Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ГУСАКОВ Александр Васильевич

БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ГРИБНЫХ ЦЕЛЛЮЛАЗ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

02.00.15-катализ 03.00.23 -биотехнология

Автореферат диссертации на соискание, ученой степени доктора химических наук

МОСКВА-2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ярополов А.И. доктор химических наук, профессор Ямсков И.А. доктор технических наук, профессор Гернет М.В.

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина

РАН, г.Пущино

Защита состоится 26 апреля 2005 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан « 2.3 » марта 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук ¿¿Ййч-* И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы - самого распространенного биополимера на Земле, по праву занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. Поэтому не случайно, начиная с середины прошлого века, во многих странах мира стали проводиться исследования целлюлаз.

Целлюлоза растительной биомассы представляет собой практически неисчерпаемый источник возобновляемого сырья, которое может быть конвертировано ферментативным путем в глюкозу. В свою очередь, глюкоза является незаменимым сырьем для микробиологических процессов получения различных видов топлива (этанола, бутанола, этилена и др.), органических и аминокислот, а также многих других полезных продуктов микробиологического синтеза. Таким образом, в будущем растительная биомасса может играть ту роль, которая сейчас принадлежит нефти.

Поэтому, помимо фундаментальных исследований, направленных на выяснение закономерностей биодеградации целлюлозы в природе, механизмов действия грибных и бактериальных ферментов, в последние 30 лет наиболее активно развивались прикладные исследования в области ферментативного гидролиза целлюлозы, а также разработки, направленные на поиск и получение новых штаммов - суперпродуцентов целлюлаз. При этом основные усилия были направлены на поиск и изучение ферментов, способных наиболее эффективно и полно разрушать целлюлозу до растворимых Сахаров и в итоге - до мономера (глюкозы).

Начиная с конца 1980-х годов, обнаружились новые перспективные возможности применения целлюлаз, связанные со способностью некоторых ферментов мягко воздействовать на поверхность целлюлозных волокон без их глубокой деструкции. К таким процессам относятся: 1) ферментативная депигментация окрашенных хлопчатобумажных и льняных тканей (в первую очередь - джинсовых изделий); 2) биополировка трикотажа и текстильных изделий на основе целлюлозных и смесовых волокон; 3) использование целлюлаз в составе моющих средств; 4) вторичная переработка макулатуры (удаление тонеров, чернил и других загрязнений с ее поверхности); 5) направленное изменение реологических и дренажных свойств целлюлозно-бумажной массы. Кроме того, целлюлазы широко применяются в пищевой промышленности, а также в качестве добавок к кормам сельскохозяйственных животных и птиц (вместе с ксиланазами, (3-глюканазами, пектиназами и другими карбогидразами).

В отличие от ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, где ферменты должны обладать максимальной «агрессивностью» по отношению к полимерному субстрату (высокой

сахаролитической активностью), в процессах биообработки текстиля (в том числе, при стирке современными моющими средствами) требуются целлюлазы, способные мягко воздействовать на поверхность волокон, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы, т. е. так называемые «тополитические» ферменты.

В настоящее время практически все имеющиеся на мировом рынке ферментов препараты целлюлаз производятся на основе высокопродуктивных мутантных штаммов грибов рода Trichoderma (Г. reesei, ^ viride, ^ longibrachiatum), а также Humicola insolens. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям.

Начиная с конца 1980-х годов в Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзимологии МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН в рамках Государственной научно-технической программы «Новейшие направления биоинженерии» велись разработки, направленные на поиск новых перспективных продуцентов грибных целлюлаз, усовершенствование существующих штаммов микроорганизмов, повышение удельной активности секретируемых ферментных комплексов, а также использование препаратов целлюлаз для биоконверсии растительного сырья в различные полезные продукты.

В течение последних лет в ИБФМ РАН путем селекции и мутаногенеза были получены новые штаммы гриба Т. reesei Т^1 и 1^-307, отличающиеся повышенной секрецией целлюлаз, на основе которых были произведены ферментные препараты с улучшенной осахаривающей способностью при гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Были также получены новые штаммы гриба Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151, дерепрессированные по глюкозе и способные секретировать на промышленных питательных средах до 40-50 г/л внеклеточного белка. Наконец, в результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз - гриб Chrysosporium lucknowense, на основе которого были получены новые штаммы (в частности, ЦУ 18-25), отличающиеся крайне высокой секрецией белка (до 50-80 г/л). Серьезным преимуществом С. lucknowense также является то, что некоторые из его целлюлаз обладают высокой активностью в нейтрально-щелочной среде, что делает данные ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов.

Цель и задачи исследования. В настоящей работе были поставлены следующие задачи и цели:

• детально охарактеризовать внеклеточный целлюлазный комплекс, продуцируемый грибом С. lucknowense, включая выделение всех

секретируемых эндоглюканаз и целлобиогидролаз, изучение их субстратной специфичности, основных биохимических и физико-химических свойств, а также получение информации по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов из данных белков), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликозид-гидролаз;

• изучить закономерности трансгликозилирования и ингибирования продуктами реакции при катализе целлюлолитическими ферментами (как важных факторов, влияющих на эффективность гидролиза природных субстратов целлюлаз);

• провести сравнение осахаривающей способности широкого круга отечественных и зарубежных целлюлазных препаратов на основе различных грибных продуцентов при гидролизе реальных видов целлюлозосодержащего сырья и выявить наиболее эффективные целлюлазные комплексы и штаммы-продуценты;

• найти возможности интенсификации процесса ферментативного осахаривания целлюлозы в лабораторных гидролиз-аппаратах различной конструкции; с помощью экспериментальных подходов, а также используя методы математического моделирования, выявить основные факторы, влияющие на кинетику ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов;

• выявить наиболее перспективные «тополитические» целлюлазы, обладающие высокой эффективностью при действии на текстильные материалы - в таких процессах, как ферментативная депигментация джинсовых изделий и биоотварка («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей; разработать теоретические основы действия «тополитических» целлюлаз; получить и испытать новые ферментные препараты, наиболее подходящие для применения в процессах биообработки текстильных материалов.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризован внеклеточный целлюлазный комплекс, секретируемый грибами рода Chrysosporium, a именно - грибом С. 1иекпоц>ете. Показано, что в состав комплекса входят, как минимум, девять целлюлаз, кодируемых различными генами: четыре целлобиогидролазы и пять эндо-1,4-(3-глюканаз. Все ферменты выделены в гомогенном виде, подробно изучены их свойства. На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей указанные ферменты классифицированы по их принадлежности к различным семьям гликозид-гидролаз. Выявлены целлюлазы, имеющие бифункциональную организацию молекул, а именно состоящие из каталитического и целлюлозосвязывающего модулей, соединенных пептидным линкером. Показано, что некоторые из целлюлаз существуют в виде множественных форм, образующихся в результате ограниченного протеолиза полноразмерных форм ферментов.

В составе ферментных комплексов, секретируемых грибами С. lucknowense и Т. reesei, впервые обнаружены специфичные ксилоглюканазы -гомологичные между собой ферменты, принадлежащие к 74-й семье гликозид-гидролаз, которые представляют новый класс карбогидраз. Показано, что оба фермента обладают уникальным экзо-типом действия на полимерный субстрат, не описанным ранее в литературе.

Проведен детальный анализ ингибирования целлюлаз продуктами ферментативного гидролиза целлюлозы - целлобиозой и глюкозой. С помощью математического моделирования на ЭВМ показано, что из-за особенностей гетерогенной системы «целлюлоза-целлюлазы», в зависимости от отношения «фермент/субстрат» (E/S) в реакционной смеси, могут наблюдаться различные типы ингибирования: неконкурентный, конкурентный или смешанный. Предложен подход для изучения ингибирования целлюлаз продуктами реакции, основанный на использовании окрашенной целлюлозы.

Используя синтетические хромогенные производные Сахаров, впервые показано, что целлобиогидролазы способны катализировать реакции трансгликозилирования, что позволило по-новому взглянуть на механизм действия данного класса ферментов и на классификацию целлюлаз в целом.

Разработаны научные основы действия «тополитических» целлюлаз в процессах ферментативной обработки текстильных изделий и материалов. Показано, что в случае ферментативной депигментации джинсовой ткани главным фактором, определяющим эффективность действия целлюлаз, является не специфическая осахаривающая активность, а особенности молекулярного строения ферментов, а именно наличие на поверхности белковых глобул кластеров ароматических и неполярных аминокислот.

Практическая значимость работы. Показано, что отечественные промышленные препараты серии "Целловиридин" (штамм Т. reesei 18.2KK), лабораторные препараты на основе нового мутантного штамма Т. reesei 307 (ИБФМ РАН) и, в особенности, лабораторные препараты на основе новых штаммов P. verruculosum В40-221-6 и В40-221-151 (ИБФМ РАН) не уступают или превосходят по эффективности действия аналогичные препараты от зарубежных производителей ферментов в процессах ферментативного осахаривания реальных видов целлюлозосодержащего сырья, подвергнутого различным типам предобработки.

Предложены подходы для интенсификации процесса ферментативного гидролиза целлюлозы, основанные на использовании реакторов нового типа: виброреактора конструкции ВНИИ «Химмаш» и реактора с интенсивным перемешиванием на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора (ПДИ) конструкции НПО «Биомаш». Показана возможность ускорения начальной скорости гидролиза в 1,5-8 раз в указанных реакторах и увеличения продуктивности процесса до 14 раз (в аппарате на базе ПДИ).

Получены высокоактивные и стабильные препараты иммобилизованной Р-глюкозидазы (целлобиазы), которые могут быть использованы для

обработки ферментативных гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы.

Предложены математические модели процессов ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы под действием целлюлазного комплекса Т. viride и гидролиза целлобиозы под действием иммобилизованной (3-глюкозидазы из аспергиллов, которые достоверно описывают кинетику указанных процессов и могут быть использованы для их оптимизации.

Выявлены «тополитические» целлюлазные препараты и индивидуальные целлюлолитические ферменты, способные наиболее мягко и эффективно воздействовать на поверхность целлюлозных волокон без их существенной деструкции. Продемонстрирована высокая эффективность действия ферментных препаратов на основе новых штаммов P. canescens, несущих ген рекомбинантной ЭГ III P. verruculosum, и препаратов целлюлаз на основе различных штаммов С. lucknowense в процессе депигментации («биостонинга») джинсовой ткани. Найдены ферментные препараты, способные эффективно осуществлять биоотварку («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей с целью увеличения их смачиваемости. Проведена оптимизация процесса биоотварки с применением отечественных препаратов Целловиридин Г2х и Г20х. Показано, что в результате ферментной обработки можно достичь показателей смачиваемости ткани, сравнимых с показателями, получаемыми при классической щелочной отварке.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: 16-й Конференции ФЕБО (Москва-1984); 10-й Конференции молодых ученых «Микроорганизмы -продуценты биологически активных веществ» (Юрмала-1984); Всесоюзной конференции «Ферменты в биохимическом анализе» (Паланга-1984); V, VI, VII Всесоюзных симпозиумах по инженерной энзимологии (Кобулети-1985, Каунас-1988, Москва-1991); IV Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Алма-Ата-1987); Международной конференции "Выделение, очистка и анализ биологически активных соединений" (Сухуми-1987); V Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (Рига-1987); VIII Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси-1987); Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала-1990); 13-м, 14-м, 15-м, 20-м и 23-м Симпозиумах по биотехнологии топлива и химических веществ (Колорадо-Спрингс-1991, Гэтлинбург-1992, Колорадо-Спрингс-1993, Гэтлинбург-1998, Брекенридж-2001, США); 215-й и 219-й Конференциях Американского химического общества (Даллас-1998, Сан-Франциско-2000, США); Международных конференциях «Биокатализ-98», «Биокатализ-2000», «Биокатализ-2002» (Пущино-1998, Москва-2000, Москва-2002); Симпозиуме Американской ассоциации текстильных химиков и колористов «Новые технологии и тенденции во влажной обработке одежды» (Новый Орлеан-1999, США); 1-м и 2-м Международных симпозиумах по биотехнологии в текстильной промышленности (Повоа-де-

Варзим-2000, Португалия; Афины-2002, США); Третьем конгрессе химиков-текстильщиков и колористов (Москва-2000); IX Конференции "Деструкция и стабилизация полимеров" (Москва-2001); II Московском международном конгрессе "Биотехнология: Состояние и перспективы развития" (Москва-2003); 22-й Конференции по генетике грибов (Асиломар-2003, США); 11-м Европейском конгрессе по биотехнологии (Базель-2003, Швейцария); 2-й в Украине международной конференции «Энергия из биомассы» (Киев-2004).

Публикации. По теме данного исследования опубликовано 3 книги, 50 статей в российских и международных журналах, получено 5 авторских свидетельств на изобретения. Кроме того, материалы диссертации опубликованы в сборниках трудов конференций и симпозиумов, список которых приведен выше (в список публикаций, приведенный в конце автореферата, тезисы докладов не включены).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (три главы), отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования, четырех глав (главы 5-8), в которых приведены результаты и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы (435 наименований). Объем диссертации составляет 385 страниц, в том числе 153 рисунка и 39 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 литературного обзора посвящена рассмотрению основных компонентов растительной биомассы. Приводится достаточно подробная информация о строении и свойствах целлюлозы как главной составляющей растительной биомассы, а также дается представление о других компонентах: гемицеллюлозах, ксилоглюканах, пектинах, (З-глюканах, лигнине. Глава 2 посвящена целлюлолитическим ферментам и микроорганизмам. В ней рассмотрены распространение и классификация Р-1,4-глюканаз (эндо-1,4-(3-глюканаз, экзо-целлобиогидролаз, ксилоглюканаз, (3-глюкозидаз и экзо-1,4-р-ггаокозидаз), особенности молекулярного строения и механизм действия целлюлолитических ферментов, их свойства, а также значительное внимание уделено микроскопическим грибам как продуцентам целлюлаз. В главе 3 рассмотрены основные направления применения целлюлаз. Значительная часть этой главы посвящена различным аспектам ферментативного осахаривания целлюлозосодержащих материалов: выбору сырья, методам его предобработки, аппаратурному оформлению процессов ферментативного гидролиза целлюлозы. Кроме того, рассмотрено применение целлюлаз в процессах биообработки текстильных материалов (ферментативная депигментация джинсовых изделий, биополировка тканей на основе целлюлозных волокон, «биоскоринг» суровых хлопчатобумажных тканей), а также использование ферментных препаратов карбогидраз в пищевой промышленности и в качестве добавок к комбикормам.

В главе 4 описаны использованные в работе методы исследования (методы определения ферментативных активностей, анализа продуктов ферментативных реакций, выделения и очистки ферментов, исследования кинетики гидролиза целлюлозы в реакторах различного типа, определения кинетических параметров, иммобилизации р-глюкозидазы, оценки действия ферментов на текстильные материалы и т.д.), а также приводится список использованных ферментных препаратов, субстратов и реактивов.

В последующих главах изложены собственно результаты диссертационной работы и проводится их обсуждение.

Глава 5. Целлюлазный комплекс гриба СНгу$о$рог1юп ¡искпо^'втг

Целью данного раздела работы было выделение и изучение свойств ферментов целлюлазного комплекса, продуцируемого мутантным штаммом С, 1искпоц>втв ЦУ 18-25. Необходимо отметить, что данные, касающиеся состава и особенностей функционирования ферментного комплекса С. 1искпоц>втв, а также сведения по ферментам, продуцируемым другими видами грибов рода Chrysosporium, практически отсутствуют в научной литературе. Поэтому представленные в главе 5 сведения (а также наши публикации по этим материалам) фактически впервые описывают целлюлазный комплекс этого важного грибного продуцента карбогидраз.

Общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowen.se.

Данные по активности ряда ферментных препаратов, полученных на основе мутантного штамма С. 1искпоц>втв ЦУ 18-25 при различных условиях культивирования, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Удельные активности ферментных препаратов (ед/г или ед/мл), полученных на основе штамма С. Ыскпотвтв ЦУ 18-25, по отношению к различным субстратам (в скобках приведена активность в расчете на 1 мг белка).

Препарат Белок, КМЦ Авицел Р-Глюкан Ксилан ПГК

мг/гили (МКЦ) ячменя березы

мг/мл

С1Л-09 680 4242 (6,2) 487 (0,72) 7066 (10,4) 3120(4,6) 98 (0,14)

N01-48 99 911 (9,2) 38 (0,38) 1289 (13,0) 345 (3,5) 14 (0,14)

РШге2уте Ь 43 555 (12,9) 24 (0,56) 634(14,7) 169 (3,9) 14 (0,32)

1ЧСЕ Ь-600 37 445 (12,1) 24 (0,65) 574(15,6) 176(4,8) 13 (0,35)

СТ1-1 51 705 (13,9) 27 (0,53) 868(17,1) 203 (4,0) 18(0,35)

Все препараты обладали высокой целлюлазной активностью (активность по КМЦ, авицелу), высокой ксиланазной активностью, а также высокой или заметной активностью по другим субстратам - ячменя,

полигалактуроновой кислоте (111 К) и ряду других полисахаридов. Оптимумы

целлюлазной и ксиланазной активности препаратов находились в области рН 4,0-6,0, однако при этом они сохраняли заметную активность также в нейтральной и слабощелочной среде (при рН 7,0-8,0). Данное свойство имеет большое значение в случае практического применения ферментов в некоторых биотехнологических процессах, что наряду с высоким уровнем биосинтеза внеклеточных ферментов делает гриб С. ¡искпоц!ете очень перспективным продуцентом.

На рис.1 представлены результаты В8-№-ПААГ-элекгрофореза некоторых ферментных препаратов на основе С. ¡искпом!вте ЦУ 18-25. Как видно из представленных данных, для всех препаратов характерно наличие более 10 мажорных белковых полос в диапазоне молекулярных масс 20-110 кДа, а также наличие многих белковых полос с более низкой интенсивностью, что свидетельствует о сложном составе мультиферментного комплекса, секретируемого данным грибом. Большинство из наиболее интенсивных белковых полос на геле относятся к целлюлазам -глюканазахМ (ЭГ) и целлобиогидролазам (ЦБГ). Для общей характеристики ферментного комплекса С. ¡искпом!вте стоит отметить, что в состав секретируемых белков с заметным уровнем экспрессии помимо целлюлаз входят, как минимум, четыре ксиланазы, относящиеся к 10-й и 11-й семьям гликозид-гидролаз и представленные множественными формами (31 и 42 кДа - Ху1 Б1, 46 и 57 кДа - Ху1 Б2, 23 кДа - Ху1 в, а также ксиланаза 38 кДа), ламинариназа (70 кДа), глюкоамилаза (68 к Да), пектатлиаза (65 кДа), две целлобиозодегидрогеназы (-90 к Да), протеаза (31 кДа).

Препарат СЫ-09 был использован для выделения и очистки всех возможных секретируемых целлюлаз.

М 12 М 3 Объем, мл

Рис.1. Ds-Na-ПААГ-электрофорез Рис.2. Фракционирование исходного

ферментных препаратов, полученных на ферментного препарата С. lucknowense

основе штамма С. lucknowense UV18-25. CL1-09 на колонке Source 15Q. По

I - CL1-09; 2 - FibreZyme L; 3 - NCE L- вспомогательной оси (справа) отложен

600. М - белки-маркеры с различной градиент концентрации соли, молекулярной массой.

С помощью анионообменной хроматографии на колонке Source 15Q (рис.2) с последующими стадиями, включающими анионообменную хроматографию на Mono S или Mono Q, гель-фильтрацию на Superóse 12 и хроматофокусирование на Mono P, были выделены 11 ферментов целлюлазного комплекса: шесть эндоглюканаз и пять целлобиогидролаз. Кроме того, из фракции 7 после Source 15Q с помощью гидрофобной хроматографии на Source 15 Isopropyl была выделена ксилоглюканаза, обладающая сравнительно низкой целлюлазной активностью, но при этом крайне высокой активностью по ксилоглюкану.

Все выделенные ферменты были гомогенными по данным Ds-Na-ПААГ-электрофореза и изоэлектрофокусирования (ИЭФ) за исключением ЭГ 44 кДа и ЭГ 47 кДа, которые при ИЭФ наряду с основной полосой содержали также минорные полосы. По данным расчета площадей хроматографических пиков, соответствующих конкретным ферментам, их конечному выходу в результате очистки (в мг), а также интенсивности соответствующих белковых полос на электрофореграмме исходного ферментного препарата было оценено примерное содержание каждого из целлюлазных компонентов в исходном препарате (табл.2).

Субстратная специфичность, классификация и свойства эндоглюканаз и целлобиогидролаз. Определение субстратной специфичности

выделенных ферментов проводили с использованием ряда полисахаридных субстратов, а также синтетических n-нитрофенильных производных целлобиозы (п-НФ-02) и лактозы (п-НФ-L). Данные представлены в табл.3.

Первые шесть ферментов, представленные в таблице, характеризовались способностью эффективно снижать вязкость карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), а также высоким уровнем КМЦазной активности, определяемой по образованию восстанавливающих Сахаров (ВС), на основании чего данные ферменты были классифицированы как эндо-1,4-Р-глюканазы (КФ 3.2.1.4). После определения аминокислотных последовательностей пептидов из выделенных эндоглюканаз (см. ниже) и/или их субстратной специфичности была установлена принадлежность этих ферментов к конкретным семьям гликозид-гидролаз (табл.2) согласно классификации, предложенной Хенриссатсм в 1989 г., а также этим эндоглюканазам присвоены индексы, принятые для целлюлаз в современной научной литературе - ЭГ I, II, III, V и VI (по аналогии с ферментами Т. reesei). Как показано ниже, два фермента являлись формами ЭГ II с различной молекулярной массой (51 и 44 кДа).

Крайне низкая активность по отношению к КМЦ и в то же время высокая удельная активность по отношению к микрокристаллической целлюлозе (МКЦ, или авицелу) позволили однозначно классифицировать ферменты с молекулярной массой 65, 52 и 70 кДа, а также один из ферментов с массой 60 кДа как целлобиогидролазы (КФ 3.2.1.91). Как показано ниже, они принадлежат к 7-й или 6-й семье гликозид-гидролаз, причем два фермента (65 и 52 кДа) являлись формами ЦБГ 1а (Се17А) с различной молекулярной массой. Некоторые сложности возникли с классификацией

целлюлазы 43 кДа. Она обладала сравнительно низкой КМЦазной и (3-глюканазной активностями, чтобы быть отнесенной к эндоглюканазам, однако характеризовалась заметной авицелазной активностью - свойством, типичным для целлобиогидролаз. Только после анализа структуры пептидов, секвенирования гена, кодирующего данный фермент, и моделирования его трехмерной структуры (см. ниже), он был однозначно классифицирован как ЦБГ Па (Се16А).

Таблица 2. Биохимические и физико-химические характеристики очищенных целлюлаз С. Шекпомгвтв.

Фермент Молек. Семья Система- Наличие Содерж. Адсорбция

масса, р1 гликозид- тическое ЦСМ в препа- на МКЦ,

кДа* гидролаз название рате, % %

ЭГI 60 3,7 7 Се17С нет 1 14

ЭГII вм 51 4,8 5 Се15А да 7 98

ЭГ II нм 44 6,0 5 Се15А нет 1 10

ЭГ III 28 5,7 12 Се112А нет 3 22

ЭГУ 25 4,0 45 Се145А нет 3 20

ЭГ VI 47 5,7 6 Се16С нет 8 29

ЦБГ 1а вм 65 4,5 7 Се17А да 17 99

ЦБГ 1а нм 52 4,5 7 Се17А нет 8 59

ЦБГ 1Ь 60 3,8 7 Се17В нет 12 65

ЦБГ Па 43 4,2 6 Се16А нет 3 32

ЦБГ ИЬ 70 5,6 6 Се16В да 15 99

Сокращения: вм - высокомолекулярная форма фермента, нм - низкомолекулярная форма фермента.

*Молекулярная масса, определенная по электрофоретической подвижности белка при Ds-Na-ПААГ-электрофорезе.

Таблица 3. Удельные активности (ед. на 1 мг белка) эндоглюканаз и целлобиогидролаз С. 1ыекпон>ете по отношению к различным субстратам.

Фермент КМЦ КМЦ Р-Глю- МКЦ Ксило- Лами- Кси- л-НФ- и-НФ-

(ВС) (виск.) кан глюкан нарии лан <л ь

ЭГ I 12 5 18 0,08 0 0 0 0,12 0,27

ЭГПвм 52 46 75 0,19 0 0,1 0,18 0 0

ЭГ II нм 59 39 74 0,06 0 0,13 0,07 0 0

ЭГШ 11 19 125 0,02 16 0 0,2 0 0

ЭГУ 17 20 5,3 0,05 1,9 0 0 0 0

ЭГ VI 14 6 18 0,07 0 0 0,08 0 0

ЦБГ 1а вм 0,2 0,01 <0,1 0,21 0 0 0 0,021 0,12

ЦБГ 1а нм 0,2 0,02 <0,1 0,10 0 0 0 0,025 0,11

ЦБГ 1Ь 0,3 0,02 <0,1 0,12 0 0 0 0,02 0,09

ЦБГ На 1,1 0,6 2,0 0,08 0 0 1,4 0 0

ЦБГ ПЬ 0,1 0,01 0,2 0,22 0 0 0,03 0 0

Все выделенные эндоглюканазы и целлобиогидролазы проявляли максимальную активность в кислой среде (оптимум при рН 4,5-6,0). Важно отметить, что два фермента (ЭГ V и ЭГ VI) сохраняли 55 и 60% активности от максимальной при рН 8,5. Высокая активность при нейтральных и щелочных значениях рН - свойство, которое встречается среди грибных целлюлаз довольно редко.

Исследование термостабильности ферментов показало, что все они обладают высокой стабильностью при 50°С и значениях рН 5,0 и 7,0. При указанных условиях очищенные целлюлазы сохраняли более 90% активности в течение 5 ч, за исключением ЭГ III при рН 7,0 (через 5 ч фермент терял 25% активности при рН 7,0, однако был стабильным при рН 5,0) и ЭГ VI (за указанное время инкубации при рН 5,0 и рН 7,0 ЭГ VI теряла 40 и 20% активности, соответственно).

Близкие значения удельной активности эндоглюканаз с молекулярными массами 44 и 51 кДа по различным субстратам (табл.3), похожие рН- и температурные профили активности данных ферментов позволили предположить, что эти эндоглюканазы являются двумя формами одного фермента. Этот вывод был в дальнейшем подтвержден МАТБГТОГ масс-спектрометрическим анализом трипсиновых гидролизатов данных ферментов (масс-спектры оказались практически идентичными - см. рис.3). Поэтому далее мы будем их называть ЭГ II (нм) и ЭГ II (вм); нм и вм - соответственно низкомолекулярная и высокомолекулярная формы. То же самое касается двух форм ЦБГ 1а (65 и 52 кДа), которые далее обозначены как ЦБГ 1а (вм) и ЦБГ 1а (нм).

Рис.3. MALDI-TOF масс-спектры трипсиновых гидролизатов двух форм ЭГ II С. lucknowense с молекулярной массой 51 кДа (а) и 44 кДа (б).

Адсорбционную способность ферментов оценивали при рН 5,0 и 4°С, определяя количество фермента, связавшегося с МКЦ при избытке субстрата (4 мг белка на 1 г носителя). Только три фермента - ЭГ II (вм), ЦБГ 1а (вм) и ЦБГ lib - характеризовались высокой адсорбционной способностью на МКЦ (степень адсорбции белка 98-99%), для остальных целлюлаз степень

адсорбции была значительно ниже (табл.2). Эти данные позволили предположить, что только у высокомолекулярных форм ЭГ II и ЦБГ la, a также у ЦБГ lib в молекулах имеются целлюлозосвязывающие модули (ЦСМ). Наличие ЦСМ у ЦБГ 1а (вм) и отсутствие такового у ЭГ V, ЭГ III и ЦБГ Па было подтверждено анализом генов, кодирующих соответствующие белки. Для остальных ферментов вывод о наличии или отсутствии ЦСМ (табл.2) был сделан на основании данных по адсорбционной способности данных белков, а также данных масс-спектрометрии.

С помощью ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой был определен состав низкомолекулярных продуктов при исчерпывающем гидролизе (3-глюкана очищенными эндоглюканазами. Полученные хроматограммы представлены на рис.4. Как видно из сравнения со стандартом (хроматограмма 7), в качестве низкомолекулярных продуктов гидролиза образовывались олигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 4, а также глюкоза. Главными продуктами действия ЭГ II, III и VI являлись ди- и трисахариды, при этом также в заметном количестве образовывался тетрасахарид и относительно мало - глюкоза. ЭГ I и V образовывали смесь глюкозы с дисахаридом и тетрасахаридом, при этом среди продуктов практически отсутствовал трисахарид.

Как и следовало ожидать, практически единственным продуктом гидролиза МКЦ под действием очищенных целлобиогидролаз оказалась целлобиоза (>90%), и лишь в следовых количествах образовывалась глюкоза. Такой состав продуктов типичен для целлобиогидролаз.

Для сравнения осахаривающей способности очищенных эндоглюканаз и целлобиогидролаз при действии на нерастворимую целлюлозу проводили длительный гидролиз МКЦ (рис.5). При этом концентрация всех целлюлаз в реакционной смеси была одинаковой - 0,1 мг/мл (по белку). Известно, что, как правило, эндоглюканазы образуют в качестве растворимых продуктов гидролиза целлюлозы смесь целлоолигосахаридов, концентрация которых слишком мала, чтобы определить ее количественно хроматографическим путем, используя в качестве детектора рефрактометр. Поэтому для всех ферментов эксперименты по гадролизу МКЦ проводили в присутствии избытка высокоочищенной (3-глюкозидазы (из A. japonicus) для того, чтобы конвертировать образующуюся целлобиозу и другие целлоолигосахариды в конечный продукт (глюкозу), упростив таким образом анализ гидролизата.

Как и следовало ожидать, наиболее высокую эффективность при гидролизе МКЦ проявили целлобиогидролазы, имеющие ЦСМ - ЦБГ 1а (вм) и ЦБГ lib, для которых концентрация глюкозы через 7 сут. реакции составила 2,5 и 3,6 г/л (степень конверсии МКЦ 45 и 65%, соответственно). Заметно меньшей (средней) осахаривающей способностью характеризовались ЭГ II (вм), ЦБГ На и ЭГ I (степень конверсии 19-23%). Несмотря на то, что по начальной скорости реакции и концентрации глюкозы через 2-3 сут. ЦБГ Ib также попала в группу ферментов со средней осахаривающей способностью, через 7 сут. степень конверсии МКЦ для нее составила 41%, т.е. данный фермент приблизился по эффективности действия к ЦБГ 1а (вм) Эндоглюканазы II (нм), III, V и VI проявили крайне низкую осахаривающую способность (степень конверсии субстрата не превышала 12%).

Анализ аминокислотных последовательностей пептидов и белков, особенности молекулярного строения целлюлаз С. lucknowense. Для

получения информации по аминокислотным последовательностям пептидов из выделенных целлюлаз, на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликозид-гидролаз, использовали три основных подхода: 1) определение N-концевой последовательности белков по Эдману; 2) расщепление белков трипсином или BrCN с последующим хроматографическим разделением пептидов и их секвенированием; 3) определение структуры «трипсиновых» пептидов методом тандемной масс-спектрометрии. Первый подход в большинстве случаев не сработал из-за блокирования N-конца белков, т.е. когда N-терминальным остатком является глутамин, который модифицирован и находится в форме пироглутамовой кислоты. Более успешными оказались другие подходы, с помощью которых удалось получить структуру пептидов из всех выделенных целлюлаз С. lucknowense за исключением ЭГ I. Для полученных пептидов были найдены гомологи в аминокислотных последовательностях известных целлюлаз из других микроорганизмов (табл.4), и на основании полученной информации эндоглюканазы и целлобиогидролазы С. lucknowense были классифицированы по их принадлежности к конкретным семьям (табл.2).

Таблица 4. Пептиды из целлюлаз С. ¡иекпон:ете, для которых были определены аминокислотные последовательности.

Фермент Кол-во пептидов (их длина, а.о.) Метод определения последовательности Найденные гомологи

ЭГП 3 (25, 9 и 9 а.о.) А-консц по Эдману (ЭГ II нм) Секв. после расщепления ВгСЫ Се15А Я insolens

ЭГШ Полный белок Рассчитана по гену Многие целлюлазы 12-й семьи

ЭГУ 2 (26 и 6 а.о.) Секвенирование после расщепления трипсином Се145А М. álbomyces Се145А Я. grísea Се145А Я. insolens

ЭГ VI 2 (34 и 7 а.о.) А'-конец по Эдману Масс-спектрометрия Cei6B Я. insolens Cel6B C.fimi Cel6A F. oxysporum

ЦБГ 1а 6(12, 11,9,8, 8 и 8 а.о.) Секвенирование после расщепления ВгСЫ (вм) или трипсином (нм) Cel7A Я grísea Cel7A T. reesei Cel7D P. chrysosporium

ЦБГ Ib 33 (от 5 до 26 а.о.) МА1Л51-ТОР масс-спектрометрия Cel7A C. hetero-thallicus

ЦБГ На 3 (29, 27 и 5 а.о.) Секвенирование после расщепления трипсином Cel6A F. oxysporum Cel6A N. crassa и др.

ЦБГ lib 7(27,18,17, 9, 8, 7 и 6 а.о.) Тандемная масс-спектрометрия Cel6A Я insolens Cel6A P. chrysosporium Cel6A T. reesei и др.

Единственной из целлюлаз С. lucknowense, для которой до настоящего времени не получено информации по аминокислотной последовательности белка (или его пептидов), оказалась ЭГ с молекулярной массой 60 кДа. Однако, она оказалась также единственной ЭГ С lucknowense, которая обладает активностью по отношению к n-HO-G2 и и-НФ-L, т.е. свойством, характерным для целлюлаз из 7-й семьи (как ЭГ, так и ЦБГ). На основании этого свойства фермент был классифицирован как ЭГ I (Се17С).

Для трех целлюлаз (ЭГ V, ЦБГ 1а и ЦБГ Па) на основании информации по аминокислотным последовательностям пептидов были синтезированы ПЦР-праймеры для использования в реакции амплификации участков ДНК генов, кодирующих указанные белки. В результате дальнейшей работы были получены полные нуклеотидные последовательности генов, кодирующих ЭГ V, ЦБГ 1а и ЦБГ Па. Вся работа по генной инженерии целлюлаз С. lucknowense была выполнена на фирме TNO Nutrition and Food Research (Нидерланды). Там же дополнительно был найден ген (eg3), кодирующий белок, гомологичный многим эндоглюканазам из 12-й семьи (табл.4). Далее на основании полученной генетической информации были рассчитаны полные аминокислотные последовательности указанных четырех ферментов,

которые приведены в диссертации. MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ пептидов из трипсинового гидролизата выделенной нами ранее ЭГ 28 кДа (т.н. пептидный «фингерпринт») показал, что фермент идентичен белку, транслированному из гена eg3. На основании данной информации ЭГ 28 кДа была классифицирована как ЭГ III (Се112А). С помощью пептидных «фингерпринтов» в дальнейшем были также подтверждены аминокислотные последовательности других целлюлаз С. lucknowense, при этом степень покрытия последовательностей специфическими «трипсиновыми» пептидами варьировала от 61 до 78%. Не подтвержденные масс-спектрометрией пептиды имели слишком высокую, либо слишком низкую молекулярную массу, чтобы быть идентифицированными данным методом.

При анализе пептидного «фингерпринта» ЦБГ Ib с помощью компьютерной программы MASCOT (http://www.matrixscience.com) на соответствие полученных пептидных масс специфическим «трипсиновым» пептидам из известных гликозид-гидролаз, имеющихся в белковых базах данных NCBI, MSDB и SWISS-PROT, ЦБГ Ib была идентифицирована как ЦБГ из Corynascus heterothallicus (CAD79788), которая принадлежит к 7-й семье гликозид-гидролаз. Всего с последовательностью указанного белка совпали 33 специфических «трипсиновых» пептида из ЦБГ Ib С. lucknowense (табл.4), что говорит об очень высокой степени идентичности (не менее 9095%) между этими ферментами. Необходимо отметить, что всего нами были охарактеризованы с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии пептидные «фингерпринты» около 30 белков С. lucknowense, и указанный случай был единственным, когда программа MASCOT обнаружила в базах данных белок, идентичный или высокогомологичный ферментам из С. lucknowense.

Используя программу SWISS-MODEL Швейцарского института биоинформатики (totp://swissmodel.expasy.org/SWISS-MODEL.htinl), а также известные кристаллические структуры целлюлаз из 6, 7, 12 и 45-й семей гликозид-гидролаз в качестве шаблонов, было осуществлено сравнительное моделирование трехмерных структур ЦБГ Па, ЦБГ 1а, ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense. Поскольку из литературных данных известны ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстратов в активных центрах целлюлаз из указанных семей, оказалось возможным дискриминировать соответствующие остатки и в молекулах ЦБГ Па, ЦБГ 1а, ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense, анализируя при этом выравненные аминокислотные последовательности гомологичных белков, а также полученные трехмерные модели ферментов в сравнении с известными кристаллическими структурами целлюлаз. Во всех случаях наиболее важные аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстратов оказались абсолютно консервативными.

На рис.6 показана трехмерная модель каталитического домена ЦБГ 1а (Се17А) С. lucknowense, представляющая собой (3-сэндвич, т.е. структуру, типичную для целлюлаз из 7-й семьи гликозид-гидролаз.

Рис.6. Трехмерная модель каталитического домена ЦБГ 1а (Се17А) С. Шекпопете. «Звездочкой» помечен «туннель» активного центра.

Рис.7. Структура активных центров ЦБГ I Т. гее&еЬ (мутант E212Q - светлосерый цвет) и ЦБГ 1а С. Ыекпо-пете (черный цвет). Две молекулы целлотетраозы, связанные в активном центре ЦБГ I Т. геехег, показаны серым цветом.

Рис.8. Трехмерные модели ЦБГ На (а), ЭГ III (б) и ЭГ V (в) С. lucknowense. Каталитические аминокислотные остатки в активных центрах ферментов помечены.

На рис.7 приведены наложенные друг на друга структуры активных центров целлобиогидролаз (Се17А) С. lucknowense и Т. reesei вместе с двумя молекулами целлотетраозы (связанной в активном центре не способного к катализу мутанта E212Q Се17А Т. reesei), при этом использована реальная структура 5CEL.PDB из базы данных трехмерных структур белков (http://www.wwpdb.org/). Только наиболее важные для катализа и связывания консервативные остатки, а также неконсервативные остатки показаны на указанном рисунке. У ЦБГ 1а С. lucknowense за катализ отвечают остатки Glu-213, Asp-215, Glu-218. Стоит также обратить внимание на четыре остатка триптофана (Тгр-38, Тгр-40, Тгр-372, Тгр-381), осуществляющих т.н. «стэкинг-взаимодействия» с гликозидными остатками в субсайтах связывания субстрата -7, -4, -2 и + 1.

Трехмерные модели ЦБГ Па, ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense приведены на рис.8. Как и в случае других целлюлаз, у данных ферментов за катализ

отвечают остатки аспарагиновои и глутаминовои кислот, которые помечены на рисунке. Стоит обратить внимание, что в отличие от ЦБГ 1а (рис.6) пептидные петли у ЦБГ Па (рис.8а) не полностью закрывают «ущелье» активного центра, образуя «туннель» - характерную особенность активных центров целлобиогидролаз. Это может объяснять более высокую активность ЦБГ На по отношению к КМЦ по сравнению с ЦБГ 1а (табл.3).

Специфичные ксилоглюканазы С. lucknowense * T. reesei и А. japonicus как представители нового класса гликозид-гидролаз. Как уже отмечалось выше, из фракции 7 после Source 15Q (рис.2) с помощью последующей гидрофобной хроматографии на Source 15 Isopropyl была выделена специфичная ксилоглюканаза (КГ) С. lucknowense, обладающая весьма низкой целлюлазной активностью (табл.5). Также нами были выделены подобные ксилоглюканазы из двух других грибных источников: Т. reesei и A. japonicus. Поскольку ксилоглюкан представляет собой разветвленный полисахарид, основная цепь которого фактически имеет такое же химическое строение, как и целлюлоза, но в боковой цепи которой имеются заместители из остатков ксилозы и некоторых других моносахаридов, до последнего времени ферменты, гидролизующие ксилоглюкан, формально относили к целлюлазам. Поэтому КГ С. lucknowense можно было бы также считать целлюлазой, входящей в состав целлюлазного комплекса данного гриба. Однако, в диссертации на основании исследования свойств трех ксилоглюканаз из различных грибных источников показано, что данные ферменты следует классифицировать в отдельный класс «специфичных ксилоглюканаз», отличающихся от истинных целлюлаз (эндо-1,4-р-глюканаз и экзо-целлобиогидролаз).

М 1 2 3 4 5 6 М

Рис.9. Ds-Na-ПААГ-электрофорез ксилоглюканаз. / - КГ Т. reesei; 2 - КГ Т. reesei после адсорбции на МКЦ; 3 - КГ С. lucknowense; 4 - КГ С. lucknowense после адсорбции на МКЦ; 5 - КГ А. ]аротсш; 6 - КГ А. ]аротсш после адсорбции на МКЦ; М - белки-маркеры с различной молекулярной массой (кДа).

Выделенные из A japonicus и С. lucknowense ферменты были гомогенными по данным Ds-Na-ПААГ-электрофореза (рис.9) и ИЭФ. Их молекулярные массы составили 32 и 78 кДа, pi - 2,8 и 3,8, соответственно. КГ Т. reesei проявлялась при электрофорезе в виде нескольких полос с молекулярными массами в диапазоне 75-105 кДа, а также в виде нескольких полос (р! 4,1-4,3) при ИЭФ. Различные хроматографические методы не

позволили разделить эти полосы на индивидуальные белки. Поэтому мы предположили, что наблюдаемая гетерогенность вызвана наличием нескольких форм одного и того же фермента. Это предположение было подтверждено масс-спектрометрическим анализом трипсиновых гидроли-затов белковых полос, соответствующих различным формам КГ Т. reesei.

Когда КГ Т. reesei была впервые выделена нами в 2002 г., поиск с помощью программы MASCOT в белковых базах данных не смог идентифицировать этот фермент по пептидному «фингерпринту». Однако, в середине 2003 г. был обнаружен и опубликован ген cell4 Т. reesei (GenBank код AY281371), который кодирует белок, принадлежащий к 74-й семье гликозид-гидролаз. В то же время сам фермент не был выделен и охарактеризован, но классифицирован как целлюлаза Се174А на основании гомологии с гликозид-гидролазами 74-й семьи. Аминокислотная последовательность белка (SWISS-PROT код Q7Z9M8), транслированного из гена cell4 Т. reesei, включает 838 остатка, белок имеет ЦСМ, расположенный на С-конце. Повторный поиск с помощью программы MASCOT, проведенный в начале 2004 г., позволил однозначно установить, что выделенная нами КГ Т. reesei идентична белку, транслированному из гена cell4 Т. reesei. В целом, 33 специфических «трипсиновых» пептида соответствовали Се174А Т. reesei, покрывая 58% аминокислотной последовательности. С-концевой пептид, принадлежащий к ЦСМ фермента (с m/z = 1266,5), был обнаружен только в высокомолекулярной (105 кДа) форме КГ Т. reesei. По-видимому, в остальных формах фермента с более низкой молекулярной массой ЦСМ отсутствовал, что могло быть результатом частичного протеолиза белка. Этот вывод также подтверждается данными электрофореза (рис.9). Так, только наиболее высокомолекулярная полоса (105 кДа) КГ 71 reesei полностью исчезала на электрофореграмме как результат адсорбции на целлюлозе (рис.9, дорожка 2, ср. с дорожкой 1).

При анализе пептидных «фингерпринтов» ксилоглюканаз A. japonicus и С. lucknowense с помощью программы MASCOT не было выявлено известных ферментов, в аминокислотных последовательностях которых имеются специфические «трипсиновые» пептиды с идентичными молекулярными массами. Поэтому для получения информации по аминокислотным последовательностям этих ксилоглюканаз некоторые выбранные из масс-спектров пептиды были подвергнуты фрагментации и анализу методом тандемной (TOF-TOF) масс-спектрометрии.

В случае КГ A. japonicus были получены аминокислотные последовательности двух пептидов (с m/z 1012,5 и 2658,0). Для первого пептида (с m/z=l012,5) в результате поиска с помощью программы BLAST в белковых базах данных не было обнаружено гомологичных пептидов среди известных гликозид-гидролаз. Для второго пептида (с m/z=2658,0) такие гомологи были найдены среди ферментов 12-й семьи, в частности - две КГ (XG1 и XG2) из A. aculeatus (коды SWISS-PROT 094218 и Q6YBY2). Ниже представлено выравнивание аминокислотных последовательностей

гомологичных пептидов. Необходимо отметить, что использованный метод тандемной масс-спектрометрии не позволял дискриминировать остатки Leu и Не (они имеют одинаковую массу), поэтому в пептиде из КГ A. japonicus в определенных позициях вместо L может присутствовать I:

XG1 А. aculeatus: 80 SYVNAALTFTPTQLNCISSIPTTWK 104

SY NAAL FT TQL +SS+PT+WK

КГ Д. japonicus: SYANAALQFTGTQLSSLSSLPTSWK

SYANAAL FT TQL +SS+PT+WK

XG2 A. aculeatus-. 62 SYANAALTFTPTQLNCISSIPTTWK 86

В случае КГ С. lucknowense с помощью тандемной масс-спектрометрии были определены аминокислотные последовательности 9 пептидов (длиной от 7 до 22 а.о.). Для всех этих пептидов были найдены гомологичные пептиды в аминокислотных последовательностях известных ферментов из 74-й семьи. Наибольшая гомология наблюдалась в случае КГ (Се174) Т. reesei (Q7Z9M8), т.е. фермента, который только что обсуждался выше.

Удельные активности очищенных ксилоглюканаз по отношению к ряду субстратов и их основные характеристики приведены в табл.5. КГ А. japonicus обладала высокой активностью только по отношению к ксилоглюкану и также проявляла следовую Р-глюканазную активность, при этом КМЦазная активность полностью отсутствовала. Две остальные КГ обладали похожей субстратной специфичностью, т.е. наибольшую активность проявляли по отношению к ксилоглюкану и при этом также обладали заметной |3-глюканазной и КМЦазной активностью, которая, однако, была в 12-19 раз ниже ксилоглюканазной активности. Все три выделенные КГ не проявляли активности по отношению к другим полисахаридам и и-НФ-производным различных моно- и дисахаридов.

Ксилоглюканазы проявляли максимальную активность при рН 5,0-6,0 (табл.5). Ферменты были стабильными при 40°С и рН 5,0 по меньшей мере в течение 24 ч. При 50°С их время полуинактивации было >24 ч. При более высоких температурах КГ A. japonicus была наиболее стабильной, сохраняя 50% активности после 28 ч инкубации при 60°С. 'Время полуинактивации ферментов из Т. reesei и С. lucknowense при 60°С составило 15 и 18 мин.

Для того, чтобы выяснить, по какому механизму (экзо- или эндо-деполимеразному) ксилоглюканазы расщепляют полимерные субстраты, изучали изменение молекулярно-массового распределения (ММР) ксилоглюкана под действием ферментов методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) - см. рис.10. Изменения ММР продуктов гидролиза ксилоглюкана под действием КГ A. japonicus указали на эндо-деполимеразный тип действия фермента (рис. 10а). При этом исходный пик ксилоглюкана быстро расширялся в ходе реакции, его молекулярная масса уменьшалась (пик мигрирует вправо на хроматограммах), но в то же время образования низкомолекулярных продуктов на начальной стадии гидролиза не происходило (кривые 2-4). Такие продукты появлялись только на заключительной стадии реакции (кривые 5 и 6).

Таблица 5. Основные свойства и удельная активность ксилоглюканаз по различным субстратам.

Свойство* КГ A. japonicus КГ С. lucknowense КГ Т. reesei

Молекулярная масса (кДа) 32 78 75-105

р1 2,8 3,8 4,1-4,3

рН-оптимум активности 5,0 6,0 5,3

рН5о** 3,8-6,1 4,5-7,2 3,3-6,9

Активность (ед/мг) по отн.:

ксилоглюкан тамаринда 98 ± 5 75 ±4 45 + 5

Р-глюкан ячменя 0,7 ±0,1 6,0 + 0,4 3,5 ± 0,3

КМЦ 0 3,9 ± 0,3 2,6 ± 0,2

Кт для ксилоглюкана (мг/мл) 0,67 ± 0,09 0,31 ±0,04 0,30 ± 0,06

Асл для ксилоглюкана (с-1) 53 ±2 99 ±3 55 ±4

Кт для Р-глюкана (мг/мл) и.о. 18 + 3 8 + 2

Аса! для р-глюкана (с"') 11.0. 30 ±3 12 ± 1

Кт для КМЦ (мг/мл) н.о. »50 51 ± 17

¿са1 для КМЦ (с"1) н.о. н.о. 46+10

* Кинетические константы (£т и feat) определены при 50°С в рН-оптимумах действия ферментов. Для КГ Т. reesei при расчете кСгt использовали теоретическую массу фермента (85 кДа), определенную из его аминокислотной последовательности.

** Область рН, в которой фермент сохраняет 50% активности или более.

0 10 20 0 10 20 0 10 20 Время удерживания, мин

Рис.10. Анализ продуктов гидролиза ксилоглюкана методом ГПХ на колонке TSK G3000SWXL. а - КГ A. japonicus; б - КГ С. lucknowense, в - КГ Т. жвз^. Время гидролиза: / - 0 мин; 2-20 мин; 3 - 40 мин; 4 - 80 мин; 5 - 140 мин; 6- 630 мин.

Характер изменения ММР ксилоглюкана под действием ксилоглюканаз С. lucknowense и Т. reesei был совершенно другим (рис. 105, 10в). В ходе гидролиза ксилоглюкана высота исходного пика субстрата постепенно уменьшалась, и это сопровождалось накоплением низкомолекулярных продуктов. В то же время образования продуктов в диапазоне средних молекулярных масс не происходило (в отличие от КГ A. japonicus). Такой характер изменения ММР субстрата характерен для экзо-ферментов.

В диссертационной работе показано, что наиболее вероятным механизмом, по которому КГ С. lucknowense и Т. reesei действуют на разветвленный полисахарид, является процессивный механизм, когда после разрыва глкжозидной связи не происходит десорбции полимерной цепи ксилоглюкана, а вместо этого она протягивается дальше вдоль «ущелья» активного центра, и таким образом происходит серия гидролитических атак на одну и ту же молекулу полимера с последовательным отщеплением олигосахаридных блоков.

Анализ углеводов методом ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой показал, что несмотря на то, что ксилоглюканазы различались по типу действия на ксилоглюкан, все они образовывали одинаковый набор из трех олигосахаридов в качестве конечных продуктов, а именно XXXG, XXLG/XLXG и XLLG (обозначения олигосахаридов даны по Фраю и др., 1993, где незамещенный остаток глюкозы обозначен как G, остатки глюкозы, содержащие ксилозильный заместитель - буквой X, а остатки, содержащие в качестве заместителя ксилозил-галактозу - буквой L). Такая структура олигосахаридов была подтверждена методом масс-спектрометрии.

Следует отметить, что к настоящему времени известно очень мало микробных КГ, обладающих высокой активностью по отношению к ксилоглюкану, но у которых при этом низкая и/или КМЦазная

активности (либо они отсутствуют). Первый такой фермент (из A. aculeatus) был описан в 1999 г. [Pauly et al., 1999]. Все известные КГ принадлежат либо к 12-й, либо к 74-й семье гликозид-гидролаз. Только одна из описанных в литературе КГ оказалась ферментом экзо-типа. действия, а именно олигоксилоглюкан-специфичная целлобиогидролаза из Geotrichum sp. [Yaoi et al., 2002], которая, в отличие от КГ С. lucknowense и Т. reesei, отщепляет с восстанавливающего конца олигоксилоглюканов сегменты, включающие два (а не четыре, как в нашем случае) глюкозидных остатка в основной цепи, и при этом она не способна действовать на полимерный субстрат.

Таким образом, представленные в диссертации данные, характеризующие три новые грибные ксилоглюканазы, вместе с литературными данными за последние 2-3 года, позволяют утверждать, что специфичные ксилоглюканазы могут считаться новым классом гликозид-гидролаз, отличаясь от истинных целлюлаз (эндо-1,4-р-глюканаз и экзо-целлобиогидролаз), действующих на линейные Р-1,4-глюканы. При этом две из обнаруженных нами специфичных ксилоглюканаз продемонстрировали необычный (не описанный ранее в литературе) экзо-тип действия на

полимерный субстрат, в результате которого от концов молекулы ксилоглюкана последовательно отщепляются олигосахаридные блоки, содержащие 4 глюкозидных остатка в основной цепи.

Глава 6. Ингибирование продуктами реакции и трансгликозилирование при катализе целлюлолитическими ферментами

Процесс ферментативного гидролиза целлюлозы осуществляется в гетерогенной системе под действием целлюлазного комплекса, состоящего из ферментов, различающихся по типу действия на полимерный субстрат, т.е. по сложному механизму. Более того, процесс осложняется влиянием различных факторов, одним из которых является ингибирование целлюлаз продуктами реакции - глюкозой и целлобиозой. Помимо основной реакции гидролиза, катализируемой целлюлазами, некоторые из ферментов также способны осуществлять побочные реакции трансгликозилирования.

Глава 6 диссертации посвящена выяснению некоторых особенностей ингибирования целлюлолитических ферментов целлобиозой и глюкозой, а также исследованию реакций трансгликозилирования, катализируемых ЦБГ I Т. longibrachiatum, которые, как будет показано ниже, были обнаружены для данного класса ферментов впервые.

Теоретический анализ ингибирования целлюлаз продуктами реакции: оценка влияния различных факторов. Из литературных данных известно, что эндоглюканазы, как правило, крайне слабо ингибируются как глюкозой, так и целлобиозой, и при описании кинетики ферментативного гидролиза целлюлозы таким ингибированием часто можно пренебречь. Однако, в случае целлобиогидролаз, вносящих основной вклад в образование растворимых продуктов гидролиза целлюлозы, было не все понятно. В частности, в литературе существовали разногласия относительно типа ингибирования. В обзоре Холтзэппла на эту тему [Holtzapple et al, 1990] отмечалось, что в большинстве случаев наблюдаемое различными исследователями ингибирование целлобиозой носило конкурентный или неконкурентный характер. Дискуссия в литературе относительно типа ингибирования в 1970-1980-е гг. не привела к единой точке зрения, несмотря на то, что практически во всех случаях использовались целлюлазные комплексы на основе Т. reesei (T. viride), т.е. близкие по составу препараты.

В диссертации рассмотрены возможные причины таких разногласий. Одной из основных причин, по-видимому, является то, что постулаты и уравнения, принятые в классической кинетике гомогенного ферментативного катализа, т.е., например, когда выполняется условие, что молярная концентрация субстрата намного больше концентрации фермента часто не применимы для гетерогенной системы «целлюлоза-целлюлазы». Поэтому мы предприняли попытку теоретического анализа ингибирования целлюлаз продуктами реакции, используя математическую модель

ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы, в которой, помимо прочих факторов, также учитывался и материальный баланс по субстрату.

Сама математическая модель подробно описана в главе 7 (раздел 7.2 диссертации). При теоретическом анализе ингибирования использовали кинетические параметры (табл.6), найденные для целлюлазного комплекса Т. viride (Целловиридин ГЗх). Единственным упрощением модели было то, что при ингибиторном анализе полагали, что субстрат представляет собой чистую целлюлозу (т.е. в нем отсутствует лигниновая фракция). Численный расчет проводили на ЭВМ с использованием метода Рунге-Кутта. В рамках указанной модели рассчитывали начальные скорости образования целлобиозы или общих Сахаров (целлобиоза + глюкоза) из целлюлозы в присутствии добавленного продукта при различных условиях, и далее полученные результаты представляли в виде графиков в двойных обратных координатах (координатах Лайнуивера-Берка), для того, чтобы более наглядно интерпретировать характер (тип) ингибирования.

Рассмотрим типичные ситуации, которые могут наблюдаться в реакционной системе «целлюлоза - целлюлазы Т. viride» при различных условиях.

Ситуация 1. Ингибирование добавленной в реакционную смесь целло-биозой, активность Р-глюкозидазы подавлена, т.е. иеллобиоза является единственным продуктом реакции. Подобный случай соответствует ситуации, когда активность отсутствует в целлюлазном

препарате или она подавлена добавлением селективного ингибитора фермента. Такая же ситуация имеет место в случае индивидуального (очищенного) фермента, действующего на нерастворимую целлюлозу, а именно ЦБГ, практически единственным продуктом действия которой является целлобиоза.

На рис. 11а представлены теоретические графики зависимостей начальных скоростей образования целлобиозы от концентрации субстрата в двойных обратных координатах, рассчитанные для случая, когда концентрация ферментного препарата равна 10 г/л (1,2 г/л по белку), что соответствовало целлюлазной активности по фильтровальной бумаге 0,8 ед/мл (активность Б1 = 0,7 ед/мл), т.е. вполне типичному (среднему) уровню целлюлазной активности, которая часто используется в реальных процессах ферментативного гидролиза целлюлозы. Как видно из представленных результатов расчета, графики (сплошные линии) имеют вид кривых, на которых можно выделить линейные участки. Линейная экстраполяция графиков в диапазоне концентраций целлюлозы между 10 и 20 г/л (или 1/[8] между 0,05 и 0,1 л/г) дает классический образец конкурентного типа ингибирования (пунктирные линии, пересекающиеся на оси ординат), в то время как линейная экстраполяция графиков в диапазоне [8] 40-100 г/л (1/[8] в диапазоне 0,01-0,025 л/г) дает неконкурентный тип ингибирования (соответствующие пунктирные линии пересекаются на оси абсцисс, что не видно на рисунке из-за его масштаба).

л/г 1/в. л/г

Рис.11. Теоретические зависимости начальных скоростей образования целлобиозы при ферментативном гидролизе целлюлозы от концентрации субстрата в двойных обратных координатах. Концентрация ферментного препарата 10 г/л; р-глюкозидазная активность подавлена. Концентрация добавленной в реакционную смесь целлобиозы: / - 0 г/л; 2 - 5 г/л; 3-10 г/л. а: К\ = 12 ед/л. б: К\ = 500 ед/л. Значения других параметров даны в табл.6.

Причиной искривления графиков на рис. 11а является лимитирование адсорбции фермента доступной площадью поверхности субстрата. Стрелками на рисунке показана минимальная концентрация целлюлозы (25,1 г/л), площади поверхности которой достаточно, чтобы связать весь имеющийся в реакционной смеси фермент Еь Таким образом, правые части графиков на рис.Па показывают зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата, которые отражают ограниченную возможность целлюлаз быть вовлеченными в каталитический процесс из-за недостатка площади поверхности субстрата, способной адсорбировать весь фермент, что выражается в итоге в кажущемся конкурентном типе ингибирования.

На рис. 116 приведены теоретические графики в двойных обратных координатах для случая гипотетической целлюлазы, которая гораздо хуже адсорбируется на целлюлозе, т.е. взамен реального значения К\ =12 ед/л в расчетах использовали значение 500 ед/л (все остальные кинетические параметры оставались теми же, что и в случае, представленном на рис.11 а). Соответствующие графики на рис.116 (сплошные линии) снова имели нелинейный вид, хотя кривые были ближе к линейным зависимостям, чем те, что показаны на рис. 11а. В данном случае линейная экстраполяция правых частей графиков приводила к кажущемуся смешанному типу ингибирования.

Другие примеры расчетов для Ситуации 1, приведенные в диссертации, показали, что тип наблюдаемого ингибирования целлюлазы Е[ целлобиозой зависит также от величины максимальной адсорбции фермента, его концентрации, используемого диапазона концентраций субстрата; при этом критическим параметром является отношение «фермент/субстрат» (Е/8) в реакционной смеси, т.к. при высоких значениях Е/8 имеет место лимитирование адсорбции фермента доступной площадью поверхности

целлюлозы. Расчеты показали, что только при очень низкой концентрации ферментного препарата и при этом крайне плохой адсорбционной способности целлюлазы (гипотетический случай) графики зависимостей начальных скоростей реакций от концентрации целлюлозы в координатах Лайнуивера-Берка имеют линейный вид во всем использованном диапазоне концентраций субстрата (1-100 г/л), указывая на неконкурентный тип ингибирования, который фактически и был заложен в использованную для расчетов модель ферментативного гидролиза целлюлозы.

Ситуация 2. Ингибирование добавленной в реакционную смесь целлобиозой, активность fi-глюкозидазы высока, и продуктами гидролиза являются иеллобиоза и глюкоза. Рассмотрим случай, когда Р-глюкозидазная активность целлюлазного комплекса высока (и она не подавлена добавлением ингибиторов), продуктами ферментативного гидролиза целлюлозы являются целлобиоза и глюкоза, и при этом предполагается, что исследователь не анализирует раздельно продукты. Такая ситуация наиболее часто наблюдается на практике, т.е. имеет место случай, когда анализируются общие ВС без дискриминации их состава.

Так как р-глюкозидазная активность препарата Т. viride, использованного для математического моделирования, была низка, интересно было заложить в расчеты более высокий уровень активности этого фермента. На рис.12 представлены результаты расчета начальных скоростей образования Сахаров (целлобиоза + глюкоза) в присутствии различных концентраций добавленной целлобиозы для случая, когда удельные активности Е| и Е2 составляют 70 ед/г препарата, а концентрация ферментного препарата - 10 г/л. Как видно из рис.12, вид графиков в двойных обратных координатах стал еще более сложным по сравнению с графиками, показанными на рис. 11. В случаях добавления в реакционную смесь целлобиозы графики приобрели S-образный вид. Понятно, что в зависимости от фантазии исследователя можно попытаться линеаризовать эти данные различным путем и в итоге получить разный тип ингибирования, поэтому дальнейшие комментарии излишни.

Ситуаиия 3. Ингибирование добавленной в реакционную смесь глюкозой, активность fi-глюкозидазы высока, и продуктами гидролиза являются целлобиоза и глюкоза. Данный случай похож на Ситуацию 2, только изучается ингибирование не целлобиозой, а глюкозой. A priori можно предположить, что если ферментная система состоит из двух последовательно действующих ферментов и при этом первый фермент не ингибируется продуктом действия второго фермента, то не имеет смысла изучать ингибирование Ei, действующего на исходный субстрат, этим конечным продуктом. Однако в реальности исследователи часто используют такой подход, получая в итоге кинетические параметры ингибирования, которые не имеют физического смысла, как будет показано ниже.

Линейная экстраполяция правых частей графиков на рис.13 формально дает тип ингибирования, похожий на неконкурентное. Однако, если обработать полученные данные в координатах зависимости величин

отсекаемых на оси ординат отрезков от концентрации ингибитора (координатах, используемых для нахождения константы неконкурентного ингибирования), то можно получить значение константы 93 г/л. Принимая во внимание, что в использованной математической модели фермент Е1 вообще не ингибировался глюкозой, а константа ингибирования глюкозой для фермента Е2 (Р-глнжозидазы) составляла 0,43 г/л, можно заключить, что кажущиеся константы ингибирования, которые можно рассчитать из данных, представленных на рис.13, не имеют физического смысла.

Рис.12. Графики зависимостей начальных скоростей образования общих Сахаров (целлобиоза + глюкоза) при ферментативном гидролизе целлюлозы от концентрации субстрата. Условия гидролиза и значения параметров такие же, как на рис.1 1а, за исключением того, что активность глюкозидазы составляет 70 ед/г препарата.

Рис.13. Графики зависимостей начальных скоростей образования общих Сахаров (целлобиоза + глюкоза) при ферментативном гидролизе целлюлозы от концентрации субстрата. Условия и значения параметров такие же, как на рис.12, за исключением того, что не целлобиоза, а глюкоза добавлена в реакционную смесь. Концентрация добавленной глюкозы: 7-0 г/л; 2 - 5 г/л; 3 - 80 г/л.

Таким образом, теоретический анализ различных ситуаций, которые могут иметь место при исследовании ингибирования целлюлаз продуктами реакции, показал, что даже в простейших случаях, когда целлюлазный комплекс можно рассматривать как один фермент, целлюлазу (возможен случай, когда в реальности действительно имеется лишь один фермент -ЦБГ) или как два фермента (целлюлазу и (З-глюкозидазу), наблюдаемый (кажущийся) тип ингибирования может быть различным. Графики зависимостей начальных скоростей образования продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы от концентрации субстрата в присутствии добавленных в реакционную смесь глюкозы или целлобиозы, как правило, имеют нелинейный вид в двойных обратных координатах, и в зависимости от условий ферментативной реакции и метода обработки данных можно получить различные типы ингибирования (неконкурентный, конкурентный или смешанного типа).

Использование окрашенной целлюлозы для изучения ингибиро-вания целлюлаз продуктами гидролиза. При практическом изучении ингибирования целлюлаз продуктами реакции методом, когда определяют начальные скорости образования целлобиозы и глюкозы (или ВС) из целлюлозы на фоне высокой концентрации тех же продуктов, добавленных в начальный момент времени реакции в реакционную смесь, точность экспериментов невысока. В таком случае может помочь использование окрашенной специальным красителем целлюлозы, когда за ферментативной реакцией следят спектрофотометрически по образованию хромофорных растворимых продуктов реакции.

В данном разделе предложен метод исследования ингибирования целлюлаз продуктами реакции с помощью окрашенного субстрата, а именно аморфной целлюлозы ОЦ-31 (НПО «Фермент», Вильнюс), к молекулам которой ковалентно присоединен краситель «Активный оранжевый ЖТ».

Проверку применимости данного подхода изучали, используя ферментный препарат Целлобранин ПОх (71 longibrachiatum). В процессе ферментативного гидролиза ОЦ-31 образовывались растворимые окрашенные продукты, которые регистрировали на длине волны 490 нм (А490). Анализ гидролизата методом ВЭЖХ показал, что продуктами реакции являлись глюкоза и целлобиоза. Сопоставление оптической плотности (А490) гидролизата с суммарной концентрацией Сахаров показало, что между этими параметрами существует прямо пропорциональная зависимость, а именно:

где - концентрации соответственно глюкозы и целлобиозы в

гидролизате; к - коэффициент пропорциональности. Уравнение (1) можно записать в следующем виде:

Таким образом, определив из независимых экспериментов коэффициент к по тангенсу угла наклона прямой в координатах можно по

величине оптической плотности гидролизата окрашенной целлюлозы определить по формуле (2) сумму концентраций содержащихся в нем продуктов. Это дает возможность определения скорости образования глюкозы и целлобиозы из окрашенного субстрата по скорости появления окраски в растворе (в том числе и в присутствии добавленных в начальный момент времени в реакционную смесь продуктов в качестве ингибиторов):

где - время гидролиза.

Это в свою очередь позволяет достаточно точно изучать ингибирование целлюлаз продуктами гидролиза по начальным скоростям реакции. Эксперименты показали, что при добавлении в реакционную смесь глюкозы

начальная скорость образования глюкозы из окрашенной целлюлозы, а также скорость появления окраски в растворе были меньше, чем соответствующие скорости в отсутствие добавленного продукта. Однако скорость образования целлобиозы при этом не изменялась (рис.14). Добавление целлобиозы вызывало уменьшение начальной скорости образования целлобиозы из целлюлозы и, соответственно, скорости образования окрашенных продуктов гидролиза, но не влияло на скорость образования глюкозы (рис.14). Таким образом, каждый из продуктов реакции (глюкоза и целлобиоза) ингибировал ферменты, ответственные за образование именно этого продукта.

В диссертации приводятся примеры определения констант ингибирования целлюлаз глюкозой и целлобиозой с помощью подхода, основанного на использовании окрашенной целлюлозы ОЦ-31. Для целлюлаз Т. ¡ап^ЬгасМаШт найденные константы ингибирования глюкозой и целлобиозой оказались равными соответственно 13,0 и 4,2 г/л, причем в данном случае наблюдали конкурентный тип ингибирования.

РисЛ4. Влияние добавленных продуктов на кинетику образования глюкозы (а), целлобиозы (б) и окраски гидролизата (в) при ферментативном гидролизе окрашенной целлюлозы. Концентрация субстрата 40 г/л, концентрация ферментного препарата Т. Ьп^ЬгасМаШт Юг/л, 50°С,рН4,5. • - без добавленных продуктов, о -с добавлением 10 г/л целлобиозы, Д - с добавлением 20 г/л глюкозы.

Учитывая, что наблюдаемые на практике типы ингибирования часто не отражают реального механизма действия целлюлолитических ферментов из-за особенностей гетерогенной системы «целлюлазы-целлюлоза» (см. предыдущий раздел), в практических целях сравнения ферментов из различных источников предложено ввести некий эффективный параметр ингибирования, который отражал бы их способность гидролизовать целлюлозу в присутствии главных продуктов действия данных ферментов -целлобиозы и глюкозы. В качестве такого параметра ингибирования могла бы служить концентрация продукта, при которой степень солюбилизации некого стандартного целлюлозного субстрата при стандартных условиях гидролиза (определенной концентрации субстрата и фермента, времени

реакции и т.п.) уменьшалась бы в 2 раза по сравнению с реакцией, проводимой в отсутствие продукта. Таким стандартным субстратом вполне может быть ОЦ-31, причем за ходом его гидролиза в присутствии добавленных целлобнозы или глюкозы можно будет следить по нарастанию окраски в растворе

Реакции трансгликозилирования. катализируемые ЦБ Г I из Т. 1опе1ЬгасМаШт. Одним из интересных свойств, присущих карбогидразам (и, в частности, некоторым целлюлазам) является способность катализировать реакции трансгликозилирования, т.е. реакции переноса углеводного остатка субстрата на акцептор, в роли которого может выступать другая молекула олигосахарида, в результате чего происходит удлинение углеводной цепи. Способность к трансгликозилированию была известна для эндоглюканаз и (3-глюкозидаз. Однако у целлобиогидролаз до конца 1980-х годов это свойство экспериментально не было обнаружено. Более того, до 1988 г. считалось, что все целлобиогидролазы (как частный случай экзо-глюканаз) катализируют расщепление гликозидной связи с обращением аномерной конфигурации гликона, и поэтому они не способны к трансгликозилированию. На этих двух свойствах даже были основаны особенности классификации целлюлаз.

В данном разделе показана способность ЦБГ I (из Т. longibrachiatum) осуществлять реакции трансгликозилирования. В качестве субстрата использовали хромогенное производное целлобиозы -биозид. Метилумбеллиферильные (МУФ) производные Сахаров были введены в практику исследований как субстраты целлюлаз ван Тилбургом с соавторами в 1982 г. Благодаря высокому коэффициенту экстинкции МУФ, нам удалось детектировать различные продукты реакции с высокой чувствительностью и, таким образом, обнаружить продукты трансгликозилирования при катализе ЦБГ I.

Гидролиз МУФ-р-Ц-целлобиозида под действием ЦБГ I проводили при концентрациях субстрата 0,5-10 мМ. Основными продуктами реакции являлись целлобиоза и МУФ. Помимо указанных продуктов, в ходе гидролиза в незначительном количестве (не более 3-4%) образовывался При концентрациях 0,5-2 мМ

накопления других продуктов не наблюдали. Однако, при более высоких концентрациях субстрата регистрировали образование неизвестного МУФ-производного (рис.15). Используя МУФ-З-О-целлотриозид и МУФ-^-О-целлотетраозид в качестве стандартов, это соединение было идентифицировано как МУФ-тетрасахарид.

Накопление МУФ-тетрасахарида как продукта трансгликозилирования возрастало с увеличением концентрации субстрата. В ходе ферментативной реакции концентрация МУФ-тетрасахарида достигала максимума и затем уменьшалась вследствие последующего гидролиза (рис. 16). Максимальная концентрация этого продукта наблюдалась при степени конверсии субстрата 40-50%. При указанных условиях весовое содержание МУФ-тетрасахарида составляло около 4% от общего количества МУФ-производных в системе.

Рис.15. ВЭЖХ-анализ на колонке 8На80гЪ МИ2 МУФ и МУФ-производных Сахаров, образующихся в реакционной системе, содержащей 10 мМ МУФ-Р-О-цсллобиозид и 0,08 мг/мл ЦБГ I. Время реакции 16 ч, 30°С, рН 4,5. Элюент: ацетонитрил-вода (80:20) при скорости потока* 1,5-3 мл/мин. 1 - МУФ и МУФ-Р-О-глюкозид (неразделенные), 2- МУФ-МУФ-тетрасахарид.

Рис.16. Кинетика образования МУФ и МУФ-производных Сахаров в реакционной системе, содержащей 10 мМ МУФ-р-Б-целлобиозид и 0,08 мг/мл ЦБГ I, 30°С, рН 4,5. 1 - МУФ-р-О-целлобиозид; 2 - МУФ; 3 - МУФ-0-Э-глюкозид; 4 - МУФ-тетрасахарид.

Простейшая кинетическая схема гидролиза, учитывающая протекание реакции трансгликозилирования, может быть представлена в виде:

На первой стадии ферментативной реакции происходит образование фермент-субстратного комплекса ЕС2МУФ, на второй стадии от молекулы субстрата отщепляется хромогенный остаток МУФ и образуется целлобиозилфермент Е02. На третьей стадии углеводный остаток целлобиозилфермента подвергается нуклеофильной атаке со стороны молекулы воды или с образованием,

соответственно, целлобиозы (02) или продукта трансгликозилирования -04МУ0. Акцептором углеводного остатка могут быть и другие соединения, присутствующие в системе (на схеме обобщенный акцептор обозначен как [А]). Так, например, если бы МУФ-р-Б-ГЛЮКОЗИД находился в избытке в реакционной системе, можно было бы ожидать предпочтительное образование МУФ-трисахарида как продукта трансгликозилирования.

Для проверки этого предположения был проведен гидролиз МУФ-ß-D-целлобиозида (2,5 мМ) в присутствии четырехкратного избытка МУФ-ß-D-глкжозида (10 мМ). В этом случае, как и ожидалось, наблюдали образование МУФ-трисахарида. Таким образом, этот эксперимент подтвердил способность ЦБГ1 катализировать реакции трансгликозилирования.

В последующих экспериментах трансгликозилирование, катализируемое ЦБГ I, было также обнаружено при использовании природных субстратов целлюлаз (МКЦ и целлотриозы как доноров гликозидного остатка) в присутствии (как акцептора).

Таким образом, впервые обнаруженная нами в 1989 г. способность ЦБГ I из Т. longibrachiatum (7-я семья гликозид-гидролаз) осуществлять реакции трансгликозилирования позволила по-новому взглянуть на механизм действия данного класса ферментов и на классификацию целлюлаз в целом. Следует отметить, что трансгликозилирующая активность целлобиогидролаз из 7-й семьи была впоследствии подтверждена другими исследователями на примере ЦБГ I T. reesei [Vrsanska and Biely, 1992; Harjunpaa et ah, 1999].

Глава 7. Применение целлюлаз для осахаривания целлюлозосодержащих материалов

В главе 7 рассмотрены свойства новых высокоактивных препаратов целлюлаз для осахаривания целлюлозосодержащих материалов, а также ряд других аспектов процесса ферментативного гидролиза целлюлозы: перспективные способы предобработки сырья; факторы, влияющие на эффективность гидролиза лигноцеллюлозы; новые реакторы для проведения процесса; использование иммобилизованной (целлобиазы)

для повышения выхода глюкозы.

Сравнение осахаривающей способности различных препаратов

целлюлаз. В диссертационной работе было проведено сравнительное исследование эффективности гидролитического действия ряда промышленных и лабораторных целлюлазных препаратов, продуцируемых мутантными штаммами грибов Т. reesei и P. verruculosum, на чистую целлюлозу (МКЦ) и реальные виды целлюлозосодержащего сырья, а именно два типа быстрорастущей травы (бермудская трава и просо прутьевидное, предобработанные жидким аммиаком с последующей взрывной декомпрессией), а также различные виды древесины (пихта, сосна, тополь, клен), предобработанные паровым взрывом или органозольвом.

Ферменты Т. reesei представляли собой промышленные целлюлазные препараты от отечественных и зарубежных производителей, а также лабораторные образцы, полученные в ИБФМ РАН на основе новых мутантных штаммов Т. reesei TW-1 и TW-307. Целлюлазные препараты Р. verruculosum представляли собой лабораторные образцы на основе штамма В1 (Институт биотехнологии г.Лейпцига), а также новых мутантных

штаммов В40-221-6 и В40-221-151 (ИБФМ РАН). Ферментные препараты на основе С. lucknowense продемонстрировали меньшую осахаривающую способность при гидролизе целлюлозосодержащих материалов по сравнению с целлюлазами Т. reesei и P. verruculosum, поэтому в данном случае они не принимали участия в испытаниях. В то же время наилучшим образом целлюлазы С. lucknowense проявили себя не как «гидролитики», а как «тополитические» ферменты при обработке текстильных материалов (см. главу 8).

В большинстве случаев целлюлазные препараты P. verruculosum продемонстрировали более высокую эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих материалов, чем препараты на основе Т. reesei. В качестве примера на рис. 17 представлены результаты оценки осахаривающей способности ряда ферментных препаратов при использовании различных образцов предобработанной древесины. В данном случае при сравнении препараты были уравнены по целлюлазной активности в реакционной смеси (активности по фильтровальной бумаге, которая составила 10 ед/мл).

Целловири- ТО-1 TW-307 #1 TW-307 #4 В40-221-151 Celluclast fibrilase динГ20х 1.5L HDL160

Рис.17. Выход Сахаров после 12 ч гидролиза различных образцов предобработанной древесины. Условия: 50°С, рН 5,0, перемешивание 250 об/мин. Концентрация субстрата 50 г/л, целлюлазная активность в реакционной смеси - 10 ед. АФБ на 1 г целлюлозы.

Как видно из рис.17, наиболее подвержена ферментативному гидролизу древесина пихты и тополя, обработанная органозольвом. Меньшую реакционную способность проявила древесина, обработанная паровым взрывом. Заметно более высокий выход ВС обеспечил при действии на все субстраты целлюлазный препарат В40-221-151 ^. verruculosum). Разница в

гидролитической способности между препаратом P. verruculosum и препаратами Т. reesei наиболее заметна на пихтовой древесине, обработанной паровым взрывом. Различные препараты Т. reesei обладали сходной осахаривающей способностью, однако при действии на некоторые субстраты промышленный препарат Fibrilase HDL 160 (фирмы logen, Канада) и лабораторные препараты серии TW-307 (ИБФМ РАН) были несколько более эффективными, чем остальные препараты на основе Т. reesei. Отечественный препарат Целловиридин Г20х на основе штамма Т. reesei 18.2KK («Промфермент», Россия) обеспечил примерно такой же выход ВС при действии на все образцы древесины, как препарат Celluclast 1.5L (компания Novozymes, Дания).

Основным недостатком большинства из ферментных препаратов Т. reesei являлся низкий уровень (целлобиазной) активности,

вследствие чего в гидролизатах целлюлозы, полученных под действием этих препаратов, было довольно высоким содержание целлобиозы (до 40% от общего количества Сахаров), что также отрицательно влияло на общий выход ВС (целлобиоза является ингибитором целлобиогидролаз). Все использованные препараты на основе мутантных штаммов Р. verruculosum обладали заметно более высокой активностью, чем

препараты Т. reesei. Поэтому основным продуктом действия целлюлазного комплекса P. verruculosum на целлюлозу была глюкоза (содержание целлобиозы в гидролизатах было менее 5% от общего количества Сахаров), и по выходу глюкозы преимущество препаратов P. verruculosum по сравнению с Т. reesei было еще более значительным, чем это показано на рис. 17.

Математическое моделирование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы и оценка влияния различных факторов на кинетику процесса. На эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы оказывают влияние многие взаимосвязанные между собой факторы. Поэтому для нахождения оптимального способа гидролиза целлюлозосодержащего сырья необходимо комплексное исследование этого процесса и количественная оценка роли этих факторов. Большую помощь при этом может оказать математическое моделирование процесса.

Для моделирования процесса ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы были выбраны в качестве объектов целлолигнин (отход после производства фурфурола из древесины на Мантуровском биохимическом заводе) и отечественный промышленный целлюлазный препарат Целловиридин ГЗх (Г. viride) производства Приволжского биохимического завода. Целлолигнин представлял удобный объект для моделирования, поскольку он являлся реальным видом сырья, обладающим хорошей реакционной способностью, не требуя при этом дополнительной предобработки, и состоял из целлюлозы (45-50% от сухого веса) и лигнина (около 50%). Математическая модель была основана на закономерностях ферментативного гидролиза целлюлозы, подтвержденных экспериментально, а также на литературных данных.

В рамках модели ферментативный гидролиз целлолигнина может быть представлен в виде следующей кинетической схемы:

^ч^ к\

Е, + Б Е^ -> Е, + 02

и*

Е1+Ь Е,Ь

К, кг

Е2 + вг Е2С2 —> Е2 + 2в (5)

Е2 + в <=2 Егб к

Е1 —> Е|'" к,

где Ei обозначает целлюлазу; Е2 - (З-глюкозидазу (целлобиазу); Е/" и Е2,п — инактивированные формы ферментов; S и L - целлюлозная и лигниновая фракции субстрата, соответственно; G2 - целлобиоза; G - глюкоза.

Систему дифференциальных уравнений, основанную на схеме (5) и описывающую изменение концентраций целлюлозы, целлобиозы и глюкозы во времени, решали численным интегрированием на ЭВМ, используя метод Рунге-Кутта 4-го порядка. Кинетические параметры действия Е2 были определены экспериментально. Остальные кинетические параметры определяли методом нелинейной регрессии из кинетических кривых образования целлобиозы и глюкозы при гидролизе целлолигнина, используя данные 15 экспериментов. Значения кинетических параметров приведены в табл.6.

Таблица 6. Кинетические параметры гидролиза целлолигнина под действием целлюлаз Т. \тйепри 50°С и рН 4,5.

Параметр Значение Единицы Параметр Значение Единицы

Уд. акт. Е| 70 ед/г *> 0,0118 мин'1

Уд. акт. Е2 12,4 ед/г кг 0,000342 г/(ед • мин)

12 ед/л к3 0,00171 мин"1

К2 3,58 г/л кл 0,00034 мин"1

Кз 15 ед/л я. 27,9 ед/г

КА 0,79 г/л Яг 15,1 ед/г

К< 0,43 г/л

Предложенная математическая модель удовлетворительно описывала кинетику образования глюкозы и целлобиозы из целлолигнина до степени конверсии субстрата 80-90% при варьировании его концентрации от 10 до 150 г/л и концентрации Целловиридина - от 1 до 40 г/л. В дальнейшем модель была модифицирована для описания кинетики действия композиционного препарата «Целловиридин-Пектофоетидин» (Пектофоетидин ГЗх имел сравнительно высокую целлобиазную активность, и его добавляли в реакционную смесь для более полной конверсии целлобиозы в глюкозу). В модифицированной модели дополнительно использовали кинетические параметры действия Р-глюкозидазы (Е3) из Пектофоетидина (А. /оеМия), которые были определены экспериментально (уд. акт. Е3, константа Михаэлиса Кт, а также константы ингибирования субстратом и продуктом К5 и АГ, составили соответственно 190 ед/г; 0,68; 7,2 и 0,36 г/л).

Путем теоретического моделирования различных ситуаций в реакционной системе, в том числе и таких, которые не могут быть реализованы на практике, была проведена оценка влияния различных факторов на эффективность ферментативного гидролиза целлолигнина. На рис.18 приведена серия кинетических кривых образования Сахаров (глюкоза + целлобиоза), рассчитанных в рамках предложенной математической модели в предположении, что тот или иной фактор отсутствует в реакционной системе. Сравнивая соответствующую теоретическую кинетическую кривую с кривой 1, учитывающей влияние всех факторов (а также с экспериментальными точками), можно выявить влияние конкретного фактора.

Рис.18. Влияние различных факторов на кинетику ферментативного гидролиза целлолигнина под действием композиционного препарата «Целловиридин-Пектофоетидин» (10 г/л + 5 г/л). Концентрация целлолигнина 150 г/л. Теоретические кривые: 1 - все факторы приняты во внимание; 2 - предполагалось, что лигнин отсутствует в реакционной системе; 3 - предполагалось, что отсутствует инактивация ферментов; 4 -не учитывалось ингибирование Ег и Ез глюкозой; 5 - не учитывалось ингибирование Е1 целлобиозой; 6 - предполагалось, что лигнин отсутствует, и не учитывалась инактивация ферментов, о - экспериментальные точки.

Моделирование показало, что наиболее значительное негативное влияние на эффективность гидролиза целлюлозы (рис.18) оказывает ингибирование продуктами реакции, инактивация ферментов (главным образом, псевдоинактивация Е1 как результат потери мобильности прочно адсорбированного фермента) и их неспецифическая адсорбция на лигнине.

Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторе на базе ПДИ и виброреакторах. Одним из возможных путей интенсификации процесса ферментативного гидролиза целлюлозы является использование аппаратов с интенсивным массообменом. В данном разделе проанализирована возможность использования такого типа аппаратов для ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов. Один из лабораторных реакторов с интенсивным массообменом (на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора - ПДИ) был разработан в НПО «Биомаш». Другой тип реакторов, в которых перемешивание осуществляется с помощью виброприводов специальной конструкции, был создан во ВНИИ «Химмаш».

Принцип работы реактора на базе ПДИ (РПДИ) заключается в следующем (рис.19). В рабочую зону, находящуюся между двумя плоскими электромагнитными индукторами, помещается термостатируемая ячейка, содержащая раствор фермента, целлюлозосодержащее сырье и ферромагнитные частицы (ФМЧ). При подаче питания в индукторах возникают параллельно бегущие, но противоположно направленные электромагнитные волны, которые, взаимодействуя между собой, образуют вращающееся магнитное поле. Под воздействием поля ФМЧ в рабочей ячейке приходят в хаотическое движение, образуя магнитоожиженный слой и обеспечивая очень интенсивное перемешивание реакционной смеси. Для экспериментов использовали два вида рабочих ячеек с объемом 20 мл (стеклянная) и 130 мл (из нержавеющей стали).

Виброреактор объемом 2 л (рис.20) состоял из уравновешенного вибропривода 1, который приводит в колебательное движение шток 2 с насаженными на него перфорированными полудисками 3 в реакционном сосуде 4, снабженном рубашкой для термостатирования. Виброреактор объемом 20 л имел два штока с насаженными на них перфорированными дисками, у которых колебания происходили в противофазах, что способствовало более интенсивному перемешиванию реакционной среды.

Плоские электромаг-

Рис.19. Схема реактора с интенсивным Рис.20. Схема лабораторного реактора с

массообменом на базе ПДИ. виброперемешиванием объемом 2 л.

Время, мин

Рис.21. Влияние загрузки ФМЧ на кинетику образования Сахаров при гидролизе МКЦ (100 г/л) целлюлазами Т. гееяег (2 ед/мл АФБ) в РПДИ при напряженности магнитного поля 64000 А/м; 50°С; рН 4,5. / - контроль. Загрузка ФМЧ: 2-15 г/л; 3 -150 г/л; 4 - 300 г/л; 5 - 600 г/л.

Рис.22. Влияние удельной загрузки ФМЧ на выход Сахаров через 1 ч гидролиза МКЦ (100 г/л) целлюлазами Т. гвавг (2 ед/мл АФБ) в РПДИ при 50°С, рН 4,5 и различной напряженности магнитного поля: 1 - 26000 А/м; 2 - 38000 А/м; 3 -64000 А/м.

Аппарат на базе ПДИ обеспечивал очень значительное ускорение (до 8 раз) ферментативного гидролиза целлюлозы по сравнению с контролем (в качестве которого использовали термостатируемые ячейки объемом 50 мл с перемешиванием на качалке - 250 об/мин). К основным параметрам, влияющим на эффективность гидролиза и обусловленным конструкцией РПДИ, относятся форма, размеры и масса загружаемых ФМЧ, а также напряженность магнитного поля. Наибольший эффект ускорения процесса наблюдали при использовании цилиндрических ФМЧ размером 0,25 х 4 мм. Влияние удельной загрузки ФМЧ на кинетику образования продуктов (целлобиоза + глюкоза) из МКЦ при максимально возможной напряженности магнитного поля показано на рис.21, а влияние загрузки частиц при различных значениях напряженности магнитного поля на выход Сахаров через 60 мин гидролиза показано на рис.22. Как видно из последнего рисунка, увеличение напряженности магнитного поля приводит к повышению эффективности процесса. Для каждого значения напряженности поля существовал определенный оптимум по массе загружаемых частиц.

Увеличение эффективности гидролиза в РПДИ под действием целлюлаз (из Т. гвв$в1 и Р. увггиеи1о$ит) наблюдали не только в случае чистой целлюлозы (МКЦ), но и при использовании целлюлозосодержащих материалов, которые реально могут служить в качестве исходного сырья для ферментативной конверсии - целлолигнина и скопа (коротковолокнистых отходов целлюлозно-бумажного производства), хотя эффекты ускорения были выражены в меньшей степени, чем в случае МКЦ. Для скопа и целлолигнина начальные скорости образования продуктов в аппарате на базе ПДИ увеличивались соответственно в 2,9 и 2,6 раза по сравнению с

контролем, а выходы Сахаров через 60 мин гидролиза возрастали в 2,5 и 2,0 раза. Наибольший эффект ускорения реакции, наблюдаемый при использовании в качестве субстрата МКЦ, можно объяснить тем, что в данном случае значительный вклад в процесс интенсификации гидролиза вносило увеличение реакционной способности целлюлозы (до 2,5 раз) вследствие непрерывного механического воздействия ФМЧ на субстрат в ходе реакции, вызывающего измельчение и разрушение кристаллической структуры целлюлозы. В случае скопа и целлолигнина, исходно обладающих более аморфной структурой и более высокой реакционной способностью, влияние механической обработки сказывалось в меньшей степени.

Среди других причин ускорения ферментативного гидролиза целлюлозы в РДПИ следует отметить сильную интенсификацию массообменных процессов в реакторе. В обычных реакторах с перемешиванием увеличение скорости перемешивания приводит главным образом к ускорению массообменных процессов во внешнем по отношению к частицам нерастворимого субстрата растворе, практически не затрагивая процессов в его порах. В РПДИ же за счет частого соударения частиц нерастворимого субстрата с ФМЧ (а также сжатия и истирания субстрата) происходит интенсификация процессов массопереноса не только во внешнем растворе, но и в порах и капиллярах целлюлозы (в частности, может происходить ускорение переноса прочно адсорбированных целлюлаз к новым участкам поверхности целлюлозы, т.е. ускорение поверхностной диффузии). Другим фактором, способствующим увеличению эффективности процесса в РПДИ, может являться ускорение переноса целлобиозы, которая является сильным ингибитором целлобиогидролаз, из пор целлюлозы в окружающий раствор.

Виброреакторы обеспечивали увеличение выхода Сахаров при ферментативном гидролизе целлюлозосодержащих материалов до 1,2-1,4 раз по сравнению с контролем (гидролизом в ячейках на качалке).

О 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50

Время, ч Время, ч

Рис.23. Гидролиз целлолигнина (100 г/л) в Рис.24. Гидролиз скопа (70-130 г/л)

виброреакторах объемом 2 и 20 л под целлюлазным препаратом Р. уеггиЫотт

действием композиционного препарата (2 ед/мл АФБ) в 2-л виброреакторе при рН

«Целловиридин ГЗх - Пекгофоетидин ГЗх» 4,5 и 50°С. 1 - целлобиоза; 2 - глюкоза.

(30 г/л + 15 г/л), 50°С, рН 4,5.1,3- 2 л; 2,4 - Стрелками показано внесение свежих

20 л. 1,2 - целлобиоза; 3,4 - глюкоза. порций субстрата в реакционную смесь.

На рис.23 показана кинетика образования Сахаров при ферментативном гидролизе целлолигнина в виброреакторах (2 и 20 л) под действием препарата «Целловиридин ГЗх - Пектофоетидин ГЗх». Как видно из рисунка, при масштабировании аппарата с виброперемешиванием от 2 до 20 л скорость процесса не только не уменьшалась, но даже несколько возрастала, что свидетельствует о том, что в виброреакторе большего объема интенсивность перемешивания и массообменные процессы протекали более интенсивно. Через 2 сут гидролиза в виброреакторах было получено 42 и 47 г/л Сахаров, соответственно, с выходом 85 и 94% от теоретического, при этом практически единственным продуктом реакции была глюкоза.

В случае целлюлозосодержащих материалов, имеющих низкую плотность и суспензия которых представляет весьма вязкую среду, гидролиз целесообразно проводить с подпиткой субстратом. На рис.24 представлены данные по осахариванию скопа целлюлазами Р. геггисиЫит (В1) в виброреакторе (2 л), где концентрация субстрата в начале гидролиза составляла 70 г/л (по сухому весу) и далее дважды в течение процесса в реакционную смесь вносили свежие порции сырья с тем, чтобы общая концентрация нерастворимых веществ составила 130 г/л. Через 2 сут гидролиза скопа общая концентрация Сахаров достигла 80 г/л.

В заключение данного раздела стоит сравнить некоторые основные параметры процесса в разных реакторах. На рис. 25а приведены концентрации Сахаров, которые достигались за 1 ч гидролиза МКЦ (100 г/л) в ячейках с перемешиванием на качалке, виброреакторе и РПДИ при одинаковых условиях проведения процесса под действием целлюлаз Т. viride. Как видно из рисунка, выход Сахаров в РПДИ превышал таковой в виброреакторе и ячейке с перемешиванием в 3,1 и 4,4 раза. Если сравнивать реакторы по продуктивности в условиях, когда достигалась одинаковая концентрация Сахаров (например, 30 г/л), т.е. при различном времени реакции, то разница будет еще более значительной (рис.256). В данном случае по продуктивности РПДИ выигрывал в 9 и 14 раз, соответственно.

Ячейки Виброреактор РПДИ Ячейки Виброреактор РПДИ

Рис.25. Сравнение результатов гидролиза МКЦ (100 г/л) целлюлазами Т. ига/е в различных реакторах (50°С, рН 4,5, 2 ед/мл АФБ). а - выход Сахаров (глюкоза + целло-биоза) за 1 ч гидролиза; б- продуктивность по достижении концентрации Сахаров 30 г/л.

Применение иммобилизованной Р-глюкозидазы для обработки гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы. Как было показано выше, гидролизаты целлюлозы, полученные под действием ферментных препаратов Т. гвв$в1 (Т. уМв), как правило, содержат значительное количество целлобиозы. Поэтому для полной конверсии целлобиозы в целевой продукт - глюкозу - необходимо дополнительно добавлять в реакционную смесь (целлобиазу) либо

обрабатывать гидролизат Р-глюкозидазой после осуществления процесса осахаривания целлюлозы. В последнем случае перспективным является применение иммобилизованного фермента. Для этой цели нами были получены препараты иммобилизованной на пористых

кремнеземах (аминированном силохроме и макропористых аэросилогелях).

Для иммобилизации на силохроме использовали препарат Пектиназа-500 из гриба А. /овййш (НПО «Биотехника»), имеющий высокую удельную целлобиазную активность (1980 ед/г). Удельная активность иммобилизованного препарата составила 66 ед/г сухого препарата (рН 4,5; 40°С). При использовании препарата в реакторе колонного типа продуктивность процесса гидролиза целлобиозы (при ее концентрации 8-63 г/л) достигала 3070 г/л реактора в час (20-50 г/л в час в случае реальных гидролизатов целлюлозы, т.е. при 1,5-2-кратном избытке глюкозы в растворе).

Для описания кинетики гидролиза целлобиозы в проточном реакторе вытеснения под действием иммобилизованной Р-глюкозидазы А. /овНйш была разработана математическая модель, учитывающая ингибирование субстратом и продуктом, а также возможность протекания побочных реакций трансгликозилирования. Модель хорошо описывала кинетику потребления субстрата, образования основного продукта реакции (глюкозы), а также кинетику образования и расхода продуктов трансгликозилирования до практически полной конверсии субстрата в диапазоне его концентраций от I до 70 г/л при температурах 30-55°С. В качестве примера на рис.26 показаны теоретические и экспериментальные зависимости степени конверсии целлобиозы на выходе из реактора от скорости протока для различных исходных концентраций субстрата.

Рис.26. Влияние скорости протока на степень конверсии целлобиозы в колонке с иммобилизованной р-глюкозидазой, 40"С. рН 4,5. Кривые - теоретические, точки - экспериментальные данные. Исходная концентрация субстрата: /' - 25 мМ; 2 -49 мМ; 3-97 мМ; 4 - 185 мМ.

О 20 40 60 80

V, мл/ч

Для иммобилизации на макропористых аэросилогелях (имеющих сферическую форму, диаметр частиц от 0,3 до 4 мм) использовали очищенную р-глюкозидазу А. ]аротст (НПО «Биотехника») с удельной активностью 160 ед/мг белка. Было получено 6 фракций иммобилизованного препарата (с размером частиц 0,3-0,5; 0,5-1,0; 1,0-1,2; 1,2-2; 2,0-3,0; 3,0-4,0 мм и удельной активностью от 105 до 390 ед/г носителя). В случае трех наиболее активных фракций (0,3-0,5; 0,5-1 и 1-1,2 мм) глубокая степень конверсии 50 мМ целлобиозы (>90%) в проточном реакторе вытеснения достигалась при времени удерживания 2-7 мин. При концентрации целлобиозы 10-20 г/л продуктивность реактора непрерывного действия с иммобилизованной (3-глюкозидазой составляла 250-300 г/(л-ч), или 6-7 кг на 1 л реактора в сутки, что является очень высокой величиной.

Испытания операционной стабильности препаратов иммобилизованной Р-глюкозидазы показали, что при непрерывной обработке гидролизатов целлюлозы в реакторе колонного типа при 40°С в течение двух недель иммобилизованный фермент сохраняет не менее 95% активности.

Глава 8. Применение «тополитических» ферментов для обработки текстильных материалов

Глава 8 посвящена научным аспектам использования целлюлаз в процессах обработки текстильных материалов - депигментации («биостонинга») джинсовых изделий и биоотварки («биоскоринга») суровой хлопчатобумажной ткани с целью увеличения ее смачиваемости.

Сравнение осахаривающей и тополитической активности целлюлаз. На примере 29 различных препаратов целлюлаз было проведено сопоставление их осахаривающей активности (по выходу ВС при гидролизе МКЦ) со способностью удалять индиго из джинсовой ткани (т.н. «абразивность», характеризующая тополитическую активность ферментов). Результаты сравнения показали, что не существует корреляции между целлюлазной активностью препаратов (по КМЦ, авицелу или АФБ) и их депигментирующей способностью при действии на ткань. Была выявлена группа препаратов, которые, обладая высокой осахаривающей активностью, были не способны осуществлять эффективную депигментацию ткани. К этой группе относилось большинство мультиферментных препаратов на основе гриба Т. reesei (хороших «гидролитиков»). Напротив, некоторые препараты с высокой тополитической активностью не обладали способностью к глубокому гидролизу целлюлозы. К ним, например, относились специально оптимизированные для обработки джинсовых изделий препараты серий (фирмы Оепепсог, США) и Бештах (Novozymes, Дания). В данную группу также попали 3 препарата на основе различных штаммов С. 1ыскпоц>ете, один из которых ^СЕ Е-600) был получен на основе штамма С. lucknowense ЦУ 18-25.

Рис.27. Депигментирующая активность очгаценных целлюлаз из С. 1ыскпон>ете при рН 5,0, 50°С. Цифры сверху показывают концентрацию белка в реакционной смеси (мг/мл).

Рис.28. Удельная депигментирующая активность очищенных эндоглюканаз и целло-биогидролаз (на 1 мг белка) при рН 5,0; 50°С. С.1. - С. lucknowense; Т.г. - Т. reesei; P.v. - P. verruculosum.

Также не было обнаружено корреляции между депигментирующей способностью очищенных целлюлаз и их КМЦазной активностью (на примере ферментов из Т. reesei и С. lucknowense). На рис.27 представлены результаты действия целлюлаз С. lucknowense на джинсовую ткань при рН 5,0 и 50°С. При сравнении эндоглюканазы уравнивали по КМЦазной активности в реакционной смеси (2 ед/мл); в случае целлобиогидролаз использовали концентрацию белка 0,15 мг/мл (т.е. такую же концентрацию белка, как для ЭГ V - фермента с наиболее выраженной тополитической активностью). Следует отметить, что ЭГ V демонстрировала практически одинаковую «абразивность» как при рН 5,0, так и при рН 7,0.

На рис.28 представлены данные, характеризующие тополитическую активность эндоглюканаз и целлобиогидролаз С. lucknowense и Т. reesei в расчете на 1 мг белка, при этом учитывались данные серий экспериментов, где реальная концентрация ферментов была примерно одинаковой (0,15-0,20 мг/мл по белку). Здесь же представлены данные для очищенной ЭГ III из Р. verruculosum. Эта ЭГ обладала наиболее высокой «абразивностью» при обработке джинсовой ткани из всех изученных ферментов. В группу очень эффективных ферментов (с удельной «абразивностью» свыше 50 ед/мг белка) также попали ЭГ III и ЭГ II Т. reesei, а также ЭГ II и ЭГ V С. lucknowense. Целлобиогидролазы, как правило, обладали более низкой способностью удалять индиго, чем эндоглюканазы.

Адсорбционная способность Ферментов как основной Фактор, влияющий на ресорбцию индиго в процессе биодепигментации джинсовой ткани. Одной из проблем, возникающих при ферментной обработке джинсовых изделий, является ресорбция индиго на белых нитях

ткани, что портит внешний вид изделий для потребителя. Степень ресорбции красителя различна в присутствии различных ферментных препаратов. В литературе высказывалось предположение, что главным фактором, способствующим ресорбции индиго, является связывание целлюлаз с поверхностью джинсовой ткани, однако убедительных доказательств этого не было приведено.

Для выявления возможной взаимосвязи между адсорбцией целлюлаз и ресорбцией красителя определяли степень связывания белка из 10 различных ферментных препаратов с МКЦ и индекс сорбции индиго (ИСИ) на белой хлопковой ткани в присутствии тех же препаратов (ИСИ служил в качестве параметра, моделирующего реальный процесс ресорбции красителя в процессе «биостонинга»). На рис.29а приведены результаты этого исследования, которые свидетельствуют о том, что существует прямая взаимосвязь между указанными параметрами (коэффициент корреляции К составил 0,82). В следующей серии экспериментов была обнаружена подобная же корреляция (К = 0,86) на примере очищенных ферментов из Р. vвrruculosum и Т. rввsвi(рис.296).

Рис.29. Взаимосвязь между адсорбционной способностью целлюлаз на целлюлозе и индексом сорбции индиго (ИСИ) на белой хлопковой, ткани в присутствии этих ферментов, 50°С, рН 5,0. а - данные для неочищенных мультиферментных препаратов; б -данные для очищенных ферментов P. verruculosum и Т. reesei.

Таким образом, было установлено, что основным фактором, определяющим степень ресорбции индиго при ферментной обработке джинсовых изделий, является адсорбционная способность целлюлаз. При этом механизм ресорбции заключается в том, что на белых (неокрашенных) целлюлозных волокнах джинсовой ткани происходит связывание ферментов (в основном целлюлаз, в молекулах которых имеется ЦСМ), и далее с адсорбированным белком связываются молекулы, либо коллоидные частицы индиго, что вызывает нежелательную окраску этих волокон. Такой механизм подразумевает, что на поверхности белковых молекул должны существовать участки взаимодействия с индиго. Такие участки (кластеры гидрофобных аминокислот) действительно были нами обнаружены.

Особенности молекулярного строения целлюлаз, определяющие эффективность их действия в процессе «биостонинга». Химическая структура индиго и его свойства (гидрофобность) позволяют предположить, что краситель может взаимодействовать с другими веществами за счет двух типов взаимодействий. С одной стороны, индиго содержит ароматические кольца, которые могут быть вовлечены в гидрофобные взаимодействия. С другой стороны, группы NH и =О в гетероцикле могут образовывать водородные связи с другими молекулами.

Для того, чтобы выяснить возможную роль неполярных боковых цепей аминокислот в связывании индиго, изучали взаимодействие красителя (его коллоидного раствора) с аминокислотами, иммобилизованными на 4% поперечно-сшитой агарозе (табл.7). Иммобилизованный Gly был использован в качестве простейшей аминокислоты, содержащей атом водорода в качестве боковой группы. Иммобилизованные Trp, Leu, Phe и Туг представляли аминокислоты с относительно большими неполярными боковыми цепями, различающимися по степени гидрофобности.

Таблица 7. Взаимодействие индиго с аминокислотами, иммобилизованными на 4% поперечно-сшитой агарозе.

Аминокислота / носитель Содержание Связанный Индекс гидрофобности

лиганда, краситель, по Миллеру*

мкмоль/мл мкг (AG, ккал/моль)

Агароза, активированная - 137 + 2 -

CNBr (контроль 1)**

КМ-декстран (контроль 2) 70 35 ±1 -

Gly / CNBr-акт. агароза 10 77 ±3 -0,06

Тгр / CNBr- акт. агароза 3 84 ± 1 -0,45

Leu / CNBr- акт. агароза 10 94 ±7 -0,65

Phe / CNBr- акт. агароза 6 120 + 8 -0,67

Туг / Эпокси-акт. агароза 20 154 ±16 0,22

*Эмпирический индекс гидрофобности боковых цепей аминокислот [S.Miller et ah, J. Mol. Biol., 1987]. Более гидрофобная аминокислота дает более отрицательное значение. **Гель был обработан 1 М моноэтаноламином при рН 9 в течение 2 ч, для того, чтобы блокировать активные группы носителя, и затем промыт 4 раза водой.

Данные, представленные в табл.7, показывают, что поперечно-сшитая агароза (контроль 1) сама по себе связывала (включала в гель) индиго. Напротив, когда карбоксильные группы присутствовали в полисахаридной матрице (контроль 2), количество связанного красителя было минимальным, указывая на то, что отрицательно заряженные карбоксильные группы негативно влияют на связывание индиго. В случае иммобилизованных аминокислот количество индиго, включенного в гель, возрастало с увеличением гидрофобности боковых цепей аминокислот в ряду: Gly < Trp <

Leu < Phe. Другими словами, чем более отрицательным был эмпирический индекс гидрофобности аминокислот, тем больше красителя связывалось с гелем. Наиболее высокий уровень связанного индиго наблюдали в случае тирозина. По-видимому, водородные связи между гидроксильными группами тирозина и =0 группой индиго совместно с возможными гидрофобными взаимодействиями между ароматическими кольцами данных соединений обеспечивали наиболее благоприятное воздействие на связывание красителя.

Таким образом, эксперименты с иммобилизованными аминокислотами показали, что молекулы индиго могут взаимодействовать с боковыми цепями ароматических и неполярных аминокислот, и эффект связывания усиливается в присутствии групп, способных к образованию водородных связей.

В последующих экспериментах непосредственное взаимодействие красителя с белками было доказано путем изучения адсорбции ферментов на нерастворимых частицах индиго. При этом оказалось, что во всех случаях (как мультиферментных препаратов, так и очищенных целлюлаз) большее количество белка адсорбировалось на частицах индиго (57-111 мкг/г носителя), чем на МКЦ (от практически 0 до 62 мкг/г носителя).

Для выявления участков связывания индиго с помощью компьютерной программы Swiss-PdbViewer анализировали молекулы различных целлюлаз, визуально выявляя на поверхности белковых глобул ароматические и неполярные аминокислотные остатки, боковые цепи которых экспонированы в раствор. Для анализа были взяты те ферменты, для которых имелись данные по их депигментирующей способности, а также были известны трехмерные структуры их молекул (кристаллические или модельные), а именно: ЦБГ I и II, ЭГ I и III Т. reesei; ЦБГ 1а и На, ЭГ III и V С. lucknowense; ЭГ III P. verruculosum и ЭГ V Я insolens. В результате была обнаружена прямая взаимосвязь между количеством (процентным содержанием) ароматических (Туг, Phe, Trp) и других неполярных аминокислот (Val, Leu, lie, Pro, Met) на поверхности молекул целлюлаз и их способностью удалять индиго из джинсовой ткани.

Рис.30. Модели трехмерной структуры ЭГ III P. verruculosum (слева) и ЭГ V С lucknowense (справа).

Анализ трехмерных структур ферментов также показал, что важным является не только общее количество экспонированных в раствор гидрофобных остатков, но и их взаимное расположение (распределение по поверхности белковой глобулы). Так, на поверхности молекул всех целлюлаз, демонстрирующих высокую «абразивность», можно выделить кластеры ароматических и неполярных аминокислот, которые, по-видимому, и участвуют в связывании индиго. В качестве примеров на рис.30 показаны структуры ЭГ III P. verruculosum (где поверхностные ароматические и неполярные аминокислоты показаны белым цветом, а все остальные остатки - серым цветом) и ЭГ V С. lucknowense (где боковые остатки ароматических аминокислот, экспонированные в раствор, помечены).

Обнаруженные на поверхности целлюлаз участки связывания индиго способствуют эффективной депигментации джинсовой ткани по двум основным механизмам (не считая собственно каталитического воздействия ферментов на целлюлозу). Во-первых, они способствуют концентрированию фермента именно на окрашенных индиго волокнах ткани (а не на белых, неокрашенных волокнах), и, во-вторых, они помогают последующему удалению красителя в раствор по типу действия ПАВ.

Эффективные ферментные препараты на основе ЭГ III Р. verruculosum и ЭГ V С. lucknowense для депигментации джинсовых изделий. На основе целлюлаз, обладающих наиболее высокой эффективностью при действии на джинсовую ткань, были созданы грибные мутантные штаммы с повышенной секрецией целевых ферментов.

Ген ЭГ III P. verruculosum был клонирован в Penicillium canescens под контролем эффективного промотора данного гриба

(ybgaS). Эксперименты, связанные с клонированием гена ЭГ, осуществлялись группой исследователей ФГУП «ГНИЙ Генетика». В качестве исходного штамма служил дикий штамм РСА 10, на основе которого ранее в «ГНИЙ Генетика» был получен штамм-суперпродуцент ß-галактозидазы РСА 26. На основе новых штаммов P. canescens, несущих ген ЭГ III Р. verruculosum (R201, R201-151, R201-151-UV5-105, R3020), были получены ферментные препараты, у которых удельная активность по КМЦ возросла на 1-2 десятичных порядка - с 0,5 ед/мг белка (для РСА 10) до 7-49 ед/мг.

Об успешном клонировании гена ЭГ III и эффективной экспрессии фермента также свидетельствуют данные электрофореза (рис.31), где на электрофореграммах препаратов на основе мутантных штаммов P. canescens появилась интенсивная полоса в районе 25 кДа, соответствующая ЭГ III.

В результате испытаний при рН 4,0-5,0 и 40-50°С все препараты серии R201, а также R3020 продемонстрировали высокую эффективность депигментации джинсовой ткани при низком уровне ресорбции красителя, сравнимую с эффективностью действия коммерческого препарата IndiAge Super GX (фирма Genencor International, США), производимого на основе ЭГ III Т. reesei.

Для увеличения уровня экспрессии ЭГ V С. lucknowense ген фермента был мультикопирован под контролем либо собственного промотора (pEg5), либо эффективного промотора ЦБГ la (pCbhl), в результате чего были получены новые штаммы С. lucknowense UV18-25-pEg5Cl::Eg5Cl, UV18-25-Pyr5::pCBHlCl::Eg5Cl и UV18-25-Pyr5::pCBHlCl::Eg5Cl#27. Данная работа была проведена фирмой TNO Nutrition and Food Research (Нидерланды). На основе указанных штаммов были получены ферментные препараты, в которых в 3-4 раза возросло содержание ЭГ V по сравнению с препаратами на основе исходного штамма UV 18-25.

Ферментные препараты на основе штаммов с мультикопированным геном гомологичной ЭГ V продемонстрировали более высокую «абразивность», чем препарат на основе исходного штамма С. lucknowense UV 18-25 (на 23-28% при 30-50°С). Все эти препараты также характеризовались умеренным (средним) уровнем ресорбции индиго на ткани. Препараты, обогащенные ЭГ V, были наиболее активны в области рН 5-7, т.е. они могут быть использованы при нейтральных значениях рН среды.

Биоотварка («биоскоринг») суровой хлопчатобумажной ткани с использованием препаратов целлюлаз. Одной из стадий классической технологии подготовки хлопчатобумажных тканей является отварка («скоринг»). Она проводится для приданиял ткани смачиваемости (капиллярности) путем удаления ряда природных низкомолекулярных и высокомолекулярных соединений, находящихся в кутикуле - тонком внешнем слое хлопкового волокна. Классическую (щелочную) отварку проводят при температуре около 100°С и концентрации щелочи около 4% в присутствии ПАВ, которые облегчают удаление этих соединений. В последнее время во многих лабораториях мира ведутся интенсивные разработки, направленные на применение ферментов для осуществления биоотварки («биоскоринга») хлопкового волокна с тем, чтобы проводить процесс в мягких условиях, снижая таким образом вредные выбросы щелочи в окружающую среду и уменьшая износ оборудования.

Нами было проведено сравнение эффективности действия широкого ряда российских и зарубежных ферментных препаратов в процессе биоотварки суровой хлопчатобумажной ткани (бязи российского производства, арт. 216, поверхностная плотность 125 г/м2, предварительно

расшлихтованной а-амилазой) на примере 25 образцов ферментов, продуцируемых грибами родов Trichoderma, Chrysosporium, Aspergillus, Humicola, Penicillium. Критерием эффективности биоотварки служило увеличение смачиваемости (капиллярности) ткани, определяемой по высоте подъема жидкости по полоске материала за 30 мин.

Рис.32. Результаты биоотварки суровой хлопчатобумажной бязи под действием различных ферментных препаратов. Условия: концентрация белка в реакционной смеси 0,6 г/л, время обработки 1 ч, 50°С, рН 5,0. После биообработки образцы ткани высушивали при 105°С.

Результаты тестирования показали, что наиболее эффективно осуществляют «биоскоринг» ферментные препараты на основе грибов рода Trichoderma (рис.32, 8 препаратов справа), причем не всякие, а только такие, которые имеют одновременно высокую удельную целлюлазную (КМЦазную) и пектиназную активности. Дальнейшие испытания, проведенные на фракциях очищенных ферментов, полученных после хроматографического разделения различных препаратов Т. reesei, показали, что наибольший эффект увеличения смачиваемости ткани обеспечивают фракции, содержащие ЭГ II, ЦБГ II и пектиназу (полигалактуроназу). По-видимому, синергистическое действие указанных ферментов вносит основной вклад в увеличение смачиваемости суровой хлопчатобумажной ткани после ее биообработки ферментными препаратами на основе Trichoderma.

Проведена оптимизация процесса биоотварки ткани под действием отечественных ферментных препаратов Целловиридин Г2х и Г20х. В результате при использовании дозы препаратов 0,3 г/л (по белку) в присутствии 1 г/л неионогенного ПАВ через 1 ч биообработки при рН 5,0 и 50°С были достигнуты показатели капиллярности ткани около 10 см (за 30 мин подъема жидкости по полоске материала), причем достигнутый эффект сохранялся и после высокотемпературной сушки обработанной ферментом ткани. Такие показатели капиллярности сравнимы с теми, которые достигаются при классической щелочной отварке.

выводы

1. Впервые охарактеризован внеклеточный целлюлазный комплекс, секретируемый грибами рода Chrysosporium, а именно - грибом Chrysosporium lucknowense, который является важным промышленным продуцентом целлюлаз и гемицеллюлаз. В состав комплекса входят, как минимум, девять целлюлаз, кодируемых различными генами: четыре целлобиогидролазы (ЦБГ la, Ib, На, lib) и пять эндо-1,4-Р-глюканаз (ЭГ I, II, III, V и VI). Все ферменты выделены в гомогенном виде, подробно изучены их свойства. На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей указанные ферменты классифицированы по их принадлежности к различным семьям гликозид-гидролаз, а именно ЦБГ la, Ib, На, ПЬ классифицированы как Се17А, Се17В, Се16А, Се16В, а ЭГ I, II, III, V, VI - как Се17С, Се15А, Се112А, Се145А, Се16С. Показано, что ЦБГ 1а и ЭГ II существуют в виде различных форм. Высокомолекулярные формы ЦБГ 1а и ЭГ II, а также ЦБГ ПЬ представляют собой типичные (полноразмерные) целлюлазы, которые состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером. У низкомолекулярных форм ЦБГ 1а и ЭГ II, образующихся в результате ограниченного протеолиза полноразмерных ферментов, а также у всех остальных целлюлаз С. lucknowense ЦСМ отсутствует.

2. В составе ферментных комплексов, секретируемых грибами С. lucknowense и Trichoderma reesei, впервые обнаружены специфичные ксилоглюканазы (гомологичные между собой ферменты, принадлежащие к 74-й семье гликозид-гидролаз), которые представляют новый класс карбогидраз. Характерными особенностями ксилоглюканаз С. lucknowense и Т. reesei являются высокая удельная активность по отношению к ксилоглюкану, которая более чем в 10 раз превышает целлюлазную и ß-глюканазную активности, а также необычный экзо-тип действия на полимерный субстрат, в результате которого от концов молекулы ксилоглюкана последовательно отщепляются олигосахаридные блоки, содержащие 4 глюкозидных остатка в основной цепи.

3. Проведен детальный анализ ингибирования целлюлаз продуктами ферментативного гидролиза целлюлозы - целлобиозой и глюкозой. С помощью математического моделирования на ЭВМ показано, что из-за особенностей гетерогенной системы «целлюлоза-целлюлазы» на практике могут наблюдаться различные типы ингибирования: неконкурентный, конкурентный или смешанный. Установлено, что тип наблюдаемого ингибирования зависит от константы адсорбции и величины максимальной адсорбции фермента, его концентрации, используемого диапазона концентраций субстрата, а также ß-глюкозидазной активности; при этом критическим параметром является отношение

«фермент/субстрат» (E/S) в реакционной смеси, т.к. при высоких значениях E/S имеет место лимитирование адсорбции фермента доступной площадью поверхности целлюлозы. Предложен подход для изучения ингибирования целлюлаз продуктами реакции, основанный на использовании окрашенной целлюлозы.

4. Впервые показано, что целлобиогидролазы способны катализировать реакции трансгликозилирования. При использовании 4-метилумбелли-

целлотриозы или микрокристаллической целлюлозы в качестве субстратов (доноров) и 4-метилумбеллиферильных производных целлобиозы и глюкозы в качестве акцепторов обнаружена способность ЦБГ I из Т. longibrachiatum (7-я семья гликозид-гидролаз) к переносу гликозидного остатка на указанные акцепторы с образованием продуктов трансгликозилирования.

5. Проведено сравнение осахаривающей способности ряда коммерческих и лабораторных целлюлазных препаратов при ферментативном гидролизе различных видов целлюлозосодержащего сырья. Показано, что отечественные промышленные препараты серии "Целловиридин" (штамм Т. reesei 18.2KK), лабораторные препараты на основе нового мутантного штамма Т. reesei TW-307 (ИБФМ РАН) и, в особенности, лабораторные препараты на основе новых штаммов Penicillium verruculosum B40-221-6 и В40-221-151 (ИБФМ РАН) не уступают или превосходят по эффективности гидролиза аналогичные препараты от зарубежных производителей ферментов. В большинстве случаев целлюлазные препараты P. verruculosum продемонстрировали максимальную эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих материалов.

6. Предложены подходы для интенсификации процесса ферментативного гидролиза целлюлозы, основанные на использовании (а) реактора с интенсивным перемешиванием на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора (ПДИ), где перемешивание осуществляется за счет хаотического движения ферромагнитных частиц во вращающемся магнитном поле, и (б) реакторов с виброперемешиванием. Показана возможность ускорения процесса гидролиза в 1,5-8 раз в указанных реакторах. В реакторе на базе ПДИ за 1 ч ферментативного гидролиза целлюлозы достигнута концентрация Сахаров (глюкоза + целлобиоза) 3050 г/л при дозах целлюлазной активности 10-20 ед. по фильтровальной бумаге на 1 г субстрата, т.е. продуктивность реактора составила 30-50 г/(л-ч). Подобная продуктивность ферментативного гидролиза целлюлозы является наиболее высокой из описанных в литературе.

7. Получены высокоактивные препараты иммобилизованной на макропористых кремнеземах [3-глюкозидазы (целлобиазы) из Aspergillus

foetidus и A. japonicus, которые могут быть использованы для обработки ферментативных гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы. При использовании препаратов в реакторе колонного типа

при 40°С в течение двух недель иммобилизованный фермент сохранял не менее 95% активности, при этом продуктивность реактора достигала 250300 г/(л-ч).

8. Проведены лабораторные испытания широкого круга целлюлазных препаратов в процессах биообработки текстильных материалов -депигментации («биостонинга») джинсовой ткани и биоотварки («биоскоринга») суровой хлопчатобумажной бязи с целью увеличения ее смачиваемости. Выявлены «тополитические» целлюлазные препараты и индивидуальные целлюлолитические ферменты, способные наиболее мягко и эффективно воздействовать на поверхность целлюлозных волокон без их существенной деструкции. Разработаны научные основы действия «тополитических» целлюлаз в процессах ферментативной обработки текстиля. Продемонстрирована высокая эффективность действия на джинсовую ткань ферментных препаратов на основе новых штаммов P. canescens, несущих ген рекомбинантной ЭГ III (Се112А) Р. verruculosum, и штаммов С. lucknowense, содержащих мульти-копированный ген гомологичной ЭГ V (Се145А).

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

Отдельные издания:

1. Синицын А.П., Клесов А.А., Рабинович M.JL, Гусаков А.В., Морозов A.M. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы, Итоги науки и техники, Серия "Биотехнология", т. 12, Москва, Изд-во ВИНИТИ, 1988,154 с.

2. Синицын А.П., Черноглазое В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов, Итоги науки и техники, Серия "Биотехнология", т.25, Москва, Изд-во ВИНИТИ, 1990 (1-е изд.), 1993 (2-е изд.), 152 с.

3. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцел-люлозных материалов: Учеб. пособие, Москва, Изд-во МГУ, 1995,224 с.

Статьи и патенты:

1. Гусаков А.В., Синицын А.П., Клесов А.А., Голдштейнс Г.Х Реакции гидролиза и трансгликозилирования, катализируемые целлобиазой. Кинетика и математическая модель процесса. Биохимия, 1984, т.49, №7, с.1110-1120.

2. Гусаков А.В., Наджеми Б., Синицын А.П., Клесов А.А. Сравнение эффективности ферментативного гидролиза целлюлозы в лабораторных установках различного типа. Прикл. биохим. микробиол., 1984, т.20, №1, с.55-63.

3. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Goldsteins, G.H., Klyosov, A.A. Kinetics and mathematical model of hydrolysis and transglycosylation catalyzed by cellobiase. Enzyme Microb. Technol, 1984, v.6, p.275-282.

4. Гусаков А.В., Синицын А.П., Клесов А.А. Кинетическая модель ферментативного гидролиза целлюлозы в реакторе колонного типа. Биотехнология, 1985, №3, с. 112-122.

5. Гусаков А.В., Синицын А.П., Герасимас В.Б., Савицкене Р.Ю., Степонавичус Ю.Ю. Изучение ингибирования целлюлолитических ферментов продуктами гидролиза с помощью окрашенной целлюлозы. Биотехнология, 1985, №5, с.38-43.

6. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Klyosov, A.A. Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose. 1. A mathematical model for a batch reactor process. Enzyme Microb. Technol., 1985, v.7,p.346-352.

7. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Klyosov, A.A. Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose. 2. A mathematical model for the process in a plug-flow column reactor. Enzyme Microb. Technol., 1985, v.7, p.383-388.

8. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Gerasimas, V.B., Savitskene, R.Y., Stepona-vichus, Yu.Yu. A product inhibition study of cellulases from Trichoderma longibrachiatum using dyed cellulose. J. Biotechnol, 1985, v.3, p. 167-174.

9. Гусаков А.В., Синицын А.П., Клесов А.А. Математическая модель ферментативного гидролиза целлюлозы препаратом гриба Trichoderma longibrachiatum в реакторе периодического действия. Прикл. биохим. микробиол., 1986, т.22, №1, с.59-69.

10. Гусаков А.В., Синицын А.П., Клесов А.А. Сравнение эффективности использования реакторов периодического и непрерывного действия для ферментативного гидролиза целлюлозы на основе кинетических расчетов: оценка влияния различных факторов. Биотехнология, 1986, № 1, с.74-84.

11. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М., Клесов А.А., Клячко Н.Л., Хмельницкий Ю.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Березин И.В. Способ получения стабилизированных препаратов целлюлаз. Авт. свид. СССР №1300439, 1986.

12. Гусаков А.В., Синицын А.П. Кинетика гидролиза целлобиозы иммобилизованной целлобиазой из Aspergillus foetidus в проточном реакторе. Биотехнология, 1987, т.З, №3, с.394-401.

13. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Klyosov, A.A. A theoretical comparison of the reactors for the enzymatic hydrolysis of cellulose. Biotechnol. Bioeng., 1987, v.29, p.898-900.

14. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Klyosov, A.A. Factors affecting the enzymatic hydrolysis of cellulose in batch and continuous reactors: computer simulation and experiment. Biotechnol. Bioeng., 1987, v.29, p.906-910.

15. Gusakov, A.V. A Fortran program for evaluation of the effectiveness factor of biocatalysts in the presence of external and internal diffUsional limitations. Biocatalysis, 1988, v.l, p.301-320.

16. Гусаков А.В., Черноглазое В.М., Синицын А.П., Березин И.В., Величко Б.А., Черкасова Г.В., Головлев Е.Л., Окунев О.Н., Белецкая О.П., Кулаев И.С. Способ получения иммобилизованной целлобиазы. Авт. свид. СССР №1473358, 1988.

17. Sinitsyn, A.P., Mitkevich, O.V., Gusakov, A.V., Klyosov, A.A. Decrease in reactivity and change of physico-chemical parameters of cellulose in the course ofenzymatic hydrolysis. Carbohyd. Polym., 1989, v. 10, p. 1-14.

18. Синицын А.П., Гусаков А.В. Условия возникновения синергизма между эндо- и экзодеполимеразами при ферментативной деструкции полисахаридов. Вестник Моск. ун-та, Сер. 2, Химия, 1989, т.ЗО, №2, с. 196200.

19. Гусаков А.В., Протас О.В., Черноглазов В.М., Синицын А.П., Ковалышева Г.В., Шпанченко О.В., Ермолова О.В. Реакции транс-гликозилирования, катализируемые целлобиогидролазой I из Trichoderma longibrachiatum при действии на природные и синтетические субстраты. Биоорг. химия, 1990, т. 16, №6, с.898-903.

20. Кузнецов В.М., Сыроежин В.Ф., Малхасян Л.Г., Голубков И.М., Синицын А.П., Клесов А.А., Гусаков А.В. Аппарат для ферментативного гидролиза лигноцеллюлозного сырья. Авт. свид. СССР №1560551,1990.

21. Sinitsyn, A.P., Gusakov, A.V., Vlasenko, E.Yu. Effect of structural and physico-chemical features of cellulosic substrates on the efficiency of enzymatic hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol, 1991, v.30, p.43-59.

22. Gusakov, A.V., Protas, O.V., Chernoglazov, V.M., Sinitsyn, A.P., Kovalysheva, G.V., Shpanchenko, O.V., Ermolova, O.V. Transglycosylation activity of cellobiohydrolase I from Trichoderma longibrachiatum on synthetic and natural substrates. Biochim. Biophys. Acta, 1991, v.l073, p.481-485.

23. Гусаков А.В., Синицын А.П., Синельник А.П., Миронюк И.Ф. Эффективные биокатализаторы на основе бета-глюкозидазы, иммобилизованной на макропористом аэросилогеле. Прикл. биохим. микробиол., 1991,т.27,№6,с.804-808.

24. Беккер Е.Г., Гусаков А.В., Синицын А.П. Реакции трансглико-зилирования, катализируемые бета-глюкозидазой из Aspergillus japonicus в присутствии модельных соединений лигнина. Прикл. биохим. микробиол., 1991, т.27, №4. с.482-485.

25. Синицын А.П., Лазарев А.П., Левашов А.В., Черноглазов В.М., Варфоломеев С.Д., Гусаков А.В., Калюжный СВ. Способ приготовления корма для свиней. Авт. свид. СССР №1674775, 1991.

26. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Manenkova, J.A., Protas, O.V. Enzymatic conversion of industrial and agricultural lignocellulosic wastes: main features ofthe process. Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, v.34-35, p.625-637.

27. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P. A theoretical analysis of cellulase product inhibition: effect of cellulase binding constant, enzyme/substrate ratio and beta-glucosidase activity on the inhibition pattern. Biotechnol Bioeng., 1992, v.40, p.663-671.

28. Синицын А.П., Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Гусаков А.В., Синицын Л.Е., Гаврин А.Г., Протас О.В. Кинетика ферментативного гидролиза микрокристаллической целлюлозы. Мед. пром-сть и биотехнол., 1992, №Ю,с.30-35.

29. Соломатов В.И., Селяев В.П., Синицын А.П., Гусаков А.В., Черкасов В.Д., Ревин В.В., Бузулуков В.И., Коротин А.И. Вяжущее. Авт. свид. СССР №1754685, 1992.

30. Синицын А.П., Гусаков А.В., Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю., Протас О.В. Ускорение ферментативного гидролиза целлюлозы в переменном неоднородном электромагнитном поле. Доклады РАН, 1993, т.ЗЗЗ, №4, с.529-531.

31. Sinitsyn, A.P., Gusakov, A.V., Davydkin, I.Yu., Davydkin, V.Yu., Protas, O.V. A hyperefficient process for enzymatic cellulose hydrolysis in the Intensive Mass Transfer Reactor. Biotechnol Lett., 1993, v. 15, p.283-288.

32. Гусаков А.В., Синицын А.П., Протас О.В., Давыдкин И.Ю., Давыдкин В.Ю. Использование реактора с интенсивным массообменом для ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов. Прикл. биохим. микробиол., 1995,т.31, №3, с.361-366.

33. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Davydkin, I.Yu., Davydkin, V.Yu., Protas, O.V. Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field. Appl Biochem. Biotechnol., 1996, v.56, p.141-153.

34. Зоров И.Н., Дубасова М.Ю., Синицын А.П., Гусаков А.В., Митченко А.А., Баразненок В.А., Гутьеррес Б., Попова Н.Н. Применение бицинхонинатного метода анализа восстанавливающих Сахаров для определения КМЦазной активности целлюлаз с использованием микроплашечного ридера. Биохимия, 1997, т.62, №7, с.826-832.

35. Гусаков А.В., Синицын А.П. О механизме действия ферментов-целлюлаз на текстильные материалы: взгляд энзимологов. Текстильная химия, 1998, №2, с.68-72.

36. Берлин А.Х., Тихомиров Д.Ф, Гутьеррес Б.Р., Гусаков А.В., Попова Н.Н., Синицын А.П. Оценка топоферментной активности целлюлаз и ксиланаз. Прикл. биохим. микробиол., 1998, т.34, №4, с.382-387.

37. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Berlin, A.G., Popova, N.N., Markov, A.V., Okunev, O.N., Tikhomirov, D.F., Emalfarb, M. Interaction between indigo and adsorbed protein as a major factor causing backstaining during cellulase treatment of cotton fabrics. Appl. Biochem. Biotechnol, 1998, v.75, p.279-293.

38. Гусаков А.В., Попова Н.Н., Берлин А.Х., Синицын А.П. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных препаратов целлюлаз. Прикл. биохим. микробиол., 1999, т.35, №2, с. 137-140.

39. Gusakov, A., Sinitsyn, A., Grishutin, S., Tikhomirov, D., Shook, D., Scheer, D., Emalfarb, M. Microassays to control the results of cellulase treatment of denim fabrics. Textile Chemist and Colorist & American Dyestuff Reporter, 2000, v.32, p.42-47.

40. Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Синицын А.П., Кричевский Г.Е., Тиматков А.Г., Барышева Н.В. Биоотварка хлопчатобумажных тканей. Текстильная химия, 2000, №2, с.65-70.

41. Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Синицын А.П., Кричевский Г.Е., Тиматков А.Г., Барышева Н.В. Ферментная обработка суровой хлопчатобумажной ткани для придания ей устойчивой смачиваемости и сорбционной способности. Текстильная пром-стъ, 2000, №4, с. 19-21.

42. Скомаровский А.А., Зоров И.Н., Гришутин С.Г., Марков А.В., Синицын А.П., Гусаков А.В., Рябов А.Д., Гнеденко Б.Б. Электрохимическое определение эндодеполимеразной активности целлюлаз. Биохимия, 2000, т.65,№10,с.1415-1420.

43. Gusakov, A.V., Berlin, A.G., Popova, N.N., Okunev, O.N., Sinitsyna, OA, Sinitsyn, A. P. A comparative study of different cellulase preparations in the enzymatic treatment of cotton fabrics. Appl. Biochem. Biotechnol., 2000, v. 88, p.l 19-126.

44. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Markov, A.V., Skomarovsky A.A., Sinitsyna, O.A., Berlin A.G., Ankudimova, N.V. Indigo-binding domains in cellulase molecules. Vestnik Moskovskogo Universiteta, Khimiya, 2000, v.41, No.6 Supplement, p.77-80.

45. Berlin, A.G., Gusakov, A.V., Sinitsyna, OA, Sinitsyn, A.P. Detection of major xylanase containing cellulose-binding domain from Penicillium verruculosum by combination of chromatofocusing and limited proteolysis. Appl. Biochem. Biotechnol., 2000, v.88, p.345-352.

46. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Berlin, A.G., Markov, A.V., Ankudimova, N.V. Surface hydrophobic amino acid residues in cellulase molecules as a structural factor responsible for their high denim-washing performance. Enzyme Microb. Technol, 2000, v.27, p.664-671.

47. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Markov, A.V., Sinitsyna, O.A., Ankudimova, N.V., Berlin, A.G. Study ofprotein adsorption on indigo particles confirms the existence of enzyme-indigo interaction sites in cellulase molecules. J. Biotechnol, 2001,v.87, p.83-90.

48. Sinitsyn, A.P., Gusakov, A.V., Grishutin, S.G., Sinitsyna, O.A., Ankudimova, N.V. Application of microassays for investigation of cellulase abrasive activity and backstaining. J. BiotechnoL, 2001, v.89, p.233-238.

49. Зоров И.Н., Гусаков А.В., Баразненок В.А., Беккаревич А.О., Окунев О.Н., Синицын А.П., Кондратьева Е.Г. Выделение и свойства целлобиазы из Penicillium verruculosum. Прикл. биохим. микробиол., 2001, т.37, №6, с.687-693.

50. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства основных компонентов внеклеточного ферментного комплекса Penicillium canescens. Биохимия, 2003, т.68, №11, с.1494-1505.

51. Марков А.В., Гусаков А.В., Гришутин С.Г., Кондратьева Е.Г., Кричевский Г.Е., Тиматков А.Г., Барышева Н.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Биоотварка хлопчатобумажных тканей ферментными препаратами: сравнение эффективности действия разных препаратов, выявление ключевых ферментов. Текстильная химия, 2003, №2, с.31-36.

52. Марков А.В., Гусаков А.В., Гришутин С.Г., Кондратьева Е.Г., Кричевский Г.Е., Тиматков А.Г., Барышева Н.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Влияние тепловой жидкостной предобработки на эффективность биоотварки х/б тканей под действием ферментных препаратов. Текстильная химия, 2003, №3, с.25-27.

53. Бухтояров Ф.Е., Устинов Б.Б., Саланович Т.Н., Антонов А.И., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Целлюлазный комплекс гриба Chrysosporium lucknowense: выделение и характеристика эндоглюканаз и целлобиогидролаз. Биохимия, 2004, т.69, №5, с.666-677.

54. Grishutin, S.G., Gusakov, A.V., Markov, A.V., Ustinov, B.B., Semenova, M.V., Sinitsyn, A.P. Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes. Biochim. Biophys. Ada, 2004, v. 1674, p.268-281.

55. Gusakov, A.V., Sinitsyn, A.P., Salanovich, T.N., Bukhtojarov, F.E., Markov, A.V., Ustinov, B.B., van Zeijl, C, Punt, P., Burlingame, R. Purification, cloning and characterisation of two forms of thermostable and highly active cellobiohydrolase I (Cel7A) produced by the industrial strain of Chrysosporium lucknowense. EnzymeMicrob. Technol, 2005, v.36, p.57-69.

ООП МГУ. Зека» 53-1GG-G5

01.00

7 '7 :М0 Ърп.Г

L iW LX3

У ' i f

106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ, ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ РАСТИТЕЛЬНОЙ БИОМАССЫ.

1.1. Строение и свойства целлюлозы как главного компонента растительной биомассы.

1.2. Другие полисахариды растений и лигнин.

1.2.1. Гемицеллюлозы.

1.2.2. Пектины и Р-глюканы.

1.2.3. Лигнин.

ГЛАВА 2. ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И ФЕРМЕНТЫ.

2.1. Распространение и классификация р-1,4-глюканаз (целлюлаз и ксилоглюканаз).

2.2. Особенности молекулярного строения и механизм действия целлюлаз.

2.2.1. Бифункциональная организация молекул грибных целлюлаз.

2.2.2. Механизм действия целлюлазного комплекса.

2.3. Микроскопические грибы как продуценты целлюлолитических ферментов.

2.4. Свойства грибных целлюлаз.

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ПРИМЕНЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛАЗ.

3.1. Осахаривание лигноцеллюлозного сырья.

3.1.1. Источники целлюлозосодержащего сырья и его предобработка.

3.1.2. Аппаратурное оформление процессов ферментативного гидролиза целлюлозы.

3.2. Ферментная обработка текстильных материалов.

3.3. Применение целлюлаз и сопутствующих им ферментов в сельском хозяйстве и пищевой промышленности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

4.1. Использованные ферменты.

4.2. Субстраты и реактивы.

4.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка.

4.4. Методы определения активности ферментов.

4.5. Использование окрашенной целлюлозы для исследования ингибирования целлюлаз продуктами реакции.

4.6. Методы выделения и очистки ферментов.

4.7. Определение адсорбционных характеристик ферментов.

4.8. Исследование термостабильности ферментов.

4.9. Исследование трансгликозилирования ЦБГ1.

4.10. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков.

4.11. Анализ молекулярно-массового распределения продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

4.12. Исследование кинетики ферментативного гидролиза целлюлозы в ячейках с перемешиванием и в реакторах различного типа.

4.13. Численные методы решения дифференциальных уравнений и определения кинетических параметров.

4.14. Методы иммобилизации р-глюкозидазы и использование иммобилизованного фермента.

4.15. Оценка способности целлюлаз к биодепигментации джинсовой ткани.

4.16. Определение индекса ресорбции индиго.

4.17. Исследование взаимодействия индиго с аминокислотами и белками.

4.18. Оценка способности ферментов к биоотварке («биоскорингу») суровой хлопчатобумажной ткани.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 5. ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЙ КОМПЛЕКС ГРИБА CHRYSOSPORIUM LUCKNOWENSE.

5.1. Общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowense.

5.2. Субстратная специфичность, классификация и свойства эндоглюканаз и целлобиогидролаз.

5.3. Целлобиогидролазы 1а и lb (Се17А и Се17В) из 7-й семьи гликозид-гидролаз.

5.3.1. ЦБГ 1а (Се17А): аминокислотная последовательность, молекулярные

I характеристики, кинетика действия и свойства разных форм фермента.

5.3.2. ЦБГ lb (Се17В): пептидный «фингерпринт» фермента и гомология с другими целлюлазами.

5.4. Целлобиогидролазы На и lib (Се16А и Се16В) из 6-й семьи гликозид-гидролаз.

5.4.1. Аминокислотная последовательность и особенности молекулярного строения ЦБГ На (Се16А).

5.4.2. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ЦБГ lib (Се16В) и гомология с другими целлюлазами.

5.5. Низкомолекулярные эндоглюканазы ЭГIII (Се112А) и ЭГ V (Се145А): аминокислотные последовательности, гомология и моделирование трехмерных структур.

5.6. Масс-спектрометрический и пептидный анализ высокомолекулярных эндоглюканаз (Се15А, Се16С, Се17С).

5.7. Специфичные ксилоглюканазы С. lucknowense, Т. reesei и A.japonicus как представители нового класса гликозид-гидролаз.

5.7.1. Пептидный (масс-спектрометрический) анализ ксилоглюканаз.

5.7.2. Субстратная специфичность и основные свойства ксилоглюканаз.

5.7.3. Тип действия ксилоглюканаз на полимерные субстраты.

5.7.4. Кинетика гидролиза ксилоглюкана и состав конечных продуктов.

ГЛАВА 6. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОДУКТАМИ РЕАКЦИИ И ТРАНС-ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ ПРИ КАТАЛИЗЕ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИМИ ФЕРМЕНТАМИ.

6.1. Теоретический анализ ингибирования целлюлаз продуктами реакции: оценка влияния различных факторов.

6.2. Использование окрашенной целлюлозы для изучения ингибирования целлюлаз продуктами гидролиза.

6.3. Реакции трансгликозилирования, катализируемые целлобиогидролазой I из Т. longibrachiatum.

ГЛАВА 7. ПРИМЕНЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ МАТЕРИАЛОВ.

7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз.

7.2. Математическое моделирование ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы и оценка влияния различных факторов на кинетику процесса.

7.3. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторе с интенсивным массообменом на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора.

7.4. Ферментативный гидролиз целлюлозы в реакторах с виброперемешиванием.

7.5. Применение иммобилизованной Р-глюкозидазы для обработки гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы.

ГЛАВА 8. ПРИМЕНЕНИЕ «ТОПОЛИТИЧЕСКИХ» ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ ТЕКСТИЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ.

8.1. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных ферментных препаратов и очищенных индивидуальных целлюлаз.

8.2. Адсорбционная способность ферментов как основной фактор, влияющий на ресорбцию индиго в процессе биодепигментации джинсовой ткани.

8.3. Особенности молекулярного строения целлюлаз, определяющие эффективность их действия при ферментативной депигментации джинсовой ткани.

8.4. Эффективные ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum и ЭГ V С. lucknowense для депигментации джинсовых изделий.

8.4.1. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ III P. verruculosum.

8.4.2. Белковая инженерия ЭГ III P. verruculosum.

8.4.3. Штаммы и ферментные препараты на основе ЭГ V С. lucknowense.

8.5. Биоотварка («биоскоринг») суровой хлопчатобумажной ткани с использованием препаратов целлюлаз.

ВЫВОДЫ.

Современный этап развития физико-химической энзимологии имеет две характерные особенности. С одной стороны, происходит накопление и развитие фундаментальных знаний, осуществляется углубленное изучение механизма действия ферментов и ферментных систем, выявление характерных особенностей их функционирования. С другой стороны, активизируются усилия, направленные на поиск возможности использования биокатализаторов в различных областях технологии. Принципы биокатализа, биотрансформации веществ все более широко применяются для реализации новых биотехнологических процессов, решения насущных задач, связанных с переходом на новые источники сырья и энергии, для разработки прогрессивных методов утилизации отходов, а также для замены традиционных химических процессов на биокаталитические, которые протекают в более мягких условиях и гораздо более безопасны с точки зрения экологии.

Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы -самого распространенного биополимера на Земле, по праву занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. Поэтому не случайно, начиная с середины прошлого века, во многих странах мира стали проводиться исследования целлюлаз.

Резкое увеличение интенсивности подобных исследований произошло в 1970-е годы в США и странах Западной Европы из-за разразившегося энергетического кризиса, связанного с резким повышением цен на нефть и другие энергоносители

1]. Целлюлоза растительной биомассы представляет собой практически неисчерпаемый источник возобновляемого сырья, которое может быть конвертировано ферментативным путем в глюкозу. В свою очередь, глюкоза является незаменимым сырьем для микробиологических процессов получения жидких и газообразных видов топлива (этанола, бутанола, этилена и др.), органических и аминокислот, кормового белка и многих других полезных продуктов микробиологического синтеза. Общие запасы на Земном шаре возобновляемого сырья, представляющего собой растительную биомассу, оцениваются в 800-1000

11 млрд. т, причем ежегодно в результате фиксации 10 кал солнечной энергии образуется примерно 50 млрд. т биомассы, а также накапливается 4-5 млрд. т отходов или вторичных продуктов промышленной и сельскохозяйственной переработки растений и древесины [1,2]. Таким образом, в будущем растительная биомасса может играть ту роль, которая в настоящее время принадлежит нефти.

Прогрессирующий дефицит невозобновляемых источников энергии и материалов наблюдается и в настоящее время. В последние годы интерес к биоэтанолу и другим видам топлива из лигноцеллюлозного сырья вновь резко повысился из-за дальнейшего роста цен на нефть, а также в связи с Киотским соглашением 1997 г., направленным на снижение выброса в атмосферу газов, вызывающих парниковый эффект. В отличие от ископаемых видов топлива, биоэтанол и другие виды топлива из возобновляемого растительного сырья не приводят к накоплению углекислого газа в атмосфере, т.к. он вновь превращается в кислород в процессе фотосинтеза, осуществляемого растениями (т.е. происходит круговорот СО2/О2 при параллельном возобновлении целлюлозы и других компонентов растительной биомассы).

Таким образом, помимо фундаментальных исследований в области целлюлолитических ферментов, направленных на выяснение биохимических и # физико-химических закономерностей биодеградации целлюлозы в природе, механизмов действия грибных и бактериальных ферментов, в последние 30 лет наиболее активно развивались прикладные исследования в области ферментативного гидролиза целлюлозы, а также разработки, направленные на поиск и получение новых штаммов - суперпродуцентов целлюлаз. При этом основные усилия были направлены на поиск и изучение ферментов, способных наиболее эффективно и полно разрушать целлюлозу до растворимых Сахаров и в итоге - до мономера (глюкозы).

С конца 1980-х годов целлюлазы стали активно применяться для обработки текстильных изделий и материалов [3,4]. Первым таким процессом стала ферментная обработка джинсовых изделий, приводящая к частичному удалению красителя с поверхности ткани, в результате которой изделия приобретают внешний вид «вареных джинсов». В течение нескольких лет ферменты практически заменили пемзу и химические агенты, применявшиеся для этой цели ранее. Позднее целлюлазы стали широко использоваться для биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и смесовых тканей. В результате такой обработки с поверхности материала удаляются ворсинки и неровности, в результате чего материал становится более гладким, приятным на ощупь, и после серии стирок на нем не происходит образования «катышков» (пилей), что повышает потребительские свойства изделий. Наконец, в последние годы стало развиваться направление применения целлюлаз (совместно с пектиназами) для биоотварки («биоскоринга») суровых хлопчатобумажных тканей с целью увеличения смачиваемости целлюлозных волокон, что облегчает окрашивание материала на последующих стадиях технологического процесса. Такая обработка является необходимой стадией в текстильной промышленности, однако в течение многих столетий отварка производится в горячем растворе щелочи, приводя к быстрой коррозии оборудования и вредным выбросам в окружающую среду.

В последнее десятилетие целлюлазы также стали активно использоваться в качестве добавок к детергентам и моющим средствам [3,4] для того, чтобы воздействуя при стирке на текстильные материалы, содержащие в своем составе целлюлозные волокна, облегчить удаление грязей за счет гидролиза части поверхностных волокон и предотвратить образование пилей.

В отличие от ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, где ферменты должны обладать максимальной «агрессивностью» по отношению к полимерному субстрату (высокой сахаролитической активностью), в процессах биообработки текстиля (в том числе, при стирке современными моющими средствами) требуются целлюлазы, способные мягко воздействовать на поверхность волокон, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы, т. е. так называемые «тополитические» ферменты.

Среди других областей применения целлюлолитических ферментов следует отметить их использование в качестве добавок к кормам животных и птиц для разрушения некрахмальных полисахаридов [3,4]. В данном случае, как правило, используются мультиферментные препараты, содержащие широкий спектр карбогидраз, т.е. не только целлюлазы, но и ксиланазы, Р-глюканазы, пектиназы. Например, добавка таких препаратов в составе премиксов к комбикормам в птицеводстве позволяет не только повысить их усвояемость, но и использовать кормовые диеты на основе таких трудноусвояемых видов злаков, как рожь и ячмень.

Специфика применения целлюлолитических ферментов в новых технологиях часто требует, чтобы ферменты обладали высокой активностью не только в кислой среде (при рН 4-5), что типично для грибных целлюлаз, но также и в нейтральной и слабощелочной среде. Поэтому в последнее время различными научными и производственными коллективами ведется интенсивный поиск нейтральных и щелочных целлюлаз.

Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Т. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Препараты целлюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются во многих странах ведущими компаниями -производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), Genencor International (США), Iogen (Канада), PrimAlko (Финляндия), Rohm Gmbh (ФРГ), Meiji Seika Kaisha Ltd. и Shin Nihon Chemical Co. (Япония) и др. В последние годы в связи с бурным развитием «текстильного» направления целлюлаз некоторыми компаниями стали производиться ферментные препараты на основе других грибных продуцентов, оптимизированные для использования в конкретных биотехнологических процессах. Например, на основе грибного продуцента Humicola insolens фирмой Novozymes (Дания) производятся ферментные препараты серии Denimax для «биостонинга» джинсовых изделий. Для этой же цели выпускаются специальные ферментные препараты фирмой Meiji (Япония). В отличие от целлюлаз Trichoderma указанные ферменты функционируют в нейтральной области рН.

По оценкам зарубежных специалистов общий объем продаж промышленных ферментов на мировом рынке должен составить в 2005 г. от 1,7 до 2 млрд. долларов США, при этом доля целлюлаз может составить 15-20% [3,4].

В СССР в 1970-1980-е годы микробиологическая промышленность также производила в промышленных масштабах или в виде опытно-промышленных партий ферментные препараты целлюлаз - такие как Целловиридин ГЗх (Т. viride), Целлобранин ГЮх (Т. longibrachiatum), Целлолигнорин ШОх (Т. lignorum), Целлокандин ГЮх (Geotrichum candidum) и некоторые другие [5-7]. Несмотря на то, что по продуктивности секреции внеклеточного (целлюлолитического) белка и удельной целлюлазной активности указанные продуценты и ферментные препараты на их основе, как правило, уступали зарубежным аналогам, с точки зрения качества целлюлазного комплекса (т.е. набора целлюлаз с различной специфичностью) отечественные препараты мало чем от них отличались, а иногда обладали более интересными свойствами. К середине 1990-х годов из-за распада СССР и общего экономического кризиса производство ферментных препаратов на большинстве биохимических заводов стран СНГ прекратилось.

Начиная с конца 1980-х годов, в Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзим ологии МГУ им. М.В.Ломоносова совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН в рамках Государственной научно-технической программы «Новейшие направления биоинженерии» велись разработки, направленные на поиск новых перспективных продуцентов грибных целлюлаз, усовершенствование существующих штаммов микроорганизмов, повышение удельной активности секретируемых ферментных комплексов, а также использование препаратов целлюлаз для биоконверсии лигноцеллюлозного растительного сырья в различные полезные продукты. В 1991 г. на основе штамма Т. reesei 18.2КК на Приволжском биохимическом заводе при участии кафедры химической энзимологии МГУ было налажено производство ферментного препарата Целловиридин А (взамен менее продуктивного штамма Т. viride, на основе которого до этого производился Целловиридин ГЗх). Несмотря на то, что к середине 1990-х годов на Приволжском заводе производство данного ферментного препарата прекратилось, оно в дальнейшем было возобновлено на ряде биохимических заводов России и бывших республик СССР (препараты Целловиридин Г20х и Г2х). В течение последних 15 лет в ИБФМ РАН путем селекции и мутаногенеза были получены новые штаммы гриба Т. reesei TW-1 и TW-307 (отличающиеся повышенной секрецией целлюлаз), на основе которых были произведены ферментные препараты с улучшенной осахаривающей способностью при гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Были также получены новые промышленные штаммы гриба Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151, дерепрессированные по глюкозе и способные секретировать на дешевых питательных средах до 40-50 г/л внеклеточного белка. Основным достоинством ферментных препаратов P. verruculosum по сравнению с целлюлазами Т. reesei является более сбалансированный состав целлюлазного комплекса, и, в частности, более высокий уровень Р-глюкозидазной активности, что, как будет показано в диссертационной работе, позволяет получать более высокий выход целевого продукта (глюкозы) при ферментативном гидролизе целлюлозосодержащих материалов. Наконец, в результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб Chrysosporium lucknowense, на основе которого были получены новые штаммы (в частности, UV 18-25), отличающиеся крайне высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) С. lucknowense UV 18-25 не уступает, либо превосходит лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз (например, различные штаммы Т. reesei). Серьезным преимуществом С. lucknowense также является то, что некоторые из целлюлаз данного продуцента обладают высокой активностью в нейтрально-щелочной среде, что делает данные ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов (в частности, для обработки текстиля, а также для применения в моющих средствах).

Следует отметить, что к настоящему времени ферменты целлюлазного комплекса Т. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. За последние 50 лет опубликовано более тысячи статей, патентов и монографий, а также проведены десятки международных конференций, посвященных микробиологическим, биохимическим и биотехнологическим аспектам гриба Т. reesei (Т. viride), а также продуцируемых данным грибом целлюлаз. Тем не менее, полный геном Т. reesei до сих пор не расшифрован, и далеко не все карбогидразы данного гриба были выделены и охарактеризованы. В литературе имеется также немалое количество публикаций по целлюлазам, продуцируемым различными видами грибов рода Penicillium, однако сведения, касающиеся пеницилльных ферментов-карбогидраз (и целлюлаз в частности), весьма противоречивы. Что касается ферментов, продуцируемых грибом С. lucknowense и другими видами грибов рода Chrysosporium, то сведения по ним практически отсутствуют в научной литературе, а также в белковых и других базах данных.

Учитывая актуальность исследования целлюлазных комплексов, продуцируемых различными микроорганизмами, как главных разрушителей растительной биомассы в природе, а также принимая во внимание все более широкое применение целлюлолитических ферментов в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах, в данной работе были поставлены следующие задачи и цели:

• детально охарактеризовать внеклеточный целлюлазный комплекс, продуцируемый грибом С. lucknowense, включая выделение всех секретируемых эндоглюканаз и целлобиогидролаз, изучение их субстратной специфичности, основных биохимических и физико-химических свойств, а также получение информации по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов из данных белков), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения их принадлежности к той или иной семье гликози д-ги дрол аз; изучить закономерности трансгликозилирования и ингибирования продуктами реакции при катализе целлюлолитическими ферментами (как важных факторов, влияющих на эффективность гидролиза природных субстратов целлюлаз); провести сравнение осахаривающей способности широкого круга отечественных и зарубежных целлюлазных препаратов на основе различных грибных продуцентов при гидролизе реальных видов целлюлозосодержащего сырья и выявить наиболее эффективные целлюлазные комплексы и штаммы-продуценты; найти возможности интенсификации процесса ферментативного осахаривания целлюлозы в лабораторных гидролиз-аппаратах различной конструкции; с помощью экспериментальных подходов, а также используя методы математического моделирования, выявить основные факторы, влияющие на кинетику ферментативного гидролиза лигноцеллюлозных материалов; выявить наиболее перспективные «тополитические» целлюлазы, обладающие высокой эффективностью при действии на текстильные материалы - в таких процессах, как ферментативная депигментация джинсовой ткани и биоотварка («биоскоринг») суровых хлопчатобумажных тканей; разработать теоретические основы действия «тополитических» целлюлаз; получить и испытать новые ферментные препараты, наиболее подходящие для применения в процессах биообработки текстильных материалов.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

Впервые охарактеризован внеклеточный целлюлазный комплекс, секретируемый грибами рода Chrysosporium, а именно - грибом Chrysosporium lucknowense, который является важным промышленным продуцентом целлюлаз и гемицеллюлаз. В состав комплекса входят, как минимум, девять целлюлаз, кодируемых различными генами: четыре целлобиогидролазы (ЦБГ la, lb, На, ИЬ) и пять эндо-1,4-р-глюканаз (ЭГ I, II, III, V и VI). Все ферменты выделены в гомогенном виде, подробно изучены их свойства. На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей указанные ферменты классифицированы по их принадлежности к различным семьям гликозид-гидролаз, а именно ЦБГ la, lb, Ila, ПЬ классифицированы как Се17А, Се17В, Се16А, Се16В, а ЭГ I, II, III, V, VI - как Се17С, Се15А, Cell2А, Се145А, Се16С. Показано, что ЦБГ 1а и ЭГ II существуют в виде различных форм. Высокомолекулярные формы ЦБГ 1а и ЭГ II, а также ЦБГ НЬ представляют собой типичные (полноразмерные) целлюлазы, которые состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером. У низкомолекулярных форм ЦБГ 1а и ЭГ И, образующихся в результате ограниченного протеолиза полноразмерных ферментов, а также у всех остальных целлюлаз С. lucknowense ЦСМ отсутствует.

В составе ферментных комплексов, секретируемых грибами С. lucknowense и Trichoderma reesei, впервые обнаружены специфичные ксилоглюканазы (гомологичные между собой ферменты, принадлежащие к 74-й семье гликозид-гидролаз), которые представляют новый класс карбогидраз. Характерными особенностями ксилоглюканаз С. lucknowense и Т. reesei являются высокая удельная активность по отношению к ксилоглюкану, которая более чем в 10 раз превышает целлюлазную и р-глюканазную активности, а также необычный экзо-тип действия на полимерный субстрат, в результате которого от концов молекулы ксилоглюкана последовательно отщепляются олигосахаридные блоки, содержащие 4 глюкозидных остатка в основной цепи.

Проведен детальный анализ ингибирования целлюлаз продуктами ферментативного гидролиза целлюлозы — целлобиозой и глюкозой. С помощью математического моделирования на ЭВМ показано, что из-за особенностей гетерогенной системы «целлюлоза-целлюлазы» на практике могут наблюдаться различные типы ингибирования: неконкурентный, конкурентный или смешанный. Установлено, что тип наблюдаемого ингибирования зависит от константы адсорбции и величины максимальной адсорбции фермента, его концентрации, используемого диапазона концентраций субстрата, а также р-глюкозидазной активности; при этом критическим параметром является отношение «фермент/субстрат» (E/S) в реакционной смеси, т.к. при высоких значениях E/S имеет место лимитирование адсорбции фермента доступной площадью поверхности целлюлозы. Предложен подход для изучения ингибирования целлюлаз продуктами реакции, основанный на использовании окрашенной целлюлозы.

Впервые показано, что целлобиогидролазы способны катализировать реакции трансгликозилирования. При использовании 4-метилумбеллиферил-Р-0-целлобиозида, целлотриозы или микрокристаллической целлюлозы в качестве субстратов (доноров) и 4-метилумбеллиферильных производных целлобиозы и глюкозы в качестве акцепторов обнаружена способность ЦБГ I из Т. longibrachiatum (7-я семья гликозид-гидролаз) к переносу гликозидного остатка на указанные акцепторы с образованием продуктов трансгликозилирования.

Проведено сравнение осахаривающей способности ряда коммерческих и лабораторных целлюлазных препаратов при ферментативном гидролизе различных видов целлюлозосодержащего сырья. Показано, что отечественные промышленные препараты серии "Целловиридин" (штамм Т. reesei 18.2КК), лабораторные препараты на основе нового мутантного штамма Т. reesei TW-307 (ИБФМ РАН) и, в особенности, лабораторные препараты на основе новых штаммов Penicillium verruculosum В40-221-6 и В40-221-151 (ИБФМ РАН) не уступают или превосходят по эффективности гидролиза аналогичные препарату от зарубежных производителей ферментов. В большинстве случаев целлюлазные препараты P. verruculosum продемонстрировали максимальную эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих материалов.

Предложены подходы для интенсификации процесса ферментативного гидролиза целлюлозы, основанные на использовании (а) реактора ^с интенсивным перемешиванием на базе плоского двухстороннего электромагнитного индуктора (ПДИ), где перемешивание осуществляется за счет хаотического движения ферромагнитных частиц во вращающемся магнитном поле, и (б) реакторов с виброперемешиванием. Показана возможность ускорения процесса гидролиза в 1,5-8 раз в указанных реакторах. В реакторе на базе ПДИ за 1 ч ферментативного гидролиза целлюлозы достигнута концентрация Сахаров (глюкоза + целлобиоза) 30-50 г/л при дозах целлюлазной активности 10-20 ед. по фильтровальной бумаге на 1 г субстрата, т.е. продуктивность реактора составила 30-50 г/(л-ч). Подобная продуктивность ферментативного гидролиза целлюлозы является наиболее высокой из описанных в литературе.

Получены высокоактивные препараты иммобилизованной на макропористых кремнеземах Р-глюкозидазы (целлобиазы) из Aspergillus foetidus и A. japonicus, которые могут быть использованы для обработки ферментативных гидролизатов целлюлозы с высоким содержанием целлобиозы. При использовании препаратов в реакторе колонного типа при 40°С в течение двух недель иммобилизованный фермент сохранял не менее 95% активности, при этом продуктивность реактора достигала 250-300 г/(л-ч).

Проведены лабораторные испытания широкого круга целлюлазных препаратов в процессах биообработки текстильных материалов - депигментации («биостонинга») джинсовой ткани и биоотварки («биоскоринга») суровой хлопчатобумажной бязи с целью увеличения ее смачиваемости. Выявлены «тополитические» целлюлазные препараты и индивидуальные целлюло-литические ферменты, способные наиболее мягко и эффективно воздействовать на поверхность целлюлозных волокон без их существенной деструкции. Разработаны научные основы действия «тополитических» целлюлаз в процессах ферментативной обработки текстиля. Продемонстрирована высокая эффективность действия на джинсовую ткань ферментных препаратов на основе новых штаммов P. canescens, несущих ген рекомбинантной ЭГ III (Се112А) Р. verruculosum, и штаммов С. lucknowense, содержащих мультикопированный ген гомологичной ЭГ V (Се145А).

1. Bungay, H.R. Energy: the biomass options, Wiley and Sons, New York, 1981, 347 p.

2. Целлюлоза и ее производные (ред. И.Байклз, Л.Сегал), М., Мир, 1974, в 2-х томах, т.1 -500 е., т.2 510 с.

3. Godfrey, Т., West, S. (eds.) Industrial enzymology, 2nd edition, Macmillan Press Ltd., Hampshire, 1996, 609 p.

4. Bhat, M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. Adv., 2000, v.18, p.355-383.

5. Калунянц K.A., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты, М., Пищевая промышленность, 1979, 118 с.

6. Морозова Е.С. Основные достижения и направления селекции продуцентов целлюлаз в СССР и за рубежом. В сб.: Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты, Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология, т. 10, М., ВИНИТИ, 1988, с.6-71.

7. Родионова Н.А. Ферментативное расщепление целлюлозы. В сб.: Целлюлазы микроорганизмов (ред. В.Л.Кретович), М., Наука, 1981, с.4-40.

8. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений, М., Мир, 1986, 387с.

9. Stephen, A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995,654 p.

10. Роговин З.А. Химия целлюлозы, M., Химия, 1972, 519 с.

11. Блинов И.П. Химия микробных полисахаридов, М., 1984. с.162.

12. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П. Химия древесины и целлюлозы, М., 1978,363 с.

13. Кленкова Н.И. Структура и реакционная способность целлюлозы, Л., 1976, 367 с.

14. Калунянц К.А., Шаненко Е.Ф., Зайцева Л.В. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов, Итоги науки и техники, Сер. Химия и технология пищевых продуктов, т.1, М., ВИНИТИ, 1988, 187 с.

15. Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В. Химия древесины и синтетических полимеров, СПб., СПбЛТА, 1999, 628 с.

16. Сихтола X., Макконен X. Целлюлоза. В сб.: Химия древесины (ред. В.Йенсен), М., Мир, 1982, с.96-129.

17. Ranby, B.G. Celluloses and their applications, Washington, 1969, p.139-210.

18. Coughlan, M.P., Hazlewood, G.P. Hemicellulose and hemicellulases, Portland Press Research Monograph, London-Chapel Hill, 1993, v.4,120 p.

19. Scalbert, A., Monties, В., Lallemand, J.Y., Guitted, E., Rolando, C. Ether linkage between phenolic acids and lignin fractions from wheat straw. Phytochemistry, 1985, v.24, p.l359-1362.

20. Mueller-Harvey, I., Hartley, R.D., Harris, P.J., Curzon, E.H. Linkage ofp-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res., 1986, v.148, p.71-85.21.