Изучение кинетических закономерностей ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы в реакторах различного типа с использованием методов математического моделирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕН« УНЕЕРСИТЕТ ж. МДЛСМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи УДК 577.152

ПРОТАС Оксана Владимировна

КЗУЧЕНЕ КИЕТИ^ЕСШ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ «РМЕНТАПШТО ГИДРОЛОА ЛГНОЦЕШЮПОЗЫ 8 РЕАКТОРАХ РАЗЛМОГО ТИТА С ИСПШЪЗОВАНСМ МЕТОДОВ МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДОИРОВАНЯ

(Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 19ЭЗ

/ /

Работа выполнена на кафедре химическое внзямологии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова

Научные руководители: доктор химических наук А.П.Синицык кандидат химических наук А.В.Гусакоз

Официальные ошюненты: доктор химических наук И.А.Ямсксз

кандидат технических наук А.М.Морозов

/

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский и проектно - конструкторский институт прикладной биохимии -

Защита состоится "и " 1993 г. Б ¿6 час. на

заседании специализированного совета Д 053.05.76 по химическим наукам при Химическом .факультете МГУ

С диссертацией ыохно ознакомиться в библиотека Химического факультета МГУ

Автореферат разослан " <3^^-^-1993 Г.

Ученый секретарь ^

Специализированного совета,

кандидат химических наук о? О.А.Кост

' ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. ■ Биоконвэрсия возобновляемого растительного сырья в различные полезные продукты рассматривается в настояшее время как одна из ключевых отраслей биотехнологии. Постоянно возобновляемые запасы целлюлозы обеспечивают сырьевые базу для получения из нее ферментативным путем глюкозы, которая затем может быть превращена в фруктозу, этанол, аминокислоты и другие ценные продукты пищевой, химической и микробиологической промышленности.

При практической реализации процесса ферментативной конверсии лигноцеллюлозного сырья возникает ряд проблем, наиболее важной из которых является поиск оптимального способа и условий проведения гидролиза. Решение этой проблемы предполагает изучение влияния на эффективность процесса гидролиза ряда факторов, основными из которых являются качественный и количественный состав целлюлазного комплекса, выбор наиболее реакционноспособного вида сырья, тип реактора, в котором осуществляется гидролиз. Для нахождения оптимальных условий проведения процесса необходимо детальное изучение закономерностей его протекания и создание математических моделей, позволяющих описать данный' процесс на основании полного понимания его кинетики и механизма. Эти аспекты определили направление данной работы, связанное с поиском оптимального способа проведения ферментативного гидролиза лигноцаллюлозы.

Целью работы являлось исследование кинетических закономерностей ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы в реакторах- различных - типов с использованием методов математического моделирования. -

Научная новизна работы. I) На основании полученных экспериментальных данных предложена кинетическая модель

ферментативного гидролиза лигноцеллкшозы, в которой наряду с другими факторами принимается во внимание влияние лигнина, составляющего значительную часть в природных целлшозосодержа-щих материалах. 2) С помощью математического моделирования оценено влияние различных факторов на эффективность ферментативного гидролиза лигноцеллвлозы. Показано, что наиболее отрицательными факторами процесса являются ингибирование продуктами, инактивация ферментов и неспецифическая адсорбция целлюлаз на лигнине. 3) Впервые установлена возможность проведения ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих субстратов в реакторе на основе линейного электромагнитного преобразователя (ЛЭМП). Показано, что реактор ЛЭМП обладает существенно большей эффективностью при проведении процессов гидролиза по сравнению с традиционно используемыми реакторами. 4) Проанализированы причины значительного повышения эффективности гидролиза целлюлозы в аппарате ЛЭМП. Показано, что наряду с увеличением реакционной способности субстрата за счет интенсивного измельчения под действием ферромагнитных частиц, в данном реакторе частично снимается эффект псевдоинактивации прочно адсорбированных ферментов за счет влияния электромагнитного поля и механического воздействия.

Практическое значение работы. В результате проведенного скрининга различных видов целлшозосодержащэго сырья найдены новые виды, являвдиеся перспективными с точки зрения дальнейшего их использования для реализации биотегнологических процессов ферментативного получения Сахаров. Проведено изучение эффективности гидролитического действия целлшлазных препаратов, полученных на основе новых высокоактивных штаммов (ТПсЪойегта гееае1, Реп1сНИш ьегтисиХозия). Полученные результаты наряду с предложенной математической моделью могут быть использованы

для оптимизации технологического процесса ферментативного получения глюкозы из лигноцэллшозного сырья.,

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на YII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991) и на XIII симпозиуме по биотехнологии топлива и химических продуктов (Colorado Springs, 1991).

Публикации. По результатам работы имеется 6 публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов исследований и их обсуждения (3 главы), выводов, списка цитируемой литературы, вклотавдего 157 ссылок. Работа изложена на {^'Ь страницах машинописного текста, содержит^ рисунков и $ таблиц.

МАТЕРИЛ® И МЕТ0Д1

Ферментные препараты. В таблице 1 приведены активности использованных в работе целлшшзных препаратов.

Таблица 1

Препарат Активности компонентов*, ед/г Активность по фильтровальной бумаге*, ед/г

эндоглюканаза целлобивза

Целловиридин ГЗх1 .260 З.б 80

Целловиридин ГЗхА1 400 3.6 147

T.reeset * 1100 5.0 240

P.verruculosm z' 1120 80,0 240

Пектофоетидин ГЗх1 - 50.0 7.0

Пектиназз-5003 380 1940,0 -

KS T.reeaet1 7,0 0,04 2.0

KS ABp.Japonlcus4 0*,1 14,0 0,04

J>

"J

* Дня культуральных яидкостей (КХ) активности выражены в ед/ыд.

1 Производство Цриволхского биохимического .завода.

2Лабораторныа^препараты, Институт биотехнологии г.Лейпцига.

"^Производство ШЮ "Биотехника".

4Предоставлена О.Н.Окуневыы, ИБИ1, г.Цущино.

Целлплозосодержащие субстраты. В работе использовали микрокристаллическую целлюлозу фарш "Chemapol" (Чехословакия), а также вида целлюлозосодериащвго сырья, перечисленные в табл.2. Реакторы для проведения процесса ферментативного гидролиза целлюлозы.

A. Рактор с перемешиванием, в качестве модели . которого использовали термостзтируемые при 50°С ячейки, объемом 20 мл. помещенные на качалку (250 качаний в минуту).

Б. Реактор с виброперемешиванием. В конструкции данного аппарата, разработанного во ВНЙИХстмгад, электроэнергия преобразуется в механическую энергию колебательного даижения рабочего органа: штоков с насаженными на них дисками (рис.1). Рабочий объем данного реактора составлял 2 л.

B. Реактор на базе электромагнитного преобразователя (ЛЭШ) с интенсивным массообменом, разработанный в ШЮ "Еиомаш". Дянянй * аппарат имеет оригинальную конструкцию, позволяпдую осуществлять интенсивное перемешивание реакционной смеси (рис.1). При питании многофазным током в рабочем, зазоре плоского двухстороннего индуктора возникает вращапцееся электромагнитное поле. При помещении в зону действия поля рабочей камеры с ферромагнитными частицами, последние приходят в хаотическое двшиние, что приводит к интенсивному перемешиванию реакционной смеси. Объем рабочих камер составлял 20 и 130 мл.

Рис.1 Принципиальные схемы реакторов, а) Виброрвактор:1-элэктро-днигетель, 2-рзбочая камера, 3-вибрирупцее устройство, 4-рубаш-ка для термостатироьания. б) ЛЭМП: 1-электромагнЕТП1й индуктор, 2-рабочая камера с ферромагнитными частицами, 3-источник питания, 4-рубаска длй термостатировншя.

НЕЗУ/ЬТАТЫ РАБОТЫ

Реакционная способность различных нидоз целлвлоэосодертлщэго сырья. Сравнительный анализ ЕффектдвносЕ действия различных ферментных препаратов.

Цри осуществлении процесса получения глшозн из цвллелозы одной из векнойших задач является поиск оптимальных видов целлшозо-содержгщего сырья. Такое сырье долзно обладать ансокой реакционной споссйностьв, быть дешевым, а запася его должны быть достаточно велики.

Нами изучена реакционная способность рлда

целлилозосодерха^гх материалов при пщроллзэ под действиол композиционного ферментного препарата, ссяоящзго из даллшазннх препаратов отечественного производства Целловиридин (лз гр^ба Trlchoöerm vlrläe) и Пактсфоетидин (из гриба Aspergillus foetläua) (табл.2).

Природные непредобработаетые цэллюлозосодержсщэ материалы обладали, как правило, низкой реакционной способностью. Этот факт подтверждается результатами гидролиза таких субстратоз, как

5 5

Таблица 2. Реакционная способность целлхлозосодержащих материалов при гидролизе композиционным ферментным препаратом, созтояпшм из Целловиридина и Пектофоетидина 1>

А Цэлпшозосодераащее Нач.скорость Выход восстанав

сырье образования Сахаров за

ГЛЕКОЗН, г/л-ч 24 часа, г/л

1 Солома измельченная 2,3 11,0

2 Чайные отходы измельч.

образец 1 1.0 6,8

а 1,2 4,1

3 3,0 5.6

. 4 3,5 7.3

5 2,9 6,1

Б 2,7 6.9

3 Отхода тайьчного произ- 2,0 13.0

водства (г.Бишкек)

4 Жом сорго (г.Саратов) 2,0 8,0

5 Хлопковая шелуха 0,5 4.0

6 Стержни початков 1,0 8.7

кукурузы

Т Скоп Святогорского ЦБК 7,0 35,0

8 Скоп Красиокаыского ЦБК 6.0

9 Целлодигнин стержней

початков кукурузы

- исх.влажный 4,7 13.0

— промытый ряйтгсшй , 7.8 37.0

- промытый сухой 7.5 28.4

10 ЦЭДДОЛШПИН 7,7 38,2

Ыантуровского ЕХЗ

11 Шллолигаш

Щуыерлинского ЕХЗ

- нсх. сухой 2.0 16,0

- промятый кпязтай 3.5 31.3

■ - проштый сухой 4.3 24,5

1 Условия ферментативного гидролиза: концентрация субстрата 100 г/л. Активности в реакционной смеси: по фильтровальной бумаге 2 ед/ил, эндоглшалазная - 9,6 од/ид, цэллобиазная I ед/нл. рН 4,5; 50°С.

солома, стебли початков кукурузы, отхода производства чая, табака, сорго, а такие хлопковая шелуха. В лучшем случае глубина гидролиза этих субстратов составляла 10-15*.

В то же время, как и следовало ожидать, наиболее высокой реакционной способностью обладали те вида цадлвяозосодэржащего сырья, которые являлись отходами промнияэнных я/или сельскохозяйственных производств, технология которых предусматривала ■ 1

физическую или химическую обработку материалов. Действительно,

исследуемые нами образцы цэллолигшна - отхода фурфурольного и

I '

ксилитного производства, а также скопа - отхода цвллюлознобунаж-вого производства, имели достаточно высокую реакционную способность по отношению к гидролизу целлплолитическими ферментами и могут рассматриваться как потенциальное сырье для ферментативного получения глюкозы. Глубина гидролиза данных субстратов состезкла 40-6556. Использование этих цаллвлозосодэр-жащих материалов позволило получать гидролизам, содержащие 3,5-4% Сахаров, главным образом, глгасозу.

Высокая реакционная способность целлолиггвна и скопа позволила нам выбра?ь указанные субстраты в качестве базовых для дальнейшего изучения кинетики и модулирования ферментативного пиролиза целлюлозы.

Вольете значение дя.т осуществления эффективного фермзнта-тееного гидролиза целлюлозы имзэт выбор оптимального целлюлаз-ного препарата. В настоящее время наиболее широко используются цел:глазные шасдазян мутантных шташов П"1сЛосй.1г>а. В России на протяжении ряда лет производится цедлилазннй препарат Цедло-Еиридин, продуцентом которого является Т.г>1г1ба. Недостатками этого препарата являются относительно небольшая осахаривавдая активность и низкое содержание целлобиагы. Поэтому поиск. высокоактивных цедлюлазных препаратов представит для нас

важную задачу.

В сотрудничества с Институтом биотехнологии г.Лейпцига бкли получены два высокоактивных мутантннх штамма - продуцента целлюлаз (ТПсЬаЗепг.а гееае1 18.2КК и Рвп1с£Шиш иегтсиЛоат. ИА 30). Использование целлюлазных препаратов, получении на основа новых штатов, при осуществления гидролизе целлюлозы позволило з 3 раза снизить затраты препаратов (по сухой массе) по сравнению с препаратами на основе Т,и(г№. Анализ влияния концьнтрации дзнинт ферментных препаратов на выход Сахаров, при использовании двух субстратов - цедлолигшпа и скопа - показал, что при их концентрациях 10 г/л (против обычно используемых в случае Цэлловиридина 30-45 г/л) еозможно получение гидролизатов с содержанием Сахаров 4-656.

Кроме этого, препарат Р.оегтсиТозт являлся более сбалансированным по компонентному составу, что приводило к получению глюкозы в качестве основного продукта гидролиза. Если при использованш в качестве субстрата цэллолигнине в аппарате с виброперемепшванием в процессе гидролиза год действием препаратов Т.геезе! или Т.VIг\бе были получены гндролизаты с примерно равными количествами глюкозы и целлобиозн, то при гидролизе под действием препарата Т.хкггисиХозт - глжкозный сироп 5£-ной концентрации (рис.2).

При выборе наиболее "технологичного" ферментного препарата необходимо учитывать и то, в каком виде он Судет использоваться. Применение высокоактивного фильтрата культуральной жидкости продуцента позволит эффективно проводить процесс гидролиза без дополнительных затрат 'на выделение и концентрирование фермента. Именно это и было осуществлено нами с помощью культуральной жидкости Т.г ее ее I, полученной в условиях промышленного производства на Привэлгском биохимзаводе.

а

Рис.2 Кинетические кривые образования глюкозы (I) и целлобиозы (2) при гидролизе в виброреакторе: а) цвллолигнгна (100 г/л) под действием препарата T.reeset (10 г/л); б) целлолитаина (100 г/л) под действием препарата P.verruculoatm (10 г/л); в) скопа (100 г/л) под действием культуральной жидкости T.reeael (активность по фильтровальной бумаге 2 вд/ип).

с

Так, при гидролизе целлолигнина в виброреакторе было подучено Л% Сахаров в гидролизате за 2 суток гидролиза. Проведение процесса в тех же условиях с использованием культуральной жидкости T.vlrlde позволяло в лучшем случае получить гидролизат -с 256-енм содержанием Сахаров.

На рис.2в представлены результаты гидролиза скопа в виброреакторе под действием культуральной жидкости T.reeael. За

2 суток гидролиза удалось получить гидролизат- с концентрацией >

•"восстанавливагазп Сахаров 8í, при этом концентрация глпсозы составила 7%.

Математическое моделирование процесса ферментативного г. гидролиза лигноцелдюлозного' сырья.

Для изучения кинетики ферментативного гидролиза лигаоцэллюлозы и последующего моделирования были шбраны целлолигнин х скоп в качестве субстратов, а также сухие ферментные препараты Цэлловиридин (T.vlrtda) и Целловиридин А {Т.reesei), выпускаемые в промышленном масштабе на Приволжском биохимзаводе.

С учетом полученных экспериментальных результатов, а такне литературных данных, основные положения модели ферментативного гидролиза целлолигнина под действием целлюлаз из Г. и tri de следующие:

1. Продуктами гидролиза являются глюкоза и целлобиоза.

2. Целлобиоза образуется под действием целлюлаз (целлобиогидро-лаз и эндоглюканаз), адсорбированных на поверхности целлюлозной фракции лигноцвлзпмюзы. Целлобиоза гидролизуется в растворе до глюкозы под действием ß-глшозидазы (целлобиазы). Такая схема реакции была подтверждена в независимых экспериментах по пиролизу целлолигнина в присутствии в-глюконолактона (селективного ингибитора целлобиазы).

3. Целлобиозообразулцие ферменты могут быть рассмотрены как один фермент (£,). Такое упрощение успешно используется в большинстве описанных в литературе моделей (Haid et al, 1984; Holtzapple et al, 1990).

4. Фермент E1 может адсорбироваться на лигаине (Черноглаэов, 1989). Этот факт был также подтвержден нами экспериментально при изучении адсорбции целлюлаз на литниковом остатке, полученном после исчерпывающего гидролиза целложгнина.

5. Адсорбированный фермент (Е1) ингибируется целлобиозой.

Адсорбционный и каталитический (ингибирсввния) центры фермента различны и независимы (Van Tilbeurgh.et al, 1986; Changas et al, 1988 ). Целлобиаза конкурентно ингибируется глюкозой.

6. Реакционная способность цаллплозной фракции цвллолигнинв не изменяется в ходе гидролиза (что было показано в независимых экспериментах).

7. В ходе гидролиза происходит' инактивация целтлаз, которая может быть описана экццонышрташтнми уравнениями (Гусаков, 1985. 1966).

В рамках этих положений ферментативный гидролиз лнгноцвллшлозы может быть представлен следующей кинетической схемой:

К1

Е.,+ S E^S К, + С2

i

E¿ + G2 EZGZ ^ + 20

B^Gg

Rj + Ъ Е.,Ь ^jj

К.

\ + 0

В, —• ЗЦ . Eg — Eg

где а, - целлюлвда, образующая целлобиозу из нерастссримой целлюлозы,

Eg - целлобиаза, гидролизупцая образующуюся- в результате

действия Е1 целлобиозу до глюкозы. В,4"' и Eg^ - инактивированные ферменты. S - целлюлоза, L - лигнин, Gg - целлобиоза, G - глюкоза.

Система дифференциальных уравнений, описыващих изменение концентраций субстрата и продуктов гидролиза, выглядит следующим образом:

d[Sj d[GP] d[0]

- = - v.; -= Y1 - V„ ; - = 1,05 • V-, (2)

dt 1 dt 1 * dt 2

где -k4t

v _ ^g^gM^6 _ скорость гидролиза целлобиозы

2 K4(1+ [GJ/Kg) + Ю2] до глшозн год действием

целлобиазы

lctlLnsle-*»*

v1 = ——'--скорость образования целлобиозы

^(1 + [Ggl/Kg) из целлюлозы,

где выражения для концентраций свободного фермента [К, ] и целлюлозы [S] в уравнении для Y1 выводятся стандартными методами стационарной ферментативной кинатшш (здесь вывод опущен).

Для решения системы дифференциальных уравнений (2) использовали численный метод Рунге-Кутта 4-го порядка.

Кинетические параметры действия целлобиазы из T.vtride (K^.Kg.kg) были определены из трех независимых экспериментов по гидролизу целлобиозы ферментным препаратом Цэдловиридин, в которых концентрацию целлобиозы варьировали в диапазоне 5-20 г/л, а концентрация ферментного препарата составляла 10 г/л.

Остальные кинетические параметры (см. схему (I)) подбирались методам наименьших квадратов го данным 15 экспериментов, в которых варьировали концентрацию цехполигнива в диапазоне 10150 г/л й концентрацию ферментного препарата в диапазоне 5-40 г/л. В некоторых из этих экспериментов в реакционную смесь в начальный момент времени добавляли глюкозу (20 г/л) или целлобиозу (10 г/л), являющиеся ингибиторами ферментов.

На рис.За приведены теоретичвсюю кинетические кривые, характеризующие гидролиз целлолигнина под действием целлюлаз из Т.и1г1бэ и соответствующие экспериментальные точки для некоторых экспериментов, в которых варьировались концентрации ферментного препарата и субстрата.

Гидролизаты, полученные при действии на целлолигнин цаллюлаз из Т.1<1г1бе, содержали значительное количество целтобиозн, так как ферментный препарат целловиридин обладал низкой целлобиазной актишостыо. Добавление целлобиазы из А./оеИсЬха может быть полезным для получения гидролизатов с высоким содержанием глюкозы. Кинетические параметры гидролиза целлобиозы под действием целлобиазы из Л./оеИЛлз были определены ранее (Гусаков, 1984). Для описания экспериментов по гидролизу целлолигнина с добавлением целлобиазы из А.?оЫ1биа нами использовалась упроданнвя кинетическая модель гидролиза целлобиозы. В указанной модели принималось во внимание ингибированив субстратом и продуктом (в упрощенной форме), но не учитывались эффекты трансгликозилирования. Уравнение, описывающее скорость гидролиза целлобиозы год действием целлобиазы из А./оеИ<Зиз, используемое в системе дифференциальных уравнений (2) вместе с уравнением для скорости т2, имело следующий вид:

3 Кб(1 + [в]/^) + [02 ]2/Кд + [02] где - активность целлобиазы из Авр^оеИ&ш (ед/л)

Кб - константа Михаэлиса.

К^.Кд - константы ингибирования продуктом и субстратом.

На рис.36 приведены кинетические кривые гидролиза целлолигнина под действием композиционного ферментного препарата Т.ь1г1<3е - А./оеНАш. Как видно из рис.36, основным продуктом

гидролиза является глшоза, причем теоретические зависимости хорошо согласуются с экспериментальными результатами.

Рис.3 Теоретические кривые образования Сахаров и соответствуют экспериментальные точки при ферментативном гидролизе: а) целлолигнина (100 г/л) под действием целлюдаз из T.vlrlde. Концентрация ферментного препарата: 1-5 г/л, 2-10 г/л. 3-20 г/л, 4-35 г/л. б) целлолигнина (150 г/Л) под действием композиционного препарата T.vlrtde (20 г/^л) - A.foetldua (10 г/л). Глшоза (I), целлобиоза (2), глшоза + цэллобиоза (3).

С помощью математического моделирования нами было оценено влияние различных факторов на эффективность гидролиза целлолигнина год действием композиционного ферментного препарата (рис.4). Теоретические кривые 2-6 на рис.4, рассчитанные при допущении, что некоторые из факторов, учитываемых в модели, не имеют места в реакционной системе, при сравнения с экспериментальными данными показывают относктальную роль этих факторов при гидролизе. Наиболее отрицательным фактором при гидролизе целлолигнина под действием композиционного ферментного препарата является ингибирование фвринхов целлобиозой и глхкозой (сравните кривые 5 и 4 с 1). Отрицательный вклад вносит инактивация ферментов (кривая 3) и, в меньшей степени, нэспецифическая адсорбция целлюлаз па лигнине (кривая 2).

3 1

,г

О , 20 «о 0 5 15 25

ВРЕМЯ , ЧАС ВРЕМЯ , ЧАС

Рис.4 Влияние различных факторов на кинетику ферментативного гидролиза целлолигнина (150 г/л) под действием композиционного препарата T.vlrlde (10 г/л)-A.foetidU3 (5 г/л). Теоретические кривые: 1-учитываются все факторы; 2-не учтено влияние лигнина; 3-нб учтена инактивация Ej, Eg и Е^; 4- не учтено ингибирование Ь> и Eg глюкозой; 5- не учтено ингибирование Ej целлобиозой; 6-не учитывается влияние лигнина и инактивация Ej, Eg и Е^. о экспериментальные точки

ВРЕМЯ , ЧАС

Рис.5 Теоретические кривые образования глгкозы (I) и целлобиозы (2) при ферментативном гидролизе скопа (70 г/л) год действием Целловиридина А (15 г/л) и соответствуициа экспериментальные точки. 50°С, рН 4,5.

Учитывая то, что ферментный препарат Целлониридин А (продуцент Г.гееаеС) является более перспективным для осахари-вания целлюлозного сырья, чем Целлониридин \T.vlrlde), а также то, что с практической точки зрения реальный интерес представляет использование в качестве сырья скопа, нами было также проведено моделирование процесса ферментатинного гидролиза для нового ферментного препарата и нового субстрата. При атом стратегия экспериментов для определения кинетических параметров была такая же, как в случае цаллолигнина и целлюлаз из

Нужно отметить, что разработанная на основе кинетической схемы (1) математическая модель допускала только цеддобиазный (р-глпсозидазный) путь образования глхкозы. Применение ее для описания кинетики гидролиза скопа под действием целлюлаз из Г.геезеС давало заниженные значения го скорости образования глюкозы. Поэтому в последнем случае учитывали дополнительный путь образования глгкозн: непосредственно из целлюлозы (и/или фрагментов ее деструкции) год действием андоглпсаназы или экзоглакозидазы (Киесов, 1981, 1939).

Использование таким образом . уточненной математической модели позволяло до&л'ься хорошего совпадения экспериментально полученных и теоретически предсказанных результатов (рис.5).

Гидролиз цоллзлозосодержащих субстратов в аппарате ЛЗШ.

Вагпое значение для осуцествлення эффективного ферментативного гидролиза це'ллюлозосодерзпщего сырья имеет выбор оптимальной конструкции реактора. Обычно в традиционном реакторе с перемешиванием процесс гидролиза длится 1-2 сут, при этом продуктивность процесса, как правило, не превышает

1-5 г/л-час. В начальный перзод реакции продуктивность процесса выше, однако достаточно высокие концентрации продуктов (не ыэнее 3-4*) не могут быть получены. Использование реактора с виброперемэшизанием позволяет несколько увеличить скорость гидролиза е его продуктивность благодаря интенсификации процесса перемешивания. Цри ферментативном гидролизе целлплозосодер-жащих субстратов в реакторе с виброперемешиванием образовывалось 4-5Я Сахаров 1 сут ведения процесса. Достопнстеом данного реактора явпштся сравнительно небольшие энергозатраты на перемешивание (потребляемая 2х-литровым реактором мощность равна 0,07 кВт), однако продуктивность процесса гидролиза хоть и возрастает, но остается сравнительно невысокой (достигает 68 г/л-час). Реальную возможность для интенсификации процесса ферментативного ссахаривавил целлвлозосодэржащих материалов представляют, на наш бзгляд, аппараты о интенсивным массообме-ном, обесгочивапдие постоянное обновление поверхности контакта реагярущих фаз. К реактора»: такого типа относится аппарат на базе линейного электромагнитного преобразователя (ЛЭШ) конструкции НПО "БЕомаш".

Все эксперименты по изучению процесса 'Зерментативного гидролиза в аппарата ЛЗЛП проведши в сравнения с контролем, в качества которого использовали результаты гидролиза в терыоста-тируемых ячейках, помещенных на качалку.

Прежде всего нами был найден оптимальный режим гидролиза целлюлозосодержащнх субстратов в аппарате ЛЭШ при варьирования параметров, обусловленных его конструктивными особенностями. К шш относятся сила тока в обмотках индуктора, а также количество и ввд используемых ферромагнитных частиц. Наибольших аффектов ускорения процесса ферментативного гидролиза в аппарате ЛЭШ достигали при силе тока 5 А (максимальная

величина для имевдегося в наличии аппарата) и использовании цилиндрических частиц диаметром 0,25 мм и длиной 4 мм.

Влияние массы (загрузки) ферромагнитных частиц на эффективность гидролиза целлюлозы в аппарате ЛЭШ при различной силе тока показано на рис.6. Для каждого значения силы тока существовало определенное оптимальное значение массы частиц, при котором эффективность гидролига максимальна: для 1=2А ш -1,5 г; 1=ЗА т_-3 г; 1«5А и -12 г. Ош оптимальном

ОПТ опт опт . . *

значении массы частиц в реакционной1 смеси осуществлялось наиболее интенсивное дня заданной силы тока перемешивание. Ори увеличении массы частжц выше питиц^^орр значения начальная скорость и выход сахароз (после окончания гадрализа) снижались, так как уменьшалась эффективность переманивания вследствие "налипания" частиц на стенках ячейки и нарушения режима стабильной работы магнитоокаюнного слоя.

150

3-

з н

о а с

О

2. 6 10 ±4

масса частиц , р Рис.6 Впшзке загрузки частиц на выход сахароз са I ч гидролиза целлплсзы (100 г/л) под действием Цэллоаиридвна А (7,5 г/л) з вппаратэ ЛЭМП. Сила тька: 1-2 А; 2-3 А, 3-5 А. Размеры частиц <т=0,25»4 кл. 50°С, рН 4,5.

На рыс.7 предстаалены кинетические кривые гидролиза микрокристаллической целлюлозы под действием Целлониридана А в

реакторе ЛЭШ го сравнению с контрольными экспериментами в ячейках. В условиях оптимального режима функционирования аппарата ЛЭШ начальная скорость гидролиза была в 9 раз вше, чем в контроле. За 1 ч гидролиза в ЛЭШ концентрация восстанавливающих сахарен в гидролизаге составила что в 7,5 раз превышало содержание Сахаров в контроле (за то хэ время процесса). Следует отметить, что такая концентрация Сахаров (5Х) в контроле достигалась за эо часов гидролиза. Продуктивность реактора ЛЭШ составляла 73 г/л-час за 30 минут гидролиза

ВРЕМЯ, МИН

Рис.7 Кинетические кривые гидролиза целлюлозы (100 г/л) под действием Целлозиридша А (7,5 г/л) в аппарате ЛЭШ (I) ив контроле (2). Сила тока 5 А, масса частиц 12 г, <1*1=0,25*4 мм. 50°С, рН 4,5.

Подобные эффекты ускорения наблюдались и для других целлюлозных субстратов (например, гвдратцаллвлозы). Однако, при ферментативном гидролизе скопа г целлолигнина эффект увеличения скорости • • реакции в аппарате ЛЭШ бал несколько меньше: в 2-2,5 раза. Причиной этого может быть более высокая влзкость реакционной смеси при использовании данных субстратов, приводящая к уменьшению эффективности перемешивания, а такяе присутствие лигнина (в случае целлолигнина).

Нами были про анализированы причины значительного повышения эффективности гидролиза в аппарате ЛЗШ.

Во-первых, причиной повышения скорости процесса мог®г быть увеличение реакционной способности целлюлозного субстрата. За счет механического воздействия ферромагнитных частиц на субстрат, приводящего к его измельчению, целлюлоза может становиться более доступной действию ферментов вследствие уменьшения степени кристалличности и увеличения шкхцади поверхности (Синицын, 1984). Для проверки этого прэддодазвния целлюлоза была подвергнута действию частиц в тех ке условиях, в которых проводится гидролиз в аппарате ЛЗШ, но б отсутствие фермента. Затем в контрольном эксперименте '(в ячейках при перемешивании на качалке) провели сравнительный анализ реакцлорюй способности исходного и предварительно , измельченного в ЛЗШ субстрата. Оказалось, что за счет, измельчения под действием ферромагнитных частиц реакционная способность целлюлозного субстрата увеличивалась до 2,5 раз в зависимости от времени и интенсивности обработки.

Существуют и друг^ причины тжлешя эффективности гидролиза. Квиболг» вероятной, на наш взгляд, ялилаа^-я увеличение педа^ гоути прочно адсорбированных на цехшапозо ферментов за счет гтаенсизного персмггивЕния, механического воздействия фрзрромагыттных частиц, с также влияния лервлюваого электромагнитного поля. Извэстно, что в процессе гидролиза на л;за>шение скорости процесса с 'увеличением глубпЕЦ гвдролизя среда прочих влияет и тот фактор, что часть ферритов, прочно связанных с поверхностью целлюлозы", обладает ограниченной подвижностью го поверхности субстрата и по мере гидролиза проникает в глубь матрицы целлюлозы, одновременно теряя активность по отношению к нерастворимому субстрату (так называемая псевдоинактивация;

Гусаков, 1986; Синицьш, 1987). Контрольные эксперименты, в которых для гидролиза использовали толысо адсорбированные на целлюлозе ферменты, показали, что такой эффект псевдоинактивации действительно частично снимается в аппарате ЛЭИП (рис.8).

Рис.8 Активность прочно адсорбированных ферментов при гидролизе целлюлозы, предварительно гидролизованной в ячейках при перемешивании. Повторный гидролиз: I - в ЛЭШ, 2 - в ячейках. Целлюлоза 30 г/л, Целловиридин А 7,5 г/л: Сила тока 5 А, масса частиц 12 г, а«1=0,25«4 мм. 50°С, рН 4,5.

Однако, наряду с причинами, обусловливающими повышение

эффективности гидролиза целлюлозы в реакторе ЛЭШ, существует

фактор, отрицательно влияющий на протекание процесса. Таковым

является значительная инактивация ферментов в реакторе, которая

происходила, в основном, на поверхности раздела фаз

раствор - воздух из-за интенсивного перемешивания, а также

частично из-за растворения воздуха в реакционной смеси. О 1

степени инактивации свидетельствует, например, тот факт, что при силе тока 5 А за 1 ч терялось до 50% общей целлюлазной активности раствора ферментного препарата при 50°С. В особенности, эффект инактивации был выражен в случае целлобиазы, действующей главным образом в растворе (в неадсорбированном

состоянии). При тех же условиях га 10 кинут терялось до £Ш целпобиазной активности. Поэтому перед вами встала задача стабилизации целлюлаз в реакторе. Известно, что к увеличению стабильности целлюлаз в растворе приводит присутствие в реакционной смеси таких, веществ, как полиэтилен- или попипро-пилентликоль, либо других' поверхностно - активных веществ, которые стабилизируют находящиеся в растворе слабо адсорбирующиеся целлюлазы за счет того, что они препятствуют попаданию целлюлолитических ферментов на поверхность раздела фаз (Kin, 1982; Синицын, 1986). Нами было изучено влияние полипропилен-гликоля (ППГ) на ход инактивации целлюлаз из T.reeael при перемешивании в электромагнитном поле. Добавление ППГ в концентрации 0,1 г/л к раствору ферментного препарата позволило увеличить стабильность при перемешивании в ЛЭЫП на Git, а в концентрации 0,2 г/л - на 20%. Большего эффекта стабилизации достичь не удалось.

вьвода

1. Изучена реакционная способность различных видов целлзолозосодержащэго сырья. В результате проведенного скрининга найдены виды сырья, являпдиеся перспективными с точки зрения дальнейшего их использования для реализации биотехнологических процессов, ферментативного получения Сахаров: скоп (отход целлхшознобуыажеого • производства) и цв»долигнин (отход фурфурольного производства).

2. Црбведено изучение эффективности гидролитического действия целлюлазвнх препаратов, полученных на основе новых высокоактивных штаммов Trlchoderma reeael I8.2KK и Penlcllllum verruculo8um wa 30, и показаны преимущества использования этих

препаратов по сравнению с традиционно используемым промышленным отечественным препаратом Целловиридин (продуцент Т.и1г1ае).

3. Изучены кинетические закономерности гидролиза целлолигина и скопа заводскими ферментными препаратами Целловиридин (Г.и1г£с1е) и Целловиридин А (Г.гееэе£). На основании полученных экспериментальных данных предложена математическая модель ферментативного гидролиза данных субстратов, позволяющая достоверно предсказывать кинетику процесса.

4. С помощью математического моделирования проведена оценка влияния различных факторов на эффективность ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы. Теоретический анализ показал, что наиболее отрицательными факторами процесса являются ингибирование продуктами, инактивация ферментов и неспецифическая адсорбция целлюлаз на лигнине.

5. Исследована возможность проведения ферментативного гидролиза целлюлозосодернащих субстратов в реакторе на основе линейного электромагнитного преобразователя (ЛЭМП). Показано, что реактор ЛЭМП обладает гораздо большей эффективностью при проведении процессов гидролиза по сравнению с традиционно используемым реактором перемешивания. Начальная скорость гидролиза целлюлозосодержащих субстратов в ЛЭМП увеличивается в 5-9 раз. Реактор позволяет проводить гидролиз на значительную глубину за 30-60 минут с получением гидролизатов, содержащих 3-5% Сахаров. Продуктивность реактора ЛЭМП составляет 30-73 г/л-ч. ;

6. Изучено влияние различных факторов на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы в аппарате ЛЭМП. Найдены оптимальные условия проведения процесса (сила тока, удельная масса частиц, температура, концентрация субстрата, активность ферменте в реакционной смеси).

7. Проанализированы причины значительного повышения эффективности гидролиза целлюлозы в аппарате ЛЭМП. Показано, что наряду с увеличением реакционной способности субстрата за счет интенсивного измельчения под действием ферромагнитных частиц, в данном реакторе частично снимается эффект псевдоинактивации прочно адсорбированных ' ферментов за счет влияния электромагнитного поля и механического воздействия.

СПИСОК ПЪБЛКАЦЮ

1. Гусаков A.B., Синицын А.П., Протас О.В. Ферментативная конверсия лигноцеллюлозных отходов: основные факторы, влияпцие на эффективность процесса. VII Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзимология", тезисы докладов. Москва, 1991,-с.29-30.

2. Gueakov i.V., Sinitsjn А.Р., Protas О.У. Enzymatio conversion of lignooellulosio residues : iaotors, aiieoting the effioienoy. // Bioohem. Bioteohnol.EIeotronio Exprees Data, Russian Bioohem.Bioteohnol., 1991, v.1, J6 2/3, p.92.

3. Заявка J6 4939786/13 - 044866. МКИ5 C13K 1/02. Способ ферментативного осахаривания растительного сырья / А.П.Синицын, П.А.Смыслов, A.B.Гусаков, О.В.Протас, Л.Е.Синицын, А.Г.Гаврин, В.Г.Попов, С.Д.Варфоломеев. - Заявлено 29.05.91. Положительное решение от 17.04.92.

4. Gusakov A.V., Sinitsyn А.P., Manenkova J.A., Protas O.Y. Enzymatio saooariiioation oi industrial and. agricultural lignooellulosio wasteB.// Appl.Bioohem.Bioteohnol., 1992, v.34/35, p.625-637-

5. Синицын А.П., Давыдкин И.Ю., Давыдкин B.D., Гусаков A.B., Синицын Л.Е., Гаврин А.Г., Протас О.В. Кинетика

фертентатзнного гидролиза микрокристаллической целлюлозы. // В с<3.:Медицинская промышленность к биотехнология. Москва, Изд-во НПО "Медбиоэкономика", 19Э2, вып.Ю, ,с.30-35.

6. Sinitsyn А.Р., Gusakov A.V., Davydkin I.Yu., Davydkin V.Yu., ProtaB O.V. A hypersfiioient ргооезв for enzymatio oelluiOBe )!;'аго1ув1з in the intensive mass transfer reaotor. // Biobechnol.Lstters. - 1593, V. , л/з , p-2SS'2&S