Сайт-специфическая фотомодификация ДНК-фрагментов производными олигонуклеотидов, содержащими ароматическую азидогруппу тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

р\б Un

На правах рукописи УДК 577.963.057.113.6

. \ oiil VJÜJ

Табатадзе Давид Резоевич

САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ДНК-ФРАГМЕНТОВ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИМИ АРОМАТИЧЕСКУЮ АЗИДОГРУППУ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации насоискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск — 1993 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН.

Научные руководители: кандидат химических наук Левина А.С.

доктор химических наук Зэрытова В.Ф.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук ЗагреСельшй С.Н. кандидат химических наук Лебедев А..В.

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А..Н. Белозерского МГУ

Защита состоится " ъкт&сГр & 1993 г. в! часов на заседании Специализированного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск 90. пр.Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии.

Автореферат разослгп "_" он1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук

О.С. Федорова

Актуальность проОпеки. Для решения кногих биохимических задач весьма актуальным остается поиск новых сайт-специфических олигонуклеотидных реагентов, действувидах на генетический материал. Эти реагенты должны отвечать определенным требованиям. Во-первых, комплекс, образуемый олигонуклеотидным адресом реагента с НК-мкшевью, должен быть достаточно термостабильным; во-вторых, они доданы быть стабильными в физиологических условиях и достаточно резкшокносюсобшми. Желательно, чтобы они могли "включаться" только при определенной воздействии. Из всех изветных олигонуклеотидных производных, содержащих химически активные группы, этим требованиям в большей степени соответствуют фотоактивнке производные олигонуклеотидов. Они вступают в реакции только при облучении светом; кроме того, они гораздо более реакционноспособны по сравнении с другими модифицирующими группами. Если для сайт-специфического воздействия на Ш-мишени олигонуклеотидньвш реагентами, содержащими алкгшрующие юм окислительно- деструктурирутаще группы, требуется несколько часов, или, иногда, суток, то действие фотореагентов при оптимальном выборе условий облучения можно свести к минутам и даже секундам.

Цель работы. Целью настоящей работы было создание новых олигонуклеотидных рёагентов, содержащих фотореакционноспособные группы на основе ароматических азидов, для эффективного и селективного воздействия на ДНК-мишани.

Научная новизна. В настоящей работе впервые синтезированы олигонукле отидяые производные, содержащие п-азидотетра-фторбензоильнуи, 2-нигро-5-азидобензоильную и п-азидобензоильную группы при СБ-положении остатка дезоксиуридина. Зарегистрирована высокоэффективная сайт-специфическая фотсмодифика-ция ДНК-фрагментов длиной 15 - 27 звеньев олигонуклеотщшши реагентами, несущими ароматическую ззидогруппу. Выявлено значительное преимущество перфорированного арилазида в качестве фотоактивной группы. Степень образования продуктов ковалентного присоединения реагента к мишени в этом случае достигает 70?. Определена позиционная направленность фотомодификэции. Исследована специфичность использованных фотореакцисннсспособных груш по отношении к разным гетероциклическим основаниям. Изучено воздействие тандема реагентов на одноцепочечную

з

одигонуклеотвд-нишень. Показано, что перфтораршюзшшые производные олигонуклготвдов с успехов котут быть использованы для фогойодафийацва ода- в деудапочечныв фрагкентов ДНК в условиях образования тройных кошззксов. Степень фотоводафшсада ее и йв дНК-мшаеней достигает 775 в 533 соответствен®). Практическая ценность . Пргдшгевы в эксперггентально испытаны новые эффективные сгЯт-спгщи&ичес»® олигозуклеотвдтй фотореагенты, несущие аридазвдные группа. Стабаяьность в физиологических условиях, способность образовывать достаточно прочные комплексы с фрагееетака НК, возшзвость реагировать с высонга квантовым выходов при облучеши Уд-светом низкоа мощности делает предложенные рг агенты перспективными препаратами для направленного воздействия на НК на клеточной уровне. Предложенные фотоактивные реагенты вогут Шль использованы как удойный инструмент исследования различках процессов в хроматине, нуклготвд-зашсияых свстеках, протекашдх с участкеи рибосон, иатрично-завасшьа ферментов в т.д.

Апробация работы. Результаты работы докладывалась на иеаду народной сиипозиукг "йштетЕчесюве олитонуклеотида: проблемы в области практического использования" (йосква, 1991), на международном секпозиуке "Антисенс-шаггонуклаотида в рибонуклеазы Н" (Франция, 1993).

Публикации. По ыатераалаа дассертации опубликовано 4 статьи. Объем работы. Диссертационная работа галогена на иь страницах машшопистго текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы еэ 184 наименований и содержит 17 таблиц и 13 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ Аронатические аэвду представляют интерес как фотореагенты, поскольку обладают васогаш квантовым выходом фотоиоди&икации. Однако олигонукпеотвдвые реагенты "того класса, описанные в литературе, оказались недостаточно аффективны. В данной работе в качестве фотореагентов ш использовали олигонуклеотидаые производные, несущее п-азидотетрафтор-, 2-нитро-Б-азидо- и «-азидо- Оевзоильные группы Был разработан метод получения олигонуклеотвдов, содеряавдп аюшолцнкер при сб-атоме дезокси-урвдина, и фотоактявные группа были введены в различные положения олигонуклеотидноЯ цепи.

I. СИНТЕЗ ФОТОАКТИВШХ ОДИГОНШЕОТНВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ»

содатавд АРилАзздотппу

Производные дезокснурздзна* с разлачныни спейсерзии

были получены ш следущэй схеке:

1) LlN,

I

I

yCHjOÇHjCM^MHCOCr^ (Il6ï

2) NH%OH,3) CF,COOC,Hs

z

ИНцОИ

(III)

0

ТГА-^î-Ala-OSuc

уСН2МИСОСНяСЛа1<НСОСГэ (IIB)

R'=CH,Br,CH,N3 » CH2OCH,CHiNHi,CH2HH2, CHJOCHJCHJNHCOCFJ.CH,NHCOCHICHaNHCOCF3

dRib

Бромированием 3 ', 5 ' -О-диацетилтимидина получали зачищенный • 5-брошетилдезоксяуридкн (О, который является исходам - соединением при синтезе производных (иа-в), несущих аминоспейсеры различной длины.

Для получения 5-азвдометилдезоксиуридина (На) соответствующее броипроизводное (I) было обработано азидом лития и затем конц. водным аммиаком для удаления ацетильных запитвых групп. Использование N-ззциценного ашшозтанола дам взаикодействия с. бромпроизводдам (г) приводит в результате указанных в схеме реакций к соединении гиб). Обработка акмиаком соединения (I) приводит к образован™ 5-акинонетиддезоксиуридана (ni), который при взаимодействии с N-оксисукцинияидаьга эфирои м-трифтор-ацетшнз-аланина (rFA-tf-ALa-osuc) дает 'соединение шв>.

Выход продуктов на каядой стадии синтеза составил 60-90%. Структура полученных соединений,подтверждена с помощью ИК- и . ПМР-спектров.

^Префикс d в обозначении дезоксинуклеозвдов и олигодезоксирибо- ■ нуклеотидов везде опущен.

Выход продуктов на каадой стадии синтеза составил 60-90%. Структура полученных соединенна подтверждена с помощь® ИК- и 1МР-спеутров.

. Из • полученных соединений (iia-в) были синтезированы Н-фосфонатвне мономеры для олигонуклеотидного синтеза по стандартной схеме:

о

DMTrcl 1.Sal PCI II

IT-— (DMTr 1Ü* .-— (DMlr )UR-0-P-H '

2.н_о I

(II) (IV) (V) 0"

a) R;= -CHjNg б) В = -CH20CH2CH2NHCOCF3

В) К = -CHgb'HCOCHgCHgNHCOCFg; SalFCl -саЛИЩЫХЛОрфрсфиТ

Используя подученные скнтоны (va-в), наряду со стандартными Н-фосфоэатшми монриерами, была синтезированы следушде олигонуклеотида, содераашде модифицированный дезоксиуридин:

ubNH'rcccA (Via,В)

ulnh'ccactt (Viia,0,B> a) l = -С№- .

TCCACUl,NHaT (VIIla.6) 6) L = -CH1OCH2CH2-

CTTTCACU1'""1 (1X6) B) L = -CHzNHCOCffeCHz-

caculmh=cac (X 6)

Состав полученных олигонуклеотидных;. производных, был подтвержден с помощью ферментативного 'гидролиза (ФДЭ - и 5'-нуклеОтидэза из яда кобры).

Кргиг цроизводных (vi-x¡.'были получены олитонуклеотиду, . со-дерашие аминогруппу на 3' шм 5'-концевом фосфате (xi-xiv i по известной методике (Годовйкова и,др. 1986).

s'HaNÍCHa'aNH-pTCCACTT XI > 8CCAAAp-HN(СНа )3NH2 а' i XII.I >

GCCAAACp-HN(CH2 )3NHa (XII) ; HN, (CH, )3NHrp( I )ie ' ' . (XIV

Ацялировашем аминогрупп.' в составе олиго'нуклецтидов (vi-xivtс помощью N-оксисукцинкмидных .эфиров соответствующих, азвдобензойшх .кислот были Синтезированы' ¡'о^рнуклеотйДкш ■производные <XV-XXV), содержащие n-азиди-,. п-азидоотетрафтор-. и '2-1Штро-5-азидобензоильше гругащ, с выходом 70-85?.: ■

i ; / * ■

i. ■ / ■ .

иьмн"тсссд 3

Соединения, содержащие арилазидную группу, при выделении с помощью обращенно-фазовой хроматографии элшруются при большей концентрации ацетонитрала по сравнению с исходными эминосодержащими олигонуклеотидами.

(XV в)

(яла-е)

(ЯШб) ( XVII1б) (Х1Х6)

^"""ССАСТТ и^ссдстт

(XXII)

(XXIII)

(XXIV)

стттсдси

слси^-дс

^(СН,)3-рТССАС7Т СССДАДСр-(СН3 )3КНЯ СССААДр-(СН3 К*НМ(СН3)3ММ-рТх>

и = а>-сн,-, б)-сн,осн,сна-, в)-сн,мнсоснасн2-

Й =

(ХХб) (ХХ1б)

(XXV)

N0,

Введение зрияазвдзых групп в олигояуклеотида не только не приводит к дестабилизации соответствующих комплементарных дуплексов, но даже несколько увеличивает (на 4-5°С) их Тш.

2. КОМПЛЕМЕНТАРНО-АДРЕССОВАНАЯ ФОТОМОДИФИКАЩЯ ДНК-ФРАГМЕНТОВ АРЙЛАЗВДНШИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЖГОНУКЛЕОТВДОВ. Полученные олигонуклеотидные реагенты, содержащие вышеназванные ароматические азвдогруппы-, были использованы для фотомодификавди ДНК-фрагментов.

Первоначально были проведены эксперименты с целью выбора условий фотомодификавди. В качестве мишени был использован 32р-меченый пентадекануклеотвд (xxvi), а в качестве реагента -

комплементарный ему олигонуклеотид (дагв).

? ^

з- рТААСТЕСАСТТТ&ЗС э (XXVI)

»- ттсассиьмни = (ху1в) Фотоактивацию ароматического азида проводили светом ртутной лампы ДРК-120 на длинах волн ЗЮ-365 нм в течение 5 мин. Реакционные смеси после облучения анализировали с помощью гель-электрофореза. Облучение мишени (XXVI) проводили в присутствии ^модифицированного гептану хлеотвда тссастт, реагента и"'"""*ссдстт (х\лв), некомплемент арного генсануклеотида ^"""тссса ( хув), «-азидотетрафторбензойной кислоты, а также в

отсутствие всяких реагентов. Шло показано,- что • специфическая модификация мшени происходит только в комплементарном комплексе (рис.1). При этом образуются продукты ковалентного присоединения реагента к мишени. Обработка реакционной смеси пиперидином после облучения привода к разрыву'. мишени • да модифицированным основаниям; при этом обнаруживается, преимущественная модификация оснований 07 и сЭ, находящихся вблизи фотоактивной группы.

Рис Л.Радиоавтограф геля, получен-

12 3 4 «>5t 7 »»

ный при злектрофоретическом анали-

гзг

зё мишени с р 3 ТAAGTGGAGT TTGGC, в

отсутствие реагентов (Г,10), в при. сутствии. гептануклеотидэ тссдстт (2,6), в присутствии фотореагента £ . (»гш> (3,7), некомпяеменгарвого

'. v 9 фотореагента ulnhrtccca (xvb)(4,8)

■ • • ;'. и n-азидотетрафторбензойной кисло-

ты (5,9), Дорожки 1-5 - до, 6-10 -' • . * . после обработки реакционных смесей

■ шперидином. Концентрация'мшени 5I0~a М, реагентов - 510"^М; буфер: 0,16 М nocí, 0,02 М кнаро». 0,1. шМ ЭДГА, рН 7,4. . ' Было показано, что максимальная ' степень• фотомодафикации мишени достигается при соотношении мишень - реагент.. 1:10 при температуре 4°С. Оптимальное время для фотомодификации реагентом,- содержащим перфтораршшидную . группу ,.' .оказалось равным 5 мин, что согласуется со значением (1,5 мин),

полученным при фотолизе перфторарилазидной группы в-растворе. .." .• На следующем этапе было проведено- сравнение-реагентов, . 'содержащих перфторарилазидогруппу либо на 5'-концевом фосфате .{реагент. шп, либо при С5-атоме дезоксиуриоина (реагенты xvi а-в).: Варьировалась также длина спейсера при ' С5-атоме •. дезоксиуридина. Степень • '• ■ образования ■ ковале нтшх -, адцуктов ■определяли, до обработки реакционной смеси пиперидином' (рис.2, дорожки 1-4). Для определения позиционной направленности фотомодафикации аликвоты реакционных смесей подвергали.обработке. ;■ шперидином. и также' анализировали с ' помощью гель-электрофореза . '.(рис.2,-дороаски 6-9). После обработки пиперидином большая. часть продуктов модификации подвергается деструкции с разрывом -..мишени

го модифицированным основаниям. Предпочтение может быть отдано реагентам (№16) и (ххгг), поскольку в этом случае при достаточно высокой общей эффективности (около 7055) происходит преимущественная модификация по остатку йэ.(ЗОЯ), а кодификация по другим остаткам не превышает 1% (дорожки 7»9). Реагент (тв) проявляет приблизительно такую ае эффективность модификации.

•■;' Рис.2. Радиоавтограф геля.

ши

•994

** и 13.

«

щ . • 6' . в т

. . полученный при электрофо-. •. ретичаском анализе мишени , 1я^1Тмбтоо!А<ггпг«зю< под-• вергшейся. облучению в при-сутствии■реагентов (ша-в) 'и (XXII)'; дорожки 1-4 - реакционные смеси до обра' ботки пиперидином;.дорожки 6-9 - после такой обра-• ' , бтки, дорожка 5 -.исходная

мишень.' Концентрация' мишени и реагентов и буфер ^ .'.'■- как в подписи-к ркс.1.. Реагент (ху1а) с коротким- спейсером оказался.во.всех''■■.отношениях наименее .подходящим:- степей, .модификации ' в .' этом -.случае ,' была примерно в-двз раза.меньше, чем для реэ1^нтсв (тб) или Чххт; кроме того,-при обработке пиперидином не - происходит выраженной модификации по какому-либо основании; степень воздействия на остаток с9 не превышает Ь%.

. Изложенные .'результаты ■свидетельствуют,.' что -оптимальными условиями для фотсмодификации олкгонуклеотвда-мшени / является 10-кратный избыток реагента'.по- отноиенш к-мишени,.-/'4?с,-"; 5 мин Облучения; ■ Максимальный.-. выход. ковалентных -,адцуктов/;\(70Ж) достигается,; когда • фотоактивная труппа . присоединена; -к; -. концевому фосфату или .С5-атому дезоксиурщдина через: .спейсер- длиной 6-7 атомов.. .-;.' ■;.•'. '. '.'• '•■'.■:•-.''.-.•; .

В . настоящей работе было ' проведено сравнение/', эффективности воздействия, олигонуклеотидных- производных ;с. различными ■' -амидогруппами ;.(хугб,' - даиб.' • х\цпб) на ДНК-мигена <хш-хх!х), содержащие разные ; пуриновые.' ;'и.пиримщсиновые основзния в предполагаемом месте м0да{)икации.'

/4-6 . м-л

5 ТААСтаЗЛСТТТС(ХЗ( XXVI ) 5 ТААйТОЮ АААААААА ( XXVIII) м-с М-Т

талстскзАССССССС(XXVII) ТАМТССАТТТТТТТ( XXIX)

При анализе реакционных смесей после фотомодификации мишеней реагентами ()Шб> и (ХУПС) во всех случаях наблюдается образований ковалентных аддуктов (табл.1). Таблица I. Результаты модификации олигонуклеотидных мишеней фотореагентами (ХУ1б) и <хупб)

Иишень XXVIII XXVII XXIX XXVI

Реагент ХУ16 ХУИб ХУ16 тгб ХУ16 ХУИб ХУ16 ХУПб

Выход продуктов ковалентного присоединения,% 45 10 45 15 40 15 70 20

Степень модификации после обработки пиперидином,% * 50 30 50 45 50 30 70 35

* - за вычетом неспецифического расщепления мишени, которое составляет =10%

Фотореагент (ХУ1б), содержащий п-азидотетрафторбензоильную группу вызывает существенно больше ковалентных сшивок реагента с мишенью, чем реагент (ХУНб) с 2-нитро-5~азидобензоальной группой. Для обоих реагентов количество ковалентных сшивок зависит от состава мишени; максимальный выход ковалентных аддуктов наблюдается для олигонуклеотида м-а. В случае реагента (XVI пб) с п-азидобензоильной группой степень модификации не превышала 556.

Для выявления щелочелабильных продуктов модификации мишеней реакционные смеси анализировали после их обработки пиперидином. Значение степени модификации, определенное после такой обработки (табл.1), увеличивается за счет скрытой модификации мишени, т.е. модификации, не приводящей к ковалентному связыванию олигонуклеотидного реагента с мишенью. Во всех случаях фотомодификация реагентом (ХУПб) приводит к большей скрытой модификации по сравнению с реагентом <тб). Наибольший вклад скрытой "модификации наблюдается для мишени XXVII.

Позиционную направленность щелочелабильной фотомодификации

ю

всех четырех мишеней фотореагентами (xlvi б) и (хит б) определяли после шперэдцшовой обработки. Результаты приведены на рис.3 в виде гистограмм, полученных при обсчете денситограмм соответствующих дорожек радиоавтографа.

Обнаруживается различная специфичность реагентов к разным основаниям. Видно, что аелочелабильной модификации реагентом (XVI6) подвергается предпочтительно остаток гуанина, а реагентом (XVH6) - остаток цитозина. Очевидно, это связано с разными фотохимическими свойствами реагентов. (Известно (Починок и др, 1979, Young et all, 1989), что при облучении перфторарилззидов и нитроарилазидов образуются синглетный и триплетний нитрены соответственно). Оба реагента преимущественно модифицируют 9-е положение мишени, если в этом месте находится предпочитаемое гетероциклическое основание; если в 9-м положении находится другой нуклеозид, модификации подвергается наряду с ним также находящийся рядом остаток g в случае реагента <xvi6) и т - в случае реагента' (XVii6>. С точки зрения предпочтительности модификации нуклеозиды располагаются в следующем порядке: о>с=т^а для реагента (Xvr6) и c>t>g>>a для реагента (Xvn6).

Нитроарилазадный реагент с xvr 1(5 з отдает заметное 'предпочтение пиримидшовым основаниям: при этом, в основном, происходит скрытая модификация мишени. Практически полностью отсутствует модификация аденозина.

Во всех случаях после пиперидановой обработки остается значительное количество продуктов сшивки, не подвергающихся расщеплению. Для фотореагента cxvii6) выход ¡целочестабшгьных продуктов мал (4-5Ж) и практически не зависит от строения мишени. Для фотореагента (XV16) выход подобных продуктов заметно выше (достигает 20%). Нерасщепляющиеся пиперидином продукты практически всегда образуются при фотомодификации нуклеиновых кислот. На наш взгляд, одним из возможных вариантов такой модификации может быть внедрение нитренз по связи С8-Н пуринов.

Для реагента (XVI6) был проделан дополнительный анализ, заключающийся в том, что обработке пиперидином подвергались по отдельности две фракции реакционной смеси, одна из которых совпадает по электрофоретической подвижности с исходной мишенью ■ х., а вторая соответствует продуктам ксвалентного присоединения реагента к мишени (Yi (рис.4).

Рис.З. Гистограмма, полученные при анализе продуктов фотомодификации мишеней после их обработки. пиперидином. Результат воздействия реагентов (умхб) (светлые столбики) и с»шб) (темные столбики) на мишени ХХУ1-ХХ1Х.

5 10 15

лИ

ТДАОТССДСТТЮСС

??т

ч;

I

ТААСТеСАТТТТТТТ. т

. I

. г

^1.1.1

л1и

..Рис.4. Соотношение степеней 'фотомодификации мишеней (М-А), (М-С), (М-О И (М-Т) по разным основаниям, определенное после пиперидшю-вйй обработки фракции х (исходная мишень), и у (ковале нтные аддукты) (пунктирные и сплошные стрелки.'.' соответственно) для,реагента ' (тб).

• При обработке шаперадном фракции х обнаруживается скрытая модификация,' о -.'которой:', говорилось . выше. относительно. всего .количества вещества.в этой фракции она составляет 30-40% и максимальна для миишеци' хжш. В случае мишеней XXVII и XXIX она происходит преимущественно по 9-му .■ положению," где,, находится пиримидиновое основание..- В.случае XXVI модификации" подвергаются в большей^степени:положения 10 и II, где расположены остатки

ТДАвТБСДАДДАДДА

ПП

ТДДСТЮЗАССССССС

: ■ ' • I • .1

тимина. При отсутствии т и с вблизи места модификации (М-А) скрытая модификация не имеет выраженного характера (рис.4).

.Полученные результаты показывает, .что реагенты (!Шб) и ГШ 16) вызывают разные типы модификации: для реагента (х9У1б) характерно образование . продуктов ковалентного присоединения реагента к мишени, а.для реагента (XVЮ) - скрытая модификация..

. Суммарная степень модификаций реагентом сотЮ) с учетом скрытого повреждения мишеней составляет 60-75%. • Фотореагент (»щб) оказался существенно менее эффективным, чем реагент (ХУ1бособенно в', отношении выхода . ковалентных аддуктов (Приблизительно в. 3 раза);., суммарное- количество ковэлентвнх сшивок..и скрытой модификации Достигает 25-50%.

. В настоящей работе- исследовайа фотомодификация пентадека-и гексадекануклеотвдов (XXVI> и (XXX) : реагентами, • ■ содержащими ; п-азидотетрафторбензоильную группу - в разных :. • положениях олигонуклеотвда-адреса: на 3 *- (реагенты ХХ1П и XXIV), шш на 5'-концевом ' фосфате .- (реагент . ■ ххп> или . при ■■ с5-атоме дезоксиурадша-(реагенты. (XIхб; . ххб'.' и XXI <5),' а также с. помощью'пар. • ' реагентов,. .комплементарных . соседним, участкам мишени (тандемы реагентов (ххп+хх1ш и (ххы+ххт).

5 ' Э ' з» 3 *

;'.'■ таавтссаотттизс (xxvi) . двдадетсает^атс . (ххх>.

ьмн'я

'ттсдсстр-гс1 (xxii) эстттсаси (xx) .';.■:■."

з

1. кнн

«..рсмдсса (XXIII.) -'¿¿акж (Ххи

3 я'рддмев (ту) ; .

ькнн1 -С1

. "тцсасст ' (xix)

/После-проведения фотомодифвдации мишеней и анализа результантов: обнаружено, что для всех-реагентов, содержащих .фотоактивную' группу • па концах .'олигонуклеотидной• цепи,.' степень • ковалентных.: аддуктов-при. 10-кратвом'' избытке,-реагента достигает 701. При' использовании- тандема - реагентов - '.соотношение олигонуклеотидов'. '.(XXVI)-: (XXII): ( XXIII). Ш (XXVI)-': < XXII)/; (XXIV), ' равнее 1:2:2, дае.т.-'более;'высокую степень' модификации «киеки (80%).'- -

' Для реагентов. несущих':: фотоактивше группы на • с5'-ат,оме.

дезоксиуридкна внутри олигонуклеотидной цепи (xix.xx.xxi), степень образования ковалентных адцуятов уменьшается до 50-55%. Более низкая степень модафикации реагентами шх-ххп является, скорее всего, следствием того, что модифицируемое основание вовлечено в образование дуплекса. Во всех случаях модификация происходит по остаткам гуанозина, приближенным к фотоактивной : груше.

в случае тандемов реагентов (ххп+ххпп и (ххи+ххху) основной . точкой модификации мииени (XXVI), приводящей к образованию ¡аелочелабильных продуктов, является гуаниновый . остаток аэ; при воздействии на мишень тандемом ( ххп+ххт направленность воздействия на основание аэ усиливается: степень кодификации остатка 09 в этом случае достигает 40%, тогда как при.использовании тандема (ххп+ххип она составляет =зо%. Это дополнительно свидетельствует о том, что перфтор-аралазидаая группа предпочтительнее модифицирует остаток гуанозина, не вовлеченный в образование дуплекса.

з. фотшодйфиклщя в тройном комплексе Сайт-специфическое воздействие на двуцепочечные ДНК является актуальной проблемой, перспективы решения которой наметились в последние года. Такое • воздействие стало возможным с помощью резкдаонноспособных производных олвгонуклеотвдов, образующих в определенных условиях тройные комплексы с комплементарными участками дауспиральной днк.

° настоящей работе исследована са£т-спецЕфическая фото-иодификация 27-звенных одно- и двуцепочечных дак-фрагментов в условиях образования тройных комплексов (комплексы 1 и 2 соответственно). В качестве фотореагента использовали гекса-декатиивдилат, содераащий перфтораралазидаую грушу на 5'-концевом фосфате, к* р(т)«в (XXV).

» ^»ир-к1 (xxv) а*1вСССАСе-(А11в-вТСв (xxxi) ? г«

.»'рОСОСАСв-(А)1в-вТСО»-'(ХХП ' к1.р(Т)1в (XXV)

в*р(Т>1в (/хху)з. сесбТ0с-(Т)1«-САССр(хххи) комплекс 1, комплекс 2

6-/ 6-2 6-У 6--гь--у .. 6-2 6-2 6-/ 6-2 5-/ Т'С ¥ гг ч гг ч гг * /г ч и ь гг ' * гг *.->г -?г * ¿г с ¿г * л | у 1 и »« »» в-л > пч1 ге а и гз г», гг «

в ®

Рис.5. Радиоавтограф геля при электрофоре ?те скок анализе вв. и г(е ДНК-мишеней (комплексы 1 и 2) в. буферах Б-1 и Б-2 при '4°С й 22"С. Дорожки 1-4, 15-18 иллвстрируют''модификацию пурин-богатой , цепи в комплексе (1).; дорожки- .19-22 - той ; же . цвот в

комплексе (2)-, дорожи 9-12,'-2з-ае - пиримидин-богатой ■ ц&ш в комплексе (2). Дорожки 1-ю реакционные смеси - до обработки пиперидином, дорожки 15-26 - после-,такой обработки. Дорояйи 13.и • Т4 - продукты расщепления цепе'й,-пурин- й пиримидин-богатых..-цепей по остаткам пуринов. Буфер Б-1. ' (0,1'■ М СДС1/10мМ . .трис-г'нсгЛмЙ спермин, >Н7,&), буфер Б-2,- (:1.МЬ1С1/10мМ трис-нЛЛмМ -спермин,-рн7,5). Кпiп№нтрациямишеней т*5'10~а.м,реагента 5-10"® м/ •

Г5-.

6отонода|икашш проводили в буферах Б-1 и Б-2 при 4° и 22°С (Б-Г- 0.1ЫЫ.С1/Ю ий трас-нС1/1 ми спермин, рН 7,5. Б-2 - 1,0 М ИС1/10 тМ ?Р2С-НС171 кМ спераин, г« 7.5).

Во всех случаях облучение приводит к образованию ковалентных адцуктов - продуктов присоединения реагента (XXV) к мишени (рас.6, дор.1-12).

Образование тройных комплексов было подтверждено данными по их термической денатурации (детектируется два максимума на дифференциальных кривых плавления).

Суммарный выход продуктов ковалентного присоединения реагента (XXV) к мишени в комплексе (1) составляет 60-77%. В коиплексе (2) реагент присоединяется к обеим - аденозин- и тшддин-богатой цепям с выходами 27-372 и 6-1656 соответственно. Выход ковалентных аддуктсв существенно зависит от условий проведения реакции: повышается при охлаждении реакционной смеси <4°с), при использовании большого (10-кратного) избытка реагента и буфера с высокой ионной силой (I Ы).

В случае комплекса (1) образуются ковзлентные аддукты х,у,г с различной электрофоретическоЯ подвижностью (рис.5, дор.1-4). Фракции X и У образуются соответственно при антипараллельном и параллельном расположении реагента по отношению мишени. а фракция ъ является результатом одновременного присоединения двух молекул реагента.

Основными точками модификации в комплексе I являются основания 07 и 024 мшени, а в комплексе 2-е? аденозин-богатой цепи и 022 тимидин-богатой цепи.

Полученные результаты свидетельствуют, что перфтор-арилазидные производные олигонуклеотидов являются эффективными реагентами для фотомодификацки как ев, так ис1о ДНК-мишеней.

Предложены и испытаны новые эффективные сайт-Специфические фотореагенты на основе олигонуклеотидов, ..несугёх арилазидные группы.

I. Разработан метод получения производаах.олигонуклеотидов, содержащих аминоспейсеры различной длины при С5-атоке дезокси-уридина. Синтезированы фотоактввшг производные олигонуклеотидов, несущие арнлазивдные группы/ (пг-азидобензоаяьну в, 2-нитро-5-азидобензоильную или п азидотетргфторбензоильную)' на . 3'- или

г«

5'-кошевом фосфате ала при С5-атоме дезоксиурэдана. Показано, что полученные производные способна образовывать стабзаьшз комплементарные комплексы. В работе синтезировано и ветояьговш» 10 олиго-'нуклеотидов длиной от 6 до 16 звеньев, содзрзвада фотоактивную группу.

2. Впервые, с высоким выходоа, осуществлена свАт-спацЕфзчвсвая фотомодификация олигодезоксирябонуклеотвдов-щааекй олигонзялао-тидными реагентами, несущиш арсматаческув азясогруппу.

а) Подобраны условия проведения фотояодзфзнзши (теыпература, время реакщи, избыток реагента по отношение к кшейа).

б) Показано, что предельная степень фотоаодф&ации сущестезгао зависит от типа используемого арилазида. Выявлено значительное преимущество п-азвдотетрзфторОензоильгой группы.

в) Для перфторарилазидаого реагента показано, что иакспаалызыЗ выход ковалентных аддуктов (70Ж) достигается, когда фотоэктнвнэя груша присоединена к кошевому фосфату или с5-атону дезоксн-урвддаа на конце цепи через спейсер длиной 6-7 атомов. Есла фотоактивная группа находится внутри цепи, модификация несколько менее эффективна (50-551 ковалентных аддуктов).

г) На исследованных моделях определена позиционная направленность фотомодификацш, выявлена избирательность аралазядаых реагентов к различным основаниям г.гае ни: для п-азидотетрзфтор-бензоильной группы наиболее "уязвигяым" оказался гуаштоэый, а для 2-нитро-5-азидобензойльной - цитозиновый остатки, расположенные рядом с фотоактивной группой и не вовлеченные в образование дуплекса.

3. Показано, что фотомодификация вызывает несколько танов повреждения шпени: образование ковалентных, щелочестабалызых или щелочелабильных, продуктов и скрытое повреадеше иишени, проявляющееся при обработке пиперидином. ' Для. п-азидотетрафтор-бензоильной группы и туаяинового остатка характерно образование ковалентных аддуктов, для 2-нитро-5-азидобегооильноЙ группы и цитозинового остатка - скрытая модификация.

4. Осуществлена сайт-специфическая фотомодйфинация лерфтор-арилазидным реагентом одно- и двуцепочечного фрагментов ДНК в условиях образования тройных комплексов с выходом ковалентных ' аддуктов 11% и 58% соответственно; во втором случае модифицируются обе цепи мшенй.

Основные, результаты диссертационной работы опубликованы; в следующих сообщениях:

1. Зарытоза В.Ф., Комарова Н.И., Левша А.С-., Лохов С.Т,, Табатадее Д.Р., Халимская . Л.М., Александрова- Л.Д.. ' Сштеэ олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих кодифицированный по- .05 дезоксиуридин с алифатической ашшогруппой//Биоорган. химия (1991) т.17. N8. с,1059-1065.

2. Tabatadze D.R., Dobr'ikow М.1., Levins А.С., Prikhodko Т.Д.,-Shiahkin Q.V. , Zarytova V.F. Sequtr.ee-specific photomodification. of nucleic acids by oligonucleotide derivatives bearing aromatic azldo groups // Nucl,.Acids Res.Eymp.ser. N 24. p.247.

3.-Добряков М.И., Зарытова В.Ф,, Комарова Н.Й., Левина ¿.С., Лохов . 0.Т., Приходько- Т.Д.., .Шишкин Г.В., Табатадзе Д.Р., Заалшзили М.М. Эффективная' комплементарно-адресованная фотомодификация нуклеиновых кислот производными олигонуклеотидов, содержащих ароматическую азидогруппу //Биоорган.химия (1992) т.18. N 4. с.540-549.

4. Добриков М.И>, Горн" В.В., Зэрытова -В.Ф., Левина к.С., Приходько Т.А., Шишкин Г.В., Табатадзе Д-Р., Заалишвили М.М. Комплементарно-адресованная фотомодафикашш нуклеиновых кислот

■арилазидаыми и. гарфторарилазидными производными ;олигонуклеотидов. it. исследование специфичности по отношению к нуклеозидам //Биоорган, химия (1992) т.18. N 9. с.Г990-1998.

1