Конструирование биокаталитических систем в неводных средах на основе бездетергентных микроэмульсий и поверхностно-модифицированных полимерных наногранул тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 541.128/135 + 547.96

НЕВЕРОВА Ирина Николаевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ СИСТЕМ В НЕВОДНЫХ СРЕДАХ НА ОСНОВЕ БЕЗДЕТЕРГЕНТНЫХ МИКРОЭМУЛЬСИИ И ПОВЕРХНОСТНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ПОЛИМЕРНЫХ НАНОГРАНУЛ

02.00.15 - Химическая кинетика и катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1991

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета

М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук А.Б.Левашов

Научный консультант: кандидат химических наук Ю.Л.Хмельницкий

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

В.Н.Измайлова доктор химических наук Л.И.Валуев

____х

Ведущая организация: Институт химической физики АН СССР.

Защита состоится " Ч " Сре&ъолЯ 1992 г, в 16 час. СЮ мин. на заседании специализированного совета Д 053.05.76 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, Москва, МГУ, Ленинские горы, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического

факультета МГУ.

Автореферат разослан " " 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На современном этапе развития энзимологии зсе большее внимание уделяется вопросам создания систем для проведения [ерментативных реакций в органических растворителях. Необходимость перегода к неводным средам обусловлена потребностью использования ферментов 5 различных практических областях, прежде всего, в тонком органическом :интезе.

В настоящее время предложено большое число разного рода макро- и ОДкрогетерогенных биокаталитических систем на основе органических ра-;творителей. Наиболее изученными микрогетерогенными системами являются >бращенные мицелла поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических >астворителях. Молекула фермента, находясь во внутренней полости парафированных обращенных мицелл, защищена от денатурирующего воздействия >рганического растворителя оболочкой из молекул ПАВ. С точки зрения фактического использования мицеллярных систем они обладают двумя ;ущественными недостатками. Во-первых, являясь динамическими )бразованиями, мицеллы могут изменять свои свойства и даже эазрушаться при варьировании компонентов и условий формирования :истемы. Во-вторых, выделение продукта из такой системы оказывается (остаточно трудоемким, особенно в плане отделения от ПАВ. Эти 1едостатки, на наш взгляд, можно преодолеть по крайней мере двумя гринципиально различными путями.

Один из них заключается в создании структурно-организованных поли-герных частиц на основе обращенных мицелл. Данный подход можно реализо-¡ать путем сополимеризации ПАВ, водорастворимого мономера и фермента, ;ак макромономера, солюбилизованных гидратированными обращенными мицел-гами. Полимерные наногранулы, полученные в результате полимеризации, гредставляют интерес в качестве контейнеров для биокатализаторов и их 1альнейшего использования в каталитических процессах, осуществляемых в [вводных средах.

Второй подход заключается в выборе такой микрогетерогенной системы, I которой'роль стабилизатора выполняет не длинноцепочечный ПАВ, а низко-юлекулярное соединение. Примером таких микрогетерогенных систем являют-;я так называемые бездетергентные микрозмульсии, существующие в трехком-гонентных системах типа: углеводород-короткоцепочечный спирт-вода.

Цель работы. При выполнен™ работы были поставлены следующие за; чи. Во-первых, при использовании систем гидратированных обращенных к целл ПАВ в органических растворителях получить ферментсодержащие повер ностно-модифицированные полимерные наногранулы (ПМПН). Во-вторых, исс; довать каталитические свойства ферментов, включенных в ПМПН. В-третьк продемонстрировать реальную возможность использования биокаталитичесв систем на основе ферментсодержащих ПМПН для препаративного синтеза ра личных соединений в органических растворителях. В-четвертых, исследова поведение ферментов в трехкомпонентных системах типа углеводоро короткоцепочечный сгшрт-вода и выявить принципиальные возможности их технологического использования.

Научная новизна работы. Впервые получены ферментсодержащие повер ностно-модифицированные полимерные наногранулы, растворимые в органиче ких растворителях.В результате оптимизации условий получения ПМПН приг товлены образцы наногранулированного «-химотрипсина, обладающие высока стабильностью <кин=2,8хЮ~5мин_1) и активностью (не менее 75% от исхо, ной) в бензоле. Осуществлен количественный синтез этилового эфи] и-ацетил-ь-тирозина в бензоле в мембранном реакторе периодического де] ствия.

Исследованы закономерности поведения ферментов (трипсин и лакказ; в трехкомпонентных системах на примере системы гексан-пропанол-2-водг Установлено, что максимальная каталитическая активность и стабильнос. ферментов достигаются в бездетергентных микроэмульсиях. Таким образо* показано, что в качестве реакционной среды для проведения ферментативнь реакций могут быть использованы бездетергентные микроэмульсии.

Практическая значимость работы. Полученные при использовании систе обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях ферментсодержащие пс верхностно-модафицированнне полимерные наногранулы могут быть использс ваныв тонком органическом синтезе, например для биокаталитической транс формации водонерастворимых органических соединений, биологически активных веществ и т.п. Описаны общие закономерности катализа ферментам в трехкомпонентных системах типа гексан-пропанол-2-вода.Бездетергентмы микроэмульсии могут представлять практический интерес в качестве сред для ферментативного синтеза органических соединений, что было подтверзн дено на примере синтеза изопропилового эфира к-карбобензокси-ь-трштофа на, катализируемого «-химотрипсином, в системе гексан-пропанол-2-вода регенерацией лакказы из той же системы.

Предложенные и описанные в работе биокаталитические системы на ос нове ферментсодержащих поверхностно-модифицированных полимерных наногра

нул и бездетергентннх микроэмульсий расширяют круг практического использования ферментов в биотехнологии.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме "Химическая физика ферментативного катализа" (Таллин, 1987), Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология"(Вильнюс, 1988), 31 Международном конгрессе iupac (София, 1987).

Публикации.. По матариалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (из наименования). Работа изложена на страницах и

включает таблиц иЗ£ рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ФЕРМЕНТ СОДЕРЖАЩИЕ ПОВЕРХНОСТНО-МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОГРАНУДЫ

Для получения агрегатов, показанных на рис.1 нами была использована система обращенных мицелл . В качестве мицеллообразугацего ПАВ был использован анионный ПАВ - Аэрозоль ОТ (АОТ, натриевая соль ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты), который обладает высокой солюбилизирующей способностью. Другой ПАВ, введенный нами в систему обращенных мицелл АОТ - Плюроник г-108. Он является неионногенным полимерным ПАВ, представляющим собой триблоксополимер полиэтиленоксида (ПЭО) и полипропиленоксида (ГОТО) [ но(сн2-сн2-о)150-(сн(снэ)-сн2-о)33-(сн2-сн2-0)1300Н). Для получения Плюроника р-108, способного к сополимеризации, концевые гидроксильные группы этого соединения были этерифицированы -хлорангидридом метакриловой кислоты. Модифицированный Плюроник р-108 обладает невысокой солюбилизирующей способностью и не образует стабильных микроэмульсий. При образовании смешанных мицелл АОТ - модифицированный Плюроник г-108 (в соотношении 100:1) последний не снижал солюбилизирую-щую способность АОТ.

Было показано, что максимальная солюбилизация водных растворов этой смесыонаблюдается в смеси толуол/октан (3:1 по объему), которая и использовалась в качестве растворителя во всех последующих экспериментах.

з

Поли-

' дилц- —с\ \ (Е) _ мериза

Ж-:" '

/7/7(9

Рис.1. Схема получения полимерных наногранул:!- модифицированный Плюро-ник р-108, 2- ЛОТ, 3- мономеры (акршшид и лт.лг-метилен(бис)акршамид), 4- п-химотрипсин, 5- органический растворитель.

Водный раствор фермента и мономеров (акриламида и иЖ-метилен(бис)акриламида) был солюбилизован системой обращенных мицелл, образованных смесью АОТ и модифицированного Плюроник р-108 в смеси октан-толуол (3:1).

С помощью ^Н-ЯМР спектроскопии было установлено, что ориентация молекул Плюроника р-108 в микроэмульсионной капле, согласно его дифильной природе, выглядит следующим образом: гидрофильные полиэтиленоксидные фрагменты молекулы Плюроника р-108 погружены во внутреннюю водную полость обращенных мицелл, а гидрофобные полипропиленоксидные фрагменты экспонированы в органический растворитель (как показано на рис.1).

Полимеризацию мономеров, солюбилизованных обращенными мицеллами,

-шицировали облучением деаэрированного раствора УФ-светом в присутствии -шициатора радикальной полимеризации - азо-бис(изобутиронитрила). По жончании полимеризации получали прозрачный раствор поверхностного дифицирова нных полимерных наногранул (ПМПН) в бензоле, поверхность которых модифицирована ковалентно пришитыми молекулами Плюроника f-108. Затем, из этого раствора методом гель-проникащей хроматографии удаляли оставшийся там ЛОТ, который был необходам на стадии получения систем об-эащенных МИцелл и их стабилизации во время полимеризации.

Размеры ПМПН в твердом состоянии и в растворе были определены с томощью электронной микроскопии и квазиупрогого рассеяния лазерного :вета (КУРЛС), соответственно. Средний диаметр частиц в твердом состояли составлял 8,8±0,8нм независимо от степени гидратации w (т.е. содержания воды И соответственно размеров) исходной системы обращенных дацелл.

С Другой стороны, гидродинамический радиус ПМПН (wq=I5) в бензоле, определенный КУРЛС, значительно выше, чем размеры, определенные с помо-цью электронного Микроскопа. Наиболее вероятное объяснение этому факту заключается в том, что с помощью электронной микроскопии был установлен зазмер полиакриламидного ядра ПМПН, в то время как с помощью КУРЛС был определен Полный размер наногранул, включая прикрепленные цепи Плюроника —108. Таким образом, толщина оболочки, образованной цепями Плюроника ~-108 составляет Порядка 35-40нм.

Ранее Шпайзер t Speiser Р.in: Reverse Micelles / Ed. Luisi P.L. & Hrallb В.Ё. - N.Y. Plenum Press, 1984 p.339], ИСПОЛЬЗУЯ СИСТеМЫ ОбращеН-

ftlx Мицелл» Получил полиакриламидные наногранулы, которые были предложении в качестбе' контейнеров для низкомолекулярных лекарственных соеди-юний. Позднее были получены ферментсодержащие полиакриламидные наногранулы [Абакумова Е.Г.и др. //ДАН СССР- 1985 т.283 стр.136]. В обоих слу-1аях полимерные наногранулы в силу гидрофильной природы составляющего их толиакриламидного геля хорошо растворялись в воде, тогда как диспергиро-зание их В органических растворителях происходило только в присутствии •шцеллообразующего ПАВ. Полученные же нами ПМПН хорошо растворяются в эазличных органических растворителях таких как бензол, хлороформ, четы-зех'хлористый углерод, этанол, ацетон, образуя оптически прозрачные и -стабильные растворы. Кроме того, ПМПН растворяются и в воде с образованием слабо опалесциругацих стабильных растворов.

Каталитическая активность и стабильность п-химотрипсина,включенно

в ПМПН

В ПМПН был включен «-химотрипсин согласно схеме, представленной рис.1. Было найдено, что наногранулированный фермент сохраняет катали ческую активность и обладает высокой стабильностью в бензоле. Уров! остаточной каталитической активности и стабильность при хранении зав№ от условий получения ПМПН, а именно, от степени гидратации исходной < стемы обращенных мицелл (ио) и концентрации мономеров во внутренней в< ной полости мицелл (рис. 2 и 3). Оптимальными условиями получения фс ментсодержзщих ПМПН являются степень гидратации «о 15 и концентрация ^ номеров (АА+МБАА) в водной полости обращенных мицелл 20вес.%. Фермент тивная активность такого препарата составляла 75% от активности исход} го «-химотрипсина, а константа инактивации при 20°С - 2,78-10~5мин~1.

1.5

2.5 п

*

о

10 20 30 40 [ААадАА],а».%

О Н-II-Г

О 10

15

2(

Рис.2, Зависимость константы инактивации а-химошртстш, включенного в ПМПН (к0 =15), от концентрации мономеров в водном ядре мицеллы.

Рис.3. Зависимость константы инактивации а-хилсщмпсиш, включенного в ПМПН (концентрация мономеров в водном ядре лицеллы 20 вес.%) от степени гидратации и .

Термостабильность бензольного раствора наногрэнулированного а-химотрипсина, полученного в оптимальных условиях (т.е. «о=15, концентрация мономеров 20вес.%) была изучена в интервале температур 20-65°С. Из температурной зависимости константы инактивации первого порядка в координатах Аррениуса была определена энергия активации, величина которой составила 37,6 кДж/моль. Термостабильность наногрэнулированного «-химотрипсина в бензоле при 65°С в 100 раз выше, чем стабильность на-тивного фермента в водном растворе или иммобилизованного в полиакрил-амидный гель при той же температуре.

Синтез этилового эфира ^ацетил-ь-тирозина (АТЭЭ) в мембранном реакторе с помощью а-химотрипсина, включенного в ПМПН

На примере синтеза АТЭЭ, осуществленного с помощью а-химотрипсина включенного в ПМПН, была продемонстрирована возможность практического использования предложенной биокаталитической системы. Синтез проводился в мембранном реакторе, конструкция которого представлена на рисунке 4.

Рис.4. Мембранный реактор для ситеза АТЭЭ. 1 - тефлоновая мембрана с избирательной проницаемостью; 2 - магнитные меишки; 3 - камера, содержащая а-химотрипсин, вктчешый в ПМПН; 4 - термоаюшруемая рубашка.

Тефлоновая мембрана, разделяющая камеры реактора, имеет поры диаметром 40нм. Она обладает избирательной проницаемостью для низкомолекулярных соединений, оставаясь непроницаемой для таких крупных частиц как

ПМПН. В качестве исходных реагентов были использованы ы-ацетил-ь-тиро: (ЮмМ) и этиловый спирт (1М). В результате реакциии этерификации. про; давшей в течение 75 мин при 30°С, м-ацетил-ь-тирозин полностью прев] щался в его этиловый эфир. По окончании реакции синтеза из камеры, содержащей наногранулированный а-химотрипсин, извлекался раствор продз та в бензоле и после упаривания растворителя АТЭЭ был получен в су? виде. При внесении в пустую камеру растворителя, а в камеру с нанограь лированным о-химотрипсином - исходных реагентов, начинался новый ци синтеза АТЭЭ.

время, мин

Рис.5. Кривые накопления АТЭЭ, синтезированного с полсяцъю а-хило-трипсина, включенного в ПМПН, для четырех циклов, проведенных мембранном реакторе

С помощью одного и того же раствора ферментсодержащих ПМПН удалое осуществить 4 цикла синтеза АТЭЭ (рис.5). Количество циклов было ограни чено не потерей наногранулированным ферментом своих каталитических ■ свойств, а деструкцией мембраны, поры которой увеличились и стали прони цаемы для полимерных наногранул.

По сравнению с сообщенными ранее кинетическими данными о катализи руемых «-химотрипсином синтезах АТЭЭ в различных водно-органическт системах, таких как смешивающиеся с водой органические растворители I присутствии' иммобилизованного фермента [Гг^аИэ И.о^ а1.// В1оЪесЬпо1, В1оепй.- 1975 у.17 р.1627], ДВуХфЭЗШе (ВОДЭ - Хлороформ) СИСТеМЫ [Иепи

M.-H. ct. nl.// Biochim. Biophys. Acta- 19R7 v.911 p. 252], СуСПеНДИрОВЭН-ный в органическом растворителе лиофилизованный фермент (Kiso н. et. al.// Enzyrnn Microbiol. Technol. -1988 v.10 p.582], ЗНЭЧеНИе КаТЭЛИТИ-

ческой производительности нашей системы, выраженное во времени, необходимом для 90% выхода продукта ( величина наибольшего выхода, достигнутого в перечисленных ранее работах) по крайней мере в 20 раз выше при сравнимых концентрациях субстратов.

ФЕРМЕНТЫ В БЕЗДЕТЕРГЕНТНЫХ МИКРОЭМУЛЬСИЯХ

Другим примером микрогетерогенных систем являются так называемые бездетергентные микроэмульсии, образующиеся самопроизвольно в трехкомпо-нентных системах типа углеводород-короткоцепочечный спирт-вода. Известно, что в таких трехкомпонентных системах существуют различные структуры, переход между которыми происходит в результате изменения соотношения компонентов. Конкретным примером может служить система гексан-пропанол-2 вода. На фазовой диаграмме этой системы выделяют область А - область существования термодинамически нестабильной макроэмульсии, которая расслаивается на две фазы. В - область существования бездетергентных микроэмульсий; С - область ассоциатов, состоящих из связанных водородными связями молекул воды и спирта, распределенных в углеводороде; Д - область истинных тройных растворов (рис.6).

Рис.6. Фазовая диаграмма трехкомпонентой системы гексан-пропакол-2-вода

Собственно бездетергентные микроэмульсии представляют собой водь микрокапли диаметром от 5 до 30 нм, распределенные в среде органическс

растворителя [Smith G.D. et al.//J.Colloid Interface Sci.-1!)77 v. p.iRB). Поскольку пропанол-2 обладает неограниченной растворимостью воде можно полагать, что он будет распределяться между водными микрока лями и гексаном, В таком случае на поведение фермента, локализованно внутри такой водной микрокапли, существенное влияние может оказыва природа микроокружения, связанная с концентрацией спирта в микрокапля Исследование природы среды микроэмульсионных капель проводили с помощ спектральной метки, в качестве которой использовали нитрат-анион, лок лизованный внутри микрокапель, спектральные свойства которого зависят < полярности окружения. Сравнение спектральных характеристик нитрат-ион в двойных смесях вода-пропанол-2 и бездетергентных микрозмульсях позв< ляет сделать вывод о том, что микросреда внутри микроэмульсионных кап. по полярности соответствует 75%-ному водному раствору пропанола-2.

Было показано, что капли, содержащие молекулы фермента, в сред» в два раза больше, чем пустые. Так как гидродинамический радиус трипсш в водном растворе составляет около 20 А, то структурную модель трипсш содержащих микроэмульсионных капель можно описать следующим образом: мс лекула фермента окружена водным-спиртовым слоем толщиной 7-10 Á, которь предохраняет фермент от неблагоприятного контакта с органической внешне фазой.

Каталитическая активность и стабильность трипсина и лакказы в трехкомпонентных системах гексан-пропанол-2-вода

В трехкомпонентных системах гексан-пропанол-2-вода была изучена ки нетика гидролиза этилового эфира n-бензоил-ь—аргинина, катализируемог трипсином и кинетика окисления пирокатехина, катализируемого лакказой которые подчинялись уравнению Михаэлиса-Ментен. Зависимость каталитичес кий активности трипсина и лакказы от состава тройной системы, определен ные при 25°С и выраженные величиной максимальной скорости (v/e), пред ставлены на рисунках 7 и 8 в виде трехмерных диаграмм, где по оси z при ведены значения каталитической активности.

Данные рисунков 7 и 8 свидетельствуют, что каталитическая актив ность как трипсина, так и лакказы, возрастает с увеличением содержани: воды в системе, достигая максимального значения в области бездетергент-ной микроэмульсии. В точке максимума величина каталитической активност] для трипсина составляет 60% от наблюдаемой в водном растворе, а для лак-

Ш

г*

аР

лролпмпл-З.

Рис. 7. Зависимость каталитической. активности трипсина, катализирующего гидролиз этилового эфира н-бензоил-ь-аргинина, от состава системы гексан-пропанол-2-вода (50мМ трис-нс], рй 8,0) при 25°С.

ч/Е.М"' гот

Рис.8. Зависимость каталитической активности лакказы, катализирующей окисление пирокатехина, от состава системы гексан-пропа-нол-2-вода (2мМ цитрат натрия, рН 4,5) при 25°С. •

казы - 20%. хотя общее содержание воды в этих микрогетерогенных система не превышает 7% по объему в обоих случаях.

Было установлено, что в бездетергентной микроэмульсии трипсин лакказа не только проявляют максимальную по сравнению с состоянием других областях фазовой диаграммы каталитическую активность, но и обла дают наибольшей стабильностью.

Нами была показана возможность многократного использования фермент; при проведении реакций в бездетергентных микроэмульсиях на примере лак казы в системе гексан-пропанол-2-вода. Схема регенерации фермента и; бездетергентной микроэмульсии представлена на рис.9.

Гексан

1-Прспанол

Органическая

1раза

избыток

гексана

Бездетергентной микразмульсав

расслоение

разделение

Х-У

Нестабильная у шкризмульсия Видная фаза

Определение ■актиднести

Водная фаза

Рис.9. Последовательность операций при регенерации Айкназы из бездетергентной микроэлулъсии.

Основная идея метода состоит в том, что добавление избытка к трой ной системе, описываемой любой точкой в области В,С и Д фазовой диаграммы, приводит к перемещению этой точки в область А (рис.6.), которая соответствует нестабильным макроэмульсиям. Такие- макроэмульсии легко расслаиваются на две несмешивающиеся фазы - водную и органическую. Фермент после расслаивания остается в водной фазе и используется повторно для получения следующей порции бездетергентной микроэмульсии. Перед началом эксперимента и по завершении каждого цикла из водной фазы отбирали пробу, в которой определяли активность фермента. Было показано, что лакказа сохраняет значительную каталитическую активность (не менее 60% от исходной) после осуществления 4 циклов регенерации (рис.10).

На примере катализируемого а-химотриписном синтеза изопропилового

спирта ы-карбобензокси-ь-триптофана была показана принципиальная возможность синтеза водонерастворимых соединений в бездетергентных микроэмульсиях. Выход продукта в 10 раз превышал выход ферментативного синтеза в водном растворе.

А,%

30 ' Рис.10. Зависимость относи-

тельной каталитической активности (л) лакказы от чис-

01-»-1-1- г ла циклов регенераций (м > из

л < 3 4 " бездепергетной ликроэлуль-

сии.

Тот факт, что ферменты различных классов - трипсин и лакказа при >астворении в бездетергентной микроэмульсии, существующей в трехкомпо-:ентной системе гексан-пропанол-2-вода, сохраняют свои каталитические войства указывает на перспективность использования бездетергентных икрозмульсий как микрогетерогенной среды для проведения ферментативных еакций в органических средах с низким содержанием воды.

выводы

1. Изучено влияние состава трехкомпонентной системы на каталитичес кую активность и стабильность ферментов. На примере системы гексаь пропанол-2-вода показано, что в области бездетергентной микроэмульсь достигаются максимальные значения активности и стабильности трипсина лакказы. В точке максимума значение каталитической активности для триг сина составляет 60% от наблюдаемой в водном растворе, а для лакказы 20%.

2. На примере катализируемого «-химотрипсином синтеза изопропилово го эфира ^карбобензокси-ь-триптофана показана принципиальная возможность ферментативного синтеза водонерастворимых соединений в бездетер гентных микроэмульсиях. Регенерация лакказы (4 цикла) из системы гексан пропанол-2-вода с сохранением не менее 60% остаточной каталитической ак тивности свидетельствует о возможности многократного использования фер ментов при проведении реакций в бездетергентных микроэмульсиях.

3. Разработана методика получения ферментсодержащих поверхностно модифицированных полимерных наногранул путем сополимеризации модифициро ванного полимерного ПАВ (модифицированный Плюроник е-108) и водораство римых мономеров (акриламида и N,N'-ме тшген(бис)акриламида) в системе об ращенных мицелл в органических растворителях.Полученные предложенным ме тодом поверхностно-модифицированные полимерные наногранулы представляю1 собой сферические частицы, общий диаметр которых не превышает 90нм.

4. «-Химотрипсин, включенный в поверхностно-модифицированные полимерные наногранулы, сохраняет до 75% остаточной каталитической активности в бензоле. Термостабильность наногранулированного «-химотрипсина 1 бензоле в 100 раз выше по сравнению с нативным ферментом в водном растворе. С помощью «-химотрипсина, включенного в поверхностно-модифицированные полимерные наногранулы осуществлен количественный синтез этилового эфира м-ацетил-ь-тирозина в бензоле в мембранном реакторе периодического действия.

Основные результаты диссертационной работы Неверовой (Жариновой) И.Н. изложены в следующих публикациях-.

1. Хмельницкий Ю.Л., Жаринова И.Н., Березин И.В., Левашов А.В., Мартинек К. Бездетергентные микроэмульсии - новая микрогетерогенная среда для ферментативных реакций.// ДАН СССР 1986, т.289, JP5, стр.П78-П81

2. Khmelnitsky Y.L., Momtcheva R., Zharinova I.N., Martinek К. Preparation of a stable, soluble in organic media enzyme product (or-chymotrypsin ) .//31 st International congress of IUPAC. The book of abstracts. Sofia, Bulgaria, 1987, p.2.

3. Khmelnitsky Y.L., Zharinova I.N., Berezin I.V., Levashov A.V., Martinek K. Detergentless microemulsions a new microgeterogeneous medium for enzymatic reaction.// Enzyme engineering 8, Ann. N.Y. Acad.Sci.

1987, v.501, p.161-164.

4. Neverova I.N., Khmelnitsky Y.L., Gladilin A.K., Levashov A.V., Momtcheva R. Catalysis by enzymes entrapped in modified polymeric nanogranules soluble in organic solvents.// Abstracts of International symposium "Chemical physics of enzyme catalysis", Tallin, 1987, p.123.

5. Неверова И.Н., Левашов А.В., Мартинек К., Хмельницкий Ю.Л. Стабилизация ферментов для использования в органических системах. // Материалы vi Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", Вильнюс,

1988, ч.I, стр.35.

6. Гладилин А.К., Неверова И.Н., Левашов А.В., Хмельницкий Ю.Л. Бездетергентные микроэмульсии как среда для биокаталитических реакций. // Материалы vi Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимология", Вильнюс, 1988, ч.1, стр.13.

7. Хмельницкий Ю.Л., Гладилин А.К., Неверова И.Н., Левашов А.В., Чартинек К. Бездетергентные микроэмульсии как среда для ферментативных реакций. Каталитические свойства лакказы в трехкомпонентной системе гексан-пропанол-2-вода.// Биоорг. химия, 1989, т.55, стр.16П-1617.

8. Khmelnitsky Y.L., Neverova I.N., Momtcheva R. , Varopolov A.I., 3elova А.В., Levashov A.V., Martinek K. Surface-modified polymeric lanogranules containing entrapped enzymes: a novel biocatalyst for use Ln organic media,// Biotech. Techniques, 1989, N3, p.275-280.