Стабилизация ферментов в гомогенных водно-огранических смесях (на примере альфа-химиотрипсина) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В ГОМОГЕННЫХ ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СМЕСЯХ (НА ПРИМЕРЕ ОС-ХИМОТРИПСИНА)

(02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук, профессор A.B. Левашов кандидат химических наук, ст.н.сотр. А.К.Гладилин

Научный консультант: доктор химических наук, профессор К.Л. Гладилин

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Б.И. Курганов доктор химических наук, вед.н.сотр. В.Л. Рубайло

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Защита состоится "-? " декабря 1996 г. в 16.00 час на заседании диссертационного совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "___" октября 1996 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование водно-органических сред для проведения ферментативных реакций имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с водными растворами. В первую очередь, это улучшение растворимости гидрофобных субстратов и эффекторов и сдвиг термодинамического равновесия многих практически важных реакций в сторону образования требуемых продуктов. Однако, эти преимущества, как правило, могут реализоваться только при высоких концентрациях органических растворителей, когда ферменты теряют каталитическую активность. Для повышения устойчивости ферментов в водно-органических смесях в литературе разработан ряд подходов. Наиболее широко изучены методы стабилизации ферментов в водно-органических средах, основанные на использовании гетерогенных систем (фермент-содержащие суспензии и ферменты, иммобилизованные на нерастворимых носителях). Гетерогенные биокаталитические системы характеризуются высокой технологичностью, связанной с легкостью отделения продукта реакции и регенерации катализатора, и широко применяются для практических целей. В то же время, для проведения ферментативных реакций крайне привлекательны гомогенные водно-органические системы ввиду отсутствия диффузионных ограничений и высоких скоростей реакций. К существенным преимуществам гомогенных систем относится также их оптическая прозрачность, что позволяет определять каталитическую активность ферментов и изучать их структурные свойства оптическими методами, например, спектрофотометрическим и флуоресцентным. Таким образом, разработка эффективных и универсальных методов стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических системах весьма актуальна. Отметим, что в настоящее время методы и механизмы стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических смесях систематически не изучены, проведенные исследования были направлены, в основном, на разработку биокаталитических систем, применимых для конкретных практических целей.

Настоящая работа посвящена разработке методов и изучению механизмов стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических системах. Для повышению устойчивости ферментов в таких системах нами предложено

использовать методы, основанные на образовании нековалентных комплексов и ковапентных конъюгатов с использованием как высоко-, так и низкомолекулярных соединений.

Цель работы. При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. На примере а-химотрипсина изучить влияние на каталитические свойства ферментов в гомогенных водно-органических смесях:

а) образования нековалентных комплексов с полиэлектролитом;

б) образования нековалентных комплексов с олигоаминами;

в) образования ковалентных конъюгатов фермента с полиалкиленоксидами;

г) ковалентной модификации низкомолекулярными гидрофильными соединениями;

д) комбинацией методов ковалентной модификации низкомолекулярными гидрофильными соединениями и нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами и олигоаминами.

2. Физико-химическими методами изучить структуру модифицированных препаратов а-химотрипсина в водно-органических смесях с тем, чтобы соотнести кинетические эффекты, обусловленные модификацией фермента, со структурными изменениями, происходящими в белках в присутствии органических растворителей.

Научная новизна работы. Найдено, что профиль каталитической активности а-химотрипсина в водно-органических смесях имеет два характерных вида, в зависимости от используемого субстрата. В случае субстратов, для которых скорость лимитирующей стадией является образование ацилфермента, при невысоких концентрациях органических растворителей (10-30 об. %) наблюдается активационный эффект. При дальнейшем увеличении содержания органического растворителя в смеси происходит снижение каталитической активности фермента до нуля. В случае субстратов, для которых скорость лимитирующей стадией является деацилирование, наблюдается уменьшение каталитической активности фермента во всем интервале концентраций органического растворителя.

В настоящей работе систематически изучены пути и молекулярные причины стабилизации ферментов в гомогенных водно-органических смесях (на примере а-химотрипсина). Показано, что при образовании нековалентных комплексов с

поли- и олигоаминами и ковалентной модификации полиалкиленоксидами и низкомолекулярными гидрофильными соединениями интервал концентраций органических растворителей, в котором фермент сохраняет каталитическую активность не ниже 10% от "водного уровня", существенно расширяется.

Найдено, что образование нековалентных комплексов фермента с поли- и олигокатионами и ковалентная модификация полиалкиленоксидами приводит к существенному увеличению активационного эффекта (в реакции гидролиза анилидных субстратов) в водно-органических смесях по сравнению с нативным ферментом.

Установлено, что при комбинации методов ковалентной модификации низкомолекулярными заряженными соединениями и нековапентного комплексообразования с поли- и олигокатионами активационный и стабилизационый эффекты усиливались. Таким образом были получены препараты а-химотрипсина, высокоактивные в широком интервале концентраций органических растворителей (от 0 до 90-95 об.%).

Показано, что основными механизмами стабилизации химотрипсина в водно-органических смесях являются: подавление агрегации, многоточечное закрепление нативной конформации фермента, изменение микроокружения фермента.

Практическая значимость работы. Предложенные в работе методы стабилизации ферментов в водно-органических смесях: образование нековалентных комплексов с поли- и олигокатионами, ковалентная модификация высоко- и низкомолекулярными соединениями и комбинация методов ковалентной модификации и нековапентного комплексообразования расширяют круг практического использования ферментов для целей анализа и тонкого органического синтеза благодаря существенному повышению уровня каталитической активности биокатализатора в широком интервале концентраций органических растворителей.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 3 Всероссийском Симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), 16 Международной Конференции "Биохимия и Молекулярная биология" (New Delhi, India, 1994), Международном Симпозиуме "Молекулярная подвижность

и порядок в полимерных системах" (Санкт-Петербург, 1994), Международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов 96" (Москва, 1996). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), постановки задачи, экспериментальной части, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на страницах и включает таблиц и рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фермент-полиэлектролитные комплексы в водно-органических смесях

Свойства фермент-полиэлектролитных комплексов изучались, главным образом, в водных растворах. Известно, что такие комплексы спонтанно образуются за счет многоточечного электростатического взаимодействия между противоположно заряженными группами фермента и полиэлектролита. На рис. 1 представлена схема образования комплекса фермента с полиэлектролитами. В настоящей работе свойства фермент-полиэлектролитного комплекса в водно-органических смесях изучены на примере а-химотрипсина (ХТ) и полибрена (ПБ) (рис. 2).

Рис. 1. Схема образования комплекса фермента с полиэлектролитом.

Рис. 2. Формула полибрена.

Существование фермент-полиэлектролитных комплексов в воде и в водно-органических смесях мы показали методом флуоресцентой спектроскопии. Метод основан на том, что при взаимодействии с поликатионом наблюдается тушение собственной флуоресценции эозина. При добавлении фермента в систему происходит конкурентное вытеснение эозина из комплекса с полибреном. Выделившийся эозин регистрируют по увеличению интенсивности флуоресценции системы. Таким образом, нами было показано, что комплекс химотрипсина с полибреном (ХТ-ПБ) существует, по крайней мере, в интервале концентраций этанола от 0 до 80 об.% (рис. 3).

[Полибрен], цМ [а-Химотрипсин], цМ

Рис. 3. Зависимость относительной интенсивности флуоресценции эозина (1/1о) от концентрации полибрена (А) и а-химотрипсина (Б), прибавляемого к системе, насыщенной полибреном при различных концентрациях этанола в смеси (об. %): 1 - 0; 2 - 20; 3 - 40; 4 -60; 5 - 80.

Нами было изучено влияние образования комплекса фермента с полиэлектролитом на каталитические свойства ХТ в водно-органических смесях на примере реакций гидролиза специфических субстратов а-химотрипсина двух типов, амидных и сложноэфирных, которые различаются скорость лимитирующей стадией.

В реакции гидролиза п-нитроанилида М-бензоил-1_-тирозина (БТНА), для которого скорость лимитирующей является стадия образования ацилфермента, в

:лучае нативного ХТ при увеличении концентрации диметилформамида (ДМФА) габлюдается возрастание каталитической активности (активационный эффект), за юторым следует снижение активности фермента до нуля (кр. 1, рис. 4А).

Образование фермент-полиэлектролитного комплекса приводит к шачительному увеличению активационного эффекта, а также существенно >асширяется интервал концентраций органического растворителя (на 30-40 )б.%), при котором фермент сохраняет каталитическую активность (не ниже 10% >т водного уровня) (стабилизационный эффект) (рис. 4А). Активационный и ¡табилизационный эффекты наблюдались и в случае органических растворителей ;ругих классов: этанола и 1,4-диоксана (рис. 4Б и В). Следовательно, :инетические эффекты, обусловленные образованием нековалентного комплекса <Т с полиэлектролитом, неспецифичны по отношению к органическим застворителям.

эис. 4. Зависимости каталитической активности ХТ-ПБ (2) в сравнении с ХТ (1) в реакции -идролиза БТНА от концентрации ДМФА (А), этанола (Б) и 1,4-диоксана (В) в водно-зрганической смеси. Концентрация фермента в системе 10'6М.

Поскольку образование комплекса фермента с полиэлектролитом осуществляется, главным образом, за счет электростатического взаимодействия, гакой комплекс может быть разрушен при создании в системе высокой ионной силы. В присутствии 0.4М ЫаС1 уровень каталитической активности 5СТ-ПБ в водно-органической смеси уменьшался и практически соответствовал уровню активности свободного ХТ при данных концентрациях этанола (рис. 5).

Полученные результаты указывают на то, что в реакции гидролиза БТНА увеличение активационного эффекта и стабилизация фермента в водно-органических смесях обусловлены именно комплексообразованием, а не присутствием в системе не связанного с ферментом полиэлектролита.

О 20 40 60 80 100 Этанол, об. %

Рис. 5. Зависимости каталитической активности ХТ-ПБ (2) и ХТ (1) в реакции гидролиза БТНА в системе вода-этанол и изменение профиля активности ХТ-ПБ в присутствии 0.4 М №С1 (I). Концентрация фермента в системе 10"8М.

При использовании двух других субстратов, этилового эфира Ы-бензоил-!.-тирозина (БТЕЕ) и метилумбеллиферилциннамата хлорида аммония (МУТМАК), для которых скорость-лимитирующей является стадия деацилирования, наблюдается иной вид зависимости каталитической активности от концентрации органического растворителя. При переходе от водного раствора в водно-органическую смесь активации для нативного химотрипсина и химотрипсина в комплексе с полибреном не наблюдалось. В то же время, как и при гидролизе БТНА, снижение активности ХТ-ПБ наблюдается при более высоких концентрациях органического растворителя (рис. 6А и Б).

С целью выяснить молекулярные причины стабилизации фермента, наблюдаемой при образовании нековалентных комплексов фермента с полиэлектролитом, структура а-химотрипсина в комплексе с полибреном в сравнении с нативным ферментом в водно-органических смесях была изучена

методами флуоресцентной и дифференциальной абсорбционной спектроскопии (рис, 7А и Б).

20 40 60 ДМФ, об. %

20 40 60 80 ДМФ, об. %

Рис. 6. Зависимости каталитической активности ХТ-ПБ (2) в сравнении с ХГ (1) в реакции гидролиза БТЕЕ (А) и МУТМАК (Б) от концентрации ДМФА в водно-органической смеси. Концентрация фермента в системе (М) А: 8*10'в, Б: 1 - 5*10'6; 2 - 3*10-0.

344

342 340 зза ззв 334 332 330

О 20 40 во 81

Этанол, об. %

5 х

о

X (в

281.7 291.6

291.3

291.4 291.3 291.2 " 291.1 291.0 280.9

!0 40 60

Этанол, об %

Рис. 7. Зависимости величины А.МОХ 8 спектрах флуоресценции (А) и дифференциально-абсорбционных спектрах (Б) ХТ (1) и ХТ-ПБ (2) от концентрации этанола в водно-органической системе. Концентрация фермента в системе (М) А: 10"7, Б: 10"5.

Резкие изменения, наблюдаемые в дифференциально-абсорбционных спектрах и спектрах флуоресценции, являются указанием на то, что в водно-органической системе происходят изменения в третичной структуре ХТ и ХТ-ПБ. В случае нативного ХТ в системе вода-этанол помимо резких изменений в спектрах происходило осаждение фермента.

Более детальная информация о вторичной и третичной структуре препаратов ХТ и ХТ-ПБ в водном растворе и в водно-органических смесях нами была получена из анализа спектров кругового дихроизма (КД) в ближней и дальней УФ-областях.

В водном растворе существенных различий в спектрах КД в дальней и ближней УФ-областях для нативного ХТ и ХТ-ПБ не наблюдается. Следовательно, ХТ-ПБ имеет третичную и вторичную структуру, подобную нативному ферменту. В соответствии со спектрами КД, в структуре ХТ-ПБ, также как и ХТ, содержится порядка 10% а-спиральных и 20% (3-структурных областей.

В системе вода-этанол для ХТ и ХТ-ПБ вид КД спектра в дальней и ближней УФ-области существенно не менялся при увеличении концентрации этанола до 20 % (в области, где наблюдались акгивационные эффекты для препаратов ХТ в реакции гидролиза БТНА) (рис. 8А и Б). При дальнейшем увеличении концентрации этанола происходило выпадение осадка в случае нативного химотрипсина и наблюдались значительные изменения в спектрах КД ХТ-ПБ. "Деструктуризация" спектра в ближней УФ-области (рис. 8А) указывает на переход остатков ароматических аминокислот в область с существенно менее упорядоченной структурой. В дальней УФ-области при увеличении концентрации этанола пики на 208 и 233 нм исчезают и появляется пик на 218 нм (рис. 8Б), что соответствует переходу фермента в конформацию с основным содержанием р-струкгуры (при концентрации этанола 60% содержание р-структуры в ХТ-ПБ составляет 60%).

Увеличение содержания р-структуры в водно-спиртовых смесях не характерно для глобулярных белков. Как правило, при увеличении концентрации органических растворителей в системе наблюдается увеличение содержания а-спиральных областей при уменьшении содержания р-структуры. С другой стороны, образование Р-структуры может происходить в областях контакта между

молекулами белка в процессе образования белок-белковых агрегатов в водно-органических смесях. Таким образом, наиболее вероятно, что переход в конформацию с высоким содержанием ^-структуры при высоких концентрациях этанола в случае ХТ-П5 связан с образованием межмолекулярных агрегатов без образования видимого осадка. Образование агрегатов в препаратах ХТ и ХТ-ПБ при концентрациях этанола в водно-органической смеси выше 25 и 60 об.%, соответственно, было показано нами независимым методом, квазиупругого лазерного светорассеяния.

220 230 240

X, нм

250 260 270 280 290 300 310 320

А* нм

200 210

220 230 240

X, нм

40

20 О -20 -40 <0 -80 -100

250 260 270 280 290 300 310 320

X, НМ

Рис. 8. Спектры КД в дальней (А и А') и ближней (Б и Б1) УФ-областях препаратов ХТ-ПБ (А и Б) и пир-ХТ-ПБ (А1 и Б1) при различных концентрациях этанола (об.%): 1 - 0; 2 - 20; 3 -40; 4 - 50; 5 - 60; 6 - 70. Концентрация фермента в системе (М) А: 2*10'5; Б: Ю-5.

Таким образом, стабилизация фермента при образовании комплекса с полиэлектролитом, по-видимому, связана с рядом причин, основные из них:

-присутствие полиэлектролита препятствует протеканию агрегации, что обусловлено электростатическим отталкиванием одноименных зарядов молекул полиэлектролита, связанных с ферментом;

-при образовании фермент-полиэлектролитного комплекса происходит фиксирование каталитически активной конформации фермента (многоточечная иммобилизация на молекулярном уровне).

2. Комплексы фермента с олигоаминами в водно-органических смесях

Мы предположили, что стабилизации фермента в водно-органических смесях можно добиться также в случае, если многоточечное закрепление каталитически активной конформации белка будет реализовано за счет нековапентного комплексообразования с низкомолекулярными природными аналогами поликатиона, олигоаминами, способными взаимодействовать с несколькими центрами на поверхности белка. В нашей работе для комплексообразования с а-химотрипсином мы использовали олигоамины,

спермин (СП): СН2-(СН2)2-СН-(СН2)2-СН-(СН2)2-СН2

nh2 nh2 nh2 nh2

и спермидин (СПД) СН2-(СН2)2-СН-(СН2)2-СН2

nh2 nh2 nh2

Эти олигоамины были обнаружены в высоких концентрациях в термофильных микроорганизмах. Предполагается, что одна из их функций in vivo состоит в стабилизации различных макромолекул при повышенных температурах. Известно, что в водных растворах олигоамины, как и полиэлектролиты (рис. 1), способны электростатически взаимодействовать с отрицательно заряженными группами поверхности белков с образованием прочных нековалентных комплексов.

В водно-органических смесях образование комплексов а-химотрипсина со спермином и спермидином (ХТ-СП и ХТ-СПД) приводит к тем же двум эффектам: активации и стабилизации по сравнению с нативным ферментом, которые наблюдались при взаимодействии а-химотрипсина с полибреном (рис. 9).

Величина эффектов зависит от длины цепи олигоамина: в случае спермина, который имеет большую длину цепи и 4 аминогруппы, способные взаимодействовать с поверхностью фермента, активационный и стабилизационный- эффекты были более значительными по сравнению со спермидином, который имеет 3 аминогруппы. По-видимому, эти различия обусловлены как способностью более длинной молекулы спермина связывать более разделенные участки на поверхности фермента, так и большим числом зарядов, участвующих в образовании связей а случае спермина (что приводит к упрочению комплекса).

Этанол, об. %

Рис. 9. Зависимости каталитической активности препаратов ХТ в реакции гидролиза БТНА от концентрации этанола в водно-органической смеси. 1 - ХТ; 2 - ХТ-СП; 3 - ХТ-СПД. Концентрация фермента в системе 10"®М.

Таким образом, использование нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами и олигоаминами представляется перспективным подходом для стабилизации ферментов в водно-органических средах, так как этот подход эффективен и прост с методической точки зрения. Кроме того, поскольку полиэлектролиты, также как и олигоамины, способны взаимодействовать практически с любым белком, на поверхности которого имеются заряженные группы, можно ожидать, что этот подход окажется универсальным, т. е. будет

применимым для широкого круга ферментов. Однако, следует отметить, что нековалентные комплексы неустойчивы при высокой ионной силе и в интервале значений рН, в которых фермент и модифицирующий реагент заряжены одноименно. Указанного недостатка лишен более сложный с методической точки зрения подход, а именно, создание ковалентных связей между ферментом и модифицирующим соединением.

3. Конъюгаты фермента с полиалкиленоксидами в водно-органических смесях

В связи с этим, в качестве другого подхода для стабилизации ферментов в водно-органических смесях мы использовали ковалентную модификацию высоко- и низкомолекулярными соединениями. В нашей работе для образования коньюгатов с а-химотрипсином были использованы моноальдегидные производные следующих полимеров:

*

о о

г

$2 «

2 >

20 40 60 80 Этанол, об. %

0 10 20 30 40 50 Изопропанол, об.%

Рис. 10. Зависимости каталитической активности коньюгатов ХТ в реакции гидролиза БТНА от концентрации органического растворителя в смеси. А - этанол: 1 - ХТ; 2 - ПЭГ5-ХГ; 3 -проксанол (2)6- ХТ. Б - Изопропанол: 1 - ХТ; 2 - ПЭГ1.5-ХТ; 3 - ПЭГ3-ХТ; 4 - ПЭГв-ХГ; 5 -ПЭГ13-ХТ. Молекулярная масса ПЭГ 2 кДа. Концентрация фермента в системе 10-®М.

ПЭГ - СН3(0СН2СНг)440СНгСН0;

проксанол (1) - С4Н9[ОСН(СНз)СН2]14(ОСН2СН2)20ОСН2СНО; проксанол (2) - С4Нд(ОСН2СН2ЫОСН(СНз)СН2]14ОСН(СНз)СНО.

Образование коньюгатов ХТ с полиалкиленоксидами приводит к тем же двум кинетическим эффектам, которые наблюдались при образовании нековалентных комплексов фермента с полибреном и олигоаминами в водно-органических смесях (рис. 10): увеличению активации фермента при невысоких концентрациях органических растворителей и расширению интервала концентраций органических растворителей, в котором фермент сохранял каталитическую активность (не ниже 10% "водного уровня"). Подобные результаты были получены для других органических растворителей: н-пропанола и диметилсульфоксида. Профиль активности в водно-органических системах практически не зависел от того, какой полимер: ПЭГ или проксанол был использован для модификации фермента (рис. 10А). Более важным фактором, влияющим на уровень активность в водно-органических системах, являлась степень модификации фермента: наиболее высокий уровень активности наблюдался для ХТ, модифицированного ПЭГ со степенями модификации 6 и ТЗ (рис. 10Б).

По-видимому, увеличение устойчивости ХТ в водно-органических смесях, при образовании коньюгатов с полиалкиленоксидами, связано с тем, что в результате взаимодействия молекул полимера с поверхностью белка происходит изменение микроокружения фермента. Другой вероятной причиной наблюдаемой стабилизации ХТ в водно-органических системах является то, что взаимодействие с полиалкиленоксидами препятствует агрегации.

4. Препараты фермента, ковалентно модифицированного низкомолекулярными гидрофильными соединениями, в водно-органических смесях

В настоящей работе в качестве низкомолекулярных соединений для модификации ХТ мы использовали пиромеллитовый и янтарный ангидриды и глицериновый альдегид. Схемы реакций модификации приведены ниже:

. . (о; ^-тЯ-г-с(0) „ -оос_^соо-

2 ° (о) С3^ С (О) 0 —" Е-ЫН — (О)С =Р=СОО ("ир-ХТ).

► Е-№(0)(>СН2'СН2-С(0)0Н (янт-ХТ),

.(О)С-СК, Е-т2 + < | г (0)С-СН2

ЫаСЫЗНЗ

Е-1ЧН2+0=СН-СН(0Н)-СНг{0Н) —" Е-Ж-СНг-СН(ОН)-СН2(ОН) (глиц-ХТ),

где Е - фермент. В результате модификации пиромеллитовым ангидридом на место каждой промодифицированной аминогруппы химотрипсина вводится три карбоксильные группы. В случае янтарного ангидрида вводится одна карбоксильная группа. Модификация глицериновым альдегидом не приводит к изменению числа зарядов на поверхности фермента.

Для модифицированных препаратов ХТ по сравнению с нативным ХТ наблюдалось смещение профиля каталитической активности фермента в сторону более высоких концентраций органических растворителей {рис. 11). Устойчивость фермента к инактивации в водно-органических смесях повышалась при увеличении степени его модификации (рис. 11).

20 40 60 ВО 100 Этанол, об.%

20 40 60 ВО 100 ДМФА,об.%

Рис. 11. Зависимости каталитической активности пир2-ХТ (2) и пир1ГХТ (3) в сравнении с ХТ (1) в реакции гидролиза БТНА от концентрации органического растворителя в смеси. А - этанол; Б - ДМ ФА. Концентрация фермента в системе 10~°М.

Этанол, об. % ДМФА, об. %

Рис. 12. Зависимости каталитической активности глиц-ХТ (2) в сравнении с ХТ (1) в реакции гидролиза БТНА от концентрации органического растворителя в системе. А -этанол; Б - ДМФ. Концентрация фермента в системе

При модификации химотрилсина незаряженным гидрофильным соединением, глицериновым альдегидом, как и в случае ХТ модифицированного пиромеллитовым ангидридом, снижение каталитической активности наблюдается при более высоких концентрациях органического растворителя по сравнению с нативным ферментом (рис. 12). Следовательно, стабилизационный эффект, обусловленный ковалентной модификацией фермента гидрофильными реагентами, не связан исключительно с введением на его поверхность заряженных групп.

На основании сопоставления данных, полученных при изучении структуры препаратов ХТ физико-химическими методами: флуоресцентной, дифференциальной абсорбционной и КД-спектроскопии, отметим, что интервал концентраций, соответствующий конформационным изменениям в модифицированных препаратах, смещался а сторону более высоких концентраций органического растворителя по сравнению с нативным ХТ незначительно (на 10 об.%). В то же время, растворимость гидрофильно модифицированных препаратов в водно-органических системах была существенно выше по сравнению с нативным ферментом.

Таким образом, наиболее вероятными причинами стабилизации а-химотрипсина при модификации низкомолекулярными гидрофильными соединениями являются: защита фермента от агрегации, а также, изменение микроокружения фермента, в частности, обогащение поверхности белка водой.

5. Комбинации методов ковалентной модификации фермента гидрофильными соединениями и нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами и олигоаминами

Отметим, что при ковалентной модификации ангидридами многоосновных карбоновых кислот на поверхность фермента вводятся дополнительные отрицательно заряженные группы. Таким образом можно увеличить число центров связывания поли- или олигокатиона на белке, что, по нашему мнению, могло бы обеспечить дополнительную устойчивость фермента к инактивации органическим растворителем за счет большей эффективности электростатического взаимодействия фермента в комплексе.

Этанол, об. % Этанол, об. %

Рис. 13. Зависимости каталитической активности препаратов ХТ в реакции гидролиза БТНА от концентрации этанола в водно-органической системе. А: 1 - ХТ; 2 - пир-ХГ; 3 - ХГ-ПБ; 4 - пир-ХТ-ПБ. Б: 1 - ХТ; 2 - пир-ХТ; 3 - ХТ-СП; 4 - пир-ХТ-СП, Концентрация фермента в

системе 10"6М.

В данной работе мы использовали комбинации методов ковалентиой модификации заряженными соединениями и нековалентного комплексообразования фермента с поли- и олигокатионами.

При увеличении плотности отрицательных зарядов на поверхности а-химотрипсина в результате модификации пиромеллитовым ангидридом активационный и стабилизационный эффекты, обусловленные образованием комплекса с полиэлектролитом и олигоамином, значительно усиливаются (рис. 13А и Б).

Модификация а-химотрипсина нейтральным соединением, глицериновым альдегидом, не приводила к дополнительной стабилизации а-химотрипсина в комплексе с полибреном (кр. 2 и 3, рис. 14). Следовательно, величина активационного и стабилизационного эффектов, наблюдаемых при взаимодействии а-химотрипсина с полибреном, определяется числом зарядов на поверхности фермента, способных контактировать с полиэлектролитом.

Этанол, об. %

Рис. 14. Зависимости каталитической активности препаратов ХТ в реакции гидролиза БТНА от концентрации этанола в водно-органической смеси. 1 - глиц-ХТ; 2 - ХТ-ПБ; 3 - глиц-ХТ-ПБ. Концентрация фермента в системе 10*вМ.

В связи с этим, мы изучили как влияет количество зарядов, искусственно введенных на поверхность фермента, на каталитическую активность а-

химотрипсина в комплексе с полибреном. Количество карбоксильных групп на поверхности а-химотрипсина мы варьировали, во-первых, используя для модификации реагенты, различающиеся по количеству заряженных групп (пиромеллитовый и янтарный ангидриды), и, во-вторых, используя производные а-химотрипсина различающиеся по степени модификации. На рис. 15 представлены зависимости максимальной скорости реакции гидролиза БТНА для различных модифицированных препаратов ХТ в комплексе с полибреном от числа введенных при модификации отрицательных зарядов (кр. 2) при трех концентрациях этанола. В качестве сравнения приведены аналогичные кривые для соответствующих модифицированных препаратов ХТ без полибрена (кр. 1). В системах, содержащих 20, 50 и 90 об.% этанола (рис. 15), чувствительность каталитической активности в случае модифицированных препаратов ХТ в комплексе с ПБ (кр. 2) к увеличению числа зарядов на поверхности ферментов была существенно выше по сравнению с модифицированными препаратами ХТ без ПБ (кр. 1). Эти результаты указывают на то, что увеличение числа зарядов на ферменте в результате ковалентной модификации существенно влияет на эффективность взаимодействия с полиэлектролитом.

N N »

Рис. 15. Зависимости каталитической активности препаратов ХТ в реакции гидролиза БТНА от числа введенных при модификации карбоксильных групп при различных концентрациях этанола (об.%) в водно-органической смеси: А - 20; Б - 50; 8 - 90. о - ХТ; О - ЯНТ5- ХТ; Д -пирд-ХТ; V - пирп-ХТ. 1 - нативный и модифицированные препараты ХТ в свободной форме; 2 - нативный и модифицированные препараты ХТ в комплексе с ПБ. Концентрация фермента в системе 10'6М.

Вторичная и третичная структура пир-ХТ-ПБ в сравнении с ХГ-ПБ в воде и в водно-органических системах была изучена методом КД-спектроскопии (рис. 8А1 и Б1). Изменения в спектрах КД, соответствующие изменениям в конформации белка в водно-органический смеси, для препарата пир-ХТ-ПБ наблюдаются при тех же концентрациях этанола, что и в случае ХТ-ПБ. По-видимому, повышение уровня каталитической активности в широком интервале концентраций этанола для пир-ХТ-ПБ по сравнению с ХТ-ПБ не связано с влиянием увеличения числа контактов при взаимодействии фермента с полиэлектролитом на конформацию фермента в водно-органической смеси.

Таким образом, в результате комбинации подходов ковапентной модификации низкомолекулярными заряженными соединениями и нековалентного комплексообразования с поли- и олигокатионами нами были получены препараты фермента с высоким уровнем каталитической активности (не ниже "водного уровня") в широком интервале концентраций органического растворителя (от 0 до 90 об. %).

ВЫВОДЫ

1. Расширение интервала концентраций полярных органических растворителей разных классов, в котором химотрипсин сохранял каталитическую активность (не менее 10% от "водного" уровня), в гомогенных водно-органических смесях ("стабилизационный эффект") было достигнуто при реализации следующих подходов:

а) нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами;

б) нековалентного комплексообразования с олигоаминами;

в) образования ковалентных конъюгатов с полиэтиленоксидом и проксанолами;

г) ковапентной модификации низкомолекулярными гидрофильными соединениями.

Наибольший стабилизационный эффект, наблюдавшийся при реализации индивидуальных подходов, соответствовал расширению интервала концентраций органических растворителей на 30-40 об.%.

2. В интервале концентраций органических растворителей 10-30 об.% в результате нековалентного комплексообразования с полиэлектролитами и олигоаминами, а также, образования ковапентных ко'нъюгатов с полиалкиленоксидами наблюдалось значительное (4-8 раз) увеличение каталитической активности препаратов химотрипсина в реакции гидролиза анилидного субстрата по сравнению с "водным" уровнем ("активационный эффект"). В случае нативного фермента активационный эффект составлял 1,5-2 раза.

3. Стабилизационный и активационный эффекты были максимальны при реализации комбинаций подходов, а именно, при некоэалентном комплексообразовании с полиэлектролитами и олигоаминами препаратов химотрипсина, ковалентно модифицированного отрицательно заряженными реагентами. Величина эффектов зависела от количества зарядов, искуственно введенных на поверхность фермента.

4. Основными механизмами стабилизации химотрипсина в водно-органических смесях при реализации подходов а)-г) являются:

-подавление агрегации за счет введения в систему большого числа одноименных зарядов (комплексообразование с полиэлектролитами и олигоаминами, ковапентная модификация отрицательно заряженными реагентами);

-закрепление нативной конформации фермента на молекулярном уровне (комплексообразование с полиэлектролитами и олигоаминами);

-изменение микроокружения фермента, в частности, обогащение водой (все подходы).

5. Наиболее вероятно, что механизм активации фермента связан с влиянием органических растворителей, присутствующих в системе, на реакционную способность нуклеофила активного центра фермента.

Основные результаты диссертационной работы изложены а следующих

публикациях:

1. Е.В. Кудряшова, А.Б. Белова, В.В. Можаев. Гидрофилизация поверхности химотрипсина увеличивает его устойчивость к денатурации органическими растворителями. // Материалы III Всероссийского Симпозиума "Химия протеолитических ферментов", Москва, 1993, с. 121.

2. Е.В. Кудряшова, А.Б. Белова, А.А. Виноградов, В.В. Можаев. Влияние гидрофобных свойств поверхности белка на его устойчивость к денатурации органическими растворителями (на примере а-химотрипсина). // Биоорганическая химия, 1994, т. 20, No 3, с. 274-286.

3. E.V. Kudryashova, А.А. Vinogradov, V.V. Mozhaev. Covalent modification imparts additional stability to enzymes in organic solvents. Ц Proc. 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology., New Delhi, India, September 19-22, 1994, p. 219.

4. A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Enzime-polycation inter-polyelectrolyte complexes. A new approach to enzyme stabilization in organic media. // Proc. 16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology., New Delhi, India, September 19-22, 1994, p. 2T9.

5. AK. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrvdov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Stabilization of enzymes in water-organic mixtures by incorporation into non-covalent complexes with polycations. // Proc. International Symhoslum on Molecular mobility and order in polymer systems., St. Petesburg, Russia, October 3-6, 1994.

6. A.K. Gladilin, E.V. Kudryashova, A.V. Vakurov, V.A. Izumrudov, V.V. Mozhaev, A.V. Levashov. Enzyme-polyelectrolyte noncovalent complexes as catalysts in binary mixtures of polar organic solvents with water. // Biotechnol. Lett., 1995, v. 17, p. 1329133*.

7. V.V. Mozhaev, R. Lange, E.V. Kudryashova, C. Balny. Application of high hydrostatic pressure for increasing activity and stability of enzymes. // Biotechnology & Bioengineering, 1996, v. 52, No 2, p. 320-331.

8. V.V. Mozhaev, E.V. Kudryashova, N.V. Efremova, I.N. Topchleva. Stability of chymotrypsin conjugated with poly(ethylene glycols) and proxanols at high temperature and in water-cosolvent mixtures. // Biotechnology Techniques, принято в печать (1996, v. 10, No 11).

9. E.V. Kudryashova, A.K. Gladilin, A.V. Vakurov, F. Heitz, A.V. Levashov, V.V. Mozhaev. Enzyme-polyelectrolyte complexes in water-cosolvent mixtures. Negatively charged groups artificially introduced into a-chymotrypsin provide additional activation and stabilization effects. // Biotechnology & Bioengineering, принято в печать, (1997).