Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред

Шнайдер, Ксения Леонидовна

Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Шнайдер, Ксения Леонидовна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Казань МЕСТО ЗАЩИТЫ

2009 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.15 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред»

Автореферат диссертации на тему "Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред"

На правах рукописи

ШНАЙДЕР КСЕНИЯ ЛЕОНИДОВНА

ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред

02.00.15-Каталю

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 4

Казань-2009

003489932

Работа выполнена на кафедре пищевой биотехнологии ГОУ ВГТО «Казанский государственный технологический университет»

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Гамаюрова Валентина Семеновна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Харлампиди Харлампий Эвклидович

доктор биологических наук, профессор Максютова Наиля Назибовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина»

Защита диссертации состоится « 25 » декабря 2009 г. в // ~~ часов на заседании диссертационного совета Д 212.080.07 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, д. 68, КГТУ, зал заседаний Ученого совета (А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан « 24 » ноября 2009 г.

Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте Казанского государственного технологического университета. Режим доступа http://www.kstu.ru/

Ученый секретарь диссертационного совета

со

кандидат химических наук, доцент

В.М.Захаров

общая характеристика работы *

Актуальность работы. Ферментные препараты находят все более широкие области применения в биотехнологии пищевой, фармацевтической, косметической и других отраслях промышленности. Сравнительно новое направление - изучение применения ферментных препаратов в неводных средах, что позволяет значительно расширить круг объектов и процессов, для которых могут быть использованы ферментные препараты.

В настоящей работе объектами исследования являются растительные масла различного жирно-кислотного состава - льняное и рапсовое масла. Эти масла важны, как для пищевой промышленности, так и для технических целей. Так, химический гидролиз рапсового масла является основой для крупнотоннажного получения ПАВ.

К перспективнейшим объектам исследования среди растительных масел можно отнести льняное масло, содержание со-З-ПНЖК (а-линоленовой кислоты) в котором составляет 35-65 % к сумме кислот. Благодаря своему жирно-кислотному составу и присутствию антиоксидантов льняное масло используется для профилактики и комплексного лечения многих заболеваний.

Наряду с льняным маслом неплохим источником а-линоленовой кислоты может служить рапсовое масло.

Современные сорта рапса содержат 40-49 % масла, богатого олеиновой (4570 %), линолевой (15-28 %) и линоленовой (6-13 %) кислотами, вследствие чего рапсовое масло можно отнести к ценным растительным маслам.

Изучение процесса ферментативного гидролиза растительных масел актуально с точки зрения получения свободных высших жирных кислот, которые имеют очень широкий спектр применения. Ферментативные процессы, как известно, протекают в мягких условиях и обладают более выраженной селективностью.

Для пищевой промышленности указанные масла представляют ценность, как источники незаменимых со-3 и со-6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) - линолевой и а-линоленовой кислот, которые выполняют функцию особого витамина, получившего наименование витамин Б. ПНЖК семейства со-3 и со-6 обладают широким спектром лечебно-профилактического действия, так как они являются биологическими предшественниками эйкозаноидов и структурными блоками биологических мембран.

В связи с этим интерес исследователей различного профиля к незаменимым ПНЖК семейств со-3 и со-6 чрезвычайно высок. При этом если источники ПНЖК семейства со-6 довольно распространены, то гораздо более ограничен круг источников ПНЖК семейства со-3. Поэтому поиск новых источников со-3 ПНЖК, доступных и легко усвояемых является актуальной задачей. Для получения продуктов с повышенным содержанием со-3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой и биологической ценностью была использована ферментативная трансформация растительных масел липазами различного происхождения.

В руководстве диссертационной работой принимала участие к.т.н., доцент кафедры пищевой биотехнологии Зиновьева М.Е.

Цель и задачи исследования. Выявление особенностей ферментативного гидролиза растительных масел различного жирно-кислотного состава липазами животного и микробиологического происхождения.

Получение нового модифицированного липидного продукта с повышенным содержанием со-3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой ценностью.

Научная новизна. Панкреатическая липаза и липаза из Candida rugosa гидро-лизуют растительные масла в органических средах (углеводороды) в мицеллярных системах АОТ гораздо эффективнее, чем в эмульсии масло/вода стабилизированной АОТ.

Панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфична по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче отделяет в аципглицеридах остатки полиненасыщенных жирных кислот, чем насыщенных и мононенасыщенных.

Липаза из Candida rugosa в системе масло/вода гораздо эффективнее подвергает гидролизу растительные масла, чем панкреатическая липаза, при этом она труднее всего отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенной а-линоленовой кислоты, что позволяет получить модифицированные масла с повышенным относительным содержанием этой кислоты.

Практическая значимость. Разработан метод гидролиза льняного масла с применением липазы из Candida rugosa в отсутствии эмульгатора, что позволяет получить биологически-активный липидный продукт с повышенным относительным содержанием оо-З-ПНЖК.

Подобраны оптимальные условия для получения активных иммобилизованных препаратов липаз различного происхождения. Показано, что при иммобилизации необходимо введение хлорида кальция в гель агара и подобраны его оптимальные концентрации.

Разработан метод выделения кальциевых и натриевых солей жирных кислот льняного масла, который включает последовательную ферментативную и химическую обработку масла. Данные соли находят применение в качестве добавок к корму сельскохозяйственных животных, а также могут использоваться как основа для получения ПАВ, восков и др.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международной научно-практической конференции "Биотехнология. Вода и пищевые продукты" (Москва, 2008), на X Международной конференции молодых ученых "Пищевые технологии и биотехнологии" (Казань, 2009), на XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха (Казань, 2009), на ежегодных отчетных конференциях КГТУ (2007-2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и библиографического указателя (129 наименований источников). Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает в себя 19 таблиц и 43 рисунка.

экспериментальная часть. объекты и методы исследований

В качестве катализаторов использовали: коммерческий препарат Lipase from porcine pancreas, Type II лиофильно высушенный (активность - 100-400 ед./мг белка с использованием оливкового масла в качестве субстрата, производство - США); коммерческий препарат Lipase from Candida rugosa, Type Vil лиофильно высушенный (активность - 700-1500 ед./мг белка по оливковому маслу, производство - Япония); коммерческий препарат, содержащий липазу, "Novozyme 868" жидкий (активность - 178 ед./мг белка по оливковому маслу, производитель Novo Nordisk A/S, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd (Дания)).

Исходную активность ферментных препаратов липаз определяли модифицированным методом Ота, Ямада и колориметрическим методом с использованием п-нитрофенилбутирата.

Изучение гидролиза масел ферментными препаратами липаз осуществляли в системе прямых и обращенных мицелл АОТ, в системе масло/вода в отсутствии эмульгатора, в эмульсиях масла с использованием в качестве эмульгатора желатина, а также гидролиз масла с добавлением органического растворителя.

Для включения фермента (панкреатической липазы или липазы из Candida rugosa) в мицеллы к 1 мл раствора АОТ в определенной концентрации (от 0,03 до 0,12 М/л) в органической среде (пентан, гексан, гептан, октан, декан), содержащей субстрат (льняное или рапсовое масло) в концентрации от 42,9 до 269,6 мкМ/мл, добавляли раствор ферментного препарата в фосфатно-цитратном буфере с pH 7,4 (количество буфера 0,0-1,0 мл; количество ферментного препарата 0,07-1,00 мг/мл). Смесь интенсивно встряхивали и выдерживали в течение 1-36 часов при определенной температуре (от 20 °С до 55 °С). Количество выделившихся в ходе реакции жирных кислот определяли методом титрования.

В контрольную пробу фермент вносили непосредственно перед титрованием.

Гидролиз в водной среде проводили подобным образом, с использованием в качестве эмульгатора АОТ.

Выход жирных кислот (мкМ/мг белка) рассчитывали по формуле:

А = (О - К) • Т • 200 / В,

где О - количество 0,2 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование пробы, мл; К - количество 0,2 н спиртового раствора NaOH, пошедшее на титрование контроля, мл; Т - титр щелочи; 200 - коэффициент пересчета в мкмоли жирных кислот; В - концентрация ферментного раствора, мг/мл.

Иммобилизацию ферментных препаратов липаз проводили методом включения в гель агара, содержащий хлорид кальция в концентрации от 0,0 М/л до 1,1 М/л. Затем с помощью иммобилизованных ферментных препаратов липаз проводили гидролиз льняного масла и эмульгированного оливкового масла.

Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз в отсутствии эмульгатора осуществляли следующим образом: льняное (рапсовое) масло

эмульгировали в воде с помощью высокоскоростного диспергатора. В 25 мл эмульсии масло/вода вносили 30 мг сухого ферментного препарата липазы (панкреатической липазы или липазы из Candida rugosa). Реакцию осуществляли при температуре 37 °С с интенсивным перемешиванием (число оборотов - 150) в течение определенного времени (от 1 до 10 часов).-------------------------------

Для отделения жирных кислот был применен метод холодной рафинации.

Из гидролизата льняного масла после обработки его липазой из Candida rugosa выделяли кальциевые соли жирных кислот. Для этого в промытый гидроли-зат вносили гидроксид кальция. Полученную смесь тщательно перемешивали и оставляли до полного застывания.

Анализ полученных продуктов осуществляли следующими методами: ИК-спектроскопия, ТСХ, ГЖХ.

Все эксперименты проводили в 3-12 повторностях. Результаты обрабатывали с помощью пакета статистических программ «Statistica». Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали при помощи t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для определения жирно-кислотного состава, в частности количества а-линоленовой и линолевой кислот в исследуемых маслах, использовали метод га-

зожидкостной хроматографии. Данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

_Состав льняного и рапсового масел_

Жирная кислота Льняное масло, % Рапсовое масло, %

Гондоиновая (С 20 0 - 1,2

а-Линоленовая (С |8 з) 49,5 7,6

Линолевая (С и.г) 17,6 20.6

Олеиновая (С 15-1) 23,8 64,5

Стеариновая (С и о) 5,8 -

Пальмитиновая (С 16 о) 3,3 6,1

Суммарное содержание кислот С 18 96,7 92,7

1 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз

в системе масло/вода

Для проведения гидролиза, чтобы адсорбция фермента на поверхности гидрофобного субстрата была продуктивной, широкое применение нашли эмульгаторы различной природы (целлюлоза, гуммиарабик, поливиниловый спирт, желатин и другие). Однако в связи с тем, что отделение продуктов гидролиза от эмульгатора (ПАВ) усложняет задачу, исследовалась возможность ферментативного гидролиза льняного и рапсового масел при отсутствии эмульгатора в системе масло/вода.

Показано, что панкреатическая липаза в подобранных условиях осуществляет гидролиз льняного и рапсового масел в системе масло/вода с крайне низким выхо-

дом жирных кислот. Так, максимальный выход целевого продукта через 4 часа гидролиза льняного масла составил 70 мкМ или 2,5 %.

В то же время гидролиз масел липазой из Candida rugosa в установленных условиях протекает значительно интенсивнее. Максимальный выход жирных кислот через 9 часов гидролиза льняного масла составил 1241 мкМ или 43,8 %, что в 17,7 раза превышает выход продуктов гидролиза масла панкреатической липазой. При гидролизе рапсового масла максимальный выход жирных кислот наблюдался через 3 часа от начала процесса и составил 37,0 %.

Для получения липидного продукта с улучшенным жирно-кислотным составом на основе льняного масла (рапсового масла), свободные жирные кислоты отделяли методом холодной рафинации. Далее продукт анализировали методом ГЖХ. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Изменение количественного и качественного состава льняного масла (рапсового масла) после гидролиза липазой из Candida rugosa_

Жирно-кислотный состав льняного и рапсового масел Жирно-кислотный состав исходного льняного масла, % Жирно-кислотный состав липидного продукта на основе льняного масла, % Жирно-кислотный состав исходного рапсового масла, % Жирно-кислотный состав липидного продукта на основе рапсового масла, %

гондоиновая - - 1,2 -

а-линоленовая 49,5 66,7 7,6 8,36

линолевая 17,6 10,7 20,6 21,4

олеиновая 23,8 15,2 64,5 63,6

пальмитиновая 5,8 2,1 6,1 6,55

стеариновая 3,3 5,3 - -

Согласно данным, представленным в таблице 2, липаза из Candida rugosa преимущественно отделяет в ацилглицеридах льняного масла остатки олеиновой и ли-нолевой кислот, а также значительно снижает содержание пальмитиновой кислоты в масле. Отделив данные кислоты от гидролизованного льняного масла, становится возможным обогатить полученный продукт а-линоленовой кислотой. Таким образом, относительное содержание ценной со-З-ПНЖК в липидном продукте увеличилось с 49,5 %до 66,7 %.

При гидролизе рапсового масла липазой из Candida rugosa также в основном отделяется олеиновая кислота, что подтверждает специфичность данного фермента по отношению к мононенасыщенным жирным кислотам. Однако относительное содержание ценных линолевой и а-линоленовой кислот в конечном продукте повышается незначительно.

2 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы. Мицеллярные системы

Другим подходом позволяющим избежать стадии эмульгирования субстрата является применение органических сред. В частности хорошие результаты показывают мицеллярные системы.

Был изучен гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы в системе обращенных мицелл поверхностно-активного вещества АОТ (ди-(2-этил)-гексиловый эфир натриевой соли сульфоянтарной кислоты) и подобраны оптимальные условия.

Показано, что при гидролизе льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы при изменяющихся концентрациях субстрата наблюдается увеличение выхода жирных кислот до определенной насыщающей концентрации, которая для льняного масла составила 157 мкМ/мл, для рапсового масла - 50 мкМ/мл. Гидролиз рапсового масла панкреатической липазой протекает со значительно более низким выходом жирных кислот.

Методом двойных обратных координат (метод Лайнуивера-Берка) были рассчитаны значения констант уравнения Михаэлиса-Ментен (Км и Утах). Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Значения Ки и Vmax

Ферментный препарат Субстрат К„, мкМ Vmax, мкМ/мг-мин

Панкреатическая липаза Льняное масло (пентан) 161,3 16,0

Рассчитать значения Км и \/тах при гидролизе рапсового масла ферментным препаратом панкреатической липазы не представляется возможным.

Зависимость каталитической активности ферментного препарата панкреатической липазы от степени гидратации мицелл в процессе гидролиза растительных масел имеет вид кривых, представленных на рис. 1.

О 200 400 600 800 1000 1200 Степень гидратации обращенных мицелл, со,.

Рис. 1 - Влияние степени гидратации на ферментативный гидролиз растительных масел ферментным препаратом панкреатической липазы в системе обращенных мицелл АОТ: 1 - гидролиз льняного масла; 2 - гидролиз рапсового масла

Условия эксперимента; среда - пентан; концентрация АОТ - 0,05 М/л; рН 7,4; время реакции - 1 час

Согласно представленным данным для панкреатической липазы наблюдаются ярко выраженные максимумы при значении степени гидратации (а>0) равном 56. Увеличение содержания воды в системе приводит к уменьшению выхода жирных кислот.

Был рассчитан радиус внутренней полости мицеллы солюбилизирующей панкреатическую липазу, который составил гт = 88 А (8,8 нм).

Ферменты можно разделить на две группы: способные и неспособные взаимодействовать с мицеллярной матрицей. Тестом на эту способность является зависимость каталитической активности ферментов от концентрации ПАВ в мицеллярной системе. Данные, полученные при гидролизе растительных масел ферментным препаратом панкреатической липазы, представлены на рис. 2.

§ ю-

« о -I-1-1-1-—|-1-1

О 0,02 0,04 0,06 0,08 ОД 0,12 Концентрация АОТ, М/л

Рис. 2 - Влияние количества АОТ на гидролиз растительных масел ферментным препаратом панкреатической липазы в системе обращенных мицелл: 1 - гидролиз льняного масла; среда -декан; 2 - гидролиз рапсового масла; среда - гексан

Условия эксперимента: рН 7,4; время реакции - 1 час

Из данных представленных на рис. 2 видно, что активность панкреатической липазы при гидролизе как льняного, так и рапсового масел зависит от концентрации АОТ, свидетельствуя о взаимодействии липазы с внутренней поверхностью мицеллы. Увеличение концентрации молекул АОТ в среде до 0,09 М/л способствует небольшому росту каталитической активности фермента.

Увеличение концентрации молекул АОТ в системе обращенных мицелл приводит к увеличению числа меньших по размеру мицелл, соответственно, происходит перераспределение воды в мицеллах и изменение степени гидратации, величина которой составила со0 = 31. Это способствует уменьшению радиуса мицеллы гт= 50,5 А (по расчету гт = 5,05 нм, по сравнению сгш= 8,8 нм, полученным ранее) и, как следствие, к увеличению поверхности раздела фаз.

Установлено, что наиболее высокий выход жирных кислот при гидролизе льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы наблюдается в среде декана, а при гидролизе рапсового масла - в среде гексана.

Применяя систему обращенных мицелл АОТ в качестве среды реакции ферментативного гидролиза льняного и рапсового масел, становится возможным снизить оптимальную температуру реакции с 37 °С до 25 °С.

Повысить скорость гидролитического процесса возможно изменяя содержание фермента в среде. Согласно полученным данным, выход жирных кислот в ходе гидролиза льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы максимален при концентрации фермента в системе - 0,07 мг/мл (соа = 31).

Полученные результаты по влиянию времени на ферментативный гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы представлены на рис. 3-6.

Рис. 3 - Влияние времени на выход жирных кислот при гидролизе льняного масла фер ментным препаратом панкреатической липазы: 1 - среда - декан; 2 - среда - вода

Условия эксперимента: концентрация субстрата - 157 мкМ/мл; и>о 31; концентрация АОТ -0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента - 0,07 мг/мл

150 -|

20 Время, ч

Рис. 4 - Влияние времени на скорость гидролиза льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы: 1 - среда - декан; 2 - среда - вода

Условия эксперимента: концентрация субстрата - 157 мкМ/мл; а>о31; концентрация АОТ -0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента - 0,07 мг/мл

Рис. 5 - Влияние времени на выход жирных кислот при гидролизе рапсового масла ферментным препаратом панкреатической липазы: 1 - среда - гексан; 2 - среда - вода

Условия эксперимента: концентрация субстрата - 50 мкМ/мл; си» 31; концентрация АОТ -0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента - 0,07 мг/мл

Рис. 6 - Влияние времени на скорость гидролиза рапсового масла ферментным препаратом панкреатической липазы: I - среда - гексан; 2 - среда - вода

Условия эксперимента: концентрация субстрата - 50 мкМ/мл; соо 31; концентрация АОТ -0,09 М/л; рН 7,4; концентрация фермента - 0,07 мг/мл

Таким образом, для ферментного препарата панкреатической липазы при гидролизе льняного и рапсового масел в системе обращенных мицелл АОТ в среде органического растворителя оптимальное время процесса составило 30 ч.

По полученным данным были рассчитаны каталитические константы скоростей реакций ферментативного гидролиза льняного и рапсового масел. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4

Значения кы, рассчитанные для процесса гидролиза льняного и рапсового

масел ферментным препаратом панкреатической липазы

кы, ч *'

Льняное масло Рапсовое масло

декан вода гексан вода

0,0163 0,0025 0,0098 -

Как видно из представленных в таблице 4 данных, при аналогичных условиях проведения процесса число каталитических актов совершаемых активным центром панкреатической липазы при гидролизе льняного масла в среде декана в 6,5 раз выше, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ.

3 Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa.

Мицеллярные системы

Гидролиз льняного масла также был осуществлен с помощью липазы из Candida rugosa с использованием мицеллярной системы АОТ.

Показано, что при концентрации льняного масла в системе 157 мкМ/мл наблюдается максимальный выход продуктов гидролиза.

Методом двойных обратных координат (метод Лайнуивера-Берка) были рассчитаны значения констант уравнения Михаэлиса-Ментен (Км и Vmax) для гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa. Данные представлены в таблице 5.

Таблица 5

Значения Км и Vmax

Ферментный препарат Субстрат КМ! мкМ Vmaxi мкМ/мг-мин

Липаза из Candida rugosa Льняное масло (гексан) 433,3 77,5

--Низкое значение Км при гидролизе льняного масла ферментным препаратом--------

панкреатической липазы (Км=161,3 мкМ) свидетельствует о том, что панкреатическая липаза обладает большим сродством к льняному маслу, чем липаза из Candida rugosa.

В то же время значение Vmax при гидролизе льняного масла липазой из Candida rugosa значительно превышает максимальную скорость гидролиза панкреатической липазой (Vmax=16,0 мкМ/мгмин), что связано с изначально более высокой каталитической активностью исходного фермента.

Зависимость выхода продуктов гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa от степени гидратации мицеллярной системы приведена на рис. 7.

fe" 40

0 200 400 600 800 1000 1200 Степень гидратации мицелл, ю»

Рис. 7 - Влияние степени гидратации на ферментативный гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл АОТ

Условия эксперимента: среда - гексан; концентрация АОТ - 0,05 М/л; pH 7,4; время реакции -1 час

Зависимость представленная на рис. 7 имеет три максимума: первый максимум - при 0о 167, второй - при ь>о 778 и третий - при а>0 1000. Наличие нескольких максимумов может свидетельствовать о нескольких фазовых переходах в системе при изменяющихся концентрациях воды. В точке максимальной каталитической активности фермента происходит геометрическое совпадение внутренней полости мицеллы с молекулой фермента. Радиус внутренней полости мицеллы, солюбилизи-рующей липазу из Candida rugosa при со0 167 составляет гт = 254,5 Á (25,4 нм); при шо778 -гт = 1171 А (117,1 нм)иприш0 1000-rm= 1504 А (150,4 нм).

Несмотря на то, что в целом состав молекулы панкреатической липазы не является исключительно гидрофобным, ее вторичная и третичная структуры, согласно литературным данным, возможно, таковы, что значительное число неполярных аминокислот находится на поверхности молекулы, а не спрятано внутри. В связи с этим молекула панкреатической липазы требует меньшего объема гидратно-сольватной оболочки. Проведенные исследования это подтверждают. Уменьшение степени гид-

ратации (с 56 до 31) и соответственно радиуса мицелл (с 8,8 нм до 5,05 нм) приводит к увеличению активности панкреатической липазы.

Липаза из Candida rugosa проявляет максимальную активность при значительно более высокой степени гидратации мицелл (рис.7). Таким образом, можно предположить наличие большего числа гидрофильных групп на поверхности белка и необходимость более объемной гидратно-сольватной оболочки белковой молекулы для проявления максимальной активности данным ферментом.

Изменяя концентрацию ПАВ в мицеллярной системе, также становится возможным регулировать каталитическую активность фермента. Данные по влиянию количества АОТ на выход продуктов гидролиза представлены на рис. 8.

еа

0 0,05 0,1 0,15

Концентрация АОТ, М/л

Рис. 8 — Влияние количества АОТ на гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в мицеллярной системе

Условия эксперимента: среда - гептан; рН 7,4; время реакции - 1 час

Согласно данным, приведенным на рис. 8, характер влияния концентрации АОТ на гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa отличается от влияния количества АОТ на гидролиз льняного масла ферментным препаратом панкреатической липазы. На кривой, представленной на рис. 8, наблюдается два пика. Первый соответствует содержанию АОТ в системе 0,03 М/л, второй - 0,1 М/л. Наличие двух максимумов на кривой, представленной на рис. 8, может наблюдаться в связи с фазовыми переходами, а также с перераспределением воды и фермента в мицеллах при изменяющихся концентрациях АОТ. Изменение оптимальной концентрации АОТ предполагает изменение степени гидратации системы, величина которой составила 0)0 = 1111, радиус мицеллы гт = 1670,5 Á (167,05 нм) при содержании АОТ - 0,03 М/л и cüo = 333, радиус мицеллы rm= 504 Á (50,4 нм) при содержании АОТ- 0,1 М/л.

Таким образом, для липазы из Candida rugosa наблюдается сложный характер зависимости протекания реакции гидролиза в мицеллярной системе как в зависимости от содержания воды, так и от содержания АОТ. Все это свидетельствует о том, что липаза из Candida rugosa представляет собой более лабильную систему, способную к легкой перестройке в зависимости от условий окружающей среды, по сравнению с более компактной панкреатической липазой.

В качестве органического растворителя при гидролизе льняного масла липазой из Candida rugosa использовали гексан, гептан, октан и декан. Как показали исследования, наилучшим растворителем является гептан.

Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл ЛОТ также дает возможность снизить оптимальную температуру процесса с 37 °С до 25 °С.

Установлено, что выход жирных кислот в ходе гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa максимален при концентрации фермента в системе -0,5 мг/мл {со0 = 333).

Данные по влиянию времени на ферментативный гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa представлены на рис. 9 и 10.

Время, ч

Рис. 9 - Влияние времени на выход жирных кислот при гидролизе льняного масла липазой из Candida rugosa'. 1 - среда - гептан; 2 - среда - вода

Условия эксперимента: концентрация субстрата - 157 мкМ/мл; а>о 333; концентрация АОТ -0,10М/л; рН 7,4; концентрация фермента-0,5 мг/мл

Время, ч

Рис. 10 - Влияние времени на скорость гидролиза льняного масла липазой из Candida rugosa: 1 - среда - гептан; 2 - среда - вода

Условия эксперимента: концентрация субстрата -157 мкМ/мл; соц 333; концентрация АОТ -0,10 М/л; рН 7,4; концентрация фермента - 0,5 мг/мл

Для липазы из Candida rugosa при гидролизе льняного масла оптимальное время процесса составило 24 ч для водной среды и 30 ч для среды гептана.

Согласно данным, представленным на рис. 10, увеличение времени проведения гидролиза льняного масла в системе мицелл АОТ сопровождается уменьшением

скорости реакции. При гидролизе эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ обнаруживается кажущаяся независимость скорости реакции от времени. По полученным данным были рассчитаны каталитические константы скорости реакции ферментативного гидролиза льняного масла. Данные представлены в таблице 6.

Таблица 6

Значения рассчитанные для процесса гидролиза льняного масла

кы, ч Льняное масло

гептан вода

0,0061 0,0009

Приведенные в таблице б результаты, свидетельствуют о том, что число каталитических актов совершаемых активным центром липазы в среде гептана почти в 7 раз выше, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ.

4 Активация и стабилизация ферментного препарата панкреатической липазы неорганическими соединениям»

Влияние на активность липаз может оказывать целый ряд веществ - желчно-кислые соли, белки, различные виды эмульгаторов, неорганические соединения.

Было изучено влияние хлоридов кальция и магния, сульфата магния на активность ферментного препарата панкреатической липазы. Показано, что панкреатическая липаза обладает более низкой активностью при отсутствии ионов кальция или магния в среде. В то же время внесение этих солей приводит к его активации. Полученные результаты приведены в таблице 7.

Таблица 7

Влияние некоторых солей на активность ферментного препарата

_ панкреатической липазы__

Вещество Эмульсия с размером частиц с!< 85-10° м Эмульсия с размером частиц (1<250 10"5м

Оптимальная концентрация активатора, М/л Прирост активности, % Оптимальная концентрация активатора, М/л Прирост активности, %

СаС12 0,02 27 0,05 94

М§С12 0,06 15 0,04 59

Мг504 - - 0,03 39

Диапазон исследуемых концентраций хлоридов кальция и магния, сульс )ата магния

0,01 М/л до 0,09 М/л.

Контрольная липолитическая активность ферментного препарата панкреатической липазы -129 ед./мг (100 %).

Как показывают результаты исследования, степень влияния неорганических соединений на скорость реакции гидролиза зависит от размера частиц эмульгированного субстрата. При этом прирост липолитической активности при введении хлорида кальция или хлорида магния в среду с большим размером частиц эмульсии существенно превышает прирост активности в эмульсии с меньшим размером частиц.

Сульфат магния показал более низкий активирующий эффект, чем хлорид магния.

5 Иммобилизация ферментных препаратов липаз в агаровый гель

Исследована иммобилизация липаз различного происхождения в гель агара.

В процессе работы иммобилизации подверглись ферментный препарат панкреатической липазы, липаза из Candida rugosa и препарат "Novozyme 868".

При использовании стандартного метода иммобилизации липаз в гель агара получены иммобилизованные препараты с крайне низкой активностью. Установлено, что внесение хлорида кальция в агаровый гель позволяет не только сохранить исходную активность, но и значительно ее повысить. Данные приведены в таблице 8.

Таблица 8

Активность иммобилизованных в гель агара препаратов липаз_

Ферментный препарат Удельная липолитическая активность, ед./мг (ед./мкл)

Исходного фермента Иммобилизованного фермента Иммобилизованного фермента при внесении хлорида кальция в оптимальной концентрации

Панкреатическая липаза 129,0 35,0 1592

Липаза из Candida rugosa 346,0 31,5 1740

"Novozyme 868" 178,0 0,0 2158

Показано, что удельная активность иммобилизованных ферментных препаратов липаз плавно возрастает с повышением концентрации хлорида кальция (диапазон концентраций составлял 0,1-1,1 М/л) и достигает максимального значения при содержании хлорида кальция в агаре 0,8 М/л для панкреатической липазы и препарата "Novozyme 868", для липазы из Candida rugosa - 0,8-0,9 М/л.

Иммобилизация в гель агара ферментных препаратов липаз позволяет повысить их липолитическую активность относительно активности исходных ферментов: ферментного препарата панкреатической липазы - в 12,4 раза; липазы из Candida rugosa - в 5 раз; препарата "Novozyme 868" - в 11,6 раз.

Установлена возможность проведения ферментативного гидролиза не эмульгированного льняного масла иммобилизованными ферментными препаратами липаз.

ВЫВОДЫ

1. Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе масло/вода без внесения эмульгатора, позволяет выделить липидный продукт, обогащенный а-линоленовой кислотой. Относительное содержание ценной со-З-ПНЖК в липидном продукте увеличилось с 49,5 % до 66,7 %.

Установлено, что в данной системе липаза из Candida rugosa проявляет более высокую специфичность по отношению к насыщенным, а также моно- и диненасы-щенным жирным кислотам. Для выделения высших жирных кислот и отделения их от модифицированного масла (липидного продукта) применен метод холодной рафинации.

Панкреатическая липаза в системе масло/вода практически не осуществляет гидролиз растительных масел.

2. Установлено, что панкреатическая липаза способна расщеплять льняное масло в системе обращенных мицелл АОТ в среде декана в 3,3 раза эффективнее, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ. Гидролиз рапсового масла в среде гексана в 16,5 раз эффективнее гидролиза стабилизированной АОТ эмульсии масло/вода.

Определены оптимальные условия для проведения гидролиза льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы. Выход жирных кислот в оптимальных условиях составил 85 % для льняного масла и 45 % - для рапсового масла.

3. Фермент панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфичен по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенных жирных кислот, чем остатки насыщенных и мононенасыщенных кислот, что приводит к тому, что в системе обращенных мицелл АОТ в среде декана льняное масло гидролизуется почти в 2 раза эффективнее рапсового масла.

4. Установлено, что гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе мицелл АОТ лучше всего протекает в среде гептана и в 3,6 раз более эффективен, чем в эмульсии масло/вода, стабилизированной АОТ. Выход жирных кислот в оптимальных условиях составил 36 %.

5. Установлено, что на липолитическую активность и стабильность ферментного препарата панкреатической липазы оказывают активирующий эффект хлориды кальция и магния, сульфат магния. Подобраны оптимальные концентрации активирующих добавок.

6. Получены иммобилизованные препараты липаз с высокой удельной активностью. Активность иммобилизованных ферментных препаратов выше липолитиче-ской активности исходных ферментов: ферментного препарата панкреатической липазы - в 12,4 раза; липазы из Candida rugosa - в 5 раз, препарата "Novozyme 868" - в 11,6 раз.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Васина, K.JI. Иммобилизация и стабилизация ферментных препаратов липаз / K.JL Васина [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. - 2007. -№ 2. - С. 103-108.

2. Гамаюрова, B.C. Влияние ионов металлов на активность ферментного препарата панкреатической липазы / B.C. Гамаюрова, K.JI. Васина // Бутлеровские сообщения. - 2007. ~Т. 12, № 7. - С. 51-54.

3. Ферментативные процессы, осуществляемые липазами в неводных средах / К.Л. Васина [и др.] // Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии: сб. науч. тр. - М.: ПищПромиздат, 2008. - С. 135-146.

4. Vasina, K.L. Enzymatic hydrolysis of linseed oil in reversed micelles / K.L. Vasina, M.E. Zinovjeva, V.S. Gamaurova // Ферменты микроорганизмов в биотехнологии и медицине: тез. докл. XIV Международ, конф. - Казань: КГУ, 2009. - С. 90-91.

5. Гамаюрова, B.C. Влияние воды на ферментативный гидролиз растительных масел в неводных средах / B.C. Гамаюрова, К.Л. Васина // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: материалы Международ, науч.- практ. конференции. - М.: ЗАО "Экспо-биохим-технологии", РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2008. - С. 264.

______6. Васина, _К.Л. Иммобилизация ферментных препаратов липаз / К.Л. Васина,

М.Е. Зиновьева, B.C. Гамаюрова // Пищевые технологии и биотехнологии: тез. докл. X Международ, конф. молодых ученых. - Казань: Изд-во «Отечество», 2009. - С. 234.

7. Васина, К.Л. Влияние ионов кальция и магния на активность ферментного препарата панкреатической липазы / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, B.C. Гамаюрова // Материалы конкурса студ. науч.-исслед. работ, 2007. - С. 276.

8. Васина, К.Л. Влияние гексана на ферментативный гидролиз льняного масла в системе обращенных мицелл / К.Л. Васина, B.C. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 5-9 февраля 2007 г. - Казань: Изд-во Казан, гос. технол. ун-та, 2007. - С. 244.

9. Васина, К.Л. Влияние ионов кальция на активность иммобилизованной панкреатической липазы / К.Л. Васина, B.C. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 5-9 февраля 2007 г. - Казань: Изд-во Казан, гос. технол. ун-та, 2007. - С. 245.

10. Васина, К. Л. Ферментативный гидролиз растительных масел в системе обращенных мицелл АОТ / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 4-8 февраля 2008 г. - Казань: Изд-во Казан, гос. технол. ун-та, 2008. - С. 241.

11. Васина, К.Л. Получение полиненасыщенных жирных кислот ферментативным гидролизом растительных масел / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, B.C. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 3-6 февраля 2009 г. - Казань: Изд-во. Казан. гос. технол. ун-та, 2008. - С. 237.

12. Васина, К.Л. Иммобилизация липаз в агаровый гель / К.Л. Васина, М.Е. Зиновьева, B.C. Гамаюрова // Научная сессия. Аннотации сообщений, 3-6 февраля 2009 г. - Казань: Изд-во. Изд-во. Казан, гос. технол. ун-та, 2008. - С. 238.

Соискатель

К.Л. Шнайдер

Подписано к печати 23.11.2009 Формат 60x84/1 б.Бумага офсетная. Усл.-печ.л. 1.0.Печать резографическая.

Тираж 100 экз.. Заказ 330 Отпечатано с готовых оригинал макетов.

420029,г.Казань,ул.Сибирский тракт,34 ЗАО «Альфа-Т, тел. 510-96-35

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Шнайдер, Ксения Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Ферменты в неводных средах.

1.1.1 Выбор растворителя для проведения реакции.

1.1.2 Основные подходы к реализации процессов, протекающих в средах с низким содержанием воды (макрогетерогенные двухфазные системы, микрогетерогенные реакционные среды).

1.1.2.1 Макрогетерогенные двухфазные системы.

1.1.2.1.1 Системы жидкость - жидкость.

1.1.2.1.2 Системы жидкость - твердая фаза.

1.1.2.2 Микрогетерогенные реакционные среды.

1.1.2.2.1 Система обращенных мицелл.

1.1.2.2.2 Бездетергентные микроэмульсии.

1.1.2.2.3 Ферменты, модифицированные полиэтиленгликолем.

1.2 Липазы в неводных средах.

1.2.1 Липазы общая характеристика.

1.2.2 Применение липаз в неводных средах.

1.3 Полиненасыщенные жирные кислоты семейства оэ-3.

1.3.1 Значение полиненасыщенных жирных кислот семейства со-3.

1.3.2 Источники полиненасыщенных жирных кислот семейства со-3.

1.4 Модификация жиров и масел липазами.

1.4.1 Химический и ферментативный гидролиз жиров и масел.

1.4.2 Химическая и ферментативная переэтерификацйя жиров и масел.

1.4.3 Иммобилизация липаз.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Ферментные препараты.

2.1.2 Субстраты.

2.1.3 Детергенты.

2.1.4 Растворители и другие реагенты.

2.2 Методы исследования. 2.2.1 Определение активности липазы (модифицированный метод Ота, Ямада).

2.2.2 Влияние ионов металлов на активность ферментного препарата панкреатической липазы.

2.2.3 Колориметрический метод определения активности ферментных препаратов липаз.

2.2.5 Иммобилизация ферментных препаратов липаз.

2.2.6 Изучение процесса ферментативного гидролиза иммобилизованными препаратами липаз.

2.2.7 Иммобилизация ферментного препарата панкреатической липазы в гель агара в присутствии АОТ.

2.2.8 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз в системе масло/вода.

2.2.9 Получение натриевых солей жирных кислот.

2.2.10 ИК-спектроскопия полученных образцов.

2.2.11 Определение качественного и количественного состава высших жирных кислот методом газожидкостной хроматографии.

2.2.12 Получение кальциевых солей жирных кислот.

2.2.13 ИК-спектроскопия кальциевых солей жирных кислот.

2.2.14 Анализ липидов методом тонкослойной хроматографии.

2.2.15 Обработка полученных результатов.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментными препаратами липаз в системе масло/вода.

3.2 Гидролиз растительных масел ферментными препаратами липаз. Мицеллярные системы.

3.2.1 Гидролиз льняного и рапсового масел ферментным препаратом панкреатической липазы.

3.2.2 Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa.

3.3 Активация и стабилизация ферментного препарата панкреатической липазы неорганическими соединениями.

3.4 Иммобилизация ферментных препаратов липаз в гель агара.

3.4.1 Проведение ферментативного гидролиза иммобилизованными препаратами липаз.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Ферментативный гидролиз растительных масел с использованием неводных сред"

В настоящей работе объектами исследования являются растительные масла различного жирно-кислотного состава — льняное и рапсовое масла. Эти масла важны, как для пищевой промышленности, так и для технических целей. Так, химический гидролиз рапсового масла является основой для крупнотоннажного получения ПАВ.

К перспективнейшим объектам исследования среди растительных масел можно отнести льняное масло, содержание со-3 ПНЖК (а-линоленовой кислоты) в котором составляет 35-65 % к сумме кислот. Благодаря своему жирно-кислотному составу и присутствию антиоксидантов льняное масло используется для профилактики и комплексного лечения многих заболеваний.

Наряду с льняным маслом неплохим источником а-линоленовой кислоты может служить рапсовое масло.

Современные сорта рапса содержат 40-49 % масла, богатого олеиновой (45-70 %), линолевой (15-28 %) и линоленовой (6-13 %) кислотами, вследствие чего рапсовое масло можно отнести к ценным растительным маслам.

Для пищевой промышленности указанные масла представляют ценность, как источники незаменимых со-3 и со-6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) - линолевой и а-линоленовой кислот, которые выполняют функцию особого витамина, получившего наименование витамин F. ПНЖК семейства со-3 и со-6 обладают широким спектром лечебно-профилактического действия, так как они являются биологическими предшественниками эйкозаноидов и структурными блоками биологических мембран.

В связи с этим интерес исследователей различного профиля к незаменимым ПНЖК семейств со-3 и со-6 чрезвычайно высок. При этом если источники ПНЖК семейства со-6 довольно распространены, то гораздо более ограничен круг источников ПНЖК семейства со-3. Поэтому поиск новых источников со-3 ПНЖК, доступных и легко усвояемых является актуальной задачей. Для получения продуктов с повышенным содержанием со-3 ПНЖК, а, следовательно, с повышенной пищевой ценностью была использована ферментативная трансформация растительных масел липазами различного происхождения.

Научная новизна. Панкреатическая липаза и липаза из Candida rugosa гидролизуют растительные масла в органических средах (углеводороды) в ми-целлярных системах АОТ гораздо эффективнее, чем в эмульсии масло/вода стабилизированной АОТ.

Панкреатическая липаза в системе обращенных мицелл АОТ специфична по отношению к жирно-кислотному составу гидролизуемых масел и легче отделяет в ацилглицеридах остатки полиненасыщенных жирных кислот, чем насыщенных и мононенасыщенных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Заключение диссертации по теме "Катализ"

выводы

1. Гидролиз льняного масла липазой из Candida rugosa в системе масло/вода без внесения эмульгатора, позволяет выделить липидный продукт, обогащенный а-линоленовой кислотой. Относительное содержание ценной со-3-ПНЖК в липидном продукте увеличилось с 49,5 % до 66,7 %.

Установлено, что в данной системе липаза из Candida rugosa проявляет более высокую специфичность по отношению к насыщенным, а также моно- и диненасыщенным жирным кислотам. Для выделения высших жирных кислот и отделения их от модифицированного масла (липидного продукта) применен метод холодной рафинации.

Панкреатическая липаза в системе масло/вода практически не осуществляет гидролиз растительных масел.

6. Получены иммобилизованные препараты липаз с высокой удельной активностью. Активность иммобилизованных ферментных препаратов выше липолитической активности исходных ферментов: ферментного препарата панкреатической липазы - в 12,4 раза; липазы из Candida rugosa - в 5 раз, препарата "Novozyme 868" - в 11,6 раз.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Шнайдер, Ксения Леонидовна, Казань

1. Варфоломеев, С.Д. Химическая энзимология / С.Д. Варфоломеев. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 480 с.

2. Кирейко, А.В. Ферментативное определение рядя лекарственных веществ в прямых и обращенных мицеллах додецилсульфата натрия / А.В. Кирейко, И.А. Веселова, Т.Н. Шеховцова // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. -2007. Т. 48, № 4. - С. 255-270.

3. Kobayashi Т. Reaction equilibrium for lipase-catalyzed condensation in organic solvent systems / T. Kobayashi, S. Adachi // Biotechnol. Lett. 2004. - Vol. 26, № 19.-P. 1461-1468.

4. Мартинек, К. Сдвиг химического равновесия в двухфазных водно-органических системах и препаративный органический синтез / К. Мартинек, А.Н. Семенов, И.В. Березин // Доклады академии наук. 1980. — Т. 252, № 2. -С. 394-398.

5. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах / К. Холмберг и др.; пер. с англ. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - 528 с.

6. Enhanced activity and stability of ionic liquid-pretreated lipase / D. T. Dang et al. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2007. -№ 45. - P. 118-121.

7. Биотехнология: учеб. пособие для вузов.: в 8 кн. / под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 7: Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин и др. - М.: Высшая школа, 1987. - 159 с.

8. Халгаш, Я. Биокатализаторы в органическом синтезе / Я. Халгаш; пер. со словац. М.: Мир, 1991. - 204 с.

9. Конструирование биокаталитических систем в органических растворителях с малым содержанием воды / Ю.Л. Хмельницкий и др. // Биотехнология. 1988. - Т. 4, № 3. - С. 292-303.

10. Ферментативные реакции в водно-органических смесях: критерий для выбора оптимального органического растворителя / A.M. Клибанов и др. // Биоорганическая химия. 1978. — Т. 4, № 1. - С. 82-87.

11. Sivalingam G. Solvent effects on the lipase catalyzed biodegradation of poly(s-caprolactone) in solution / G. Sivalingam, S. Chattopadhyay, G. Madras // Po-lym. Degrad. and Stab. 2003. - Vol. 79, № 3. - P. 413-418.

12. Stability of hydrolytic enzymes in water-organic solvent systems / L.M. Simon et al. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1998. - Vol. 4, № 1-2.-P. 41-45.

13. Villeneuve P. Lipases in lipophilization reactions / P. Villeneuve // Biotechnology Advances. 2007. - doi: 10.1016/j.biotechadv.2007.06.001.

14. Enhanced activity and stability of immobilized lipases by treatment with polar solvents prior to lyophilization / J.C. Wu et al. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2007. - № 45. - P. 108-112.

15. Enzymatic dehydrogenation of steroids by b-hydroxysteroid dehydrogenase in two-phase system / P. Cremonesi et al. // Arch. Biochem. Biophys. 1973. -Vol. 159-P. 7-10.

16. Аринбасарова, А.Ю. Использование водно-органических систем в эн-зиматической трансформации стероидов / А.Ю. Аринбасарова, К.А. Кощенко // Прикладная биохимия и микробиология. — 1984. Т. 19, № 1. - С. 20-29.

17. Реут, Е.Н. Выделение мио-инозита из растворов ферментативной биотрансформацией / Е.Н. Реут, М.М. Рахимов // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, №4.-С. 413-418.

18. Горохова, И.В. Соосаждение липазы Pseudomonas fluorescens с гидрофобными соединениями как подход к ее иммобилизации при катализе в неводных средах / И.В. Горохова, А.Е. Иванов, В.П. Зубов // Биоорганическая химия.- 2002. Т. 28, № 1. - С. 44-49.

19. Биохимический способ получения сложных эфиров жирных кислот / Е.В. Крюкова и др. // Прикладная биохимия и микробиология. — 1993. Т. 29, № 3. - С. 370-373.

20. Смирнова, Н.А. Фазовое поведение и формы самоорганизации растворов смесей поверхностно-активных веществ / Н.А. Смирнова // Успехи химии.- 2005. Т. 74, № 2. - С. 138-154.

21. Жуджикова, Г.В. Молекулярно-динамическое моделирование микроагрегатов ПАВ в неполярной среде н-октана / Г.В. Жуджикова, Е.Н. Бродская // Коллоидный журнал. 2005. - Т. 67, № 4. - С. 500-507.

22. Бендер, М. Биоорганическая химия ферментативного катализа / М. Бендер, Р. Бергерон, М. Комияма; пер. с англ. М.: Мир, 1987. - 352 с.

23. Мицеллярная энзимология. Каталитическая активность пероксидазы в коллоидном растворе воды в органическом растворителе / К. Мартинек и др. // Доклады академии наук. 1983. - Т. 269, № 2. - С. 491-493.

24. Мицеллярная энзимология / К. Мартинек и др. // Биологические мембраны. 1985. - Т. 2, № 7. - С. 669-689.

25. Образование и свойства микроэмульсий, стабилизированных оксиэти-лированными глицеридами / Т.В. Глухова и др. // Коллоидный журнал. 2005. -Т. 67, №3.- С. 328-332.

26. Давранов, К.Д. Синтетазная активность липазы из Penicillium sp. в водной среде и в системе обращенных мицелл / К.Д. Давранов, В.Б. Халамей-зер, О.Н. Вагина // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32, № 4. -С. 386-388.

27. Захарченко, H.JI. Влияние микроокружения трипсина на константы скорости элементарных стадий реакции гидролиза этилового эфира >Г-бензоил1.аргинина / H.JI. Захарченко, E.A. Ермакова, Ю.Ф. Зуев // Биоорганическая химия. 2008. - Т. 34, №3. - С. 404-408.

28. Исследование щелочного и ферментативного гидролиза п-нитрофенилацетата в перколирующей микроэмульсии вода-масло на основе АОТ / H.JI. Захарченко и др. // Вест. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2000. -Т.41, № 6. - С. 386-389.

29. Павленко, И.М. Влияние химической модификации липазы на регуляцию липолитической активности в системе обращенных мицелл / И.М. Павленко, H.JI. Клячко, А.В. Левашов // Биоорганическая химия. 2005. - Т. 31, № 6. -С. 593-601.

30. Особенности иммобилизации субстрата и каталитическая активность трипсина в обращенной микроэмульсии / Ю.Ф. Зуев и др. // Вест. Моск. Унта. Сер. 2. Химия.-2003.-Т. 44, № 1.-С. 13-15.

31. Влияние заряда межфазной поверхности на структуру и активность трипсина в обращенных мицеллах / Ю.Я. Валиуллина // Биоорганическая химия. 2008. - Т. 34, № 3. - С. 399-403.

32. Гликозилированный а-химотрипсин в системах обращенных мицелл Аэрозоля ОТ в октане как модель в изучении роли углеводных фрагментов в гликопротеинах / Р. В. Рарий и др. // Биоорганическая химия. 1994. - Т. 20, № 3. - С. 249-256.

33. Замена воды на водно-органическую смесь в системах обращенных мицелл — путь к повышению эффективности ферментативного катализа / H.JT. Клячко и др. // Биоорганическая химия. 1990. - Т. 16, № 5. - С. 581-589.

34. Бездетергентные микроэмульсии как среда для ферментативных реакций: каталитические свойства лакказы в трехкомпонентной системе гексанпронанол-2 вода / Ю. JI. Хмельницкий и др. // Биоорганическая химия. — 1989. - Т. 15, № 12. - С. 1611-1617.

35. Ферментативная активность комплексов полимер-белок в смешивающихся с водой органических растворителях / И.К. Сакодынская и др. // Биоорганическая химия. 1999. - Т. 25, № 6. - С. 439-443.

36. Этилен гликоль и термостабильность трипсина в системе обращенных мицелл / Е.А. Ступишина и др. // Биохимия. 2006. — Т. 71, № 5. - С. 660-665.

37. Barsi М. Synthesis of fatty esters by polyethyleneglycol-modified lipase / M. Barsi //J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1995. - Vol. 64, № 1. - P. 10-16.

38. Vemura T. Polyethyleneglycol-modified lipase catalyzed asymmetric alco-holysis of decalactone in n-decanol / T. Vemura, M. Furukawa, Y. Kodera // Biotechnol. Lett.- 1995.-Vol. 17, № 1.-P. 61-66.

39. Chemoselectivity and enhanced activity of poly(ethyleneglycol)-modified lipases acylating hydrophilic aminoasid derivatives in organic solvents / C. Ebert et al. // Biotechnol. Techn. 1994. -Vol. 8, № 11. - P. 811-816.

40. Multiple effects of water on solvent-free enzymatic esterifications / M.L. Foresti et al. // Enzyme and Microbial Technology. 2007. - № 41. - P. 62-70.

41. Жеребцов, H.A. Ферменты: Их роль в технологии пищевых продуктов: учеб. пособие / Н.А. Жеребцов, О.С. Корнеева, Е.Д. Фаранжева. Воронеж: Издательство Воронежского государственного университета, 1999. — 120 с.

42. Исследование гидролиза в монослоях новых липидоподобных субстратов и трилаурина под действием липазы Pseudomonas fluorescens i С.Ю. Зайцев и др. // Биоорганическая химия. — 2000. — Т. 26, № 3. С. 224-230.

43. Биферментная система липаза/липоксигеназа в обращенных мицеллах АОТ в октане / И.М. Павленко и др. // Биоорганическая химия. 2002. - Т. 28, № 1.-С. 50-55.

44. Особенности выбора температуры для проведения реакции каталитического гидролиза масла сафлора под действием липазы из Candida rugoza / А.Б. Майдина и др. // Вест. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2008. - Т.49, № 2. -С. 134-137.

45. Кислухина, О.В. Биотехнологические основы переработки растительного сырья / О.В. Кислухина, И. Кюдулас. Каунас.: Технология, 1997. - 183 с.

46. Варфоломеев, С.Д. Каталитические центры гидролаз: структура и каталитический цикл / С.Д. Варфоломеев, И.А. Гариев, И.В. Упоров // Успехи химии.-2005.-Т. 74, № 1.-С. 68-83.

47. Варфоломеев, С.Д. Активные центры гидролаз: основные типы структур и механизм катализа / С.Д. Варфоломеев, А.Е. Пожитков // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. - Т. 41, № 3. - С. 147-156.

48. Amperometric biosensor based on Prussian Blue-modified screen-printed electrode for lipase activity and triacylglycerol determination / I.B. Rejeb et al. // Analytica Chimica Acta. 2007. - № 594. p. 1-8.

49. Transesterification of primary and secondary alcohols using Pseudomonas aeruginosa lipase / M. Singh et al. // Bioresource Technology. 2007. - doi: 10.1016/ j .biortech.2007.05.041.

50. Исследование особенностей строения активного центра липазы Rhizopus japonicus / Т.А. Ковалева и др. // Вестник ВГУ. Серия химия, биология. 2001.-№ 2. - С. 114-117.

51. Идентификация каталитически активных групп липазы зародышей семян пшеницы (Triticum aestivum L.) / О.С. Корнеева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - Т. 48, № 4. - С. 387-393.

52. Тырсин, Ю.А. Идентификация гистидина в активном центре липазы I Rhizopus oryzae 1403 / Ю.А. Тырсин, С.А. Шеламова // Вестник ОГУ. 2009. -№ 6. - С. 374-378.

53. Грачева, И.М. Технология ферментативных препаратов / И.М. Грачева. М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

54. Рубан, E.JI. Синтез и гидролиз липидов у микроорганизмов (Обзор) / E.JI. Рубан // Прикладная биохимия и микробиология. — 1980. — Т. XVI, № 4. — С. 490-501.59. http://opm.phar.umich.edu/species.php.cBo6oflHbm.

55. Давранов, К. Микробные липазы в биотехнологии (Обзор) / К. Давра-нов // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. — Т. 30, Вып. 4-5. — С. 527-533.

56. Вилкинсон, Д. Принципы и методы диагностической энзимологии / Д. Вилкинсон. М.: Медицина, 1981. - 624 с.

57. Activity and stability of Chromobacterium viscosum lipase in modified AOT reverse micelles / M.M.R. Talukder et al. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. - № 22. - P. 203-209.

58. Chen-Li C. Activity and stability of lipase in aerosol-OT / isooctane reverse micelles / C. Chen-Li // Biotechnology Techniques. 1999. - Vol. 13, № 7. -P. 453-457.

59. Gutierrez-Ayesta C. Relation between lipase structures and their catalytic ability to hydrolyse triglycerides and phospholipids / C. Gutierrez-Ayesta, A. A. Carelli, M. L. Ferreira // Enzyme and Microbial Technology. 2007. № 41. -P. 35-43.

60. Dandavate V. Novel approach for the synthesis of ethyl isovalerate using surfactant coated Candida rugosa lipase immobilized in microemulsion based organogels / V. Dandavate, D. Madamwar // Enzyme and Microbial Technology. — 2007. -№41. -P. 265-270.

61. Koike H. Enrichment of triglyceride docosahexanoic acid by lipase used as a hydrolysis medium in lecithin-based nano-scale molecular assemblage / H. Koike, M. Imai, I. Suzuki // Biochemical Engineering Journal. 2007. - № 36. - P. 38-42.

62. Характеристика семян льна и их применение в производстве продуктов питания / Л.П. Пащенко и др. // Хранение и переработка сельхозсырья. -2004.-№7.-С. 56-57.

63. Источники липидов в энтеральном и парентеральном питании / Г.И. Юсупова и др. // Вопросы питания. 2003. - № 3. - С. 32 - 35.

64. Трумина, Э.Н. О механизмах действия полиненасыщенных жирных кислот на иммунную систему / Э.Н. Трумина, O.K. Мустафина, М.Н. Волгарев // Вопросы питания. 2003. - № 3. - С. 35 - 40.

65. Конь, И.Я. Омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты в профилактике и лечении болезней детей и взрослых / И.Я. Конь, Н.М. Шилина, С.Б. Вольфсон // Лечащий врач. 2006. - № 4. - С. 14-17.

66. Нечаев, А.П. Растительные масла функционального назначения / А.П. Нечаев, А.А. Кочеткова // Масложировая промышленность. 2005. - №3. -С. 20-21.

67. Запасы и потенциальная продукция незаменимых полиненасыщенных жирных кислот зообентоса Енисея / М.И. Гладышев и др. // Доклады академии наук. 2004. - Т. 394, № 1.-С. 133-135.

68. Химия биологически активных природных соединений / под ред. Н.А. Преображенского. -М.: Химия, 1976. 456 с.

69. Ляпков, Б.Г. Молекулярные виды триацилглицеринов пищевых растительных масел / Б.Г. Ляпков, Д.Б. Меламед // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. - Т. 26, № 2. - С. 157-167.

70. Кулакова, С.Н. О растительных маслах нового поколения в нашем питании / С.Н. Кулакова, М.Г. Гаппаров, Е.В. Викторова // Масложировая промышленность. 2005. - № 1. - С. 4-8.

71. Некоторые факторы, определяющие стабильность растительных масел к окислению / А.Н. Лисицын и др. // Масложировая промышленность. 2005. — № 3. — С. 11-15.

72. Галкин, Ф.М. Особенности селекции льна масличного / Ф.М. Галкин // Масложировая промышленность. — 2000. — № 3. С. 13-14.

73. Паронян, В.Х. Пути обогащения жирнокислотного состава эмульсионного жирового продукта / В.Х. Паронян, К.Г. Восканян // Хранение и переработка сельхозсырья. 2005. - № 6. - С. 54.

74. Использование семян льна для повышения биологической ценности хлебобулочных изделий / Л.П. Пащенко и др. // Хранение и переработка сель-хозсырья. 2003. - № 4. - С. 82-85.

75. Характеристика семян льна и их применение в производстве продуктов питания / Л.П. Пащенко и др. // Хранение и переработка сельхозсырья. -2004. № 7. - С. 56-57.

76. Постолов, Ю.М. Руководство по технологии получения и переработки растительных масел и жиров: в 4 т. Т 4 / Ю.М. Постолов, А.Н. Николавский. — Ленинград: Издательство ВНИИ жиров, 1975. 375 с.

77. Пат 2 246 535 РФ МПК С2 С 11 С 1/06, С 07 С 51/087. Способ получения жирных кислот / A.M. Иванов, И.А. Иванов; заявитель и патентообладатель Курск, гос. технич. ун-т. № 2003108096/04; заявл. 24.03.2003; опубл. 20.02.2005.

78. Пат 2 166 534 РФ МПК С2 С 11 С 1/04. Способ получения жирных кислот / Ф.И.О.; заявитель и патентообладатель Курск, гос. технич. ун-т.- № 99112458/04; заявл. 08.06.1999; опубл. 10.05.2001.

79. Immobilization of lipase by ultrafiltration and cross-linking onto the poly-sulfone membrane surface / W. Yujun et al. // Bioresource Technology. 2007. -doi: 10.1016/ j .biortech.2007.05.014.

80. Production of a diacylglycerol-enriched palm olein using lipase-catalyzed partial hydrolysis: Optimization using response surface methodology / Cheong L.-Z. et al. // Food Chemistry. 2007. - doi: 10.1016/ j.foodchem.2007.03.070.

81. Mercon F. Enzymatic hydrolysis of babasso oil in a membrane bioreactor / F. Mercon, L. Geraldo // J. Amer. Oil Chem. Soc. 2000. - Vol. 77, № 10. -P. 1043-1048.

82. McNeill G.P. Isolation of erucic acid from rapeseed oil by lipase catalyzed hydrolysis / G.P. McNeill, P.E. Sonnet // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1995. - Vol. 72, №2-P. 213-218.

83. Douglas G. Isolation of fatty acids from Limnantes alba oil by lipase catalyzed hydrolysis / G. Douglas, R. Kleiman // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1993. - Vol. 70, №6. -P. 555-560.

84. Can A. Enrichment of hazelnut oil with long-chain n-3 PUFA by lipase-catalyzed acidolysis: optimization by response surface methodology / A. Can // J. Amer. Oil Chem. Soc. 2005. - Vol. 82, № 1. - P. 27-32.

85. Фермента переработка тваринних жир1в / П.О. Некрасов и др. // ITE: 1нтегров. технол. та енергозбереження. 2005. - № 3. — С. 95-99. - Реф. в: Химия и технология пищевых продуктов: науч.- реф. сб. — 2006. — Вып.6

86. Углеродсодержащие макроструктурированные керамические носители для адсорбционной иммобилизации ферментов и микроорганизмов. 1. Адсорбция глюкоамилазы / Г.А. Коваленко и др. // Биотехнология. — 2002. — № 3. — С. 55-66.

87. Li S.-F. Electrospun polyacrylonitrile nanofibrous membranes for lipase immobilization / S.-F. Li, J.-P. Chen, W.-T. Wu // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2007. - № 47. - P. 117-124.

88. Bayramoglu G. Immobilization of Candida rugosa lipase onto spacer attached poly-(GMA-HEMA-EGDMA) microspheres / G. Bayramoglu, В. Kaya, A. M. Yakup // Food Chem. 2005. - Vol. 92, № 2. - P. 261-268.

89. Иммобилизация липазы Rhizopus japonicus 1403 путем ковалентного связывания / C.A. Шеламова и др. // Биотехнология. 2001. - № 5. - С. 32—39.

90. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Т.А. Ковалева и др. // Сорбц. и хрома-тогр. процессы.-2005.-Т. 5, № 5.-С. 704-711.

91. Неклюдов, А.Д. Свойства препарата иммобилизованной липазы Rhizopus oryzae 14-14 / А.Д. Неклюдов, Б.Д. Шведов, В.В. Цибанов // Прикладная биохимия и микробиология. — 1981. Т. XVII, № 4. - С. 510-515.

92. Chowdary G.V. Synthesis of ethyl iosovalerate using Rhizomucor miehei lipase: optimization / G.V. Chowdary, S.G. Prapulla // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т. 39, № 3. - С. 278-283.

93. Многокомпонентные термочувствительные системы для биокатализа / Д.В. Капустин и др. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2005. -№2.-С. 443-448.

94. Multiple effects of water on solvent-free enzymatic esterifications / M.L. Foresti et al. // Enzyme and Microbial Technology. 2007. - № 41 - P. 62-70.

95. Fernandez-Lorente G. Effect of the immobilization protocol in the activity, stability, and enantioselectivity of Lecitase Ultra / G. Fernandez-Lorente et al. // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2007. - № 47. - P. 99-104.

96. Кока-Армас, X. Исследование некоторых каталитических свойств иммобилизованной липазы из Mucor griseocyanus / X. Кока-Армас, X.JI. Марти-нес-Эрнандес, X. Дустет-Мендоса // Вест. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 2006. -Т. 47, №2.-С. 103-108.

97. Адсорбционная иммобилизация щелочной липазы / Е.Я. Софьина и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т. 27, № 4. — С. 523-528.

98. Bagi К. Immobilization and characterization of porcine pancreas lipase / K. Bagi, L.M. Simon, B. Szajani // Enzymatic and Microbial Technology. — 1997. -№20. -P. 531-535.

99. Shukla A. Experimental studies and mass-transfer analysis of the hydrolysis of olive oil in a biphasic zeolite-membrane reactor using chemically immobilized lipase / A. Shukla, A. Kumar // Ind. and Eng. Chem. Res. 2004. - Vol. 43, № 9. -P. 2017-2029.

100. Abbas Н. Aroma synthesis by immobilized lipase from Mucor sp / H. Abbas, L. Comeau // Enzyme and Microbial Technology. 2003. - Vol. 32, № 5. -P. 589-595.

101. Aylin A. Activity and adsorption of lipase from nogella sativa seeds on celite at different pH values / A. Aylin, U. Guldem // Biotechnology Letters. 2000.- Vol. 22, № 5. P. 355-359.

102. Jeganathan J. Hydrolytic pretreatment of oily wastewater by immobilized lipase / J. Jeganathan, G. Nakhla, A. Bassi // Journal of Hazardous Materials. — 2007.- № 145.-P. 127-135.

103. Jeganathan J. Pre-treatment of high oil and grease pet food industrial wastewaters using immobilized lipase hydrolyzation / J. Jeganathan, G. Nakhla, A. Bassi //Journal of Hazardous Materials. 2006. -№ 137. - P. 121-128.

104. Бакулина, О.Н. Формула пищи: микронутриенты для детского питания / О.Н. Бакулина // Пищевая промышленность. — 2005. — JN® 4. — С. 22-24.

105. Асташов, В. И. Урожаи рапса и подсолнечника растут / В. И. Аста-шов // Технические культуры. — 1988. — № 5. — С. 53-68.

106. Перспективы и реальность использования масел растительного происхождения в качестве биотоплива / В. А. Гаврилова и др. // Масложировая промышленность. 2005. - № 4. — С. 15-17.

107. Зиновьева, М.Е. Гидролиз оливкового масла панкреатической липазой в неводных средах / М.Е. Зиновьева, Н.В. Калачева, B.C. Гамаюрова // Биотехнология. 1998. - № 2. - С. 64-67.

108. Брокерхоф, X. Ли политические ферменты / X. Брокерхоф, Р. Джек-сен; пер. с англ. М.: Мир, 1978. - 388 с.

109. Рабинович, В.А. Краткий химический справочник / В.А. Рабинович, З.Я. Хавин. Л.: Изд-во «Химия», 1978. - 392 с.

110. Объемные свойства растворов олеиновой, линолевой и линоленовой кислот в н-гексане и н-гептане при 298,15 К / А.Г. Рамазанова и др. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2006. - № 4. - С. 643-647.

111. Попадич, И.А. Активация ферментных систем и микроорганизмов / И.А. Попадич, С.Е Траубенберг. сб. научн. тр. Совершенствование пищевой технологии и техники. - М.: МТИПП, 1981. - С. 10-17.

112. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы / под ред. Д. Вуд-вордса; пер. с англ. -М.: Мир, 1988. — 215 с.