Тандемные системы бинарных олигонуклеотидных производных: исследование закономерностей сенсибилизированной фотомодификации биополимеров тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ГАЙНУТДИНОВ ТИМУР ИМИЛЬЕВИЧ

Тандемные системы бинарных олигонуклеотидныж производных: исследование закономерностей сенсибилизированной фотомодификации

биополимеров

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Новосибирск, 2003 г.

Работа выполнена в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (бывший Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН)

Научные руководители:

д.х.н., академик К.Х.Н.

Власов Валентин Викторович Добряков Михаил Иванович

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор

Д.Х.Н.

Дымшиц Григорий Моисеевич Сильников Владимир Николаевич

Ведущая организация: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Защита состоится « ¡2Ь » 2003 г. в _часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева. 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан « /5Г» 2003 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор химических наук Фёдорова О.С.

~\4fj4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотореакционноспособные производные олигонук-леотидов являются перспективными реагентами для направленной химической модификации определенных последовательностей нуклеиновых кислот и инструментами для исследования структуры и функции биополимеров.

Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов позволяют осуществить фотомодификацию ДНК с повышенной эффективностью (Vlassov et al., 1996; Dobrikov et al., 1997). Принцип подхода заключается в том, что используются два олигонуклеотида, комплементарные соседним участкам ДНК- или РНК-мишени, к одному из которых присоединен сенсибилизатор, к другому - фотореагент. При комплементарном связывании таких пар олигонуклеотидных конъюгатов с нуклеиновой кислотой сенсибилизатор и фотореагент сближаются, в результате чего формируется фотореакционнеспособный центр. Облучение образовавшегося комплекса длинноволновым светом вызывает возбуждение сенсибилизатора с последующей активацией фотореагента за C4ef бёзызлучательного переноса энергии и фотомодификацию биополимера.

Фотомодификация нуклеиновых кислот и белков, взаимодействующих с РНК и ДНК, бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов может быть использована как инструмент в исследовательских, диагностических и терапевтических целях. В условиях in vivo исключительно важно, чтобы фотомодификация инициировалась видимым или ИК-светом, более глубоко проникающим в клетки и не вызывающим, в отличие от коротковолнового УФ, нежелательных побочных эффектов облучения. Поэтому применение бинарных систем олигонуклеотидных конъюгатов активизируемых длинноволновым светом особенно перспективно для использования in vivo.

Целью настоящей работы являлась разработка нового подхода для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты. В соответствии с этим были поставлены задачи:

Разработка новых, активируемых видимым светом, бинарных систем производных олигонуклеотидов для фотосенсибилизированной модификации биополимеров.

Изучение влияния химической структуры сенсибилизатора и влияния последовательности целевой нуклеиновой кислоты на эффективность фотомодификации ДНК-мишени.

Использование бинарных систем конъюгатов олигонуклеотидов для исследования процессов взаимодействия нуклеиновых кислот с клеточными белками in vivo.

Научная новизна и практическая ценность. Разработаны и охарактеризованы новые бинарные системы производных олигонуклеотидов на основе сенсибилизаторов - 3-периленметиламина и 3-аминопропионилгидразон 9-антраценаля, обес-

j ."óС НАЩЮНАЛЬИАЯ i 1 БИБЛИОТЕКА I

I С. Петербург ¿глл I

< ОЭ T0Ó5 >К*ЯХ/ I

печивающих в сочетании с фотореагентом (Ы-(п-азидотетрафторбензаль)-гидразон-N'-пропиониламином) инертность компонентов при облучении видимым светом (более 460 нм) в отсутствие целевого биополимера, но участвующих в формировании активного фотореакционного центра при образовании комплементарного комплекса фотореагент - нуклеиновая кислота - сенсибилизатор. Это позволило осуществить высокоселективную сайт-специфическую модификацию ДНК-мишени. Экспериментально.показано, что использование 9-хлор-10-аминометилантрацена в качестве сенсибилизатора позволяет достичь 100% модификации' ДНК-мишени, содержащей в сайте модификации последовательность (pG)4. " '

Показано, что в отличие от ранее использованных сенсибилизаторов, нерасхо-дуемых в ходе реакции фотомодификации целевой нуклеиновой кислоты, сенсибилизированная 3-аминометилпериленом фотомодификация сопровождается инактивацией сенсибилизатора. Полученные данные позврляют сделать предположение, что наиболее вероятной причиной инактивации ■ сенсибилизатора является фотоокисление периленового остатка вследствие фотоиндуцированного переноса электрона с азидогруппы реагента на электронно-возбужденный сенсибилизатор.

На основе полученных в ходе исследования данных была разработана новая высокоэффективная система для сенсибилизированной фотомодификации биополимеров бинарными системами производных олигонуклеотидов. С использованием этой бинарной системы олигонуклеотидных конъюгатов было исследовано взаимодействие поверхностных белков эукариотических клеток с экстраклеточными нуклеиновыми кислотами. В условиях in vivo продемонстрировано, что белки, связывающие олигонуклеотиды, участвуют и в связывании двуцепочечной ДНК. Публикации и апробация работы. По результатам работы опубликовано 7 статей. Результаты работы были представлены на 2 международных конференциях. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах, содержит 21 рисунок и 2 таблицы, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 195 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-мишени на эффективность сенсибилизированной фотомодификации

Для достижения значимых бйологических эффектов при воздействии на ДНК in vivo необходимо, чтобы эффективность модификации была высокой. При фотомодификации ДНК олигонуклеотидными реагентами эффективность реакции зависит дт реакционной способности реагента по отношению к нуклеотидам целевой последовательности ДНК-мишени и от геометрических параметров комплекса. Ранее было показано, что эффективность прямой фотомодификации ДНК-мишени за

висит от ее последовательности в сайте модификации (предельная степень модификации растет в ряду Т < С, А < в и составляет 40%, 45%, 45% и 65% соответственно (Ьеута е1 а1., 1996)).

Поэтому для разработки подходов, направленных на увеличение эффективности сенсибилизированной фотомодификации ДНК бинарными системами олиго-нуклеотидных конъюгатов нами была исследована зависимость выхода продуктов модификации от состава нуклеотидной последовательности ДНК-мишеней в предполагаемом сайте модификации.

1.1. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишеней М1 и М2

СХЕМА 1

Выбор ДНК-мишеней М1 (нуклеотидная последовательность которой аналогична последовательности регуляторного участка от -96 до -76 гена СУР 102, кодирующего цитохром Р450) и М2, различающихся одним остатком -А12 и С12, был основан на предположении, что присутствие гуано-зина в области формирования фотореакционного центра должно приводить к повышению эффективности модификации ДНК-мишени. Структура ДНК-мишеней и олигонуклеотидных конъюгатов: сенсибилизатора ОЫ-ВгА (несущего остаток N-(5-фтор-12-метилбензо[а]антрацен-7-илацетил)этилендиамина), реагентов ОЬ2-И и ОЬЗ-К (несущих остаток Ы-(4-азидотетрафторбензилиден)-Ы'-(3-аминопропил)гидразина) приведены на схеме 1. Использование ОЫ-ВгА в качестве сенсибилизатора было обусловлено тем, что закономерности сенсибилизированной модификации ДНК-мишени М1, в сочетании с используемым фотореагентом были подробно исследованы ранее (Укввоу е1 а!., 1996; БоЬпкоу е1 а1., 1997).

В результате обработки модифицированных мишеней пиперидином была определена позиционная направленность реакции фотомодификации в комплементарных (М1 + ОЬ2-И); (М1 + ОЫ-ВгА + 01,2-11); (М2 + ОЬЗ-Я); (М2 + ОЫ-ВгА + ОЬЗ-Л) и неполностью комплементарных (М1 + ОЬЗ-Я); (М1 + ОЫ-ВгА +

5' *рАТСТТТААСТв-АТбААСТТСТ М1 3' АСАААТТбАС ТАСТТвААвА Р Р

ои-э (§)<Ю OL2-R

5' *рАТСТТТААСТ6-дТбААСТТСТ М2 3' АбАААТ Т БАС САСТТвААвА Р Р

ои-э

С ЫН(СН2)гМН-

о

сн=ы—ш^сн^нн

ОЬЗ-К); (М2 + ОЬ2-Я); (М2 + ОЫ-ВгА + ОЬ2-К) комплексах (рис. 1). Деградации облученных в отсутствие фотореагентов мишеней М1 (дор. 7) и М2 (дор. 11) не наблюдается. Прямая и сенсибилизированная фотомодификации мишеней М1 и М2 в комплементарных комплексах (панель А) протекают по остатку й" (дор. 1, 2) и по остаткам в", С12 (дор. 5, б, соответственно). Фотомодификация мишеней М1 и М2 в неполностью комплементарных комплексах (панель Б) протекает менее специфично. Основное расщепление ДНК М1 наблюдается по остаткам Оп и Т13, незначительное расщепление происходит по остаткам Т10 и А12 (дор. 8, 9). Обработка пиперидином фотомодифицированной мишени М2 приводит к преимущественному расщеплению по остаткам в", в12 и в меньшей степени по остатку Т13 (дор. 12, 13).

12 3 4 5 6 7 в 9 10 II 12 13 N

шш

> ш Ш ШшшЛ(С)П — ^ — ** ~

тШг ^ИР'ЧИрчИР •

шш

«р щт «»

Рис. 1. Радиоавтограф геля, полученный после пиперидинового расщепления (Ш пиперидин, 95 °С, 30 мин) продуктов фотомодификации 5'-[32Р]-меченых ДНК-мишеней М1 и М2 в комплементарных (А) и неполностью комплементарных (Б) комплексах, облученных в течение 300 мин светом (365-580 нм): М1 + ОЬ2-И - /; М1 + ОЫ-ВгА + OL2-R -2; М2 + ОЬЗ-И - 5; М2 + ОЫ-В/А + ОЬЗ-Н - 6; М1 - 7; М1 + ОЬЗ-Я - 5; М1 + ОЫ-ВгА + ОЬЗ-К -9; М2 - //; М2 + ОЬ2-И - 12; М2 + ОЫ-ВгА + ОЬ2-И - 13; А+О-расщепление ДНК- V мишеней М1 - 3, 10 и М2 - 4, ¡4 Продукты фотомодификации ДНК-мишени анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПААГ

Была изучена фотомодификация мишени М2 комплементарным ей олигонук-леотидным реагентом ОЬЗ-К. Полученные данные были сопоставлены с данными по модификации неполностью комплементарным реагентом ОЬ2-К (рис. 2). Было найдено, что при фотомодификации мишени М2 в комплементарных комплексах (М2 + ОЬЗ-К) и (М2 + ОЫ-ВгА + ОЬЗ-К) начальная скорость и предельная степень модификации (кривые 3, 4) выше, чем в неполностью комплементарных комплексах (М2 + ОЬ2-Я) и (М2 + ОЫ-ВгА + ОЬЗ-К) (кривые 1,2, соответственно).

Сравнение количественных параметров фотомодификации двух мишеней оли-гонуклеотидными реагентами в полностью комплементарных комплексах (М1 + ОЬ2-11); (М1 + ОЫ-ВжА + ОЬ2-К); (М2 + ОЬЗ-К) и (М2 + ОЫ-ВгА + ОЬЗ-Я) показывает, что предельная степень сенсибилизированной (рис. 2, кр. 4) и особенно прямой (рис. 2, кр. 3) фотомодификации мишени М2 (75% и 72%) больше, чем мишени М1 (68% и 41%, рис. 1, дор. 7, 12, соответственно). Эффективность фотомодификации возрастает в том случае, когда в предполагаемом месте модификации , ДНК-мишени находятся два остатка в.

Полученные результаты, свидетельствуют о том, что выбор мишени с двумя остатками гуанозина в предполагаемом сайте модификации приводит к повыше-_ нию эффективности модификации.

Рис. 2. Зависимость выхода ковапентных аддуктов при фотомодификации мишени М2 олигонуклеотидными реагентами ОЬ2-Я (кривые 1 и 2) и ОЬЗ-Я (кривые 3 и 4) от времени (полулогарифмические координаты). Прямая фотомодификация: кривые I и 3; фотомодификация, сенсибилизированная конъюгатом ОЫ-ВгА: кривые 2 и 4. Концентрации компонентов: [М2] = 0.1 мкМ, [ОЫ-ВгА] = [01,2-11] = [ОЬЗ-Н] =50 мкМ. Облучение видимым светом 400440 нм. Продукты фотомодификации ДНК-мишени анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПААГ, степень модификации определяли денситометрией радиоавтографа (соответствующий радиоавтограф не представлен).

Время облучении, мин

1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени МЗ

При фотомодификации одноцепочечной ДНК-мишени МЗ бинарной системой олигонуклеотидных реагентов было проверено предположение о том, что дальнейшее увеличение числа гуанозиновых остатков должно существенно повысить степень модификации. В качестве ДНК-мишени МЗ был использован 25-звенный олигодезоксирибонуклеотид, соответствующий фрагменту последовательности мРНК человеческого гена множественной лекарственной устойчивости и несущий в предполагаемом месте модификации тетрануклеотидную (рв)4-последовательность. Фотомодификацию проводили с помощью гептануклеотидных

конъюгатов ОЬ4-А1 и ОЬ5-Н, несущих остатки антрацен-9-ил-метиламина и пер-

Было предложено использовать сенсибилизатор на основе антрацена, поскольку энергия его первого возбужденного состояния (£, = 73 ккал/моль) сопоставима с энергией возбуждения ранее использованного сенсибилизатора Ы-(5-фтор-12-метилбензо[а]антрацен-7-илацетил)этилендиамина (Ех = 72 ккал/моль). Спектр поглощения антрацена сдвинут в длинноволновую область на 10 нм (А.макс 377 и 367 нм, соответственно) по сравнению со спектром поглощения бензантрацена, что позволяет инициировать сенсибилизированную фотомодификацию ДНК светом с большей длинной волны.

Облучение видимым светом комплекса МЗ + ОЬ4-А1 + ОЬ5-И приводило к образованию ковалентных аддуктов (рис. 3). Начальная скорость сенсибилизированной фотомодификации (основано на анализе денситограммы, полученной после обработки приведенного радиоавтографа (данные не представлены)) была примерно в 50 раз выше, чем прямой. Предельный выход ковалентных аддуктов фотомодификации был высоким: в дуплексе МЗ + ОЬ5-И он достигал 82-85% за 200 мин облучения (дор. 7), а в комплексе МЗ + ОЬ4-А1 + ОЬ5-Я - 98-99% за 10 мин облучения (дор. 11-13).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

ттшт т т ш—

Рис. 3. Радиоавтограф геля, полученный после электрофорегического разделения продуктов прямой (2-7) и сенсибилизированной (8-13) фотомодификаций 5'-[32Р]-меченой мишени МЗ при облучении светом диапазона 380-580 нм. Концентрации [МЗ] -1 мкМ, [ОЬ4-А1] и [ОЬ5-К| - 50 мкМ, Т = 21 "С. Время облучения, мин: дор. 2, 8 - 0.1; дор. 3, 9 - 0.5; дор. 4, 10 - 2; дор. 5, 11- 10; дор. 6, 16 - 50; дор. I (мишень МЗ, облучение в отсутствии ОЬ4-А1 и ОЬ5-И), 7, 13- 200. Продукты фотомодификации ДНК-мишени анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПААГ. '' *

фторарилазида И, соответственно. СХЕМА 2

•рАТв<ЗАТТСТТСААвС-в<ЗАССвСАТТ МЗ

ААСТТСС ССТввСв Р Р

ОЬ4-А1 01.5-1*

ссо

ш-

Гк) = N3—^^-с^шнс^снжмн—

Данные, полученные в результате расщепления модифицированных мишеней пиперидином (табл. 1), показывают, что основной точкой прямой фотомодификации в дуплексе МЗ + ОЬ5-Л является остаток С16, находящийся в одноцепочечной части комплекса. Следует отметить, что в обоих комплексах расщепление преимущественно происходит по остаткам О15 и в16 и в меньшей степени по остаткам в'4 и С17.

Таблица 1. Позиционная направленность прямой и сенсибилизированной фотомодификаций ДНК-мишени МЗ после 200 мин облучения светом (365-580 нм) и обработки пиперидином.

Комплексы МЗ + ОЬ5-Я МЗ + ОЬ4-А1 + ОЬ5-Я

Степень модификации после обработки пиперидином,% 76 92

Нерасщепившиеся аддукты, % 25 42

Продукты расщепления пиперидином по основаниям нуклеоти-дов: С14 3 6

С15 10 20

с16 36 20

с" 2 4

Из данных, полученных при фотомодификации трёх ДНК-мишеней, следует, что предельные степени прямой фотомодификации мишеней (М1 - 41%, М2 - 72% и МЗ -85%) возрастают при увеличении количества остатков О в сайте модификации. Предельные степени сенсибилизированной фотомодификации ДНК-мишеней -(68%, 75% и 99%, соответственно) - также возрастают при увеличении количества остатков в в сайте модификации. Во всех случаях степень сенсибилизированной , фотомодификации выше, чем прямой.

Таким образом, высокая эффективность сенсибилизированной фотомодификации ДНК-мишени МЗ определяется наличием четырех остатков гуанозина в сайте « модификации, в-специфичностью фотореагента и тем, что каждая молекула сенсибилизатора способна инициировать модификацию до 10 молекул мишени (данные не приведены). Предлагаемая конструкция фотореакционноспособного центра может способствовать дополнительному увеличению специфичности сенсибилизированной фотомодификации за счет того, что любая замена остатков гуанозина в мишени МЗ будет приводить не только к снижению стабильности неполностью комплементарного комплекса, но и к снижению выхода модификации такой ДНК-мишени вследствие более низкой эффективности реакции перфторароматических азидов по другим нуклеотидным остаткам.

2. Влияние строения сенсибилизатора на скорость и эффективность сенсиби-

лизированной фотомодификации ДНК

Ключевым моментом при разработке бинарных систем, активируемых видимым светом, является поиск химических соединений, способных выступить в качестве сенсибилизатора в данных условиях. Для реализации рациональных подходов к поиску таких соединений необходимо исследовать как химическое строение и спектрально-люминесцентные свойства сенсибилизатора влияют на скорость, эф- • фективность и спектральную зависимость сенсибилизированной фотомодификации нуклеиновых кислот.

Далее представлены результаты исследования влияния различных заместите- '< лей в антраценовом остатке сенсибилизатора на скорость и эффективность сенсибилизированной фотомодификации ДНК-мишени с помощью бинарной системы олигонуклеотидных производных.

2.1. Влияние заместителей в антраценовом остатке

Было изучено влияние введения в 9 и(или) 10 положение антраценового ядра различных заместителей (аминометильной или аминопропионилгидразоновой групп; атома С1) на эффективность сенсибилизированной фотомодификации.

В качестве мишени был использован синтетический 25-звенный дезокси-рибоолигонуклеотид МЗ. Строение сенсибилизаторов представлено на схеме 3 (строение мишени МЗ, олигонуклеотидов ОЬ4 и ОЬ5 и фотореагента идентично структурам, представленным на схеме 2).

СХЕМА 3

©- О^О

у

конъюгат X У ^-макс

ОЫ-А1 н- -сн2-ын- 388

ОМ-А2 С1- -СНгШ- 403

ОЬ4-АЗ н- -СН=ШНСО(СН2)2Ш- 392

ОЫ-А4 С1- -СН=ШНСО(СН2),ГчН- 404

Введение аминометильной группы в антраценовое ядро вызывает длинноволновый сдвиг максимума поглощения на 7 нм (А1), введение 3-аминопропионилгидразоновой группы - длинноволновый сдвиг максимума поглощения на 10 нм (АЗ). Хлорирование антрацена приводит к батохромному сдвигу на 8-11 нм (А2 и А4). Наличие атома хлора и аминометильной группы приводит к увеличению интенсивности флуоресценции (А2), в то время как наличие гидразоно группы на два порядка снижает ее интенсивность (АЗ и А4). Стоксов сдвиг (разни-

ца между максимумом флуоресценции и максимумом поглощения) для аминоме-тильных производных составляет 31-33 нм и для гидразонопроизводных - 77-78 нм. Эти данные свидетельствуют о том, что для аминометильных производных А1, А2 безызлучательные потери энергии в фотовозбужденном состоянии меньше, чем для гидразонопроизводных АЗ, А4.

Методом гашения флуоресценции антрацена и его производных А1-А4 перфторарилазидом ЯН (схема 3) были оценены значения эффективных констант переноса энергии (КЭфф). Полученные значения представлены в таблице 2. Видно, что значение констант падает при увеличении длины волны максимума флуоресценции (Хя).

С целью оценки влияния заместителей в 9 и 10 положении остатка антрацена (схема 3: X и У) на эффективность переноса энергии было изучено накопление ковалентных аддуктов в ходе сенсибилизированной и прямой фотомодификаций (рис 4). Присоединение производных антрацена (А1-А4) к олигонуклеотиду ОЬ4 приводило к батохромному смещению максимума поглощения сенсибилизатора на 7-10 нм (схема 3). Поэтому облучение проводилось в том диапазоне длин волн (380-420 нм), в котором располагаются максимумы поглощения олигонуклео-тидных конъюгатов ОЬ4-А1 - ОЬ4-А4.

1 2 3 4 5 6 7 * 9 10 II 12 13 14 11 16 17

- I—1111

МЗ МЭ+ОЬ5 К»014-Л1 МЭ+ОЬ5-И+ОЬ4-А2 МЗ+ОЬ5-Н+ОЫ-АЗ М3+01Л-Н+0Ь4-А4

Рис. 4. Радиоавтограф геля, полученный после электрофоретического разделения продуктов сенсибилизированной (2-17) фотомодификации 5'-[Р32]-меченой мишени МЗ при облучении светом (380-420 нм). Концентрации: МЗ - 1 мкМ, фотореагент ОТ.5-К и сенсибилизаторы ОЬ4-А1 - ОЬ4-А4 - 50 мкМ; Т = 25 °С. Комплексы 1- МЗ; 2-5 - МЗ + ОЬ5-И + 01,4-А1; 6-9 - МЗ + ОЬ5-И + ОЬ4-А2; 10-13 - МЗ + ОЬ5-И + ОЬ4-АЗ; 14-17- МЗ + ОЬ5-И + ОЬ4-А4. Время облучения, мин: дор. 2, 6, 10, 14- 0.2,; дор. 3, 7, 11, 15- 2; дор. 4, 8, 12, 16 -20; дор. 1, 5, 9, 13, 17 - 200. Продукты фотомодификации ДНК-мишени анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПААГ.

Можно констатировать, что предельная степень сенсибилизированной фотомодификации увеличивается в ряду сенсибилизаторов ОЬ4-А4 < ОЬ4-АЗ < ОЬ4-А1 < ОЬ4-А2, достигая для последних двух 98-99% (рис. 4, дор. 6, 9). Возможно низкая эффективность сенсибилизации фотомодификации конъюгата ОЬ4-А4 обу-

словлена тем, что энергия возбужденного состояния этого соединения недостаточна для активации азидогруппы.

Следовательно, с учетом начальной скорости (определенной после денсито-метрической обработки представленного на рис. 4 радиоавтографа) и предельной степени фотомодификации при облучении в максимуме поглощения, наиболее перспективным сенсибилизатором является конъюгат 9-хлорантраценил-10-метиламина ОЬ4-А2.

Несколько иная картина наблюдается при облучении видимым светом в диапазоне длин волн 420-580 нм (рис. 5), где небольшое поглощение наблюдается только для олигонуклеотидных производных 9-антраценальгидразона ОЬ4-АЗ и ОЬ4-А4. Начальная скорость накопления ковалентных аддуктов фотомодификации ДНК- \ мишени увеличивается следующим образом: прямая фотомодификация < ОЬ4-А1 < ОЬ4-А2 < ОЬ4-А4 < ОЬ4-АЗ. Предельная степень модификации для фотореакции, сенсибилизированной олигонуклеотидным производным 9-антраценальгидразон-пропиониламина ОЬ4-АЗ также выше, чем для остальных конъюгатов.

Еще более заметным становятся преимущества соединения ОМ-АЗ как сенсибилизатора при облучении видимым светом с большей длиной волны. При облучении светом с длиной волны более 460 нм (данные не приведены) наблюдается только фотомодификация, сенсибилизированная олигонуклеотидным конъюгатом ОЬ4-АЗ, в то время как ни прямая реакция, ни реакция, сенсибилизированная производными ОЬ4-А1 и ОЬ4-А2, в этих условиях не протекают. По-видимому, это обусловлено тем, что введение гидразоно-группы в антраценовое ядро приводит к расширению полосы поглощения антраценового производного АЗ. Максимальная длина поглощения (А,макс) для этого соединения - 387 нм, при этом полоса поглощения простирается в видимую область, что позволяет сенсибилизировать фотомодификацию при облучении видимым светом с длиной волны >460 нм.

Таким образом, конъюгат ОЬ4-АЗ позволяет высокоспецифично проводить сенсибилизированную фотомодификацию в условиях, когда в отсутствие этого

сенсибилизатора фотореагент практически инертен. >

Рис 5. Зависимость выхода ковалентных аддуктов ДНК-мишени МЗ с олигонуклеотидным производным ОЬ5-Я при прямой (кр. 1) и сенсибилизированной олигонуклеотидными производными ОЫ-А1 (кр. 2), ОЬ4-А2 (кр. 3), 01.4-ЛЗ (кр. 4), и ОЬ4-А4 (кр. 5) фотомодификаций от времени облучения (полулогарифмические координаты). Условия облучения: 420-580 нм. Продукты фотомодификации

ДНК-мишсни анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПААГ, степень модификации определяли денситометрией радиоавтографа (соответствующий радиоавтограф не представлен).

2.2. Использование перилена в качестве сенсибилизатора

В диссертационной работе Гайдамакова С. А. было описано применение в ка* честве сенсибилизатора 3-периленметиламина. Была отмечена высокая эффективность сенсибилизированной этим соединением реакции фотомодификации. В данной части работы предлагается детальное исследование механизмов сенсибилизации производным олигонуклеотида ОЫ-Рег модификации ДНК-мишени М1 фотореагентом ОЬ2-К.

2.2.1. Гашение флуоресценции олигопуклеотидного производного перилена в двуцепочечных комплексах

В качестве мишени был использован синтетический 21-звенный дезоксирибо-олигонуклеотид Ml. Строение ДНК-мишени, олигонуклеотидных конъюгатов, сенсибилизаторов и фотореагента М-(4-азидотетрафторбензилиден)-М'-(3-аминопропил)гидразина (R) представлено на схеме 4.

СХЕМА 4 Спектр поглощения конъюга-

та OLl-Per сдвинут батохромно относительно поглощения исходного перилена (А.макс 433 нм) на 15 нм, следовательно, энергия его возбужденного состояния ниже, чем энергия Е0<0 перилена на 2-3 ккап/моль. В свою очередь энергия возбуждения Eafl перилена ниже, чем энергия Е0>0 ароматических азидов. Следовательно, необходимо было убедиться в способности остатка перилена в составе конъ-югата OLl-Per сенсибилизировать фотодиссоциацию азида. Возможность переноса энергии электронного возбуждения с сенсибилизатора OLl-Per на олигонуклео-тидный реагент OL2-R была показана методом гашения флуоресценции остатка перилена при образовании комплементарных дуплексов (рис. 6, кривые 5-5). В качестве сравнения приведены аналогичные данные для сенсибилизатора OLl-BzA

■¡■♦pATCTTTAACTG-ATGAACTTCT N11 з- AGAAATTGAC TACTTGAAGA P P

OL1-S OL2-R

Per

tfHi

0»CNH(CH2)2NH-

Xya(cs 357 нм

ch2nh-

>-макс- 448 нм

(§7 = N,-<^CH.N-NHClCH,bNH-

(Рис. 6, кривые /, 2), реализующего механизм синглет-синглетного переноса энергии фотовозбужденя. Для каждого соединения использовались максимальные длины волн возбуждения и эмиссии.

IOL21 ¡OL2RI мкМ 4 (lib)

~i) (la) = Ml + OLI'BzA

(16) = M1 + ОИ-Рег

(III) * M1 + OL1 + OL2-R

-*p2R) метка

(lla) = Ml + OLI-BzA + OL2 (II6) «М1 + OL1-Per + OL2

(IVa) = (IV6) =

M1 + OL1-BZA + OL2-R M1 + OL1-Per + OL2-R

Рис. 6. Гашение флуоресценции (F, %) олигонуклеотидных производных 1,2-бензантрацена (OLl-BzA) {1-2) и перилена (OLl-Per) (3-5) при последовательном образовании комплексов (I), (II) и (IV). Концентрации конъюгатов OLl-BzA - 1 и OLl-Per - 0.5 мкМ в 2 мМNa2HP04, рН 7.1, 200 мМ NaCI: 1-2 - lBOj6= 335-345 нм, L,M= 376±5 нм; / - образование дуплекса (1а), 2 - комплекса (IVa). 3-5 - XBOj0 = 445-455 нм, ¡tJM = 485±5 нм; 3 - образование дуплекса (16), 4 - комплекса (Иб), 5 - комплекса (IV6). Стрелкой (4) отмечены точки добавления в реакционную смесь олигонуклеотидного конъюгата OL2-R или олигонуклеотида OL2.

При связывании олигонуклеотидного производного Ы-(5-фтор-12-метилбензо[а]антрацен-7-илацетил)этилендиамина (OLl-BzA) с комплементарной последовательностью Ml наблюдается пятикратное гашение его флуоресценции (кривая ]). Добавление к дуплексу (1а) второго олигонуклеотида, несущего фотореагент, приводит к незначительному дальнейшему гашению флуоресценции (кривая 2). Эти данные подтверждают, что лишь небольшая часть энергии возбуждения остатка бензантрацена переносится на фотореагент.

В случае конъюгата OLl-Per наблюдается другая картина. При образовании дуплекса с ДНК-мишеныо интенсивность флуоресценции гасится всего на 20% (кривая 3), добавление второго олигонуклеотида без фотореагента практически не приводит к дальнейшему гашению флуоресценции сенсибилизатора (кривая 4). Добавление к дуплексу (16) олигонуклеотидного конъюгата OL2-R приводит к дополнительному трехкратному гашению флуоресценции (кривая 5), что свидетельствует об эффективном переносе энергии с остатка перилена на фотореагент в комплементарном комплексе (IV6).

2.2.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени

Для изучения того, каким образом различия в эффективности гашения флуоресценции остатков бензантрацена и перилена отражаются на эффективности модификации нуклеиновых кислот была проведена прямая и сенсибилизированная фотомодификация мишени М1 при облучении видимым светом 440-580 нм в составе дуплексов (16), (III), (IVa) и (IV6). Очевидно (рис. 7), что фотомодификация ДНК фотореагентом OL2-R в комплексе (IV6), сенсибилизированная олигонуклео-тидным производным перилена OLI-Per заканчивается после 1 мин облучения (дорожка 5). Выход ковалентных аддуктов сшивки фотореагента с ДНК-мишенью достигает 70% и не меняется при дальнейшем облучении (дорожки 6 и 7). Ни производное OLI-Per (дорожка 9), ни производное фотореагента OL2-R (дорожка 10) по отдельности не вызывают фотомодификации после 100 мин облучения. Сенсибилизированной производным бензантрацена OLl-BzA фотомодификации ДНК в комплексе (IVa) (дорожки 2-4) в данных условиях не наблюдается.

i 2 j 4 s б 7 s 9 Рис. 7. Радиоавтограф геля, полученный при

электрофоретическом анализе продуктов прямой (9) и сенсибилизированной (2-7) фотомодификации 5'-32Р-меченой мишени М1, инициированной облучением видимым светом (440-580 нм). Концентрации конъюгатов OLl-BzA, OLl-Per, OL2-R и оли-гонуклеотидов OLI, OL2 - 50 мкМ, олигонуклео-тида MI - 1 мкМ: 1 - 5'-32Р-меченая мишень М1, ^ШНЩЩ/^Щ/НШ ШЙРШШ^^Ш т0бл 100 мин; 2-4 - дуплекс с участием OLl-BzA

(IVa), Хобл 1, 10, 100 мин соответственно; 5-7 - комплекс с участием OLl-Per (IV6), т0бл 1, 10, 100 мин соответственно; 8- дуплекс (16), то6л 100 мин; 9 - комплекс (III), то6л 100 мин. Продукты фотомодификации ДНК-мишени анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПА-АГ.

На рис. 8 представлены данные по прямой (кривая 1) и сенсибилизированной олигонуклеотидным производным бензантрацена (кривая 2) и перилена (кривая 3) фотомодификации ДНК-мишени при облучении видимым светом в более широком диапазоне экспозиций (Н). Приведенные данные демонстрируют, что 10%-ный выход продуктов сшивки реагента с мишенью в случае сенсибилизированной периле-ном фотомодификации достигается при lg Н = 0.3 (кривая 3), сенсибилизированной бензантраценом - при lg Н = 4.7 (кривая 2) и при lg Н = 5.7 в случае прямой фотомодификации (кривая 1). Следовательно, скорость сенсибилизированной производным перилена OLl-Per фотомодификации ДНК в комплексе IV6 примерно в

Шт

300000 раз больше, а сенсибилизированной производным бензантрацена OLl-BzA - примерно в 10 раз больше, чем прямой фотореакции в комплексе III.

Рис. 8. Выход продуктов сшивки ДНК-мишени Ml с олигонуклеспидным производным OL2-R при прямой (1) и сенсибилизированной олигонуклеотидным производным 1,2-бензантрацена (2) или перилена (3) фотомодификации в зависимости от логарифма экспозиции (Н, Джем"2). Условия облучения: 1,2 - 420-580 нм, 3 440-580 нм. Продукты фотомодификации ДНК-мишени анализировали электрофорезом в 13% денатурирующем ПААГ, степень модификации определяли денситометрией радиоавтографа (соответствующий радиоавтограф не представлен).

Из полученных результатов следует, что высокоэффективную сенсибилизированную фотомодификацию ДНК в комплексе IV6 можно проводить специфично, поскольку в условиях, необходимых для модификации, производные OLI-Per и OL2-R по отдельности не активны.

Вследствие высокой эффективности сенсибилизированной фотомодификации было решено более подробно изучить механизм фотосенсибилизации фотореагента периленом.

Ig Н, (Джем1)

2.2.3. Механизм сенсибилизации фотореагента основан на переносе электрона

Перенос электрона из основного состояния азида на возбужденное состояние сенсибилизатора считается наиболее вероятным механизмом синглет-синглетной сенсибилизации ароматических азидов периленом, хотя перенос электрона не исключает также синглет-синглетного переноса энергии (Leyshon and Reiser, 1972). Оба механизма могут реализовываться параллельно, но вклад переноса электрона увеличивается при росте диэлектрической проницаемости растворителя, которая способствует разделению зарядов. Константа скорости гашения флуоресценции перилена ароматическими азидами увеличивается при росте диэлектрической проницаемости растворителя и достигает диффузионно контролируемого предела в метаноле при е = 32 (Leyshon and Reiser, 1972). Примерно такое же значение диэлектрической проницаемости наблюдается в бороздках двухцепо-чечной ДНК (Barawkar et al., 1995).

Было предположено, что обнаруженное значительное увеличение скорости сенсибилизированной производным перилена OLI-Per фотомодификации ДНК-

мишени (по сравнению со скоростью реакции сенсибилизированной бензантраце-новым производным) может быть обусловлено переносом электрона. Для проверки предположения был изучен фотолиз перилена и смесей перилен - перфторнафтила-зид и перилен-перфторнафтойная кислота. Перфторнафтойная кислота и 2-азидоперфтор-7-нафтойная кислота были выбраны вследствие того, что их спектры поглощения (А,макс 340 и 345 нм, соответственно) не перекрываются со спектром поглощения перилена (Хчакс 251 и 433 нм). При облучении в течение 1 ч видимым светом (440-580 нм) фотолиза ни перилена, ни азида, ни смеси перилен-перфторнафтойная кислота ни в кислородных, ни в бескислородных условиях не наблюдается. При облучении в течение 1 ч видимым светом (440-580 нм) смеси перилен - 2-азидоперфтор-7-нафтойная кислота в присутствии кислорода, одновременно происходит фотопревращение как азида, так и перилена с х^ 8 мин. По данным ВЭЖХ перилен практически целиком превращается в соединение, не флуоресцирующее и обладающее характерным для 1,12-периленхинона спектром поглощения (^Макс 334 и 444 нм). Можно предположить, что идет фотоокисление перилена кислородом воздуха. При барботировании перед облучением смеси перилен - 2-азидоперфтор-7-нафтойная кислота аргоном скорость фотопревращения перилена несколько снижается, но процесс не прекращается, видимо, из-за неполного удаления кислорода и высокой скорости окисления.

При облучении видимым светом комплекса ГУб в кислородных условиях наблюдаются аналогичные изменения - полное гашение флуоресценции периленово-го остатка и углубление цвета реакционной смеси (данные не представлены). Полученные результаты подтверждают, что при сенсибилизированной фотомодификации ДНК бинарной системой олигонуклеотидных конъюгатов (ОЫ-Рег + ОЬ2-К) одновременно с фотопришивкой реагента к мишени происходит фотоокисление сенсибилизатора (в), вероятнее всего за счет фотоиндуцированного переноса электрона.

Перенос электрона с фотовозбужденного сенсибилизатора на азид (Рис. 9а) теоретически возможен, но в нашем случае маловероятен. Подобный перенос электрона должен приводить к появлению в спектре поглощения смеси новой полосы переноса заряда (ПЗ). Экспериментально такой полосы обнаружено не было (данные не представлены).

■я,

Рис. 9. Расположение электронных уровней при фотоиндуцирован-ном переносе электрона (а) - с сенсибилизатора (в) на фотореагент (И) и (б) - с фотореагента на сенсибилизатор.

-е- п

в»

(Рег-Н)

(ЯН)

■ (Рег-Н)

(МО

Наблюдаемая сенсибилизированная фотомодификация ДНК в комплексе IV6 обусловлена вероятнее всего переносом электрона с неподеленной электронной пары (п) атома азота в азидогруппе фотореагента на фотовозбужденный перилен (рис. 96). В результате этого из перилена образуется анион-радикал, который быстро окисляется кислородом воздуха до соответствующего 1,12-периленхинона. Одновременно с этим из перфторарилазида образуется катион-радикал, который в ходе темновых превращений вызывает фотомодификацию ДНК, характерную для синглетного нитрена.

Из представленных результатов можно сделать вывод, что при сенсибилизированной производным перилена фотомодификации ДНК происходит инактивация сенсибилизатора. Наиболее вероятным механизмом иннактивации является перенос электрона и последующее фотоокисление остатка перилена.

3. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотид-связывающих белков, представленных на поверхности эукариотических клеток

Существенным препятствием для развития антисмысловых технологий и практической генотерапии является низкая проницаемость клеточных мембран для оли-гонуклеотидов и полимерных нуклеиновых кислот. Можно полагать, что подход к решению проблемы создания методов эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки организма может быть разработан на основании использования естественных механизмов транспорта нуклеиновых кислот в живых системах.

Структура фотоактивируемого реакцион неспособного дуплекса практически не отличается от фрагмента двуцепочечной ДНК и может служить удобным инструментом для исследования взаимодействия двуцепочечной ДНК с белками, обладающими сродством к нуклеиновым кислотам. Целью настоящей главы являлась демонстрация возможности применения бинарных систем олигонуклеотидных конъюгатов в качестве инструмента для исследования процессов взаимодействия дцДНК с белками in vivo на примере сенсибилизированной фотомодификации олигонуклеотид-связывающих белков, представленных на поверхности культивируемых эукариотических клеток.

Для исследования взаимодействия дцДНК с олигонуклеотид-связывающими белками с помощью бинарных систем олигонуклеотидных производных была использована модельная система, представленная на схеме 6. Олигонуклеотид OL4-А1, несущий остаток сенсибилизатора 9-аминометилантрацена и 5'-[12Р]-меченый олигонуклеотид OL5-R, несущий остаток фотореагента Ы-(и-азидотетрафторбензальгидразоно)-Ы'-пропиониламина, комплементарны соседним участкам одноцепочечного олигонуклеотида-матрицы МЗ. В контрольных экспериментах олигонуклеотидный конъюгат OL6-A1, несущий остаток 9-аминометилантрацена, был использован вместо производного OL4-A1.

СХЕМА 6

pATGGATTCTTGAAGG-GGACCGCATT МЗ OL4-A1 ААСТТСС CCTGGCGp* 0L5-R

*-32Р метка

3' AGAAATTGACp 0L6-A1

é= СТО

CH-NNHp(CH¡)¡NH-

Для того, чтобы в условиях фотомодификации исключить возможность транспорта олигонуклеотидного производного в клетки и обеспечить взаимодействие исследуемого олигонуклеотид-связывающего белка с реакционноспособным производным олигонуклеотида непосредственно на клеточной поверхности, инкубацию клеток в присутствии производных олигонуклеотидов и облучение проводили при 4 °С. Температура плавления комплексов, образуемых производными олигонуклеотидов OL4-A1 и OL5-R с олигонуклеотидом МЗ, составляет 28 °С и 19 °С соответственно, т.е. в данных условиях большая часть олигонуклеотидных производных OL4-A1 и OL5-R должна находиться в составе комплементарного комплекса с олигонуклеотидом МЗ.

Для выявления поверхностных клеточных белков, способных взаимодействовать с одноцепочечным фотореагентом OL5-R и фотореакционноспособным дуплексом ш vivo, нами была осуществлена фотомодификация эукариотических клеток линии СПЭВ. Реакцию фотомодификации инициировали облучением фильтрованным светом 365-580 нм. Показано, что при фотомодификации клеточного монослоя олигонуклеотидным производным OL5-R (рис. 10, дор. 1) и предформированным двуцепочечным комплексом (рис. 10, дор. 2 и 3) наблюдается появление одного и того же продукта модификации. Его молекулярная масса, оцениваемая по подвижности в ПААГ относительно стандартных маркеров молекулярной массы, составляет -79 кДа, что соответствует массе описанного ранее олигонуклеотид-связывающего белка, участвующего в связывании и транспорте олигонуклеотидов в ядро. В контрольных экспериментах, при темновой инкубации клеток в присутствии одноцепочечного фотореагента (рис. 10, дор. 4) и предформированного двуце-почечного комплекса, состоявшего из олигонуклеотидов OL4-A1, OL5-R и МЗ (рис. 10, дор. 5), продуктов модификации клеточных белков не наблюдалось. Можно предположить, что олигонуклеотид-связывающий белок (или группа белков с одинаковой подвижностью), ответственный за связывание и транспорт олигонуклеотидов, участвует и в связывании дцДНК.

¡ 2 3 4 5 6

Ш&ШЬ, Шк ¡ШЬ,

старт

КГ'

РГ

202 кДа 133 кДа 71 кЛа

42 кЛя ЗОкДа

Рис. 10. Электрофоретическое разделение продуктов модификации поверхностных белков клеток СПЭВ фотоактивируемым производным олигонуклеотида. Клеточный монослой инкубировали при 4 °С в течение 5 мин в среде ДМЕМ, содержащей: (1, 4, 6) - 0,5 мкМ фотореагента [32Р]-ОЬ5-К; (2) - 0,5 мкМ фотореагента и 0,5 мкМ комплементарного олигонук-леотида-матрицы МЗ; (3, 5) - 0,5 мкМ фотореагента, 0,5 мкМ олигонуклеотида ОЬ4-А1 и 0,5 мкМ комплементарного им олигонуклеотида-матрицы МЗ. Затем клетки инкубировали в темноте в течение 30 мин при 4 °С (4, 5) или облучали фильтрованным светом (А. = 365-580 нм) в тех же условиях (1, 2, 3 и 6). На дорожке 6 нанесена аликвота среды, в которой проводилась фотомодификация клеток. Продукты фотомодификации анализировали электрофорезом в 12% БОЗ-ПААГ КГ - концентрирующий гель; РГ - разделяющий гель.

Для доказательства связывания олигонуклеотид-связывающего белка с дуплексом были использованы мягкие условия облучения (400-580 нм). В контрольном эксперименте вместо производного олигонуклеотида ОЬ4-А1 использовали некомплементарный олигонуклеотиду - матрице конъюгат ОЬ6-А1 (схема 6), также не-

Рис. 11. Зависимость относительной степени модификации и начальных скоростей прямой и сенсибилизированной фотомодификаций поверхностных белков клеток линии СПЭВ от времени облучения (полулогарифмические координаты). Клеточный монослой инкубировали при 4 "С в течение 5 мин, в присутствии: 1 -0,5 мкМ фотореагента [32Р]-ОЬ5-Я и 0,5 мкМ комплементарного олигонуклеотида-матрицы МЗ; 2 - 0,5 мкМ фотореагента, 0,5 мкМ олигонуклеотида ОЬ4-А1 и 0,5 мкМ комплементарного им олигонуклеотида-матрицы МЗ; 3 - 0,5 мкМ фотореагента, 0,5

сущий 9-аминометилантраценовый остаток.

Время облучения, мин

мкМ комплементарного олигонуклеотида-матрицы МЗ и 0,5 мкМ олигонуклеотида OL6-A1. Клетки облучали видимым светом (А. = 400-580 нм). Продукты фотомодификации клеточных белков анализировали электрофорезом в 12% SDS-ПААГ, степень модификации определяли денситометрией радиоавтографа (соответствующий радиоавтограф не представлен).,

В эТих условиях облучения эффективность сенсибилизированной модификации была выше, чем эффективность прямой фотомодификации (сравни рис. 11, кривые 2 и 1). При облучении клеточного монослоя в присутствии конъюгата OL4-А1 начальная скорость накопления продуктов фотомодификации примерно в 3-4 раза больше чем в случае прямой модификации (рис. 11, кривые 2 и I).

•• -Отсутствие эффекта сенсибилизации при использовании производного олигонуклеотида OL6-A1 (рис. 11, кривая 3) свидетельствует о том, что в данном случае группировки сенсибилизатора и фотореагента располагаются на расстоянии, не позволяющем осуществить перенос энергии и инициировать реакцию фотомодификации. Таким образом, можно утверждать, что сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотид-связывающего белка происходит только после связывания с ним полностью собранного двуцепочечного фотореакционноспособного комплекса OL4-AI +OL5-R+M3.

Нами продемонстрирована возможность применения бинарных систем олиго-нуклеотидных конъюгатов в качестве инструмента для исследования взаимодействий двуцепочечнЬг'х нуклеиновых кислот с белками in vivo. Показано, что олиго-нуклёотид-связывающие белки, представленные на поверхности эукариотических клеток, обладают''Способностью взаимодействовать также и с двуцепочечными нуклеиновыми кислотами.

. > í

(■•-'•■ ВЫВОДЫ

1. Предложены и охарактеризованы новые бинарные системы фотоактивируемых олигонук{|еотрдных. реагентов - с использованием сенсибилизаторов ■ • 3-периленметиламина де,.3-аминопропионилгидразон-9-антраценаля и фотореагента Мг(4-азидотетрафт9рбензилиден)-К'-(3-аминопропил)гиДразина. Фотохимические свойства комбинаций предложенных сенсибилизаторов и фотореагента позволяют осуществить инициированную видимым светом (более 460 нм) высокоселективную сайт-специфическую фотомодификацию комплементарной. ДНК-мишени и обеспечивают инертность компонентов в отсутствие целевого биополимера.

2. . Показано, что в отличие от ранее использованных сенсибилизаторов, нерасхо-

дуемых в ходе реакции фотомодификации целевой нуклеиновой кислоты, сен,. сибилизированная 3-периленметиламином фотомодификация сопровождается инактивацией сенсибилизатора, вероятно, вследствие фотоокисления перилс-

нового остатка за счет фотоиндуцированного переноса электрона с азидогруп-пы реагента на электронно-возбужденный сенсибилизатор.

3. Продемонстрировано, что использование олигонуклеотидного производного 9-хлор-10-аминометилантрацена для сенсибилизации фотомодификации ДНК-мишени в сочетании с выбором целевой последовательности, содержащей в предполагаемом сайте модификации нуклеотидную последовательность (pG)4, позволяет осуществить количественную модификацию ДНК.

4. С использованием бинарной системы олигонуклеотидных конъюгатов исследовано взаимодействие поверхностных белков эукариотических клеток с экстраклеточными нуклеиновыми кислотами. В условиях in vivo продемонстрировано, что данные белки, связывающие олигонуклеотиды, участвуют и в связывании двуцепочечной ДНК

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Добриков М.И., Гайдамаков С.А., Гайнутдинов Т.И., Тенетова Е.Д., Шишкин Г. В., Власов В.В. "Бинарная система олигонуклеотидных производных перилена и я-азидотетрафтор-бензапьгидразона для сенсибилизированной к видимому свету фотомодификации ДНК." //Докл. РАН. 1998. Т. 358. С. 403-407.

2. Добриков М.И., Гайдамаков С.А., Гайнутдинов Т.И., Тенетова Е.Д., Шишкин Г.В., Власов В.В. "Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов. IV. Фотоиндуцированный перенос электрона" II Биоорган, химия. 1999. Т. 25. С. 31-39.

3. Добриков М.И., Гайдамаков С.А., Гайнутдинов Т.И., Иванова Т.М., Власов В.В. "Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов. V. Влияние строения ДНК-мишени. Количественная фотомодификация" // Биоорган, химия. 1999. Т. 25. С. 137-146.

4. Добриков М.И., Гайнутдинов Т.И., Иванова Т.М., Власов В.В. "Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов. VI. Влияние заместителей." // Биоорган, химия. 2000. Т. 26. С. 617-622.

5. Dobrikov МЛ., Gainutdinov 'ГЛ., Vlassov V.V. "Visible light activatable binary system of oligonucleotide conjugstes for nucleic acid modification. // Nucleo-sides@Nucleotides. 1999. V.18. P. 1517-1518.

6. Dobrikov M.I., Bichenkova E. V., Douglas K.T., Gainutdinov T.J., Vlassov V. V. Structure of Photoreactive Binary System of Oligonucleotide Conjugates Assembled,on the Target Nucleotide Sequence. //J. Biomol. Struct. Dyn.. 1999. V. 17. P. 213-221.

7. Гайнутдинов Т. И, Шестова О. Е., Якубов Л. А., Добриков М. И.,. Власов В. В "Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотидсвязывающих белков, представленных на поверхности эукариотических клеток" // Изв. Акад. наук. Сер. Хим.. 2002. Т. 7. С. 1108-1112.

»14971

[4f74

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фотодинамическая терапия

1.1.1. Фотохимические основы ФДТ

1.1.1.1. Воздействие синглетного кислорода (фотодинамический эффект II типа)

1.1.1.2. Фотоокисление с участием радикальных частиц и переноса электрона 13 (фотодинамический эффект I типа)

1.1.2. Фотосенсибилизаторы, применяемые в фотодинамической терапии рака

1.1.2.1. Сенсибилизаторы первого поколения на основе порфиринов

1.1.2.2. Сенсибилизаторы второго поколения 17 Производные хлорофилла а и бактериохлорофилла а 19 Синтетические хлорины и бактериохлорины 21 Тетраазапорфирины 23 Аналоги порфиринов

1.1.3. Транспорт и распределение фотосенсибилизаторов в организме 25 1.1.3.1. Распределение фотосенсибилизаторов в организме 25 Транспорт и распределение фотосенсибилизаторов гидрофобной природы 26 Транспорт и распределение водорастворимых фотосенсибилизаторов

1.1.4. Патофизиологические процессы, вызывающие некроз клеток

1.1.4.1. Реакции, сенсибилизируемые в клетке

1.1.4.2. Острая воспалительная реакция (ранняя фаза) 31 Высвобоэюдение биологически активных ионов 31 Высвобождение биологически активных веществ

1.1.4.3. Отложенная воспалительная реакция (поздняя фаза) 34 Активация системы комплемента 34 Клеточные реакции и гистологические изменения

1.1.5. Недостатки, ограничения и пути совершенствования методов фотодинамической 36 терапии

1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами 39 олигонуклеотидных реагентов

1.2.1. Синглет-синглетный перенос энергии

1.2.2. Двухквантовое резонансное триплет-триплетное возбуждение

1.2.3. Перспективы использования фотореагентов для направленной модификации 45 нуклеиновых кислот in vivo

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Олигонуклеотиды

2.3. Методы

2.3.1. Получение фотоактивируемых реакционноспособных производных 48 ол и го нуклеотидо в

2.3.2. Синтез производных олигонуклеотидов, несущих остаток сенсибилизатора

2.3.3. Выделение олигонуклеотидных производных методом ВЭЖХ

2.3.4. Гашение флуоресценции периленильных производных

•К 2.3.5. Введение радиоактивной метки в олигонуклеотиды

2.3.6. Фотомодификация нуклеиновых кислот.

2.3.7. Электрофоретический анализ продуктов модификации, радиоавтография и 52 денситометрия.

2.3.8. Определение степени и позиционной направленности модификации ДНК-мишени

2.3.9. Культивирование клеток.

2.3.10. Модификация клеточных белков фотоактивируемым производным 53 олигонуклеотида

2.3.11. Электрофоретический анализ белков.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-мишени на эффективность 55 сенсибилизированной фотомодификации

3.1.1. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишеней Ml и М

3.1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени МЗ

3.2. Влияние строения сенсибилизатора на скорость и эффективность 65 сенсибилизированной фотомодификации ДНК

3.2.1. Влияние заместителей в антраценовом остатке

3.2.1.1. Строение и спектрально-люминесцентные свойства сенсибилизаторов на основе 66 антрацена

3.2.1.2. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени

3.3. Использование перилена в качестве сенсибилизатора

3.3.1. Спектрально-люминесцентные свойства перилена

3.3.2. Гашение флуоресценции олигонуклеотидного производного перилена в 72 двуцепочечных комплексах

3.3.3. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК-мишени

3.3.4. Механизм сенсибилизации фотореагента основан на переносе электрона

3.4. Сенсибилизированная фотомодификация олигонуклеотид-связывающих белков, 85 представленных на поверхности эукариотических клеток

ВЫВОДЫ

Фотореакционноспособные производные олигонуклеотидов являются перспективными реагентами для направленной химической модификации определенных последовательностей нуклеиновых кислот и инструментами для исследования структуры и функции биополимеров [1,2].

Фотореакционноспособные конъюгаты олигонуклеотидов обладают рядом преимуществ по сравнению с другими реагентами на основе олигонуклеотидов - они инертны в отсутствие облучения, а процесс фотоактивации легко регулировать. Фотоактивация позволяет повысить селективность воздействия - реакция преимущественно проходит в сформированном аффинном комплексе. Фотоактивные антисмысловые олигонуклеотиды могут связываться с целевыми мРНК и, после облучения, ингибировать их трансляцию. Они способны образовывать трехтяжевые комплексы с двуцепочечной ДНК и ингибировать репликацию и транскрипцию генов in vitro и in vivo. Фотоактивируемые конъюгаты олигонуклеотидов могут взаимодействовать с белками, обладающими сродством к нуклеиновым кислотам, что позволяет применять их для исследования механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами и модулировать активность белков in vivo.

Бинарные системы олигонуклеотидных конъюгатов позволяют осуществить фотомодификацию ДНК с повышенной эффективностью и селективностью [3-8]. Принцип подхода заключается в том, что используются два олигонуклеотида, комплементарные соседним участкам ДНК- или РНК-мишени, к одному из которых присоединен сенсибилизатор, к другому - фотореагент. При комплементарном связывании таких пар олигонуклеотидных конъюгатов с нуклеиновой кислотой сенсибилизатор и фотореагент сближаются, в результате чего формируется фотореакционноспособный центр. Облучение образовавшегося комплекса длинноволновым светом вызывает возбуждение сенсибилизатора с последующей активацией реагента за счет безизлучательного переноса энергии и фотомодификацию биополимера.

Фотомодификация нуклеиновых кислот и белков взаимодействующих с РНК и ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов может быть использована как инструмент в исследовательских, диагностических и терапевтических целях. В условиях in vivo исключительно важно, чтобы фотомодификация инициировалась видимым или ИК-светом, более глубоко проникающим в клетки и не вызывающим, в отличие от коротковолнового УФ, нежелательных побочных эффектов облучения. Поэтому применение бинарных систем олигонуклеотидных конъюгатов активизируемых длинноволновым светом особенно перспективно для приложения in vivo.

Целью данной работы являлось: а) - разработка новых, активируемых видимым светом, бинарных систем производных олигонуклеотидов для фотосенсибилизированной модификации биополимеров; б) - изучение влияния химической структуры сенсибилизатора и влияния последовательности целевой нуклеиновой кислоты на эффективность фотомодификацию ДНК-мишени; в) - использование бинарных систем конъюгатов олигонуклеотидов для исследования процессов взаимодействия нуклеиновых кислот с клеточными белками in vivo.

выводы

1. Предложены и охарактеризованы новые бинарные системы фотоактивируемых олигонук-леотидных реагентов с использованием сенсибилизаторов - 3-периленметиламина и 3-аминопропионилгидразон-9-антраценаля и фотореагента N-(4-азидотетрафторбензилиден)-ГЧ'-(3-аминопропил)гидразина. Фотохимические свойства комбинаций предложенных сенсибилизаторов и фотореагента позволяют осуществить инициированную видимым светом (более 460 нм) высокоселективную сайт-специфическую фотомодификацию комплементарной ДНК-мишени и обеспечивают инертность компонентов в отсутствие целевого биополимера.

2. Показано, что в отличие от ранее использованных сенсибилизаторов, нерасходуемых в ходе реакции фотомодификации целевой нуклеиновой кислоты, сенсибилизированная 3-периленметиламином фотомодификация сопровождается инактивацией сенсибилизатора, вероятно, вследствие фотоокисления периленового остатка за счет фотоиндуцированного переноса электрона с азидогруппы реагента на электронно-возбужденный сенсибилизатор.

3. Продемонстрировано, что использование олигонуклеотидного производного 9-хлор-10-аминометилантрацена для сенсибилизации фотомодификации ДНК-мишени в сочетании с выбором целевой последовательности, содержащей в предполагаемом сайте модификации нуклеотидную последовательность (pG)4, позволяет осуществить количественную модификацию ДНК.

4. С использованием бинарной системы олигонуклеотидных конъюгатов исследовано взаимодействие поверхностных белков эукариотических клеток с экстраклеточными нуклеиновыми кислотами. В условиях in vivo продемонстрировано, что данные белки, связывающие олигонуклеотиды, участвуют и в связывании двуцепочечной ДНК

1. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and Targeted Reactions of Oligonucleotide Derivatives. Boca Raton, Florida, CRC Press. 1994.

2. Каневский Н.Э., Кузнецова C.A. Получение реакционноспособных производных нуклеиновых кислот и их использование для исследования структуры и функций биополимеров., Успехи химии, 1998, Т. 67, С. 688-704

3. Vlassov V.V., Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gaidamakova E.K., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A. DNA and RNA Cleavers and Chemotherapy of Cancer and Viral Diseases. Dordrecht, Kluwer Acad. Publiser. NATO ASI Series. 1996, V. 479, P. 309-317.

4. Dobrikov M.I., Gaidamakov S.A., Gainutdinov T.I., Koshkin A.A., Vlassov V.V. Sensitized Photomodification of Single-Stranded DNA by a Binary System of Oligonucleotide Conjugates.

5. Antisense. Nucleic. Acid Drug Dev., 1997, V. 7, P. 309-317.

6. Добриков М.И., Гайдамаков С.А., Шишкин Г.В., Власов В.В. Сенсибилизированная фотомодификация ДНК бинарными системами олигонуклеотидных конъюгатов. III. Двухквантовая сенсибилизация. Биоорган, химия, 1998, Т. 24, С. 831-838.

7. Миронов А.Ф. Фотодинамическая терапия рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей. Сор. Обр. Журнал, 1996, Т. 8, С 32-40.

8. Шинкаренко H. В., Алесковский В. Б. Химические свойства синглетного молекулярногокислорода и значение его в биологических системах. Успехи химии, 1982, Т. LI, С. 713-735.

9. Lipson R.L., Baldes E.J., Gray M.J. Hematoporphyrin Derivative for Detection and Management of Cancer. Cancer 1967, V. 12, P. 2255-2257

10. Byrne C.J., Marshallsay L.V., Ward A.D. The composition of Photophryne II. J Photochem Photobiol 8, 1990, V. 6, P. 13-27

11. Moan J., Properties for Optimal PDT Sensitizers. J. Photochem. Photobiol., B: Biology, 1990, V. 5, P. 521-524.

12. Matsuura E., Fukimbara Т., Kawahara H., Ito H. Studies on photodynamic action of chlorophyl derivatives—phototoxicity of pheophorbide-A on rats. Kitasato Arch. EjcP. Med, 1988, V. 61, P. 201-213

13. Kochubeev G.A., Frolov A.A., Sarzhevskaia M.V., Gurinovich G.P. Erythrocyte Photohemolysis Sensitized by Chlorine e6. Biofizika, 1987, V. 32, P. 652-655

14. Roberts W.G., Shiau F.Y., Nelson J.S., Smith K.M., Berns M.W. In vitro Characterization of Monoaspartyl Chlorin e6 and Diaspartyl Chlorin e6 for Photodynamic Therapy. J. Natl. Cance.r Inst., 1988, V. 80, P. 330-336

15. Kessel D. Determinants of Photosensitization by Mono-L-aspartyl Chlorin e6. Photochem. Photobiol., 1989a, V. 49, P. 447-452

16. Borland C.F., McGarvey D.J., Morgan A.R., Truscott T.G. Laser flash photolysis of purpurins: novel potential photosensitizers of interest in photodynamic therapy. J. Photochem. Photobiol. B, 1988, V. 2, P. 427-434.

17. Kessel D. Determinants of Photosensitization by Purpurin. Photochem. Photobiol., 1989b, V. 50, P. 169174

18. Morgan A.R., Rampersaud A., Garbo G.M., Keck R.W., Selman S.H. New sensitizers for photodynamic therapy: controlled synthesis of purpurins and their effect on normal tissue. J. Med Chem., 1989, V. 32, P. 904-908

19. Sahai D., Lo J.L., Hagen I.K., Bergstrom L., Chernomorsky S., Poretz R.D. Metabolically Convertible Lipophilic Derivatives of pH-Sensitive Amphipathic Photosensitizers. Photochem. Photobiol., 1993, V. 58, P. 803-808.

20. Henderson B.W., Sumlin А.В., Owczarczak B.L., Dougherty T.J. Bacteriochlorophyll-a as photosensitizer for photodynamic treatment of transplantable murine tumors. J. Photochem. Photobiol. B, 1991, V. 10, P. 303-313.

21. Schuitmaker J.J., van Best J.A., van Delft J.L., Dubbelman T.M., Oosterhuis J.A., de Wolff-Rouendaal D. Bacteriochlorin a, a new photosensitizer in photodynamic therapy. In vivo results. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1990, V. 31, P. 1444-1450.

22. Bonnett R., Photosensitizers of the Porphyrin and Phtolocyanine Series for Photodynamic Therapy, Chem. Soc. Reviews, 1995, V. 24, P. 19-33.

23. Michels S., Barbazetto I., Schmidt-Erfurth U. Choroidal changes after photodynamic therapy (PDT). A two-year follow-up study of 38 patients. Klin. Monatsbl. Augenheilkd., 2000, V. 217, P. 94-99.

24. Rousset N., Vonarx V., Eleouet S., Carre J., Bourre L., Lajat Y., Patrice T. Cellular Distribution and Phototoxicity of Benzoporphyrin Derivative and Photofrin. Res. ExP. Med. (Berl.), 2000, V. 199, P. 341357.

25. Kaplan M.J., Somers R.G., Greenberg R.H., Ackler J. Photodynamic Therapy in the Management of Metastatic Cutaneous Adenocarcinomas: Case Reports from Phase 1/2 Studies Using Tin Ethyl Etiopurpurin (SnET2). J. Surg. Oncol., 1998, V. 67, P. 121-125.

26. Rosental I., Ben-Hur E. Phthalocyanines in Photobiology. New York, VCH, 1989, P. 393-425.

27. Ochsner M. Light scattering of human skin: a comparison between zinc (Il)-phthalocyanine and photofrin II. J. Photochem. Photobiol. В., 1996, V. 32, P. 3-9.

28. Henderson B.W., Doughterty T.J. How Does Photodynamic Therapy Work? Photochem. Photobiol., 1992, V. 55, P. 145-157.

29. Firey P.A., Rodgers M.A. Photo-properties of a silicon naphthalocyanine: a potential photosensitizer for photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., 1987, V. 45, P. 535-538.

30. Aramendia P.F., Redmond R.W., Nonell S., Schuster W., Braslavsky S.E., Schaffner K., Vogel E. The photophysical properties of porphycenes: potential photodynamic therapy agents. Photochem. Photobiol., 1986, V. 44, P. 555-559.

31. Patterson M.S., Wilson B.C., Graff R. In Vivo Tests of the Concept of Photodynamic Threshold Dose in Normal Rat Liver Photositized by Aluminium Chlorsulphonated Phthalocyanine. Photochem. Photobiol., 1990, V. 51, P. 343-349.

32. Weishaupt K.R., Gomer C.J., Doughterty T.J. Identification of Singlet Oxygen as the Cytotoxic Agent in

33. Photo-Inactivation of a Murine Tumor. Cancer Researh, 1976, V. 36, P. 2326-2329.

34. Moan J., Boye E. Photodinamic Effect on DNA and Cell Survival of Human Cells Sensitized by Hematoporphyrn. Photochem. Photobiophys., 1981, V. 2, P. 301-307.

35. Foster Т.Н., Murant R.S., Bryant T.G., Knox R.S., Gibson S.L., Hilf R. Oxygen Consumption and Diffusion Effects in Photodinamic Therapy. Radial. Res., 1991, V. 126, P. 296-303.

36. Henning J.P., Fourier R.L., Hampton J.A. A Transient Mathematical Model of Oxygen Depletion During Photodinamic Therapy. Radial. Res., 1995, V. 142, P. 221-226.

37. Geiger P.G., Korytowski W., Girotti A.W. Photodynamically Generated 3|}-hydroxy-5a-cholest-6-ene-5-hydroxyperoxyde: Toxic Reactivity In Membranes And Susceptibility To Enzymatic Detoxification. Photochem. Photobiol., 1995, V. 62, P. 580-587.

38. Kulig M.J., Smith L.L. J. Org. Chem., 1973, V. 38, P. 3639-3642.

39. Gollnick K. Type II Photooxygenation Reactions in Solution. Adv. Photochem., 1968, V. 6, P. 1-122.

40. Murrel G., Francis M., Bromley L. Fibroblasts Release Superoxide Free Radicals. Biochem. Soc. Trans., 1989, V. 17, P. 483-484.

41. Straight R.C., Spikes J.D., Photosensitized Oxidation of Biomolecules. Boca Raton, CRC Press, 1985, P. 92-143.

42. Foote C.S. Photooxydation of biological model compounds. In: Oxygen and Oxy-Radicals in Chemistry and Biology. Eds: Rodgers M. and Powers E.L. New York, Academic Press, 1981, P. 425-440.

43. Scalkos D., Hampton J.A. Iminium Salt Benzochlorins as Potential Photosensitizers In Photodynamic Therapy. Med. Che. Res., 1992, V. 2, P. 276-281.

44. Selman S.H., Hampton J.A., Morgan A.R., Keck R.W., Balkany A.D., Scalkos D. Copper Benzochlorin, A Novel Photosensitizer For Photodynamic Therapy: Effects On Transplantable Urothelial Tumor. Photochem. Photobiol., 1993, V. 57, P. 681-685.

45. Hampton J.A., Skalkos D., Taylor P.M., Selman S.H. Iminium Salt of Copper Benzochlorine (CDS1), a Novell Photosensitizer for Photodynamic Therapy: Mechanism of Cell Killing. Photochem. Photobiol., 1993, V. 58, P. 100-105.

46. Egorov S., Kamalov V., Koroteev N., Krasnovsky A., Toleutaev В., Zinukov S. Rise and Decay Kinetics of Photosensitized Singlet Oxygen Luminiscence in Water. Chem. Phys. Lett., 1989, V. 163, P. 421-424.

47. Wilkinson F., Brummer J. Rate Constants for the Decay and Reactions of the Lowest Electronicaly Excited Singlet State of Molecular Oxygen in Solution. J. Phys. Chem. Ref. Data, 1981, V. 10, P. 809999.

48. Kanolsky J. Quencin of Singlet Oxygen by Human Red Cell Ghosts. Photochem. Photobiol., 1991, V. 53, P. 93-99.

49. Baker A., Kanofsky J. Quenching of Singlet Oxygen by Biomolecules from L1210 Leukemia Cells.

50. Photochem. Photobiol., 1992, V. 55, P. 523-528.66.