Синтез новых аффинных фотореагентов на основе аналогов ТТР для исследования белково-нуклеиновых взаимодействий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ СО РАН

На правах рукописи

Колпащиков Дмитрий Михайлович СИНТЕЗ НОВЫХ АФФИННЫХ ФОТОРЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АНАЛОГОВ ТТР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВО-НУКЛЕИНОВЫХ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ

/02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ/

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: профессор, доктор хим. наук О.И. Лаврик

Новосибирск 1999

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ........................................................................................................................................2

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ...............................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ КАК ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ БИОПОЛИМЕРОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)..............................8

1.1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ. ЕЕ МЕСТО В РЯДУ ДРУГИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ. ЦЕЛИ НАСТОЯЩЕГО ОБЗОРА.....................................8

1.2. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ. НЕКОТОРЫЕ ПРИМЕРЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ.....................................................................................................................................10

1.2.1. "Прямые фотосшивки"...........................................................................................................10

1.2.2. Реагенты, содержащие 4-тиоурацш...................................................................................18

1.2.3. Нуклеиновые кислоты, содержащие 5-бромурацш............................................................25

1.2.4. Фотореагенты на основе З-трифторметил-З-аршдиазиринов.......................................30

1.2.5. Реагенты на основе арилазидов............................................................................................34

1.3. ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ МЕТОДА....................................................................................47

1.3.1. Флеш фотолиз как метод регистрации перестройки конформаций биополимеров.......47

1.3.2. Введение фотореакционноспособных групп в белки............................................................49

1.3.3. Методы высокоселективного аффинного мечения.............................................................51

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................................54

2.1. МАТЕРИАЛЫ................................................................................................................................54

2.2. МЕТОДЫ........................................................................................................................................55

2.3. СИНТЕЗ АРИЛАЗИДОВ НА ОСНОВЕ 3-ХЛОР-4-АЗИДО-2,5-ДИФТОРПИРИДИНА.......56

2.4. СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ТТР, ЗАМЕЩЕННЫХ ПО 5-ОМУ ПОЛОЖЕНИЮ УРИДИНА....... 56

2.5. ФОТОЛИЗ ФОТОРЕАГЕНТОВ...................................................................................................63

2.6 ИССЛЕДОВАНИЕ СУБСТРАТНЫХ СВОЙСТВ АНАЛОГОВ ТТР........................................ 63

2.6.1. Синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой из Ткегтш ЖгторЬИт......................63

2.6.2. Проверка субстратных свойств ЫАВ-п-сШТР для ДНК-полимеразы [5 крысы................64

2.6.3. Измерение констант Михаэлиса для аналогов ТТР............................................................64

2.7. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ...................................................64

2.7.1. Фотоаффинная модификация ДНК- полимеразы из ТЪегтш 17пеггпоркИи8.......................64

2.7.2. Фотоаффинная модификация ДНК-полимеразы ¡3 крысы.................................................65

2.8. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ РЕПЛИКАТИВНОГО БЕЛКА А ЧЕЛОВЕКА.......65

2.9. СЕНСИБИЛИЗИРОВАННАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ.......................65

ГЛАВА 3. СИНТЕЗ АФФИННЫХ ФОТОРЕАГЕНТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ ДНК-ПОЛИМЕР A3 И РЕПЛИКАТИВНОГО БЕЛКА А ЧЕЛОВЕКА (РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ)............................................................................................66

3.1. СИНТЕЗ АНАЛОГОВ ТТР С ВАРИАБИЛЬНОЙ ДЛИНОЙ ЛИНКЕРА МЕЖДУ ОСНОВАНИЕМ И ФОТОАКТИВНОЙ ГРУППОЙ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛОК-НУКЛЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ.............................................................66

3.1.1. Синтез аналогов ТТР, содержащих 2-нитро-5-азидобензоипъный остаток, соединенный с 5-ым положением урацила линкерами различной длины (NAB-n-dUTP)...................................67

3.1.2. Исследование субстратных свойств NAB-n-dUTP для эукариотической ДНК-полимеразы ¡3.....................................................................................................................................69

3.1.3. Фотоаффинная модификация ДНК-полимеразы fiuRPA..................................................70

3.1.4. Использование аналогов ТТР для идентификации двух конформаций RPA......................79

3.2. ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ МОДИФИКАЦИИ ПУТЕМ ВАРЬИРОВАНИЯ ПРИРОДЫ АРИЛАЗИДОГРУППЫ....................................................................................................82

3.2.1. Получение арилазидов на основе 3-хлор-2,4,5,6-тетрафторпиридина.............................83

3.2.2. Получение аналогов ТТР, содержащих в качестве реакционноспособных групп З-хлор-4-азидо-2,5-дифторпиридин-б-ил (FAP-7-dUTP, FAP-8-dUTP) и 4-азидо-2,3,5,б-тетрафтор-бензоил (FAB-4-dUTP). Исследование их фотохимических и субстратных свойств................85

3.2.3. Фотоаффинная модификация ДНК-полимеразы из Thermus thermophilics с использованием FAP-7-dUTP и FAP-8-dUTP..................................................................................90

3.3. ПРИМЕНЕНИЕ БИНАРНОЙ СИСТЕМЫ ФОТОАФФИННЫХ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНОЙ МОДИФИКАЦИИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ.............................................93

3.3.1. Принципиальная схема фотосенсибилизированной модификации ДНК-полимераз.........93

3.3.2. Синтез аналога ТТР, содержащего остаток пирена и его субстратные свойства для ДНК-полимеразы ¡3 крысы................................................................................................................99

3.3.3. Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимераз.................................................99

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................................106

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................107

БЛАГОДАРНОСТИ.............................................................................................................................121

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ-спектр - ультрафиолетовый спектр поглощения

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

РСА -рентгеноструктурный анализ

УФ-свет - ультрафиолетовый свет

ПАГ(Э) - полиакриламидный гель (электрофорез)

ИКК - интеркомбинационная конверсия

НК - нуклеиновая кислота

ДЦК - N,N'-дициклогексилкарбодиимид

SucONAB - N-гидроксисукцинимидный эфир 2-нитро-5-азидобензойной кислоты

ТЭАБ - триэтиламмонийбикарбонат

ТЭА - триэтиламин

DMF - диметилформамид

dUTP - дезоксиуридин-5'-трифосфат

(d)NTP - (дезокси)нуклеозид-5'-трифосфат

ТТР - тимидин-5'-трифосфат

s4U - 4-тиоурацил

BrU - 5-бромурацил

TMP - тимидин-5'-монофосфат

Tte ДНК-полимераза - ДНК-полимераза из экстремально термофильной бактерии Thermus

thermophilus В - 35

пол ß - ДНК-полимераза ß крысы

ДНК ПК - ДНК-зависимая протеинкиназа

RPA - репликативный белок А человека

ВВЕДЕНИЕ

Изучение деталей функционирования белок-нуклеиновых комплексов в составе надмолекулярных структур является важнейшей фундаментальной задачей современной молекулярной биологии. Основными методами исследования таких структур являются методы рентгеноструктурного анализа, сайт-направленного мутагенеза и аффинной модификации.

Фотоаффинное мечение белков - удобная и широко применяемая разновидность метода аффинной модификации. Преимущество этого подхода состоит в том, что фотореагенты до облучения светом являются инертными и их фотоприсоединение можно осуществить после формирования правильного комплекса фермент-субстрат (белок-лиганд). Это упрощает в большинстве случаев интерпретацию полученных данных. В связи со сложностью биологических объектов и широким распространением метода фотоаффинного мечения актуальным становится выбор наиболее удобных фотореакционноспособных групп. В практике аффинной модификации широко используются прямые фотосшивки ДНК-белок, а также фотореагенты на основе 4-тиоурацила, 5-бромурацила, реагенты на основе арилазидов и фотореагенты, генерирующие карбены [1, 2]. Преимуществами фотореагентов, содержащих в качестве реакционноспособной группы арилазиды, являются возможность вариации типа арилазидогруппы, а также длины линкера, соединяющего эту группу с аффинной частью реагента [3], и, как следствие этого, возможность вариации эффективности и селективности модификации биополимеров.

Ранее были получены аналоги сШТР, содержащие фотореакционноспособные арилазидогруппы [4, 5]. Производные пиримидиновых нуклеозид-5'-трифосфатов, содсржзгцис объемные ароматические заместители по гетероциклическому основанию, являются эффективными субстратами всех исследованных ДНК-полимераз. Это свойство было использовано для синтеза праймеров, содержащих на З'-конце

фотореакционноспособную группу, с целью последующего их применения для аффинной модификации ДНК-полимераз [5-8], ДНК-матриц в комплексе с ДНК-полимеразами [7, 9] а также факторов репликации [10]. Разработанный подход был использован для идентификации компонентов репликативного комплекса в ядерном экстракте Ркузагит ро1усерка1ит [11]. Фотохимические характеристики аналогов позволяют проводить УФ-облучение в области, далекой от фотоинактивации белков и нуклеиновых кислот (длина волны света выше 300 нм), однако эффективность модификации белков такими реагентами, как правило, не превышает 10% от общего количества белка [7]. Ранее было отмечено, что вариация типа арилазидогруппы влияет на эффективность фотоаффинной модификации ДНК-мишени [12]. Было бы интересно сравнить эффективность модификации белков фотореагентами, содержащими различные арилазидогруппы, и попытаться повысить эффективность модификации белков, изменяя тип арилазидогруппы.

Использование ряда реагентов, содержащих реакционноспособную группу, связанную линкерами разной длины с гетероциклическим основанием, позволяет получать информацию о строении белок-нуклеиновых комплексов [13]. Используя ряд подобных биоконъюгатов, можно исследовать удаленность того или иного компонента белок-нуклеинового комплекса от аффинной части такого биоконъюгата. Поэтому важным является создание ряда аналогов сЮТР, содержащих реакционноспособную группу, присоединенную к гетероциклическому основанию линкерами разной длины.

Одним из подходов, увеличивающих эффективность модификации биополимеров, является применение бинарной системы фотоаффинных реагентов [14-18]. Ранее такой подход был применен для фотомодификации ДНК-мишени бинарной системой олигонуклеотидных реагентов, комплементарных соседним участкам мишени. Один из олигонуклеотидов содержал фотореагент, второй - фотосенсибилизатор. При облучении светом в специально подобранных условиях энергия изначально поглощается

сенсибилизатором и затем передается на реагент, который в возбужденном состоянии модифицирует ДНК-мишень. Используя такой подход, можно практически количественно модифицировать ДНК-мишень [18].

По нашему мнению, такой подход может быть применен также и для обеспечения селективности модификации биополимеров. При таком способе модификации ковалентное присоединение реагента к мишени будет происходить только в тройном комплексе реагент-мишень-фотосенсибилизатор, и, следовательно, вероятность модификации случайной мишени из раствора резко уменьшается; кроме того, биополимеры, способные связывать только реагент, но не фотосенсибилизатор, не должны модифицироваться в данных условиях.

Целью данной работы явилось создание реагентов на основе аналогов ТТР для изучения белок-нуклеиновых взаимодействий методом фотоаффинной модификации белков. Предполагалось создание (1) ряда реагентов, содержащих 2-нитро-5-азидобензоильную группу, связанную линкерами разной длины с аффинной частью реагента; (11) реагентов с новым типом арилазидогруппы, на основе З-хлор-2,4,5,6-тетрафторпиридина; (ш) бинарной системы фотоаффинных реагентов для высокоселективной модификации ДНК-полимераз. В качестве объектов для апробации этих инструментов нами выбраны белки, отвечающие за метаболизм ДНК в клетке, -ДНК-полимераза из Ткегтш МегторкИш, эукариотические ДНК-полимераза (3, ДНК-полимераза а-праймаза и репликативный белок А человека.

ГЛАВА 1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ КАК ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИЙ БИОПОЛИМЕРОВ (обзор литературы)

1.1. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ. ЕЕ МЕСТО В РЯДУ ДРУГИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ. ЦЕЛИ НАСТОЯЩЕГО ОБЗОРА Изучение деталей строения и функционирования сложных биологических комплексов является важной фундаментальной задачей современной биологии. Методы рентгеноструктурного анализа (РСА), сайт-направленного мутагенеза, аффинной модификации являются основными методами исследования таких структур.

Метод РСА на сегодняшний день дает наиболее полную информацию при изучении строения отдельных биополимеров и их комплексов с лигандами. Однако этот метод пока мало пригоден для изучения сложных многокомпонентных структур из-за сложности получения кристаллов таких комплексов. Есть и другой существенный недостаток РСА -всегда остается сомнение, являются ли данные, полученные для кристаллов, применимыми для комплексов в растворе и, тем более, для взаимодействий in vivo.

Методом сайт-направленного мутагенеза можно получать информацию о функции той или иной аминокислоты, или же о значении того или иного фрагмента полипептидной цепи в функционировании белка. В то же время, белки - мутанты могут иметь изменённую третичную структуру в сравнении с природными, что усложняет интерпретацию полученных результатов. Кроме того, с помощью этого метода вряд ли возможно идентифицировать весь спектр аминокислотных остатков, находящихся в области контакта с субстратом (лигандом). Применение данного подхода пока ограничено при изучении надмолекулярных структур и процессов in vivo.

На протяжении многих лет исследователи используют метод аффинной модификации для исследования специфических взаимодействий между биополимерами или биополимеров с низкомолекулярными лигандами [19]. Этот подход включает в себя (i)

образование специфического комплекса между мишенью (белок, НК) и реагентом (реакционноспособным аналогом биополимера или лиганда), (11) образование ковалентной связи между реагентом и связывающим центром мишени, (ш) идентификация той части биополимера, к которой присоединился реагент. На основании полученных данных делается вывод о месте контакта мишени с реагентом. Изменяя условия комплексообразования и положение реакционноспособной группы в структуре реагента, можно делать выводы о конформациях комплекса мишень-реагент. Этот метод применим также для определения термодинамических параметров комплексообразования биополимер-лиганд; рассмотрение аффинной модификации в таком аспекте выходит за рамки данного обзора.

Основное преимущество применения фотоаффинных реагентов вместо других типов аффинных реагентов (алкилирующих, ацилирующих, арилирующих и т. д.) связано с тем, что фотореагенты до облучения светом инертны и можно индуцировать фотоприсоединение после формирования правильного комплекса биополимер-реагент. Это упрощает в большинстве случаев интерпретацию полученных данных. Кроме того, возможно варьирование скорости фотохимической реакции путем изменения мощности облучения (при этом не меняется или меняется незначительно химический состав реакционной смеси), что также удобно при постановке экспериментов. В данной работе под словом «модификация» («фотомодификация») мы будем подразумевать образование ковалентной связи между реагентом (фотореагентом) и мишенью.

В связи со сложностью постановки экспериментов с живыми организмами большинство работ по исследованию функционирования биополимеров проведено на модельных системах в водных растворах. Однако данные, полученные таким способом, всегда оставляют сомнение в применимости их к реальным биологическим условиям (условиям живой клетки). Ведь реальные процессы осуществляются в сложных надмолекулярных комплексах в окружении липидных мембран и низкомолекулярных

участников биохимических процессов. Адекватное моделирование таких систем in vitro представляется маловероятным. Поэтому лишь результаты исследований в клетке или в клеточных, а также в ядерных экстрактах (сложных системах) могут внушать уверенность в подлинности полученной картины. Создание химических инструментов, способных помочь в исследовании сложных систем, является первоочередной задачей.

Целью данного обзора является рассмотрение фотохимических инструментов, созданных на сегодняшний день для изучения биологических объектов (белков, НК и их комплексов). Особое внимание уделяется возможности применения таких инструментов в сложных системах. Примеры по фотоаффинной модификации взяты из области изучения репликации, транскрипции и трансляции - основных процессов передачи и реализации генетической информации. Все перечисленные процессы являются матричным синтезом биополимеров: ДНК, РНК и белков, соответственно. В природе они осуществляются в процессе работы сложных надмолекулярных комплексов, и состоят из трех основных этапов:

1) инициация (выбор места старта, образование инициаторного комплекса, а также, в случае транскрипции, первые несколько каталитических актов);

2) элонгация (собственно каталитический акт и транслокац