Синтез и свойства коньюгатов белков с водорастворимыми полиалкиленоксидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 678.01:577.16.02

ЕФРЕМОВА Надевда Викторовна

СИНТЕЗ И СВОЙСТВА К0НЫ5ГАТСГ, БЕЛКОВ С ВОДОРАСТВОРИМОЙ ПОЛИАЛКШГЕНОКСИДАМИ

'02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1994-

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений Химического факультете МГУ им. М.В. Ломоносова.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

академик В. Л. Кабанов

доктор химических наук, ст.н.с. И. Н. Топчиева

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор химических наук, профессор В. Н. Изыайлова доктор химических наук, вед.н.о. Я. Байков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт Биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится ЩЯ0« сг^гА^- 1994 года в ^"часов на заседании специализированного совета Д 053.05.43 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус • "А", кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.

С диссертацией можно -ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " ^Ма^ГЛ- 199^. года.

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

^_, Т.К.Брокич

У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние , годы активно разрабатываются новые подхода к созданию биомиметических систем. Один из таких подходов состоит в модификации биологических молекул синтетическими дифильными полимерами, способными к самоорганизации в водных растворах. Суть этого подхода заключается в создании синтетическим путем надмолекулярных структур, имитирующих высшие уровни организации биологических молекул (мембранные белки, клеточные мембраны). В этом отношении большой интерес представляет использование водорастворимых дифильных блок-сополимеров (БС) на основе окиси этилена -(сн3снао>- и окиси пропилена -(сн(сн3)сн2о)-(проксанолов, плюроников). Известно, что такие сополимеры способны как к самоэссоциации (мицеллообразованию) в водных растворах, так и к взаимодействию с гидрофобными и дифильными веществами. Мохно было ожидать, что продукты ковалентного присоединения проксанолов к белкам будут обладать способностью к ассоциативным взаимодействиям и созданию надмолекулярных ансамблей, имитирующих белки в лшшдном окружении.

С другой стороны, модификация белков гидрофильными полимерами, например, полиэтиленгликолем (ПЭГ) используется как способ направленного изменения свойств белковых систем с целью придания им ряда важных в практическом отношении качеств: улучшения стабильности, снижения ишуногенности и антигенности при введении в организм, пролонгирования действия белковых препаратов, а также для придания органорастворимости гидрофильным белкам.

Можно ожидать, что замена ПЭГ на. его дифильные аналоги -проксанолы - позволит, сохранив ценные свойства конъюгатов белков с ПЭГ, придать белкам новые качества, обусловленные дифильной природой полимерных цепей.'

Цель работы. Целью' настоящей работы является разработка методов синтеза и характеристики коныогатоз белков с полиалкиленоксидами, а также изучение зависимости между строением конъюгата и его свойствами, такими как стабильность, поведение а растворе, каталитические свойства, способность взаимодействовать с дифильными лигандами и биологическими мембранами. . Для лучшего понимания изучаемых закономерностей наряду с конъюгатами белков с проксанолами были синтезированы и изучены конъюгата белков с ПЭГ.

В качестве объектов для модификации полимерами были выбраны два белка с хорошо изученными структурой и свойствами:

а-химотрипсин (а-ХТ) из поджелудочной железы быка и бычий сывороточный альбумин (БСА). Кроме того, разработанные методы синтеза были применены к белкам и гормонам белковой природы, имеющим медицинское назначение - супероксиддисмутазе, цитохрому С, инсулину.

Научная новизна и практическая ценность. Разработан новый метод синтеза и выделения конъюгатов белков с водорастворимыми полиалкиленоксвдами, позволяющий сохранить нативную структуру белка.и - в случае ферментов - высокую каталитическую активность. Показано, что модификация белков полиалкиленоксидами приводит к увеличению их термической и автолитической стабильности. Найдена корреляция между стабилизирующим эффектом и степенью модификации белковой глобулы в коньюгате. Показано, что модификация белка полимерными цепями БС обеспечивает возможность взаимодействия с различными дифильными лигандами (проксанолами, p-циклодекстрином), а также с биомембранами. Показана способность конъюгатов транслоцироваться через клеточную мембрану внутрь клетки, и изучено, как это свойство зависит от химического строения и структурной организации конъюгатов. Обнаруженные высокая термостабильность и мембранотропность конъюгатов при сохранении ими каталитических функций фермента создают предпосылки для использования этих веществ в прикладных областях, в частности в медицине и в биотехнологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всероссийской конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1992) и на международной конференции "Modern enzymology: problems and trends" (Ладога, 1992).

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава I), посвященного синтезу и свойствам конъюгатов белков с водорастворимыми полимерами, экспериментальной части (глава 2), результатов и их обсуждения (глава 3), выводов и списка цитируемой литературы (.406 наименований). Работа изложена на {Qtj страницах, содержит Ц таблиц и рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СИНТЕЗ КОНЪЮГАТОВ БЕЛКОВ С ПОЖАЛКИЛЕНОКСИДАМИ

Как правило, для получения звездообразных конъюгатов полимеров с белками используют двухстадийный синтез. Первая стадия состоит в получении монофункциональных полимерных производных,

содержащих реакционноспособную концевую группу. На второй стадии проводят реакцию между поверхностными функциональными группами бежа и полимерными реагентами в мягких условиях.

В настоящей/работе в качестве полимерных реагентов были использованы моноальдегидные производные полиэтиленгликоля и проксанолов, полученные окислением соответствующих монофункциональных полимеров кислородом воздуха в присутствии оксида марганца (IV) в качестве катализатора.

МпОа

г р-снасна-он + оа -► р-снг-с^ + нао

где I? = : Про: счнао-(снснао) -(снаснао) -

* I л т п

СН3 т=14, п-25 ОПро. с„няо-(снаснао)п-(снснао)т-

сн3

. ПЭГ сн3о-(снасн2о)к- к=42

Затем, путем восстановительного алкилирования первичных поверхностных аминогрупп бежа, были получены конъюгагы белков с полиалкиленоксидами:

¿о ?н

Г?-СГ + НаМ-Е > Р-СН-МН-Е ■► Й-СН=МН~Е -►

N ' '--"-

ЫаВ(СИ)Н;,

--► 1?-сна-ын-Е-, где и - полимерная цепь

Схемы строения коныогатов о. полиэтиленгликолем и проксанолаш различных типов приведены на рис.1. Конъюгаты представляют собой звездообразные структуры с белковой глобулой в центре и ковалентно присоединенными к ней полимерными "лучами". Доступность блок-сополимеров, содержащих концевую он-группу как в гидрофобной, так и в гидрофильной части молекулы, создает возможность для синтеза коныогатов с различным порядком присоединения полимерных блоков к белку (рис.1, и-ш). Число полимерных цепей в конъюгате можно регулировать путем изменения соотношения полимер-белок в. реакционной смеси.

Поскольку в синтезируемых наш конъюгатах полимерные цепи присоединены не ко всем поверхностным гма-группам, возникает возможность их различного расположения друг относительно друга. Так, полимерные цепи могут быть распределены по всем имеющимся на поверхности белка мна-группам равномерно (см. рис.1, 116), либо сконцентрированы в одном месте поверхности белка, образуя домены

(рис.1, на). По-видимому, предпочтительное осуществление того или иного расположения пожат быть задано на стадии синтеза коныогата.

Рис.1. Схемы стрэния конызгатов белков с полиалкиленоксидами, I - конъюгат с ПЭГ, IIa - конъюгат с Про с неравномерным распределением полимерных цепей, Ilö- конъюгат с Про с равномерным распределением полимерных цепей, III - конъюгат с ОПро. Темным цветом выделен полипропиленоксидный блок Про.

При проведении синтеза в водных буферных средах, где, проксанолы способны проявлять дифильные свойства (склонность к самоассоциации), возникают условия для их неравномерного распределения по поверхности белковой глобулы. Полученные таким образом конъюгаты можно рассматривать как внутримолекулярные мицеллы, стабилизированные гидрофобными взаимодействиями между присоединенными к белку полимерными цепями. В то же врем» проведение синтеза конъюгатов в водао-органических средах, где гидрофобные взаимодействия между молекулами проксанолов-подавляются, должно способствовать юс более равномерному распределению на поверхности белковой глобулы. С учетом этих соображений были синтезированы две серии конъюгатов, обозначаемые далее как неравномерные и равномерные (неравн. и равн.). На различии в их свойствах мы остановимся ниже.

Для выделения конъюгатов из реакционной смеси применялись два метода: I)' диализ с последующим высаживанием конъюгатов ацетоном; 2) гель-проникающая хроматография. Первый из указанных методов оказался более простым и эффективным для очистки конъюгатов белков с проксанолами от избытка полимерного реагента.

Для контроля чистоты получаемых конъюгатов применялись метода гель-проникающей хроматографии, тонкослойной хроматографии на силикагеле и гидрофобной хроматографии. -Этими методами было показано, что выделенные продукты не содержат примесей исходных белков и полимеров. '• •

ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЪЮГАТОВ

В Таблице I приведены характеристики полученных конъюгатов, такие как состав, степень модификации и число первичных, т.е. непромодифицированных аминогрупп в белковой части конъюгата.

Содержание- ' белка в конъюгатах определялось спектрофотометрически (\=280 нм), а также с помощью биуретовой реакции. Содержание полимера в конъюгатах определялось по разности-между навеской конъюгата и количеством белка в нем. Из данных до составу была рассчитана степень модификации, т.е. среднее число полимерных цепей на молекулу белка в конъюгате. Кроме того, степень модификации была независимо определена' титрованием оставшихся незамещенными первичных аминогрупп белка. Хорошее совпадение результатов обоих методов подтверждает тот факт, что модификация проходит только по первичным аминогруппам белка и не

затрагивает другие аминокислотные остатки.

Таблица I. Характеристики конъюгатов белков с полиалкиленоксидаыи.

Белок Полимер Содержание белка в конъ-югате,вес.% Степень модификации Число первичных поверхностных N43-груш. Обозначение

а-ХТ ПЭГ 80,5 3 12 (ПЭГ)3-ХГ

а-ХТ ПЭГ 67,6 6 9 (ПЭГ)6-ХТ

а-ХТ ПЭГ 59,5 9 5 (ГОГ)Э-ХТ

а-ХТ Про 88,1 2 13 (Про)2-ХТнер

а-ХТ Про 80,6 3 12 (Про)з-ХТнер

а-ХТ Про 75,8 4 II (Про)„-ХТнер

а-ХТ Про 67,6 6 9 (Про)в-ХТнер

а-ХТ Про 45,5 II 4 (ПрО^-ХТнер

а-ХТ Про 80,4 3 12 (Про)з-ХТравн

а-ХТ Про 71,5 5 - (Про)=-ХТравн

а-ХТ Про 67,4 6 9 (Про)в-ХТравн

а-ХТ Про 45,5 II . - (Про)14.-ХТравн

а-ХТ ОПро 80,7 3 12 (ОПро)з-ХТнер

а-ХТ ОПро 80,7 3 12 (ОПро)з-ХТравн

а-ХТ ОПро 64,2 7 8 (0Про)7-ХТнер

БСА Про 80,8 8 - (Про)в-БСАнер

БОА Про 69,1 15 - (Про)1=-БСАрав

БОА ПЭГ 80,8 8 - (ПЭГ)„-БСА

Каталитические характеристики конъюгатов а-химотрипсина приведены в Таблице 2 .

•■ Таблица 2. Ферментативные свойства конъюгатов а-ХТ с полиалкиленоксидаш

* п/п Белок, конъюгат Каталитический гидролиз казеина Каталитический: гидролиз и-бензоил-1-тирозина Число активных центров, %

Активность , % ^кат' сек"1 V м*ю~5

Активность,%

I а-ХТ 100 100 31,2±0,5 6,27±0,94 . 80

2 (Про)з-ХТрав 103 115 - - 80

3 (Про)в-ХТрав 96 98 32,5±1,2 6,18±0,82 67

4 (Про)11-ХТрав 50 57 37,0±0,4 21,7±3,5 40

5 (Про)s-XTHep 102 97 42,4±2,8 13,0±2,9 61

6 (ПЭГ),-ХТ 97 98 40,4±0,8 9,3±1,5 80

7 (ОПро)з-ХТ 98 100 - ■ 80

Из таблицы 2 видное что:

1) Конъюгаты обладают высокой ферментативной активностью по отношению ко всем использованным субстратам.

2) Каталитическиеь константы гидролиза .низкомолекулярного субстрата - этилового эфира и-бензоил-1-тирозина (ВТЕЕ) ферментом,-входящим в состав конъюгатов, изменились незначительно по сравнению с нативным ферментом. Аналогичные результаты были получены . и при исследовании гидролиза высокомолекулярного субстрата - казеина. По-видимому, это связано с тем, что активный центр а-химотршсина на стадии синтеза конъюгата был запдещен обратимо связанным с ним ингибитором, поэтому полимерные цепи не могли присоединиться в непосредственной близости от активного центра фермента.

3) Существенная потеря ферментативной активности наблюдалась только при достижении высоких степеней модификации (11 и выше). Видно, что уменьшение активности в этом случае является следствием не снижения ккат, а уменьшения числа активных центров в конъюгате (таблица 2, К).

Независимыми экспериментами • с использованием методов кругового дихроизма и 1Н-ЯМР был подтвержден факт сохранения нативной структуры белковой глобулы для конъюгатов а-химотрипсина со степенями модификации меньше 11, а также для конъюгатов БСА.

ТЕРМИЧЕСКАЯ И АВТОЛИТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КОНЬКГАТОЗ

Важным практическим следствием модификации белков полимерами является изменение устойчивости -белковой' глобулы к действию повышенных температур и автолиза. Для исследования термической стабильности конъюгатов мы применяли метод, состоящий в кинетическом изучении ферментативных свойств конъюгатов при повышенной температуре. Соответствующие кинетические кривые (зависимости активности от времени) представлены на рис.2. Видно, что.скорость термоинактивации а-ХТ существенно уменьшается уже при-присоединении трех полимерных цепей (кривые 2 и 3 на рис.2). По мере увеличения степени модификации конъюгата этот эффект становится значительнее (см. кривые 4-6 { рис.2), т.е. термическая стабильность конъюгатов возрастает симбатно с увеличением степени модификации. При равном числе присоединенных полимерных цепей термостабильность конъюгатов, характеризующихся их равномерным распределением, вше, по сравнению с неравномерным (кривые 5 и 4,

рис.2), а стабильность конъюгатов, у которых гидрофобный блок находится на периферии, выше, чем у конъюгатов с обратным порядком расположения блоков. Наиболее термически стабильными являются конъюгаты с ПЭГ. Эти данные можно объяснить, исходя из представлений ' о том, что модификация поверхности белка гидрофильными реагентами должна приводить к стабилизации белковой молекулы, т.к. позволяет экранировать поверхностные гидрофобные группы белка от термодинамически невыгодного контакта с водой. Действительно, как видно из рис.1, в случае неравномерного распределения полимерных цепей в конъюгате значительная часть поверхности белка остается незащищенной, в то время как при равномерном распределении имеется больше возможностей для экранирования белковой глобулы. Это и приводит к увеличению термостабильности конъюгатов с равномерным распределением цепей по сравнению с неравномерным.

Рис.2. Кинетические кривые термоинактивации а-ХТ и его конъюгатов. Буфер 0,2 М трис-на , рН 8.05, Концентрация Остаточная активность в момент времени t выражена в Ж от исходной активности данного конъюгата.

ХТрдЬ.

ХТйгр. (олр^ХТигр, ХТ+ Про (щоо) .¿-хт

Т=45°С белка-1*Ю"бМ.

6°

30 130

Врема.мин

Влияние дифшъных добавок на терлостабильность конъюгатов. Нами было показано, что, используя способность полимерных цепей в конъюгатах взаимодействовать с различными дифильными веществами, можно регулировать их термическую стабильность. Так, введение свободного проксанола в раствор, содержащий конъюгат, приводит к возрастанию термостабильности конъюгата (см. рис.3.). По-видимому, это обусловлено связыванием полимерных цепей конъюгата с дополнительно введенным полимером, что позволяет создать более плотную полимерную оболочку вокруг белка. Противоположная картина наблюдается, если в качестве дифильной добавки в систему вносят р-циклодокстрин ф-ЦД) - циклический олигосахарид с гидрофобной внутренней полостью, способный образовывать комплексы включения с

Аотн>5б

(про)ц-хт:про

ВО врем А <20 0>0,НИН

Рис.3 а)Схема взаимодействия коныогата с добавками Про. б) Кинетические кривые . термоинактивации коныогата (Про)„-ХТ чистого и с добавлением Про. Условия- -как в подписи к рис.2.

проксанолами. В этом случае _ благодаря нанизыванию р-ЦЦ нэ полимерные цепи конъ-югата последние приобретают более вытянутую конформацию. В результате они уже не могут эффективно экранировать гидрофобные участки белка, что приводит к снижению термостабильности (рис.4). Нужно отметить, что эта реакция позволяет • выявить различия между конъю-гатами с равномерным и - неравномерным распределением цепей. Так, конъюгат с неравномерно распределенными цепями не способен- взаимодействовать с р-ЦЦ, по-видимому, из-за сте-рической недоступности полимерных цепей вследствие взаимодействий соседних цепей друг с другом.

90

ао

150 мн

Зй 60

Рис.4, а)Схема взаимодействия коныогатов с добавками р-ЦД. б)Кинетическиэ кривые термоинактивации конъюгата (Про),-ХТрав. чистого (Ъ) и с добавками р-ЦЦ. Молярное соотношение конъюгат-ЦЦ -1:5 (2), 1:10 (3), 1:50 (4). Условия - как в подписи к рис.2.

результатами конъюгатов

методом ДСК.

На

Изучение терлостабилъности конъюгатов летодол дифференциальной сканирутей тлорилетрии (ДСК).

Данные, полученные кинетическим методом, были дополнены полученными при изучении тепловой денатурации рис.5 представлены кривые тешюпоглощения водных растворов а-ХТ и его конъюгатов. Видно, что для конъюгатов наблюдается существенное измэ- -нение формы пика теплопоглоще-ния. Кроме первого максимума, расположенного в области температур 47,6-49,6°С, как и "у исходного а-ХТ, в случае конъю-. гатов появляется второй максимум в области более высоких температур, 54,5-55,5°С. Можно предположить, что по мере того, как в процессе денатурации белковой глобулы -гидрофобные участки полипептидной цепи экспонируются в растворитель, они становятся доступными для взаимодействия - с гидрофобными блоками полимерных . цепей, входящих в состав конъюгата. По-видимому, появление второго максимума на кривых тешюпогло-щения конъюгатов обусловлено плавлением такого полимер-белкового комплекса.

Для доказательства правильности этого предположения исследования, подтверждающие проксанолов - взаимодействовать с а-ХТ при повышенной Было показано, что:

40 ■ 5о во °С

Рис.5. Кривые теплопоглощения а-ХТ и его конъюгатов. Буфер -0.02М Na-фосфат, pH 7,0. Концентрация препаратов - I мг/мл, скорость нагрева - I град/мин.

были проведены способность температуре

дополнительные

I) При сканирующем прогреве от 20° до 60°С (I град/мин)

раствора а-ХТ,- содержащего проксанол (мольн. происходит выпадения осадка (агрегации). '

соотн.' 1:20) не

Z) Аналогичный прогрев раствора, содержащего смесь а-ХТ и ПЭГ, приводит к агрегации фермента, подобно тому, .как это происходит в растворе а-ХТ в таких же условиях.

3) Продукт взаимодействия, полученный в результате прогрева смеси а-ХТ - проксанол до 60°С, содержит лишь 50" белка. Длительное выдерживание продукта в воде не приводит в появлению з растворе свободного полимера.

4) На кривой теплопоглощения раствора, содержащего смесь а-ХТ - проксанол, наблюдается один пшс, близкий по энтальпии к пику плавления чистого а-ХТ, но смещешшй в сторону больших температур-

<Ттах=54'5°С>-

Перечисленные выше факты свидетельствуют о том, что при повышенных температурах происходит образование полимер - белкового комплекса, который имеет лик плавления, расположенный в той же области температур, что и второй 'максимум на кривых теплопоглощения конъюгатов.

Стабильность ионъюгатов по отношению к автолизу

. Автолиз, или протеолитическое .саморасщепление, - явление, характерное для ряда протеолитических ферментов, в том числе и для а-ХТ. Присоединение значительного числа полимерных цепей должно

существенно повысить стабильность фермента по отношению к инактивации автолизом. Это обусловлено тем, что скорость-

(Про^ХТрлЬн

(Про^ЛТ нер

{Про)|ХТрА?н лимитирующей стадией " этого процесса •

является образование комплекса двух молекул фермента, а поли-Рис.6 Кинетика автолиза а-ХТ и его конъюга- мерные цепи в тов. Условия - рН 7.7, 10 мМ трис-НС1, 4°С, конъюгатах создают

стерические затруднения протеканию бимолекулярных процессов. Действительно, такая стабилизация нами . наблюдалась при модификации а-ХТ как проксанолами, так и ПЭГ, и была особенно заметна для конгюгатов, содержащих более трех присоединенных полимерных цепей (см. рис.6)

°фермвнта~ 4 ш<*м

МЕМБРАНОТРОШЫЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГАТОВ

Принципиально новш свойством конъюгатов белков с проксанолами является их способность взаимодействовать с биомембранами. Поскольку входящие в их состав гидрофильные белки не являются мембраноактивными, можно предположить, что осуществление этого свойства обусловлено присутствием дкфильных полимерных цепей проксанолов. Как было показано ранее, проксанолы обладают способностью встраиваться и транслоцироваться через биологическую мембрану.

Для изучения мембранотропных свойств конъюгатов нами применялись два подхода. Первый из них состоял в использовании модельных систем, в качестве которых были выбраны обращенные мицеллы, содержащие фермент и его коньюгаты? Известно, что зависимость ферментативной активности от концентрации ПАВ в этих -системах (при постоянной степени гидратации) является критерием способности белка взаимодействовать с мембраной. Это связано с тем, что мембраноактивный белок, взаимодействуя с водой и ПАВ

мицеллы, в которой он находится, влияет на ее геометрические 'О параметры (радиус внутренней полости цриблизительно соответствует радиусу №. белка). Поскольку ферментсодеркащие -хтр. мицеллы находятся в динамическом равновесии с пустыми мицеллами другого размера, межмицеллярные'взаимо-

действия могут приводить к частичным

3.0^

2,0

1,0

(Про^ХТрдВ,

ы,-хт неблагоприятным перестройкам опти-[АОТ] % мальной белок-содержащей мицеллы,

п.о ол ох о*> сопровождающимися снижением катали-

Рис.7. Зависимости наблюда- тической активности включенного

емой к^у от концентрации фермента.

обращенных мицелл Аэрозоля Наш были получены зависимости

ОТ в- октане для исходного наблюдаемой ккат для исходного а-ХТ

ф-ХТ и его конъюгатов при и его конъюгатов от концентрации

постоянной степени гидрата- мицелл при постоянной степени гидра-

ции тации. Как видно из рис. 7,

♦ Данное исследов.-аниа проводилось совместно с сотрудниками Института биохимии им. А.Н.Баха д.х.н., проф. Кургановым Б.И. и м.н.с. Тепловой М.в.

%т*х' «Ю*

каталитические свойства коныогата с ПЭГ, как и самого а-ХТ, не зависят от концентрации ПАВ, что характерно для гидрофильных белков, ре взаимодействующих с мембраной. В то же время при изучении каталитической активности мицеллярных систем, содержащих конъюгаты с проксанолами, обнаружена зависимость к^^, от концентрации ПАВ, причем тангенс угла наклона кривых 1/ккат- [ПАВ] тем больше, чем больше степень модификации конъгата. Наибольший эффект в этих опытах проявлял наиболее гидрофобный конъюгат -а-ХТ, модифицированный стеариновой кислотой, использованный как объект сравнения. Таким образом, зависимости ккат от концентрации-ПАВ свидетельствуют, что конъюгаты с проксанолами, в отличие от

конъюгатов с ПЭГ и от исходного белка, способны взаимодействовать с МИ1*еллой что является указанием на их мембранотропность.

Второй подход заключался в изучении взаимодействия конъюгатов с клеточными мембранами Г-лимфоцитов? В данном случае исследовалась-способность, конъюгатов проникать через биомембрану внутрь клетки. Известно, что дифильные вещества, способные к транслокации через клеточную мембрану, могут достигать расположенного в митохондрии 1ШЬН дегидрогеназного комплекса, ответственного з8 клеточное дыхание, и ингибировать находящийся в нем фермент. При проведении подобных экспериментов с коныогатами оказалось, что некоторые из них способны подавлять клеточное дыхание Т-лимфоцитов, что свидетельствует об их транслокэции внутрь клетки. Было изучено, как- зависит это свойство конъюгатов от природы присоединениях цепей и характера их распределения

Рис.8 а) Влияние конъюгатов с различными полимерами на скорость потребления кислорода Т-лимфоцитами. о)Влияние конъюгатов, содержащих различное число цепей Про,на скорость потребления кислорода Т-лимфоцитами. Условия: рН 7.4, 37 С, концентрация о лимфоцитов

. 10° кл./мл_ относительно белковой глобулы.

Данное исследование проводилось совместно с сотрудниками Института физико-химической медицины им. А.Н.Белозерского д.б.н. КН. Моховой и к.б.н. Г.П.Кирилловой.

Оказалось, что только конъюгаты с полимером Про, у которых гидрофобные блоки находятся на периферии молекулы, а цепи расположены неравномерно (см. рис.1, На) способны транс-лоцироваться через мембрану, при условии, что их степень модификации больше трех. В то же время ни конъюгаты с ОПро, у которых на периферии молекулы находится гидрофильный блок, ни конъюгаты с Про, характеризуемые равномерным распределением полимерных цепей по поверхности белка, не влияют на клеточное дыхание Т-лимфоцитов, следовательно, не обладают способностью транслоцироваться через мембрану (см. рис.8). Таким образом, можно сформулировать три условия, обеспечивающие гранслокацию конъюгата через биомембрану:

1) Количество полимерных цепей проксанола, присоединенных к белку, должно быть не меньше трех;

2) Гидрофобные блоки, входящие в состав БС, должны быть расположены на периферии молекулы конъюгата;

3) Полимерные цепи должны быть неравномерно распределены по поверхности белковой глобулы.

вывода

1. Разработан метод синтеза конъюгатов белков с полиажиленоксидзми, позволяющий сохранить нативную структуру белка и высокую ферментативную активность.

2. Показано, что в результате модификации белка полимерами меняется микроокрукевде белковой глобулы, что приводит к увеличению ее термической и автолитической стабильности.

3. Показано, что конъюгаты белков с проксанолами способны взаимодействовав с различными _ дифильными лигандами, а также с биомембранами.

4. Показана зависимость мембранотропных свойств конъюгатов от природы и расположения полимерных цепей в них.

5. Синтезированные в ' данной работе конъюгаты белков с полиалкиленоксвдами представляют собой новый тип супрамолекулярных структур, сочетающих свойства белков и водорастворимых дифильных блок-сополимеров. Характерной особенностью этих структур является то, что самоорганизация синтетических полимеров в них происходит на поверхности белковой глобулы. -

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ СОДЕРЖАТСЯ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Ефремова Н.В., Можаев В.В., Топчирво Н.В., Термическая стабильность конъюгатов а-химотрипсина с водорастворимыми полиалкиленоксидами.//Биохимия, 1992, Т.57, Ш, С.342-347.

2. Топчиева И.Н., Ефремова Н.В., Иванова В.П., Мохова Е.Н., Кириллова Г.П., Курганов Б.И., Теплоза М.В., Горская И.А. Конъюгаты белков с полиалкиленоксидами на основе окиси этилена.// Тезисы V Всероссийской конференции "Новые направления' биотехнологии", Пущино, 1992.

3. Ефремова Н.В., Топчиева И.Н. Конъюгаты а-химотрипсина с полиалкиленоксидами.// Вестн. Моск. ун-та, 1992, сер.2, Химия, Т.33, №6, С.600-604.

4. Ефремова Н.В., Топчиева И.Н. Супрамолекулярные структуры на основе конъюгатов белков с полиалкиленоксидами. Комплексы с p-циклодексгрином.// Биохимия, 1993, Т.53,- Ш, СЛ071-Ю76.

5. Геплова М.В., Курганов Б.И., Горская И.А., -Топчиева И.Н., Ефремова Н.В., Бушуева Т.Л. Структурно-функциональные свойства конъюгатов белков с полиалкиленоксидами: исследование методом флуоресценции.// Биохимия, 1993, Т.58, Ш, C.I930-I937

6. Kirillova G.P., Mochova E.N., Deduchova V.I., Tarakanova A.N., Ivanova V.P., Eiremova N.V., Topchieva I.JJ. Block copolymers oi ethylene oxide and propylene oxide and their protein conjugates are able to pass through the lymphocytes plasma membrane and to inhibit respiration in mitochondria.// Bioteohno.l. Appl. Bioohem., 1994, in press.

7. Топчиева И.Н., Мохова E.H., Кириллова Г.П., Ефремова Н.В. Мембранотропные свойства конъюгатов белков с блок-сополимерами окиси этилена и окиси пропилена.// Биохимия, 1994, Т.59, Ш,

8. Topohieva I.N., Eiremova N.V. Conjugates oi a-ohymotrypsin with poly(alkylene oxides) in "Modern Enzymology: Problems and Trends? B.I.Kurganov, S.N.Koohetkov, V.I.Tiehkov, Eds. Nova Soienoe Publishers, Inc., N.Y., 1994, in press.

С Л6-22.