Свойства ферментов, включенных в нестехиометричные полиэлектролитные комплексы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. РЕГУЛЯЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ

ПШ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАХ.

1.1. Влияние иммобилизации на полиэлектролитах на кинетические свойства ферментов.

1.2. Положительная и отрицательная кооперативность при низкой ионной силе.

1.3. Влияние полиэлектролитного окружения на специфические взаимодействия между белками.

1.4. Регуляция стабильности ферментов синтетеческими водорастворимыми полимерными носителями.

1.5. Влияние иммобилизации на полиэлектролитах на термодинамику обратимых ферментативных реакций.

2. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ

БЕЛКОВ.

2.1. Нековалентные комплексы, включающие синтетические поли электролиты и биополимеры.

2.2. Обратимо-растворимые ферментативные системы.

3. НОВЫЙ КЛАСС КОМПЛЕКСНЫХ ВОДОРАСТВОШМЫХ ПОЖЭЛЕКТРОШТОВ.

4. ЭКСПЕНМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.Модификация ферментов сшивающими агентами,

4.3. Связывание ферментов с поликатионом (ПВП).

4.4. Выделение ферментов, связанных с поликатионом.•.

4.5. Связывание ферментов с полианионом (ПМАК).

4.6. Выделение ферментов, связанных с полианионом.

4.7. Определение активности ферментов.

4.8. Получение фазовой диаграммы системы поликатион-полианион.

4.9. Измерение размеров коллоидных частиц.

4.10.Светорассеяние растворов полимеров.

4.11.Титрование нативного и иммобилизованного в полиэлектролитные комплексы о(-химотрипсина основным панкреатическим ингибитором трипсина.

4.12.Термоинактивация нативных ферментов.

4.13. Термоинактивация иммобилизованных ферментов.

4.14.Нековалентное комплексообразование ферментов с поли электролитами.

5. СВОЙСТВА НЕСТтОМЕТШЧШХ ПОЖЭЛЖТРОЛЙТНЫХ

КОШЕКСОВ (НПЭК).

5.1. Фазовые диаграммы растворов НПЭК.

5.2. Свойства нестехиометричных полиэлектролитных комплексов, содержащих ферменты.

6. ВЛИЯНИЕ ФАЗОВЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ В РАСТВОРАХ

НЕСТЕХИОМЕТРИЧНЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТШХ КОМПЛЕКСОВ

НА. КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИММ0БИЖ30ВАННЫХ

ФЕШЕНТОВ.

6.1. Гидролиз низкомолекулярных субстратов.

6.2. Влияние полиэлектролитного окружения на белок-белковые взаимодействия.

7. ВЛИЯНИЕ ФАЗОВЫХ ПРЕВРАЩЕНИЙ В РАСТВОРАХ НПЭК

НА ТЕШШНАКТИВАЦИЮ ИММСШЖЗСВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ.

8. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЖЭЛЕКТРОЖТШХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ВЫВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТА ИЗ СФЕРЫ РЕАЫЩ.

8.1. Выведение фермента из реакционной смеси, используя нестехиометричный ПЭК.

8.2. Использование стехиометричного комплекса состава I для аналитических целей.

ВЫВОВД.

СПИССК ЛЙТЕРАТУШ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ В ТЕКСТЕ СОКРАЩЕНИЙ.

Интерес к использованию ионогенных полимерных матриц по сравнению с неионогенными для иммобилизации связан с широким набором свойств, которые несут полиэлектролиты. Более того, физико-химические свойства полиэлектролитов зависят от таких параметров внешней среды, как рН, ионная сила, температура, концентрация ионов металлов /I/. Это позволяет широко варьировать условия, в которых могут находиться ферменты, причем эти условия можно целенаправленно задавать. Иммобилизация ферментов на синтетических полиэлектролитах открывает богатые возможности для регулирования свойств получаемых иммобилизованных ферментов. В научном аспекте изучение свойств иммобилизованных на полиэлектролитах ферментов необходимо прежде всего для понимания катализа a? vivo . В ряде работ убедительно показано, что внутриклеточные ферменты в основном ассоциированы с различными фракциями клетки /2, 3/, в том числе клеточными стенками и мембранами, белками, нуклеиновыми кислотами, фосфолипидами, которые в свою очередь являются природными полиэлектролитами.

Влияние химической природы и, в частности, заряда носителя на свойства связанного фермента интенсивно изучалось и изучается. Однако, влияние заряженной матрицы на поведение фермента посредством микроокружения - не единственный путь регуляции ферментативной активности внутри клеток. Jw vivo структурные изменения природных полиэлектролитных матриц, например, агрегация и плавление, также вызывают существенные изменения в функционировании ферментов /4-6/. Такое влияние иммобилизации на свойства фермента через физическое состояние матрицы пока изучено крайне недостаточно /7/.

Исследование влияния на поведение фермента сложных структурных изменений полиэлектролитного носителя требует, по всей видимости, использования в качестве модели сложных полиэлектролитных систем. Это стало возможным совсем недавно в связи с открытием нового класса нестехиометричных полиэлектролитных комплексов (НПЭК), состоящих из нескольких полиэлектролитных компонентов с высокой плотностью заряда - полианиона и поликатиона /8, 9/. В отличие от стехиометричных полиэлектролитных комплексов НПЭК в определенных условиях не выпадают в осадок и ими можно оперировать как обычными растворимыми полиэлектролитами. Вместе с тем, усложнение структуры по сравнению с линейными полиэлектролитами приводит к тому, что НПЭК обладают рядом уникальных свойств. Во-первых, растворы НПЭК способны к изменению фазового состояния при определенных условиях (рН, ионная сила, Ме2+). Во-вторых, фазовые переходы, вызываемые изменением ионной силы и рН, являются полностью обратимыми.

Можно ожидать, что использование НПЭК для иммобилизации может привести к появлению уникальных свойств у связанного фермента. Это представляет интерес как с точки зрения биомоделирования, так и для получения новых обратимо растворимых биокатализаторов.

В настоящей работе было исследовано влияние фазовых переходов растворов НПЭК и структурных изменений НПЭК в растворе до фазовых переходов на каталитические свойства и термостабильность включенного биокатализатора.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

I. РЕШИЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ФЕРМЕНТОВ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИИ НА ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТАХ

Изменения, происходящие в ферментативных системах при иммобилизации на полиэлектролитах, можно подразделить на следующие составные части.

1). Образование помимо ковалентных дополнительных неко-валентных (электростатических, водородных, гидрофобных) связей белок-носитель.

2). Эффекты микроокружения, которые являются наиболее выраженными в случае заряженной матрицы. Свда входит также влияние носителя на диэлектрическую константу фазы иммобилизованного фермента, влияние на локальную растворимость субстрата и продукта.

3). Диффузионные ограничения, имеющие место в том случае, когда кинетические параметры ферментативной реакции определяются, в значительной степени, скоростью диффузии субстрата через неперемешиваемый слой вокруг матрицы. Эти ограничения могут быть особенно выражены в случае заряженных субстратов и продуктов.

4). Стерические эффекты, когда фермент взаимодействует с высокомолекулярными субстратами, ингибиторами, играют существенную роль в случае гетерогенной системы.

5). Модификация фермента при иммобилизации. Это может быть химическая модификация фермента, вызываемая кова-лентным связыванием в результате изменения собственного общего заряда фермента. В случае полиэлектролитных носителей такое влияние обычно перекрывается гораздо большими электростатическими эффектами микроокружения, создаваемого носителем. В эту группу входят также специфические влияния соседних химических груш на область активного центра, а также изменения в межмолекулярных взаимодействиях.

6). Нельзя исключать возможности, что электрическое поле носителя влияет на его структуру и/или вызывает конформа-ционные изменения в ферменте.

Накопленные литературные данные позволяют оценить влияние этих ключевых факторов на: константы взаимодействия с низкомолекулярными субстратами ( ккат, Км, К0 , к, ) и рН-зависимость этих констант; появление положительной и отрицательной кооперативности; изменение субстратной специфичности по отношению к высокомолекулярным субстратам; влияние на термодинамику ферментативных реакций (положение равновесия).

ВЫВОДЫ

1. Разработарха методика включения ферментов в частицу ШЭК. Получены препараты ШЭК, содержащие пенищшшнамидазу, пенициллин-\/-ацилазу, с(-химотрипсин, уреазу, глутаматде-гидрогеназу. Показано, что включение бежа в ШЭК практически не изменяет свойства комплексов. ШЭК с включенным ферментом способен претерпевать кооперативные фазовые переходы в узком диапазоне изменений внешних условий (рН, ионная сила раствора), причем такие фазовые переходы являются обратимыми и могут быть проведены многократно.

2. Изучены некоторые свойства самих ШЭК. Обнаружено, что существенные конформационные перестройки комплексов, а также их компактизация происходят еще до достижения условий фазового разделения. Получены диаграммы агрегации системы ПМАК-ПВП.

3. Показана зависимость каталитических свойств пенициллинамидазы, включенной в ШЭК, от фазового состояния ШЭК. Фазовый переход раствор ч~ осадок, вызванный изменением рН, приводит к скачкообразному увеличению величины Км ферментативного гидролиза бензилпенициллина в 5,7 раз, 2-нитро-4-фе-нилацетамидобензойной кислоты - в 9,8 раз. Компактизация частиц ШЭК, содержащих пенициллинамидазу, при изменении рН среды до границ фазового перехода никак не сказывается на взаимодействии фермента с низкомолекулярным субстратом.

4. Расположение фермента в частице ШЭК оказывает существенное влияние на его взаимодействие с белковым ингибитором. Так, ковалентное присоединение (А -химотрипсина к цепи полианиона делает его практически полностью доступным к взаимодействию с основным панкреатическим ингибитором трипсина независимо от фазового состояния НПЭК. Если же фермент включен в ядро ШЭК, то основная его часть недоступна белковому ингибитору, причем осаждение НПЭК увеличивает долю недоступного фермента.

5. Включение фермента в НПЭК дает возможность регулировать не только его активность, но и термостабильность. Существенная стабилизация ферментов (пенициллинамидазы до 300 раз, уреазы до 20 раз), включенных в ядро НПЭК, происходит при фазовом переходе ШЭК раствор осадок, причем изменения стабильности полностью определяются влиянием матрицы, являются обратимыми и могут быть проведены многократно.

6. Модификация Л-химотрипсина полиметакриловой кислотой существенно улучшает белок-белковые взаимодействия с основным панкреатическим ингибитором трипсина: прочность комплекса улучшается примерно на порядок, а скорость реакции ассоциации увеличивается в 6 раз. Кроме того, такая модификация позволяет выделять комплекс фермент-ингибитор из реакционной смеси при добавлении поли- [\/-этил-4-винилпиридиний бромида при полном отсутствии неспецифического включения белка в поликомплекс. На основании этих результатов предложен новый метод гомогенного иммуноферментного анализа.

1. Збзин А.Б. Полиэлектролиты. - В кн.: Энциклопедия полимеров: В 3-х т./ Под ред. И.В. Кабанова. М., 1977, т. 3, о. 90-102.

2. Kempner E.S., Miller J.H. The molecular biology of Euglena gracilis. -Exptl. Cell Res., 1968, vol. 51, N 1, p.150-156.

3. Ленинджер А. Биохимия: Пер, с англ. М.: Мир, 1974, о. 856-866.

4. Londesborough J. The cauaes of sharply bent or discontinuous Arrhenius plots for enzyme-catalyzed reactions. Europ. J. Biochem., 1980, vol,105, N 2, p.211-215.

5. Hatefi Y., Yagi Т., Phelps Б.С. et al. Substrate binding affinity changes in mitochondrial energy-linked reactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, vol.79, H 6, p. 1756-1760.

6. Bozzato R.P., linker D.O. Effects of membrane fluidity and identification of the rate-limiting step in the protein mediated phosphatidylcholine exchange reaction. Canad. J. Biochem., 1982, vol .60, H 4-, p.409-418.

7. Мартинек К., Шикшнио В.А., Можаев В.В., Березин И.В., Смирнов В.И., Торчилин В.П. Регулирование каталитической активности фермента, иммобилизованного на полиэлектролитном нооителе. Докл. АН СССР, 1981, т.259, № 3, с. 746-750.

8. Tsuchida E., Osada Y., Sanada K. Interaction of polystyrene sulfonate) with polycations carrying charges in the chain ЪаскЪопе. J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 1972, vol.10, N 11, p.3397-3404.

9. Гуляева Ж.Г., Полетаева О.А., Калачев А*А., Касаикинt

10. В.А., ЗезинА.Б. Исследование водорастворимого полиэлектролитных комплексов на основе 5,6-ионен бромида и полиакриловой кислоты, Высокомолек. соед., 1976, т. А18, № 12, о. 2800-2805.

11. Busch Н, Eistones and other nuclear proteins. F.Y»: Acad. Press, 1965, p. 197-222.

12. Cundall R.B., bawton J ,B., Murray D., Phillips G.O. Polyelectrolyte complexes. 2. Interaction between collagen and polyanions. Intern. J. Biol. Macromol., 1979, vol. 1, N 5, p. 215-222.

13. Huxley A.P. Muscle structure and theories of contraction. Progr. Biophys. Biophys. Chem., 1957, vol. 7, P. 255-312.

14. Morell A.Gr., Gregoriadis &., Scheinberg I.H, et al, The role of sialic acid in determining the survivalof glycoproteins in the circulation. -J. Biol. Chem., 1970, vol. 246, N 5, P. 1461—1467.

15. Smith G.F. Fibrinogen fibrin conversion. - Biochem. J., 1980, vol. 185, N 1, p. 1-11.

16. Griffith M.J. Kinetic analysis of the heparin-enhanc-ed antithrombin III/thrombin reaction. J. Biol. Chem., 1979, vol. 254, N 23, p. 12044-12049.

17. Besancon 3?., Bourgeade H.P., Justesen J. et al. Two inducers of cell differentiation enhance the 2'5!о11goadenylate synthetase activity in MSY transformed cells, -Biochem. Biophys, Res. Commun., 1981, vol. 103, N 1, p. 16-24.

18. Bonfils C., Nato E., Bourrillon R., Balny C. Poly-anionic character of plasma membrane, sialoglycopro-teins. FEBS Lett., 1981, vol.123, N 2, p.222-224.

19. Katchalsky A., Michaeli I. Polyelectrolyte gels in salt solutions. J. Polymer Sei., 1955, vol.15,N 79, P. 69-86.

20. McLaren A.D., Esterman E.F. Influence of pH on the activity of chymotrypsin at a solid-liquid interface, Arch. Biochem. Biophys., 1957, vol.68, N 1,p,157-160.

21. McLaren A.D., Babcock K.L. Characteristics of enzyme reactions at surfaces. Inj Subcellular Particles/ / T, Hayashi, ed. N.T.: Ronald Press, 1959, p.23-36.

22. Levin Y., Peeht M., Goldstein L., Katchalski E. A water-insoluble polyanionic derivative of trypsin (I) preparation and properties. Biochemistry, 1964, vol. 3, H 12, p. 1905-1913.

23. Goldstein L., Levin Y., Katchalsky E, A water-insoluble polyanionic derivative of trypsin. 2. Effect of polyelectrolyte carrier on the kinetic behavior of the "bound trypsin. Biochemistry, 1964, vol,3, N 12, p. 1913-1919.

24. Goldstein L. Water-insoluble derivatives of proteolytic enzymes. — In: Methods in Enzymology. N.Y.j Acad. Press, 1976, vol. 19, P. 935-962.

25. Goldstein L., Katchalski E. Use of water-insoluble enzyme derivatives in "biochemical analysis and separation, Presenilis Ztschr, analyt. Chem., 1968,1. Bd. 243, S. 375-396.

26. Pecht M., levin Y. Water-soluble polycationic derivatives of trypsin and chemotrypsin — preparation and properties. -Biochem. Biophys. Res. Commun., 1972, vol. 46, N 6, p. 2054-2061.

27. Hornby W.E., Lilly M.D., Crook E.M. The preparation and properties of ficin chemically attached to carbo-xymethylcellulose. Biochem. J., 1966, vol.98, N 2, p. 420-425.

28. Hornby W.E., Lilly M.D., Crook E.M. Some changes in the reactivity of enzymes resolving from their chemical attachment to water-insoluble derivatives of cellulose» -Biochem. J., 1968, vol.107, N 5, p.669-674.

29. Eatchalski E., Silman I., Goldman R. Effect of the microenvironment on the mode of action of immobilized enzymes. In: Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology. N.T.i Acad. Press, 1971, vol. 34, P. 445-536.

30. Bender M.L., Kezdy F,J, Mechanism of action of proteolytic enzymes, — In: Annual Review on Biochemistry, Palo Alto,Calif,, 1965, vol. 34, p„ 49-76,

31. Easamoto К. Surface charge densities and ionic substrate concentrations at the membrane surface in smooth microsomes isolated from rat liver, J* Bio-chem. (Tokyo), 1982, vol. 92, N 2, p. 365-371.

32. Tamura A,, Fujii I. Roles of charged groups on the surface of membrane lipid bilayer of human erythrocytes in induction of shape change. J. Biochem. (Tokyo), 1981, vol. 90, N 3, p. 629-634.

33. Стрельцова 3,A., Швядао В.К», Макоименко А.В. и др. Влияние полиэлектролитов на свойства пенициллинамидафзы и щелочной фосфатазы. Биоорг. химия, 1975, т«1, В 10, о. 1464-1469.

34. Wo;jtezak L., Famulski K.S., ITalecz E#J., Zborowski J. Influence of the surface potential on the Michaelis constant of membrane—bound enzymes. Effect of membrane solubilization. FEBS Lett., 1982, vol,139, H 2, p. 221-224.

35. Douzou P., Maurel Pt Ionic control of biochemical reactions. С.R.Acad.Sci., Paris, 1976, vol,282D,N 18, p. 2107-2110.

36. Goldstein D. Eicroenvironmental effects on enzyme catalysis, A kinetic study of polyanionic and polycationic derivatives of chymoifcr. -Biochemistry, 1972, vol.11,1. H 22, p. 4072-4084.

37. Engasser JHorvath C. Electrostatic effects on the kinetics of bound enzymes, Biochem. J., 1975, vol. 145, N 3, p. 431-435.

38. Goldstein It. Immobilized enzymes. Synthesis of a new type of polyanionic and polycationic resins and their utilization for the preparation of water-insoluble enzyme derivatives. Biochim. Biophys. Acta, 1973, vol. 315, N 1, p. 1-17.

39. Goldman R., Kedem 0., Katchalski E. Kinetic behavior of alkaline phosphatase collodion membranes. Biochemistry, 1971, vol. 10, li 1, p. 165-172.

40. Noat G., Crasnier M., Ricard J, Idnic control of acid phosphatase activity in plant cell walls. Plant Cell Environm., 1980, vol. 3, N 3, p. 225-229.

41. Wishio I., Hayashi R. Digestion of protein substrates by subtilisin: Immobilization changes the pattern of products. Arch. Biochenu Biophys., 1984, vol. 229, H 1, P. 304-311.

42. Von Specht B.-U., Brendel W. Preparation and properties of trypsin and chymotrypsin coupled covalentlyto poly (iT-vinylpyrrolidone) . Biochim.Biophys .Acta, 1977, vol. 484, N 1, p. 109-114.

43. Кинстлер О.Б., Жагат Р.Л., Торчилин В.П. Модификация ферментов биосовместимыми полимерами. Биоорг. химия, I960, т. 6, В 9, с. 1396-1403.

44. Glazer A.N., Bar-Eli A., Katchalski Е. Preparation and characterisation of polytyrosyl trypsyn. —J.Biol. Chem., 1962, vol, 237, N 6, p. 1832-1838.

45. Kasche Y. Effect of the microenvironment of the specific interaction between —XI and immobilized soybean trypsin inhibitor. Studia Biophysica, 1973, Bd.35,1. N 1, 5. 45-56.

46. Иммобилизованные ферменты: В 2-х т./ Под ред, Й.В. Березина, В.К, Антонова, К. Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1976, т. 2, с. 109-147.

47. Можаев В.В. Инактивация и реактивация белков (ферментов). В кн.: Введение в прикладную энзимологию/ Под ред. К.В. Березина, К, Мартинека. М.: Изд-во МГУ,1982, с. 180-193.

48. Мартинек К., Березин И.В. Стабилизация ферментов -ключевой фактор при внеднении биокатализа в практику. Успехи химии, 1980, т. 49, вып. 5, с. 737-770.

49. Мартинек К. Стабилизация ферментов один из ключевых факторов при внеднении биокатализа в практику. - В кн.: Успехи биоорганического катализа/ Под ред. И.В. Березина, К, Мартинека. М. : Изд-во МГУ, 1979,с.105-157.

50. Мартинек К., Торчилин В.П. Основные принципы стабилизации ферментов. В кн.: Инженерная энзимология и биоорганический катализ/ Под ред. В.Л. Кретовича,И.В. Березина. М.: ВИНИТИ, 1978, с. 17-48. (Итоги науки и техники, серия Биол. химия, т. 12).

51. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Применение иммобилизованных физиологически активных веществ белковой природы в медицине. В кн.: Введение в прикладную энзи-мологию/ Под ред. И.В. Березина, К. Мартинека. М.: Изд-во МГУ, 1982, с. 284-305.

52. Торчилин В.П., Рейзер И.Л., Тищенко Е.Г. и др. Иммобилизация ферментов на биосовместимых носителях. « Биоорг. химия, 1976, т. 2, № 12, с. 1687-1694.

53. Westman Soluble stable polyelectrolyte derivative of trypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun.,1969, vol. 35, N 3, p. 313-317.

54. Казанокая Н.Ф., Кост O.A. Модифицирование трипсина водорастворимым полиэтиленимином. Биоорг. химия, 1975, т. 1, $ 9, с. 1332-1336.

55. Epstein C.J., Anfinsen C.B., Sela M. Polyalanyl trypsin and polyalanyl chymotrypsin. « J. Biol. Chem., 1962, vol. 237, N 11, p. 3458-3463.

56. Sakharov I.Yu., barionova N.I., Kazanskaya N.F., Be-rezin IЛ• Stabilization of proteins by modification with water-soluble polysaccarides. Enzyme Microbiol. Technol., 1984, vol.6, p. 27-30.

57. Bier М., Sri Ram J., Nord F.F. Inhibition of acyltrypsins Ъу human serum. Nature, 1955, vol. 176,p,789-790.

58. Диков M.M., Осипов А.П., Егоров A.M., Березин И.В., Муотафаев М.й., Кирш Ю.Э», Кабанов В.А. Стабилизация лабильной к окислению SH-групп формиат-дегидрогеназы поликатионом. Докл. АН СССР, 1979, т. 248, & 5,с. 1260-1263.

59. Dikov М.М., Osipov А.Р., Bgorov A.M. et al. Method of stabilization of SE-enzymes: Stabilization of formate dehydrogenase and alcohol dehydrogenase of polyca-tions. J. Solid-Phase Bioehem., 1980, vol, 5, N 1,

60. Ingalls R.G., Squires R.G., Butler L.G. Reversal of enzymic hydrolysis: Rate and extent of ester synthesis as catalyzed Ъу chymotrypsin and subtilisin Carlsberg at low water concentrations. Biotechnol. Bioengng., 1975, vol. 17, N 11, p. 1627-1637.

61. Klibanov A.M. Enzyme stabilization by immobilization. Analуt. Bioehem., 1979, vol.93, N 1, p.1-25.

62. Kapune A., Easche If. Kinetically controlled equilibria. The perturbation of hydrolysis equilibria in reactions catalyzed by -chymotrypsin immobilized on charges supports. -Bioehem. Biophys. Res. Commun., 1978, vol. 80, N 4, p. 955-962.

63. Carroll D. Optical properties of deoxyribonucleic acid-polylysine complexes, -Biochemistry, 1972, vol. 11, IT 3, p. 421-433.

64. Кольцова C.B., Гликина M.B., Самсонов Г.В. Осаждение трипсина полиметакриловой кислотой. Изв. АН СССР,1

65. Сер. хим., 1970, № 8, с. 1895-1896.

66. Самсонов Г.В. Полимерные комплексы, включающие синтетические полиэлектролиты и физиологически активныеiкомпоненты. Высокомолек. соед., 1979, т. А21, $ 4, с. 723-733.

67. Morawetz Н., Hughes W.b,,Jr# Interaction of proteins with synthetic polyelectrolytes. 1, Complexing of Ъо-vine serum albumin. J. Phys, Chem., 1952, vol, 56,i1. N 1, p. 64-69.

68. Berdick M., Morawetz H. Ihe interaction of catalase with synthetic polyelectrolytes. -J. Biol. Chem., 1954, vol. 206, U 2, pt 959-962.

69. Poison A,, Potgieter G.H., bargier J.P, et al. Fractionation of protein mixtures by linear polyfraction-ation of high-molecular weight. Biochim. Biophys. ' Acta, 1964, vol. 82, N 3, p. 463-475.

70. Кабанов В.к,, Муотафаев Н.И., БлохинаВ.Д., Агафьева B.C. О кункурентных взаимоотношениях фракций белков » сыворотки при образовании комплексов с поликатионом.- Молек. биология, 1980, т. 14, II, о. 64-75.

71. Kokufuta Е., Matsumoto W., Rakamuro I. Immobilization of Kitrosomonas europeac cells with polyelectrolyte complex. -Biotechnol. Bioengng., 1982, vol,24, N 7, p. 1591-1603.

72. Kokufuta E., Eatsumoto W., Nakamuro I. Use of poly-electrolyte complex for immobilization of microorganisms. J. Appl. Polymer Sei., 1982, vol.27, N 7, p. 2503-2512.

73. Uar. 3695999 (CM). Isolation of enzymes from aqueous media by means of polyanions/ P.S. Forgione, K.M. Smyth. OnydJi. 1972.

74. Osa£La J., lino ¿F., ITivmaairi Y. Preparation and 'behaviors of enzymes immobilized by polymer-polymer complexes. Chemistry Lett., 1982, N 4, p. 559-562. t

75. Ricard J., Hoat G., Orasnier M., Gob D. Ionic control of immobilized «¡nzymes. Kinetics of acid phosphatase bound to plai.t cell walls. Biochem. J., 1981, vol. 195, H 2, p. 357-367.

76. Van Leemputten E.V., Horisberger №. Immobilization of enzymes on magnetic particles. Biotechnol, Bio-engng., 1974, vol. 16, N 3, p. 385-396.

77. Marshall G.G., Rabincwitz M.L, Preparation and characterization of a dextran-trypsin conjugate.

78. J. Biol. Chern., 1976, vol.251, N 4, p.1081-1087.

79. Schmidt R.D. Stabili2ed soluble enzymes. In: Immo-* bilized Enzymes II. Berlin etc.j Springer-Verlag,1979, P. 41-118. (Advances in Biochemical Engineering, vol. 12).

80. Geiger B., Yon Specht B.U., Arnon R. Stabilization of human -D-N-acetylhexosaminidase A towards proteolytic inactivation by coupling it to poly(N-vinylpyrro-lidone). L Europ. J. Biochem., 1977, vol. 73, N 1,p. 141-147.

81. Dellert Б., Stahmann H.A. Inhibition, restoration and enhancement of proteolytic action of polylysine and polyglutamic acid, Nature, 1955, vol.176, N 4491, p. 1028-1029.

82. Rice R.Y., Stahmann M„A., Alberty R, A. Ihe interaction of lysine polypeptides and "bovine plasma albumin.- J. Biol. Chem., 1954, vol.209, N 1, P.105-115.

83. Smith R.A.G-, Preparation and properties of amphipathic enzyme-polymer conjugates, Biochem. J., 1979, vol, 181, N 1, p. 111-118.

84. Charles E., Coughlin R.W,, Hasselberg F.X, Soluble-insoluble enzyme catalysts. -Biotechnol. Bioengng,,ч/1974, vol. 16, И 11, p. 1553-1556.

85. Coughlin R.W., Aizawa M., Charles Ж. Preparation and properties of soluble-insoluble nicotinamide coenzymes. -Biotechnol. Bioengng,, 1976, vol.18, N 2,p. 199-208,

86. Heemputten В.ЧГ», Horisberger M. Soluble-insoluble complex of trypsin immobilized on acrolein-acrylic acid \ copolymer. Biotechnol. Bioengng,, 1976, vol.18, N 4, p. 587-590.

87. Пат. 4088538 (США), Use of an enzyme for converting anмorganic compound at least one other organio compound/ / H. Schneider. Опубл. 1978.

88. Павлова H.P., Кирш Ю.2., Кабанов В.А. Изучение молекулярной динамики в растворах полиэлектролитов и их кооперативных комплексов методом тушения флуоресценции. '- Выоокомолек. соед., 1979, т. А21, i& 9, о. 2062-2069,

89. Рогачева В.Б., Зезин А.Б. Взаимодействие слабых полимерных кислот и солей полимерных оснований. Вы- а сокомолек. соед., 19(59, т. Б11, № 5, с» 327-328,

90. Зезин А.Б., Луценко В.В., Рогачева В.Б. и др. Кооперативные взаимодейстзия синтетических полиэлектролитов в водных растворах. Выоокомолек, соед», 1972» т. А14, 4, с. 772-778.

91. Зезин А.Б., Рогачева В.Б. Полиэлектролитные комплексы. В кн.: Успехи химии и физики полимеров. М.: Химия, 1973, с. 3-32«

92. Луценко В.В., Зезин Калюжная Р.й. Термодинамика кооперативного вэЕшмодеЁствия полиэлектролитов в ' водных растворах. Выоокомолек. соед», 1974, т. А16, № 11, с. 2411-2417.

93. Зезин А.Б. Реакции между линейными макромолекулами. -В кн.: Макромолекулахные реакции/ Под ред. H.JL. Платэ, А.Д. Литмановича, О.В. Ноа. М.: Химия, 1977, с.233-252.

94. Луценко В.В., Зезин А.Б., Лопаткин А.А. Статистиче-екая модель кооперативной реакции между слабыми полиэлектролитами. Выоокомолек. соед., 1974, T.A16,1. В 11, с * 2429-2434.

95. Michaels A. Polyeleetrolytes complexes. Industr. Engng. Chem,, 1965, vol. 57, N 10, p. 32-40. 1

96. Рогачева В.Б., Мирлина С.Я., Каргин В.А. Электронно--микроскопичеокое исследование взаимодействий противоположно заряженных полиэлектролитов в растворах. -Выоокомолек. соед., 1970, т. Б12, В 5, с. 340-344.

97. ЕаЪапочг Ч.A., Zezin Л,В, Soluble interpolymeric complexes as a new class of synthetic polyelectrolytes.- Pure a. Appl, Chem., 1984, vol.56, ÏÏ 3, p.34-3-354.

98. Касаикин В.А,, Харенко О.А., Харенко А.В., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Принципа образования водорастворимых полиэлектролитных комплексов. Выоокомолек. соед., * 1979, т. Б21, В 2, с, 84-85.

99. Гуляева Ж.Г., Зезин А.Б., Берестецкая Т.З., Разводов-ский Е.Ф. Исследование полиэлектролитных комплексов на основе полимерных четвертичных аммонитных солей.- Высокомолек. соед.,. 1974, Т.А16, № 8, с. 1852-1857.

100. Изумрудов В.А., Касаикин В.А., Ермакова Л.Н., Зезин 1.Б. Исследование водорастворимых полиэлектролитных » комплексов неэквимольного состава. Высокомолек. соед., 1978, т. А20, № 2, с. 400-406.

101. Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Изучениеtреакции образования нестехиометричных полиэлектролитных комплексов. Высокомолек. соед., 19ВЗ, т. А25, № 9, с. 1972-1978.

102. Kabanov Y.A., Zezin А.В., Mustafaev K.I,, Kasaikin Y.A. Soluble interpolymer complexes of polyamines and polyammonium salts. Inj Polymeric Amines and t Ammonium Salts/ B.J. Goethals, ed. Oxford: Pergamon Press, 1980, p. 173-192.

103. Зезин А.Б., Луценко Б.В., Изумрудов В.А., Кабанов

104. В.А. Особенности кооперативного взаимодействия в реакциях между полиэлектролитами. Высокомолек. соед., 1974, т. А16, & 3, с, 600-604.

105. Харенко 0.JI., Харенкс» A.B., Каоаикин В.А., Зезин

106. A.Б., Кабанов В.А. Строение нестехиометричных водорастворимых полиэлектролитных комплексов. Высокомолек. соед., 1979, т. А21, & 12, с. 2726-2733.

107. Изумрудов В.А., Савицкий А.П., Зезин А.Б., Кабанов

108. B.А. О кинетике макромолекулярного обмена в растворах полиэлектролитных комплексов. Докл. АН СССР, 1983, т. 272, № 6, с. 1408-1412.

109. Харенко O.A., Изумрудов В.А., Харенко A.B.,и др. Процессы ассоциаций-диссоциаций в растворах нестехиометричных полиэлектролииных комплексов. Высокомолек. соед., 1980, т. А22, № 1, с. 218-223.

110. Изумрудов В.А., Харекко O.A., Харенко A.B., Гуляева Ж.Г., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Поведение нестехиометричных полиэлектролитных комплексов в водных растворах солей. Высокомолек. соед., 1980,т. А22, В 3, с. 692-699.

111. Кабанов В.А., Зезин А.Б., Рогачева В.Б., Изумрудов

112. В.А., Рыжиков C.B. Сопряженные физико-химические превращения в водно-солевых растворах нестехиометричных полиэлектролитных комплексов. Докл. АН СССР, 1982, т. 262, I 6, с. 1419-1422.

113. Кабанов Б*А., Зезин А.Б., Рогачева В.Б., Рыжиков C.B. Диспропорционирование нестехиометричных полиэлектролитных комплексов в водно-солевых растворах. Докл. АН СССР, 1982, т. 267, № 4, с. 862-865.

114. Паписов И.М., Барановский В.Ю., Черняк В.Я. и др*

115. О нестатическом распределении олигомера по матрицам на примере системы яолиметакриловая кислота (матрица) полиэтиленгликоль (олигомер). - Докл. АН СССР, 1971, г. 199, & , <$. 1364-136?.

116. Kabanov V.A., Zezin А,В. A new class of complex water-soluble polyelectrolytes • Makromol. Chem,, Suppl. 6, 1984, S. 259-276.

117. Березин И.В., Клесов А.А., Марголин А.Л. и др. Изучение пенициллинамидазы из е. coli. рН-зависимости кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики, 1976, т, 21, № 5, с. 411-415.

118. Schonbaum (J.R., Zerncr В., Bender Ж.Ь. The spectro-photometric determins.tion of the operational normality of an -chymotrypsin solution. J. Biol. Chem., 1961, vol. 236, N 11, p. 2930-2935.

119. Salesse R., Garnier J., beterrier P. et al. Modulation of adenylate cyclase activity Ъу the physical state of pigeon erythrocyte membrane. Biochemistry, 1982, vol, 21, N 7, P. 1561-1586.

120. Pooss R.M., Struss TJ.P. Polyelectrolytes. 2. Poly-4--vinylpyridonium chloride and poly-4-vinyl-K-butyl-pyridonium bromide. J. Polymer Sci., 1948, vol.3, p. 246-263.f

121. Margolin A.L., Izumrudov T.A., Svedas V.E., Zezin

122. А.В., Kabanov V.A., Berezin 1Д, Preparation and properties of penicillin amidase immobilized in polyelec-trolyte complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1981, vol. 660, N 2, p. 359-365.

123. Stacey К.A. bight scattering in the physical chemistry. N.Y.: Acad. Press, 1956, - 230 p

124. Кленин В.Й., Щеголев С.Ю., Лаврушин В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных систем. Саратов: Изд-во Саратовск. ун-та, 1977, с.8-170.

125. Sandermann H.,Jr. Regulation of membrane enzymes by lipids, Biochim. Biophys. Acta, 1978, vol, 515,1. N 3, p. 209-237.

126. Oldfield E., Chapman D. Dynamics of lipids in membranes; Heterogeneity and the role of cholesterol. -PEBS Lett., 1972, vol. 23, N 3, p* 285-297.

127. Seeman P. The membrane actions of anesthetics and tranquilizers. -Pharmacol. Rev., 1972, vol.24, N 4, P. 583-655.

128. Sandhoff K., Pallmann B. Membrane-bound neuraminidase from calf brain: Regulation of oligosialoganglioside degradation by membrane fluidity and membrane components. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol, 75,1. N 1, p. 122-126.

129. Зезин А.Б., Кабанов B.A. Новый класс комплексных водорастворимых полиэлоктролигов. Уопехи химии»1982, т. 51, вып. 9, с. 1447-1483.

130. Salesse R., G-arnier ¿j'., Daveloose В. Modulation of adenylate cyclase activity Ъу the physical state of pigeon erythrocyte mesmbrane. Biochemistry, 1982, vol. 21, N 7, P. 1587-1590.

131. Kawato S., Lehner C., Muller M., Cherry R.J. Protein-protein interactions! of cytochrome oxidase in inner mitochondrial membranes. J. Biol.Chem,, 1982,vol. 257, H 11, p. 6^-70-6476.

132. Swerdlow B.M., Setlow В., Setlow P. bevels of H+ and other monovalent cations in dormant and germinating, -J. Bacteriol., 1981, vol. 148, p. 20-29.

133. Vfarth A.D. Heat stability of Bacillus coreus enzymes within spores and in extracts. J. Bacteriol1980, vol. 143, N 1, p. 27-34.

134. Bradbury J.H., Foster J.R., Hammer L. et al. The source of the heat resistance of bacterial spores study of water in spcres by NMR. Biochim. Biophys. Acta, 1981, vol. 678, N 2, p. 157-164.

135. Margolin A.L., Izumrtr.dov Y.A., Svedas V.K., Zezin A.B. Communications "to the editor: Soluble-insoluble immobilized enzymes. — Biotechnol. Bioengng., 1982, vol. 24, ^ 1, P. 237-240.

136. Bieth J. Some kinetic consequences of the tight binding of protein-proteinase-inhibitors to proteolytic enzymes and their application to the determination of dissociation constants. In: Proteinase Inhibitors: Proc. of the 2nd Intern, res, conf./

137. H, Fritz et al. Berlin: Springer, 1974, P.463-469. (Bayer-Symposium 5).

138. Green H,M. Kinetics of the reaction between trypsin and the pancreatic trypsin inhibitor, Biochem. J,, 1957, vol, 66, N 3, 407-415.

139. Дзантиев Б.Б., Блинцэв A.f^, Изумрудов В.А., Шерстюк С.Ф. Применение иммобилизованных на водорастворимом полимере антител для аналитических целей. В кн.: Тезисы докладов 1У Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология". Киев, 19Г.3, с. 30.

140. Ныс П.С., Савицкая Е.М., 0; зсов А.А. и др. Изучение денициллинамидазы из е. col l, рН-зависимость кинетики инактивации фермелта. Антибиотики, 1978, т. -23, № 1, с. 46-50.

141. СПИСОК ПРИНЯТЫХ В ТЕКСТЕ СОКРАЩЕНИЙ1МЕТ1. ВАЭЭ ВАЛ1. V,