Этидиевые производные олигонуклеотидов - высокоэффективные реагенты для фотохимической модификации нуклеиновых кислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Р Г Б ОД

о , !ГМ] ¡^'РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ! СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 547.963.3+535.217+535.371

КОШКИН АЛЕКСЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

ЭТИДИЕВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ -ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЕ РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ФОТОХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисканиэ ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск, 1994г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научный руководитель - кандидат химических наук Лебедев А.В.

Официальные оппоненты: доктор химических наук • Загребельный С.Н. кандидат химических наук Иванова Е.М.

Ведущая организация: Институт химической кинетики и горения СО РАН (г. Новосибирск)

Защита состоится » Л, 1994 года в 9— часов на

заседании совета по защите диссертаций К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан -2- 1994 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций, кандидат химических наук

Актуальность проблемы. Для осуществления сайт-специфической модификации нуклеиновых кислот (НК) в настоящее время широко используются производные олигонуклеотидов, содержащие в своем составе реакционноспособные группировки. Основными факторами, которые определяет эффективность и селективность модификации НК-мишени с помощью -олигонуклеотидных реагентов, являются стабильность комплементарного комплекса НК-мишень -олигонуклеотидный реагент и природа модифицирующей группировки, ковалентно присоединенной к олигонуклеотиду-адресу.

Среди многочисленных химических группировок, применяемых для модификации НК, все более широкое распространение получают фотоактивируемые производные, главным преимуществом которых является возможность проведения реакции фотомодификации в определенный момент времени, что особенно ваяно в случае применения этого метода в экспериментах in vivo.

Многообразие фотохимических групп, способов их введения в состав олигонуклеотидов, широкий выбор источников света и условий проведения фотомодификации НК-мишени позволяют надеятся на перспективность метода фотохимической сайт-специфической модификации НК.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в разработке методов синтеза новых олигонуклеотидных реагентов, содержащих высокореакционноспособные группы азидоэтидиевых красителей, и использовании полученных производных для исследования закономерностей сайт-специфической фотомодификации одно- и двуцепочечных НК.

Научная новизна. Новизна результатов, полученных в диссертационной работе, состоит в следующем. Впервые были синтезированы производные олигонуклеотидов, несущие моноазидоэтидиевые группировки. Проведены систематические исследования комплексообразую-щих и фотохимических свойств этидиевых и азидоэтидиевых производных олигонуклеотидов; Для этого методами термической денатурации и футпринтинга изучены комплементарные комплексы этих производных с одно- и двуцепочечными НК. Проведено сравнение эффективности и позиционной направленности адресованной фотохимической модификации, осуществляемой при использовании этидиевых и азидоэтидиевых производных олигонуклеотидов. Впервые осуществлена- высокоэффективная модификация фрагмента двуцепочечной ДНК

в составе комплементарных триплексов с олигонуклеотидными производными,- содержащими азидоэтидиевые красители.

С целью апробации возможности применения таких производных в биологических экспериментах была изучена стабильность нескольких этидиевых производных декатимидилата по отношению к клеточным нуклеазам внутри клеток асцитной карциномы Кребса-2, а также проведены эксперименты по фотохимическому мечению клеточных белков.

Практическая ценность. Предложены и испытаны новые эффективные сайт-специфические олигонуклеотидные фотореагенты, содержащие азидоэтидиевые красители. .На основании полученных данных разрабатываются новые, более эффективные, фотореагенты.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международных симпозиумах: "Перспективы терапевтического и диагностического применения олигонуклеотидных производных" (Новосибирск, 1988), "Синтез олигонуклеотидов: проблемы и границы практического применения" (Москва, 1991), "Нуклеиновые кислоты как терапевтические агенты" (Тампа, США, 1991).

Публикации. По теме исследований, представленных в диссертации, опубликовано 4 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 158 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав, выводов и списка цитируемой литературы из 164 наименований и содержит 11 таблиц и 25 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Синтез этидиевых и азидоэтидиевых производных

0лиг0де30ксириб0нукле0тид0в.

Для ковалентного присоединения этидиевых или азидоэтидиевых красителей к олигонуклеотидам был предложен метод синтеза фенантридиниевых производных, которые могут быть легко присоединены к любому олигодезоксирибонуклеотиду, содержащему концевую фосфатную группу. Суть метода заключается во введении остатка 3-аминопропионила в состав катиона этидия или его моноазидного аналога путем обра°^вания карбамидной связи1 с ароматической аминогруппой в положении 2 и/или 7. Структуры красителей, синтезированных по данной методике, представлены на схеме 1. Эти

производные содержат линкер с первичной алифатической аминогруппой и могут быть легко присоединены фосфамидной связью к коше-

Схема 1.

(ЕЬс1-1): Е= -С(0)СН2СН2№!2, ¡г"= -Н

п'нитт (Еъа-2): н= -н, п'= -с(о)сн„сн,ни2

(ЕЫ-З): Н= Р-'= -С(0)С!1£С512?:Н2

/,— \ гп

(АгРЛа-1): В= -С(О)СН2СН2КН„ , К'= -Нд (АгЫ<1-2): Я= -N'3, Р.' = -С(0)С.Ч£СН,Г.'Н2

вым фосфатам олигодезоксирибонуклеотидов. Такое присоединение осуществляли по широко известной методике, разработанной в НИБХ СО РАН (Годовикова Т.С. и др. Бкоорган. химия. 1986. Т. 12. С.475). через промежуточное образование активного 4-И',Ы'-диметиламинопиридиниевого производного олигонуклеотида. С выходили 50-80% в работе было синтезировано и использовано 20 различных производных олигонуклеотидов, содержащих этидиевне или азидозтидиевые красители.

2. Исследование термической стаб!1льности олигонуклеотидных

дуплексов, содержащих этшмевые красители.

Необходимым условием эффективной адресованной: модификации НК-милэнп с помощью реакционноспособных производных олигонуклео-тидов является возможность образования стабильного комплементарного комплекса адрес-мишень. Поэтому эффективность использования этидиевых производных олигодезоксирибонуклеотидов (ЭПО) в качестве адресованных реагентов зависит от того, каким образом наличие кола-четно присоединено™ этидиевого красителя влияет на стабильность комплементарных НК-комплекссв. С целью изучения такого влияния наш! были проведены эксперименты по определению ■¡ырмичеиксй стабильности ряда олигонуклеотидных дуплексов, содержащих этидиевне красители (Е1с1-1) или

В зависимости от длины и состава олигонуклеотидов, каждый присоединешшй остаток красителя повышает значения температуря плавления комплементарных комплексов на 20-25°С ¡'значения т

Таблица I. Термическая стабильность комплементарных комплексов для этидиевых производных олигодезоксирибонуклеотидов.

КОМПЛЕКС Концентрация цепи (х 105 М) для различных к

он (ЕЪ<1-1) (Е1с1-2)

(»-1) 5* И-рААТАСТСТ 0.75 24 43 43

3' АТТСАОТТАТаАОАр 0.75

(0-2) 5' Р-рТТТТТТТТ 1.6 - 37 -

3* СТСААААААААаТСр 1.6

(0-3) 5* ттттттттр-!? 1.6 17 35 -

З1 СТвААААААААОТСр 1.6

(0-4) 5* К-рССАААСА 2.5 27 49 50

3' СООТТТОТр 2.5

(0-5) 5' тсстттсссстсст 5.0 12 43 -

3' ¿Аллар-К 5.0

(0-6) 5' тсстсссстттсст 5.0 10 38 -

3' САААСр-Е 5.0

(0-7) 5' тсстсссстттсст 5.0 10 36 -

3' 1?-рОААА(; 5.0

(0-8) 5' тсстттсссстсст 5.0 12 34 -

3' И-рСАААС 5.0

Твах 03Начает значение температуры, соответствующее точке максимума на дифференциальной кривой термической денатурации; Использованные буферные системы: 0,01 м 1;г1з-нС1 (рН 7,3), о,2М ЫаС1, 0.01М МвС12 (комплекс (0-1)); 0.02М Ма2НРОд (рН 7,4),0,16М ЫаС1, О,1шМ ЭДТА (комплексы (0-2) - (0-4)); 0.01М Ыа2НР04'рН 7,0), 1,0 М ЫаС1, 0,1тМ ЭДТА (комплексы (Ю-5) - (0-8)).

Причем оба красителя (() и (еь<1-2)) демонстрируют приблизительно одинаковый стабилизирующий эффект (см. дуплексы (о-1) и (р-4), таблица I).

Сравнение значений ттах для комплексов (ю-2) и Ю-з), (о-5) и (т>-7), (в-6) и (р-8) показывает, что 5'-ЭП0 образуют более стабильные комплексы, чем соответствующие 3'-производные. С другой стороны, ковалентно присоединений остаток этидиевого красителя стабилизирует комплементарный комплекс более эффективно в том случае, если он направлен в сторону более протяженного неспаренного участка комплементарного олигонуклеотида-мишени (ср. комплексы (0-5) И (0-6) ИЛИ (0-7) И (0-8), Н=(Е1<1-1); таблица I).

Таким образом, можно заключить, что наличие ковалентно присоединеного остатка этидиевого красителя значительно повышает стабильность комплементарных олигонуклеотидных дуплексов. Этот эффект может оказаться весьма полезным для проведения адресованной модификации одноцепочечных нуклеиновых кислот. Более актуальным, однако, в настоящее время является разработка подходов для направленной модификации двуцепочечных участков НК. В связи с этим, в следующем разделе исследована возможность взаимодействия ЭПО с двуцепочечной ДНК.

3. комплексообразование ЗПО с двуцепочечной ДНК.

Взаимодействие этидиевых производных олигонуклеотидов с двуцепоче^ной ДНК (дц ДНК) было изучено на примере фрагмента ДНК (110 пар оснований), представляющего собой участок обратного транскрипта, полученного от ТВЕ7 РНК. Фрагмент ДНК содержал полипурин-полипиримидиновый сайт (АО)ел-(тс)6т (схема 2), который был использован в качестве сайта адресации для комплементарных гекса- и тридекануклеотидов.

Схема 2.

-10123456789 10 12

3'—О-С-Т+Т-С-Т-С-Т-С-Т-С-Т-С-Т-С-Т 5*—С-О-А+А-С-Д-С-Д-С-А-О-А-Е-Д-О-Д-

г-Т-Б— 5'

:-д-с— з •

Для исследования процесса комплексообразования применялся метод футпринтинга с использованием (СН3)2804. При этом рассчитывали относительную степень защиты (Р1) от модификации диметил-сульфатом для нуклеозидного остатка а(1) согласно уравнению:

8. в Ее Р.= (1--х ----) х 100Х

Б. с Ез х

где: е.- площадь пика (1) на денситограмме, соответствующего полосе остатка с(±) из (AG)gA тракта; "в" означает анализируемый образец, а "с" - контрольный анализ (эксперимент без добавления олигомеров); £ представляет собой сумму прощадей четырех контрольных пиков на денситограмме, соответствующих остаткам дез-оксигуанозина (-4), (-6), (-10) и (-13) (которые были выбраны в стороне от (ао6а тракта): £ = б_5 + б_6 + з_10 + з_13.

На рисунке 1 (стр.7) представлены гистограммы степеней защиты остатков гуанозина фрагмента ДНК как в присутствии рсЦТС)3 или растерт, так и их 5'-этидиевых производных, содержащих кова-лентно присоединенный остаток (Ега-г).

Видно, что как при использовании тридекануклеотида, так и при использовании его этидиевого производного, степень защиты остатков гуанозина в положениях 4, 6 и 8 дц ДНК была приблизительно одинаковой и достагала 85-100%. Частичная защита (около 50Ж) наблюдалась в этих случаях также и для двух других остатков С(2) и 0(10). В присутствии (еьй-2)рс!(тс)бс1Т наблюдалась повышенная степень метилирования для остатка С(-1), граничащего с триплексной структурой, что свидетельствует о взаимодействии остатка этидия с двуцепочечным участком фрагмента ДНК.

На основании данных футпринтинга можно заключить, что в условиях эксперимента тридекануклеотид ректорат и его 5'-этидиевое производное способны образовывать прочные триплексы с комплементарным участком дц ДНК. При этом остаток этидиевого красителя взаимодействует с ДНК-матрицей и, вероятно, стабилизирует комплементарный комплекс.

Исследование метилирования ДНК в присутствии гексануклео-тида рсКТС)^ или его этидиевого производного (Еъа-2)рсЦТС показало, что при их использовании наблюдаются совершенно различные картины защиты остатков гуанозина. Так, в случае гекса-нуклеотида ра(ТС)3 наблюдается приблизительно одинаковый уровань защиты "внутренних" остатков 0(4, б, 8). Этот факт объясняется возможностью образования ряда равновероятных триплексных структур, возникающих при взаимодействии гексануклеотида с тринад-цатизвенным участком комплементарное™.

к т

с ы г-

сЮ ПОЛЯНИЕ 12 8 4 -1

10 е г

Л

(И<1-2)р<1(ТС)3

100л

0-

(«м-ЛрЛто.ет

-100-1

<10 ПОЛОШИЕ

12 8 4 -1 10 в 2

РИС. 1

Гистограммы степеней защиты остатков гуанозина дц ДНК от метилирования ди-метилсульфатом в присутствии комплементарных олиго-нуклеотидов и их этидиевых производных.

В противоположность рй(тсего этидиевое производное (Е1с1-2)ра.(тсдемонстрирует относительно высокий уровень защиты "внутренних" С-остатков за исключением случая с 0(6). Повышенная степень защиты этих остатков свидетельствует об образовании более стабильного триплекса с преимущественным образованием тандемной структуры. Очевидно, кооперативное взаимодействие двух соседних ЭПО в тандемном триплексе значительно стабилизирует этот комплекс.

Таким образом, из приведенных данных следует, что олигону-клеотидные производные, содержа'цие ковалентно присоединений остаток этидиевого интеркалятора, способны формировать стабильные комплексы с комплементарным участком дц ДНК. Более того, показано, что этидиевое производное гексануклеотида способно,- в отличие от рй(тс)^йт, образовывать прочные гандемные триплексы на двуцепочечной ДНК-матрице. Это может служить косвенным доказательством стабилизации триплекса в присутствии остатка этидия.

Исследованные нами модели олигонуклеотидных дуплексов и триплексов дц ДНК с ЭПО были использованы при изучении сайт-специфической модификации НК, что будет описано ниже.

4. Фотохимическая модификация одноцепочечных НК этидиевши производными олигонуклеотидов .

Фотореагенты на основе ароматических азидов представляют большой интерес из-за высокого квантового выхода реакции фотомо-дифшсации. Поэтому мы ожидали, что азидоэтидиевые производные олигонуклеотидов будут обладать повышенной фотоактивностью по сравнению с аналогичными производными, содержащими остаток этидиевого красителя. Для проверки этого предположения мы провели ряд экспериментов по фотомодификации октануклеотида-мишени в составе комплементарного комплекса (с-4), содержащего остатки как этидиевых, так и азидоэтидиевых красителей.

12345678 5* . . .р32<1(Т-а-Т-Т-Т-С-0-С)

(0-4)

3'... <1(А-С-А-А-А-С-С)р(Ю

Так, на рисунке 2 (стр. 9) представлен радиоавтограф, полученный при электрофоретическом анализе продуктов фотомодификации в комплексе (в-4, в= АгЕъ<1-1). При облучении этого комплекса светом ксеноновой лампы (337 нм, плотность мощности о,1 р

мВт/см^) наблюдалось образование ковалентных аддуктов адрес-мишень (дорожка 2). При двухкратном избытке адресованного реагента (АгЕ1с1-1 )рс((ССАААСА) по отношению к мишени выход ковалентных аддуктов составил 53%.

Природа этих аддуктов довольно сложна. Хроматографический анализ на обращенной фазе показал наличие как минимум ю основных продуктов. Часть этих аддуктов (около 60$) оказалась неустойчивой в условиях стандартной пиперидиновой обработки реакционной смеси (10$ водный пиперидин, 30 мин при 100°С; дорожка 3). Результаты пиперидиновой обработки, приводящие к расщеплению аддуктов позволили оценить соотношение модификаций остатков С(7)/С(8) как 1:4. Сохранение суммарного выхода модификации до и после обработки реакционной смеси пиперидином говорит о низком уровне скрытых повреждений мишени, которые способны генерироваться при использовании адресованных фотореагентов.

Аналогичный результат по фотомодификации в комлексе (б-4) оыл получен при использовании другого азидоэтидиевого реагента -

Рис. 2

Авторадиограмма гель-электрофореза, полученная при анализе продуктов

о о

модификации ^-pd(TGTTTGGC) в составе комплементарного комплекса (d-4, r= AzEtd-i). Дорогаи: (1)- исходный 32pd(TGTTTGGC); (2)- комплекс (D-4, r= AzEtd-i) после облучения светом 150 Вт ксеноновой лампы (337 нм; 30 мин при 4°С ); соотношение концентраций pd(TGTTTGGC) И (AzEtd-1)pd(CCAAACA) равно 1:2; (3)-образец дорожки (2), обработанный пиперидином; (4)- частичное (А+О-расщепление матрицы -32pd(TGTTTGGC). Концентрация окта-нуклеотида pd(TGTTTGGC) 1-ю_бм. Буфер: см. табл.1.

(AzEtd-2)pd(CCAAACA). Единственными продуктами фотореакции в этом случае такке оказались ковалентные аддукты. Однако, выход модификации в тех же условиях составил только 36$. Повысить уровень модификации до 81 % нагл удалось, используя метод последовательного добавления (5- и 10-кратных избытков) адресованного реагента и последующего облучения.

Как ожидалось, использование этидиевых производных гепта-нуклеотида (Etd-1)pd(CCAAACA) И (Etd-2)pd(CCAAACA) ДЛЯ фОТОМОДИфикации октануклеотида p32d(TGTTTGGC) в комплементарном дуплексе (D-4) не привело к заметной модификации мишени в условиях, идентичных для случая использования' азидоэтидиевых реагентов. Для проведения фотохимических реакций с использованием этидиевых реагентов возникла необходимость использования более мощного источника света, такого как азотный лазер (337 нм, плотность

р г

мощности 120 мВт/см^) и больших избытков адресованных реагентов по отношению к мишени. Результаты этих экспериментов представлены на рисунке 3 (стр.10).

12 3 4

"Й

О

.. V") С ) о

5

Ъ О G(7) о g{s) Т(5) Т(4)

т(3)

<3(2)

Облучение комплекса (d-4, r= Etd-i) светом азотного лазера р

(интенсивность 120 мВт/см ) привело к модификации мишени за счет

Рис. 3

Авторадиограмма гель-электрофореза при анализе продуктов модификации октануклеотида 32pd(TGTTTGGC), образующихся при лазерном облучении комплементарного комплекса (d-4, к= Etd-1 или Etd-2). дорожки: (1)-Комплекс (d-4, к= Etd-i) после лазерного облучения (4 часа) при 4°С; (2)- образец дорожки (1), обработанный пиперидином; (з)-исходный октануклеотид

32pd(TGTTTGGC); (4)- продукты частичного (а + G) -гидролиза; (5)-комплекс (D-4, R= Etd-2) после лазерного облучения (4 часа) при 4°С; (6)- образец дорожки (5) после обработки пиперидином. Концентрации: 5-Ю~7М pd(TGTTiGGC) и 5- Ю~5М для этидиевых производных гептануклеотида. Буфер: см. табл.1.

образования ковалентных аддуктов с выходом около 20® (рис.3, дорожка 1). Стандартная пиперидиновая обработка облученной смеси привела к полному расщеплению ковалентных аддуктов (дорожка 2). Точки модификации мишени были идентифицированы при этом как нуклеозидные остатки G(6) и G(7) (соотношение еыходов 3:2). Общий выход модификации G(6)+G(7) составил что свидетельствует о присутствии скрытых повреждений (выход около 45%) в полосе, соответствующей олигонуклеотиду исходной длины.

Аналогичные результаты были получены для другого этидиево-• го изомера в комплексе (d-4, r = Etd-2}.' Как и в предыдущем случае, наблюдалось образование неустойчивых к пиперидиновой обработке ковалентных аддуктов с выходом 45« (рис.3, дорожка 5). Суммарный выход модификации (нуклеозидные остатки G(6) и G(7) в соотношении 3:2), определенный после. пиперидиновой. обработки

1 2 3 4 5 6

С<8) ^ в(7)

<Ч»)

- Т(в)

Т(4)

Т(3)

в<2)

-Ю-

составил 70%. Это свидетельствует о наличии скрытых (пиперидин лабильных) повреждениях мишении (около 20%) в полосе, соответствующей исходному олигонуклеотиду (ср. дорожки 5 и 6; рис.3).

Сравнение результатов, полученных при использовании адресованных реагентов, которые содержали этидиевые красители (еъ<1-1) и (еъ<1-2), показывает, что оба красителя одинаково эффективно модифицируют октануклеотид-мишень в составе дуплекса (э-4). Использование красителя (), однако, приводит главным образом к образованию скрытых (чувствительных к пиперидиновой обработке) повреждений мишени, в то время как краситель (.еьа-ъ) с большей эффективностью вызывает образование ковалентных аддук-тов.

Приведенные выше результаты однозначно доказывают эффективность использования этидиевых и азидоэтидиевых производных в качестве адресованных реагентов для фотохимической модификации НК в составе комплементарных дуплексов. Высокий квантовый выход фотореакцин использованием азидоэтидиевых реагентов позволяет проводить повреждение олигонуклеотидной мишени, используя возбуждение красителей светом низкой интенсивности и небольшие избытки адресованного реагента по отношения к матрице.

5. Фотохимическая модификация двуцепочечной ДНК.

Возможность сЬотомодификации дц ДНК была показана на примере модификации фрагмента ДНК, использованного ранее в экспериментах по футпринтингу (стр. 5). В качестве адресованных реагентов применялись производные тридекануклеотида, содержащие азидо-этидиевые красители (аге1<1-1) и (аге1с1-2).

Фотомодификация ДНК-мишени с использованием производного (АгЕ1<1-1)рс1(ТС)-с1Т привела к повреждению обеих цепей ДНК. При этом наблюдалось образование двух основных продуктов модификации пуриновой цепи (рис.4, стр;12). Первый из них явился результатом прямого расщепления цепи в - положении остатка йЫ). Второй продукт представлял собой ковалетные аддукты (АгЕ1а-1)р(ТС)£Т с пуриновой цепью. Основная часть аддуктов оказалась неустойчивой в условиях пиперидиновой обработки, которая приводила к расцеплению иепи в положении нуклеозида с(-1). Модификация каких-либо других нуклеозидных остатков не наблюдалось. Однако небольшая часть аддуктов оставалась устойчивой при пиперилиновой обработке

Р'С

1 2 3 4 G С

ПУРКНОВАЯ ЦЕПЬ + - ♦ - - . — О - «И

CC^ZTP

7 6 В 101112

пирвлвиноаля

ЦЕЛЬ + - ■> - - —

Jro

А о к а А а

А

О

М«Н

Ри с. 4

Радиоавтограф гель-

электрофореза при анализе продуктов модификации после облучения тройного комплекса фрагмента дц ДНК с три-декануклеотидным производным (АгЕ1(1-1)ра(1С)баТ до (-) и после (+) обработки пиперидином.

Дорожки: (1, 2)- УФ-облучение комплекса дц ДНК (АгЕъа-ПрсЦТСЬсИ; (3,

облучение ДНК с (5)-

контроль дц ДНК (32Р меченная пиримидиновая цепь). УФ-облучение: 150 Вт ксеноновая лампа при 337 нм (30 мин при 21°С). Лазерное облучение: азотный лазер (337 нм, ю мин при 21°С. Концентрации» 5-10_8М для фрагмента ДНК и 6-10_7М для (AzEtd-i)pd(TC)gdT. Буфер: 50 мМ ацетат натрия (рН 5,3), 150 мМ ЫаС1, 1 мМ ЭДТА.

с

4)- лазерное комплекса дц (АгЕЪ<1-1 )рс1(ТС )6с1Т; (А+О- расщепление; (6)-контроль дц ДНК (Замеченная пуриновая цепь); (7, 8)- УФ-облучение комплекса дц ДНК с (АгЕ1:<1-1)рй(1С}6с1Т ; (9, 10)- лазерное облучение комплекса дц ДНК с

(АгЕ1х1-1)рсЦТС)6с1Т; (11)-

(Т+С)- расщепление; (12)-

S

(см. рис.4, дорожки 1 или 3 и таблицу 2).

Что касается пиримидиновой цепи ДНК-фрагмента, то в этом случае основным продуктом фотомодификации оказались ковалентные аддукты. Незначительное количество прямых разрывов пиримидиновой цепи наблюдалось в положениях С(-1) и С(2) (см. таблицу 2). Пиперидиновая обработка облученной смеси привела к разрушению

ковалентных аддуктов и расщеплению пиримидиновой цепи в положении т (о).

Использование второго азидоэтидиевого реагента (AzEtd-2)pd(TC)gdT для фотомодификации дц ДНК позволило достичь высоких выходов модификации только пиримидиновой цепи ДНК-мишени. При этом наблюдалось образование ковалентных аддуктов и скрытых повреждений (чувствительных к пиперидиновой обработке), но не происходило образования прямых разрывов пиримидиновой цепи. После пиперидиновой обработки реакционной смеси выяснилось, что основной точкой модификации является нуклеозидный остаток Т(0). Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Степени модификации дц ДНК* [%) по различным нуклео-зидным остаткам после облучения в присутствии адресованных азидоэтидиевых реагентов.

РЕАГЕНТ РХР ПУРИНОВАЯ ЦЕПЬ '-10 g a KA Сума пиримадиновАЯ ЦЕПЬ -1 0 1 1416 с т т g g КА Сумма

(Aztítd-X)pT(CT)g -(AzEtd-1)рТ(СТ)е + (AzEtd-2)рТ(CT)g -(AzEtd-2)pT(CT)g + 15 0 30 45 30 0 15 45 ООО 0 ООО 0 сл 0 0 0 0 10 >10 5 30 0 0 0 0 35 0 0 0 0 0 35 35 5 65 0 0 0 0 70

* Структура ДНК-мишени:

-1 О 1 2 3 4 5 6 7 8 Э 11 14 16

...З'-Т ВСТТСТСТСТСТСТСТОЮО А...

...!'-А ССААбАСАОДСАбАСАСАССТ... »*

условия облучения: трансиллюминатор (320-420 нм); 30 мин при 21°С; концентрации: 5-10_8М для дц ДНК и 5-10"6М для азидоэтидиевых производных олигонуклеотидов; *** до (-) и после ( + ) обработки облученной смеси пиперидином;

сл - следовое количество; КА - ковалентный аддукт.

Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что тип азидоэтидиевого реагента является существенным фактором, определяющим направленность фотохимической модификации в комплементарном триплексе. Единственным разумным объяснением этого, на наш взгляд, может служить различное расположение остатка красителя в составе триплексной структуры.

Результаты, представленные в данном разделе, показывают возможность высокоэффективной фотохимической модификации дц ДНК 5'-азидоэтидиевыми производными комплементарного олигодезокси-рибонуклеотида, содержащими остатки красителей (AzEtd-i) и (AzEtd-2). Использование различных азидоэтидиевых производных позволяет избирательно модифицировать одну или обе цепи фрагмента ДНК.

6. Устойчивость ЭПО против нуклеазн0г0 гидролиза внутри клеток.

Как 1ыло показано в предыдущих главах, этидиевых производные олигснуклеотидов оказались эффективными реагентами для фотохимической модификации одно- и двуцепочечных НК in vitro. Однако, возможность использования реакционноспособных прозводных олигонуклеотидов в качестве инструмента для специфической модификации биополимеров в составе живых клеток ограничена рядом факторов. Одним из таких факторов является стабильность олиго-нуклеотидных производных внутри клетки.

Для изучения возможности использования ЭПО in vivo нами были проведены эксперименты по определению их устойчивости внутри клеток асцитной карциномы Кребса-С (АКК). Клетки АКК были

способны сохранять активность в течении 24 часов. После выдержи-32

вания р -меченных олигонуклеотидов или их этидиевых производных в клеточной культуре продукты деградации анализировали методом гель-электрофореза. Различные 3'- или 5'-этидиевые производные декатимидилата оказались более устойчивыми как в среде, содержащей клетки АКК, так и внутри клеток по сравнению с немодифициро-ванным p(dT)10 (таблица 3). Производные (ol-i) и (ol-5), захваченные клетками АКК, были практически полностью защищены от деградации. Олигонуклеотидное производное (ol-4), содержащее остаток этидиевого красителя на 3'-конце, оказалось значительно гидролизованным после выдержевания с клетками в течение 24

часов. Скорость гидролиза производного (01,-4), однако, была значительно ниже, чем у незащищенного декатимидилата.

Таблица 3. Стабильность этидиевых производных декатимидилата, выдержанных в клеточной культуре в присутствии клеток асцитной карциномы Кребса-2.

Производное (ЮсКТТТТТТТТТТХй') Процент исходного (неразрушенного) декануклеотидного производного (±10$) через 1ч через 24ч

(ОЬ-1) клетки 93 84

Р=рЫН (ЯС1) * , I?' =р () среда 85 90

(ОЬ-2) клетки 94 82

Н=рЫЩВС1), и'=р среда 88 79

(оь-з) К=Р. Р'=р клетки 21 следовое количество

(ОЬ-4) клетки 58 19

й=р. п'=р(Еьа-2) среда 39 6

(ОЬ-5) р=р(е1<1-2), 1?'=0Н клетки 95 95

* РС1 - остаток 4-[М-метил-Ы-(2-хлорэтил)амино]бензиламина

Таким образом, результаты таблицы 3 позволяют сделить вывод о том, что этидиевые производным декатимидилата (оь-х) и (оь-5) способны сохраняться в клетках АКК в течении времени, необходимого для проведения фотохимической реакции с клеточными

компонентами.

Результаты по устойчивости этидиевых производных декатимидилата внутри клеток АКК отчетливо демонстрируют возможность применения этих соединений в данной биологической системе. Это позволяет надеяться на потенциальную возможность использования ЭПО для исследования других живых объектов.

выводы

1. Разработан метод получения фотоактивных производных олиго нуклеотидов, несущих азидоэтидиевые группы на 3'- или 5'-концевом фосфате.

а) Синтезированы производные моноазидоэтидиевых (7-азидо,

2-Ы-(3-алинопропионилалидо1-Ю-этил-9-фенилфенатридин и г-азидо, 7-ы- (з-алинопропионилаяидо) -ю-этил-9-фенилфенантридин ) красителей, содержащие в положениях 2 или 7 линкерную группу

3-аминопропионовой кислоты.

б) Подобраны условия ковалентного присоединения синтезированных красителей к олигодезоксирибонуклеотидам, содержащим 3'-и/или 5'- концевые фосфатные группы.

2. Проведено систематическое исследование комплексообразующих свойств этидиевых производные олигонуклеотидов с одно- и дву-цепочечными НК.

а) Методом термической денатурации показано, что во всех модельных олигонуклеотидных дуплексах (исследовано 18 моделей) наличие ковалентно присоединенного остатка этидиевого красителя значителльно повышает стабильность комлементарных комплексов. Показано, что более прочные комплексы формируются при участии 5'- (а не 3'-) производных и в случае, когда остаток красителя направлен в сторону более протяженного неспаренного участка олигонуклеотидной матрицы.

б) Методом футпринтинга с использованием (СН^ЗОд впервые показано, что присутствие ковалентно присоединенной к адресу отидиевой группировки не препятствует образованию триплексной структуры двуцепочечной ДНК-мишени с комплементарным олигонук-леотидом-адресом. Кроме того, в случае тандемннх комплексов остаток этидиевого красителя способствует усилению кооперативных взаимодействий олигонуклеотидных производных на двуцепочечной ДНК-матрице.

3. На примере модельных олигонуклеотидных дуплексов проведено

сравнение эффективности и позиционной направленности адресованной фотохимической модификации, осуществляемой при использовании этидиевых и азидоэтидиевых производных олигонуклеотидов. Максимальные выходы адресованной модификации мишеней составили 70-75% для этидиевых и 80-85? для азидоэтидиевых олигонуклеотидных реагентов. Найдено, что предпочтительными местами повреждений олигонуклеотидных мишеней для этидиевых производных являются остатки дезоксирибогуанозина, как вовлеченные, так и не вовлеченные в образование дуплексной структуры. Азидоэтидиевые реагенты предпочтительнее модифицируют остатки дезоксирибоцитидина и, в меньшей степени, остатки дезоксирибогуанозина.

4. Осуществлена высокоэффективная модификация фрагмента двуцепо-чечной ДНК в составе комплементарных триплексов с азидоэтидиевы-ш производными тридекануклеотида (АгЕЪ<1-1 )р<1(ТС и (АгЕ1с1-2)рс1(ТС )6с1Т. Показана возможность повреждения обеих цепей ДНК. Максимальный выход точечной модификации достигнут в случае производного (АгЕ1<1-2)рс1(ТСи составляет 65-70$ (остаток ат(О) пиримидинбогатой цепи).

5. Показано, что наличие ковалентно-присоединенного к 5'-концевому фосфату декадезоксириботимидилата остатка этидиеьо-го красителя полностью подавляет ферментативный гидролиз олиго-нуклеотида внутри клеток АКК. Методом фотохимического мечения с использованием 3'-этидиевого производного декадезокситимидилата впервые проведена специфическая фотомодификация мембранных белков в клетках асцитной карциномы Креббс-2.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Benimetskaya L.Z., Bulychev N.V., Kozionov A.L., Koshkin A.A., Lebedev A.V. , Novozhilov S.Y., Stockman M.I. Site-specific laser modification (cleavage) of oligodeoxynueleotides. // Biopolymers. 1989. V.28. Jê6. P. 1129-1147.

2. Koshkin A.A., Lebedev A.V., Ryte A.S. Ylassov V.V. Ethydium oligonucleotide derivatives. Stability against cellular nuclease hydrolisis and photochemical modification of cellular proteins in the living cells. // Nucleos. Kucleot. 1991. V.10. P.541-542.

3. Кошкин A.A., Иванова T.M., Булычев H.B., Добриков M.И., Лебедев A.B. Фотоактивные этидиевые и азидоэтидиевыэ красители. Синтез, свойства и ковалентное присоединение к олигодезокси-нуклеотидам. // Биооргац. химия. 1993. Т.19. К5. С.570-582.

4. Mamaev S.V., Ivanova T.M., Koshkin A.A., Semuchina O.V. , Godovikova T.S., Sergeev D.S., Zarytova V.F., Vlassov Y.V. Sequence specific chemical modification of single- and double-stranded DNA fragments with reactive oligonucleotide derivatives. // Nucl. Acids Symp. Ser. 1991. K24, P.245.