Влияние стимул-чувствительной полимерной матрицы на кинетические свойства иммобилизованного α-химотрипсина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.8

1.1. Фазовый переход в стимул-чувствительных полимерах.

1.1.1. Изменение системы взаимодействий и степени гидратации при фазовом переходе в поли-ГЧ-изопропилакриламиде.

1.1.2. Теоретическое описание фазового перехода в стимул-чувствительных гелях.

1.1.3. Фазовый переход в поли-НИПАА в водно-органических смесях.

1.1.4. Гидрофобные взаимодействия поли-НИПАА с различными соединениями при фазовом переходе в полимере.

1.1.5.Особенности кинетического поведения ферментов, связанных с термочувствительными полимерами.

1.2. Ферменты в водно-органических смесях.

1.2.1. Влияние органического растворителя на спектральные свойства белков.

1.2.2. Влияние органического растворителя на наблюдаемую кинетику ферментативных реакций.

1.2.2.1. Влияние органического растворителя на величину Кт.

1.2.2.2. Влияние органического растворителя на величину к^.

1.2.3. Концепция низко-барьерных водородных связей в применении к функционированию сериновых протеиназ в водно-органических смесях.

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.65

2.1. Исходные вещества.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Определение концентрации активных центров а-химотрипсина.

2.2.2. Определение активности а-химотрипсина и трипсина.

2.2.3. Определение коэффициентов экстинкции п-нитроанилина и п-нитрофенола в водно-органических смесях.

2.2.4. Определение параметров ферментативного гидролиза.

2.2.5. Синтез иммобилизованных препаратов а-химотрипсина и трипсина.

2.2.6. Приготовление суспензии геля.

2.2.7. Подведение материального баланса при иммобилизации а-химотрипсина

2.2.8. Изучение степени набухания ферментсодержащих препаратов поли-НИПАА и поли-АА-гелей.

2.2.9. Изучение стабильности иммобилизованного а-химотрипсина.

2.2.10. Изучение циклической работы поли-НИПАА-препаратов а-химотрипсина

Глава 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.84

3.1. Некоторые характеристики фермент-содержащих полимерных матриц.

3.1.1. Зависимость степени набухания матриц от концентрации ДМСО в смеси и температуры.

3.1.2. Кинетические свойства иммобилизованных препаратов а-химотрипсина.

3.2. Влияние фазового перехода поли-НИПАА-матрицы на кинетику действия иммобилизованного а-химотрипсина.

3.2.1. Влияние температуры на гидролиз различных субстратов а-химотрипсином, иммобилизованным в поли-НИПАА-гель.

3.2.2. Кинетическое поведение нативных ферментов в водно-органических смесях

3.2.3. Кинетическое поведение иммобилизованных ферментов в смесях вода-ДМСО.

3.2.4. Совместное влияние температуры и ДМСО на кинетику действия нативного и иммобилизованного в поли-НИПАА-матрицу а-химотрипсина.

3.3. Формально-кинетическое описание гидролиза а-химотрипсином N-ацетил-замещенных субстратов в водно-органических смесях.

3.4. Применение концепции низко-барьерных водородных связей к функционированию нативных и иммобилизованных ферментов в водно-органических смесях.

ВЫВОДЫ.

В последнее время большой интерес исследователей вызывают так называемые «умные», или стимул-чувствительные системы, способные обратимо изменять свою структуру и свойства в ответ на действие внешнего стимула. Одним из примеров таких систем являются полимерные гидрогели, синтезированные на основе №замещенных аклкилакриламидов. Такие гели способны претерпевать обратимый фазовый переход при изменении физических или химических параметров среды. Фазовый переход сопровождается уменьшением степени гидратации (коллапсом) полимерной сетки. Движущей силой этого процесса является изменение энергетического баланса взаимодействий между полимером и растворителем (в определенных условиях контакты полимер-полимер становятся более энергетически выгодными, чем контакты полимер-растворитель).

Иммобилизация ферментов в стимул-чувствительные гели приводит к получению препаратов, кинетика действия которых зависит от состояния полимерной матрицы. Например, при температурном коллапсе поли-1Ч-изопропилакриламида наблюдается понижение активности иммобилизованных в гель гидролаз с ростом температуры. Несмотря на то, что механизм влияния полимерной матрицы на кинетику действия иммобилизованных ферментов остается до конца невыясненным, сама возможность регуляции активности биокатализатора путем изменения состояния матрицы выглядит весьма привлекательной с прикладной точки зрения. Перспективным применением подобных систем могут быть, например, ферментные реакторы, «включающиеся» или «выключающиеся» под действием какого-либо сигнала (свет, температура, состав среды и т.д.) Очевидно, что во всех случаях необходимо знать закономерности, управляющие кинетикой и механизмом действия биокатализатора в окружении, изменяющем свои свойства. Следовательно, существует необходимость изучения взаимосвязи между состоянием стимул-чувствительной матрицы и активностью иммобилизованного фермента.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы явилось выявление механизма влияния стимул-чувствительной поли-К-изопропилакриламилной (поли-НИПАА) матрицы на кинетические свойства иммобилизованного в ней а-химотрипсина. Были поставлены следующие задачи:

• изучение кинетики действия иммобилизованного а-химотрипсина в реакциях гидролиза различных субстратов в условиях коллапса поли-НИПАА-матрицы, вызываемом увеличением концентрации диметилсульфоксида (ДМСО) в системе и (или) повышением температуры;

• исследование кинетического поведения нативного а-химотрипсина в водно-органических смесях (вода-ДМСО и вода-этанол), а также фермента, иммобилизованного в неколлапсирующую поли-акриламидную (поли-АА) матрицу, при увеличении температуры и (или) концентрации ДМСО в смеси;

• проведение сравнительного анализа экспериментальных данных по кинетике гидролиза различных субстратов нативным а-химотрипсином и его иммобилизованными препаратами в различных условиях.

выводы.

1. Исследовано влияние стимул-чувствительной поли-НИПАА-матрицы в смесях вода -ДМСО на кинетику гидролиза иммобилизованным а-химотрипсином различных синтетических субстратов - И-замещенных производных Ь-тирозина. Показано, что кинетические проявления влияния матрицы на фермент зависят от структуры гидролизуемого субстрата.

2. Продемонстрировано, что кинетические закономерности для а-химотрипсина, ковалентно иммобилизованного в поли-НИПАА-гель, в смесях вода-ДМСО сходны с закономерностями, полученными для нативного фермента. Установлено, что при использовании в качестве субстратов И-ацетил-замещенных производных Ь-тирозина наблюдаемый кинетический эффект определяется взаимодействием полимерных цепей гидрофобизующейся поли-НИПАА-матрицы и (или) органического растворителя в Б2-сайте сорбционного центра а-химотрипсина.

3. Сопоставление экспериментальных данных позволяет предположить, что изменение кинетической картины при гидролизе И-ацетил-замещенных субстратов как нативным а-химотрипсином, так и а-химотрипсином, иммобилизованным в поли-НИПАА-матрицу, связано, по-видимому, с изменением конформации активного центра фермента. Связывание Ы-бензоильной группы субстрата в 82-сайте фермента, равно как закрепление структуры а-химотрипсина путем иммобилизации в неколлапсирующий поли-акриламидный гель стабилизирует конформацию активного центра.

4. Предложена кинетическая схема, описывающая гидролиз Ы-ацетил-замещенных производных Ь-тирозина, предполагающая, что взаимодействие органического растворителя и (или) гидрофобизующейся поли-НИПАА-матрицы с 82-сайтом а-химотрипсина приводит к увеличению скорости ацилирования и замедлению

1. Amya, T., Tanaka T. Coil-globula transition in polymer. Macromolecules, 1987, V.20, p.l 162-1164.

2. Li Y., Tanaka T. Phase transitions of gels. Ann.Rew.Mater.Sci., 1992, V.22, p.243-277.

3. Taylor L., Ceranokowski L.D. Preparation of films exhibiting a balanced temperature dependence of permeation by aqueous solutions a study of lower cosolute behaviuor. J. Polym.Sci., Polymer Chemistry Edition, 1975, V.13, p.2551-2570.

4. Тагер A.A., Сафронов А.П., Шарина C.B., Галаев И.Ю. Термодинамика водных растворов поливиншкапролактама. ВМС, 1990, т.32, N.3, с.529-534.

5. Шерстюк С.Ф., Галаев И.Ю., Савицкий А.П., Кирш Ю.Ф., Березин И.В. Поливинилкапролактам обратимо осаждаемый термополимер. Соосаждение белков. Биотехнология, 1987, т.З, N.2, с.179-183.

6. Home R.A., Almeida J.P., Day A.F., Yu N.-T. Macromolecule hydratation and the effect of solutes on the cloud point of aqueous solutions of poly(vinyl-methyl) ether. J.Coll.Imterface Sci., 1971, V.35, p.77-85.

7. Bae Y.C., Lambert S.M., Soane D.S., Prausnitz J.M. Cloud point curves of polymer solutions from thermooptical measurements. Macromolecules, 1990, V.24, p.4403-4407.

8. Будтов В.П. Физическая химия растворов полимеров. С.-Пб.: Химия, 1992, с.53.

9. Karlstrom G. A new model for upper and lower critical solution temperatures in poly(ethyleneoxide) solutions. J.Phys.Chem., 1985, V.89, N.23, p.4962-4964.

10. Nishio I., Swislow G., Sun S.-T., Tanaka T. Nature, 1982, V.300, p.243-244.1 l.Swislow G., Sun S.-T., Nishio I., Tanaka T. Phys.Rew.Lett., 1980, V.44, p.796-798.

11. Kokofuta E. Novel applications for stimulus-sensitive polymer gels in the preparation of functional immobilized biocatalysts. in Responsive Gels: Volume phase transitions II (Dusek, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin: 1993, pp.159-177.

12. Hirotsu Sh. Phase transition of a polymer gel in pure and mixed solvent media.

13. J.Phys.Soc.Jpn., 1987, V.56, N.l, p.233-242. 14.Suetoh Y., Shybayama M., Effects of non-uniform solvation on thermal response in poly(N-isopropylacrylamide) gels. Polymer, 2000, V.41, p.505-510.

14. Maeda Y.,Higuchi T., Ikeda I. Change in hydration state during the coil-globule transition of aqueous solutions of poly(N-isopropylacrylamide) as evidence by FTIR spectroscopy. Langmuir, 2000, V.16, p.7503-7509.

15. Lin Sh.Y., Chen K.-S., Run-Chu L. Thermal micro ATR/FT-IR spectroscopic system for quantitative study of the molecular structure of poly(N-isopropylacrylamide) in water. Polymer, 1999, V.40, p.2619-2624.

16. Shibayama M., Mizutani Sh., Nomura Sh. Thermal properties of copolymer gels containing

17. Inomata H., Goto Sh., Saito Sh. Phase transition of N-substituted acrylamide gels.

18. Macromolecules, 1990, V.23, p.4887-4888. 20.1wai K., Hanasaki K., Yamamoto M. Fluorescencce label studies of thermo-responsive poly-(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J.Luminescence, 2000, V.87-89, p.1289-1291.

19. Chee C.K., Rimmer S., Soutar I., Swanson L. Fluorescence investigations of the thermally induced conformational transition of poly (N-isopropylacrylamide). Polymer, 2001, V.42, p.5079-5087.

20. Ito K., Ujihira Y., Yamashita T., Hone K. Change in free volume during phase transition of poly(N-isopropylacrylamide) gel as studied by positron annihilation lifetimes: temperature dependence. Polymer, 1999, V.40, p.4315-4323.

21. Lele A.K., Hirve M.M., Badiger M.V., Mashelkar R.A. Predictions of bound water content in poly(N-isopropylacrylamide) gel. Macromolecules, 1997, V.30, p. 157-159.

22. Tanaka N., Matsukawa Sh., Kurosu H., Ando I. A study on dynamics of water in cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gel by NMR-spectroscopy. Polymer, 1998, Y.39, N.20, p.4703-4706.

23. Ganapathy S., Rajamohanan P.R., Badiger M.V., Mandhare A.B., Mashelkar R.A. Proton magnetic resonance imaging in hydrogels: volume phase transition in poly(N-isopropylacrylamide). Polymer, 2000, V.41, p.4543-4547.

24. Dusek K., Patterson D. Transition in swollen polymer networks induced by intramolecular condensation. J.Polym.Sci., 1968, V.6, p. 1209-1216.

25. Flory P.J. Principles of polymer chemistry. Cornell Univ. Press, Ithaca, New-York, 1953, 576p.

26. Tanaka T., Fillmore D., Sun S.-T., Nishio I., Swislow G., Shah A. Phase transition in ionic gels. Phys.Rew.Lett., 1980, V.45, p.1636-1639.

27. Li Y., Tanaka T. J.Chem.Phys.1989, V.90, p.5161-5166.31.0take K., Inomata H., Konno M., Saito Sh. A new model for the thermally induces volume phase transition of gels. J.Chem.Phys., 1989, V.91, N.2, p.1345-1350.

28. Nemethy G., ScheragaH.A. J.Chem.Phys., 1962, V.36, p.3382-3401.

29. Hirokawa Y., Tanaka T. Volume phase transition in a nonionic gel. J.Chem.Phys., 1984, V.81, N.12, p.6379-6380.

30. Katayama S., Horokawa Y., Tanaka T. Reentrant phase transition in acrylamide-derivative copolymer gels. Macromolecules, 1984, V.17, N.12, p.2657-2663.

31. Lele A.K., Badiger M.V., Hirve M.M., Mashelkar R.A. Chem.Eng.Sci., 1995, V.50, p.3535.

32. Hirotsu Sh. Phase transition of a polymer gel in pure and mixed solvent media. J.Phys.Soc.Jpn., 1987, V.56, N.l, p.233-242.

33. Amya T., Hirokawa Y., Hirose Y., Li Y., Tanaka T. Reentrant phase transition of N-isopropyl acryl amide gels in mixed solvents. J.Chem.Phys., 1987, V.86, N.4, p.2375-2379.

34. Hirotsu Sh. Critical points of volume phase transition in N-isopropylacrylamide gels. J.Chem.Phys., 1988, V.88, N.l, p.427-431.

35. Winnik F., Ringsdorf H., Venzmer J. Methanol-water as a co-nonsolvent system for poly(N-isopropylacrylamide). Macromolecules, 1990, V.23, p.2415-2416.

36. Winnik F., Ottaviami M.F., Bosmann S.H., Pan W., Garcia-Garibay M., Turro NJ. Cononsolvency of poly (N-isopropylacrylamide): a look at spin-labeled polymers in mixtures of water and tetrahydrofuran. Macromolecules, 1993, V.26, p.4577-4585.

37. Winnik F., Ottaviami M.F., Bosmann S.H., Pan W., Garcia-Garibay M., Turro N.J. Cononsolvency of poly(N-isopropylacrylamide) in mixed water-methanol solutions: a look at spin-labeled polymers. Macromolecules, 1992, V.25, p.6007-6017.

38. Asano M., Winnik F.M., Yamashita T., Horie K. Fluorescense studies of dansyl-labeled poly(N-isopropylacrylamide)gels and polymers in mixed water/methanol solutions. Macromolecules, 1995, V.28, p.5861-5866.

39. Durand A., Hourdet D. Thermoassociative graft copolymers based on poly(N-isopropylacrylamide): effect of added co-solutes on the rheological behaviour. Polymer, 2000, V.41, p.545-557.

40. Zhu P.W., Napper D.H. Volume phase transitions of poly(N-isopropylacrylamide) latex particles in mixed water-N,N-dimethylformamide solutions. Chem.Phys.Lett., 1996, V.256, p.51-56.

41. Zhou Sh., Fan Sh., Steve C.F.A., Wu C. Light-scattering studies of poly(N-isopropylacrylamide) in tetrahydrofuran and aqueous solution. Polymer, 1995, V.36, p. 13411346.

42. Liang L., Rielke P.C., Fryxell G.E., Young J.S., Engelhard M.H., Alford K.L. Surfaces with reversible hyrophilic/hydrophobic characteristics on cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Langmuir, 2000, V.16, p.8016-8023.

43. Takei Y.G., Aoki T., Sanui K., Ogata N., Sakurai Y., Okano T. Dynamic contact angle measurement of temperature-responsive surface properties for poly(N-isopropylacrylamide) grafted surfaces. Macromolecules, 1994, V.27, p.6163-6166.

44. Wada N.s Kajima Y., Yagi Y., Inomata H., Saito S. Effect of surfactant on the phase transition ofN-alkylamidegels. Langmuir, 1993, V.9, p.46-49.

45. Go H., Sudo Y., Hosoya K., Ikegami T., Tanaka N. Effects of mobile-phase composition and temperature on the selectivity of poly(N-isopropylacrylamide)-bonded silica gel in reversed-phase liqiud chromatography. Anal.Chem., 1999, V.70, p.4086-4093.

46. Hosoya K., Kimata K., Araki T., Tanaka N., Frechet J.M. Temperature-controlled highperformance liqiud chromatography using a informly sized temperature-responsive polymer-based packing material. Anal.Chem., 1995, V.67,p.l907-1911.

47. Kanasawa H., Yamamoto K., Matsushima Y., Takai N., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Temperature-responsive chromatography using poly(N-isopropylacrylamide)-modified silica. Anal.Chem., 1996, V.68, p.100-105.

48. Kanasawa H., Kashiwase Y., Yamamoto K., Matsushima Y., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Temperature-responsive chromatography. 2. Effects of hydrophobic groups in N-isopropylacrylamide copolymer modified silica. Anal.Chem., 1997, V.69, p.823-830.

49. Kanasawa H., Matsushima Y., Okano T. Temperature-responsive chromatigraphy. Trends in Anal.Chem., 1998, V.17, N.7, p.435-440.

50. Ivanov A.E., Zhigis L.S., Kurganova E.V., Zubov V.P. Effect of temperature upon the chromatography of proteins on porous glass? chemically coated with N-isopropylacrylamide copolymer. J.Chromatogr.A, 1997, V.776, p.75-80.

51. Stayton P.S., Shimboji Т., Long C., Chilkoti A., Chen G., Harris J.M., Hoffman A.S. Control of protein-ligand recognition using a stimuli-responsive polymer. Nature, 1995, V.378, p.472-474.

52. Ding Zh., Long C.J., Hayashi Y., Bulmus E.V., Hoffman A.S., Stayton P.S. Temperature control of biotin binding and release with a streptavidin-poly(N-isopropylacrylamide) site-specific conjugate. Bioconjug.Chem., 1999, V.10, p.395-400.

53. Марквичева E.A., Бронин A.C., Кудрявцева H.E., Кузькина И.Ф., Пашкин И.И., Кирш Ю.Э., Румш Л.Д., Зубов В.П. Новый метод иммобилизации протеолитических ферментов в полимерных гидрогелях. Биоорг.Хим., 1994, Т.20, N.3, с.257-262.

54. Markvicheva Е.А., Bronin A.S., Kudryavtseva N.E., Rumsh L.D., Kirsh Yu.E., Zuboj/v.P. У Immobilization of proteases in composite hydrogel based on poly(N-vinylcaprolactam). Biotechnol.Techn., 1994, V.8, N.3, p. 143-148.

55. Кирш Ю.Э., Галаев И.Ю., Карапутадзе T.M., Марголин A.JI., Швядас В.К. Термоосаждаемые конъюгаты поливинилкапролактам-фермент. Биотехнология, 1987, T.3,N.2, с.104-108.

56. Matsukata М., Aoki Т., Sanui К., Ogata N., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Effect of molecular architecture of poly(N-isopropylacrylamide)-trypsin conjugates on their solution and enzymatic properties. Biocong.Chem., 1996, V.7, p.96-101.

57. Chen G., Hoffman A.S. Preparation and properties of theroreversible, phase-separating enzyme-oligo(N-isopropylacrylamide) conjugates. Biocong.Chem., 1993, V.4, p.509-514.

58. Chen J.-P., Hsu M.-Sh. Preparations and properties of temperature-sensitive poly(N-isopropylacrylamide)-chymotrypsin conjugates. J.Mol.Catalysis B:Enz., 1997, V.2, p.233-241.

59. Валуев Л.И., Земфирова O.H., Обыденнова И.В., Платэ Н.А. Водорастворимые полимеры с нижней критической температурой смешения для направленного транспорта лекарственных препаратов и других веществ. Высокомол.Соедин., 1993, Т.35, с.83-86.

60. Matsukata М., Takei Y., Aoki Т., Sanui К., Ogata N., Sakurai Y., Okano T. Temperature modulated solubility-activity alterations for poly(N-isopropylacrylamide)-lipase conjugates. J.Biochem., 1994, V.l 16, p.682-686.

61. Lee H., Park T.G. Conjugation of trypsin by temperature-sensitive polymers containing a carbohydrate moiety: thermal modulation of enzyme activity. Biotechnol.Prog., 1998, V.14, p.508-516.

62. Kim H.K., Park T.G. Synthesis and characterization of thermally reversible bioconjugates composed of a-chymotrypsin and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamido-2-deoxy-D-glucose). Enz.Microb.Technol., 1999, V.25, p.31-37.

63. Dong L.C., Hoffman A.S. Thermally reversible hydrogels. 3. Immobolization of enzymes for feedback reaction control. J.Control.Release, 1986, V.4, p.223-227.

64. Hoffman A.S. Application of thermally reversible polymers and hydrogels in therapeutics and diagnostics. J.Control.Release, 1987, V.7, p.297-305.

65. Monji N., Hoffman A.S. A novel immunoassay system and bioseparation process based on thermal phase separating polymers. Appl.Biochem.Biotechn., 1987, V.14, p.107-120.

66. Park T.G., Hoffman A.S. Immobilization and characterization of fi-galactosidase in thermally reversible hydrogels beads. J.Biomed.Mat.Res., 1990, V.24, p.21-38.

67. Park T.G., Hoffman A.S. Effect of temperature cycling on the activity and productivity of immobilized P~galactosidase in thermally reversible hydrogel bead reactor. Appl.Biochem.Biotechn., 1988, V.19, p. 1-9.

68. Cicek H., Tuncel A. Immobilization of a-chymotrypsin in thermally reversible isopropylacrylamide-hydroxyethylmethacrylate copolymer gel. J.Polym.Sci. Part A:Polymer Chemistry, 1998, V.36. p.543-552.

69. Tuncel A. An engineering analysis for the continuous reactor behavior of a-chymotrypsin-immobilized thermosensitive gel cylinders. J.Biotechnol., 1998, V.63, p.41-54.

70. Еремеев H.JI., Сиголаева Л.В., Казанская Н.Ф. Формально-кинетическое описание температурного поведения а-химотрипсина, включенного в N-изопропилакриламидный гель. Вестн.МГУ.Сер.Хим., 1992, Т.ЗЗ, с.511-515.

71. Сиголаева Л.В., Еремеев Н.Л., Казанская Н.Ф. Влияние коллапса матрицы на активность иммобилизованного а-химотрипсина. Биотехнология, 1993,N.5,c.36-40.

72. Еремеев Н.Л., Сиголаева Л.В., Казанская Н.Ф. Аномальная температурная зависимость активности препаратов иммобилизованного а-химотрипсина. Биоорг.Хим., 1994, Т.20, с.268-273.

73. Еремеев Н.Л., Сиголаева Л.В., Симаков П.А., Казанская Н.Ф. Температурное поведение равновесных и кинетических констант ферментативных реакций при фазовом переходе в термочувствительной матрице. Биохимия, 1995, Т.60, с.991-999.

74. Кухтин А.В., Еремеев Н.Л., Беляева Е.А., Казанская Н.Ф. Взаимосвязь между состоянием термочувствительной матрицы и активностью иммобилизованной в ней уреазы. Биохимия, 1997, т.62, N.4, с.437-443.

75. Eremeev N.L., Kuhtin A.V. Stimuli-sensitive hydrogel material for biosensor-chemical trigger. Anal.Chim.Acta, 1997, V.347, p.27-34.

76. Eremeev N.L., Kuhtin A.V., Kazanskaya N.F. Enzyme-dependent responses of stimulisensitive systems. BioSystems, 1998, V.45, p.141-149.

77. Eremeev N.L., Kuhtin A.V., Belyaeva E.A., Kazanskaya N.F. Effect of thermosensitive matrix phase-transition on urease-catalyzed urea hydrolysis. Appl.Biochem.Biotechnol., 1999, V.76, p.45-55.

78. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. Москва: Высшая школа, 1998,478 с.

79. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структурной организации белков. Москва: Мир, 1982, 354 с.

80. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. Биохимия, 1998, t.63,N.3, с.408-421.

81. Белова А.Б., Можае В.В., Левашов А.В., Сергеева М.В., Мартинек К., Хмельницкий Ю.Л. Взаимосвязь физико-химических характеристик органических растворителей с их денатурирующей способностью по отношению к белкам. Биохимия, 1991, т.56, N.11, с.1923-1945.

82. Guinn R.M., Blanch H.W., Clark D.S. Effect of a water-miscible organic solvent on the kinetic and structural properties of trypsin. Enz.Microb.Technol., 1991, V.13, p.320-326.

83. Timasheff S.N. Protein-solvent interactions and protein conformation. Acc.Chem.Res., 1970, V.3, N.l, p.62-68.

84. Herskovits T.T., Gadegbeku B., Jaillet H. On the structural stability and solvent denaturation of proteins. J.Biol.Chem., 1970, V.245, N.10, p.2588-2598.

85. Herskovits T.T., Jaillet H. Structural stability and solvent denaturation of myoglobin. Science, 1969, V.163, p.282-285.

86. Herskovits T.T., Behrens C.F., Siuta P.B., Pandolfelli E.R. Solvent denaturation of globular protein. Unfolging by the monoalkyl- and dialkyl-substituted formamides and ureas. Biochim.Biophys.Acta, 1977, V.490, p. 192-199.

87. Simon L.M., Kotorman M., Garab G., Laczko I. Structure and activity of a-chymotrypsin and trypsin in aqueous-organic media. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2001, V.280, p.1367-1371.

88. Mares-Guia M., Figueiredo A.F. Trypsin-organic solvent interactions. The simultaneous operation of competative inhibition and dielectric effect. Biochemistry, 1972, V.ll, N.ll, p.2091-2098.

89. Rosell C.M., Vaidya A.M., Hailing P J. Prediction of denaturing tendency of organic solvents in mixtures with water by measurement of naphtalene solubility. Biochim.Biophys.Acta, 1995, V.1252, p.158-164.

90. Gekko K., Onmae E., Kameyama K., Takagi T. Acetonitrile-protein interactions: amino acids solubility and preferential solvation. Biochim.Biophys.Acta, 1998, V.1387, p. 195-205.

91. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamics and quantium mechanics analysis of the effect of DMSO on enzyme structure and dynamics: subtilisin. J.Am.Chem.Soc., 1996, 118, 4175-4180.

92. Kijima Т., Yamamoto Sh., Kise H. Study on tryptophan fluorescense and catalytic activity of a-chymotrypsin in aqueous-organic media. Enz.Microb.Technol., 1996, V.18, p.2-6.

93. Fernandez M.M., Clark D.S., Blanch H.W. Papain kinetics in the presence of a water-miscible organic solvent. Biotechnol.Bioeng., 1991, V.37, p.967-972.

94. Griebenow K., Klibanov A.M. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure ogranic solvent. J.Am.Chem.Soc., 1996, V.47, p. 11695-11700.

95. Simon L.M., Kotorman M., Garab G., Laczko I. Structure and activity of a-chymotrypsin and trypsin in aqueous-organic media. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2001, V.280, p.1367-1371.

96. Шевченко А. А., Кост О. А. Метод расчета доступности растворителю ароматических аминокислотных остатков белков в водно-органических смесях. Биохимия, 1996, т.61, N.12, с.2092-2098.

97. Клячко H.JI., Богданова Н.Г., Кольтовер В.К., Мартинек К., Левашов А.В. Взаимосвязь активности и конформационной подвижности а-химотрипсина в системах обращенных мицелл. Биохимия, 1989,Т.54, N.7, с.1224-1230.

98. Kidd R.S., Sears P., Huang D.H., Witte К., Wong C.H., Farber G.K. Breaking the low barrier hydrogen bond in a serine protease. Protein Sci., 1999, Y.8, N.2, p.410-417.

99. Deschrevel В., Vincent J.C., Thellier M. Kinetic study of the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis and synthesis of a peptide bond in a monophasic aqueous/organic reaction medium. Arch.Biochem.Biophys., 1993, V.304, N.l, p.45-52.

100. Tanizawa K., Bender M.L. The application of insolubilized a-chymotrypsin to kinetic studies on the effect of aprotic dipolar organic solvents. J.Biol.Chem., 1974, V.249, N.7, p.2130-2134.

101. Faller L, Sturtevant J.M. The kinetics of the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl acetate in organic solvent-water mixtures. J.Biol.Chem., 1966, V.241, N.21, p.4825-4834.

102. Maurel P. Relevance of dielectric constant and solvent hydrophobicity to the organic solvent effect in enzymology. J.Biol.Chem., 1978, V.253, N.5, p.1677-1683.

103. Пб.Мосолов B.B., Соколова E.B. Взаимодействие гликолем и глицерина с активным центром трипсина и химотрипсина. Докл.Акад.Наук, 1972, Т.207, N.l, С.228-231.

104. Fink A.L. Effect of dimethyl sulfoxide on the interaction ofproflavine with a-chymotrypsin. Biochemistry, 1974, V.13, N.2, p.277-280.

105. Clement G.E., Bender M.L. The effect of aprotic dipolar organic solvents on the kinetics of a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis. Biochemistry, 1963, V.2, N.4, p.836-843.

106. Kassera H.P., Laidler K.J. Transient-phase studies of a trypsin-catalyzed reaction. CanJ.Chem., 1970, V.48, N.l 2, p.l 793-1802.

107. Seydoux F., Yon J. Competition nucleophile dans les reactions d'hydrolyse enzymatique. Analyse et application a I'hydrolyse trypsique de quelques esters. Eur.J.Biochem., 1967, V.3, p.42-56.

108. Mao Q., Walde P. Substrate effects on the enzymatic activity of a-chymotrypsin in reverse micelles. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1991, V.178, N.3, p.l 105-1112.

109. Simon L.M., Laszlo K., Vertesi A., Bagi K., Szajani B. Stability of hydrolytic enzymes in water-organic solvent system. J.Mol.CatalysisB:Enz., 1998, V.4, p.41-45.

110. Kuptsova S.V., Markvicheva E.A., Kochetkov K.K., BelokonYu.A., Rumsh L.D., Zubov V.P. Proteases entrapped in hydrogels based on poly(N-vinyl caprolactam) as promising biocatalysts in water/organic systems. Biocat.Biotransform., 2000, V.18, p. 133-149.

111. Markvicheva E.A., Tkachuk N.E., Kuptsova S.V., Dugina T.N., Strukova S.M., Kirsh Yu.E., Zubov V.P., Rumsh L.D. Stabilization of proteases by entrapment in a new composite hydrogel. Appl.Biochem.Biotechnol., 1996, V.61, N.l, p.75-84.

112. Kise H., Tomiuchi Y. Unusual solvent effect on protease activity and effective optical resolution of amino acids by hydrolytic reactions in organic solvents. Biotechnol.Lett., 1991, V. 13, N.5,p.317-322.

113. Miles J.L., Morey E., Crain F., Gross S., San Julian J., Canady W.J. Inhibition of a-chymotrypsin by diethyl ether and certain alcohols: a new type of competitive inhibition. J.Biol.Chem„ 1962, V.237, N.4, p. 1319-1322.

114. Stein B.R., Laidler K.J. Kinetics of the inhibition of a-chymotrypsin by methanol andDFP. CanJ.Chem., 1959, V.37, p.1272-1277.

115. Tomiuchi Y., Ohishima K., Kise H. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. XVII. Optical resolution of amino acids esters by enzymatic hydrolysis in organic solvents. Bull.Chem.Soc.Jpn., 1992, V.65, p.2599-2603.

116. Salvador D., Sinisterra J.V., Guisan J.M. Organic reactions catalyzed by insolubilized enzymes; peptide synthesis catalyzed by insolubilized a-chymotrypsin. J.Mol.Catalysis, 1990, Y.62, p.93-105.

117. Seydoux F., Yon J., Nemethy G. Hydrophobic interactions of some alcohols with acyl trypsins. Biochim.Biophys.Acta, 1969, V. 171, N.l, p. 145-156.

118. Seydoux F. Mise en evidence cinefique d'une transesterification au cours de I'hydrolyse trypsique de I'ester ethylique de la lysine en presence de divers alcools. BiochimBiophys.Acta, 1967, V.149, p.544-552.

119. Colleti-Preveiro M.A., Preveiro A., Zuckerkandl E. Separation of the proteolytic and esterasic activity of trypsin by reversible structural modifications. J.Mol.Biol., 1969, V.39, p.493-501.

120. Bender M.L., Clement G.E., Gunter C.R. The kinetics of a-chymotrypsin reactions in the presence of added nucleophiles. J.Am.Chem.Soc., 1964, V.86, p.3697-3603.

121. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977, 270 с.

122. Berezin I.V., Kazanskaya N.F., Klesov А.А. Determination of the individual rate constants of a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis with the added nucleophilic agent, 1,4-butanediol. FEBS Letters, 1971, V.15, p.121-124.

123. Березин И.В., Казанская Н.Ф., Клесов А А. Кинетика реакций гидролиза, катализируемых а-химотрипсином и трипсином в присутствии дополнительных нуклеофильных агентов. Биохимия, 1971, Т.36, N.1, с.108-117.

124. Frey Р.А., Whitt S.A., Tobin J.B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. Science, 1994, V.264, p.1927-1930.

125. Markley J.L., Westler W.M. Protonation-state dependence fo hydrogen bond strengths and exchange rates in a serine proteases catalytic triads: bovine chymotrypsinogen A. Biochemistry, 1996, V.35, p.l 1092-11097.

126. CassidyC.S., Lin J., Frey P.A. The deuterium isotope effect on the NMR signal of the low-barrier hydrogen bond in a transition-state analog complex of chymotrypsin. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2000, V.273, p.789-792.

127. Cleland W.W. Low-barrier hydrogen bonds and low fractionation factor bases in enzymatic reactions. Biochemistry, 1992, V.31, p.317-319.

128. Cleland W.W., Kreevoy M.M. Low-barrier hydrogen bonds and enzymic catalysis. Science, 1994, V.264, p.1887-1890.

129. Ash E., Sudmeier J.L., De Fabo E.C., Bachovchin W.W. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases? Theory versus experiment. Science, 1997,V.278, p.l 1281130.

130. Warshel A., Papazyan A., Kollman P.A. On low-barrier hydrogen bonds and enzyme catalysis. Science, 1995, V.269, p.102-105.

131. Голубев H.C., Гиндин B.A., Лигай. C.C., Смирнов С.Н. Исследование водородных связей в "каталитической триаде " трипсина по спектрам ЯМР на ядрах 1Н, 'С и 15N. Биохимия, 1994, т.59, N.5, с.613-624.

132. Gerlt J.A., Gassman P.G. Understanding the rate of certain enzyme-catalyzed reactions: proton abstraction from carbon acids, acyl-transfer reactions and displacement reactions of phosophodiesters. Biochemistry, 1993, V.32, p.l 1943-11952.

133. Tsilikounas E., Rao Т., Gutheil W.G., Bachovchin W.W. 15N and }H spectroscopy of the catalytic hisitidine in chloromethyl ketone-inhibited complexes of serine proteases. Biochemistry, 1996, V.35, p.2437-2444.

134. Braxton S., Wells J. A. The importance of a distal hydrogen bonding group in stabilizing the transition state in subtilisin BPN'. J.Biol.Chem., 1991, V.266, N.18, p.l 1797-11800.

135. Shechter I., Berger A. Biochem.Biophys.Res,Commun., 1967, V.27, p.157-162.

136. Клесов А.А. Природа субстратной специфичности трипсина. Роль заряда и гидрофобности боковой цепи в определении реакционной способности специфических субстратов. Биоорг.Химия, 1977, т.З, с. 1100-1110.

137. Mares-Guia М., Shaw Е., Cohen W. Studies of the active center of trypsin. Further characterization of the hydrophobic binding site. J.Biol.Chem., 1967, V.242, p.5777-5781.

138. Krieger M., Kay L.M., Dickerson R.E. The structure and specific binding of trypsin: comparison of inhibited derivatives and a model for substrate binding. J.Mol.Biol., 1974, V.83, p.209-230.

139. Neimann C., McCasland G.E. Thesynthesus of 2', 6'-diiodo-dl-thyronine. J.Am.Chem.Soc., 1944, V.66,p.l870.

140. Методы получения химических реактивов и препаратов. М: Химия, 1965, 136 с.

141. Plaut Н., Ritter J.J. A new reactions of nitriles. VI. Unsaturated amides. J.Am.Chem.Soc. 1951, V.73, p.4076-4077.

142. Вейганд К., Хильгетаг Г. Методы эксперимента в органической химии (пер. с. нем.). М.: Химия, 1968, с.387.

143. Bender M.L., Baque-Canton M.L., Blakeley R.L., Brubacher L.J., Feder J., Gunter C.R., Kezdy F.J., Killhafer I.V., Marshall Т.Н., Miller G.G., Stoops J.K. J.Am.Chem.Soc., 1966, V.88, p.5890-5900.

144. Gestrelius S., Mattiasson В., Mosbach K. On the regulation of the activity of immobilized enzymes. Microenvironmental effects of enzyme-generated pH-changes. Eur.J.Biochem., 1973, V.36, p.89-96.

145. Клесов А.А., Березин И.В. Биохимия, 1972, т.37, с. 170.

146. Cornish-Bowden A. Fundamentals of enzyme kinetics. London, PortlandPress Ltd., 1999, 343 p.

147. Лукашева E.B., Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф., Еремеев Н.Л. Свойства а-химотрипсина, ковалентно включенного в сферические микрогранулы из полиакриламида. Биохимия, 1980, t.45,N.3, с.449-454.

148. Сиголаева Л.В. Регуляция активности биокатализаторов матрицей, чувствительной к температуре. Дисс.канд.хим.наук, МГУ, Москва, 1995.

149. Tozser J., Szabo G., Pozsgay M., Aurell L., Elodi P. Active center studies on bovine pancreatic chymotrypsin with tripeptidyl-p-nitroanilide substrates. ActaBiochim.Biophys.Hung., 1986, V.21, N.4, p.335-348.

150. Brady K., Abeles R.H. Inhibition of chymotrypsin by peptidyl trifluoromethylketones: determinants of slow-binding kinetics. Biochemistry, 1990, V.29, p.7608-7617.

151. Клесов A.A., Цетилин В.И. Роль структурных факторов в реакциях олигопептидных субстратов и ингибиторов с а-химотрипсином. Биоорг.Химия, 1977, т.З, с. 1523-1538.

152. Wells G.B., Mustafi D., Makinen M.W. Structure at the active site of an acylenzyme of a-chymotrypsin and implications for catalytic mechanism. An electron nuclear double resonance study. J.Biol.Chem., 1994, V.269, N.6, p.4577-4586.

153. Segal D.M., Powers J.C., Cohen G.H. Stereochemistry of substrate binding to chymotrypsin AT Biochemistry, 1971, V.10, p.3728-3737.

154. Desie G., Boens N., De Schryver F.C. Study of the time-resolved tryptophan fluorescence of crystalline a-chymotrypsin. Biochemistry, 1986, Y.25, p.8301-8308.

155. Birktoft J J., Blow D.M. Structure of crystalline a-chymotrypsin. V. The atomic structure of tosyl-a-chymotrypsin at 2 A resolution. J.Mol.Biol., 1972, V.68, p. 187-240.