Синтез и исследование свойств конъюгатов олиго- и полинуклеотидов с низкомолекулярными лигандами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

российская академия наук

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. ШЕМЯКИНА и Ю.А. ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

003450806 ПРОХОРЕНКО Игорь Адамович

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ КОНЪЮГАТОВ ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ ЛИГ АНДАМИ

02.00.10 - Биоорганическая химия

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

з о о;;т2с:о

Москва 2008

003450806

Работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

[То. А. Берлин]

кандидат химических наук В. А. Коршун

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Т. С. Орецкая

доктор химических наук В. К. Потапов

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится ^ноября 2008 г. в 10— на заседании

Специализированного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан^Роктября 2008 г.

Ученый секретарь ——___

Специализированного совета доктор физ.-математических наук

"О

Олейников В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аю-уальность проблемы. Одним из важнейших факторов, обеспечивающих последние значительные достижения молекулярной и физико-химической биологии, является прогресс в области синтеза модифицированных нуклеиновых кислот и компонентов. Особое внимание уделяется разработке новых высокочувствительных реагентов для исследования биоспецифических взаимодействий, исследования структуры и биологической роли этого важнейшего класса природных соединений. Для этой цели хорошо зарекомендовали себя современные люминесцентные метки. Они характеризуются стабильностью, высокой чувствительностью, возможностью автоматизации процедур модификации и обнаружения, возможностью одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорамн, а также меньшим отрицательным воздействием на окружающую среду и человека.

Широкое применение для мечения олигонуклеотидов находят производные полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Повышенный интерес к ним обусловлен как доступностью исходных флуорофоров и хорошо разработанными методами функционапизации, так и интересными физико-химическими свойствами. Это и люминесцентные свойства, особенно способность к эксимерной флуоресценции, и специфическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, а также другими биомолекулами и их комплексами. Конъюгаты олигонуклеотидов с ПАУ продолжают находить всё новые и новые применения в биомедицинских исследованиях и в ближайшее время наверняка войдут в набор рутинных методов ДНК-диагностики.

Во многих случаях оптимальным способом синтеза олигонуклетидных конъюгатов является амидофосфитный автоматический твердофазный синтез с использованием наряду со стандартными реагентами модифицированных фосфамидитных реагентов и носителей. Разработке таких реагентов как нуклеотидной, так и ненуклеотидной природы, уделяется большое внимание.

Цель работы. Диссертация посвящена синтезу реагентов для амидофосфитного автоматического твердофазного синтеза на основе гидроксипролинола (ЗЯ, 55-3-гидрокси-5-гидроксиметилпирролидина). С помощью этих реагентов, а также другими методами, были синтезированы модифицированные олигонуклеотидные коньюгаты с пиреном, 1-фенилэтинилпиреном (ФЭП) и рядом других широко используемых флуоресцентных красителей: флуоресцеином, тетраметилродамином, СуЗ, Су5, Нильским красным, были изучены спектральные свойства полученных конъюгатов и разрабатаны методы их применения в анализе ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе разработаны методы получения новых реагентов для флуоресцентной модификации и функционализации олигонуклеотидов. С помощью этих реагентов были получены новые флуоресцентные олигонуклеотидные коньюгаты и исследованы их флуоресцентные свойства. На основе полученных результатов были разработаны олигонуклеотидные зонды для детекции точечных нуклеотидных замен с помощью микрочипов, а также методом флуоресцентной гибридизации в растворе.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на 3 Международном симпозиуме по биоорганической химии (Дагомыс, 1995), международном симпозиуме «12-й Круглый стол: Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологические применения» (JIa-Хойя, 1996), Юбилейной научной сессии, посвященной 100-летию со дня рождения профессора H.A. Преображенского (Москва, 1996), международной конференции «Тенденции в химии нуклеиновых кислот» (Москва, 2000), конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущиио, 2001), VI чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2002), XV и XVI зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003 и 2004), 5 Кембриджском симпозиуме "Химия и биология нуклеиновых кислот" (Кембридж, Великобритания, 2003), международном симпозиуме «17-й Круглый стол по нуклеозидам, нуклеотидам и нуклеиновым кислотам» (IRT-XVII; Берн, Швейцария, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей в реферируемых журналах.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (222 ссылки). Работа изложена на 129 страницах, содержит 37 рисунков, 16 схем и 9 таблиц.

1. Синтез модифицирующих реагентов на основе гндроксннролинола

В качестве структурной основы для этих реагентов был выбран (ЗЛ,55)-3-гидрокси-5-гидроксиметилпирролидин (от/«мс-4-гидрокси-Ь-прол1тол, 1.01, схема 1, И2=Н), производное аминокислоты гидроксипролина, которое легко получить восстановлением карбоксильной группы последнего до первичной гидроксилыюй группы. Данниое соединение представляет собой пятичленный азотистый гетероцикл, содержащий первичную и вторичную гидроксильпые группы, и имеет структурное сходство с рибозным остатком нуклеиновых кислот. Благодаря этому сходству вещество нашло широкое применение для синтеза модифицирующих реагентов с использованием стандартного набора химических методов автоматического твердофазного олигонуклеотидного синтеза.

1.1. Синтез пнренсодержащего фосфамиднтного реагента на основе гидроксипролмнола

Представляло интерес получить ненуклеотидный модифицирующий фосфамиднтный реагент, содержащий остаток пирена, и пригодный для синтеза олигонуклеотидных зондов, несущих пиреповый псевдонуклеозидный фрагмент в предварительно заданном месте олигонуклеотидной цепи. Желательно, чтобы вводимый фрагмент минимально искажал структуру дуплекса с участием конъюгата. Этого можно достигнуть, используя в качестве псевдосахарной единицы группировку, структурно родственную 2'-дезокси-рыбо-фуранозе нуклеозндов.

О H н

Л il _ NHCI

R О

Ьн Ън "ÛR3

/1.01: R1 = H 1.03 . /• 1.04: R2 = H, R3 = H

M.02: R1 = Me > 1.05: R2 = Dmt, R3 = H

^1.0

V .06: R2 = Dmt, R3 = P(NPr,2)OCH2CH2CN

Схема 1. Реагенты и условия: i) Тионилхлорид, метанол, ледяная баня, 94%; il) 1. NaBH.i, метанол; 2. Соляная кислота; 71%; iii) 1.05, триэтиламин, пиридин, 87%; iv) Диметокситритилхлорид, пиридин, ледяная баня, 63%; v) (PrSN^POCHîCtkCN, тегразолид диизопропиламмония, ацетонитрил, 65%.

В качестве псевдосахарной единицы использован (25',4Я)-2-гидроксиметил-4-гидроксипирролидин 1.03, полученный в две стадии из L-гидроксипролина, природной минорной аминокислоты. Синтез гидроксипролинола 1.03 из гидроксипролина 1.01 осуществлялся по литературной методике с использованием в качестве восстановителя L1BH4/THF. Была также опробована система NaBH4/EtOH, применявшаяся для

восстановления сложных эфиров 3,6-дидезокси-3,6-иминогексоновых кислот в соответствующие иминогекситолы.

Для введения пиренового остатка выбрана 1-пиренилуксусная кислота, в которой сохраняются флуоресцентные свойства пирена (как обычно у алкилпиренов), и, в то же время, спейсер для присоединения пиренового полицикла имеет минимальную длину. 1-Пиренилуксусная кислота была синтезирована по известным методикам. Кислота была превращена в активированный пентафторфениловый эфир с использованием Л^У-дициклогексилкарбодиимида. Выход на стадии этерификации составил 92%. Стандартная схема получения модифицирующего реагента из предшественника 1.03 обычно представляет собой присоединение модификатора по атому азота гетероцикла и селективное блокирование первичного гидроксила с помощью диметокситритильной защитной группы. Для ацилирования полученного гидроксипролинола по аминогруппе было необходимо подобрать условия, так как реакция активированного эфира с иминодиолом 1.03 при комнатной температуре в пиридине протекала очень медленно, а в присутствии ОМАР приводила к сложной смеси продуктов, по-видимому, в результате ацилирования по гидроксильным группам. Применение в качестве основания триэтиламина позволило достигнуть приемлемой скорости и селективности реакции. Целевое вещество 1.04 было выделено с выходом 89% (схема 1). Объемный пиренилацетильный остаток, расположенный ближе к первичному гидроксилу (2-СН2ОН), чем к вторичному (4-ОН), уменьшает селективность тритилирования: при проведении реакции диола 1.04 с ОМТС1 в стандартных условиях (пиридин, 0°С, 1 экв БМТС1) выход монозащищенного вещества 1.05 составил лишь 63%. Дальнейшее фосфитилирование по вторичной 4-ОН-группе привело к амидиту 1.06 с выходом 65%.

1.2. Разработка универсального подхода к синтезу модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола

Очистка и выделение амидных производных яг/?анс-4-гидрокси-Ь-пролинола,

аналогичных 1.03, но содержащих остаток более полярного красителя, иногда является

достаточно трудоемкой процедурой из-за низкой растворимости данных соединений в

органических растворителях и малой хроматографической подвижности в условиях

адсорбционной хроматографии на силикагеле. В связи с этим был разработан новый подход

к получению таких производных, основанный на присоединении модифицирующих

реагентов к частично защищенному по первичному гидроксилу

диметокситритилгидроксипролинолу 1.11. Для его получения была разработана схема с

использованием стандартного метода восстановления эфиров аминокислот

натрийборгидридом. Однако для удобства дальнейших превращений, а также выделения

4

промежуточных продуктов была использована стандартная бензилоксикарбонильная защитная группа (схема 2). Выбор самой защитной группы был обусловлен ее удобством для дальнейших превращений, а именно, для деблокирования аминогруппы при условии сохранения DMT-защиты. В связи с этим было решено использовать в качестве исходного вещества для получения базового структурного блока коммерчески доступный реагент N-карбобензокси-Ь-гидроксипролин 1.07.

Схема 2. Реагенты и условия: <) Метанол, серная кислота, 92%, и) №ВН|, метанол, тетрагидрофуран 92%; ш) Диметокситритилхлорид, пиридин, ледяная баня, 83%, ¡V) Водород, 10% палладий на угле, метанол, 99%

Метиловый эфир Л,-бензнлоксикарбонил-/н/>анс-4-гидрокси-Ь-пролина 1.08 был получен по методу Фишера с использованием в качестве катализатора серной кислоты. Полученный метиловый эфир восстанавливали №ВН4 в тетрагидрофуране с добавлением рассчитанного количества метанола с образованием А'-бензилоксикарбонилыгого производного 1.09. Продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии. Данное соединение тритилировали по стандартной методике с использованием БМТС1 в пиридине с выходом 83 %. Целевой продукт 1.10 в связи с этим необходимо было выделять с помощью колоночной хроматографии. Следующей стадией синтеза было деблокирование аминогруппы в условиях каталитического гидрирования по стандартной методике удаления бензилоксикарбонильной группы каталитическим гидрированием с использованием 10% палладия на угле в качестве катализатора. Если в реакции используется хроматографически очищенное карбобензоксипроизводное, продукт 1.11 может быть использован без дополнительной очистки в последующих реакциях. Выход на данной стадии составил 99%.

Затем на основе данного полупродукта был синтезирован ряд реагентов для модификации олигонуклеотидов. КонденсациеГ! базового блока 1.11 с рядом пентафторфениловых эфиров (1.13, 1.16, 1.18) в хлористом метилене были синтезированы предшественники реагентов 1.24а-с, позволяющие вводить в олигонуклеотиды функциональные группы на гибком линкере. Синтез пентафторфениловых эфиров 1.13, 1.16, 1.18 показан на схеме 3.

,з

'ОН

1.07: R1 = Н

'ОН

1.09: R2 = H, R3 = Cbz

Схема 3. Реагенты и условия: i) Пентафторфенол, трифторуксусный ангидрид, трифторуксусная кислота, 86%; й) Тиоацетат калия, метанол; iii) Дициклогексилкарбодиимид, пентафторфенол, этилацетат; 22% (на две стадии); iv) Дициклогексилкарбодиимид, пентафторфенол, метиленхлорид, 93%

Из аминокапроновой кислоты 1.12 обработкой трифторуксусным ангидридом и пентафторфенолом был приготовлен пентафторфениловый эфир 1.13. При синтезе реагента для введения меркаптогруппы вначале алкилированием тиоуксусной кислоты 6-бромкапроновой кислотой 1.14 получали сырую 6-(ацетилтио)капроновую кислоту 1.15, которую затем без выделения превращали в пентафторфениловый эфир 1.16 стандартным методом с использованием дициклогексилкарбодиимида с последующей хроматографической очисткой. Коммерчески доступная гексиновая кислота 1.17 также была превращена в эфир 1.18 карбодиимидным методом.

Для синтеза модифицирующих реагентов также использовались следующие производные нерадиоизотопных репортерных групп: пентафторфениловый эфир О-защищённого 6-карбоксифлуоресцеина 1.19, 6-карбокситетраметилродамин 1.20, карбоксипроизводные 3,3,3',3'-тетраметил-2,2'-индокарбоцианина (СуЗ) 1.21 и 3,3,3',3'-тетраметил-2,2'-индодикарбоцианина (Су5) 1.22, а также пентафторфениловый эфир биотина 1.23.

Ацилированием блока 1.11 пентафторфениловыми эфирами 1.13, 1.16, 1.18 с выходами 65-83% были получены предшественники трёх модифицирующих реагентов для введения в олигонуклеотиды алифатической амино- и тиольной групп, а также терминального ацетилена (схема 4).

При снятии трифторацетильной группы с производного 1.24а получается аминопроизводное, которое без выделения было обработано пентафторфениловым эфиром биотина 1.23 и защищенного производного флуорофора 6-FAM 1.19 с образованием соединений 1.24f и 1.24g. Аналогичный предшественник фосфорамидитного реагента с флуорофором TAMRA 1.24h был получен из кислоты 1.20 с помощью конденсирующего реагента РуВор. Производные двух других широко используемых флуорофоров СуЗ 1.21 и

Су5 1.22, уже содержащие в своём составе карбоксильную группу на гибком алифатическом линкере, были присоединены непосредственно к блоку 1.11 также с помощью конденсирующего реагента РуВор.

ЫМе2

ТАМЯА

1 „,-в

Мв рр6 ^ ^ ,,

С02Н _ _ V V со н

Су51«

1

НЫ N4

1.23 О

ИтЮ

н

I

ОтЮ

он

1.11

Ъи2

1.24-1.26

1.24а: Я1 = СО(СН2)5МНТГа, Я2 = Н 1.24Ь: Н1 = СО(СН2)5ЗАс, Р2 = Н 1.24с: Я1 = СО(СН2)3С=СН, Я2 = Н 1.24(1: Я1 = СО(СН2)5-СуЗ, Я2 = Н 1.24с: Я1 = СО(СН2)5-Су5, Я2 = Н 1.24^ Я1 = СО(СН2)5Ш-Ыо«пу1, Я2 = Н 1.24д: Я1 = СО(СН2)5МНСО-РАМ, Я2 = Н 1.24Ь: Я1 = СО(СН2)5МНСО-ТАМРА, Я2 = Н

1.25а-Ь: Я2 = Р^РгуоСНгСНгСМ

1.26а<^: Я2 = ОСОСН2СН2СОМН-|_СААСРС

Схема 4. Реагенты и условия: ¡) Активированный эфир (1.13, 1.16, 1.18), триэтиламин, метиленхлорид или кислота (1.21, 1.22), триэтиламин, РуВОР, РМР; И) 1. Карбонат калия, метанол, вода; 2. Активированный эфир (1.19, 1.23), триэтиламин, метиленхлорид или кислота (1.20), триэтиламин, РуВОР, ОМР; ш) (Рг'21Ч)2 РОС Н2 СН2 СМ, тетразолид диизопрогшламмония, метиленхлорид или Рг'гОТ^ЦОСНгСНгСН, диизопропилэтиламин, метиленхлорид; ¡V) Пентафторфенол, пиридин, диизопропилкарбодиимид, сукцинил-ЬСААСРв, БМИ.

Таким образом бьш получен набор соединений, которые далее были превращены серию фосфамидитных реагентов 1.25а-Ь и твердофазных носителей 1.26а-с,Г При этом в случае соединений 1.24а, 1.24с и 1.24Г для этого превращения использовался более мягкий бис-диизопропиламиноцианэтоксифосфин во избежание нежелательных побочных реакций.

Для остальных же предшественников был применён

диизопропиламиноцианэтоксихлорфосфин как наиболее эффективный и быстрый фосфитилирующий реагент.

2. Синтез и свойства олигонуклеотидов, модифицированных реагентами на основе гидроксипролинола

Для исследования физико-химических свойств олигонуклеотидов, содержащих в своём составе пиреновый псевдонуклеозидный фрагмент, с помощью реагента 1.06 был синтезирован ряд олигонуклеотидных структур ОШ-(Ж14 (табл. 1). Табл. 1. Последовательности модельных пиреновых олигонуклеотидов.

Шифр

Последовательность, 5'—>3'

MALDI-TOF, рассчитано/найдено

ONOl ТТТТТТТТТРугТТГТПТПТ 6139,0/6138,2

ON02 ГПТГПТПРугТПТП'ПТ 6139,0/6137,9

ON03 АААААААААРугАААААААААА 6311,4/6312,1

ON04 ААААААААААРугААААААААА 6311,4/6312,8

ON05 АААААААААРугРугААААААААА 6418,6/6419,2

ON06 AGCTTGPyrCTGCAGGTCACGGATCCCCGG 5111,5/5108,6 ON07 САААСАААААРугААААСАААААААС 7468,1/7467,8

ON08 САААСААААААРугАААСАААААААС 7468,1/7469,3

ON09 GTTTTTTTGrnTPyrTTTTTGTTTG 7456,9/7451,2

ONIO GTTTTTTTGTTTTTPyrTTTTGTTTG 7456,9/7459,1

ONU GTTTTTTTGTTTPyrTTTTTTGTTTG 7574,1/7574,0

ON12 GTTTTTTTGTTTPyrPyrTTTTTGTTTG 7347,9/7350,0

ON13 CAAACAAAAACAAAACAAAAAAAC

ON14 CAAACAAAAAPyrPyrAAACAAAAAAAC_

Олигонуклеотиды выделяли методом электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Выделенные из геля образцы, соответствующие целевым олигомерам, были очищены обращенно-фазовой ВЭЖХ. Как и следовало ожидать, модификации, связанные с введением гидрофобных пиреновых заместителей, увеличивают время удерживания конъюгатов. В спектрах поглощения олигонуклеотидов помимо полосы, соответствующей олигонуклеогидной части, можно наблюдать также и характерный пик, соответствующий пиреновуму флуорофору (рис. 1).

А«10-з

Рис. 1. Спектр поглощения олигонуклеотида ON05.

15 ДО ¡5 ДО 45 <0 (О 65 70 П 80

Рис. 2. Кривые плавления дуплексов модифицированных олигонуклеотидов с комплементарной матрицей (слева направо) ОМ4хОШ2, (Ж08*(Ж10, (Ж07х(Ж10.

Присутствие в конъюгате одного или нескольких пиреновых остатков ощутимо увеличивает его гидрофобность по сравнению с ^модифицированными олигонуклеотидами, что, однако, не препятствует использованию для выделения и очистки коньюгатов стандартных методов - электрофореза в ПААГ и обессоливания на колонке с ЭерИаскх 0-25.

Табл. 2. Температуры плавления дуплексов модельных олигонуклеотидов.

Дуплекс Последовательность Т. пл., °С

0\'04*Т2,| 3'-ааааааааар аааааааааа 43,3

|р]р |р|р|р тт ттт тттт х т т

ОШ5хТ2„ З'-аааааааааррааааааааа 39,2

^ в Т^РТ т тттт ттт тт ттт тт

ош>*о?ш З'-стттстттттрттттйтттттттв 49,5

5'-сааасааааасаааасааааааас

(Ж08*(Ж09 З'-стттстттттрттттвттттттто 54,0

5'-сааасааааараааасааааааас

ОШОхОГШ З'-стттсттттттртттстттттттб 5 '-сааасааааасаааасааааааас 47,5

ОКОЭхОМО 3 '-втттвттттттртттвтттттттв 56,5

5'-сааасааааараааасааааааас

ОМЦхОМЗ З'-стттсгттттрртттотттттттс 5'- с ааас ааааасаааас ааааааас 47,6

Из полученых олигонуклеотидов были приготовлены соответствующие дуплексы и исследована их термическая устойчивость методом определения температуры плавления в термостатируемой кювете. Температуры плавления дуплексов определялись по точкам перегиба на кривых плавления дуплексов (рис. 2, табл. 2). Вставка пиренового модификатора в середине цепи олигонуклеотида снижала температуру плавления дуплекса более чем на 15°С. Размещение второго пиренового остатка рядом с первым приводило к понижению устойчивости дуплекса уже в значительно меньшей степени по сравнению с мономодифицированным олигомером. Интересно отметить, что если вставка второго пиренового реагента находится в комплементарной цепи дуплекса напротив первой, то это вносит дополнительный стабилизирующий эффект, повышая при этом его температуру плавления на 6-8°С по сравнению с одной модификацией. По-видимому, при данном благоприятном расположении пиреновых остатков в данной структуре стэкинг-взаимодействия между ними вносят дополнительный стабилизирующий вклад. А когда пнреновые остатки расположены не точно напротив, а со сдвигом в сторону 5'-конца (ОШ9хО]\Ю), то такой стабилизирующий эффект ещё выше.

В спектрах флуоресценции пиренсодержащих олигонуклеотидов при введении рядом двух пиреновых остатков появляется интенсивная эксимерная полоса, которая уменьшается при образовании дуплекса с комплементарной немодифицированной цепью.

Использование модифицированных олигонуклеотидов, содержащих ацетиленовые группы и флуоресцентные цианиновые красители, в создании микрочипа для детекции точечных мутаций

Для демонстрации эффективности разработанных реагентов в олигонуклеотидном синтезе и использовании конъюгатов в модельной системе, разработанной для определения точечных нукпеотидных замен, был синтезирован ряд модифицированных олигонуклеотидов, а полученные конъюгаты были использованы в ПЦР и для иммобилизации на твёрдой фазе.

но^О 9'.? г

ч^Р—0-

[СиТВТАГ

ОЛИГОНУКЛЕОТИД

И о N

ур-0-[ ОЛИГОНУКЛЕОТИД |—в*

Схема 5. Иммобилизация аллельспецифических праймеров на стеклянном микрочипе. Значком В* обозначено З'-концевое основание, комплементарное букве, входящей в последовательность одного из аллелей

Олигонуклеотиды с ацетиленовыми группами были с помощью автоматического устройства нанесены микрокаплями на специальную стеклянную подложку. Для этого подложка была вначале обработана стандартным аминирующим агентом аминопропилсиланом, а затем активированным эфиром азидокислоты 2.1 (схема 5). Таким образом была приготовлена стеклянная поверхность с алифатическими азидогруппами. Далее апкинилированные олигонуклеотиды в присутствии комплекса Си1+ весьма

10

эффективно иммобилизовывались на стеклянную поверхность, что обнаруживалось по флуоресценции модельных конъюгатов (при этом иммобилизовывался олигонуклеотид, содержащий флуоресцентный краситель). На полученном таким образом стеклянном микрочипе была проведена гибридизация с ПЦР фрагментом гена, содержащим возможную точечную замену напротив З'-концевого нуклеотпда у иммобилизованных на подложке олигонуклеотидных зондов-праймеров. Далее к иммобилизованным дуплексам был добавлен раствор полимеразы и флуоресцентно меченых трифосфатов и осуществлась аллель-специфическая реакция достройки с целью последующего выявления однонуклеотидного полиморфизма по соответствующей окраске микропятен.

3. Синтез конъюгатов олнгонуклеотндов с сольватохромным флуоресцентным красителем Нильским красным

DNA

DMF/1M Et3NH2C03 буфер, рН7 О

DNA

DNA

HN

Ж

DNA

ON15 ATTTGAGCCTGGGAG ON 16 ATTTGAGCCTGGGAG (RNA) ON17 CTCCCAGGCUnCAAAT ON18 CUnCCCAGGCTCAAAT

Схема 6. Получение конъюгатов 2'-аминомодифицированных олигонуклеотидов с активированным производным красителя Нильский красный 3,1.

В качестве модельной сиситемы для изучения свойств конъюгатов олигонуклеотидов с Нильским красным была выбрана последовательность, комплементарная позициям 22-36 транс-активаторной области TAR RNA вируса имунодифицита человека типа 1 (ВИЧ-1) 35.

Уридин-2'-карбамат с длинноцепочечной аминогруппой UA или 2'-дезоксиуридин Ud помещены вместо внутреннего остатка тимидина (ON17) и тимидина, расположенного ближе к 5'-концу (ON18) (схема 6). Также были синтезированы комплементарные им немодифицированные олигонуклеотиды ON15 и ON16.

Остаток Нильского красного нейтрализует отрицательное влияние карбаматной группы на стабильность дуплекса примерно на 3°С при её различном расположении (ON17 или ON18). Подобное увеличение стабильности наблюдалось ранее для 2'-карбаматных производных дуплексов, содержащих плоские остатки полициклических углеводородов на коротком линкере, и объяснялось размещением хромофора в бороздках дуплекса ДНК.

Хорошо известно, что Нильский красный - это незаряженная гидрофобная молекула, флуоресценция которой сильно зависит от полярности микроокружения. Как видно из структуры, можно было бы предположить сильное увеличение дипольного момента данной молекулы в возбуждённом состоянии.

Рис. 4. Спектры испускания а) олигонуклеотида ON17 (1) и его дуплексов с ДНК ON17xON15 (2) и РНК ON17xON16 (3), Ь) олигонуклеотида ON18 (1) и его дуплексов с ДНК ON18xON15 (2) и РНК ON18*ON16 (3). Концентрация 2-Ю"7 М, Х,0,6 540 нм, 297 К, гибридизационный буфер (см. эксп. часть)

Поэтому не удивительно, что флуоресценция этого хромофора сильно тушится в полярных растворителях по сравнению с неполярными. Интенсивность флуоресценции конъюгатов ON17 и ON18 в водных растворах довольно слаба. Причём флуоресценция конъюгата с внутрицепочечной меткой ON17 выше, чем у ON18, и максимум испускания конъюгата ON17 сдвинут по сравнению с ON18 в синюю область. При гибридизации конъюгатов с ДНК и РНК их флуоресценция тушится (рис. 4).

4. Синтез н свойства конъюгатов олнгонуклеотндов с пиреновым бихророфором

Для синтеза конъюгата с пиреновым бихромофором 4.1 была разработана схема, позволяющая присоединить данную молекулу по 5'-концу олигонуклеотида на твёрдой фазе, поскольку мечение в растворе реагентом 4.2 затруднительно из-за плохой растворимости в водных растворах гидрофобного реагента, а также его повышенной склонности к гидролизу.

г*-

НО-| САССАААСАССТАТСАС |-

25% водн. ЫН,

ОЖ9

ЛСАА-СРС„ 0

5' ' 3'

САССАААСАССТАТСАС

0№0

Н2М 0 11

2. Н2Ы'

3. (4.2)/ТНР

4. 25% водн. ЫН3

2. Н2М

н 5. 3. 25% водн. МНз 3.

. N ^О-С АвСАААС АССТАТСАС ОЫ21

О

5'

3'

- N -^.О-САСвАААСАССТАТСАС

О ОЫ22

СТССТТТСТССАТАСАС

ОЫ23

Н 5' 3'

.^О-САССАААСАССТАТСАС

СТССТТТСТССАТАСАС

Схема 7. Получение конъюгатов 5'-аминомодифицированных олигонуклеотидов с пиреновым бихромофором 4.1.

Процедура модификации в синтезе меченого олигонуклеотида 5'-САООАААСАОСТАТСАС-З', представляющего собой обратный универсальный праймер

для секвенирования в системе бактериофага М13, была полностью проведена на твердой фазе (схема 7). Конъюгат ОШ2 был использован для изучения влияния присоединения бихромофора к олигонуклеотиду и гибридизации конъюгата с комплементарной последовательностью на люминесцентные свойства метки.

Рис. 5. Спектры флуоресценции а) пиренового бихромофора 4.1 (1), раствора 4.1 в присутствии олигонуклеотида ON23 (2), конъюгата ON22 (3), раствора 4.1 в присутствии дуплекса ON20*C>N23 (4), дуплекса ON22*ON23 (5) в 25% водном метаноле; Ь) дуплекса ON22xON23 в воде (1), олигонуклеотида OI425 в воде (2) и в 25% водном метаноле (3), дуплекса ON22xON23 в 25% водном метаноле (4) Концентрация всех соединений 2-10'6М.

Полученные данные по флуоресценции пиренового бихромофора и его олигонуклеотидных производных позволяют сделать вывод о том, что имеет место сильное взаимодействие метки с одноцепочечной ДНК, препятствующее образованию эксимера, даже если метка и олигонуклеотид не связаны ковалентно, а присутствуют в растворе в концентрации 10"6 М (рис. 5). При образовании дуплекса или в присутствии метанола взаимодействие бихромофора с ДНК уменьшается и в той или иной степени проявляется эксимерная флуоресценция.

5. Разработка метода детекции точечных мутаций с помощью олигонуклеотидов, содержащих 1-фенилэтинилпиреновый флуорофор

Ранее было показано, что 1-фенилэтинильный флуорофор способен к эксимерной флуоресценции и может быть введён в состав олигонуклеотидов с помощью простого реагента. Представляло интерес попытаться использовать чувствительность фенилэтинилпиренового эксимера к микроокружению в гибридизационном анализе.

Была разработана новая система детекции точечных мутаций A2143G, А2143С, A2144G в гене 23S рРНК Н. Pylori в растворе. Основными компонентами этой системы являются зонды, содержащие бихромофор на основе двух сближенных фенилэтинилпиреновых флуорофоров, работающих как молекулярный переключатель. Реагируя на конформационные изменения, молекула зонда меняет свой спектр флуоресценции специфическим образом, что было использовано для обнаружения

точечных нуклеотндных замен. Был синтезирован набор зондов с одинаковой нуклеотидной последовательностью, но у каждого из них в середине цепи олигонуклеотида два расположенных рядом нуклеотида заменены на два пиреновых остатка, способных менять свой спектр флуоресценции в зависимости от конформации молекулы. Анализ спектров дуплексов позволил нам найти наиболее чувствительные к данным точечным заменам зонды и выявить закономерности оптимального расположения пиреновых остатков относительно вариабельных нуклеотидов ДНК-мишени.

Табл. 3. Нуклеотидные последовательности ДНК-зондов и ДНК-мишеней. «X» фенилэтинилпиреновый псевдонуклеозид

Фрагмент гена 23S РНК Я

pylon (кодирующая цепь;

дикий тип) 5' -GAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTAC-3 '

Модельный NNG 3' -TAAGGAGGATGGGCGCCGTTCTGCCTTTCTGGGGCACCTG- ■5'

фрагмент ДНК- G43C 3' -TAAGGAGGATGGGCGCCGTTCTGCCCTTCTGGGGCACCTG- ■5'

мишени длинной G43G 3' -TAAGGAGGATGGGCGCCGTTCTGCCGTTCTGGGGCACCTG- ■5'

40 п о (некодиру- G44C 3' -TAAGGAGGATGGGCGCCGTTCTGCCTCTCTGGGGCACCTG- 5'

юшая цепь)

GPM8 5' -GCAAGACXXAAAGACCCCGT-3 '

РЕРу эксимерные GPM9 5' -GCAAGACGXXAAGACCCCGT-3'

зонды GPM10 5 ' -GCAAGACGGXXAGACCCCGT-3'

GPMI1 5' -GCAAGACGGAXXGACCCCGT-3'

Была сконструирована модельная система, где с олигонуклеотидом-мишеныо, которая может содержать нуклеотидную замену, взаимодействует олигонуклеотид-зонд с двумя расположенными рядом остатками красителя в середине цепи. Задача состояла в том, чтобы подобрать оптимальное расположение пары флуорофоров в последовательности олигонуклеотидного зонда для обнаружения трёх конкретных нуклеотндных замен по спектральным изменениям в процессе взаимодействия зонда с мишенью.

Для исследования влияния точечных нуклеотндных замен в составе олигонуклеотида-мишени на спектры флуоресценции модельной системы зонды были спроектированы таким образом, чтобы один из двух соседних фенилэтинилпиреновых остатков (рис. б) располагался напротив заменяющегося основания или чтобы флуорофоры находились по соседству с парой оснований, содержащей возможный мисматч.

Рис. 6. Структура составного фенилэтинилпиренового бихромофора XX в зондах, собственно 1-фенилэтинилпиреновые хромофоры выделены.

Модифицированные олигонуклеотидные зонды были выделены с помощью электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) в стандартных условиях, используемых при очистке немодифицированных олигонуклеотидов. При этом полосы, соответствующие целевым структурам, легко идентифицировать по специфической флуоресценции УФ-свете (ЛВ0!е 254 нм). Наличие в структуре двух фенилэтиниллиреновых остатков существенно повышает гидрофобность конъюгатов, что дало возможность для их дополнительной очистки при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ. В связи с наличием ассиметрического центра в структуре модифицирующего реагента зонды, содержащие два остатка фенилэтинилпирена, представляют из себя четыре диастереомера, которые разделяются в условиях данного градиента. Затем синтезированные зонды были охарактеризованы с помощью МАЬВЬТОР масс-спектрометрии (рис. 7).

24,3

15000-

6468 4

10000-

ОРМ8

X

5000-

0-

6000

6500

тЛ

7000

7500

15 20 25 30 35 40 45

Время лдсрживипия, чнш

Рис. 7. Масс-спектр и профиль ВЭЖХ одного их зондов (СРМ8).

Растворы олигонуклеотидов, содержащих пару соседних фенилэтинилпиреновых остатков, имеют спектры флуоресценции, характерные для подобных структур с несколькими пиреновыми остатками, расположенными по соседству и способными образовывать эксимер (рис. 8). Однако их максимумы флуоресценции 402 и 425 нм для мономерной составляющей и Хш^ 505 нм для эксимерной составляющей спектра) находятся в более длинноволновой области, поскольку фенилэтинильная группа вносит дополнительный вклад в структуру флуорофора и, как следствие, сдвигает максимумы поглощения и флуоресценции в красную область.

Рис. 8. Эмиссионные спектры зондов СРМ8, СРМ9, СРМ10, вРМН в фосфатном буфере.

Модельные дуплексы были получены отжигом эквимолярных растворов олигонуклеотидных зондов и соответствующих мишеней с последующей регистрацией спектров флуоресценции. При благоприятном расположении фенилэтинилпиреновых остатков наблюдалась полоса эмиссии фенилэтинилпиренового эксимера.

При гибридизации ДНК-зондов СРМ8, вРМ9, вРМЮ, с мишенями, содержащими точечные замены (С43С, С43С, С44С), и немутантной (NN0) характер спектров (рис. 9) менялся. Интенсивность эксимерной флуоресценции этих дуплексов заметно уменьшилась, что особенно четко видно в случае зондов вРМ9 и вРМЮ. При этом в дуплексах, где она полностью исчезла, произошло возрастание интенсивности мономерной флуоресценции. Полоса, соответствующая эксимерной флуоресценции отсутствовала в спектрах дуплексов СРМ9><ШС, СРМ9хС44С, СРМ10*ШС, СРМ10хС43С, СРМ10*С43С. ДНК-зонд СРМ8 продемонстрировал только слабую

селективность по отношению к мишени <343С. Из рис. 9 видно, что зонды вРМ9 и вРМЮ ведут себя похожим образом. А именно, когда в модельных дуплексах в цепи олигонуклеотида-мишени происходит замена нуклеотида Т на б или С напротив расположенного ближе к 3'-концу фенилэтинилпиренового остатка в цепи зонда, то в дуплексах появляется эксимерная флуоресценция. Причём отношение интенсивности эксимерной флуоресценции к мономерной меньше, чем в растворах одноцепочечных зондов или дуплексов олигонуклеотидов-мишеней с другими зондами, не проявляющими чуствительности к анализируемым мутациям.

3

^ 150000

Рис. 9. Спектры флуоресценции дуплексов зондов СРМ8, СРМ9, СРМ10, вРМП с мишенями С43в (1), NN0 (2), в44С (3) и С43С (4) в фосфатном буфере.

Рис. 10. Пробирки с растворами модельных дуплексов СРМЮхШС (1),

СРМ10хС!44С (2), СРМ10*С43С (3) и СРМЮхСИЗС, К,* 360 нм.

В дуплексах этих зондов с другими мишенями полоса эксимерной флуоресценции практически полностью отсутствовала. Таким образом, спектры флуоресценции дуплексов зондов GPM9 и GPM10 при наличии или отсутствии точечных замен в заданном положении последовательности ДНК-мишени существенно отличаются от спектров одноцепочечных зондов и спектров других зондов и их дуплексов.

Флуоресценция фенилэтинилппренового флуорофора хорошо различима невооруженным глазом. В УФ-свете раствор дуплекса, содержащего точечную замену, визуализируется по зеленой эксимерной флуоресценции его раствора (рис. 10).

Зонды GPM9 и GPM10 были использованы в тест-системе для обнаружения трех выше упомянутых мутаций на 14 разных образцах ДНК, полученных из нормальных и кларитромпцнн-резистентных штаммов Н. Pylori. Из известных образцов геномной ДНК Н. Pylori при помощи полимеразной цепной реакции с использованием двух праймеров были получены двухцепочечные фрагменты гена 23S рРНК длиной 201 нуклеотид, содержащие анализируемый участок (1964-2164) последовательности гена. После чего полученные реакционные смеси использовали без дополнительной очистки в качестве матрицы для проведения асимметричной полимеразной цепной реакции с одним праймером. При этом использовались аликвоты, соответствующие 10-кратному по сравнению со стандартным для матрицы количеству ПЦР-продукта. Продукты такой асимметричной амплификации образцов ДНК штаммов Н. Pylori анализировали электрофорезом в агарозном геле. В образцах хорошо видна более диффузная полоса одноцепочечного продукта (ss), который является мишенью для флуоресцентных зондов (рис. 11).

Рис. 11. Асимметричная ПЦР участка 1964-2164 последовательности гена 23S rRNA Н. pylon (иекодирующая цепь) с матрицами из штаммов дикого типа (1), и с мутациями A2144G (2), A2143G (3) и А2143С (4); ds - двухцепочечный продукт, ss -одноцепочечный продукт; слева - стандарты молекулярного веса.

Для спектров остальных образцов были расчитаны отношения интенсивности эксимерной составляющей флуоресценции к мономерной. Видно, что зонды GPM9 и GPM10 позволяют четко дифференцировать нуклеотидные замены (GPM9 в положении 2143, GPM10 в положении 2144): в спектрах флуоресценции дуплексов, содержащих нуклеотидные замены, появляется эксимерный пик в более длинноволновой области, в то время как пик мономерной флуоресценции уменьшается. При этом присутствие в образце

ДНК одновременно мутантной и немутантной последовательности не мешает обнаружению нуклеотидной замены.

Табл. 4. Отношение интенсивностей мономерной (405 нм) и эксимерной (510 нм) флуоресценции для продуктов асимметричной ПЦР из образцов ДНК различных штаммов. '\УТ - дикий тип (не содержит мутаций.

Номер образца Мутации в образце ДНК Гибридизация с зондами СРМ9 вРМЮ

1 А21430, Ш 0.54

2 А2144С, \УТ 1.50

3 А21430 0.83 _*

4 А21440 1.34

5 А2144й 1.34

6 А21430, А2144в 0.30 1.47

7 А21440 1.18

8 А21430, А2143С 0.62 _*

9 А21430 0.82

10 А21430, А21440, \УТ 0.43 0.97

11 А21430 0.82

12 А2143С 0.72

13 А2144в _* 1.52

14 \УТ

* Полоса эксимерной флуоресценции отсутствует

400 450 500 550 600

X, нм

Рис. 12. Спектры флуоресценции гибридов ДНК-зонда СРМ10 и одноцепочечных ампликонов из образцов ДНК 2, 7 и 14 (табл. 4).

выводы

1. Разработан ряд ненуклеотидных модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола (ЗЛ^З-З-гидрокси^-гидроксиметилпирролидина) (амидофосфиты и твердофазные носители) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения в состав олигонуклеотидов функциональных групп (алифатические амино- и тиольная группы, терминальный алкин), аффинной метки (биотин) и флуоресцентных меток (FAM, TAMRA, СуЗ, Су5).

2. Синтезированы конъюгаты олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями Нильским красным, пиреновым бихромофором и 1-фенилэтинилпиреном. Для полученных конъюгатов изучены флуоресцентные и гибридизационные свойства.

3. Разработана система для обнаружения однонуклеоитидных замен A2144G, A2143G и А2143С в гене 23S rRNA Helicobacter pylori с помощью эксимеробразующих флуоресцентных зондов на основе олигонуклеотидных коньюгатов с фенилэтинилпнреном. Установлено оптимальное расположение флуорофоров в структуре зондов для наиболее эффективного обнаружения мутаций. Продемонстрирована возможность использования полученных зондов для анализа образцов ДНК, выделенных из бактериальных штаммов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ

1. Prokhorenko I.A., Korshun V.A., Petrov A.V., Gontarev S.V., Berlin У. A. Incorporation of a pyrene nucleoside analogue into synthetic oligodeoxynucleotides using a nucleoside-like synthon. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1995, 5, (18), 2081-2084.

2. Балакин K.B., Коршун B.A., Прохоренко И.А., Малеев Г.В., Куделина И.А., Гонтарев С.В., Берлин Ю.А. Новый реагент для мечения биомолекул - активированное производное пиренового бихромофора с эксимерной флуоресценцией. Биоорган, химия, 1997, 23, (1), 33-41. [Balakin K.V., Korshun V.A., Prokhorenko I.A., Maleev G.V., Kudelina I.A., Gontarev S.V., Berlin Y.A. A new reagent for labeling macromolecules: an activated derivative of the pyrene bichromophore with excimer fluorescence. Russ. J. Bioorgan. Chem., 1997,23, (1), 28-36].

3. Korshun V.A., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova E.V., Malakhov A.D., Berlin Y.A. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 1997, 16, (7/9), 1461-1464.

4. Balakin K.V., Korshun V.A., Mikhalev I.I., Maleev G.V., Malakhov A.D., Prokhorenko I.A., Berlin Y.A. Conjugates of oligonucleotides with polyaromatic fluorophores as promising DNA probes. Biosensors <£ Bioelectronics, 1998,13, (7/8), 771-778.

5. Prokhorenko I.A., Dioubankova N.N., Korshun V.A. Oligonucleotide conjugates of Nile Red. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1/2), 509-520.

21

6. Malakhov A.D., Skorobogatyi M.V., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Kozhich D.T., Stetsenko D.A., Stepanova I.A., Shenkarev Z.O., Berlin Y.A., Korshun V.A. I-Phenylethynylpyrene and 9,10-bis(phenylethynyl)anthracene, useful fluorescent dyes for DNA labeling: excimer formation and energy transfer. Eur. J. Org. Chem., 2004 (6), 12981307.

7. Квач M.B., Гонтарев С.В., Прохоренко И.А., Степанова И.А., Шманай В.В., Коршун В.А. Простой реагент для синтеза олигонуклеотидов, меченных 3,3,3',3'-тетраметлл-2,2'-индодикарбоцианином. Изв. АН, Сер. хим., 2006 (1), 154-158. [Kvach M.V., Gontarev S.V., Prokhorenko I.A., Stepanova I.A., Shmanai V.V., Korshun V.A. A simple reagent for the synthesis of oligonucleotides labeled with 3,3,3',3'-tetramethyl-2,2'-indodicarbocyanine. Russ. Chem. Bull., 2006 (1), 159-163.]

8. Prokhorenko I.A., Malakhov A.D., Kozlova A.A., Momynaliev K., Govorun V.M., Korshun V.A. Phenylethynylpyrene-labeled oligonucleotide probes for excimer fluorescence SNP-analysis of 23S rRNA gene in clarithromycin-resistant Helicobacter pylori strains. Mutation Res., 2006, 599(1/2), 144-151.

9. Kvach M.V., Prokhorenko I.A., Ustinov A.V., Gontarev S.V., Shmanai V.V., Korshun V.A. Reagents for the selective immobilization of oligonucleotides on solid supports. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2007, 26 (6/7), 809-813.

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИЙ И СИМПОЗИУМОВ

1. Prokhorenko I.A., Korshun V.A., Gontarev S.V., Malakhov A.D., Berlin У.А. Nile red, a dye for efficient oligonucleotide labelling. Third International Symposium on Bioorganic Chemistry. Abstracts. Dagomys, Russia, 1995, 100.

2. Korshun V.A., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova E.V., Malakhov A.D., Berlin Y.A. New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. XII International Roundtable "Nucleosides, Nucleotides and their Biological Applications". Abstracts. La Jolla, CA, USA, 1996, 158.

3. Прохоренко И.А., Балакин K.B., Малеев Г.В., Коршун В.А., Берлин Ю.А. Новое активированное производное пиренового бифлуорофора - синтез и использование для введения в олигонуклеотиды метки с эксимерной флуоресценцией. Юбилейная научная сессия, посвященная 100-летию со дня рождения профессора Н.А. Преображенского. Тезисы докладов. Москва, 1996, 96-97.

4. Prokhorenko I.A., Kuznitsova S.V., Korshun V.A. A new fluorescent nucleoside analogue for synthesis of oligonucleotide probes. International Conference "Trends in Nucleic Acid Chemistry". Abstracts. Moscow, Russia, 2000, 10.

5. Malakhov A.D., Prokhorenko I.A., Skorobogatyi M.V., Korshun V.A. 1-(Phenylethynyl)pyrene and 9,10-bis(phenylethynyl)anthracene as useful luminescent dyes for DNA study. International Conference "Trends in Nucleic Acid Chemistry". Abstracts. Moscow, Russia, 2000, 18.

6. Малахов АД, Прохоренко И.А., Скоробогатый M.B., Дюбанкова Н.Н., Коршун В.А. Синтез флуоресцентных нуклеозидов и их аналогов в качестве инструментов исследования нуклеиновых кислот. Конференция "От современной фундаментальной биологин к новым наукоемким технологиям". Труды. Пущино, 2001, 75.

7. Дюбанкова Н.Н., Скоробогатый М.В., Пчелинцева А.А., Степанова И.А., Прохоренко И.А., Виноградова Л.А., Малахов А.Д., Берлин Ю.А., Коршун В.А. Модифицированные нуклеозиды и псевдонуклеозиды в синтезе люминесцентных производных олигонуклеотидов. VI Чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Тезисы докладов. Москва-Пущино, 2002,24.

8. Пчелинцева А.Л., Скоробогатый М.В., Прохоренко И.А., Коршун В.А. Метод мечения олигонуклеотндов периленовым флуорофором. XV Зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2003, 36.

9. Prokhorcnko I.A., Dioubankova N.N., Korshun V.A. Nile Red - far-visible fluorescent dye on nucleic acids. 5th Cambridge Symposium "Nucleic Acids Chemistry & Biology". Abstracts. Cambridge, UK, 2003, P78.

Ю.Козлова А.А., Малахов А.Д., Момыналиев K.T., Прохоренко И.А., Коршун В.А. Применение 1-фенилэтинилпиренового псевдонуклеозида для конструирования эксимеробразующих ДНК-зондов. XVI Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2004, 50.

11. Kvach М., Prokhorenko I., Ustinov A., Gontarev S., Korshun V., Shmanai V. Reagents for selective conjugation of oligonucleotides. XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. Conference Book. Bern, Switzerland, 2006, 137.

Зака; № 17-1/10/2008 Подписано в печать 17.10.2008 Тираж 70 экз Усл. п л. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таН:info@cfr.ru

Оглавление

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1. Синтез, свойства и применение конъюгатов олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями (обзор литературы)

1.1 Присоединение активированных производных флуоресцентных красителей к олигонуклеотидам с функциональными группами

1.1.1 Методы присоединения красителей по алифатической аминогруппе и реагенты для её введения в олигонуклеотиды

1.1.2 Методы введения в олигонуклеотиды тиольной группы

1.1.3 Модифицирующие реагенты для получения конъюгатов олигонуклеотидов с красителями с помощью реакций циклоприсоединения

1.2 Методы прямого введения производных красителей в олигонуклеотиды с помощью модифицирующих твердофазных носителей и амидофосфитных реагентов.

1.2.1 Флуоресцеин и другие ксантеновые красители

1.2.2 Пирен и другие полициклические ароматические углеводороды

1.2.3 Цианиновые красители

1.3 Взаимодействие флуорофоров, присоединенных к ДНК, с сенсибилизаторами, тушителями, другими флуорофорами.

1.3.1 Резонансный перенос энергии флуоресценции в исследовании нуклеиновых КИСЛОТ

1.3.1.1 Неразветвленные комплексы НК

1.3.1.2 Разветвленные комплексы НК

1.3.1.3 Взаимодействие НК с белками и рибозимами

1.4 Применение резонансного переноса энергии флуоресценции для в ДНК-диагностике.

1.5 Взаимодействие двух одинаковых флуорофоров: эксимерная флуоресценция.

ГЛАВА 2. Синтез модифицирующих реагентов. Синтез и изучение свойств флуоресцентно меченных олигонуклеотидных конъюгатов (результаты и обсуждение)

2.1 Синтез модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола.

2.1.1 Синтез пиренсодержащего фосфамидитного реагента на основе гидроксипролинола.

2.1.2 Синтез и свойства модифицированных олигонуклеотидов, содержащих пиреновый псевдонуклеозид на основе гидроксипролинола.

2.1.3 Разработка универсального подхода к синтезу модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола.

2.1.4 Синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих ацетиленовые группы и флуоресцентные цианиновые красители, и их использование в создании микрочипа для детекции точечных мутаций.

2.2 Синтез конъюгатов олигонуклеотидов с сольватохромным флуоресцентным красителем Нильским красным.

2.3 Синтез и свойства конъюгатов олигонуклеотидов с пиреновым бифлуорофором.

2.4 Синтез и флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.

2.4.1 Флуоресцентные свойства олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.

2.4.2 Разработка метода детекции точечных мутаций с помощью олигонуклеотидов, содержащих фенилэтинилпиреновый флуорофор.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть

Материалы

Методы

Выводы

Благодарности

Одним из важнейших факторов, обеспечивающих последние значительные достижения молекулярной биологии и медицинской диагностики, явился прогресс в области синтеза модифицированных дезокси- и рибоолигонуклеотидов. В связи с этим современные методы синтеза модифицированных олигонуклеотидов постоянно совершенствуются [1-3]. Пожалуй, наиболее широкое применение модифицированные олигонуклеотиды находят в ДНК-анализе, основанном на специфической гибридизации. Традиционный гибридизационный анализ с применением современных микрометодов развился в технологии микрочипов и микроэррэев и прочих микроматриц [4-5]. В настоящее время также бурно развиваются микро- и нанотехнологии с использованием олигонуклеотидов. При этом получило своё развитие и такое современное направление, как химия микро- и наночастиц, в том числе и их конъюгатов с биомолекулами, такими как олигонуклеотиды [6].

Помимо этого олигонуклеотиды продолжают находить применение в молекулярно-биологических исследованиях для изучения процессов жизнедеятельности клетки, молекулярных механизмов функционирования нуклеиновых кислот, субстратной специфичности ферментов, а также в качестве ген-направленных реагентов как антисмысловых ингибиторов экспрессии генов и РНК-интерферирующих агентов [7-8]. Много работ было посвящено изучению структуры и свойств продуктов взаимодействия с таким известным канцерогеном, как бенз[а]пирен и другими токсичными производными полициклических ароматических углеводородов [9-11]. Пиреновые производные олигонуклеотидов используются для моделирования индуцирования канцерогенеза полициклическими ароматическими углеводородами [12-16]. Для применения модифицированных олигонуклеотидов как ген-направленных реагентов были синтезированы аналоги с модифицированными нуклеиновыми основаниями, образующими более прочные водородные связи, конформационно фиксированные нуклеиновые кислоты (ЬЫА), пептидные нуклеиновые кислоты (РКА) и их фосфо-аналоги, конъюгаты с молекулами, стабилизирующими образование дуплекса (с интеркаляторами, малобороздочными лигандами). В настоящее время интенсивно изучаются возможности применения специальных олигорибонуклеотидов и их дуплексов, которые, благодаря недавно открытому механизму РНК интерференции, связываясь с комплементарной цепью РНК, способны специфически расщеплять её и блокировать работу гена. Ведётся работа по изучению эффективности олигонуклеотидных конъюгатов с различного рода алкилирующими агентами, органическими основаниями, комплексообразователями, комплексами активных переходных металлов, катализирующими окислительное или другого типа расщепление комплементарной мишени нуклеиновой кислоты антибиотиками, обладающими такого типа активностью. Мишенями для таких реагентов могут быть и взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами белки. Модифицированные олигонуклеотиды помогают также и в исследованиях функции таких белков, изучении механизма их работы. Широкое применение в этих исследованиях получили конъюгаты олигонуклеотидов с так называемыми фотоафинными реагентами, которые способны ковалентно связываться с мишенью после активации световым излучением [17].

Среди широкого спектра научного и практического применения модифицированных олигонуклеотидов в авангарде находятся современные методы анализа ДНК. Для этого применяют конъюгаты олигонуклеотидов с репортерными группами, дающими аналитический сигнал, который позволяет регистрировать комплементарные взаимодействия между олигонуклеотидными зондами и исследуемыми образцами ДНК. Методы повышения чувствительности репортерных групп с использованием достижений современной биохимии довольно быстро шагнули на весьма высокий уровень благодаря разработке ферментных методов детекции. По аналогии с современным иммуноферментным анализом вначале ферментные метки присоединяли к олигонуклеотидным зондам ковалентно. Затем во избежание трудоёмких стадий получения и очистки таких конъюгатов в обиход вошли афинные метки, позволяющие присоединять молекулу фермента после гибридизации в виде белок-белкового конъюгата за счёт биоспецифических взаимодействий. Одной из самых распространённых афинных меток является биотин, дающий очень прочный комплекс с белком стрептавидином. В настоящее время в массовом масштабе получают конъюгаты стрептавидина с ферментами для использвания в диагностике. Применение биотиновых амидофосфитов позволяет получать 5'-меченые биотинилированные зонды [18-21]. В принципе, в олигонуклеотиды в качестве аффинной метки могут быть введены самые разнообразные гаптены с последующей детекцией при помощи специфических антител, например, реагенты предназначены для множественного мечения олигонуклеотидов остатками 3-(4-нитрофенил)-1-адамантилацетамидаи карбазола [23].

Однако в связи с дальнейшим развитием оптической техники, особенно флуориметрических приборов, конъюгаты с флуоресцентными метками в значительной степени вытеснили радиоактивные метки из большинства областей ДНК-анализа, а особенно из рутинных процедур диагностики. Технические возможности современных приборов и физические свойства самих флуорорфоров дают огромные преимущества при использовании флуоресцентных меток как в медицинской диагностике, так и в фундаментальных исследованиях.

В настоящее время существуют целые классы флуоресцентных красителей, производные которых получили широкое применение в ставших уже рутинными процедурах анализа ДНК, особенно автоматизированных современными специализированными аналитическими приборами. В первую очередь это ксантеновые красители, к которым относится и один из самых известных флуорофоров - флуоресцеин. Это один из самых обширных по применению классов соединений, куда входят также и родамины, а также галогено-, сульфо- и другие производные флуоресцеинов и родаминов [24-27]. Другой большой класс флуорофоров - это цианиновые красители. В первую очередь следует упомянуть индокарбоцианиновые соединения СуЗ, Су5, Су7, а также другие производные этого ряда и их аналоги, поскольку они в силу удобства синтеза и характерных люминесцентных свойств получили наиболее широкое применение в биохимических исследованиях [28-30]. Существует ещё ряд красителей, некоторые производные которых получили применение в синтезе конъюгатов с олигонуклеотидами. Это производные дипирролилметена ВСЮГРУ [31], биман [32], бензоксадиазол (№Ш-С1) [33]. Благодаря своим интересным свойствам они по прежнему находят различные интересные применения в этой области.

Весьма высокую популярность для мечения олигонуклеотидов приобрели производные полициклических ароматических углеводородов [34-37]. Высокий интерес к ним обусловлен как доступностью исходных флуорофоров и хорошо разработанными методами функционализации, так и весьма интересными физико-химическими свойствами. Это и люминесцентные свойства, особенно способность к эксимерной флуоресценции, и специфическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, а также другими биомолекулами и их комплексами. Конъюгаты олигонуклеотидов с ПАУ продолжают находить всё новые и новые применения в биомедицинских исследованиях и некоторые из них в ближайшее время наверняка войдут в набор рутинных методов ДНК-диагностики.

Комплексы переходных металлов с хелаторами и другими прочно связывающимися лигандами благодаря своим оригинальным люминесцентным свойствам продолжают использоваться для получения конъюгатов с биологически активными молекулами. Большое время жизни и высокий квантовый выход флуоресценции делают комплексы переходных металлов особенно подходящими для изучения энергетических и электронных переносов в ДНК- дуплексах. Из них в первую очередь выделяются комплексы рутения и редкоземельных элементов, с которыми были получены олигонуклеотидные конъюгаты.

Конъюгаты олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями находят очень широкое применение в современных биологических исследованиях и медицинской диагностике. В неё входит круг вопросов, связанных с обнаружением и идентификацией микроорганизмов, в том числе и вирулентных бактерий и вирусов, исследованиями онкологических заболеваний, генетических нарушений, включая те, которые вызваны точечными мутациями. Например, благодаря возможностям современной флуоресцентной микроскопии осуществляют селективное окрашивание и визуальное наблюдение определённых участков хромосом или даже отдельных генов с использованием метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) [38-39]. В современных методах секвенирования ДНК флуоресцентные метки уже давно и прочно заняли ведущие позиции [26, 40-42]. Это флуоресцентные методы секвенирования с использованием автоматических приборов, современные методы анализа на основе ПЦР, такие как ПЦР в реальном времени (Real Time PCR). Так гибридизационный анализ на ДНК-микрочипах, микроэррэях. Флуоресцентные метки в составе конъюгатов обычно используются для детекции олиго- и полинуклеотидной части конъюгатов, реже они служат источником информации о структурных изменениях в процессе различных взаимодействий.

Наряду с твердофазными методами анализа на основе технологии микрочипов флуоресцентные олигонуклеотидные конъюгаты позволили осуществить с помощью ПЦР-амплификации генетический анализ в растворе с добавлением специальных флуоресцентных зондов. Существуют различные варианты таких зондов [43-45]. Для того, чтобы зонды меняли флуоресценцию при связывании с мишенью, используется два способа физического воздействия на флуорофор в возбуждённом состоянии: резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) и тушение. В первом случае в молекулу с флурофором вводится акцептор, и такой зонд меняет спектр испускания при взаимодействии с мишенью. Если вместо акцептора присоединить тушитель, то в исходном состоянии флуоресценция зонда потушена, а при связывании с мишенью происходит разгорание, которое детектируется прямо в пробирке в процессе реакции амплификации ДНК-мишени на специальном приборе. Существуют разные красители, которые применяются в качестве тушителей флуоресценции, и не обязательно их спектр поглощения должен перекрываться со спектром испускания флуорофора.

В обзоре литературы собраны наиболее интересные примеры изменения эмиссионных спектров одиночных флуоресцентных красителей (особое внимание уделено пирену) в результате их взаимодействия с НК, а также данные о применении пар красителей, присоединенных к НК.

Целью данной работы явился синтез ряда модифицирующих реагентов, получение на их основе олигонуклеотидных конъюгатов и исследование спектральных свойств полученных флуоресцентных производных олигонуклеотидов.

Настоящая работа выполнена в Лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

выводы

1. Разработан ряд ненуклеотидных модифицирующих реагентов на основе гидроксипролинола (Э.Я,5£-3-гидрокси-5-гидроксиметилпирролидина) (амидофосфиты и твердофазные носители) для синтеза модифицированных олигонуклеотидов. Показана эффективность полученных реагентов для направленного введения в состав олигонуклеотидов функциональных групп (алифатические амино- и тиольная группы, терминальный алкин), аффинной метки (биотин) и флуоресцентных меток (FAM, TAMRA, СуЗ, Су5).

2. Синтезированы конъюгаты олигонуклеотидов с флуоресцентными красителями Нильским красным, пиреновым бихромофором и 1-фенилэтинилпиреном. Для полученных коньюгатов изучены флуоресцентные и гибридизационные свойства.

3. Разработана система для обнаружения однонуклеотидных замен A2144G, A2143G и А2143С в гене 23S rRNA Helicobacter pylori с помощью эксимеробразующих флуоресцентных зондов на основе олигонуклеотидных коньюгатов с фенилэтинилпиреном. Установлено оптимальное расположение флуорофоров в структуре зондов для наиболее эффективного обнаружения мутаций. Продемонстрирована возможность использования полученных зондов для анализа образцов ДНК, выделенных из бактериальных штаммов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор посвящает свою работу памяти Юрия Адольфовича Берлина, руководство которого помогло освоить различные аспекты научных исследований в области химии природных соединений, почувствовать уверенность в своих силах и стимулы для дальнейшего совершенствования професиональных навыков. Автор выражает благодарность своему научному руководителю Владимиру Аркадьевичу Коршуну за руководство и помощь в освоении методов органохимической работы, навыков работы с литературой и проведения лабораторных исследований. Автор благодарит своих коллег по лаборатории А. Д. Малахова, Н. Н. Дюбанкову, М. В. Скоробогатого и К. Р. Бирих за постоянную помощь и поддержку, И. А. Степанову за помощь в расшифровке ЯМР-спектров. Автор благодарен заведующему лабораторией В. А. Ефимову за полезные научные обсуждения и поддержку, Т. С. Зацепину за помощь и плодотворное сотрудничество, 3. О. Шенкареву за регистрацию и помощь в расшифровке ЯМР-спектров. Автор также благодарит членов своей семьи и родственников за помощь и поддержку.

1. Beaucage S.L., 1.er R.P. The functionalization of oligonucleotides via phosphoramidite derivatives. Tetrahedron, 1993, 49 (10), 1925-1963.

2. Коршун В.А., Берлин Ю.А. Введение нерадиоактивных репортерных групп в синтетические олигонуклеотиды и их детекция. Биоорган, химия, 1994, 20 (6), 565616.

3. Cobb A. J.A. Recent highlights in modified oligonucleotide chemistry. Org. Biomol. Chem., 2007, 5 , 3260-3275.

4. Heller M.J. DNA Microarray Technology: Devices, Systems, and Applications. Annu. Rev. Biomed. Eng., 2002, 4, 129-153.

5. Roth CM. Yarmush M.L. Nucleic Acid Biotechnology. Annu. Rev. Biomed. Eng., 1999, 1, 265-297.

6. Lebedeva I., Stein C.A. Antisense oligonucleotides: promise and reality. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2001, 41, 403^119.

7. Crooke S.T., Bennett C.F. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1996, 36, 107-129.

8. Weinstein I.В., Jeffrey A.M., Jennette K.W., Blobstein S.H., Harvey R.G., Harris C., Autruf H., Kasai H., Nakanishi K. Benzoa.pyrene diol epoxides as intermediates in nucleic acid binding in vitro and in vivo. Science, 1976,193 (4253), 592-595.

9. Steinbrecher Т., Becker A., Stezowski J.J., Oesch F., Seidel A. Synthesis of oligodeoxynucleotides containing diastereomeric dihydrodiol cpoxide-A^-deoxyadenosine adducts of polycyclic aromatic hydrocarbons. Tetrahedron Lett., 1993, 34 (11), 1773-1774.

10. Lee H, Luna E., Hinz M., Stezowski J.J., Kiselyov A.S., Harvey R.G. Synthesis of oligonucleotide adducts of the bay region diol epoxide metabolites of carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons. J. Org. Chem. 1995, 60 (17), 5604-5613.

11. Chaturvedi S., Lakshman M.K Site-specific modification of the human N-ras photo-oncogene with each diol epoxide metabolite of benzoa.pyrene and thermal denaturation studies of the adducted duplexes. Carcinogenesis, 1996, 17 (12), 2747-2752.

12. Zou Y., Liu T.-M., Geacintov N.E., Van Houten B. Interaction of the UvrABC nuclease system with a DNA duplex containing a single stereoisomer of dG-(+)- or dG-(—)-anti-BPDE. Biochemistry, 1995, 34 (41), 13582-13593.

13. Liebmann M., Di Pasquale F., Marx A. A new photoactive building block for investigation of DNA backbone interactions: photoaffinity labeling of human DNA polymerase beta. ChemBioChem., 2006, 7 (12), 1965-1969.

14. Kumar P., Sharma A.K., Gupta K.C. Base-labile group protected biotinphosphoramidite reagents for solid phase biotinylation of oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 1996, 15 (7/8), 1263-1273.

15. Korshun V.A., Pestov N.B., Nozhevnikova E.V., Prokhorenko I.A., Gontarev S.V., Berlin Y.A. Reagents for multiple non-radioactive labelling of oligonucleotides. Synth. Commun., 1996, 26(13), 2531-2547.

16. Olejnik J., Krzymanska-Olejnik E., Rothschild K.J. Photocleavable biotin phosphoramidite for 5'-end-labeling, affinity purification and phosphorylation of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 1996, 24 (2), 361-366.

17. Zhao Z., Ackroyd J. A biotin phosphoramidite reagent for the automated synthesis of 5'-biotinylated oligonucleotides . Nucleosides Nucleotides, 1999,18 (6/7), 1231-1234.

18. Fang S., Bergstrom D.E. Fluoride-cleavable biotinylation phosphoramidite for 5'-end-labeling and affinity purification of synthetic oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 2003, 31 (2), 708-718.

19. Fino J.R., Mattingly P.G., Ray K.A. A convenient method for the preparation of hapten phosphoramidites. Bioconjugate Chem., 1996, 7 (2), 274—280.

20. Wojczewski, C., Stolze, K., and Engels, J. W. Fluorescent oligonucleotides-versatile tools as probes and primers for DNA andRNA analysis. Synlett 1999, 1667-1678.

21. Asseline U. Development and applications of fluorescent oligonucleotides. Curr. Org. Chem., 2006, 10(4), 491-518.

22. Topics in Fluorescence Spectroscopy, V. 7: DNA Technology (Lakowicz, J. R., Ed.) 2003, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York.

23. Ranasinghe, R. T., and Brown, T. Fluorescence based strategies for genetic analysis. Chem. Commun. 2005, 5487-5502.

24. Griesang N., Giefiler K., Lommel T., Richert C. Angew. Four-color, enzyme-free interrogation of DNA sequences with chemically activated, 3'-fluorophore-labeled nucleotides. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 6144-6148.

25. Johansson M. K, Fidder II, Dick II, Cook R. M. Intramolecular dimers: a new strategy to fluorescence quenching in dual-labeled oligonucleotide probes. J. Am. Chem. Soc. 2002,124, 6950-6956.

26. Jaluria P., Konstantopoulos K., Betenbaugh M., Shiloach J. A perspective on microarrays: current applications, pitfalls, and potential uses. Microb. Cell Factories 2007, 6, 1-14.

27. Wanninger-Weiss C., Di Pasquale F., Ehrenschwender T., Marx A., Wagenknecht H.-A. Nucleotide insertion and bypass synthesis of pyrene- and BODIPY-modified oligonucleotides by DNA polymerases. Chem. Commun., 2008, (12), 1443-1445.

28. Armstrong B., Garner H.R. Analysis of protocol variations on DNA yield. Genet. Anal.: Biomol. Eng. 1996, 9 (5/6), 127-133.

29. Meyer J., Buldt A., Vogel M., Karst U. 4-(N-Methylhydrazino)-7-nitro-2,l,3-benzooxadiazole (MNBDH): a novel fluorogenic peroxidase substrate. Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39 (8), 1453-1455.

30. Burmeister J., Azzawi A., von Kiedrowski G. Synthesis of novel phosphoramidite derivatives bearing pyrenyl and dansyl groups. Tetrahedron Lett., 1995, 36 (21), 3667-3668.

31. Yamana K, Tekei M., Nakano H. Synthesis of oligonucleotide derivatives containing pyrene labeled glycerol linkers: enhanced excimer fluorescence on binding to complementary DNA sequence. Tetrahedron Lett., 1997, 38 (34), 6051-6054.

32. Ren R. X.-F., Chaudhuri N.C., Paris P.L., Rumney IVS., Kool E. Naphthalene, phenanthrene, and pyrene as DNA base analogues: synthesis, structure, and fluorescence in DNA. J. Am. Chem. Soc., 1996,118 (33), 7671-7678.

33. Yamana K., Kumamoto S., Nakano H. Homopyrimidine oligonucleotides modified by a pyrenylmethyl group at the terminal position: enhanced fluorescence upon binding to double helical DNA. Chem. Lett., 1997 (11), 1173-1174.

34. SchrokE., du Manoir S., Veldman T., Schoell B., Wienberg J., Ferguson-Smith M. A., Ning Y., Ledbetter D. H., Bar-Am I, Soenksen D., Garini Y., Ried T. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 1996, 273, 494-497.

35. Ju J., Glazer A.N., Mathies R.A. Cassette labeling for facile construction of energy transfer fluorescent primers. Nucl. Acids Res., 1996, 24 (6), 1144-1148.

36. Hung S.-C., Ju J., Mathies R.A., Glazer A.N. Energy transfer primers with 5- or 6-carboxyrhodamine-6G as acceptor chromophores. Anal. Biochem., 1996, 238 (2), 165-170.

37. Ju J., Glazer A.N., Mathies R.A. Energy transfer primers a new fluorescence labeling paradigm for DNA sequencing and analysis. Nature Med., 1996, 2 (2), 246-249.

38. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnol., 1996,14 (3), 303-308.

39. Tyagi S., Landegren U., Tazi M., Lizardi P.M., Kramer F.R. Extremely sensitive, background-free gene detection using binary probes and Q(3 replicase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93 (11), 5395-5400.

40. Methods in Molecular Biology, V. 353: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes (Hilario, E., Mackay, J., Ed.) Humana Press, New Jersey, 2007 167-176, 177-203.

41. Caruthers M.H. Chemical synthesis of DNA and DNA analogues. Acc. Chem. Res., 1991, 24 (9), 278-284.

42. Davies, M. J., Shah, A., and Bruce, I. J. Synthesis of fluorescently labelled oligonucleotides and nucleic acids. Chem. Soc. Rev. 2000, 29, 97-107.

43. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edittion, Springer, Baltimore, MD, 2003, 63-95.

44. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. Elsevier, 2008, 1195 p.

45. De Vos M.J., Van Elsen A., Bollen A. New non nucleosidic phosphoramidites for the solid phase multi-labeling of oligonucleotides: comb- and multifork-like structures. Nucleosides Nucleotides, 1994, 13 (10), 2245-2265.

46. Behrens C., Petersen K.H., Egholm M., Nielsen J., Buchardt O., Dahl O. A new achiral reagent for the incorporation of multiple amino groups into oligonucleotides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5 (16), 1785-1790.

47. Lyttle M.H., Adams H., Hudson D., Cook R.M. Versatile linker chemistry for synthesis of 3'-modified DNA. Bioconjugate Chem., 1997, 8 (2), 193-198.

48. Kumar A. A rapid solid phase method for the synthesis of 3'-thiol group containing oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 1993,12 (7), 729-736.

49. Kumar A. A versatile solid phase method for the synthesis of masked 3'-thiol group containing oligonucleotides. Nucleosides Nucleotides, 1993, 12 (10), 1047-1059.

50. Salo II., Guzaev A., Azhayev A., Lonnberg H. Disulfide tethered solid supports for oligonucleotide synthesis: preparation and a comparative study on the resistance to ammonolysis. Collect. Czech. Chem. Commun., 1996, 61 (Spec. Iss.), sllO-slll.

51. Reed M.V., Lukhtanov E.A., Gorn V.V., Lucas D.D., Zhou J.H. Structure activity relationships of cytotoxic cholesterol - modified DNA duplexes. J .Med. Chem. 1995, 38, 4587-4596.

52. Graham D., Enright A. Cycloadditions as a nethod for oligonucleotide conjugation. Curr. Org. Synth. 2006, 3 (1), 9-17.

53. Hill K. IV, Taunton-Rigby J., Carter J. D„ Kropp E., Vagle K, Pieken W., McGee D. P., Husar G. M., Leuck M., Anziano D. J., Sebesta D. P. Diels-Alder bioconjugation of diene-modified oligonucleotides J. Org. Chem. 2001, 66, 5352-5358.

54. Latham-Timmons H. A., Wolter A., Roach J. S., Giare R., Leuck M. Novel method for the covalent immobilization of oligonucleotides via Diels-Alder bioconjugation Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2003, 22, 1495-1497.

55. Okamoto A., Taiji T., Tainaka K., Saito I. Oligonucleotides containing 7-vinyl-7-deazaguanine as a facile strategy for expanding the functional diversity of DNA Bioorg. Med. Chem Lett., 2002,12, 1895-1896.

56. Torwe C. IV., Christensen C., Meldal M. Peptidotriazoles on solid phase: l,2,3.-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides .,/. Org. Chem., 67 (9), 3057-3064 (2002).

57. Rostovtsev V.V., Green L.G., Fokin V.V., Sharpless KB. A Stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective ligation of azides and terminal alkynes. Angew. Chem., Int. Ed., 2002, 41 (14), 2596-2599.

58. Chan T.R., Hilgraf R., Sharpless KB., Fokin V.V. Polytrazoles as Copper(I)-Stabilizing Ligands in Catalysis. Org. Lett, 2004, 6 (17), 2853-2855.

59. Kolb H.C., Finn M.G., Sharpless KB. Click chemistry: diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem., Int. Ed., 2001, 40 (11), 2004-2021.

60. Gierlich J., Burley G.A., Gramlich P.M.E., Hammond DM., Carell T. Click Chemistry as a Reliable Method for the High-Density Postsynthetic Functionalization of Alkyne-Modified DNA Org. Lett., 2006, (8), 3639-3642.67.