систем в том числе для идентификации определенных белков в клеточных и ядерных экстрактах необходимо повышение селективности и эффективности данного метода. Одним из путей решения этой задачи является фотосенсибилизированная модификация, основанная на использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов. Особый интерес представляет создание и применение новых реагентов для повышения селективности и эффективности модификации ДНК-полимераз и других белков, взаимодействующих с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНК, в многокомпонентных системах, таких как клеточные и ядерные экстракты. Усовершенствование этого подхода, безусловно, актуально для получения достаточных количеств меченых белков с целью их последующей идентификации.

Целью данной работы являлось совершенствование метода высокоселективной и эффективной модификации ДНК-полимераз, основанного на использовании фотохимической сенсибилизации, в реконструированных системах на примере ДНК-полимеразы р, ДНК-полимеразы Tte из Thermus thermophilus В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии факторов репликации ДНК, а также идентификации ДНК-полимераз этим методом в клеточных и ядерных экстрактах.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: • повышение селективности модификации различных ДНК-полимераз в присутствии других ДНК-связывающих белков; подбор оптимальных структур реагентов и сенсибилизаторов для создания новых, наиболее эффективных пар фотореагент - сенсибилизатор; увеличение эффективности модификации ДНК-полимераз в условиях избытка реагента; фотосенсибилизированная модификация каталитических субъединиц ДНК-полимераз в многокомпонентных системах, таких как ДНК-полимераза а-праймаза, клеточный экстракт фибробластов мыши и ядерный экстракт семенников крупного рогатого скота.

выводы

1). Проведена селективная модификация ДНК-полимераз с использованием бинарной системы фотоаффинных реагентов, состоящей из фотореакционноспособного праймера и аналога dNTP, несущего сенсибилизатор.

Бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет селективно модифицировать каталитическую субъединицу четырехсубъединичной ДНК-полимеразы а-праймазы, в то время как прямая модификация приводит к мечению трех субъединиц этого фермента. Впервые с помощью бинарной системы фотореагентов проведена высокоселективная аффинная модификация термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus В35 и ДНК-полимеразы а-праймазы в присутствии репликативного белка А.

2). Впервые показано, что использование бинарной системы фотоаффинных реагентов позволяет повысить эффективность модификации ДНК-полимераз по сравнению с прямым мечением фермента фотореакционноспособным праймером.

Наибольшая эффективность фотопришивки наблюдается при использовании в качестве фотореагента ДНК-праймера, несущего на З'-конце остаток FAB-4-dUMP, а в качестве сенсибилизатора - Pyr-6-dUTP. В условиях 10-кратного избытка праймера по отношению к ферменту такая бинарная система фотоаффинных реагентов позволяет достичь 30%-ого уровня мечения ДНК-полимеразы р, что в ~2 раза выше уровня прямого мечения, достигаемого в более жестких условиях (>.=334-365 нм).

3). Продемонстрирована возможность селективной модификации ДНК-полимераз в клеточном и ядерном экстрактах с применением бинарной системы фотоаффинных реагентов.

При использовании бинарной системы фотоаффинных реагентов в экстрактах клеток и ядер наблюдается повышение интенсивности модификации ДНК-полимеразы р, тогда как в условиях прямого мечения фотореакционноспособные ДНК - интермедиаты эксцизионной репарации оснований ковалентно присоединялись к ДНК-полимеразе р, флэп-эндонуклезе-1, АР-эндонуклеазе-1 и поли-(АБР-рибозо)-полимеразе-1. Таким образом, с помощью предлагаемого подхода, ДНК-полимераза Р выявлена как ключевой фермент в инициации ресинтеза ДНК в длиннозаплаточной репарации оснований.

4). Предложена новая пара реагент — сенсибилизатор для модификации ДНК-полимераз.

Впервые в качестве фотореагента в бинарной системе был использован аналог dUTP. содержащий 4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридильную группу (FAP-8-dUTP), а в качестве сенсибилизатора — аналог dUTP, содержащий пиренильную группу (Pyr-6-dUTP), что позволило повысить эффективность модификации ДНК-полимеразы р в экстрактах клеток и ядер.

1. Diffley J.F.X. Affinity labeling the DNA polymerase alpha complex. Identification of subunits containing the DNA polymerase active site and an important regulatory nucleotide-bindingsite // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 19126-19131.

2. Basu A., Modak M.J. Identification and amino acid sequence of the deoxynucleoside triphosphate binding site in Escherichia coli DNA polymerase I. II Biochemistry. 1987. V. 26. P. 1704-1709.

3. Basu S., Basu A., Modak M.J. Pyridoxal 5 '-phospate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: Identification of lysine-635 as an essential residue for the processive mode of DNA synthesis. II Biochemistry. 1988. V. 27. P. 6710-6716.

4. Pandey V.N., Modak M.J. Affinity labeling of Escherichia coli DNA polymerase I by 5 '-fluorosulfonylbenzoyladenozine. Identification of the domain essential for polymerization and Arg-682 as the site of reactivity. H J. Biol. Chem. V. 263. P. 6068-6073.

5. Knorre D.G., Lavrik O.I., Nevinsky G.A. Protein-nucleic interaction in reaction catalysed with DNA polymerases. 11 Biochimie. 1988. V. 70. P. 655-661.

6. Невинский Г.А., Доронин C.B., Лаврик О.И. ДНК-полимераза I Е. coli: зависимость от праймер-матричного комплекса инактивации фермента имидазолидами дезоксинуклеозид-5'-трифосфатов. // Биополимеры и клетка. 1985. Т. 1. № 5. С. 247253.

7. Doronin S.V., Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Podust V.N. The efficiency of dNTP complex formation with human placenta DNA polymerase a as demonstrated by affinity modification. IIFEBS Lett. 1987. V. 216. P. 221-224.

8. Захаренко A.JI. // Диссертация на соискание степени кандидата химических наук.

9. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Исследование взаимодействая репликативного белка А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов dTTP Н Биоорган, химия. 1998. Т. 65. С.160-163.

10. Kolpashchikov D.M., Weisshart K., Nasheuer H.P., Khodyreva S.N., Fanning E., Favre A., Lavrik O.I. Interaction of the p70 subunit of RPA with a DNA template directs p32 to the З'-end of nascent DNA II FEBS Lett. 1999. V. 450. P. 131-134.

11. Kolpashchikov D.M., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Y., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. Polarity of human replication protein A binding to DNA И Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 373-379.

12. Колпащиков Д.М., Ходырева C.H., Лаврик О.И. Репликативный белок А связывает одноцепочечную ДНК полярно II Доклады академии наук. 2000. Т. 372. С. 824-826.

13. Колпащиков Д.М., Пестряков П.Е., Власов В.А., Ходырева С.Н., Лаврик О.И. Исследование взаимодействия репликативного фактора А человека с ДНК с применением новых фотореакционноспособных аналогов ТТР II Биохимия. 2000. Т. 65. С. 194-198.

14. Wold M.S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism II Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.1. J"

15. Lee S.H., Pan Z.Q., Kwong A.D., Burgers P.M., Hurwitz J. Synthesis of DNA by DNA polymerase epsilon in vitro //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 22707-22717.

16. Tsurimoto Т., Stillman B. Multiple replication factors augment DNA synthesis by the two eukaryotic DNA polymerases, alpha and delta // EMBO J. 1989. V. 8. P. 3883-3889.

17. Blackwell L.J., Borowiec J.A. Human replication protein A binds single-stranded DNA in two distinct complexes И Mol. Cell Biol. 1994. V. 14 P. 3993-4001.

18. Blackwell L.J., Borowiec J.A., Masrangelo I.A. Single-stranded-DNA binding alters human replication protein A structure and facilitates interaction with DNA-dependent protein kinase II Mol. Cell Biol. 1996. V. 16 P. 4798-4807.

19. Bullock P.A. The initiation of simian virus 40 DNA replication in vitro II Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1997. V. 32. P. 503-568.

20. Kolpashchikov D.M., Hughes P., Favre A., Baldacci G., Lavrik O.I. Localization of the large subunit of replication factor С near the 5' end of DNA primers. II J. Mol. Recognit. 2001. V. 14. P. 239-244.

21. Mossi R., Keller R.C., Ferrari E., Hubscher U. DNA polymerase switching: II. Replication factor С abrogates primer synthesis by DNA polymerase alpha at critical length. II J. Mol. Biol. 2000. V. 295. P. 803-814.

22. Doerhoefer S, Windisch C, Angerer B, Lavrik OI, Lee BS, Holler E. The DNA-polymerase inhibiting activity of poly(beta-l-malic acid) in nuclear extract during the cell cycle of Physarum polycephalum. II Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 1253-1258.

23. Persinger J., Bartolomew B. Mapping the contacts of yeast TFIIIB and RNA polymerase III at various distances from the major groove of DNA by DNA photoaffinity labeling // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 33039-33046.

24. Zlotkin Т., Kaufmann G., Jiang Y., Lee M.Y.W.T., Uitto L., Syvaoja J., Dornreiter I., Fanning E., Nethanel T. DNA polymerase epsilon may be dispensable for SV40- but not cellular-DNA replication I IEMBO J. 1996. V. 15. P. 2298-2305.

25. Mass G., Nethanel Т., Kaufmann G. The middle subunit of replication protein A contacts growing RNA-DNA primers in replicating simian virus 40 chromosomes II Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 6399-6407.

26. Mass G., Nethanel Т., Lavrik O.I., Wold M.S., Kaufmann G. Replication protein A modulates its interface with the primed DNA template during RNA-DNA primer elongation in replicating SV40 chromosomes II Nucleic Acids Res. 2001. V. 29. P. 3892-3899.

27. Lavrik O.I., Prasad R„ Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoaffinity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate II J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25541-25548.

28. Rando R.R. Chemistry and enzymology ofkcat inhibitors I I Science. 1974. V. 185. P. 320324.

29. Phillips A.T. Differential labeling: a general technique for selective modification of binding sites. II Methods of Enzymol. 1977. V. 46. P. 59-69.

30. Radzicka A. and Wolfenden R. Transition state and multisubstrate analog inhibitors II Methods of Enzymol. 1995. V. 249. P. 284-312.

31. Rando R. Mechanism-based irreversible enzyme inhibitors. 11 Methods of Enzymol. 1977. V. 46. P. 28-41.

32. Grachev M.A., Kolocheva T.I., Lukhtanov E.A., Mustaev A.A. Studies on the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. Highly selective affinity labelling by analogues of initiating substrates // Eur. J. Biochem. 1987. V. 163. P. 113-121.

33. Severinov K., Fenyo D., Severinova E., Mustaev A., Chait B.T., Goldfarb A., Darst S.A. The sigma subunit conserved region 3 is part of "5'-face" of active center of Escherichia coli RNA polymerase. II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 20826-20828.

34. Kashlev M., Lee J., Zalenskaya K., Nikiforov V., Goldfarb A. Blocking of the initiation-to-elongation transition by a transdominant RNA polymerase mutation. // Science. 1990. V. 248. P. 1006-1009.

35. Mustaev A., Kashlev M., Zaychikov E., Grachev M., Goldfarb A. Active center rearrangement in RNA polymerase initiation complex II J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 19185-19187.

36. Severinov K., Mustaev A., Severinova E., Kozlov M., Darst S.A., Goldfarb A. The beta subunit Rif-cluster I is only angstroms away from the active center of Escherichia coli RNA polymerase И J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 29428-29432.

37. Severinov K., Mustaev A., Kashlev M., Borukhov S., Nikiforov V., Goldfarb A. Dissection of the beta subunit in the Escherichia coli RNA polymerase into domains by proteolytic cleavage II J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 12813-12819.

38. Schuster G.B., Platz M.S. Photochemistry of phenyl azides // Advances in photochem. 1992. V. 17. P. 69-143.

39. Doronin S.V„ Dobrikov M.I., Lavrik O.I. Photoaffmity labeling of DNA polymerase alpha DNA primase complex based on the catalytic competence of a dNTP reactive analog II FEBS Lett. 1992. V. 313. P. 31-33.

40. Doronin S. V., Dobrikov M. I., Buckle M., Roux P., Buc H., Lavrik О. I. Affinity modification of human immunodeficiency virus reverse transcriptase and DNA template by photoreactive dCTP analogs H FEBS Lett. 1994. V. 354. P. 200-202.

41. Foiani М., Lindner A.J., Hartmann G.R., Lucchini G., Plevani P. Affinity labeling of the active center and ribonucleoside triphosphate binding site of yeast DNA primase II J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 2189- 2194.

42. Лаврик О.И., Захаренко А.Л., Прасад P., Власов B.A., Богачев B.C., Фавр A. dNTP, ковалентно присоединенные к ДНК-полимеразам через основание, активны в реакциях нуклеотидильного переноса II Молекуляр. биология. 1998. Т. 32. С. 621-628.

43. Goeldner М.Р., Hirth C.G. Specific photoaffinity labeling induced by energy transfer: application to irreversible inhibition of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1980. V. 77. P. 6439-6442.

44. Kotzyba-Hibert F., Lagenbuch-Cachat J., Jaganathen J., Goeldner M., Hirth C. Aryldiazonium salts as photoaffinity labels of the nicotinic acetylcholine receptor PCP binding site IIFEBS Lett. 1985. V. 182. P. 297-301.

45. Peng L., Alcaraz M.L., Klotz P., Kotzyba-Hibert F., Goeldner M. Photochemical labeling of membrane-associated and channel-forming domains of proteins directed by energy transfer H FEBS Lett. 1994. V. 346. P. 127-131.

46. Schalk I., Ehret-Sabatier L., Bouet F., Goeldner M., Hirth C. Trp279 is involved in the binding of quaternary ammonium at the peripheral site of Torpedo marmorata acetylcholinesterase II Eur. J. Biochem. 1994. V. 219. P. 155-159.

47. Langenbuch-Cachat J., Bon C., Mulle C., Goeldner M., Hirth C., Changeux J.P. Photoaffinity labeling of the acetylcholine binding sites on the nicotinic receptor by an aryldiazonium derivative //Biochemistry. 1988. V. 27. P. 2337-2345.

48. Raviv Y., Salomon Y., Gitler C., Bercovici T. Selective labeling of proteins in biological systems by photosensitization of 5-iodonaphthalene-l -azide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 6103-6107.

49. Riordan J.R., Deuchars К., Kartner N., Alon N., Trent J., Ling V. Amplification of P-glycoprotein genes in multidrug-resistant mammalian cell lines II Nature. 1985. V. 316. P. 817-819.

50. Raviv Y., Pollard H.B., Bruggemann E.P., Pastan I., Gottesman M.M. Photosensitized labeling of a functional multidrug transporter in living drug-resistant tumor cells II J. Biol. Cheme. 1990. V. 265. P. 3975-3980.

51. Bercovici Т., Gitler C. 5-125I.Iodonaphthyl azide, a reagent to determine the penetration ofproteins into the lipid bilayer of biological membranes II Biochemistry. 1978. V. 17. P. 1484-1489.

52. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized photomodification of single-stranded DNA by a binary system of oligonucleotide conjugates II Antisense Nucleic Acid Drug. Dev. 1997. V. 7. P. 309-317.щ

53. Захаренко A.JL, Колпащиков Д.М., Ходырева С.Н., Лаврик О.И., Менендес-Ариас Л. Исследование dNTP-связывающего участка обратной транскриптазы ВИЧ-1 с помощью фотореакционноспособных аналогов dNTP И Биохимия. 2001. Т. 66. С. 1227-1237.

54. Huang H., Chopra R., Verdine G. L., Harrison S. Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance 11 Science. 1998. V. 282. P. 1669-1675.

55. Драчкова И.А., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Захаренко А.Л., Шишкин Г.В.,

56. Назаркина Ж.К., Петрусева И.О., Сафронов И.В., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Исследование взаимодействия флэпэндонуклеазы-1 с репликативным белком А с использованием фотоактивных интермедиатов репарации ДНК // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1136-1146.

57. Lebedeva N.A., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. АР endonuclease 1 has no biologically significant 3'-5'-exonuclease activity // Biochem. Biophys. Res. Com. 2003. V. 300, P. 182-187.

58. Суханова M.B., Ходырева C.H., Прасад P., Вилсон С.Г., Лаврик О.И. TIonu(ADP-рибоза)-полимераза-1 ингибирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый ДНК-полимеразой /3// Биохимия. 2003. в печати.

59. Henricksen L.A., Umbricht С.В., Wold M.S. Recombinant replication protein A: expression, complex formation, and functional characterization II J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P.11121-11132.

60. Ямщиков В.Ф., В кн. Методы молекулярной генетики и генной инженерии, (под ред. Салганика Р.И.) // Наука. Москва. 1990. С. 112-114.

61. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

62. Grimm E, Arbuthnot P. Rapid purification of recombinant Taq DNA polymerase by freezing and high temperature thawing of bacterial expression cultures // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 4518-4519.

63. Речкунова Н.И., Акишев А.Г., Лебедева H.A., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Лаврик О.И. Термостабильная ДНК-полимераза из Thermus thermophilus В35: выделение и изучение свойств //Биохимия. 1998. Т. 63. С.1490-1495.

64. Prasad R., Lavrik O.I., Kim S.J., Kedar P., Yang X.P., Vande Berg B.J., Wilson S.H. DNA polymerase beta -mediated long patch base excision repair. Poly(ADP-ribose)polymerase

65. Sawaya M.R., Prasad R., Wilson S.H., Kraut J., Pelletier H. Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with gapped and nicked DNA: evidence for an induced fit mechanism. И Biochemistry. 1997. V. 36. P. 11205-11215.

66. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции /I Успехи химии. 1998. Т. 67. С. 486-502.

67. Lakowicz, J.R. Principles of Fluorescence Spectroscopy 11 Kluwer Academic. New York. 1999. P. 13-14.

68. Сафронов И.В. Конструирование фотоаффинных реагентов для исследования комплексов матрично-зависимого синтеза нуклеиновых кислот. Производныеd)NTP, несущие перфторазидоарилъные группы II Дис. к-та хим. наук. НИБХ СО РАН, 1999. С. 60-70.

69. Favre A., Saintome С., Fourrey J.-L., Clivio P., Lauga P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions. // J. Photochem. Photobiol. B:Biol. 1998. V. 42. P. 109-124.

70. Pelletier H., Sawaya M.R., Wolfe W., Wilson S.H., Kraut J. Crystal structure of human DNA polymerase p complexed with DNA: implications for catalytic mechanism, processivity and fidelity 11 Biochemistry. 1996. V. 35. P. 12742-12761.

71. Wold M. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism //Annu. Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 61-92.

72. Collins K.L., Russo A.A.R., Tseng B.Y., Kelly T.J. The role of the 70 kDa subunit of human DNA polymerase alpha in DNA replication // EMBO J. 1993. V. 12. P. 4555-4566.

73. Kaguni L.S., Rossignol J.-M., Conaway G.R., Banks G.R., Lehman I.R. Association of DNA primase with the beta/gamma subunits of DNA polymerase alpha from Drosophila melanogaster embryos // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9037-9039.

74. Tseng B.Y., Ahlem C.N. DNA primase from mouse cells. Purification and partial characterization // J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 9845-9849.

75. Lehman I.R., Kaguni L.S. DNA polymerase alpha И J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 42654267.

76. Copeland W.C., Wang T.S.F. Enzymatic characterization of the individual mammalian primase subunits reveals a biphasic mechanism for initiation of DNA replication // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. 26179-26189.

77. Nasheuer H.-P., Grosse F. DNA polymerase alpha-primase from calf thymus. Determination of the polypeptide responsible for primase activity // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 8981

78. Santocanale С., Foiani M., Luchini G., Plevani P. The isolated 48,000-dalton subunit of yeast DNA primase is sufficient for RNA primer synthesis И J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1343-1348.

79. Schneider A., Smith R.W.P., Kautz A.R., Weisshart K., Grosse F., Nasheuer H.-P. Primase activity of human DNA polymerase alpha-primase. Divalent cations stabilize the enzyme activity of the p48 subunit // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 21608-21615.

80. Wang T.S. Eukaryotic DNA polymerases U Annu. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 513-552.

81. Wilson S.H. Mammalian base excision repair and DNA polymerase beta H Mutat. Res. 1998. V. 407. P. 203-215.

82. Srivastava D.K., Berg B.J., Prasad R., Molina J.T., Beard W.A., Tomkinson A.E., Wilson S.H. Mammalian abasic site base excision repair. Identification of the reaction sequence and rate-determining steps // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 21203-21209.

83. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. 1993. V. 362. P. 709-715.

84. Demple В., Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology II Annu. Rev. Biochem. 1994. V. 63. P. 915-948.

85. Wilson III D.M., Thompson L.H. Life without DNA repair // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 12754-12757.

86. Biade S., Sobol R.W., Wilson S.H., Matsumoto Y. Impairment of proliferating cell nuclear antigen-dependent apurinic/apyrimidinic site repair on linear DNA II J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 898-902.

87. Dianov G.L., Prasad R., Wilson S.H., Bohr V.A. Role of DNA polymerase beta in the excision step of long patch mammalian base excision repair II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 13741-13743.

88. Matsumoto Y., Kim K., Hurwitz J., Gary R., Levin D.S., Tomkinson A.E., Park M.S. Reconstitution of proliferating cell nuclear antigen-dependent repair of1. БЛАГОДАРНОСТИ

89. Автор выражает искреннюю благодарность своим научным руководителям Лаврик Ольге Ивановне и Речкуновой Надежде Ивановне за помощь в написании диссертационной работы, за обсуждение постановки экспериментов, а также просто за их человечность.

90. Особая благодарность Буневой Валентине Николаевне и Моор Нине Александровне за внимательное прочтение работы, ценные советы и замечания.

91. Автор глубоко благодарен Ученому совету Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, который смог понять и оценить данную работу.