Конъюгаты нуклеозидов и флуоресцентных красителей, содержащие сопряженную систему кратных связей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

п

о

л. •

V- г4.-1

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

МАЛАХОВА Екатерина Владимировна

КОНЪЮГАТЫ НУКЛЕОЗИДОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ, СОДЕРЖАЩИЕ СОПРЯЖЕННУЮ СИСТЕМУ

КРАТНЫХ СВЯЗЕЙ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных соединений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители д.х.н. Ю.А. Берлин к.х.н. В.А. Коршун

Москва - 1998

-2-

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение 6

ГЛАВА I. АЛКИНИЛИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ И ИХ АНАЛОГИ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА

(обзор литературы)

1.1 Методы синтеза алкинилированных нуклеозидов 9

1.1.1 Первые примеры синтезов. Генерация алкинов по методу Кори-Фукса. Синтез алкинилированных нуклеозидов

гликозилированием алкинилированных оснований 9

1.1.2 Алкинилирование нуклеозидов и нуклеиновых оснований с

помощью реакции Хека-Соногаширы 17

1.2 Строение алкинилированных нуклеозидов 64

1.3 Спектральные свойства алкинилированных нуклеозидов 67

ГЛАВА II. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ 5-АРИЛЭТИНИЛЬНЫЕ

ПРОИЗВОДНЫЕ 2'-ДЕЗОКСИУРИДИНА: СИНТЕЗ, СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА И ВВЕДЕНИЕ В СОСТАВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ (результаты и обсуждение)

И.1 Синтез 5-арилэтинильных производных 2'-дезоксиурцдина 72

II. 1.1 5-( 1 -пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин 73

II. 1.2 5-(4-пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин 80

II. 1.3 5-(3-периленилэтинил)-2'-дезоксиуридин 83

II. 1.4 5-[4-(2-бензоксазолил)фенил]этинил-2'-дезоксиуридин 86

П.2 Спектральные свойства флуоресцентных аналогов нуклеозидов 89

II. 3 Синтез модифицирующих реагентов (фосфамидитов и

твердофазных носителей) на основе 5-(1-пиренилэтинил)- и 5-[4-(2-бензоксазолил)фенил] этинил-2'-дезоксиуридина 95

И.4 Синтез и свойства олигонуклеотидов, содержащих 5-(1-

пиренилэтинил)- и 5-[4-(2-бензоксазолил)фенил] этинил-2'-дезоксиуридин

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

III. 1 Материалы и оборудование 101

111.1.1. Растворители 101

111.1.2. Реактивы 101

111.1.3. Оборудование 102 III. 2 Методы 102

Выводы 118

Благодарности 119

Литература

120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ас - ацетил

Alk - алкил

Аг - арил

Вое - 7рет-бутилоксикарбонил

Виг - бутил

Bz - бензоил

(Cl)Bz - 4-хлорбензоил

DCC - 1,3-дициклогексилкарбодиимид

DCE - 1,2-дихлорэтан

DDEM - донор-донорная миграция энергии

DDQ - 2,3-дихлор-5,6-дициан-л"-бензохинон

ddUTP - 2',3'-дидезоксиуридин-5'-трифосфат

DMAP - 4-(N, ЛАдиметиламино)пиридин

DMF - диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DMT - 4,4'-диметокситритил (4,4'-диметокситрифенилметил)

dUTP - 2'-дезоксиуридин-5'-трифосфат

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль

Et - этил

Fc - ферроценил

Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил

FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции

HMDS - гексаметилдисилазан

HSY - вирус простого герпеса

LCAA-CPG- аминоалкилированное стекло с определенным размером пор

LDA - диизопропиламид лития

Me - метил

MOM - метоксиметил

Ph - фенил

Piv - пивалоил (2,2-диметилпропионил)

Рг7 - изопропил

Рх - пиксил (ксантен-9-ил)

Ру - пиридин

Руг - пиренил

ТВОМБ - трег-бутилдиметилсилил

тг - трифлил (трифторметилсульфонил)

ТИБ - тетрагидрофуран

ТНР - 2-тетрагидропиранил

То1 - толуил (4-метилбензоил)

Тг - тритил (трифенилметил)

ъ - бензилоксикарбонил

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КССВ - константа спин-сгшнового взаимодействия

НК - нуклеиновые кислоты

ПААГ - полиакриламидный гель

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

УФ - ультрафиолетовый

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

-6-

ВВЕДЕНИЕ

Методы ковалентного присоединения люминесцентных красителей к нуклеозидам, нуклеотидам, олиго- и полинуклеотидам хорошо разработаны [1-5], поскольку сфера применения таких конъюгатов обширна. Так, флуоресцентные производные нуклеозид-5'-трифосфатов используются для автоматизированного секвенирования ДНК [6], а флуоресцентные конъюгаты олигонуклеотидов - как ДНК-зонды [7,8].

Предел детекции обычных радиоизотопных меток на два порядка ниже, чем для флуоресцентных красителей, однако у флуоресцентных меток есть такие преимущества, как отсутствие ионизирующего излучения, практически неограниченный срок хранения конъюгатов, возможность автоматизации детекции, возможность одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами.

В качестве люминесцентных меток для нуклеиновых кислот преимущественно используются производные гидрофильных ксантеновых красителей (флуоресцеин, родамины и т. п.), флуоресценция которых в водных растворах мало зависит от физико-химических свойств микросреды. Поэтому в большинстве случаев красители в составе конъюгатов применяются лишь для детекции их нуклеотидной части. В то же время, флуорофоры могут служить также источником информации о структурных изменениях в ходе различных процессов с участием нуклеиновых кислот (гибридизации с образованием дуплексов или триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами). Анализ процессов взаимодействия НК по изменению эмиссионных спектров до недавнего времени привлекал ограниченное внимание исследователей из-за его трудоемкости, особенно в отношении синтеза. Однако в последние годы появилось значительное число работ, иллюстрирующих перспективность флуоресцентных красителей в этой области.

Среди флуорофоров, использовавшихся для детекции взаимодействий НК, бесспорным лидером является пирен - тетрациклический ароматический углеводород, обладающий большим временем жизни возбужденного состояния (до нескольких сотен микросекунд). Одиночная пиреновая метка применялась для мониторинга гибридизации НК [9-27] и взаимодействия меченого зонда с ферментом [28]. Способность пирена к эксимерной флуоресценции, проявляющаяся при сближенном стопочном расположении плоских полиароматических остатков, используется для детекции гибридизации [21,26,2932], например, для эффектного доказательства образования параллельного ДНК-дуплекса [33-35].

Другой возможностью повысить чувствительность эмиссионного спектра зонда к

микроокружению является использование двух различных флуорофоров (донора и акцептора энергии) в качестве "составного" флуорофора. Для такой пары эффективность безызлучательного резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET, fluorescence resonance energy transfer) обратно пропорциональна шестой степени расстояния между красителями. Это означает, что цри возбуждении в области поглощения донора и регистрации эмиссии акцептора последняя должна быть крайне чувствительной к изменениям расстояния между обоими флуорофорами. Для биополимеров такой подход особенно эффективен [36-42].

Например, с использованием праймеров, меченных флуорофором и тушителем, реализован экспресс-анализ делеционной мутации AF508 гена кистофиброза человека [43]. Применение донорно-акцепторной пары флуорофоров, присоединенных к олигонуклеотидам, позволило детектировать процесс гибридизации в растворе при концентрациях ДНК на два-три порядка меньших, чем необходимые для наблюдения гипохромизма [44,45]; с помощью FRET была реализована возможность регистрации процесса гибридизации в живой клетке [46], предсказывавшаяся ранее [47]. Резонансный перенос энергии на нуклеиновых кислотах использовался для структурного анализа [48— 56], мониторинга гибридизации [57-65] и деградации [66-68] олигонуклеотидов, секвенирования [69-73], контроля ПЦР [42,62,74,75] и детекции высвобождения олигонуклеотидов из липосом [76].

Для присоединения красителя к нуклеозиду или олигонуклеотиду используют линкеры различной природы. Поскольку взаимодействие флуорофора с гетероциклическими основаниями может вызывать значительное уменьшение квантового выхода флуоресценции (это было показано на примере производных пирена [12]), то, стремясь уменьшить такое взаимодействие, флуорофор обычно присоединяют при помощи довольно длинного спейсера, разобщающего обе группировки и их системы электронов. В то же время с точки зрения изучения спектральных свойств значительный интерес представляют модифицированные нуклеозиды, в которых нуклеиновое основание л-сопряжено с флуорофором, - в этом случае ароматическая система гетероцикла становится составной частью флуоресцентного красителя, что приводит к дополнительным спектральным эффектам. Примеров синтеза подобных соединений известно совсем немного, причем в качестве флуоресцентной метки, как и в работе [12], использовался пирен [77-79].

Известно, что введение 1-алкин-1 -ильной группы в положение 5 пиримидинового нуклеозида не нарушает субстратных свойств dUTP и ddUTP в полимеразной реакции [6,80-83] и даже способно увеличивать стабильность комплексов нуклеиновых кислот [84-

-895]. Алкинильный спейсер оказался удобным для присоединения спиновой метки для изучения молекулярной динамики ДНК [96-101]. В то же время тройная связь пригодна также для сопряжения ^-электронных систем флуорофора и нуклеинового основания, поскольку известно, что введение арилэтинильного заместителя в молекулу красителя (органические красители, люминесцирующие в видимой области, представляют собой (гетеро)ароматические соединения, часто полициклические) приводит к изменению его флуоресцентных свойств, а именно, к существенному длинноволновому сдвигу максимумов поглощения и эмиссии, т.е. фактически к новым красителям (см, например [102-111]).

Целью данной работы явился синтез и исследование спектральных свойств 5-арилэтинильных л-сопряженных флуоресцентных производных 2'-дезоксиуридина, а также получение на их основе реагентов, пригодных для введения флуоресцентных красителей в олигонуклеотиды.

Настоящая работа выполнена в лаборатории механизмов экспрессии генов Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

АЛКИНИЛИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ И ИХ АНАЛОГИ: СИНТЕЗ, СТРОЕНИЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА*

(обзор литературы)

Интерес к химии модифицированных нуклеозидов продолжает расти. В первую очередь это связано с поиском новых противовирусных и противоопухолевых препаратов. Поскольку химический синтез НК разработан превосходно, в настоящее время возможно получение широкого круга олиго- и полинуклеотидов, содержащих модифицированные нуклеозиды в заданных положениях. Такие модифицированные полимеры полезны для изучения структуры и функции НК, межнуклеотидных и нуклеиново-белковых взаимодействий, а также представляют интерес в качестве возможных терапевтических препаратов.

Число публикаций в области химии и применения модифицированных нуклеозидов стремительно возрастает. Множество исследований проводится в лабораториях химических и фармацевтических компаний, поскольку получаемые результаты довольно быстро могут привести к разработке различных коммерческих продуктов: фармацевтических препаратов, реактивов для биохимии, молекулярной биологии и биомедицинской диагностики, высокотехнологичного научного оборудования (например, система для автоматического секвенирования ДНК) и т. д. Результаты исследований в этой области публикуются в десятках журналов, а также в патентах многих стран. Поэтому систематизация и критическое сопоставление результатов, полученных различными исследователями, весьма актуальны.

В данном обзоре обобщены сведения о методах синтеза алкинилированных нуклеозидов и их аналогов и приведена сводка описанных веществ этой группы, представители которой лежат в основе перспективных антисмысловых ингибиторов экспрессии генов.

I. МЕТОДЫ СИНТЕЗА АЛКИНИЛИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ

1.1 Первые примеры синтезов. Генерация алкинов по методу Кори-Фукса. Синтез алкинилированных нуклеозидов гликозилированием алкинилированных оснований.

Первое сообщение о синтезе представителя алкинилированных нуклеозидов, 5-этинил-2'-дезоксиуридина, было опубликовано в 1976 г. [112]. Исходным веществом служил 5-формилурацил (I). Реакцией Виттига он был превращен в дибромалкен (II),

* Здесь и далее термином "алкинилированные нуклеозиды и их аналоги" обозначены соединения, имеющие 1 -алкин-1 -ильные заместители при С-атомах нуклеиновых оснований нуклеозидов, их аналогов и производных.

дезоксирибозилирование которого силильным методом привело к соответствующему нуклеозиду в виде смеси ß- и а-аномеров (-3:1); после хроматографии на силикагеле ß-аномер (III) был выделен с умеренным выходом (схема 1).

1. hmds/(nh4)2so4

ТоЮ— о

0 о н ^w-a

HnVHO Ph3P-CBr2 HN'VVBr 2' Tolb '^

0^NJ ВГ -~--TolOn^0

I

Н Н . !_

1 1. HMDS NaOMe/^ TolO 111 2. PhLi

° ^ " HN\VBr ^

HN .......Y o N ^ Br 1. HMDS/Me3Sia ±

А ) НО о | 2. PhLi HO-! °o Y

O N ^ 7 3. AcOH/MeOH

" 1 19% '-

IV он V он VI

Схема 1

После удаления л"-толуильных групп был получен нуклеозид (V), кислородные функции в котором защищали щелочелабильными , силильными группами. Дибромэтенильная группировка действием PhLi в THF при -50 и 0°С была превращена в этинильный остаток. После мягкого кислотного десилилирования с низким выходом был выделен целевой нуклеозид (VI) [112] (табл. 1, №1). В этой же работе был описан синтез 5-этинилурацила (IV) из дибромалкена (II) в результате серии аналогичных превращений [112].

Другой группе исследователей после нескольких безуспешных попыток [113] также удалось синтезировать 5-этинилурацил (IV) [114] (схема 2). Исходный 5-ацетилурацил

(VII) обработкой РОС1з переводили в 5-(1-хлорвинил)-2,4-дихлорпиримидин (VIII), который при действии NaOEt в этаноле дал смесь алкинильных производных (IX) и (X) в соотношении ~ 1:2,2 (схема 2). Гидролиз этой смеси 2 М НС1 вернул гетероциклу его исходную структуру, но сопровождался присоединением хлороводорода по тройной связи с образованием 5-(1-хлорвинил)урацила (XI). Отщепление НС1 от этого вещества действием NaOEt с высоким выходом привело к целевому алкину (IV). Авторы обнаружили, что это соединение может быть также получено непосредственно из алкена

(VIII) при щелочном гидролизе/дегидрохлорировании [114].

В работах [112] и [114] отмечается, что не удается провести превращение дибромалкена (II) в алкин (IV) действием BuLi, который использовался в общем методе синтеза терминальных алкинов из альдегидов через дибромалкены, разработанном Кори и Фуксом [115].

ны

О N

н IV

J к

NaOEt 86%

О С1

X

Схема 2

н XI

Оказалось, что алкинилированные пиримидиноны могут быть гликозилированы обычным образом. В 1977 г. появилось сообщение о синтезе таким путем 5-этинилцитидина (XVI) [116] (схема 3). Соединение (VIII) при обработке ГЧНз дало смесь продуктов (XII) и (XIII), последний из которых действием щелочи был превращен в 5-этинилцитозин (XIV). Гликозилирование основания (XIV) с высоким выходом привело к 2',3',5'-три-0-защищенному нуклеозиду (XV), из которого в результате дебензоилирования метилатом натрия бьш получен целевой 5-этинилцитидин (XVI).

С1 С1

ц-Ч^ч ИНз/ЕЮН

С1 С1

I !

МН2 С1

] ] +

СК N

VIII

н2м

.....N

XII

(11%)

С1

N (28%) XIII

2 М КОН -

1. НМ05/^Н4)2504 ВгО-1 о

г 5па4

_В2Р ОВ2_Вго-

<90%

Ш.

ВгО ОВг

XV

Схема 3

НО

ОН ОН

XVI

Таким образом, сначала были разработаны два подхода к синтезу алкинилированных нуклеозидов. В первом из них тройная связь создается из двойной в составе готового нуклеозида по методу Кори-Фукса (например, превращение алкена (V) в алкин (VI); см. также табл. 1).

Таблица 1. Синтез этинилированных нуклеозидов с использованием метода Кори-Фукса [4]

№ Исходный нуклеозид Реагенты Условия реакции Продукт реакции Выход, % Литература

1 о н НС- * о он V 1. HMDS/Me3SiCl 2. PhLi 3. AcOH/MeOH 1 ч при -50°С, затем 45 мин при 0°С в ТЭТ 0 I/ HN ^ НО— о ! О он VI 19 112, 117 (Схема 1)

2 0 н HN^^V^V®1 НО. °0У 41 он он PhLi - о HN-V^ oV он он - 117

3 9 Н Вг BzO qN3 о AcO 1. PhLi (8,4 экв) 2. MeOH 2 ч при -78°С, затем 2 ч при 0°С в ТОТ »V O^N^ HO- o^3 о? он 39* 118

* Приведена методика синтеза.

В табл. 1 приведены имеющиеся данные о превращениях алкенильных производных нуклеозидов в алкинильные. Как видно из примера 3, О-защитные ацильные группы в процессе реакции отщепляются (поэтому необходим большой избыток PhLi), тогда как алифатическая азидогруппа в этих условиях устойчива. Этим методом получали только 5-этинильные производные урацильных нуклеозидов.

Второй подход включает в себя синтез алкинилированного гетероциклического основания и его гликозилирование. В табл. 2 представлены данные о гликозилировании алкинильных производных гетероциклических оснований, триметилсил ильные производные которых могут быть выделены или же приготовлены in situ. Незащищенная терминальная ацетиленовая группа выдерживает различные условия гликозилирования (№ 1, 5, 6 в табл. 2). Выходы нуклеозидов колеблются в широких пределах; препаративное выделение целевого p-аномера нередко представляет собой трудноразрешимую задачу. В реакциях гликозилирования (табл. 2) использовались производные урацила (№ 1-4), цитозина (№ 5-6) и пиримидин-2-она (№ 7-9); сведений о гликозилировании алкинилированных пуринов обнаружено не было.

Таблица 2. Синтез алкинилированных нуклеозидов гликозилированием алкинилированных гетероциклических оснований

№ Алкинилированный гетероцикл и силилирующие реагенты Углеводное производное Условия реакции Продук