Фотомодификация нуклеиновых кислот флуоресцентными производными олигодезоксинуклеотидов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 547.963.3+535.217+535.371

БУЛЫЧЕВ Николай Владимирович

ФОТОМОДИФИКАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ ' ПРОИЗВОДНЫМИ 0ЛИГ0ДЕ30КСИНУКЛЕ0ТЩ0В.

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 1991 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР.

Научный руководитель - кандидат химических наук

Лебедев Александр Васильевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Петренко В.А. кандидат химических наук Буторин А.С.

Ведущая организация: МГУ, Институт физико-химической

биологии им. А.Н. Белозерского

на заседании Специализированного совета К 003.52.01 при Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект Лаврентьева 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР.

Защита состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

О.С. Федорова

Актуальность проблемы. В настоящее время синтетические олигодезоксирибонуклеотиды являются незаменимым инструментом исследования в биоорганической химии, молекулярной биологии и медицине. В частности, они широко используются для конструирования искуственных генов, сайт-специфического мутагенеза, гибридизационных тестов и, особенно эффективно, для аффинной модификации биополимеров в варианте комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот. В последнем случае, как правило, применяют алкилирунцие, платинирующие и каталитически активные производные олигонуклеотидов. Однако, особый интерес представляют производные олигонуклеотидов химически неактивные в обычных условиях, но способные резко повышать свою реакционную способность, т.е. "включаться" при воздействии физических факторов. В качестве таких производных перспективны олигонуклеотиды с ковалентно-присоединенным остатком красителя, а в качестве "включателя" - свет в диапазоне от 300 нм и выше, где нуклеиновые кислоты не поглощают, но поглощает краситель. Разнообразие последних, а также источников света с возможностью выбора подходящего спектрального диапазона и мощности излучения позволяют надеяться на создание универсального метода "комплементарно-адресованной фотомодификации нуклеиновых кислот".

Цель работы заключалась в разработке производных флуоресцентных красителей, методов их введения в состав олигонуклеотидов и использовании полученных флуоресцентных производных олигонуклеотидов для фотоЬюдификации комплементарных олиго- и полинуклеотидов.

Научная новизна. В работе впервые синтезированы производные олигонуклеотидов, несущие на З1- или 5'-конце флуоресцентные группы на основе дансила, флуоресцеина или фенантри--дина. Все эти производные были впервые применены для комплементарно -адресованной фотомодификации нуклеиновых кислот. Было показано, что фотомодификация происходит в месте адресации хромофорной группы. Наилучшие результаты были получены в случае фенантридиниевых производных олигонуклеотидов (суммарная степень модификации достигала 90 %),

- я -

Практическая ценность. Предложен ряд новых производных олигодезоксинуклеотидов для фотомодификадии нуклеиновых кислот. Полученные производные уже сейчас используются при исследованиях фотоаффинной модификации нуклеиновых кислот, в том числе в системах in vivo. С фенантридиниевыми производными олигонуклеотидов в настоящее время проводятся исследования в НИБХ СО АН СССР, Национальном музее естественной истории (Париж, Франция) и Институте экологической генетики (Кишинев, Молдова). На основе полученных результатов разрабатываются новые, более эффективные, фотореагенты.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международном симпозиуме "Химия нуклеиновых кислот" (Прага, 1984), рабочих совещаниях "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Новосибирск, 1985) и (Тбилиси, 1986), международных симпозиумах "Перспективы терапевтического и диагностического применения олигонуклеотидных производных" (Новосибирск, 1988), "Нуклеиновые кислоты как терапевтические агенты" (Тампа, США, 1991).

Публикации. По теме исследований, представленных в диссертации, опубликовано 8 печатных работ.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из трех глав, введения, выводов, примечаний, списка цитируемой литературы из 145 наименований и содержит 4 таблицы и 2? рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Осуществление направленного -химического воздействия на биополимеры - одна из центральных задач молекулярной биологии. В области нуклеиновых кислот (НК) наиболее перспективным с точки зрения специфичности представляется подход,, основанный на комплементарно-адресованной модификации.

Суть этого подхода состоит в том, что реакционноспособную группировку химически присоединяют к олигонуклеотиду, имеющему последовательность оснований, комплементарную выбранному участку НК. Модификация (химическое взаимодействие реак-ционноспособной группы олигонуклеотида-адреса и НК) происхо-

дат специфично после образования комплекса вблизи места связывания олигонуклеотида-адреса. В этой связи большой интерес представляет фотохимическая комплементарно-адресованная модификация. Для ее осуществления в качестве ре'акционноспособ-ной группировки, присоединенной к олигонуклеотиду-адресу, используется фотоактивная хромофорная группа. Очевидным преимуществом фотохимической модификации является возможность

Схема I.

сн,ых

бо2ЫН-Е'

Е3-ЫН-

О) -ЫН-Е4

Б=С-Ш-Е'

(I)

(II) (Ша) (Ш6) (IIIв)

(IV)

(V)

(VI):

(VII) (ТШа) (У1116)

(IX) -

(X)

Е =

Х=СН„

= -СН2СН20(рс1Т)9, Х=СН3; = -О^О^О^ОрШСАСААССТ)], = -С^СНдЫН-рСеКААТАСТСТ)], X = СН2СН2С1; = -СН2СН2СН2Ш-р[й(ААТАСТСТ ) ] ; X = р[с1(ТААТАССА)]р-ОСН2СН2СН2-, X

= рШТААТАССА) ]р-0СН2С!Н2СН2-

СН2СН2С1; СН2СН2С1;

X = СН.

3'

Е""= р[й(ТААТАССА)]р-ОСН2СН2СН2-; Е3=Н, Б4= -СОСН2СН21Ир[с1(ААТАСТСТ)]; Е3= -СОСН2СН2ННр[(1(АА1АСТСТ)]( Й4=Н;

Е3= -СОСН2СН2ЫНр[й(ААТАСТСТ)], Е4= -СОСН2СН2№2; Б3= -С0СН2СН2Ш2, Е4= -СОСН2СН2ЫНр[й(ААТАСТСТ)];

сКАССТТСТССАОСАО - олигонуклеотид-мишень для (II); ■ р[й.(ТСАСТССТаттА)] - олигонуклеотид-мишень для (ШВ), (IV) и (V);

(XI) - р[й(асастаттсастта)] - олигонуклеотид-мишень для .

(Ша-б), (VI), (VII) и (VIII):

(XII) - р[й(СТСТСААТТС АС)]; (XIII) - р[а(ААТАСТСТ)].

"йключения" реакции в определенный момент времени, без изменения внутренних условий исследуемой системы.

В качестве хромофорных групп, нами были выбраны хорошо известные в молекулярно-биологической практике производные дансилхлорида, флуоресцеинизотиоцианата и бромистого эти-дия. При выборе красителей учитывали различие их физико-химических, в том числе спектральных свойств, что должно было привести к разной эффективности при использовании этих красителей в качестве фотоактивной группировки. Это давало возможность определить в ходе исследования наиболее, перспективный краситель и в дальнейшем более детально сконцентрироваться на его исследовании.

Первоначально были синтезированы и охарактеризованы с помощью ЯМР, УФ- и флуоресцентной спектроскопии красители с присоединенными линкерными группами. В качестве линкерных групп использовали остатки 2-аминоэтанола, 3-аминопропанола, пропилен- или этилендиамина для дэнсильных производных;

Таблица I.

Температуры плавления комплементарных комплексов.

Комплекс тпл' <°С)

сИрТ х ро1у(А) (I) х ро1у(А) р [с1 (ТААТАССА ) ] х р [сЦТСАСТССТАТТА) ] Шй) х р[ сЦТСАСТССТАТТА)] (VI) х р [ с1 (АСАСТАТТСАСТТА) ] (VII) х р[сЦ АСАСТАТТСАСТТА)] (VIII) х р[<1 (АСАСТАТТСАСТТА)] (XIII) х р[сЦАСАСТАТТСАСТТА)] 30 ± I 30 1 I 30 ± I 31-1 48,8 - 0,8 43,3 ± 0,5 43,3 - 0,4 23,7 ± 0,5

*• Кривые плавления получали на установке, разработанной в НИБХ СО АН СССР. Эксперименты проводили в 0,01 М буфере трис-НС1 (рН 7,5), содержащем 0,2 М ЫаС1 и 0,01 М Использованные концентрации олигонуклеотидов

составляли 5x10 М. Скорость изменения температуры 1,0 град./мин.

3-аминопропанола для флуоресцеинильного производного; /з-аланина для фенантридиниевых производных. Затем были синтезированы флуоресцентные производные олигонуклеотидов. Структуры флуоресцентных групп и олигонуклеотидов представлены на Схеме I.

Структура соединений была подтверждена с помощью УФ- и флуоресцентной спектроскопии, а также с помощью жидкостной хроматографии.

В таблице I приведены температуры плавления комплементарных комплексов флуоресцентных производных олигонуклеотидов. Из данных таблицы видно, что присоединение к олигонуклеотиду остатка красителя не препятствует образованию комплементарного комплекса, а в случае фенантридиниевых производных приводит к его стабилизации. При этом повышение температуры плавления значительно выше, чем в случае известных акридини-евых и феназиниевых производных олигонуклеотидов (Asseiine U. и др. Ргос. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. v. 81. p. 3297; Зарытова В.Ф. и др. Биоорган, химия. 1986. т. 12. с. 911).

Все синтезированные флуоресцентные производные олигонуклеотидов были использованы для комплементарйо-адресованной модификации олиго- или полинуклеотидов.

Облучение сфокусированным светом азотного лазера ЛГИ-21 (x=337 нм) смеси соединения (I) и полиадениловой кислоты приводило к расщеплению цепи полинуклеотида (Рис.1а). В случае использования полицитидиловой или полиуридиловой кислот расщепления полинуклеотидов не наблюдалось (Рис.1б,в). В отдельном эксперименте была установлена квадратичная зависимость фоторасщепления полиадениловой кислоты от плотности мощности излучения, что указывает на нелинейный характер фотомодификаций.

Облучение сфокусированным светом азотного лазера (150 р

МВт/см ) смеси соединений (II) и (IX) приводило к расщеплению олигонуклеотида-мишени (IX) и образованию ковалентных аддуктов адрес-мишень (Рис.2). Цистамин, известный перехватчик свободных электронов, приводил к подавлению образования ковалентных аддуктов адрес-мишень (Рис.2, дорожка 3). Подоб-

Рисунок I. Гель-хроматография на сефадексе G-IOO superfine смесей (DnsNHEt)(pdI)g (I) с poly(A) (a), poly(О) (б) и poly (С) (в) до (I) и после облучения с дозой 4,7 (2), 14 (3) и 42 Дж/см2 (4), Колонка 0,25x17 см, элеядия 7 М мочевиной (рН 7,5) со скоростью 0,59 мл/час. Пики I - полинуклео-тид; II - продукт фотодимери-зации.Ц); III - производное нонатимидилата; IY -^продукты деградации дансильного производного нонатимидилата и поли-нуклеотида,

ные результаты были получены и для комплементарных пар (IV)+(X), (У)+(Х).

Облучение несфокусированным светом смесей (Il)+(ix), (Г7)+(Х) и (V)+(X) не приводило к расщеплению олигонуклеоти-да-мишени или образованию ковалентных аддуктов (данные не приведены).

Полученные результаты позволяют сделать ряд выводов:

- общая картина и выходы фотомодификации для 3'- и 5'-флуоресцентных производных близки, только в последнем случае степень адресованности более ярко выражена, что указывает на более благоприятное расположение хромофорной группы;

- расщепление олигонуклеотида-мишени заметно усилено в области адресации, причем этот эффект в большей степени выражен для флуоресцеинильного хромофора;

- расщепление олигонуклеотида-мишени является оптически нелинейным процессом (квадратичная зависимость от плотности мощности облучения);

- некомплементарный адресованный хромофор не вызывает замет-

Рисунок 2. Авторадиограмма

гель-электрофореза системы 12 3^5

(1Х)*+ (II), а также сь - _

(1Х)*+(IV). По вертикали (сбоку ) приведены ожидаемые поло- 14 - | жения олигонуклеотидных фраг- ; ментов тетрадекануклеотида - ~ ~ указанных длин, оцененных в в ' ~ ~ отдельных экспериментах. Отмечено также положение ковалент-ного аддукта (1Х)*+(11). съ-ковалентный аддукт. Дорожки: I - необлученный (IX)*; 2 - облученная в фокусе смесь (IX)*+(II), октануклеотид добавлялся равными порциями 6 раз; 3 - облученная в фокусе

смесь (1Х)*+(II)+цистамин, октануклеотид добавлялся равными порциями 6 раз; 4 - облученная в фокусе смесь (1Х)*+(1У)+цистамин, октануклеотид добавлялся равными порциями 6 раз; 5 - облученная в фокусе смесь (1Х)*+(И)+цистамин, концентрация октануклеотида была двенадцатикратной .

ного расщепления олигонуклеотида-мишени в области адресации (ср. дорожки 3 и 4 на Рис.2);

- цистамин не подавляет расщепления . Данный факт свидетельствует о том, что' расщепление не вызвано сольватированными электронами, которые могут освобождаться при нелинейной фотоионизации хромофора;

- лазерное облучение индуцирует образование ковалентных ад-дуктов мишень-адрес. Образование аддуктов является высокоспецифичным, так как ковалентные аддукты с некомплементарным адресом не наблюдаются. Выход ковалентных аддуктов в несколько раз понижается при добавлении цистамина.

1 г %

Ъ 4 5 6 7

12 -

© 9

4 - • - О

2 -

Рисунок 3. Авторадиограмма гель-электрофореза в 20 % поли-акриламидном геле (0,75 % бис-акриламид). Напряженность поля 30 В/см, буфер 50 мМ трис-борат (рН 8,3), содержащий 7 М мочевину~и 0,5 мМ ЭДТА. Дорожки: I - смесь 5 эквивалентов (Шв) и (X)* после облучения;.

■ частичное расщепление (X) А+й; 3 - смесь 10 эквива-

2 -по

лентов (Шв) и (X)" после облучения; 4 - смесь дорожки 3 обработана пиперидином; 5 -смесь 5 эквивалентов (Шв) и (X)* без облучения; 6 - необ-лученный додекануклеотид (X)*; 7 - смесь 5 эквивалентов (IV) и (X)* после облучения. Облучение проводилось несфокусированным светом азотного лазера при 4°С в течение I часа.

В случае производных (1Па)-(П1в) было установлено, что реакционная способность 2-хлорэтиламиногруппы в дансильном аналоге ароматических 2-хлорэтиламинов может быть резко повышена при облучении ближним ультрафиолетовым светом. Без облучения удавалось зарегистрировать лишь следовые количества ковалентного ацдукта (1-2%) (Рис.3, дорожка 5). Дансиль-ное производное (IV) в аналогичных условиях не вызывает модификации олигонуклеотида-мишени (X) (см. Рис. 3, дорожка 7), что указывает на участие 2-хлорэтиламиногруппы в процессе фотомодификации. Выход фотомодификации достигает 80% (Рис.3, дорожка 3). Было установлено, что модификации подвергается гуанозин в четвертом положении додекануклеотида (X) (дорожка 4). В экспериментах с комплексом (Шб)+(Х1) выделенный ковалентный аддукт после обработки разбавленной уксусной кислотой распадался на октануклеотид (XIII) и тетраде-кануклеотид с присоединенной флуоресцентной группой.

- 10 -

Рисунок 4. Авторадиограмма гель-электрофореза продуктов фотомодификации тетрадеканук-леотида (XI). Дорожки: I- репер длин (продукты частичного расщепления по А+О; 2 - необ- •

12 3 i, 5 6 7 8 9 ЮН/2/3/4

лученный (XI)*; 3 -

тетрадекануклеотид

а

(XI) облученный в стандартных условиях в присутствии цистамина; стандартные условия представлены на дорожке 6 - смесь 0,ImkM (XI)* + 6 мкМ (VIII), плотность мощности 15 МВт/см2, доза облучения 200 Дж/см2. Далее указаны отличия от стандартных условий. 4 -доза облучения 400 Дж/см2; 5 -доза облучения 50 Дж/см2; 7 -

в присутствии 10 мМ цистамина; 8 - в присутствии 300 мкМ олигонуклеотида (XII); 9 - при указанных выше концентрациях цистамина и (XII); 10 - смесь 0,1 мкМ (XI)* + 6 мкМ (XIII) + 6 мкМ этидий бромида; II - плотность мощности облучения 150 МВт/см2; 12 - концентрация соединения (VIII) 30 мкМ; 13 -после облучения стандартная смесь обработана пиперидином; 14 - облучёние в присутствии 1,3 М трет- бутанола. Справа указана шкала длин.

На Рис.4 представлена авторадиограмма гель-электрофореза продуктов облучения фенантридиниевого производного (VIII) и тетрадекануклеотида (XI). Данный эксперимент проводился с целью исследования адресованного расщепления, обнаружения влияния дозы и плотности мощности облучения, а также перехватчиков свободных радикалов (цистамин, трет-бутанол). Как видно из Рис.4 (дорожки 4-9, II, 12, 14, ср. с дорожкой I), облучение в присутствии адресованного хромофора (VIII) непо-

средственно (без каких-либо дополнительных воздействий) приводит к селективному расщеплению мишени вблизи сайта адресации (йТ8-<Ю9).

Наблюдаемые на Рис.4 продукты, имеющие подвижность меньшую, чем у исходного тетрадекануклеотида, представляют собой ковалентные аддукты мишень-адрёс. В пользу такого предположения свидетельствует зависимость от дозы (ср, между собой дорожки 4-6): наибольшее количество аддукта наблюдается уже при минимальной дозе облучения (дорожка 5); с увеличением дозы выход аддукта падает, а продуктов адресованного расщепления растет. Отсюда следует, что аддукт действительно содержит хромофор (о наличие в аддукте нуклеотида-мишени

ор

свидетельствует Р-метка).

При отсутствии хромофора или без облучения расщепление не происходит (контрольные дорожки 2, 3). Облучение смеси мишени (XI) с олигонуклеотидом (XIII) и свободным бромистым эти-дием (в концентрации, эквимолярной адресу) также не приводит к заметному расщеплению (дорожа 10), Это доказывает, что наблюдаемая модификация индуцируется только ковалентно присоединенным хромофором.

На дорожках 7-9, 14 приведены результаты для системы мишень (XI)-адресованный хромофор (VIII) в присутствии перехватчиков свободных радикалов - цистамина, трет-бутанола, а также олигонуклеотида (XII). Константа скорости реакции последнего с неадресованными фотопродуктами близка к таковой для исследуемого комплекса. Из сравнения дорожек 7, 9, 14 с дорожкой 6 видно, что добавление перехватчиков свободных радикалов не приводит к подавлению расщепления. Данный факт позволяет полностью исключить наличие свободных радикалов, распределенных в объеме облучаемой смеси, в качестве причины наблюдаемой модификации.

Добавление неспецифического перехватчика (XII) (см. Рис.4, дорожка 8) приводит к повышению выхода адресованного и некоторому подавлению неадресованного расщепления. Уменьшение доли неадресовэнного расщепления может объясняться тем," что добавленный самокомплементарный олигонуклеотид

Таблица 2.

Относительная доля основных продуктов фотомодификации непосредственно после облучения комплексов мишень-

адресованный хромофор (верхняя строка) и с последующей обработкой пиперидином (нижняя строка). Приведены средние величины из двух опытов.

Продукт (длина фрагмента) Адресованный хромофор

VI VII VIII

8 3 5 9

22 22 36

(XI) 19 62 42

12 38 15

СЬ* 68 20 22

40 6 4

СЬ* - ковалентный аддукт

(XII) связывает свободный хромофор, который может образовываться в результате саморасщепления адресованного хромофора. Усиление адресованного расщепления является следствием подавления неадресованного, то есть уменьшением модификации олигонуклеотида-мишени образовавшимся свободным прорзводным бромистого этидия.

Для выявления скрытых повреждений, а также для установления положения новой связи в ковалентном аддукте, продукты облучения были обработаны пиперидином (Рис.4, дорожка 13). Как видно из сравнения дорожек 13 и 6, после обработки пиперидином относительный выход расщепления намного повышается при сохранении столь же высокой степени адресованное™, а

количество ковалентного аддукта уменьшается.

Подобные результаты были получены и для производных (VI) и (VII), данные приведены в Табл. 2.

Анализ результатов полученных для этидиевых производных олигонуклеотидов позволяет сделать ряд выводов:

- в процессе облучения происходит адресованное расщепление• тетрадекануклеотида (XI) в области адресации с преимущественным образованием октануклеотида-осколка;

- выход адресованного расщепления максимален (примерно 10%) для адресованного хромофора (VIII);

- облучение приводит также к генерации "скрытых" (мало влияющих на электрофоретическую подвижность) повреждений;

- выход скрытых повреждений максимален в случае адресованного хромофора (VIII) и составляет не менее 27 %;

- происходит также образование ковалентных аддуктов мишень-адресованный хромофор; наибольшая доля (70%) образования ковалентного аддукта наблюдается для хромофора (VI);

- суммарный выход адресованной модификации для разных хромофоров составляет 60-90 % (см. Табл. 2);

- селективная модификация целиком обусловлена адресованным хромофором, то есть хромофором, ковалентно связанным с олигонукле о тидом-адре сом;

- цистамин не подавляет расщепления;

- анализ полос на гель-электрофорезе позволяет заключить, что большинство разрывов отстоит от сайта адресации не более чем на одно основание.

ВЫВОДЫ

1. Синтезирован ряд новых производных красителей с функциональными группами для их присоединения к олигонуклеоти-дам. Впервые синтезированы производные олигонуклеотидов, содержащие ковалентно присоединенные хромофорные группы: дансильную, 1-ы-метил-ы-г'-хлорэтиламинонафталин-5-сульфо-нильную, флуоресцеинильную, фенантридиниевые.

- 14 -

2. Показано, что хромофорные группы не ухудшают комплек-сообразушие свойства олигонуклеотида-адреса, а в случае фенантридиниевых производных олигонуклеотидов существенно стабилизируют комплементарные комплексы (на 20-25°С).

3. Впервые флуоресцентные производные олигонуклеотидов исследованы в реакциях фотомодификации нуклеиновых кислот в составе комплементарных комплексов:

а. При использовании дансильного производного нонатимидила-та впервые обнаружено комплементарно-адресованное селективное лазерное расщепление полиадениловой кислоты.

б. При исследовании гетерогенных комплементарных комлексов, включающих в себя дансильное или флуоресцеинильное производное октануклеотида-адреса, обнаружено, что модификация олигонуклеотида-мишени происходит вблизи места локализации хромофорной группы. Помимо разрывов олигонуклеотидной цепи в месте адресации наблюдается образование ковалентных ад-дуктов адрес-мишень и неспецифические разрывы олигонуклеотида-мишени.

в. Впервые с помощью фотоактивации в составе комплементарного комплекса резко повышена реакционная способность 1-ы-метил-М-2'-хлорэтиламинонафталин-5-сульфамидной группы - дансильного аналога алкилирупцих ароматических 2-хлор-этиламинов. Проведена фотомодификация олигонуклеотида-мишени с эффективностью до 30 %.

г. При фотомодификации олигонуклеотида-мишени с помощью фенантридиниевых производных олигонуклеотида-адреса выход адресованной модификации олигонуклеотида-мишени достигает 60 -90%. Показано наличие трех видов модификации: расщепление олигонуклеотидной цепи, образование ковалентных аддуктов адрес-мишень и скрытые повреждения мишени, выявляемые обработкой пиперидином.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Булычев A.B., Лебедев A.B., Бенимецкая Л.З., Козионов А.Л., Нестерихин Ю.Е., Новожилов С.Ю., Раутиан С.Г., Штокман М.И. Селективное лазерное расщепление полиадениловой кислоты с использованием флуоресцентного производного олиготимидилата. //Биоорган, химия. 1984. т. 10. № 4. с. 520-526.

2. Бенимецкая Л.З.Булычев A.B., Горн В.В., Козионов А.Л., Кутявин И.В., Лебедев A.B., Новожилов С.Ю., Подыминогин М.А., Штокман М.И. Комплементарно-адресованное лазерное расщепление олигодезоксинуклеотидов. //Препринт ИАиЭ СО АН СССР № 252. Новосибирск. 1984.

3. Бенимецкая Л.З., Булычев A.B., Козионов А.Л., Кошкин A.A., Лебедев A.B., Новожилов С.Ю., Штокман М.И. Высокоэффективная комплементарно-адресованная лазерная модификация (расщепление) олигодезоксинуклеотидов. //Биоорган, химия. 1988. т. 14. № I. с. 48-57.

4. Булычев Н.В., Горн В.В., Кутявин И.В., Лебедев A.B. Комплементарно-адресованное фотосенсибилизированное введение флуоресцентной группы на основе дансила в олигодезоксинуклеотиды. //Изв. СО АН СССР. 1988. № 19. выпч 6. с.124-130.

5. Бенимецкая Л.З.,. Булычев A.B., Козионов А.Л., Кошкин A.A., Лебедев A.B., Новожилов С.Ю., Штокман М.И. Высокоэффективная комплементарно-адресованная лазерная модификация (расщепление) олигодезоксинуклеотидов. Препринт ИАиЭ СО АН СССР № 354. Новосибирск. 1987.

6. Benimetskaya L.Z., Bulychev N.V., Kozionov A.b., Lebedev A.Y., Nesterikhin Yu.V., Novozilov S.Yu., Rautian S.G., Stockman M.I. Two-quantum selective laser scission of polyadenilic acid in the complementary complex with dansyl derivative oligothymidilate. //FEBS Letters. 1983. v. 163. N 1. p. 144-149

7. Benimetskaya L.Z., Bulychev N.Y., KoShkirv A.A., Kozionov

Novozilov S.Yu., Stockman M.I.

modification (cleavage) of //Biopolymers. 1989. v. 28. p.

A.I., Lebedev A.V. , Site-spesific laser oligideoxynucleotides. 1129-1147.

8. Benimetskaya L.Z., Bulychev N.Y., Kozionov A.L., Lebedev A.Y., Novozilov S.Yu., Stockman M.I. Two-quantum selective laser modification of poly- and oligonucleotides in complementary complexes with dansyl derivatives of oligonucleotidesy/Nucl. Acids Res. Symp. series. 1984. N 14. p. s323-s324.

Подписано к печати 11.91

Формат бумаги 60x84/16 Объем I печ. л.

Уч.-изд. л. I Заказ № 37 Тираж 100 экз.

Ротапринт Новосибирского института органической химии, 630090, Новосибирск 90, просп. Лаврентьева, 7.