Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих новые нуклеозид-2'-карбаматные и 2,4-дигидроксибутирамидные производные флуоресцентных красителей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и ЮЛ. ОВЧИННИКОВА

на правахрукописи УДК 577.113.6

ДЮБАНКОВА Наталья Николаевна

СИНТЕЗ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ НОВЫЕ НУКЛЕОЗИД-2-КАРБАМАТНЫЕ И 2,4-ДИГИДРОКСИБУТИРАМИДНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -2004

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители доктор химических наук, профессор

ЕО.А. Берлин]

кандидат химических наук В.А. Коршун

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Т. С. Орецкая

доктор химических наук В. К. Потапов

Ведущая организация Институт химической биологии и фундаментальной медицины

СО РАН

Защита состоится 25 февраля 2004 г. в 10.00 на заседании

Специализированного совета Д 002.019.01 при Институте биоорганической химии им. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16710

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии ям. М М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 23 января 2004 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук

В.А. Несмеянов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Стремительное развитие химии модифицированных нуклеиновых кислот в значительной степени обусловлено расширением области их применения в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Особое внимание уделяется разработке новых высокочувствительных реагентов для детекции взаимодействий различных биомолекул. Для этой цели хорошо зарекомендовали себя нерадиоизотопные люминесцентные метки. Они характеризуются стабильностью (практически неограниченный срок хранения), высокой чувствительностью, возможностью автоматизации процедур модификации и детекции, возможностью одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами, а также меньшим отрицательным воздействием на окружающую среду и человека.

Перспективными люминесцентными красителями для создания высокочувствительных зондов оказались полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они химически устойчивы, обычно имеют высокие коэффициенты экстинкции и высокие квантовые выходы люминесценции. Очень интересным свойством ПАУ является их способность к образованию эксимеров (сокращение от excited (timers - возбужденные димеры) и эксиплексов (excited complexes - возбужденные комплексы). ПАУ относительно легко модифицировать с расширением системы 71-сопряжения, что может приводить к соединениям, по люминесцентным свойствам существенно отличающимся от исходных ПАУ (то есть, к новым красителям). Кроме того, ПАУ способны нековалентно взаимодействовать с ДНК.

Во многих, случаях оптимальным способом синтеза олигонуклетидных конъюгатов является амидофосфитный автоматический твердофазный синтез с использованием наряду со стандартными реагентами модифицированных амидофосфитов и носителей. Разработке таких реагентов как нуклеозидной, так и ненуклеозидной природы, уделяется большое внимание.

Цель работы. Диссертация посвящена синтезу реагентов для амидофосфитного автоматического твердофазного синтеза на основе нуклеозид-2'-карбаматов и 2,4-дигидроксибутирамидов, получению с их помощью модифицированных олигонуклеотидов, содержащих пирен, 1-фенилэтинилпирен (ФЭП) и 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен (БФЭА), и изучению спектральных свойств полученных конъюгатов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе разработаны методы получения новых реагентов для флуоресцентной модификации олигонуклеотидов нуклеозидной и ненуклеозидной природы, позволяющих вводить краситель в любое заданное положение. Их эффективность продемонстрирована в синтезе флуоресцентно меченых олигонуклеотидов,

содержащих в своем составе фрагмент, комплементарный

Tat-белком вируса иммунодефицита человека. Показано, что флуорофоры нековалентно взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, что может быть использовано для структурного исследования биополимеров.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2002), XV и XVI зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003, 2004), международной конференции "Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA Interference", (Новосибирск, 2003); 5th Cambridge symposium "Nucleic Acids Chemistry and Biology" (Cambridge, UK, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в реферируемых журналах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (121 ссылка). Работа изложена на 144 страницах, содержит 62 рисунка, 18 схем и 39 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В рамках диссертации синтезированы два класса реагентов для модификации олигонуклеотидов: нуклеозидные - на основе уридин-2'-карбаматов и ненуклеозидные -производные ЛГ-замещенных-2,4-дигидроксибутирамидов. В ряду нуклеозидных реагентов мы получили соединения с различной конфигурацией при С2 фуранового кольца (производные рибозы и арабинозы). В ряду ненуклеозидных реагентов мы варьировали конфигурацию С2. Следует отметить, что R-конфигурация асимметрического центра повторяет конфигурацию 3' углеродного атома нуклеозида.

Существует ряд требований к модифицирующим реагентам. Во-первых, устойчивость в условиях стандартного твердофазного олигонуклеотидного синтеза и деблокирования аммиаком. Во-вторых, введение модификации в середину олигонуклеотидной последовательности не должно изменять длину олигонуклеотида по сравнению с немодифицированным аналогом. Поэтому для сохранения длины олигонуклеотида необходимо наличие 1,3-диольной системы в структуре модифицирующего синтона. Для удобства синтеза важно наличие первичной и вторичной гидроксильных групп. Желательно, чтобы синтоны были оптически активными. Время конденсации модифицированных реагентов должно быть сопоставимо со временем конденсации стандартных реагентов в условиях олигонуклеотидного синтеза Синтезированные нами реагенты удовлетворяют всем этим требованиям.

1. Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцентными уридин-2'-карбаматами

/./ Амидофосфитные реагенты на основе 1-фенилэтинилпиренового, 9,10-бис(фенилэтинил)антраценового и пиренового 2 '-карбаматных производныхуридина

В качестве исходного нуклеозида был выбран уридин 1 (схема 1). Его вводили во взаимодействие с реагентом Маркевича для защиты 3'- и 5'-гидроксильных групп. Обработка силильного производного 2 1,1-карбонилдиимидазолом приводила к образованию к имидазолида 3. Последний устойчив к водной обработке, но гидролизуется в исходный 3*,5*-0-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)уридин 2 в слабокислых и слабощелочных условиях и частично ралагается при хроматографировании на силикагеле. Имидазолид 3 реагирует с алифатическими аминами с образованием карбаматов, например, продуктом реакции с 4-иодбензиламином - является 2'-О(4-иодбензиламинокарбонил)-3*,5'-0-

(тетраизопрогшлдасилоксан-1,3-диил)уридин 4.

Схема 1.

Полученный карбамат 4 содержит арилиодидную группировку, что позволяет вводить его в реакцию сочетания с терминальными ацетиленами по Хеку-Соногашире в присутствии-тетракис(трифенилфосфин)палладия - (0), иодида меди (I) и триэтиламина в среде диметил формам ида. Было проведено такое сочетание с 1-этинилпиреном и 9-этинил-10-(фенилэтинил)антраценом. Для удаления защиты Маркевича мы использовали Е1зЫ"ЗНР в тетрагидрофуране. После избирательного 4,4'-диметокситритилирования и фосфитилирования был получены амидофосфитные реагенты 5 и 6.

Для получения реагентов на основе арабино-уридин-2'-карбаматов в качестве исходного соединения использовали коммерчески доступный- урацил- -арабинофуранозид (спонгоуридин 7), который вводили во взаимодействие с 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксаном с образованием защищенного по 3'- и 5'-положениям нуклеозида 8. Обработка нуклеозида 8 2,5-кратным избытком 1,1-карбонилдиимидазола с количественным выходом приводила к имидазолиду 9, который по стабильности аналогичен производному рибонуклеозида. Взаимодействие 9 с 10%-ным избытком 1-пиренилметил амина в смеси MeCN-THF 1:1 (об.) при 55°С в течение 7 суток приводило к практически полному превращению исходного имидазолида 9 в 2'-карбамат 10. После выдерживания карбамата 10 с Е1зЫ'ЗНР в течение ночи был получен нуклеозид, который стандартным образом 4,4'-диметокситритилировали и фосфитилировали. Амидофосфитный реагент 11 выделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (схема 2).

1.2 Синтез олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцентнымиуридин-2'-карбаматами

С использованием модифицированных амидофосфитов 5, 6 и И был синтезирован ряд модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих в своем составе фрагмент, комплементарный участку 22-36 TAR РНК, связывающийся с Tat-белком вируса иммунодефицита человека типа 1. Для этого мы вводили флуоресцентные уридин-2'-карбаматы вместо одного или двух остатков тимидина (табл. 1). В синтезе олигонуклеотидов использовали 0,1 М растворы амидофосфитов в ацетонитриле и такой же синтетический цикл, как для обычных нуклеотидов. Эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов и первой из последующих конденсаций с участием стандартного мономера, определенная по оптическому поглощению Dmt+-катиона, составила приблизительно 99%.

« ds

« га

I—I—I—■—I—■—I—■—I ■—I

о « за зо 40 т

Время удерживания, мин

Рис.1. Примеры офВЭЖХ

немодифициро ванного (>N01 (/) и модифицированных пиреном (>N17 (2), 9,10-бис( фенил этиннл)антраце ном (>N03 (.?) и 1-фенклэтинилпиреном О N06 (■/)

олигонуклеотидов до очистки. Условия офВЭЖХ: колонка РЬепотелех №-08 (3,90 х 300 мм), буфер А 5% МеСЫ (об.) в 0,1 М ацетате триэтиламмониа, буфер В: МеСЫ, скорость 1 нл/мин, градиент В в А: 0-» 5%, 3 мин; 5-» 15%, 10 мин; 15-. 40%, 30 мин; 40-» 80%, 10 мин; 80-» 0%, 10 мин, детекция при 254 нм

Олигонуклеотиды были деблокированы обычным образом и выделены электрофорезом в 20% денатурирующем полиакриламидном геле; их чистота оценена с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 1). Как и следовало ожидать, введение модифицированных реагентов с гидрофобными заместителями, увеличивало время удерживания олигонуклеотидов на обращенной фазе. Конъюгаты, содержащие пирен, сильнее удерживаются на обращенной фазе, чем немодифицированные олигонуклеотиды той же длины. Еще большим временем удерживания обладали ФЭП и БФЭА конъюгаты.

Структура синтезированных олигонуклеотидов доказана MALDI-TOF масс-спектрометрией (табл. 1), а наличие флуоресцентного красителя в конъюгатах подтверждается появлением дополнительного максимума поглощения в УФ-спектрах и наличием характерного сигнала в спектрах флуоресценции (рис. 2). Так, в спектрах поглощения пиренсодержащих олигонуклеотидов помимо нуклеотидного максимума поглощения при 260 нм присутствуют максимумы поглощения при 333 нм и 350 нм, в спектрах ФЭП конъюгатов - 371 нм и 393 нм, БФЭА-конъюгатов - 448 нм и 477 нм. Спектры флуоресценции тех же олигонуклеотидов характеризуются следующими максимумами: пиренсодержащий ON 17 381 нм и 399 нм, ФЭП

7

ON06 - 402,5 нм и 421 нм, и БФЭА ON03 - 484 нм и 517 нм. Следует отметить, что наличие дополнительной фенилэтинильной группы приводит к длинноволновому сдвигу максимумов поглощения и флуоресценции пиренового хромофора.

Таблица 1. Олигонуклеотидные конъюгаты, модифицированные флуоресцентными уридин-2*-карбаматами.

# Последовательность, 5'->3* Экспериментальная масса, m/z Вычисленная масса ГМ+Hf

ONOI CTCCCAGGCTCAAAT 4490,4 4496,0

ON02' ATTTGAGCCTGGGAG 4643,8 4643,0

ON03 CTCCCAGGC11ЛСАААТ 4930,1 4930,9

ON04 CUaCCCAGGCTCAAAT 4927,8 4930,9

ONOS CTCCCAGGCTCAAAUaP 5013,4 5013,4

01Ч06 CTCCCAGGC И^САААТ 4853,8 4854,9

ON07 CUACCCAGGCTCAAAT 4855,2 4854,9

ON08 CUI'PCCCAGGCUI'PCAAAT 5214,2 5214,0

ON09 CTCCCAGGCTCAAAU1'pp 4935,8 4934,9

ONIO CTCCCAGGCTCAAAU1'pCTGGp 6185,1 6186,1

ONI1 AUrpTTGAGCCTGGGAG 5005,9 5005,9-

ONI2 ATU1'PTGAGCCTGGGAG 5002,8 5005,9

ON13 ATTllrpGAGCCTGGGAG 5007,5 5005,9

ON14 CCAGAUrpTTGAGCCTGGGAG 6229,7 6229,2

ON15 CCAGATUt'pTGAGCCTGGGAG 6228,7 6229,2

ON16 CCAGATTU^GAGCCTGGGAG 6228,2 6229,2

ON17 CTCCCAGGCU^CAAAT 4748,5 4756,2

ON18 CUACCCAGGCTCAAAT 4751,4 4756,2

ON19 CU^CCCAGGCU^CAAAT 5009,6 5015,5

ON20 CTCCCAGGCTCAAAU^CTGG 6002,3 6008,0

ON21 AUTIXjAGCCTGGGAG 4903,5 4907,3

ON22 ATU^TGAGCCTGGGAG 4902,9 4907,3

ON23 ATTU^GAGCCTGGGAG 4903,4 4907,3

ON24 CCAGAUr)TTGAGCCTGGGAG 6121,9 6128,1

ON25 CCAGATUr,TGAGCCTGGGAG 6120,6 6128,1

ON26 CCAGATTU^GAGCCTGGGAG 6119,0 6128,1

Рис.2. Спектры поглощения (а) и флуоресценции (б) олигонуклеотидных • коныогатов, модифицированных флуоресцентными уридин-2'-карбаматами: ON17 (/), ON06 (2), ONOJ (3) Спектры поглощении записаны в воле, нормализованы по поглощению при 260 нм, спектры флуоресценции записаны в гибридизационном буфере (100 мМ NaCl, 10 мМ Ыа-фосфат, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,0); К 330 нм (для ON17), К, 375 нм (для 01N06), К. 440 нм (для CJN03), концентрация олигонуклеотидов ON17 l.S'lO"'М, 01Ч06 и QN03 НОМ.

1.3 Флуоресцентные свойства модифицированных дуплексов

Хорошо известно, что некоторые флуоресцентные красители при сближении и возбуждении способны образовывать эксимеры и эксиплексы, эмиссионные свойства которых резко отличаются от свойств исходных флуорофоров. Несколько полезных методов, основанных на взаимодействии хромофоров: безызлучательном резонансном переносе энергии (FRET), «молекулярных маячках» и комбинированных флуорофорах, прочно вошли в обиход исследований нуклеиновых кислот. Появилась возможность автоматизации секвенирования, гибридизационного анализа, а также изучения взаимодействий между нуклеиновыми кислотами и белками. При конструировании зондов необходимо обращать особое внимание на расстояние между флуорофорами и их взаимное расположение в третичной структуре конъюгатов. Так, безызлучательный перенос энергии наиболее эффективен при расстояниях между донором и акцептором в несколько десятков ангстрем, тогда как эксимеры образуются между флуорофорами, удаленными друг от друга на несколько ангстрем, а плоскости флуорофоров компланарны. Поэтому мы уделили особое внимание изучению флуоресцентных свойств хромофоров не только в составе одноцепочечных олигонуклеотидов, но и в составе дуплексов с комплементарными матрицами.

Рис. 3. Спектры флуоресценции (а) одноцепочечных олигонуклеотидов, модифицированных 9,10-бис(фенилэтин11л)амраценом ОГЧОЗ Х^ 440 им (/), 1-фенилэтинилпиреном О.N11 X«. 375 им (2), и их дуплекса ^ 37} им (J), К 440 ни (-0; (б) дуплексов ON03xONU (У). ON03xON12 (Д СИЧОЗхОМЗ (.?), Х„ 37S им. Спеюры записаны в гибрноизационном буфере (см. подпись к рис. 2), концентрация каждого олигоиуклеотида ю'м

Мы изучили спектры флуоресценции дуплексов, содержащих остаток ФЭП в одной цепи и БФЭА - в другой, в которых происходит сближение флуорофоров, находящихся в разных олигонуклеотидных цепях (рис. 3). Это приводит к резонансному переносу энергии флуоресценции, который мы зарегистрировали для дуплексов ON03xONll, ON03xON12 и ON03xON13. В спектрах флуоресценции дуплексов, регистрированных при длине волны возбуждения донора энергии - ФЭП, наблюдается сигнал, соответствующий флуоресценции акцептора энергии БФЭА (рис. За). Величина сигнала в изученном нами ряду несущественно зависит от расстояния между флуорофорами (рис. 36). Следует отметить, что эффективность

9

переноса энергии невелика: интенсивность флуоресценции акцептора при 500 им значительно меньше интенсивности донора при 400 нм. Это может быть связано как с довольно жестким 2'-карбаматным линкером, препятствующим свободному вращению хромофоров, так и с тем, что красители вступают в нековалентные (ван-дер-ваальсовы) взаимодействия с олигонуклеотидным дуплексом и расположены неблагоприятным для переноса энергии образом.

Спектр флуоресценции одноцепочечного олигонуклеотида ON 19, содержащего два остатка пирена, существенно меняется при отжигании его на немодифицированной комплементарной матрице (рис. 4). Интенсивный эксимерный сигнал при 500 нм в спектре одноцепочечного конъюгата, по-видимому, связанный с образованием метастабильной шпильки и сближением хромофоров, полностью пропадает и остается только сигнал мономерной флуоресценции при 380410 нм. Это явление известно для других олигонуклеотидных пиреновых конъюгатов, его легко детектировать и можно использовать для создания высокоэффективных зондов для детекции гибридизации.

Следует отметить, что сближение остатков пирена разных олигонуклеотидных цепей в дуплексе также сопровождается образованием эксимера (табл.- 2). В случаях, когда модифицированные нуклеозиды направлены друг к другу З'-углеродами и отделены одной парой оснований, в спектрах флуоресценции дуплекса появляется интенсивный эксимерный сигнал

(дуплексы О№7хОМ23 и О№9хОМ23). Высокая величина отношения эксимерной флуоресценции к мономерной может свидетельствовать о «статическом» характере эксимера (т. е., хромофоры преорганизованы в дуплексе благоприятным для нековалентного взаимодействия образом: их молекулы компланарны и сближены на расстоянии около 3,5А).

Таблица 2. Флуоресцентные свойства модифицированных пиреновым арабино-уридин-2'-карбаматом олигонуклеотидных конъюгатов и их дуплексов.

Олигонуклеотид или дуплекс Схематическое изображение Флуоресценция пирена мономерная эксимерная

ОМ7 'тиимм^ттттт + -

ОМ9 т*.......1..... + +

ОМ9х01Ч02 ?т ? 1 1 1 1 1 1 1 f I 1 1 1 1 + -

0№7х0№1 ilMNIIIlflllJI + -

ОМ7хСЖ22 ;М111111|Т|||Ц + -

ОШ7х(Ж23 гмпшпТцщ - +

ОМ7х(Ж24 ;ггпттттт1ттф-, 1, . + -

ОЛИ7хОМ25 ;i м м 111 if п j 111,. i + -

ОМ7х(Ж26 .'minnifij....... - +

ON19xON21 'Л......fiiiji + -

ОМ9х(Ж22 Shnrcninpi + -

ОШ9х<Ж23 sWnfajm + +

СЖ20х{Ж23 '...........i'^- + -

ON20xON22 .............И"" + -

ON20xON21 ;i11ii11111111 jf" ■ ■ + +

(№ОхО№6 *i i м i 11 i imji if 11 11 + -

(Ж20х(Ж25 Mm.....n|iW + -

(Ж20х0№4 ;u 1111111111 ijf 1111 + -

Рис. б. Возможное расположение двух пиреновых остатков, образующих эксимер в большой бороздке. Дуплекс ()\17хО>23. Комплементарные цепи обозначены голубым и желтым цветами, фосфатные группы - красным, остатки пкрена - синим.

При увеличении расстояния между остатками пиреновых арабыно-уридин-2'-карбаматов (две, как в ОШ7хОМ22, или три, как в О№7хОМ21, пары оснований), в спектрах флуоресценции присутствует только мономерный сигнал (рис. 5а). Данные молекулярного моделирования

подтверждают возможность образования эксимера в случае ОШ7хОШ3, поскольку остатки пирена направлены в большую бороздку дуплекса, сближены до нескольких нанометров и компланарны (рис. 6). В таком положении пирены могут быть дополнительно стабилизированы за счет образования водородных связей между NH группой карбаматного линкера и 5'-фосфатной группой одного из модифицированных уридин-2'-карбаматов и N7 соседнего остатка dG. В том случае, когда модифицированные нуклеозиды направлены друг к другу 5*-углеродами (дуплекс ОШОхОШ1), в спектре флуоресценции мы наблюдали эксимерный сигнал, равный по интенсивности мономерному. Пара хромофоров в этом случае находится на конце дуплекса. В аналогичном случае, с 19-звенным дуплексом ОШОхОШ4, в котором пара хромофоров находится ближе к середине дуплекса, присутствует только сигнал мономерной флуоресценции (рис. 56).

1.4 Термическая стабильность дуплексов, модифицированных флуоресцентнымиуридин-2'-

карбаматами

Известно, что введение рибо-уридин-2'-карбаматных заместителей дестабилизирует как ДНК-ДНК, так и ДНК-РНК дуплексы. Для того, чтобы проверить влияние заместителя при 2'-карбаматной группе арабино-уриднна на термическую стабильность дуплексов, нами был синтезирован нуклеозид 12, амидофосфитный реагент на его основе по схеме, аналогичной использованной для синтеза амидита 11 (схема 2), и олигоиуклеотиды, последовательность которых представлена в табл. 3.

Данные по термической денатурации модифицированных дуплексов показывают, что введение 2'-карбаматной модификации на арабино-уридине приводит к дестабилизации дуплекса (ОШ7хОШ2, ОШ8хОШ2, ОШ9хОШ2, табл. 4). Как и ожидалось, модификация, находящаяся ближе к концевому положению, дестабилизирует дуплекс в меньшей степени, чем модификация в середине цепи (ОШ7хОШ2, ОШ8хОШ2). ДНК-дуплексы ОШ7хОШ2, ОШ8хОШ2, ОШ9хОШ2, состоящие из пирен-модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов,-дестабилизированы. менее, чем аналогичные бутилсодержащие дуплексы ОШ7хОШ2, ОШ8хОШ2, ОШ9хО^2. Следует отметить, что пиренсодержащие ДНК-ДНК-дуплексы менее дестабилизированы, чем ДНК-РНК-дуплексы.

Существенно меньший дестабилизирующий эффект (данные не приведены) по сравнению с литературными данными для рибо-уридин-2'-карбаматных модификаций с неароматическими

заместителями, мы наблюдали для дуплексов, содержащих флуоресцентные рибо-уридин-2'-карбаматные нуклеозиды. Мы полагаем, что это обусловлено нековалентными взаимодействиями полициклических ароматических углеводородов с бороздками ДНК-дуплексов. Причем, в случае рыбо-конфигурации углевода 2'-карбаматные заместители расположены в малой бороздке В-ДНК, а в случае арабмно-конфигурации - направлены в большую бороздку. Тийлнца 4. Термическая стабильность модифицированных дуплексов

» Последовательность, 5'-»3* Дуплекс с комплементарной

ДНК (0!М02) РНК

Тя,°С тт,°С ЛТт, °с

01401 СТСССАООСТСАААТ 57,6 - 59,2 -

(>N27 СТСССАООСи'САААТ 51,4 -6 Л но.0 н.о.

О N28 СИВСССАСССТСАААТ 53,5 -4,1 н.о. и.о.

(>N29 С ивСССАСОС и"САААТ 45,8 -11,8 н.о. н.о.

ОМ7 СТСССАОСЗСи,'САААТ 55,4 -2,2 52,9 -6,3

ОМ8 Си'СССАСХГСТСАААТ 55,5 -2,1 53,2 -6,0

ОМ9 СигСССАСЮСи,'САААТ 54,3 -33 523 -6,9

"Вычисленная разница между Тт модифицированного и соответствующего немодифицированного дуплексов, * н о - значение не определяли

Интересный эффект наблюдался при плавлении дуплекса ОМ9хО^2. Регистрируя поглощение при 350 нм, мы заметили, что поглощение уменьшалось при увеличении температуры (что может быть связано с уменьшением среднего расстояния между хромофорами) и кривая поглощения имела перегиб при той же температуре, что и кривая поглощения при 260 нм (рис. 7). Похожий эффект отсутствовал при плавлении дуплексов с одним или с двумя остатками пирена в разных цепях.

2. Синтез и спектральные свойства олигонуклеотидов, модифицированных флуоресцентными 2,4-дигидроксибутирамидами

2.1 Амидофосфитные реагенты и твердофазные носители на основе 2,4-дигидроксибутирамидов

Для нерадиоизотопного мечения и введения функциональных групп в олигонуклеотиды в

процессе твердофазного синтеза было предложено большое число ненуклеозидных реагентов.

13

Зачастую старались соблюсти природное расстояние между фосфатными группами в нуклеиновых кислотах, поэтому значительная часть предлагаемых реагентов является производными 1,3-пропандиола. Однако такие реагенты как правило являются рацемической смесью или прохиральны, что приводит к появлению диастереомеров на уровне олигонуклеотида и усложняет выделение и очистку целевого продукта Амидофосфитные производные первичных спиртов менее стабильны, чем аналоги на основе вторичных спиртов; кроме того, монотритилирование симметричных бис-первичных диолов часто протекает с невысоким выходом. Попытки ряда исследователей обойти первую проблему на основе ахиральных синтонов (производные диэтаноламина) потребовали увеличения межфосфатного расстояния. Более успешным представляется синтез на основе природных оптически активных предшественников: L-треонинола, трано-4-гидроксипролинола, 2-гидроксиметил-З-гидроксипирролидина и ещё более близких аналогов нуклеозидов на основе 2'-дезоксирибозы; однако синтез большинства из них довольно сложен. В рамках диссертационной работы мы синтезировали новое семейство ненуклеозидных реагентов на основе (R или 5)-2,4-дигидроксибутирамида для флуоресцентного мечения и модификации нуклеиновых кислот путём твердофазного синтеза. Полученные соединения легкодоступны, являются оптически чистыми и в виде модифицированных амидофосфитов и носителей пригодны как для единичного введения метки по 3'-концу, так и для единичного или множественного мечения по 3'- и 5'-концу и в середине олигонуклеотидной цепи.

В качестве хиральных предшественников нами были использованы коммерчески доступные да-(+)-а-гидрокси-у-бутиролактон (13а), ^)-(-)пантолактон (136) и их S-изомеры. Конфигурация (Л)-стереоизомеров аналогична 2*-дезоксирибозе, если представить, что вторичная гидроксильная группа при асимметрическом атоме углерода соответствует З'-ОН, а карбонильная группа занимает место С2. Наличие двух дополнительных метальных групп в производных пантолактона, по-видимому, ограничивает свободу вращения ациклического псевдонуклеозидного фрагмента, а также повышает растворимость этих соединений в органических растворителях.

На схеме 3 представлен синтез Л-2,4-дигидроксибутирамидных реагентов. Ацилирование лактонами 13а,б соответствующих первичных аминов (1-пирениламина, 4-иодбензиламина или 3-иодбензиламина) при 55 °С в течение 7 дней приводило к получению соответствующих оптически активных диолов (14а-в). Бутирамиды, содержащие арилиодидную группировку (14а,б), вводили во взаимодействие с 1-этинилпиреном в условиях реакции Хека-Соногаширы в присутствии тетракис(трифенилфосфин)палладия (0), иодида меди (I) и триэтиламина в среде диметилформамида. Селективное 4,4'-диметокситритилирование первичной гидроксильной группы соединений 14в и 15а,б давало производные 1ба-в, которые по стандартным методикам переводили в фосфамидиты 17а-в или полимерные носители 18а-в. Структура полученных соединений подтверждена 'Н-ЯМР-, 13С-ЯМР-, 31Р-ЯМР-спектрами, масс-спектрами и элементным анализом.

Схема 3

V

¿Г

13а 13 = Н

136 Я = Ме

ОН

АгСН2МН2 ^

55°С

,Аг

14а Аг = 4-иодфенил, 146 Аг « 3-иодфенил, 14в Аг ■ пиренил ОпИС1 пиридин

„Аг

15а Аг ■ 4-(пирен-1-илэтинил)фенил, 156 Аг = 3-(пирен-1-илэтинил)фенил

16а Аг > 4-(пирен-1-илэтинил)фенил, 166 Аг » 3-(пирен-1-илэтинил)фенил, 16в Аг = пиренил

Ь1Сч-^ОР(МРН2)2 тетразолид диизопропи Аммония

сн2а2

ф-ММеС0<СН2)2С02Н.

диизолропилкарбодиииид \ДМАП, пиридин

ОйпИ

17а Аг = 4-(пирен-1-илэтинил)фенил, 176 Аг= 3-(пирен-1-илэтинил)фенил, 17в Аг= пиренил

18а Аг ■ 4-(пирен-1-илэтинил)фенил, 186 Аг ■ 3-(пирен-1-илэтинил)фенил, 18в Аг=пиренил

Таблица 5. Флуоресцентные диолы на основе 2,4-дигидроксибутирамцца

Условное Конфигурация Я Аг

обозначение С-2

В К н пиренил

О Я Ме пиренил

Е Б Н пиренил

Р 8 Ме пиренил

Н Я Н 3-(пирен-1 -илэтинил)фенил

Л Я н 4-(пирен-1 -илэтинил)фенил

В таблице 5 представлены синтезирование в рамках данной работы флуоресцентно меченые диолы на основе 2,4-дигидроксибутирамида, из которых были получены реагенты (амидофосфиты и полимерные носители) для автоматического твердофазного олигонуклеотидного синтеза.

2.2 Синтез олигонуклеотидое, модифицированных флуоресцентными 2,4-дигидроксибутирамидами

С использованием модифицированных амидофосфитов и твердофазных носителей был синтезирован ряд модифицированных олигонуклеотидов (табл. 6). Для синтеза мы использовали 0,15 М растворы пиреновых амидофосфитов в ацетонитриле или 0,15 М растворы фенилэтинилпиреновых амидофосфитов в смеси 10% СН2С12 в МеСМ и такой же синтетический цикл, как для обычных нуклеотидов. Время конденсации было увеличено до 15 мин. Несмотря на то, что амидофосфитные реагенты оказались неустойчивы в условиях колоночной хроматографии на силикагеле, они хорошо сохранялись в течение многих месяцев при -20°С без заметной потери активности. Эффективность конденсации с участием модифицирующих реагентов и первой из последующих конденсаций с участием стандартного мономера определялась по оптическому поглощению Эш^-катиона и составила около 99%. Олигонуклеотиды были деблокированы обычным образом, выделены электрофорезом в 20% денатурирующем полиакриламидном геле и охарактеризованы МЛЬЭ1-ТОР масс-спектрометрией; их чистота была оценена с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ. Как и следовало ожидать, введение гидрофобных заместителей увеличивало время удерживания олигонуклеотидов. Чем ближе к концу олигонуклеотида находится метка, тем больше время удерживания (ср. 0№0 и О№2, О№7 и ОМ58); максимальным временем удерживания обладают 3'- и 5'-модифицированные олигонуклеотиды. Введение двух и более модификаций дополнительно увеличивает время удерживания (О№0 и ОМ31; ОМ57 и ОМ58 и ОМ60). Аффинность к гидрофобной фазе у ФЭП конъюгатов больше, чем у пиреновых (ср. ОЮ0 и ОЮ8).

Спектры поглощения модифицированных олигонуклеотидов помимо нуклеотидной полосы поглощения при 260 нм содержат дополнительные полосы поглощения соответствующего красителя (Лти при 333 и 350 нм для пиреновых олигонуклеотидов и при 373 и 395 нм для фенилэтинилпиреновых) (рис. 8). При сравнении УФ-спектров олигонуклеотидов, содержащих различное число остатков пирена, можно проследить увеличение полосы поглощения при 260 нм, величина которого заметно меньше, чем величина приращения при 350 нм или при 240 нм. Поскольку спектр поглощения ФЭП-хромофора сдвинут в длинноволновую область на ~45 нм относительно спектра поглощения пирена, в пиренсодержащих олигонуклеотидах присутствует четко выраженная полоса поглощения при 240 нм, тогда как в ФЭП-модифицированных олигонуклеотидах такого четкого сигнала нет. Интенсивность поглощения остатков фенилэтинилпирена существенно больше, чем пирена, поэтому в нормализованных по поглощению красителя спектрах полоса поглощения при 260 нм ФЭП-модифицированных конъюгатов меньше, чем пирен-модифицированных.

# Последовательность, 5'-»3' Экспериментальная масса, т/г Вычисленная масса [М+Н]+ Время удерживания в ВЭЖХ", мин

©N30 СТСССАОССВСАААТ 4586,7 4590,1 19,4

ONЗr СВСССАСЮСВСАААТ 4676,7 4681,2 23,6

(>N32 СВСССАС(ЮТСАААТ 4589,5 4590,1 20,4

©N33 СТСССАООСТСАААТВ 4890,5 4892,3 24,9

©N34 АТТШАОССТОСЮАОВ 5041,9 5046,4 21.4

©N35 ВСТСССАОССТСАААТ 4892,2 4892,3 21,0

©N36 СТСССАООСОСАААТ 4617,9 4618,1 18,2

©N37 СОСССАСЮСТСАААТ 4616,8 4618,1 21,4

©N38 СОСССАССЗСОСАААТ 4736,8 4737,4 22,9

(>N39 СТСССАООСТСАААТО 4920,6 4920,3 27,7

©N40 АПТСАСССТСОСАСО 5070,4 5074,4 25,3

©N41 ОСТСССАОССТСАААТ 4920,9 4920,3 41,6

©N42 ОАТТТОАСЗССТСХЮАО 5069,6 5074,4 26,1

(>N43 СТСССАОСЗСЕСАААТ 4585,3 4590,1 17,1

(>N44 СЕСССАООСТСАААТ 4583,8 4590,1 18,9

(Ж45 СЕСССАООСЕСАААТ 4677,9 4681,2 20,7

0>46 ЕСТСССАООСТСАААТ 4887,3 4892,3 30,1

□N47 ЕАТТШАОССТСКЮАО 5039,2 5046,4 22,0

<>N48 АТТГСАСССТОСЮАОЕ 5039,5 5046,4 23,0

(Ж49 СТСССАОСЗСТСАААТЕ 4887,2 4892,3 25,6

©N50 СТСССАООСГСАААТ 4614,6 4618,1 18,0

ON51 СРСССАООСТСАААТ 4617,0 4618,1 21,0

©N52 СРСССАСОСГСАААТ 4735,0 4737,4 23,5

©N53 РСТСССАОСЗСТСАААТ 4917,6 4920,3 24,1

©N54 РАТГГОАОССТСООАО 5066,3 5074,4 26,0

ONS5 АПТОАСССТСШАСР 5069,2 5074,4 27,0

©N56 СТСССАСвСТСАЛАТК 4923,1 4920,3 28,5

©N57 СТСССАООСНСАААТ 4682,9 4690,2 25,8

(Ж58 СНСССАООСТСАААТ 4683,3 4690,2 29,2

(>N59 СНСССАСЮСНСАААТ 4876,3 4881,5 33,8

<>N60 СТСССАСССТСАААТН 4989,1 4992,4 41.1

(>N61 АТГгаАОССШШАОН 5141,0 5146,5 39,4

(>N62 СТСССАСССЛСАААТ 4682,6 4690,2 27,2

©N63 С1СССА(ЮСТСАААТ 4684,0 4690,2 30,8

(>N64 СУСССАООСЛСАААТ 4872,7 4881,5 35,5

(>N65 СТСССАООСТСАААТЛ 4989,9 4992,4 41.7

(>N66 АТГТСА0ССТС(К}А0.1 5138,7 5146,5 40,4

* Условия см подпись к рис 1

Рис* 8. Спектры поглощения пирен-модифицированных олигонуклеотидов ON36 (1 остаток пирена, кривая У), ОМ38 (2 остатка пирена, кривая 2). <>N57 (1 остаток ФЭП, кривая 5), <>N59 (2 остатка ФЭП, кривая 4) в воде. Нормализовано по поглощению красителей.

250 300 360 400 нм 450

1.3 Флуоресцентные свойства модифицированных олигонуклеотидов и их дуплексов

Пиренсодержащие олигонуклеотиды имеют характерные спектры флуоресценции. Интенсивность флуоресценции олигонуклеотида 0N30, содержащего пирен в середине цепи, больше интенсивности флуоресценции олигонуклеотида 0N32, содержащего пирен ближе к концу. Но сигнал олигонуклеотида 0N33, меченного пиреном по 3' концу, больше сигналов олигонуклеотидов 0N30 и 0N23, меченых в середине цепи. В спектре олигонуклеотида 0N31, меченного пиреном дважды, появляется сигнал эксимерной флуоресценции, приблизительно такой же интенсивности, что и сигнал мономерной флуоресценции (рис. 9а). Интенсивность сигнала флуоресценции изменяется в зависимости от того, какое основание является ближайшим к пиреновому остатку. Так, в ряду олигонуклеотидов, содержащих 3'- или 5'-концевые 5-2,4-дигидрокси-33-Диметилбутирамидные пиреновые модификации, максимальная флуоресценция у олигонуклеотида 0N56 (ближайшее к пирену основание - тимин), минимальная у 0N53 (ближайшее основание - цитозин) (рис. 96).

Рис. 9. Спектры флуоресценции пирен-модифицированных олигонуклеотидов (а) ON3(> (1), ON32 (2), ON33 (3) и ON31 (4); (б) ONS6 (/), ON53 (2), ON55 (3) и ON54 (О в гибридизационном буфере (см. подпись к рис. 2), концентрация олигонуклеотида зю-'м.тиззо нм

Интересные флуоресцентные свойства были зарегистрированы для дуплексов, состоящих из олигонуклеотида с двумя остатками пирена в середине цепи и немодифицированной матрицы. Оказалось, что при образовании дуплекса сигнал эксимерной флуоресценции пропадает не во всех случаях. Так, например, для олигонуклеотида ON31, содержащего R-2,4-дигидроксибутирамидную пиреновую модификацию, интенсивность эксимерного сигнала, максимальная в случае одноцепочечного олигонуклеотида ON31, уменьшается в ряду дуплексов ON31xON02, ON31x2t, ON31x2g, ON31x2c. Если напротив пирена находится остаток 2-гидроксиметил-3-гидрокситетрагидрофурана (abasic site, я), сигнал в районе 470 нм очень слабый, а в случае выпячивающихся пиреновых остатков пропадает совсем (рис. 10). Это явление можно объяснить тем, что если при образовании дуплекса основание напротив пирена отсутствует, он может располагаться между соседними парами оснований внутри спирали, что исключает возможность взаимодействия между пиренами.

Данные по флуоресценции хорошо согласуются с данными по термической стабильности дуплексов (табл. 7). Так, дуплексы, в которых напротив пирена нет основания, более термически стабильны, и в их спектрах флуоресценции нет эксимерного сигнала. Это еще раз подтверждает высказанное нами предположение о том, что пирен располагается между соседними парами оснований внутри спирали.

Интенсивность флуоресценции мономеченых ФЭП конъюгатов зависит от положения ФЭП (как 3-ФЭП, так и 4-ФЭП) в цепи (рис. 11). Интенсивность флуоресценции при 401 нм и 423 нм больше, если метка находится ближе к середине цепи. В спектрах димеченых олигонуклеотидов помимо мономерной флуоресценции появляется сигнал при 505 нм. Соотношение интенсивностей мономерной и эксимерной флуоресценции выше у олигонуклеотида ON64, содержащего 4-ФЭП, чем у олигонуклеотида ON59, содержащего 3-ФЭП. Наличие эксимерного сигнала при образовании дуплекса зависит от того, какое основание находится напротив модификации. Здесь

можно проследить отличие от аналогичных пиренсодержащих конъюгатов (табл. 7). В большинстве случаев для фенилэтинилпирена эксимерная флуоресценция исчезает при образовании дуплексов.

Таблиц* 7. Сравнение флуоресцентных свойств и термической стабильности дуплексов, меченных двумя остатками пирена или фенилэтинилпирена.

5'-СХС ССА СбС ХСА ААТ-3' У =, номер олигонуклеотида

З'-ОУО ОСТ ССв УвТ ТТА-51 А, (>N02 <3.2« С, 2с а,2и ,2х

а в—д^схр - ©N31 +++• 50,7б +++ 52,2 + 53,9 ++ 46,2 + 55,5 57,0

1 ~" ХДД ©N38 50,2 +++ 48,8 51,8 +++ 44,0 54,3 56,2

" ии ©N45 + 51,9 +++ 52,1 ++ 53,9 ++ 48,8 55,3 56,3

§ 51,9 +++ 52,1 ++ 54,0 + 47,3 55,3 56,7

з 8 48,3 ++ 48,6 50,7 + 43,2 51,1 55,7

и X ЪСГ ON64 44,4 + 45,0 47,1 42,2 48,3 47,0

в Условные обозначения' - нет эксимера, + слабый эксимер, -н- средний эксимер, +++ интенсивный эксимер. * Температура плавления дуплекса, °С.

М-.....................I I « .............о...........

Эв0 400 420 «40 4ев4в0кювг1»м>бе0 Вв0т£00 300 400 420 440 4в0 400 600 Б20 040 МО 0в0н^00

Рис. 11. Спектры флуоресценции (й) 3-ФЭП-модифицированных олигонуклеотидов 01457 (У), ОЧ58 (2), и (>N59 (5), (5) 4-ФЭП-модифицированных олигонуклеотидов (>N62 (/), ОМ63 (Д и (>N64 (¿) в гибридизадионном буфере (см. подпись к рис. 2), концентрация олигонуклеотида 3-10"6 М, Х^ 375 нм.

1.3 Термическая стабильность дуплексов, модифицированных флуоресцентными 2,4-дигидроксибутирамидами

Чтобы оценить влияние введенной 2,4-дигидроксибутирамидной модификации на стабильность модифицированных дуплексов мы синтезировали амидофосфитный реагент и твердофазный носитель из диола 19 и соответствующие модифицированные олигонуклеотиды (табл. 8). Введение в середину олигонуклеотидной - цепи синтона 19 существенно снижает

стабильность дуплекса с немодифицированной матрицей (-12,9 °С для 1 JxON02); чем ближе такая модификация к концу цепи, тем меньше дестабилизация дуплекса (-4,5 °С для 3JxON02), a дуплекс, содержащий синтон 19 на З'-конце одной из цепей, даже немного более стабилен, чем немодифицированный (+ 0,5 °С для 13JxON02).

Сравнивая эти данные с данными, представленными в таблице 9, можно заметить, что введение гидрофобных планарных заместителей в модификацию уменьшает дестабилизирующий эффект, и даже в случае довольно объемных ФЭП-заместителей дуплексы стабильнее, чем дуплексы, модифицированные остатком 19.-

Таблицй 8. Сравнение термической стабильности дуплексов, модифицированных 2,4-дигцлроксибутирамкдным диметилэтилендиаминовым синтоном.

Рассмотрим дуплексы, содержащие одну модификацию в середине цепи (табл. 9). Для Я-бутиролактонового пиренового производного разброс температур плавления лежит в интервале 1,8 °С. Наименее дестабилизирован дуплекс, в котором модификация находится напротив dG (53,2 °С, ON30x43g), наиболее - дуплекс, содержащий B-dA пару (51,4 °С, ON30xON02). В случае /?-пантолактонового пиренового производного максимальная (52,7 °С для ON36x43g) и минимальная (51,6 °С для ON36x43t) температуры плавления различаются на 1,1 °С. Несмотря на то, что /?-конфигурация 2,4-дигидроксибутирамидных производных соответствует конфигурации 3'-углеродного атома рибозы в - нуклеиновых кислотах, дуплексы, содержащие 5-изомеры, оказались дестабилизированы в меньшей степени, чем аналогичные с Л-изомерами. Разница температур плавления дуплексов с S-бутиролактоновыми пиреновыми производными лежит в интервале 2,2 °С. Как и в случае R-бутиролактонового производного, наименее дестабилизирован дуплекс, в котором модификация находится напротив dT (54,5 °С, ON43x43t), наиболее - дуплекс, содержащий E-dA (52,2 °С, ON43xON02). Интервал разброса температур плавления дуплексов, содержащих 5-пантолактоновый пиреновый изомер, составляет 13 "С. Дуплексы, содержащие F-dC и F-dG пару, плавятся одинаково (53,6 °С, ON50x43c, ON50x43g). Наиболее дестабилизирован ON50x43t (52,2 °С). Неожиданным для нас результатом явилось то, что температуры плавления дуплексов, содержащих довольно объемный 3-ФЭП-заместитель, лежат в том же диапазоне, что и температуры плавления пиренсодержащих дуплексов. Самая низкая температура плавления у дуплекса ON57xON02, в котором напротив 3-ФЭП находится dA (51,8°C).

Следует отметить, что 15-звенные дуплексы, в которых напротив пиреновых и 3-ФЭП модификаций находится 2-гидроксиметил-З-гидрокситетрагидрофуран (а) более стабильны, чем

21

дуплексы, в которых напротив модификаций находится любой из природных нуклеозидов. Еще более стабильны дуплексы, содержащие 15-членный модифицированный пиреновыми или 3-ФЭП синтонами олигонуклеотид и укороченный немодифицированный 14-мер (43х); что не верно для 4-ФЭП-содержащих дуплексов. Возможно, это связано с тем, что объемные гидрофобные заместители интеркалируют между парами оснований в дуплексе. Если напротив модификации находится какое-либо основание, оно выталкивается из дуплекса, что вызывает дестабилизацию. В тех случаях, когда основание отсутствует, гидрофобная модификация, наоборот, стабилизирует вторичную структуру за счет стэкинговых взаимодействий. Это справедливо, когда напротив модификации находится abasic site (сравним Itx43u и ON30x43u, ON36x43u, ON43x43u, ON50x43u, ON57x43u); и еще в большей степени, если модификация выпячивается из дуплекса (сравним Itx43x и ON30x43x, ON36x43x, ON43x43x, ON50x43x, ON57x43x). Интересно отметить, что наиболее стабильным дуплексом, содержащим модификацию в качестве выпячивающегося нуклеозида, является 3-ФЭП-содержащий ON57x43x. По-видимому, такое расположение пирена в 3-ФЭП позволяет получить наиболее благоприятное перекрывание плоскостей углеводорода и соседних пар оснований, что приводит к максимальному стэкингу.

Таблица 9. Сравнение термической стабильности дуплексов, содержащих 2,4-дигвдроксибутирамидные пиреновые и ФЭП-модификации в середине цепи. Тт, °С

5'-СТС CCA GGC ХСА ААТ-3' Y =, номер олигонуклеотида

З'-GAG GGT CCG YGT ТГА-5' A, ON02 Т, 43t G,43g С, 43с а, 43и ,43*

о f^Y4! "^«YYT бн н KJ^J ON30 51,4 52,6 53,2 53,0 55,5 56,5

бн н UU ON36 51,8 51,6 52,7 52,3 54,3 55,8

1 ОН н UJ О,N43 52,2 54,5 53,8 54,4 55,4 56,4

о 3 & 8 6 о & я он " ON50 523 52,2 53,6 53,6 54,7 56,1

он 51,8 52,3 53,5 53,5 54,2 56,9

X и" X о н ^^^^ ГУ4! 49,3 50,5 52,9 52,9 523 51,3

А, 1а 48,9 58,4 54,7 47,9 45,5 46,8

Т, ONOl 57,6 50,5 50,7 41,9 42,3 46,0

G, lg 52,0 53,2 54,0 62,3 45,1 46,6

С, 1с 46,0 46,9 61,2 43,7 44,7 49,8

48,3 49,2 51,5 48,4 - 56,9

Как уже упоминалось, отличными свойствами обладают дуплексы, содержащие 4-ФЭП-модификацию. Наиболее стабильны дуплексы, в которых напротив 4-ФЭП находится dG (ON62x43g) или dC (ON6 2x43c), немного менее стабильны ON62x43u и ON62x43x. Максимально дестабилизированы ON62xON02 и ON62x43t, в которых напротив ФЭП находятся dA и dT соответственно. Отсутствие оснований напротив модификации не повышает стабильность 4-ФЭП-модифицированных дуплексов. Мы полагаем, это связано с тем, что 4-ФЭП плохо укладывается в двойную спираль из-за больших линейных размеров.

ВЫВОДЫ

1. Разработан ряд нуклеотидных (на основе рибо- и ара6ино-уридин-2-карбаматов) и ненуклеотидных (на основе R- и 5-энантиомеров 2,4-дигидроксибутирамидов) флуоресцентных реагентов (амидофосфиты и твердофазные носители) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов.

2. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения флуоресцентных меток (пирена, 1-фенилэтинилпирена, 9,10-бис(фенилэтинил)антрацена) в состав олигонуклеотидов. Синтезирован ряд олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки флуоресцентно меченных нуклеозидов и псевдонуклеозидов в заданных положениях.

3. 2'-Карбаматная модификация арабино-урпдина представляет собой новый способ введения репортерных или функциональных групп в большую бороздку ДНК-дуплекса. Расположение заместителей в большой бороздке подтверждено образованием пиренового эксимера.

4. Изучены флуоресцентные свойства полученных конъюгатов; показана возможность их применения в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации ДНК в растворе и структурного исследования нуклеиновых кислот по изменению соотношения интенсивности мономерной и эксимерной флуоресценции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. N. N. Dioubankova, A. D. Malakhov, D. A. Stetsenko, V. A. Korshun, M. J. Gait. (R)-2,4-Dihydroxybutyramide Seco-Pseudonucleosides: New Versatile Homochiral Synthons for Synthesis of Modified Oligonucleotides. Organic Letters, 2002,4, № 26,4607-4610.

2. N. N. Dioubankova, A. D. Malakhov, D. A. Stetsenko, M. J. Gait, P. E. Volynsky, R G. Efremov, V A. Korshun. Pyrenemethyl ara-Uridine-2'-Carbamate: a Strong Interstrand Excimer in the Major Groove ofDNA Duplex. ChemBioChem, 2003,4, № 9,841-847.

3. I. A. Prokhorenko, N. N. Dioubankova, V. A. Korshun. Oligonucleotide Conjugates ofNile Red. Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 2004,23, № 1-2,509-520.

4. N. N. Dioubankova, A. D. Malakhov, V. A. Korshun, S. С Holmes, D. A. Stetsenko, M. J. Gait. Non-Nucleoside Reagents for Incorporation of Catalytically Active Groups into Oligonucleotides. Nucleosides, Nucleotides, andNucleicAcids, 2004,23, № 3.

5. Н.Н. Дюбанкова, А.Д. Малахов, Д.А.Стеценко, В.А.Коршун. Детекция точечных мутаций с помощью ДНК-зондов, меченных пиреном. Известия Академии наук. Серия химическая, 2004, №2.

Тезисы конференций

1. Малахов А.Д., Прохоренко И.А., Скоробогатый М.В., Дюбанкова Н.Н., Коршун В.А. Синтез флуоресцентных нуклеозидов и их аналогов в качестве инструментов исследования нуклеиновых кислот. Конференция «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». Пущино, 2001,75.

2. Дюбанкова Н.Н., Скоробогатый М.В., Пчелинцева А.А., Степанова И.А., Прохоренко И.А., Виноградова Л -А., Малахов А.Д., Берлин Ю.А., Коршун В.А. Модифицированные нуклеозиды и псевдонуклеозиды в синтезе люминесцентных производных олигонуклиотидов. VI чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва, 2002,24.

3. Дюбанкова Н.Н., Малахов А.Д., Коршун В.А. Новый пиреновый амидофосфит на основе арабиноуридина. ХУЗзимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2003,34.

4. Дюбанкова Н.Н., Малахов А.Д., Стеценко Д.А., Гейт М.Дж., Коршун В.А. Новые пиреновые гомохиральне секо-псевдонуклеозиды. XVзимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2003, 35.

5. Dioubankova N. N.. A. D. Malakhov, D. A. Stetsenko, V. A. Korshun, and M. J. Gait. Non-nucleoside reagents for incorporation ofcatalytically active groups into oligonucleotides. International Conference Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and KM A Interference", Novosibirsk, 2003,23.

6. Dioubankova N.N., Malakhov A.D., Stetsenko D.A., Gait M.J., Korshun V.A. ara-Uridine-2'-carbamates: new reagents for introduction of functional groups into the major groove of a DNA duplex. 5h Cambridge symposium "Nucleic Acids Chemistry and Biology". Cambridge, UK, 2003, P16.

7. Dioubankova N.N., Malakhov A.D., Stetsenko D.A., Gait M.J., Korshun V.A. Versatile homochiral non-nucleoside reagents for oligonucleotide modification. 5th Cambridge symposium "Nucleic Acids Chemistry and Biology". Cambridge, UK, 2003, P54.

8. Dioubankova N.N., Malakhov A.D., Stetsenko D.A., Gait M.J., Korshun V.A. Fluorescent uridine-2'-carbamate derivatives for DNA labeling. Sl Cambridge symposium "Nucleic Acids Chemistry and Biology". Cambridge, UK, 2003, P17.

9. Prokhorenko I.A., Dioubankova N.N., Korshun V.A. Nile Red - far-visible fluorescent dye on nucleic acids. Sl Cambridge symposium "Nucleic Acids Chemistry and Biology". Cambridge, UK, 2003, P78.

10. Дюбанкова H.H., Малахов А.Д., Прохоренко И.А., Коршун В.А. Флуоресцентные нуклеозид-2*-карбаматы. (Dioubankova N.N.. Malakhov A.D., Prokhorenko I.A., Korshun V.A. Fluorescent nucleoside-2*-carbamates).CT7/Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Казань, 2003, А240.

11. II.II. Дюбанкова, А.Д. Малахов, В.А.Коршун. Пиреновый эксимер для детекции точечных мутаций. XVIзимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2004.

•-2543

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 20.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 50 экз. Заказ 023. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. ТелУФакс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Синтез и свойства модифицированных нуклеозидов, повышающих стабильность олигонуклеотидных дуплексов за счет стэкинг-взаимодействий (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Синтез модифицированных аналогов нуклеозидов

Физико-химические основы стэкинг-взаимодействий

Влияние ароматических углеводородов в составе нуклеозидных аналогов на стэкинг-взаимодействия

Стабилизация олигонуклеотидных дуплексов мостиковыми структурами

Полициклические гетероциклические нуклеозидные аначоги, не образующие водородные связи

Аннелированные нуклеозиды

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Синтез 1-фенилэтинилпиренового и 9,Ю-бис(фенилэтинил)антраценового 2'-карбаматных производных уридина и амидофосфитных реагентов на их основе; спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов

1.1. Получение 2'-карбаиатных нутеозидных производных: 2'-0-[4-(пирен-1-ил-этинил)фенилметиламинокарбонил]- и 2 '-0-[4-(Ю-феншэтиншантрацен-9-ил-этинил)фенилметиламинокарбонил]уридинов

1.2. Спектральные свойства 2 '-0-[4-(пирен-1-илэтинил)феншметилаиинокарбонил]- и 2'-0-[4-(10-фентэтинилантрацен-9-ил-отинил)фенг1гметшаминокарбонил]уридина

1.3. Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки ФЭП и БФЭА уридин

2 '-карбаматов

2. Синтез пиренилметильного и бутильного а/?а£мн0уридин-2'-карбаматов и амидофосфитных реагентов на основе урацил-1-арабинозида; спектральные свойства пиреновых производных

2.1. Синтез пиреншметильного и бутильного арабиноуридин-2 '-карбаматных амидофосфитных реагентов

2.2. Спектральные свойства пиренового арабиноуридин-2 '-карбамата

2.3. Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих остатки пиренового и бутилового арабиноуридин-2 '-карбаматов

3. Синтез модифицирующих реагентов на основе 2,4-дигидроксибутирамида и спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов

3.1. Синтез модифицирующих реагентов на основе Ы-замещенных 2,4- 66 дигидроксибутирамидов

3.2. Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих 2,4-дигидроксибутираиидные синтоны

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и оборудование

Растворители

Реактивы

Оборудование

Методы

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Стремительное развитие химии модифицированных нуклеиновых кислот в значительной степени обусловлено расширением области их применения в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Особое внимание уделяется разработке новых высокочувствительных реагентов для детекции взаимодействий различных биомолекул. Среди таких реагентов хорошо зарекомендовали себя нерадиоизотопные люминесцентные метки. Они характеризуются стабильностью (практически неограниченный срок хранения), высокой чувствительностью, возможностью автоматизации процедур модификации и детекции, возможностью одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами, а также меньшим отрицательным воздействием на окружающую среду и человека.

Перспективными люминесцентными красителями для создания высокочувствительных зондов оказались полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они химически устойчивы, обычно имеют высокие коэффициенты экстинкции и высокие квантовые выходы люминесценции. Очень интересным свойством ПАУ является их способность к образованию эксимеров (сокращение от exr/'ted dimers - возбужденные димеры). ПАУ относительно легко модифицировать с расширением системы я-сопряжения, что может приводить к соединениям, по люминесцентным свойствам резко отличающимся от исходных ПАУ (то есть, к новым красителям). Кроме того, ПАУ способны к нековалентным взаимодействиям с ДНК.

Некоторые исследователи утверждают, что водородные связи не являются основной движущей силой образования ДНК дуплексов. Они обращают внимание на другой тип взаимодействий - между основаниями, уложенными одно над другим, - стэкинг-взаимодействие (от англ. stacking - укладка). Путем химической модификации нуклеиновых кислот можно сделать такие взаимодействия более сильными, что обеспечит создание более стабильных комплексов. Одинми из направлений модификации является расширение плоскости нуклеиновых оснований путем достраивания дополнительных бензольных колец. Это приводит не только к увеличению площади стэкинга, но и к изменению спектральных свойств оснований.

Еще одним способом изменения нековалентных взаимодействий в нуклеиновых кислотах является введение в олигонуклеотид полициклических ароматических углеводородов. Их участие в стэкинг-взаимодействиях подтверждается увеличением стабильности дуплексов и изменением спектров флуоресценции.

Литературная часть работы посвящена обсуждению природы стэкинг-взаимодействий, способов увеличения силы таких взаимодействий с помощью модификации природных оснований. В основной части диссертации рассмотрены способы введения различных полициклических ароматических углеводородов в олигонуклеотиды. Особое внимание уделено влиянию ПАУ на стабильность дуплексов и изменению их флуоресцентных свойств в составе нуклеиновых кислот.

В качестве флуоресцентных меток нами выбраны пирен, 1-фенилэтинилпирен и 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен. Они имеют высокие коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции, способны к нековалентным взаимодействиям с нуклеиновыми кислотами, образованию эксимеров и эксиплексов (сокращение от excited complex -возбужденные комплексы). Кроме того, 1-фенилэтинилпирен и 9,10-бис(фенилэтинил)антрацен являются донорно-акцепторной парой при безызлучателыюм резонансном переносе энергии.

Для синтеза олигонуклеотидных коньюгатов мы использовали как нуклеозидные реагенты, так и соединения ненуклеозидной природы. Можно указать ряд очевидных требований к таким реагентам. Во-первых, устойчивость в условиях стандартного твердофазного олигонуклеотидного синтеза и деблокирования раствором аммиака. Во-вторых, введение модификации в середину олигонуклеотидной последовательности не должно изменять длину олигонуклеотида по сравнению с немодифицированным аналогом. Поэтому для сохранения длины олигонуклеотида необходимо наличие 1,3-диольной системы модифицирующего синтона. Для удобства синтеза реагентов и их стабильности важно наличие первичной и вторичной гидроксильных групп. Желательно, чтобы синтоны были оптически активными. Время конденсации модифицированных реагентов должно быть сопоставимо со временем конденсации стандартных реагентов в условиях олигонуклеотидного синтеза.

Синтезированные нами реагенты удовлетворяют всем этим требованиям. Они эффективно вступают в реакцию конденсации в автоматическом режиме и выдерживают дальнейшие операции выделения и очистки олигонуклеотидов. Изучение термической стабильности дуплексов и спектральных свойств модифицированных коньюгатов подтвердило наличие нековалентных взаимодействий (интеркаляция, стэкинг и, возможно, связывание с бороздками дуплекса) выбранных нами флуоресцентных зондов с нуклеиновыми кислотами.

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Синтез и свойства модифицированных нуклеозидов, повышающих стабильность олигонуклеотидных дуплексов за счет стэкинг-взаимодействий (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Физические и химические факторы, обеспечивающие функционирование ДНК в клетке, изучаются уже на протяжении нескольких десятилетий. В последние годы эта область развивается особенно быстро благодаря усовершенствованию методов работы с ДНК. Для изучения структуры ДНК широко используются химически модифицированные аналоги нуклеозидов.

Вклад водородных связей в стабилизацию дуплексов оценивают как 0,5-1,8 ккал/моль на одну пару оснований ДНК [1-4]. Эта величина в значительной степени зависит от окружения молекулы. Относительно низкий вклад отражает конкуренцию при образовании водородных связей между основаниями и средой [5]. В газовой фазе, где такая конкуренция отсутствует, вклад одной связи оценивают как 6-7 ккал/моль [6]. Высказывается мнение, что водородные связи не являются основной движущей силой образования ДНК дуплексов [710]. Исследователи обращают внимание на другой тип взаимодействий - между основаниями, уложенными одно над другим, - стэкинг-взаимодействие (от англ. stacking -укладка).

Авторы работы [6] оценивают вклад стэкинг-взаимодействий в 1 ккал/моль на одну пару оснований РНК. Несомненно, стэкинг оснований является существенным фактором в образовании вторичной структуры дуплексов, триплексов и более сложных систем. Путем химической модификации оснований можно сделать такое взаимодействие более сильными, что обеспечит создание более стабильных комплексов. Целью данного обзора является обсуждение природы стэкинг-взаимодействий, способов увеличения силы таких взаимодействий с помощью модификации природных оснований.

Синтез модифицированных аналогов нуклеозидов

В настоящее время синтезирован широкий ряд нуклеозидов, содержащих в качестве основания полициклические ароматические гетероциклы. Их особенностью является то, что многие из них могут специфично участвовать в уотсон-криковском взаимодействии, имеют большую площадь поверхности, что может обеспечить стабилизацию содержащих их 4 9 олигонуклеотидиых дуплексов, и обладают характерными флуоресцентными свойствами, что делает их удобным инструментом в исследовании изменений в структуре ДНК дуплексов.

Соединения 1-3 образуются в результате взаимодействиея ¿/-[(триизопропилфенил)-сульфонил]пиримидиновых нуклеозидов с ароматическими диаминами [И, 12]. Например, при кипячении 3',5'-ди-0-ацетил-04-[(триизопропилфенил)сульфонил]-5-бром-2'-дезоксиуридина с 4-нитро-1,2-фенилендиамином в тетрагидрофуране с выходами 32% и 43% были получены диацетильные производные соединения 1 (Я=Вг) [11]. Аналогичная реакция с /7е/7М-диаминонафталином давала диацетильное производное соединения 2 с выходом 78% [11], а с 2,3-диаминонафталином - 3 с выходом 57% [11]. Присутствие таких модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотидиых дуплексах стабилизирует их за счет увеличения площади стэкинг-взаимодействий нуклеиновых оснований [11, 12]. При этом они не участвуют в образовании водородных связей. мо2

И X

N^0 НО уч но

ОН Я = СН3, Вг I

Группа исследователей во главе с М.Э. Маиеиса запатентовала ряд нуклеозидов 4, содержащих конденсированную с пиримидином систему [13-16]. Они стабилизируют дуплексы, проявляют флуоресцентные свойства и облегчают проникновение олигонуклеотида в клетку [17, 18]. Поэтому нуклеозиды такого типа активно синтезируются и другими исследователями [19].

Где X = 5,0. К;

Я| | Мп Я], 1*2, Яз- различные заместители см. [13-16] N N

Л, но^

ОН

Наиболее изученными соединениями такого типа являются феноксазиновые (Х=0, У=С) (5), (76) и фенотиазиновые (Х=8, У=С) (7а) нуклеозиды. В качестве примера на схемах 1 и 2 приведен их синтез [20,21].

Ключевой стадией в синтезе 5 является взаимодействие 5-гидрокси-2'-дезоксицитидина с гексафторбензолом в ЭМБО в присутствии карбоната калия при 50°С [20]. я он он он

Схема 1. Реагенты и условия: (а) 1. Вг2, Н20,20°С, затем 01ЕА; (Ь) К2С03, гексафторбензол, ЭМБО, 50°С.

Фенотиазиновый нуклеозид 7а получали из 5-иод-2'-дезоксиуридина. Диацильное производное исходного 5-галогеннуклеозида обрабатывали мезитиленсульфохлоридом в присутствии триэтиламина. Последующее взаимодействие активированного соединения с 2-аминотиофенолом в присутствии БВи, давало 6а с выходом 54%, которое кипятили в ф этаноле в присутствии трет-бутипала калия, получая 7а с выходом 38%. Аналогичный подход для феноксазинового соединения 76 оказался неудачным, поскольку на стадии циклизации происходило элиминирование иода без образования трициклического продукта. Поэтому исходным соединением выбрали 5-бром-2'-дезоксиуридин, который давал соединение 66 с выходом 27%. Циклизация оказалась более эффективной на незащищенном продукте, поэтому 66 сначала обрабатывали аммиаком в метаноле, затем кипятили в этаноле в присутствии фторида калия, получая 76 с количественным выходом [21].

Другой подход к синтезу трициклических пиримидиновых производных представлен на схеме 3 на примере нуклеозида 8. Он заключается в присоединении Вос-защищенного о-триметилстанниланилина по методу Стилле к 5-иоддезоксиуридину в присутствии • (РЬ3)2Рс1С12 в ОМР при 80°С. 5'-Гидроксильную группу полученного с 60% выходом бисарильного соединения защищали диметокситритильной группой, а З'-триметилсилильной. Затем О4 активировали, как в синтезе соединений 7а и 76 (схема 2), мезитиленсульфохлоридом в присутствии триэтиламина и ОМАР в СНгСЬ при 20°С и циклизовали с помощью ОВ11 в СНгСЬ. После снятия триметилсилильной защиты целевой нуклеозид 8 был получен с выходом 50% [22]. и ны

X а

Сг N АгО

0^1 54% (6а) 27% (66)

ОН

X = I, Вг

ОАс

6а: X = I, У = Б 66: X = Вг, У = О

ООН

7а г, 100%

66 -НО он он

76

Схема 2. Реагенты и условия: (а) Ас20 в пиридине, 20°С; (б) мезитиленсульфохлорид, Е^Ы; (в) 2-аминофенол или 2-аминотиофснол, ОВи, 20°С; (г) Ш3 в СН3ОН, 20°С; (д) 10 экв. КР в ЕЮН, кипячение; (е) гВиОК. в ЕЮП, кипячение.

НО

А. °г° г, с,™/ он а, 60 %

НО

ОН

Схема 3. Реагенты и условия: (а) (РЬ3)2Рс1С12, ОМР, 80°С; (б) БпИ-С!, Ру, 20°С; (в) I. N,0-бис(триметилсилил)трифторацетамид, СН2С12, 20°С; 2. мезитиленсульфохлорид, ОМАР, Е^Ы, СН2С12, 20°С; 3. ОВи, СН2С12,20°С; (г) /ВиМН2/МеОН (1:1)20°С

Запатентован ряд полициклических производных пуриновых нуклеозидов 9-11 [17, 23], стабилизирующих дуплексы, проявляющих флуоресцентные свойства и способствующих проникновению олигонуклеотида в клетку [18].

9 10 И

На схеме 4 представлен пример синтеза нуклеозида 11. б-Хлор-7-деаза-7-иод-3',5'-ди-0-толил-2'-дезокси-(/?-0-рибофуранозил)пурин вводили в реакцию Стилле с Вос-защищенным о-триметилстанниланилином в присутствии (РИз^РсЮг в БМР при 60°С, получая бисарильный нуклеозид с выходом 68%. Его обработка БаЬсо и БВи приводила к образованию тетрациклического соединения. На этой стадии не была полностью удалена т/?е/я-бутилоксикарбонильная защита. Поэтому смесь продуктов обрабатывали трифторуксусной кислотой, получая целевое соединение с выходом 96%. После снятия защитных групп метилатом натрия в метаноле нуклеозид 11 был получен с выходом 64%

17].

ОТо1 ОТо1 ОН

11

Схема 4. Реагенты и условия: (а) Лг-(/иреот-бутилоксикарбонш1)-2-(триметилстаннш])анилин (4 экв.), (РЬ3Р)2Рс1С12 (0,1 экв.), ЭМР, 60°С, 24 ч (68%); (б) ЭаЬсо (2 экв.), ЭВи (2 экв.), 75°С, 21 ч; (в) 25% СР3СООН в СН2С12, И, 3 ч (96% на стадии б, в) (г) ЫаОМе, МеОН, И (64%).

Нуклеозиды, содержащие основания с расширенной площадью поверхности, получают также гликозилированием соответствующих оснований защищенными сахарами.

На схеме 5 показан синтез бициклических нуклеозидных аналогов 12 (а, б). Поверхность стэкинг-взаимодействий дополнительно расширена за счет введения пропинильной группы. Для этого после гликозилирования соединение иодировали хлоридом иода (I), а затем вводили в реакцию Соногаширы с пропином в присутствии (РИз^РсЮг и иодида меди (I) в триэтиламине, получая защищенный нуклеозид с выходом 77%. После снятия защитных нуклеозиды 12а и 126 были получены с выходом 87% [24, 25].

12а: R=Me 126: R=H

Схема 5. Реагенты и условия: (а) бистриметилсилил ацетамид, OToi , затем SnCl4(26%); (б) ICI, СН2СЬ (87%); (в) пропин, (Ph3P)PdC!2, Cul, Et3N (77%); (г) 0,4 M NaOMe (87%).

Большой интерес представляют флуоресцентные рибонуклеозиды 13 и 14. Полагают, что 13 может участвовать в уотсон-криковских взаимодействиях аналогично уридину. Синтез рибонуклеозидов 13 и 14 представлен на схеме 6. При обработке 1,2,3,5-тетраацетилрибозы силильным производным аллоксазина при комнатной температуре в ацетонитриле в присутствии кислоты Льюиса (тетрахлорид олова) сначала образуется смесь N1, N3 продуктов гликозилирования, которая через два часа превращается только в N1-гликозилированный продукт. Если реакцию проводить в дихлорметане при -20°С, гликозилирование протекает только положению N3 [26].

Нуклеозид 15, содержащий в качестве основания диоксопиримидо-тетратиафульвален, сильный донор электронов, участвует в образовании комплементарных водородных связей с аденозином [27]. Схема его синтеза представлена на схеме 7. Исходное соединение, полученное из барбитуровой кислоты, вводили во взаимодействие с 1,2,3,5-тетраацетилрибозой в присутствии триметилсилилтрифторметансульфоната. Продукт обрабатывали селоном 16 в присутствии трифенилфосфина. После удаления защитных групп нуклеозид 15 был получен с выходом 9% в расчете на исходное соединение. а. б, в

-0-^-ОАс

----^и^улМ

АсО

АсО ОАс а, г, в N

НО. о N О

ОН ОН 13

О N N

Схема 6. Реагенты и условия: (а) Н ТМ5-С1, РЬН; (б) БпСЬ, СН2С12, -20°С, 95% на две стадии; (в) ЫН3; (г) БпСЬ, МеСЫ, И, 85% на две стадии.

НЫ

-Л

НМ'

11>2е б

-О. ОАс ОАс

Ас^ О^И^ Б-ОАс ОАс

Т ГК]

НО. О^М^ Б

-Б Б

ОН ОН 15

Схема 7. Реагенты и условия: (а) , ТМБ-О-ТГ, МеСМ; (Ь)

ЕЮН.

6 , РРЬз, РЬМе; (с) ЫН3,

Физико-химические основы стэкинг взаимодействий

Hunter и Sanders представили простую теоретическую модель взаимодействий л-облаков гетероциклических оснований [28]. В ней рассматриваются электростатические взаимодействия л-облаков выше и ниже плоскости молекулы. Ароматические молекулы имеют характерное распределение заряда. Ядро образует положительно заряженную а-рамку, которую, как сэндвич, окружают два отрицательно заряженных л-облака. При расположении двух таких молекул в стопку возникает отталкивание между ними, однако если молекулы расположить с некоторым смещением, то а-рамка и л-облако будут притягиваться.

Показано, что стэкинг-взаимодействия природных оснований не являются очень сильными, и что не сложно найти такие соединения, которые будут в большей степени стабилизировать дуплексы [1, 10,29].

Наибольшее перекрывание поверхностей оснований обеспечивает наибольший стэкинг [10, 30]. На рисунке 1 показано перекрывание соседних молекул 5-нитроиндольного нуклеозидного аналога [31] по сравнению с гуанозиновыми остатками в GGG-фрагментах А-и В-ДНК. Для аналогов нуклеозидов, содержащих ароматические остатки, характерно' перекрывание плоскостей ароматических циклов с небольшим сдвигом в результате суммирования двух эффектов: отталкиванием л-электронов в соседних молекулах и притяжением между л-системой и а-остовом [31].

Рис. 1. Относительное расположение 5-нитроиндол-2'-дезоксирибозных остатков в молекуле (в центре) по сравнению с 2'-дезоксигуанозиновыми остатками в А-ДНК (слева) и В-ДНК (справа). Видно перекрывание между гетероциклами [31].

Многие исследователи обращают внимание на ван-дер-ваальсовы взаимодействия между нуклеиновыми основаниями [31-33] при рассмотрении силы стэкинг-взаимодействий. Эти силы зависят от площади поверхности перекрывания оснований, и их поляризуемости в водных растворах.

Влияние ароматических углеводородов в составе нуклеозидных аналогов на стэкинг-взаимодействия

В ряде работ авторы пытаются найти среди различных физических параметров (хроматографический коэффициент удерживания (log Р), поляризуемость молекул, дипольный момент, площадь поверхности и размеры области стэкинга) неполярных ароматических аналогов нуклеозидов такой, который оказывает максимальное влияние на стэкинг-взаимодействия [10, 34-36]. Физические свойства исследованных ими аналогов оснований (рис. 2) представлены в таблице 1.

Рис. 2. Структура некоторых неполярных аналогов нуклеозидов, представленных в табл. 1 [37].

Стэкинг-взаимодействия пуриновых оснований в дуплексах оказались более сильными, чем для меньших по размеру пиримидиновых оснований [33]. Так, взаимодействия между двумя соседними дезоксиаденозинами увеличивают энергию стабилизации самокомплементарной последовательности на 2,0 ккал/моль, тогда как взаимодействия между тимидиновыми основаниями дают только 1,1 ккал/моль для стабилизации дуплекса [28]. Это связано с тем, что поверхность контакта между пуриновыми основаниями больше, чем между пиримидиновыми, что обеспечивает более сильное взаимодействие с соседней парой.

Увеличение гидрофобности аналогов нуклеозидов увеличивает стабильность олигонуклеотидов, содержащих такие аналоги. Замена природных оснований в ДНК на их неполярные неприродные аналоги (рис. 2) приводит к более сильным стэкингвзаимодействиям [10]. Например, Тт самокомплементарных дуплексов с1(ХСССССС), содержащих в качестве X дифтортолуол, на 6,3°С больше, чем у тимидинсодержащих дуплексов, хотя последние имеют такой же размер, и форму [10]. Изостерический аналог аденина - 4-метилиндол увеличивает Тт на 3°С [10] (табл. 1). Очевидно, что сила взаимодействия возрастает с увеличением размера основания. Так, замена тимидина на небольшой по размеру бензольный нуклеотид приводит к незначительному увеличению Тт олигонуклеотида (0,2°С), а замена на нафталиновый - к увеличению Тт на 8,1°С (табл. 1). Однако вклад фенантренового нуклеозида, имеющего больший размер по сравнению с нафталиновым, оказался практически одинаковым. Поэтому можно предположить, что третье кольцо фенантрена не контактирует с соседними основаниями и, вероятно, не укладывается в двойную спираль ДНК (рис. 3).

Таблица 1. Рассчитанные физические свойства и сила стэкинг-взаимодействий природных нуклеиновых оснований и их неполярных аналогов1-2 по данным термической стабильности самокомплементарного дуплекса с1(ХСССССО), где Х - нуклеозид, содержащий в качестве основания указанную ароматическую структуру [10].

Ароматическая структура Т 1 OQ3 logP (октанол -вода)2,5 Поляризуемость, (А3)2 Дипольный момент, (дебай)2 Площадь поверхности, (А2)46 Площадь поверхности стэкинга, (А2)4-7 AAG" стэкинга, ккал8

Тимин 48,1 -0,36 12,3 4,51 142 95 1,1

Аденин 51,6 -1,07 13,7 2,27 142 128 2,0

Цитозин 46,2 -0,76 11,3 6,02 127 102 1,0

Гуанин 51,5 -1,36 15,0 6,55 154 139 1,3

Пиррол 46,6 +0,82 7,8 2,25 96 77 0,8

4-метилиндол 54,6 +2,91 15,5 1,94 165 157 3,1

5-нитроиндол 60,6 +2,46 16,9 8,19 173 165 3,4

Бензол 48,3 +2,52 9,1 0,26 110 88 1,4

Дифтортолуол 54,4 +3,32 12,5 1,84 144 96 2,6

Триметилбензол 51,4' +3,98 14,0 0,00 173 114 1,6

Нафталин 56,2 +3,52 15,7 0,27 158 134 2,9

Фенантрен 57,3 +4,52 19,8 0,29 203 122 2,6

Пирен 64,1 +4,67 23,9 0,35 217 184 3,4

- ¡og Р, поляризуемость и дипольный момент даны для метилированных соединений, площадь поверхности и поверхности стэкинга - для незамещенных компонентов. 2 - значения даны для оснований, имеющих метальную группу в положении присоединения к нуклеозиду. 3 - Тт измерена в IM NaCl, 10 мМ Na фосфатном буфере pH 7, концентрация дуплекса 5,0 мкМ.4 - значения даны для незамещенных оснований.J -значения вычислены по методу Ghose - Crippen [38]. Отрицательные величины показывают избыток воды, положительные - октанола. 6 - половина вычисленной площади поверхности оснований. 7 - оценочное значение для набора соседних оснований. 8 - свободная энергия стэкинга (ДДС°) получена вычитанием свободной энергии самокомплементарного дуплекса d(CGCGCG) из свободной энергии дуплекса d(XCGCGCG), где X - указанная ароматическая структура; подробности расчета ДДС° в [10]. 9 - концентрация дуплекса 6,0 мкМ.

Авторы работы [10] предложили грубую корреляцию между поляризуемостью молекул и стэкинг-взаимодействиями. Для наиболее сильно поляризуемого аналога, пирена, они максимальны, для наименее поляризуемого - пиррола - минимальны (табл. 1). Это правило верно для большинства исследованных ими структур, включая природные нуклеозиды. Однако есть исключения. Например, поляризуемость дифтортолуола и фенантрена различаются очень сильно, а их стэкинг почти равен, а примерно одинаковые по поляризуемости дифтортолуол и триметилбензол имеют значительно отличающуюся силу ♦ стэкинга.

Кроме этого, авторы сделали попытку отделить влияние дисперсионных сил (взаимодействие мгновенный диполь - наведенный диполь) на вторичную структуру ДНК от других эффектов [10]. Сравним, например, нафталин и фенантрен. Силы их стэкинг-взаимодействий приблизительно равны, тогда как поляризуемость фенантрена намного больше, чем поляризуемость нафталина (табл. 1). Площади стэкинг-взаимодействий приблизительно одинаковые. Если бы дисперсионные силы давали большой вклад или были бы доминирующими, можно было бы ожидать большей силы стэкинга для фенантрена. Так как этого не наблюдалось, то можно предположить, что взаимодействие мгновенный диполь ^ - наведенный диполь вносит относительно небольшой вклад. Это утверждение также подтверждает сравнение тимина и дифтортолуола (силы их стэкинг-взаимодействий существенно различаются, тогда как поляризуемости приблизительно одинаковы), а также 4-метилиндола и нафталина по сравнению с гуанином. Таким образом, авторы утверждают, что дисперсионные силы не вносят большого вклада в стэкинг-взаимодействия.

Рассмотрим теперь взаимодействие диполь - наведенный диполь. Оно должно зависеть как от величины диполя ароматической системы, поляризуемости партнера по стэкингу, так и от относительной ориентации оснований. Так как среди оснований, представленных в таблице 1, цитозин имеет наибольший дипольный момент, следовало бы ожидать, что взаимодействие диполь - наведенный диполь в системах, содержащих цитозин, будет зависеть преимущественно от поляризуемости ароматической структуры. Однако, как говорилось выше, поляризуемость и дисперсионные силы, зависящие от нее, не являются доминантным фактором.

Взаимодействие между частичными зарядами партнеров по стэкингу может стабилизировать или дестабилизировать систему, в зависимости от ориентации и величины поляризации локальных связей участников.

Иг

Рис. 3. Относительное расположение 5'-концевых нуклеозидных аналогов по отношению к соседней С-С парс. [10]. А - тимин или дифторбензол, В -аденин или 4-метилиндол, С - бензол, В - нафталин, Е - фенантрен, Р -пирен.

Авторы считают, что размер площади поверхности стэкинг-взаимодействия является основным фактором, отвечающим за увеличение стабильности, содержащих их олигонуклеотидных дуплексов [10]. Этот параметр определяется не только площадью поверхности молекулы, но и ее формой и геометрией перекрывания с соседней парой оснований (рис. 3). Из таблицы 1 видно, что стэкинг-взаимодействия пиррола, имеющего наименьшую площадь поверхности стэкинг-взаимодействия, наименее сильные. А введение пирена, имеющего максимальный размер площади поверхности стэкинг-взаимодействия, сильнее всего увеличивает термическую стабильность дуплекса по сравнению с любым природным основанием. Этот факт многие исследователи использовали при создании нуклеозидов с расширенной площадью стэкинг-взаимодействий [11-26].

Стабилизация олигонуклеотидных дуплексов мостиковыми структурами

Для связывания олигонуклеотидных последовательностей используют различные линкеры [39]. Наибольшее распространение получил линкер на основе этилен гликоля, поскольку его длину легко варьировать [39]. Он не обеспечивает стабильных дуплексов сам по себе. Однако недавно были синтезированы линкеры, способные стабилизировать дуплекс из связываемых последовательностей за счет взаимодействия л-облаков линкера и нуклеиновых оснований. К ним относятся линкеры на основе диимидов перилена и нафталина и стильбеновые линкеры.

Линкеры на основе диимидов перилена 17 и нафталина 18, 19 ковалентно привязывали к 5'-концу одного олигонуклеотида и З'-концу другого в триплексах [39-41]. При этом обеспечивалось стэкинг-взаимодействие между всеми тремя нуклеиновыми основаниями и линкером. Наблюдаемое гашение флуоресценции перилена при образовании комплекса может свидетельствовать о наличии л-взаимодействий между периленовым остатком и нуклеиновыми основаниями.

Данные по термической стабильности ДНК дуплексов и триплексов, стабилизированных периленовыми и нафталиновыми мостиками, в зависимости от рН среды представлены в таблице 2 [39]:

ОпП-О

ОгтЧ-О

Н)-«0 18

ОСН2СН2СМ

Р-Рч

ОСН2СН2СМ

ОгтП О

19

Из таблицы 2 видно, что при замене этиленгликольного линкера на нафталиндиимидный или перилендиимидный происходит образование более стабильных дуплексов и триплексов. Полагают, что это возможно из-за перекрывания л-облаков, что стабилизирует не только двойную спираль, но и триплексы [39] и квадруплексы [42]. Такие комплексы имеют структуру бутерброда (рис. 4). Дуплексы, триплексы и более сложные структуры могут быть стабилизированы периленовыми линкерами за счет стэкинг-взаимодействия со всеми тремя (в триплексах) или четырьмя (в квадруплексах) концевыми основаниями (рис. 4). Соответствующие нафталиновые производные проявляют похожий эффект, хотя имеют меньшую поверхность для стэкинга [39].

Таблица 2. Зависимость термической стабильности (Т„,) дуплексов и триплексов, содержащих нафталиновые и периленовые линкеры от рН [39].

Дуплекс: З'АСААААСАА

5' ТСТТТТСТТ Триплекс-9: 3'ТСТТТТСТТ

5' АСААААСАА 3' ТСТТТТСТТ Триплекс-19: 3' ТСТТТТСТТ

5' СТСССАСААААСАА—Ь—СТСС 3' 5' ТСТТТТСТТ

Линкер Комплекс Величина рН

5,5 6,4 7,0 7,5 8,0

Дуплекс - 64,0 64,0 -

-0(СН2СН20)3СН2СН2- Триплекс-9 39 35 33 30 27

Триплекс-19 34 31 27 25 23

СН2СН2ОСН2СН2О- Дуплекс 72 72 осЬ Триплекс-9 49 46 43 39 36 о^ы^о СИ2СН20СН2СН20- Триплекс-19 51 45 41 39 35

СН2СН2ОСН2СН2Оо^ы^о

О N о

СН2СН2ОСН2СН2О

Дуплекс

Триплекс-9

Триплекс-19

50 53

68

48

49

67

43

44

41

42

37

38

Из таблицы 2 также видно, что при увеличении рН среды стабильность триплексов уменьшается. Это обусловлено тем, что в триплексах образуется структура С+-С-С. При этом наибольшую стабильность тестированных триплексов обеспечивает периленовый мостик, что согласуется с моделью взаимодействия линкеров с основаниями, представленной на рисунке 4. о а) б) X О т

3' А

5'

Рис. 4. Стабилизация триплексов (а) и квадруплексов (б) периленовыми линкерами [39,42].

На основе диимида перилендикарбоновой кислоты получен также интеркалятор PIPER, стабилизирующий G-квадруплексы [42]. В качестве примера можно привести стабилизацию теломер, которые являются важными концевыми частями хромосом [42-44].

Еще одним примером линкера, стабилизирующего олигонуклеотидные дуплексы за счет взаимодействия я-облаков линкера и нуклеиновых оснований может служить стильбендикарбоксамидный линкер. Олигонуклеотиды, содержащие такой мостик, могут образовывать структуры двух типов (рис. 5). При этом форма шпильки преобладает [45, 46], что доказано данными температуры плавления и спектров флуоресценции. Линейный гетеродуплекс (справа) является естественной вторичной структурой, если отсутствует внутримолекулярная комплементарность.

Большой интерес к таким комплексам обусловлен следующими их свойствами:

• температура плавления у них необычно высока, что связано с удачной геометрией мостика, который жестко закрепляет олигонуклеотидные комплексы.

• флуоресцентные свойства стильбендикарбоксамидной группы делают возможным мониторинг ближайшего окружения мостика. В частности, это позволяет различии»

PIPER организованные ансамбли, которые несут две стильбеновые группы рядом, как, например, в дуплексе с гетерогенными последовательностями [45,46]. • чувствительность олигонуклеотидных коньюгатов к фотоиндуцируемым реакциям может быть проконтролирована путем модификации нуклеотидной последовательности, присоединенной к мостику. Например, стильбендикарбоксамидный мостик, связанный с последовательностью, начинающейся с пары сЮ:с1С, высоко устойчив к фотоиндуцируемым реакциям; если же он присоединен непосредственно к (1Т:(1А парам, то • стильбен становится чувствителен к свету. При облучении раствора стильбена или его производных образуется смесь цис- и /и/?я«с-производных, продуктов внутри- и межмолекулярной циклизации (Тт дуплекса, содержащего такие производные, значительно возрастает вследствие ковалентного связывания олигонуклеотидов) и циклобутановых производных (димеры стильбена) [45]. О

5'-с1Тп ч 5'-с1Тп-1-с1Ап 5'чЮСТОА-Е-<1АСТСТ

Е 3'-с1Ап-1-с1Тп 3'-сЮОАСТ-1-с1ТСАОА

З'^Ап/ смешанный шпилька линейный дуплекс линейный дуплекс

Рис. 5.

Следует отметить, что ёТ и с1С не гасят флуоресценцию стильбена, сЮ гасит сильнее, чем (1А, что связано с различными электроннными свойствами пуриновых и пиримидиновых оснований. Гашение флуоресценции при этом вызвано переносом электрона от основания ((1А или (Ю) к стильбеновой группе [45].

Полициклические гетероциклические нуклеозидные аналоги, не образующие ф водородные связи

Трициклические пуриновые нуклеозиды 20 обнаружены в И1ЫАРЬе грибов (20а), печени крыс (206) и растениях Гогм/ор5/5 ШИз (20в), они проявляют сильные флуоресцентные свойства и их нуклеозидная связь легко гидролизуется в слабокислых условиях, уже при рН 4 [47].

20«: Я

20а: Я-Н

НСООСНз чсоосн3 ООН

20в:Я- МНСООСНз

СООСНз он он

Аналоги оснований, которые не различают А, Т, й и С в комплементарной цепи, могут рассматриваться как «универсальные» [29, 48]. Они представляют большой интерес при конструировании олигонуклеотидных праймеров и гибридизационных зондов, для которых в целевом олигонуклеотиде не известна точная последовательность [48], и могут использоваться для различных технологий, использующих рекомбинантные ДНК, например, при создании геномных библиотек, мечении с помощью рандомизированных олигонуклеотидов, случайной терминация цепи. Способность с одинаковой эффективностью имитировать все четыре основания ДНК разупорядочивает стандартное уотсон-криковское спаривание, что важно в рамках фундаментальных вопросов, связанных со стабильностью дуплексов и точностью репликации [30, 48]. К настоящему времени синтезирован большой ряд «универсальных» оснований [29]. Но среди них найдено немного аналогов, которые могут гибридизоваться без дестабилизации дуплекса. При конструировании таких универсальных оснований большое внимание уделяется стэкинг-взаимодействию оснований, так как оно в значительной степени обеспечивает стабилизирующий эффект [10].

ОН ОН ОН ОН ОН

21а (ГСБ) 216 (МКЗ) 21в(5М1С5) 12а (Р1М) 12б(Р1С5)

В качестве «универсальных оснований» синтезированы соединения 12а,б и 21 (а-в) [23, 24, 48]. Введение их в олигонуклеотидный дуплекс приводит к незначительной деформациии спирали, при этом кетогруппа располагается в малой бороздке и может образовывать водородную связь с растворителем. Данные об устойчивости дуплексов, содержащих «универсальные основания», представлены в таблице 3.

Таблица 3. Температуры плавления дуплексов, содержащих соединения 12а,б и 21 (а-в) [23,24,48].

II II 21а (ICS) 216 (MICS) 21в (5MICS) 12а (PIM) 126 (PICS) А т G С

21а (ICS) 59,3

216 (MICS) 61,6 62,3 61,8 54,2 51,9 55,2 51,2

21в (5MICS) 55,3 54,6 51,6 54,2 49,9

12а (Р1М) 60,9 62,3 66,3 65,2

126(PICS) 58,8 62,6

А 55,1 53,6 55,7 55,1 55,5 52,7 58,7 52,3 48,8 т 53,0 55,1 55,5 54,7 53,7 59,2 49,8 52,8 47,2

G 52,2 54,8 54,3 56,2 51,4 55,4 53,5 50,5 61,8

С 51,0 54,8 55,5 53,4 54,4 48,4 45,0 60,7 44,8

5-gcgatgxgtagco

- для получения температур плавления использовали Змкм J'-cgctacycatcgc дуплексы в 10 мМ PIPES, 10 MgCIj, 100 мМ NaCI, рН7, используя Сагу 300 Bio UV/Vis спектрофотометр. Нагревали в интервале от 16 до 80°С со скоростью 0,5°С/мин. I

O^N •Ы. Jy

59.34:

O^N у

61.6°С й

62.3°С

О N

61.8°С У

58.8°С

N^o O^N 62.3 "С

N^-O O^N ^ 60.ГС >

N^O O^N У

62.6'с >

65.2°С

N'^o О N >

66.3°С

Ч-ДТт = -0.7 - 0.2°С ДТт =3.6 -4.3°С Y

ДТт = 2.1 -3.0°С J Y

ДТт-=0.5-|.4°С J

Рис. 6. Взаимосвязь между структурой модифицированных нуклеозидов и стабильностью содержащих их дуплексов [23, 24,48].

Из рисунка б и таблицы 3 видно, что олигонуклеотиды, содержащие пару модифицированных оснований, наименее стабилизирующую дуплекс (21а:21а), плавятся при температуре, сравнимой с немодифицированными олигонуклеотидами (например, содержащими пару с1А:с1Т), 59,3°С и 59,2°С соответственно. Добавление метильной группы к одному или обоим нуклеозидным аналогам в паре увеличивает Тт содержащих их дуплексов на 2,1-3,0 и 2,6-3,4°С соответственно. Введение пропинильной группы в один аналог либо незначительно стабилизирует либо дестабилизирует дуплексы (например, при переходе от пары 216: 216 к 12а: 216 Тт не изменяется, а от21а:21а к 126:21а или от 216:21а к 12а:21а Тт уменьшается на 0,5-0,7°С). Однако введение пропинильной группы в оба аналога значительно стабилизирует содержащие их дуплексы (на 3,4-4,0°С). При введении и • метильной и пропинильной в оба аналога наблюдается максимальная стабилизация дуплексов (Тт дуплекса, содержащего пару 12а:12а, на 4,5°С выше дуплекса, содержащего с!С:с1С).

Из таблиц 4 и 5 видно, что введение в олигонуклеотидную цепь соединений 2 и 3 (структура соединений приведена на стр. 9) стабилизирует дуплексы. Максимальная стабилизация достигается в случае, когда модифицированные нуклеозиды находятся во втором с 5'- или З'-конца положении олигонуклеотида (табл. 4). Уменьшение стабилизирующего эффекта при введении соединения 3 в середину цепи связано с тем, что оно нарушает трехмерную структуру дуплекса. Однако на концах цепей такое нарушение менее заметно и фактор стабилизации за счет стэкинг-взаимодействий увеличивается. Как и следовало ожидать, дуплексы, содержащие два модифицированных основания на концах, дополнительно стабилизированы (табл. 5). Если модифицированные нуклеозиды находятся на разных цепях дуплекса, величина стабилизации равна приблизительно сумме стабилизации одним модифицированным основанием. Но если два модифицированных основания находятся на одной цепи дуплекса, такого суммирования не наблюдается.

Таблица 4. Температуры плавления ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные основания X = 3 (Я= СНзНП].

Дуплекс Т14/А|4 З'-ТХТи 5'-Т5ХТЦ 5'-Т}ХТ» 5'-Т,ХТ7 5'-Т,ХТ5 5'-ТпХТ3 5'-Т,5ХТ т14/

Ам /Ам /Ам /Ам /Ам /Ам /Ам 5'-АХА,3

Тт,.° с 31 40 36 34 34 34 34 37 40

- Тт измерена в буферном растворе (100 мМ ЫаС1, 10 мМ ЫагНРОд, 10 мМ ЭДТА, рН 7) при концентрации олигомеров 2 мМ.

Таблица 5. Температуры плавления ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные основания [И].

Гш'(приХ=), °С Дуплекс А 2 3, Я = СНз

5'-САСТСАТСТСТ 3'-СТСАСТАСАСА 42

5■-СХАСТСАТСТСТ 31-ССАСТАСАСА 40 (-2)2 47(+5) 50 (+8)

51-САСТСАТСТСХТ 3'-СТСАСТАСАСА 40 (-2) 46 (+4) 49 (+7)

51-САСТСАТСТСТ 3'-СХТСАСТАСАСА 43 (+1) 44 (+2)

5'-САСТСАТСТСТ 3'-СТСАСТАСАСХА 48 (+6) 48 (+6)

5'-СХСТСАТСТСТ 3'-СТСАСТАСАХА 53 (+11) 55(+13)

5'-САСТСАТСТХТ 3'-СХСАСТАСАСА 46 (+4) 51 (+9)

5'-СХСТСАТСТХТ 3'-СТСАСТАСАСА 47 (+5)

5•-САСТСАТСТСТ 3'-СХСАСТАСАХА 46 (+4)

- Т„ измерена в буферном растворе (100 мМ №С1, 10 мМ Ыа2НР04, 10 мМ ЭДТА, рН 7) при концентрации олигомера 2 мМ. 2 - Величина в скобках указывает разницу температуры плавления дуплекса с температурой плавления немодифицированного дуплекса.

Аннелированные нуклеозиды

Под аннелированными нуклеозидами понимаются конденсированные многоядерные гетероциклические системы, являющиеся аналогами природных нуклеозидов, способные образовывать водородные связи.

В таблице 6 представлены данные по термической стабильности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих нуклеозид 22, и их флуоресцентные свойства. При спаривании пиридопиримидинового кольца (соединение 22) с гуанином ДНК-дуплексы стабилизируются сильнее, чем при СС-спаривании [49]. Однако при замене в на другие основания стабильность дуплексов уменьшается. При этом в наиболее стабильных дуплексах наблюдается наибольшее гашение флуоресценции пиридопиримидина. О

Таблица 6. Данные по термической стабильности дуплексов, состоящих из самокомплементарных олигонуклеотидов, содержащих нуклеозид 22, и их флуоресцентные свойства [49].

22 Ятшх, HM Тт, °С Интенсивность флуоресценции (%)

330, 250 100

5 '-dGGG A ACGTTCCC-3 ' 257 50,5 0

5 '-dGGG А АТАТТССС-3 ' 258 47,9 0

5'-dGGGAA22TTTCCC-3' 333,258 25,3

5 '-dGGG А А2 2 СТТССС-3 ' 333,258 21,0

5'-dGGGAA22ATTCCC-3' 341,257 39,4 1,7

5'-dGGGAA22GTTCCC-3' 338, 255 58,4 <1,0 измерена при pH 7 в присутствии

При введении в олигонуклеотидную цепь соединений 23 и 24 стабильность дуплексов уменьшается (табл. 7). Авторы статьи [50] полагают, что это происходит из-за того, что эти модифицированные основания образуют только две водородные связи с гуанином. Хотя водород при N7 соединения 23 может образовывать и третью водородную связь с О6 (Ю, однако она очень слабая из-за не оптимальной ориентации. Поэтому пара 23:(Ю дестабилизирует дуплекс по сравнению с (1С:(Ю. К сожалению, таких данных для пары (1А:(1Т авторы [50] не приводят.

ОН

ОН

J I .H'VN' 3 t°

X.H-N-H но

Nf6 о

-О он он

24

Таблица 7. Данные по термической стабильности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих модифицированное основание 23 [50].

Цепь А 5' XTY AXA AXY ATX YYA YYA XXY AAY YAY X 3' Цепь Б 3' YAX TYT TYX TAY XXT XXT YYX TTX XTX Y 5'

Цепь А Цепь Б Tmx (°C) Уменьшение T„ на одно модифицированное основание

X Y X Y

С G С G 75,6 0

23 G С G 70,6 0,71

С G 23 G 72,0 0,38

23 G 23 G 69,6 0,35

- Tm измерена в буферном растворе TNM (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 мМ EDTA, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCI2), при концентрации олигомеров 2 мкМ.

Трициклические нуклеозиды 7, 8, 25, 26 стабилизируют содержащие их олигонулеотидные дуплексы и проявляют характерные флуоресцентные свойства. В таблицах 8 и 9 приведены данные по термической стабильности таких модифицированных дуплексов.

Таблица 8. Сравнение стабильности олигонуклеотидных дуплексов, содержащих трициклические нуклеозиды (X).

Нуклеотидная последовательность X T I о p * m 9 ^ АT„ на 1 заместитель Ссылка

Целевая РНК: 3' AGAGGGAGAGAAAA

5' dTCTCXCTCTCTTTTT 7a2 70,0 + 1,0 21

5' dTCTCXCTCTCTTTTT 7b2 71,0 + 2,0 21

5' dTXTCCCTXTX 1ТПТ 7a 76,0 + 2,3 21

5' dTXTCCCTXTXTTTTT 7b 75,5 + 2,2 21

5' dTCTXXXTCTCTTTTT 7a 81,0 + 4,0 21

5' dTCTXXXTCTCTTTTT 7b 84,0 + 5,0 21

5' dTCTCCCTCTCTTTTT 82 69,0 22

5* dTCTCXCTCTCTTTTT 8 70,0 + 1,0 22

5' dTXTCCCTXTXTTTTT 8 71,5 + 0,8 22

5' dTCTXXXTCTCTTTTT 8 77,0 + 2,6 22

5' dTCTCXCTCTCT 5-метилцитозин (Cm) 50,5 - 51

5' dTCTCXCTCTCT 7b 57,0 + 6,5 51

5' dTCTCXCTCTCT 253 68,5 + 18,0 51

5' dTCTCXCTCTCT 263 51,5 + 1,0 51 - Тт измерена в буферном растворе, содержащем 140 мМ KCl, 5мМ Na2HP04, 1 мМ MgCl2, pH 7,2 при концентрации олигомеров 2 мкМ, 2 - структура соединений приведена на с.П, 4 - структура соединения приведена на рис. 8, с.31

Увеличение термической стабильности (табл. 8) дуплексов олигодезоксинуклеотид-РНК, где трициклические гетероциклы находятся рядом, можно объяснить максимальным перекрыванием я-облаков соседних ароматических оснований [21]. На рисунке 7 показано, каким образом два дополнительных ароматических кольца обеспечивают большее перекрывание. Когда два феноксазиновых кольца находятся в спирали рядом, второе кольцо одного трициклического остатка перекрывается с третьим кольцом соседнего основания, что невозможно для аналогов с меньшим числом ароматических колец. В то же время видно, что два цитидиновых основания не перекрываются друг с другом.

Рис. 7. Перекрывание соседних оснований в А-дуплексах [21] (комплементарные основания не показаны).

А - перекрывание феноксазинов В - перекрывание цитозинов В n4

Таблица 9. Температуры плавления ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные основания [20].

Нуклеотидная последовательность ъ "О -- И т„, °С X = А т„, °с х = т т„, °С х = с

Целевая ДНК: З'-АОАОХОАОАОААААА

5,-ТСтТСтСтСп>ТС,,>ТСтТПТТ Ст контроль 57,5 45,0 44,5 43,0 мах (-12,5) (-13,0) (-14,5)

5'-ТСтТСтТСпуГС',>ГСтТТТТТ Т (контроль) 49,0 53,5 46,0 44,0

Рг(52) (-4,5) мах (-7,5) (-9,5)

5,тспугстррспугсп»тспугтттт 59,0 58,0 49,0 50,0 мах (-1,0) (-10,0) (-9,0)

5'-ТСтТСтСтС',>ГСгпТСпуГ Ст-контроль 50,5 32,0 30,0 29,0 мах (-18,5) (-20,5) (-21,5)

5,-тспугстгсттсп>тстт 7Ь5 57,0 44,5 42,0 33,0 мах (-12,5) (-15,0) (-24,0) з'-тстс'гстстст 254 68,5 45,5 41,0 40,0 мах (-23,0) (-27,5) (-28,5)

- Т„ измерена в буферном растворе, содержащем 140 мМ КС1, 5мМ Ыа2НР04, 1 мМ М§С12, рН 7,2 при концентрации олигомеров 2 мкМ, 2 - структура соединения приведена на с. 10, 3 - структура соединения приведена на с. II,4- структура соединения приведена на рис. 8, с. 31.

Из таблицы 9 видно, что неприродные гетероциклические аналоги 5, 7Ь, 25 в составе оликонуклеотидов при гибридизации специфичны к гуанозину. При этом тетрафторфеноксазин (5) специфичен также к аденину. Это может быть вызвано практически нулевым изменением свободной энергии при переходе от амино- (как С) к имино- (как Т) таутомерной форме основания 5 [21]. В тоже время исходный феноксазин (7Ь) более устойчив в амино- (как С) форме, что доказано селективной гибридизацией его с в [21]. Другой возможной причиной комплементарности тетрафторзамещенного производного феноксазина (5) как к А, так и к С, является увеличение стэкинг-взаимодействия этого гетероцикла с соседними основаниями [20, 21]. Возможность существования гетероциклов в двух таутомерных формах, находящихся в равновесии, обусловлена наличием электроотрицательных заместителей в третьем кольце. Поэтому введение различных заместителей в кольцо феноксазина может привести к созданию новых аналогов, специфичных к А.

Исследования в этом направлении привели к созданию соединений 25 и 26 [51]. Замена 5-метилцитидина в составе нуклеотидной цепи на соединение 25 приводит к значительному увеличению стабильности двойной спирали. Это связано с возрастанием числа водородных связей соединения 25 с в из-за удобного расположения доноров и акцепторов водородной связи в паре С-с1атр - в (рис. 8). Поэтому соединение 25 обладает значительной специфичностью при гибридизации с гуанозином (табл. 9). Взаимодействие протонированой аминогруппы с О6 гуанина в ДНК-дуплексах имеет прецедент также в комплексах ДНК с белком [51]. А В Я

ОМА

Сошр1ешеп1

ОН ,—ч

С-с1ашр 25 Я = о-26 Я = но^о

Рис. 8. А. Структура цитозиновых аналогов. В. Модель взаимодействия С-с1ашр - й в спирали ДНК.

Исследовано влияние на стабильность триплексов при замене тимина на хиназолин-, бензо[§]хиназолин- и бензо[Г|хиназолин-2,4-дион-(1#,3//)дионовые нуклеозиды (27-29) [5254]. Оказалось, что при замене тимидина на бензо[£]хиназолин-2,4-дион и бензо[Пхиназолин-2,4-дион стабильность дуплексов слегка понижается [53, 54]. Соединения 27-29 имеют большую л-поверхность, чем тимидин, поэтому можно сделать вывод о том, что этот фактор не является основным для стэкинг-взаимодействий [53]. Более существенное значение здесь имеет конформация нуклеозида. Для образования водородных связей между соединениями 27-29 и (1А необходимо, чтобы хиназолиновые нуклеозиды имели анти-конформацию. Си//-конформация более энергетически выгодна, поскольку в ней отсутствует стерическое загромождение арильной группой. Наблюдаемая дестабилизация дуплексов в этом случае может означать, что и в структуре образующихся триплексов отсутствует возможность максимального перекрывания л-облаков модифицированного основания и соседних оснований. Или наоборот, стэкинг-взаимодействия между бензохиназолиновым основанием и соседними основаниями настолько сильные, что параметры образующейся жесткой структуры не согласуются с параметрами триплекса, вызывая его дестабилизацию

Бензохиназолиновые нуклеозиды 28,2 9 также интересны своими флуоресцентными свойствами, которые позволяют детектировать изменения в их микроокружении. Флуоресцентные свойства бензо^]хиназолин-2,4-диона 29 в составе олигонуклеотидного дуплекса практически не изменяются по сравнению со свойствами нуклеозида. При введении бензо[§]хиназолин-2,4-диона в хугстиновскую цепь наблюдается значительное уменьшение интенсивности и сдвиг максимума эмиссии флуоресценции в коротковолновую область. А когда бензо[£]хиназолин-2,4-дион является участником уотсон-криковской пары при образовании триплекса, сдвиг максимума эмиссии также наблюдается, однако, уменьшение интенсивности флуоресценции незначительное. Из этого можно сделать вывод, что во

52]. втором случае в стэкинг-взаимодействиях участвует большая часть я-поверхности молекулы, чем в третьем [52].

ОН

27

ОН

28

ОН

29 содержащих качестве

Синтезирован ряд амидофосфитных реагентов, гетероциклического основания птеридин (30-32) [55]. Соединения, в которых расположение карбонильной и аминогруппы аналогично гуанозину ЗОа-в имеют высокий квантовый выход флуоресценции (0,70-0,88), в то время как аналоги аденозина (31а-в) - низкий (табл. 10). 2хУх"'

30а - в

30а Яррибоза, Я2-СН3, Я3-Н 306 Ярдезоксирибоза, Яг-Н, Я3-СН3 ЗОв Я|-рибоза, Я2-Н, Я3-Н N Л гмн2

Ух

31а - в

31а Яррибоза, Я2-РЬ, Я3-Н 316 Иррибоза, Я2-Н, Я3-РЬ 31в Ирдезоксирибоза, Иг-Н, И3-Н

N1' рибоза 32

СН3 СН3

Таблица 10. Флуоресцентные свойства птеридиновых оснований [55]

Соединение Х„, нм Хет, нм О

30а 348 430 0,88

306 340 431 0,70

ЗОв 348 430 0,87

31а 354 444 0,41

316 358 440 0,16

31в 334 443 0,27

32 336 400 0,54

Спектры регистрировали в Тт'НС! буфере, рН 7,5 при комнатной температуре; Х„ - длина волны возбуждения; Хеш - максимум эмиссии; () - квантовый выход флуоресценции, измеренный относительно сульфата хинина (квантовый выход 0,51).

При введении птеридиновых оснований 30а и 306 в олигонуклеотидную цепь наблюдается гашение флуоресценции, что говорит об их участии в стэкинг-взаимодействиях [55]. Максимальное тушение обнаружено при положении флуорофора рядом с пуриновым основанием. Степень гашения в дуплексах по сравнению с одноцепочечным олигонуклеотидом увеличивается незначительно (табл. 11).

Таблица 11. Флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих птеридиновые основания [55]

Олигопуклеотидная последовательность X Число цепей Тушение, %

5'-ACT GCT AXA GAT ТТТ CCA САСТ' 32а i 96

5'-АСТ GCT AXA GAT TTT CCA САС-3' 32а 2 96

5'-АСТХСТ AGA GATTTTCCA САС-3' 32а 1 64

5'-ACTXCTAGAGATTTT ССА САС-3* 32а 2 68

5*-ACTGCTAXA GATTTTCCA САС-3* 326 I 96

5'-ACT GCT AXA G AT TTT ССА САС-3* 326 2

5*-АСТХСТ AGA GAT TTT ССА САС-3* 326 J 56

5*- ACT ХСТ AG A G AT TTT ССА САС-3* 326 2 64

Степень тушения флуоресценции дана относительно дезоксирибонуклеотидного птеридинового мономера. Квантовый выход соединений 30а и 306 даны в таблице 10.

Изучение стабильности дуплексов, содержащих птеридиновые основания 30а и 306, показало, что соединение 30а не участвует в спаривании с комплементарным олигонуклеотидом, так как уменьшение Тт приблизительно равно уменьшению Тт в дуплексах, содержащих пропуск одной пары оснований (табл. 12). В то время как Тт дуплексов, содержащих 306, почти такая же как Тт немодифицированных дуплексов. Из чего следует, что это основание принимает участие в образовании дуплекса.

Таблица 12. Температуры плавления олигонуклеотидных дуплексов, содержащих птеридиновые основания [55]. и » 'm » ^

Олигопуклеотидная последовательность

Х=30а Х=30б Одна пара оснований пропущена

Комплементарная последовательность

5*-АСТ GCT AGA GAT TTT ССА САС-3*

5*-GTX TGG AAA АТС TCT AGC AGT-3* 56,0

5*-GTG TXG AAA АТС TCT AGC AGT-3' 55,6

5'-GTG TGX AAA АТС TCT AGC AGT-3' 53,8 63,6 54,4

5'-GTG TGG AAA АТС TCT AXC AGT-3* 52,0 54,4

5*-GTG TGG AAA АТС TCT AGC AXT-3* 58,8 62,6

Комплементарная последовательность

5'-GTG TGG AAA АТС TCT AGC AGT-3*

5'-ACT GCT AGA ХАТ TTT CCA CAC-3* 58,4

5'-ACT GCT AXA GAT TTT CCA CAC-3' 50,4 61,6

5 '-ACT XCT AGA GAT TTT CCA CAC-3 ' 54,6 - Tm измерена в 10 мМ Tris-HCl буфере, 10 мМ NaCI, pH 7,5,1 -модифицированных оснований равна 63,2°С Тт контрольного дуплекса, не содержащего

Заключение

В связи с активным развитием области науки, связанной с технологиями антисмысловых нуклеиновых кислот, встает вопрос о разработке модифицированных олигонуклеотидов, образующих более стабильные по сравнению с немодифицированными дуплексы, триплексы и более сложные системы [56]. Поскольку стэкинг-взаимодействия гетероциклов в нуклеиновых кислотах вносят значительный вклад в стабилизацию таких систем, для создания комплексов с повышенной стабильностью стремятся обеспечить максимальные стэкинг-взаимодействия путем химической модификации нуклеиновых оснований. Полученные таким образом высокостабильные структуры представляют интерес для изучения регуляции генной экспрессии путем образования специфичного к последовательности дуплекса с целевой мРНК т у/уо (антисмысловой подход) [21]. Для диссоциации прочных дуплексов требуется большее энергичное воздействие клеточных ферментов, например, РНКазы, поэтому время жизни таких дуплексов увеличивается [23].

Комплементарные олигонуклеотиды, связанные стильбендикарбоксамидным мостиком, могут служить низкомолекулярными моделями участков ДНК и оказаться полезными в качестве продолжения двойной спирали, которое стабилизирует вторичную структуру полинуклеотидов. Такие линкеры используют и для присоединения олигонуклеотидов к специфическим регуляторным белкам [57].

Для доставки антимысловых олигонуклеотидов в клетки применяются различные приемы, например, использование липосом, содержащих катионные липиды [58]. Однако использование катионных липидов для этих целей ограничено из-за малоэффективной доставки в животные клетки. Эту проблему можно решить, используя короткие олигонуклеотиды, содержащие с качестве одного или нескольких оснований феноксазин [17, 18].

В последнее время были опубликованы новые интересные сведения по спектральным свойствам флуоресцентных ПАУ, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами [59-64].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

выводы

1. Разработан ряд нуклеотидных (на основе рибо- и я/?абшш-уридин-2'-карбаматов) и ненуклеотидных (на основе Я- и З'-энантиомеров 2,4-дигидроксибутирамидов) флуоресцентных реагентов (амидофосфнты и твердофазные носители) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов.

2. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения флуоресцентных меток (пирена, 1-фенилэтинилпирена, 9,10-бис(фенилэтинил)антрацена) в состав олигонуклеотидов. Синтезирован ряд олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих остатки флуоресцентно-меченных нуклеозидов и псевдонуклеозидов в заданных положениях.

3. 2'-Карбаматная модификация арабипо-уритиз. представляет собой новый способ введения репортерных или функциональных групп в большую бороздку ДНК-дуплекса. Расположение заместителей в большой бороздке подтверждено образованием пиренового эксимера.

4. Изучены флуоресцентные свойства полученных конъюгатов; показана возможность их применения в качестве ДНК-зондов для детекции гибридизации ДНК в растворе и структурного исследования нуклеиновых кислот по изменению соотношения интенсивности мономерной и эксимерной флуоресценции.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность своим родителям Дюбанковым Татьяне Павловне и Николаю Филипповичу за терпение и поддержку во время выполнения работы; В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой; своим коллегам из Лаборатории химии нуклеиновых кислот (К. Р. Бирих и И. А. Прохоренко) за постоянную поддержку и ценные советы; руководителю лаборатории В.А. Ефимову за интерес к данной работе и полезное обсуждение; 3. О. Шенкареву за регистрацию 'Н-ЯМР-спектров; П. Е. Волынскому за вычисления молекулярной динамики дуплексов; своим коллегам из Alma-mater (М. А. Маслову и М. Мансуровой) за моральную поддержку и помощь при написании работы. Автор признателен коллегам из группы Майкла Гейта (Лаборатория Молеулярной Биологии, Кембридж, Великобритания) за предоставленную возможность воспользоваться великолепной приборной базой (УФ- и флуоресцентный спектрометры, MALD1 масс-спектрометр).

1. KoolE.T., Morales J.C., Guckian KM. Mimicking the structure and function of DNA: insights into DNA stability and replication. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000,39,990-1009.

2. Gould I.R., Kollman P.A. Theoretical investigation of the hydrogen bind strengths in guanine-cytosine and adenine-thymine base pairs. J. Am. Chem. Soc., 1994,116,2493-2499.

3. Martin F.H., Castro M.M., Aboul-ela F., Tinoco Jr. I. Base pairing involving deoxyinosine: implications for probe design. Nucleic Acids Res., 1985,13, 8927-8938.

4. Rotello V.M., Vitani E.A., Deslongchamps G., Murray B.A., RebekJ., Jr. Molecular recognition in water: new receptors for adenine derivatives. J. Am. Chem. Soc., 1993,115,797-798.

5. Petersheim M„ Turner D.H. Base-stacking and base-pairing contribution to helix stability: thermodynamics of double-helix formation with CCGG, CCGGp, CCGGAp, ACCGGp, CCGGUp, and ACCGGUp. Biochemistry, 1983, 22,256-263.

6. Schweitzer B.A., Kool E.T. Hydrophobic, non-hydrogen-bonding bases and base-pairs in DNA. J.Am.Chem.Soc. 1995,117, 1863-1872.

7. Gellman S.H., Haque T.S., Newcomb L.F. New evidence that the hydrophobic effect and dispersion are not major driving forses for nucleotide base stacking. Biophys. J. 1996, 71, 35233525.

8. Friedman R.A., Honig B. Response to S.H. Gellman, T.S. Haque, L.F. Newcomb. Biophys. J. 1996, 71,3525-3526.

9. Guckian K.M., Schweitzer B.A., Ren R.X.-F., Shells C.L., Tahmassebi D.C., Kool E.T. Factors contributing to aromatic stacking in water: evaluation in the context of DNA. J. Am. Chem. Soc. 2000,122, 2213-2222.

10. Bischofberger N., Matteucci M.D. Synthesis of novel policyclic nucleoside analogues, incorporation into oligodeoxynucleotides and interaction with complementary sequences. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 3041-3046.

11. Bischofberger N. Matteucci M.D. Synthesis of novel polycyclic nucleoside analogs. Nucleotides & Nucleosides, 1989, 8, 859-862.

12. Lin K.-L., Matteucci M. D. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners. US Pat. 6007992, 1999.

13. Lin K.-L., Matteucci M. D. Pyrimidine derivatives and oligonucleotides containing same. US Pat 6028183,2000.

14. Matteucci M. D., Jones R.J., Lin K.-L. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners. US Pat 5502177, 1996.

15. Matteucci M.D., Jones R.J., Lin K.-L. Pyrimidine derivatives. US Pat 6005096, 1999.

16. Burg C.A., Matteucci M.D., Froehler B.C. Synthesis of tetracyclic 2'-deoxyadenozine analog. Tetrahedron Lett. 1999,40, 8969-8970.18,1920,21,22,23,24,25,26,27.28,29,3031,32,3334,35,

17. Flanagan W.M., Wagner R.W., Grant D., Lin K.-L., Matteucci M.D. cellular penetration and antisense activity by a p henoxazine-substituted heptanucleotide. Nature Biotechnology, 1999, 17,48-52.

18. Matteucci M. D., Krosigk U. Hybridization properties of oligonucleotides bearing a tricyclic 2'-deoxycytidine analog based on a carbazole ring system. Tetrahedron Lett. 1996,37, 5057-5060

19. Froehler B„ Matteucci M. D. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines. Pat. USA 5594121,1997.

20. McMinn D. L., Ogawa A. K, Wu Y., Liu J., Schultz P. G., Romesberg F. E. Efforts toward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition of a highly stable, self-pairing hydrophobic base. J. Am. Chem. Soc., 1999,121,11585-11586.

21. Berger M., Ogawa A. K, McMinn D. L., Wu Y, Schultz P. G., Romesberg F. E. Stable and selective hybridization of oligonucleotides with unnatural hydrophobic bases. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2000,39,2940-2942.

22. Wang Z., Rizzo C. J. Regioselective synthesis of P-Nl- and P-N3-alloxazine nucleosides. Org. Lett., 2000, 2, 227-230.

23. Neilands O., Liepinsh V., Turovska B. Synthesis of novel tetratiafylvene system containing redox-active ridonucleoside and oligoribonucleotide. Org. Lett., 1999,1, 2065-2067.

24. Hunter C.A., Sanders J. K. M. The nature of 71-71 interactions. J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 5525-5537.

25. Gucian K.M., Krugh T.R., Kool E.T. Solution structure of a DNA duplex containing a replicable difluorotoluene-adenine pair. Nature Struct. Biol., 1998, 5, 954-959.

26. Hunter C.A. Sequence-depend DNA structure. The role of base interactions. J Mol. Biol. 1993, 230. 1025-1054.

27. Moran S., Ren R.X.-F., Rumney IV S., Kool E.T Difluorotoluene, a nonpolar isostere for thymine, codes specifically and efficiently for adenine in DNA replication. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 2056-2057.

28. Matray T.J., Kool E.T. Selective and stable DNA base pairing without hydrogen bonding. J.Am. Chem.Soc. 1998,120, 6191-6192.36,37.