Регуляция стабильности и каталитической активности ферментов изменением хаотропных свойств среды (на основе альфа-химотрипсина и рибонуклеазы) тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЛЕВИЦКИИ ВЛАДИСЛАВ ЮРЬЕВИЧ

РЕГУЛЯЦИЯ СТАБИЛЬНОСТИ И КАТАЛИТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ИЗМЕНЕНИЕМ ХАОТРОПНЫХ СВОЙСТВ СРЕЛЫ

(на примере а- химотрипсина п рибонуклеазы)

Специальность - 02.00.15 - химическая кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена на кафедре Химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: д. х. н. В. В. Можаев Научный консультант; д. х. и. А. В. Левашов

Официальные оппоненты:

д. х. н, профессор Е. С Чухрай д. б. н. А. В. Махсименко

Ведущая организация:

Институт Молекулярной биологии им. А. В. Энгельгардта РАН

Защита состоится ")Ъ" 1992 г. в 16 часов на заседании

специализированного Ученого совета Д.053.05.76 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, ГСП-3, Москва, Ленинские горы, Химический факультет МГУ, аудитория 202 корпуса кафедры Химической энзимологии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "23" 1992 г.

Ученый секретарь совета, кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение взаимосвязи структуры и стабильности белков представляет собой одну из фундаментальных проблем современной биологии. Без понимания основных закономерностей воздействия различных факторов среды на конформационное состояние и стабильность белков невозможно ни изучение сложных ферментативных процессов, ни создание ферментных систем с заранее заданными свойствами. С другой стороны, применение ферментов на практике во многих случаях сдерживается низкой стабильностью ферментных катализаторов. Поэтому разработка общих незмпирических принципов стабилизации белков является важнейшей задачей инженерной энзимологии.

Все существующие в настоящее время методы стабилизации ферментов против необратимой термоинактивациик являются разновидностями трех основных подходов.

Первый подход заключается в упрочении белковой молекулы в результате изменения ее первичной структуры. Замена аминокислотных остатков с помощью генно-инженерных процедур, ковалентная модификация внутренних областей глобулы, наложение поперечных сшивок и т. д. позволяет усилить "слабые" по отношению к инактивации места молекулы фермента. Такие процедуры требуют подробного знания структуры фермента для точного воздействия на конкретные труппы. Это делает подход технически сложным, часто он приводит к непредсказуемым результатам.

Второй подход основан на защите фермента от влиятгя неблагоприятных факторов среды путем создания благоприятного микроскруження. Воздействие на белок осуществляется на уровне третичной структуры молекулы. Реализация этого подхода осуществляется путем иммобилизации фермента, его солюбилизации в мицеллах, ковалентной и нековалентной модификации поверхности белка. Эти методы хорошо изученны и трлдкционнь: для знзимолоши. Основным их недостатком является гетерогенность, а также непредсказуемость свойств полученного модифицированного препарата или созданной системы.

Этих недостатков лишен третий способ воздействия на стабильность - создание оптимальной для стабильности фермента макросреды. Он основан на изменении структуры растворителя в

присутствии различных . растворенных веществ, например, солей, органических растворителей и т. п. В результате изменяется гидратация фермента и опосредованно - его структура и стабильность. Принцип универсален и просто реализуется, т. к. применим для ферментов различных классов и не требует точного знания их структуры.

До недавнего времени разобщенные, иногда противоречивые литературные данные не позволяли сформулировать общую идею стабилизации белха низхомолехулярными добавками. В литературе отмечено, что, например, соли влияют на термоинактивацию ферментов, как правило, согласно положению в ряду Гофмейстера, сделаны многочисленные попытки описать в виде корреляционных уравнений влияние на стабильность ферментов органических растворителей. Однако, полное понимание влияния свойств среды на термостабильность ферментов, особенно при высоких температурах, пока не достигнуто.

Основная 'цель работы состояла в том, чтобь: изучить термоинакгивацшо ферментов (на примере а-химотрипсина и рибонуклеазы А) в присутствии различных солей, денатурантов, органических растворителей и установить ее основные закономерности при высоких температурах.

Научная новизна работы. Проведено широкомасштабное исследование термсяшакгиващт а-шмотрипсиха е различных солевых системах. Показано, что зависимость константы скорости необратимой термоинактивации нативных химотрипсина и рибонуклеазы от температуры в координатах Аррениуса при низких значениях рН, а также в растворах хасгсропных веществ имеет необычный "пилообразный" характер. Нелинейная зависимость объяснена в рамках кинетической схемы, основным элементом которой является обратимый конформационный переход катизной формы фермента в более развернутую форму, стабильную при высокой температуре. Показано, что "высокотемпературная" форма а-:шмсгарипсина не обладает каталитической активностью по отношению к специфическому модельному субстрату, но сохраняет протеолитическую ферментативную астивноегь по отношению к полимерному белковому субстрату.

Предложени количественные критерии выбора оптимальной (с точки гргхия стабильности белъа) еодяо-солевой среди. Обнаружена корреляция стабильности а-химотрипсина по отношению х необратимой инактивация при высоких температурах с заотропкыми (всатгизающими) свойствами среды. Корреляция объяснена влиянием расгвореьньтх

веществ на конформационное равновесие между двумя формами фермента, различающимися по стабильности. Показано, что вещества разной природы: органические и неорганические соли, денатуранты, органические растворители, а также их смеси воздействуют на стабильность фермента аддитивно. Для а-химотрипсина в сильновсаливающих растворах достигнуты более чем стократные стабилизационные' эффекты, сравнимые с эффектами, достигаемыми методами химической модификции и иммобилизации.

Научная и практическая значимость. Продемонстрированная в работе возможность регуляции стабильности и каталитической активности ферментов целенаправленным изменением хаотропных свойств среды может быть положена в основу стратегии создания высокостабильных растворимых ферментных систем с заданными свойствами.

Достигнутые для а-химсггрипсина стабилизационные эффекты могут представлять интерес для решения практических задач, в которых требуются препараты, способные выдерживать воздействие высоких температур без существенной необратимой потери каталитической активности, например, в условиях стерилизации, при производстве синтетических моющих средств, в кожевенной промышленности и т. п.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на VI и VII Всесоюзных симпозиумах по инженерной энзимологии (Вильнюс, 1988, Москва, 1991), XX Конференции федерации европейских биохимических обществ (Будапешт, 1990), VII Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Варна, 1990), Всесоюзной конференции НПО "Биолар" по методам получения,-"анализа и применения ферментов (Рига, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (посвященного механизмам инактивации белков и влиянию на их стабильность низкомолекулярных веществ), постановки задачи, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (из ( наименований). Работа Iпложена на 1 страницах и включает 2 таблицы и ^¿.рисунков.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

Принципиальная возможность регуляции термостабильности ферментов добавками низкомолекулярных веществ может быть прояснена в рамках общей кинетической схемы термоинахтивацни ферментов, предложенной Ламри и Эйрингом (1954):

К к

N <==> О---> I (1)

где N - нативная, В - обратимо денатурированная и I - необратимо инактивировакные формы фермента. Согласно этой схеме, инактивация начинается с обратимого конформационного изменения с константой равновесия К, вслед за которым происходят необратимые процессы различной' природы, характеризующиеся константой скорости к. Наблюдаемая константа скорости необратимой термоинактивации, кт, характеризующая стабильность фермента, предсгазляет собой . эффективную величину:

кт - кК / (1 + К) (2)

Стабильность фермента можно изменять, воздействуя на любую из констант, составляющих кик. Елиянис на константу схоросга необратимых инактквационных процессов к требует знания их природы в случае каждого конкретного белка, тогда как воздействовать на константу равновесия К можно, исходя ю общих принципов влияния низкомолекулярных веществ на информационное состояние белка. Известно, например, что высаливающие (или хосмотрешше) соли затрудняют информационные изменгш-л, связанные с разворачиванием и стабилизируют напшную хонформацию фермента при небольших температурах, а всалнвающие (или хаотролные) соли, напротив, облегчают протекание информационных изменений и стабилизируют более развернутые формы. Это указычает на принципиальную возможность регуляции стабильности изменением солевого состг.са среды и требует более подробного изучккад.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

1. КнпетнчесЕие гривые тсрмоипактивацип о-хнмотрппсипа. Кинетика термоинактивации нативного а-химотрипсина в растворах разного солевого. состава и значения рН (от 3.0 до 8.0) имеет ярко выраженный двухфазный характер (кривая 1 на рис. 1). В отдельных кинетических и электрофоретичесюгх экспериментах было показано, что двухфазный характер кинетических кривых не связан с бимолекулярными процессами агрегации и автолиза. Скорее, фермент содержит по крайней мере две фракции, различающиеся по стабильности. В этом случае сначала идет быстрая кгактиЕацкя более лабильной фракции (участок а), затем более медленная - стабильной фракции (участок б).

Рис. 1. Кинетические кривые необратимой термоинактивацим нативного химотр;птсина при 46 °С, рН 2,0 до (кривая 1) и после (кривая 2) очистки с помощью избирательной термоинактивашш. Относительная остаточная активность Аоуд (текущая активность А относительно активности фермента до термоинактиЕации А0) приведена в полулогарифмической шкале.

Стабильная фракция фермента была выделена с помощью следующей процедуры, которую в дальнейшем мы будем называть избирсггсмыизй терлоииактиваимей. Исходный препарат прогревали в течение 20 минут. За эта время успевала тгрочнехтиЕярозать лабильная фракция. Фермент, оставшийся активным, содержал только стабильную фракцию. Она была выделена методом аффинной хроматографии на панкреатическом ингибиторе трипсина в качестве лгтанда. Полученный гомогенный препарат характеризуется строго минаэкспсне;шиальной кинетикой ипистиъации (кривая 2 на рис. 1). Кривая 2 и конечный уч?сток б исходной, инактивационной кривой 1 имеют одинаковый наклон, т. к. обе относятся к стабильной фракции фермента. Это позволило в дальнейшем работать с исходным препаратом фермента без описанной очистки. Его стабильность характерюсЕали величиной определенной из тангенса угла наклона конечного участка

инактивационной кривой, иными слогами, анализировали в исходном ферменте только характеристики стабильной фракции.

2. Аномальные температурные зависимости скорости необратимой термоннастивацин нативных ферментов. Кинетическая схема 1 описывает термоинактивацию большинства нативных белков в условиях, близких к физиологическим. Серьезное изменение условий термоинакгивации может приводить к появлению отклонений, которые нельзя объяснить в рамках этой схемы. Так, термоииакгивация большинства белков характеризуется линейной зависимостью кци от температуры в координатах Аррениуса (кривая 1 на рис.1). Однако, как показано недавно (Мелнк-Нубароз и др. 1990), препараты а-химотрипсина, модифицированные гидрофильными соединениями, характеризуются "пилообразными" зависимостями ^ кш£ от обратной температуры (типа кривой 2 па рис.2А). Для объяснения наблюдаемого явления бьша предложена кинетическая схема 3:

Ег <=

К

=»е2

(3)

«=2

где Е] - "низкотемпературная'' или нативная форма, Е2 "высокотемпературная", а и 12 - необратимо пнактивирсванные формы фермента. Согласно схеме:

кI Кк2 кин ~ ------- + ------

(1 + К) (1+К)

(4)

Наличие ниспадающего участка 5 объясняется в рамках схемы 3 обратимым переходом фермента из натавной "¡шзкогемпературной" колфермации Ех в значительно более стабильную, но неактивную информацию Е2, существующую при высоких температурах.

Мы полагаем, что "пилообразная" зависимость кШ1 и объясняющая ее схема 3 не являются специфическими для модифицированных

препаратов. У нативных ферментоз в этих же условиях келннейнь!е зависимости не могут быть обнаружены, т. к. для них температура конформационного перехода Е} < = = = = > Е2 (при которой К - 1) достаточно высока, тогда как стабильность "шакотемпературной" конформации Ех невелика, поэтому зесь фермент задолго до перехода инактивируется согласно процессу Е} —> Это наблюдается, например, у дативного а-химотрипсина при рН 8,0 (кривая 1 на рис. 2А).

Для дативного фермента можно подобрать условия, при которых нелинейная зависимость кт от обратной температуры обнаруживается экспериментально. Так, при кислых значениях рН среды, когда "низкотемпературная" хонформация Ех более стабильна, у нагиеного о-химотршзсина и рибонуклеазы наблюдаются нелинейные зависимости кш (рис. 2).

Для а-химотрипсина температурные зависимости кии имеют "пилообразный" характер (рис. 2А). Наблюдаемую ломаную линию можно условно разбить на три линейных участка. На низкотемпературной ветви (участок а кривой 4 на рис. 2А) фермент находится преемущестЕенно в конформации Ех (К< <1) и инактивируется согласно процессу Ех — > иными словами, ки71 = (у.

90 80 70 60 50 °С юо 90 80 ТО~ 60 °С

19 Кн -1.0-3.02.8 ¿9 3.0 3.1 ¿7 28 £9 3.0 1/Т 103, К"1 1/Т 103, К"1

Рис. 2. Зависимость константы скорости необратимой термо-инакттсзацик кии а-хкмотркпсина (А) и рибонуклеазы (Б) от температуры с координатах Арренкуса при разных значениях оН среды. А. Концентрация а- химотрипсикаСАмхМ. рН: 1- 8,0; 2- 5,0; 3- 4,0; 4- 3,0. Б. Концентрация рибонуглеазыО.бмкМ. рН'буфера: 1- 3,0; 2- 6,0.

Значение кич на ниспадающем участке О является функцией всех трех констант К, кх, ;с2 г уравнении 4. Высокотемпературная ветвь (участок в) характеризует термсстабильность конформера Е2, для нее кхш = «2-

Излом на зависимости кш для рибонуклеазы (кривая 2 на рис. 2Б) также указывает на смену механизма инактивации фермента в результате конформационного изменения, а отсутствие ниспадающего участка говорит о том, что "низкотемпературная" нативная форма рибонуклеазы стабильнее, чем ее "высокотемпературная" конформация, т. е. для рибонуклеазы /у < «2-

Аналогичные "пилообразные" зависимости кШ1 были обнаружены для а-химотрипсина при рН 8,0 в растворах роданида калия и хлорида гуанидиния (рис. 3). Эти соли находятся б правой части ряда Гоффмейсгера, т. е. обладают сильным всаливающим действием и облегчают протекание конформационного перехода Е}

90 80 70 60 50 °С до 80 70 60 50 °С

1д кин

-1.0-1.5-2.0--г5-

2.8 ¿9 3.0 3.1 ¿8 ¿9 3.0 ЗЛ

1/Т 103, К"1 1/Т 10з,

Рис. 3. Зависимость константы скорости необратимой термоинактивации а-химотрипсина от температуры в координатах Аррениуса ггои разной концентрации роданида калия (А) и хлорида гуанидиния (Б). рН 8,0. Концентрация а-химотрипыша 0.6 мкМ. А. Концентрация ЮСИ: 1- ОД М; 2- 0,5 М; 3- 1,0 М. Б. Концентрация СиНО: 1- ОД М; 2- 1,0 М; 3- 6 М

3. Экспериментальные подтверждения предложенной гинсткчесгон аемы. Постулированный схемой 3 конформационный переход был -изучен независимыми физико-химическими методами: флуоресцентной спектроскопией (ФС) и дифференциальной сканирующей микрокалориметртей (ДСК). Метод ФС был выбран, т. к. в результате кснформационного перехода, как правило, происходит изменение эхспонированносги в растворитель вкутремшх гидрофобных хромофоров (остатков тирозина и триптофапа), и, следовательно, изменение спектра собстЕгняой флуоресценции белка (более развернутая форма характершуется большей длиной волны максимума собгтьеш-юй

флуоресценции - ¿макс)- Было показано, что во всех случаях нелинейной зависимости к.м от температуры (при кислых значенигх рН, в растворах хаотроггаых солей КБСЫ и СиНС1), в интервале температур, соответствующем излому на кривой, действительно происходит конформационный переход, связанный с разворачивавшем фермента из формы Щ в более развернутую форму £2 (Рис- 4)-

40 50 60

X, гл!

"им

" "1.5 Рис. 4. Зависимость длины

волны максимума собственной флуоресцеяценция Какс а~ химотрипсина в 1 М растворе ОиНСЬ рН 8^). Пунктирной

" -2.0

3.3

3.1 2.9 103 Г1, К"1

линиеи показана температурная зависимость кт химо-трипсина в т« же условиях.

Подобное значительное разворачивание белковой молекулы сопровождается гидратацией новоэкслонированных в растворитель гидрофобных групп, и, следовательно, увеличением теплоемкости системы, которое может быть зафиксировано методом ДСК.

Термограмма исходного гетерогенного а-химотрнпсина в растворе всаливающей соли КБСМ имеет сложную конфигурацию, составленную го двух ликов (кривая 1 на рис. 5). Первый пик (пик а на кривой 1 рис.5) характеризует информационный переход Е] < = = > относящийся к лабильной фракции. На термогргиме для химотрипсива, отделенного от лабильной фракции (кривая 2), он отсутствует. Второй шгк характеризует переход <- = > Е2 стабильной фракцич фермента.

Рис. 5. Полученные методом ДСК термограммы натисиого

а-химотрипенка в 0,5 М КЗСИ при рН 8,0 до (криьая 5) и госле (кривая 2) очистки с помощью ЕэЗкрательной термоинахгикции.

Т, °С

Температура, соответствующая вершине пика на рис. 5, считается температурой перехода Тпер (константа равновесия К в этой точке равна 1). Для обеих фракций сг-химотрипсина ^пср .линейно уменьшается с ростом концентрации всалпвающей соли КБСЗЯ.

55- 0 О 1 в 2 03

45-

35- а\ \ь

• 25- N

О 1 2 1 3

- [КЗ-ГС], м

Рис.6. Зависимость температуры информационного перехода исходного гетерогенного а-химстрипсина от концентрации КБСМ. Линия А относится к лабильной фракции фермента, линия Б - к стабильной Данные получены:

1- методом ДСК;

2- из кинетихи инактивации;

3- методом ФС

Обратимость конформациоиного перехода Е^ < = = = = > Е2 не удается продемонстрировать стандартным калориметрическим приемом -охлаждением раствора фермента и повторным сканированием по температуре, т. к. наряду с переходом С/ < = = = = = > Е2 протекает необратимая инактивация фермента согласно процессу —> Бея лабильная фракция фермента инактлвнруется за время' пергого сканирования; а значительная часть стабильной фракции - за время последующего охлаждения и повторного прогреза. Обратимость была продемонстрирована с помощью более быстрых флуоресцентных методов, а т;'.кг.;е с помощью следующего эксперимента. Фермент прогревали г термостате при температурах выше Тпар т. течение времени, достаточного для того, чтоб« фермент перешел га формы в ферму Е2 (время определяли из данных ДСК), быстро охлаждали, перемокши в ячейку калориметра и прописывали тармограмму. На термогрглше наблюдался один узкий пик, по температуре соответствующий переходу ЕI < = - - > л? стабильной фрикции феру-ептс. Это означает, что ллби.глчгя фрмеца,- необратимо иаз;л«:ируеглась,йсйабю1ч.:1{'* - крегераель кс '.'мючл« ■>:

---->

(5)

где стадии 1 соответствует быстрый прогрев в термостате, стадии 2 -быстрое охлаждение, стадии 3 - прогрев раствора фермента в калориметре. Результат эксперимента свидетельствует об обратимости конформационного перехода.

4. Каталнтнчесхая активность гоиформеров фермента. Можно перевести весь фермент.в форму £2 Дяжс при комнатной температуре, сделав К>>1 действием высоких концентраций всалнвающих солей. Экстраполяция линейной зависимости Тпер от КЭСМ (рис. б) в область низких температур позволяет считать, что при 25 °С в М растворе КБСМ весь фермент переходит в форму Е2-

На рис. 7. показано изменение ферментативной активности а-химотрипсина по отношехппо к низкомолекулярному специфическому субстрату при 25 °С в результате добавления в реакционную систему соли ХБКС.

А, % |о—сг

Рис. ?. Зависимость ферментативной акптЕностн а-хлмотрипсика по отношению к специфическому субстрату АТЭЭ от :;оние:пт>ацич К5СН при 25 °С.

Ферментативная активность, восстановленная в результате разбастения системы расггором субстрата, изображена пунктирной линией.

Ферментативную активность впрггеляля по начальной скорости каталшяруемого а-хдмстр.чпапгом гндро.иза раствора ггилсвого эфира М-ацетил-Х^-тирсзина. (АТЭЭ) методом рК-ггаткргла'.и'я г;рм рН 8 0.

В шггерггсч. кср.иечтрлций родгчпя? в» ми* 1.1 - 2 М Фермент с.-;оло 30% дп'^иос!!:, - гтлсузап-л ж»ляк,*праккп 3,0 - З/1 М -

оставшиеся 20%. Потеря активности носит ярко выраженный пороговый характер, что указывает на высокую кооперативность процесса. Активный нативный фермент переходит в конформащпо Е^, которая неактивна по отношению к модельному специфическому субстрату- (АТЭЭ). В гетерогенном исходном препарате а-химотрипсина сначала претерпевает переход Е) —> Е2 лабильная форма фермента (первый порог - участок А на рис. 7), затем - стабильная форма (участок Б). При разбавлении субстратом до небольших остаточных концентраций соли, активность стабильной фракции восстанавливается полностью, а лабильной - лишь частично. Чем ниже температура эксперимента, тем больший процент активности фермента удается восстановить. Это объясняется уменьшением вклада необратимых процессов, протекающих при высоких температурах, и еще раз подтверждает обратимость конформационного перехода Е] < = = = = > Е2.

Форма Е2 неактивна по отношению к специфическому низкомолекулярному субстрату АТЭЭ, но сохраняет протеолитическую активность по отношению г. белковому субстрату ОКА - Г^Г-Р-дикарбамидоэтилказеину, окрашенному п-сульфодиазобензолом.

1000

200

■

1

с I

— 2

Рис. 8. Кинетические кривые протеолиза белкового субстрата ОКА, катализируемой с - химотрипсином, находящимся в нативкой (кривая 1) и развернутой "высокотемпературной"

0 6 24

В отдельных экспериментах убеждались, что наблюдаемая активность не связана с присутствием форм Ех и Соотношение скоростей реакции с ОКА для форм Е} и Е2 составляет приблизительно 300 раз (рис. 8.), что по порядку величины сравнимо с замедлением реакции при переходе от Ь- к Б-форме модельного субстрата из-за полной потери специфичности (для а-химотрипсика около 1000 раз).

5. Регуляция термостабильности ферментов кзменепиек хаотроипых свойств среды. Согласно кинетической схеме 3, стабильность растворенного химсприпсина по отношению к необратимой термоинахтизации при высокой температуре должна коррелировать со

свойствами растворителя. Присутствие всаливающих солей облегчает связанный с раззорачиванием конфорччционньш переход < = = = > Е^, и, таким образом, способствует переходу фермента в конформацию более стабильную при повышенных температурах. Экспериментально это означало бы возрастание стабильности с усилением всаливающих свойств раствора, т. е. уменьшение Кцц в уравнении 4 за счет роста величины К.

Действительно, корреляция между стабильностью а-химотрипсина при высокой температуре и всаливающей силой раствора была установлена нами экспериментально (рис. 9).

КсС

зысаливакщае всалдвалцне системы

Рис. 9. Зависимость константы скорости необратимей термоинактивации кш я-химотрипсина при 76 °С, рН 8,0, от всаливающей силы раствора, выраженной в условных единицах параметра КгС уравнения Сеченова.

I - КоБсц, 2 - ко, з - (снз)4ка, 4 - ка + Сина,

5 - к2504 + (СН3)4На, 6 - КЗИС, 7 - (ктъ^со,

8 - СиНС1, 9 - КйМС + КчБОд, 10 - КЗМС + ОиНС1,

II - (С2Н5)4МВг, 12 - (СН^ЫЕг, 13 - НСОШг. М - С2К5ОН. Различные точки, обозначенные одинаковыми цифрами, относятся к разным концентрациям добавленных в раствор эффекторов.

В качестве меры всаливающей силы системы был выбран традиционный для химии растворов электролитов параметр - константа Кс уравнения Сеченова:

КсС = log So/S (6)

где S - растворимость модельного соединения в растворе соли к So - в чистой воде. Значения Kq для растворимости полшгепткда в растворах многих веществ были измерены Дженхсом с сотр. (Robinson, Jencks 1965, Nag', Jencks 1965).

Корреляция свидетельствует о том, что органические и неорганические "соли, классические денатураты, органические растворители, а также их смеси (рис. 10) воздействуют на стабильность фермента в строгом соответствии с величинами К^С в системе.

lg к i lg к

-0.5- 3 102 ! О ft° 1 \ i -0.5

; \ \ 4 5 6

-1.5 i \ О п п -1.5

0.3

КсС

-0.3

0.3

КсС

-0.3

ig к -0.5-

-1.5

0.3

О

КсС

-0.3

Рис. 10. Зависимость кии а-химагрипсина при 76 °С pH 8,0 от всаливающей силы раствора. 1 - K7SO4, 2 - (CHjkNCl,

3 - K2S04 + (CH3)4NC1,

4 - GuHCl, 5 - KSNC,

6 - KSNC + GuHCl, 7 - KCl,

8 - KCl + GuHCl,

9 - KSNC + K9SO4.

Наблюдаемая аддитивность воздействия эффекторов разной природы (рис. 10) позволяет сделать вывод о сходности механщмоз стабилизации химотрипсина изученными соединениями.

Всаливающие соли стабилизируют ферыенг, облегчая его переход в более, стабильную конформацию Е2. Достижение предела стабилизации з сильно гсаливающих растворах означасг, что зес±. фермелгг перешел в фопму ¿2 н инактивируется согласно процессу Е2 — >

О

О

Рис. 11. Схематичное изображение гипотетических механизмов инактивации по механизму неправильного сворачивания (верхняя часть рисунка) и стабилизации фермента:

1 - методом гидрофильной модификации поверхности,

2 - созданием сильновсаливающей снсга.сы,

3 - созданием высаливающей системы,

4 - методом ковалеигной иммобилизации.

На схеме: N - нативная конформация фермеггга, Б - развернутая "высокотемпературная" конформация, I - необратимо денатурированная форма белка.

на который концентрация соли не влияет. Таким процессом может быть более медленное химическое изменение первичной структуры: гидролиз пептидных и амидных связей, окисление аминокислотных остатков и т. п.

На химическую природу инактивационных процессов, идущих при высоких температурах, указывает и одинаковый небольшой наклон "высокотемпературных" ветвей Аррениусовских зависимостей кШ1 химотрипсина в растворах всаливающих солей (рис. 2). Эффективное значение энергии активации Еа процесса, который они описывают, составляет величину порядка 80-100 КДж/мсль. Именно такими величинами Еа и характеризуются химическая деструкция биополимеров, тогда как конформационные процессы характеризуются величиной Еа порядка 300^400 КДж/моль.

Наблюдаемый предел стабильности сходен с максимальным уровнем стабилшации, достигнутым методом химической модификации поверхности, что указывает на сходность механизмов стабилизации при использовании этих подходов. В обоих случаях фермент переводится в развернутую форму Е2,' защищенную от "неправильного" сворачивания или гидрофобными "поплавками" на поверхности, или лучшей гидратацией гидрофобных групп поверхности в хаотропных системах (рис. И).

В свою очередь, высаливающие соли незначительно стабилизируют фермент за счет усиления гидрофобных взаимодействий внутри белковой глобулы, находящейся в информации В их присутствии затруднены конформационные изменения, связанные с разворачиванием,в том числе и приводящие к необратимой инактивации (путь 3 на схеме 11). Такой способ стабилизации напоминает закрепление фермента в нативной информации при его г.овалентной иммобилизации (путь 4 на схеме II).

выводы.

1. Обнаружено, что зависимость константы скорости необратимой термоинактивации кин нативных (немодифицированных) с-химотрипсина и рибонуклеазы от температуры в координатах Аррениуса (/# «ид - при кислых значениях рН среды, а также в растворах хаотропкых вещестз имеет "пилообразный" характер: на кривой чередуются участки с положительными и отрицательными значениями энергии активации.

2. Нелинейные зависимости объяснены обратимым переходом натизной фермы фермента при повышенной температуре в более стабильную "высокотемпературную" информацию. Независимыми физико-химическими методами показано, что переход связан с разворачиванием белковой глобулы, и его температура линейно уменьшается с увеличением концентрации всаливающей соли.

3. Показано, что "высокотемпературная" конформация а-химотрипсина не обладает каталитической активностью по отношению к специфическому модельному субстрату, ко сохраняет протеолитичесхую ферментативную активность по отношению к приходному белковому субстрату.

4. Стабильность я-химстрипсгаа по отношению к необратимой термоинактивации при высокой температуре коррелирует с параметром К^С уравнения Сеченова как мерой хаотропных сзойсгз среды. Корреляция объяснена влиянием растворенных веществ н? информационнее равновесие между двумя формами фермента, различающимися по стабильности. Вещества разной природы, а именно, органические и неорганические соли, классические денатуранты, органические растворители, а также их смеси, воздействуют на фермент аддитивно и в строгом соотз'ггегзни с величинам!! папаметра ¡С-С.

5. Продемонстрирована .возможность регуляции стабильности фермента целенаправленным изменением хаотропных сеойстз соеды. Достигнутые для а-химотрипсина стабплкзациог.ные эффекты (сотни раз) сравнимы с допчжямымп .методом ковплентной химической модификации :' иммобилизации фермента.

Основные результаты диссертация изложены в следующих работах:

1. Мелик-Нубаров"Н. С, Слепнев В. К, Левицкий В. Ю, Можаев В.

В. Аномальная температурная зависимость стабильности препаратов а-химотрипсина, модифицированных восстановительным алкилированием. . - Причина повышенной стабильности белка при высоких температурах.// Тезисы докладов VI Всесоюзного симпозиума по инженерной этимологии. Каунас. 1988. С. 3L

2. Levitsky V. Yu, Mozhaev V. V. Regulation of enzyme thermostability

by "medium engineering".// Proc. 20^ FEBS Meeting. Budapest, ' Hungary. 1990. P. 180.

3. Левицкий В. Ю, Панова А. А, Можаев В. В. Стабилизация ферментов за счет изменения состава среды: а-химотрипсин в растворах солей.// Тезисы докладов Всесоюзной конференции по методам получения, анализа и применения ферментов НПО "Биолар". Рига. 1990. С. 119.

4. Шикшнис В. А, Галкаптайте Н. 3, Мелик-Нубаров Н. С, Левицкий

В. Ю, Слепнев В. И, Можаев В. В. Необычная (пилообразная) температурная зависимость скорости необратимой термоинактиващш ферментов.// Биохимия. 1990. Т. 55. С. 13471355.

5. Левицкий В. Ю, Мелик-Нубаров Н. С, Слепнев В. И., Шикшнис В.

А, Можаев В. В.// Регуляция термостабильности ферментов изменением состава среды. Нативный и модифицированный а-химотрнпсин.// Молекулярная Биология. 1990. Т. 24. С 1245-1254.

6. Levitsky V. Yu, Mozhaev V. V. Operating thermostability of chyrnotrypsm by "medium engineering".// Proc. Int. Conference of Young Scientists on Organic and Biological Chemistry. Varna, • Bulgaria. 1990. P. 22-4.

7. Левицкий В. Ю, Панова А. А, Можаев В. В. Коредляция между

стабильностью а-химотрипсина при высоких ■ температурах и "всаливающей" силой водно-солевого раствора.// Тезисы докладов VII Всесоюзного симпозиума по инженерной энзимологии. Москва. 1991. С 53.

8. Mozhaev V. V, Melik-Nubarov N, S, Siksnis V. A, Levitsky V, Yu.

High stability to irreversible inactivation at elevated temperatures of

enzymes covalently modified by hydrophilic reagents: a-chymotrypsin.// Biotech. Bioengin. 1992. in press. 9.! Левицкий В. Ю, Панова А. А, Можаев В. В. Корелляция между стабильностью а-химотрипсина при высоких температурах и "всаливающей" силой водно-солевого раствора.// Биохимия. 1992. в печати.