Свойства целлюлолитических ферментов Penicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

Ji/t/frjiÙ '

МОРОЗОВА ВАЛЕРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ PENICILLIUM VERRUCUIOSUM И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СЫРЬЯ

02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2009

□Q3467634

003467634

Работа выполнена на кафедре химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын А.П.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков И.А. доктор химических наук, профессор Попов В.О.

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, г.Пущино

Защита состоится апреля 2009 года в 160с часов на заседании совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан марта 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На сегодняшний день перед человечеством стоит проблема потенциального исчерпывания традиционного углеводородного сырья, из которого производят моторное топливо и продукты химического синтеза. Кроме того, с каждым годом увеличивается объем антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу, что приводит к изменению климата на Земле. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии, а именно к возобновляемому растительному сырью и целлюлозосодержащим отходам промышленности и сельского хозяйства. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза лигноцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо - этанол или бутанол.

Эффективность процесса получения Сахаров зависит в значительной степени от состава целлюлолитического комплекса и взаимодействия индивидуальных ферментов в нем, стабильности целлюлаз и ингибирующего влияния на них продуктов. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma играют ведущую роль, что обусловлено их высокой секреторной способностью. Тем не менее, ферментный комплекс Trichoderma имеет недостатки, среди которых можно отметить невысокую удельную активность целлюлаз и низкое содержание р-глюкозидазы. В отличие от Trichoderma, грибы рода Pénicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляющие целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты Pénicillium обладают высокой удельной активностью и операционной стабильностью.

Ключевые ферменты целлюлазного комплекса — эндоглюканазы и целлобиогидродазы, способные гидролизовать главным образом высокоупорядоченные области целлюлозы. К сожалению, сведения, касающиеся пеницильных ферментов-карбогидраз, весьма противоречивы, при этом аминокислотных последовательностей, транслированных из генов P. verrucidosum, практически нет в белковых базах данных. Ранее в нашей лаборатории были изучены некоторые ферменты, продуцируемые P. verrucidosum. Создание новых мутантных штаммов привело к секреции новых ферментов: целлобиогидролазы 60 кДа и эндоглюканазы 70 кДа.

Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось изучение молекулярных и каталитических свойств целлобиогидролаз и эндоглюканаз, секретируемых высокопродуктивным мутантным штаммом гриба P. verrucidosum В221-151, полученным в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, а также разработка подхода для создания на основе ферментов P. verrucidosum смесей, способных осуществлять глубокий гидролиз растительной биомассы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Г

• Выделить все секретируемые целлюлазы Р. уе/тиси1о.уит\

• Исследовать биохимические и каталитические свойства целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа в сравнении с ранее описанными ыеллобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента;

• Разработать подход для создания мультиферментных смесей на основе целлюлаз Р. уеггиси/отт для эффективного гидролиза различных целлюлозосодержащих субстратов.

Научная новизна работы. Впервые выделены целлобиогидролаза ЦБГ II 60 кДа и эндоглюканаза ЭГ I 70 кДа из Р. \еггиси1озит, исследованы их биохимические и физико-химические свойства в сравнении с остальными целлобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента. На основе анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей ЦБГ I, ЦБГ И, ЭГ II 39 кДа и р-глюкозидаза 116 кДа классифицированы по их принадлежности 7-й, 6-й, 5-й и 3-й семьям гликозид-гидролаз соответственно. Выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активном центре перечисленных выше ферментов. Разработан подход для создания ферментных смесей для глубокого гидролиза различных лигноцеллюлозных субстратов.

Практическая значимость работы. Усовершенствована схема аналитического разделения ферментов Р. уеггисиЬяит, основанная на использовании высокоэффективной белковой хроматографии среднего давления. Выделены и исследованы высокоактивные целлобиогидролаза ЦБГ II и эндоглюканаза ЭГ I Р. \erruculomm, способные осуществлять глубокую деструкцию лигноцеллюлозных материалов. Выявлены «ключевые» целлюлазы Р. \erruculosum, ответственные за эффективный гидролиз целлюлозного сырья. Продемонстрирована принципиальная возможность создания смесей на основе ферментов из Р. \erruculosum для эффективного осахаривания различных видов целлюлозосодержащих отходов. Показано превосходство гидролитической эффективности искусственно составленных композиций из целлюлаз Р. уеггиси\о$ыт не только над ферментными препаратами Р. уеггиЫозит и Т. гееяег, но и над искусственными смесями, составленными из наиболее активных индивидуальных целлюлаз Т. гееэе1 и СИгувозрогшт 1искпсмеп$е. Предложены способы увеличения выхода глюкозы при осахаривании лигноцеллюлозных материалов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях "Биокатализ-2007" (Москва -Санкт-Петербург, 2007), "Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях" (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора (две главы); отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены результаты и их обсуждение; выводов; списка литературы, содержащего 183 ссылки на

публикации в отечественных и зарубежных журналах, и приложения. Объем диссертации составляет 159 страниц и включает 63 рисунка и 24 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор посвящен описанию состава и структуры целлюлозосодержащих материалов, а также способам предобработки лигноцеллюлозной биомассы. Подробно рассматриваются вопросы, связанные с особенностями молекулярного строения и субстратной специфичностью целлобиогидролаз и эндоглюканаз. Особое внимание уделено обсуждению механизма действия целлюллазного комплекса и факторов, влияющих на его эффективность. Рассмотрены методы ферментативной конверсии целлюлозосодержащих материалов в этанол. Представлен современный взгляд на вопрос о возможности реализации программы по производству биоэтанола в России, а также описаны достижения и опыт других стран. В заключительной части характеризуется штамм Р. хеггиси1отт и приводится анализ ферментов, входящих в его состав

Отдельная глава посвящена описанию использованных в работе методов исследования, в ней приводится также список субстратов, реактивов, ферментов и ферментных препаратов.

В последующих главах изложены результаты исследований и их обсуждение. Необходимо отметить, что на основе впервые полученных аминокислотных последовательностей целлобиогидролаз (ЦБГ I и II), эндоглюканазы II 39 кДа (ЭГ II 39 кДа) и Р-глюкозидазы 116 кДа (БГЛ 116 кДа) Р. уеггисиЬзит были определены их структурные домены, а также аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах перечисленных ферментов.

1. Выделение и очистка ферментов целлюлазного комплекса Р. verruculosum

Ферменты целлюлазного комплекса выделяли из препарата Р. геггисиЬянт В221-151 с помощью различных видов хроматографии (ионообменной, гидрофобной), используя систему РРЬС. В результате были выделены 5 эндоглюканаз - ЭГ III 25 кДа, ЭГ II 33 кДа, ЭГ II 39 кДа, ЭГ I 52 кДа и ЭГ I 70 кДа, причем ЭГ I 70 кДа выделенна впервые; 4 целлобиогидролазы - ЦБГ I 66 и 55 кДа, ЦБГ II 60 и 50 кДа, причем ЦБГ II 60 кДа выделена впервые; две ксилоглюканазы 25 и 70 кДа (КГ); ксиланаза 23 кДа (Ксил); Р-глюкозидаза 116 кДа (БГЛ). По результатам ДДС-электрофореза (рис. 1) и изоэлектрофокусирования ферменты были гомогенными.

Все выделенные ферменты Р. хеггиси1о$ит были идентифицированы методом масс-спектрометрии.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М

- 116

"- 97 66

45 36

29 24

Рисунок 1. ДДС-электрофорез основных очищенных ферментов Р. \errucuhsum. 1 - ЦБГ If 60 кДа, 2 - ЦБГII 50 кДа, 3 - ЭГ 111 25 кДа, 4 - Ксил ¡1 23 кДа, 5 - ЦБ Г I 55 кДа, 6 - ЭГ ¡1 33 кДа. 7 - ЦБГ I 66 кДа, 8 - БГЛ ! 16 кДа, 9 - ЭГ 1 52 кДа. 10 - ЭГ I 70 кДа, П - КГ 70 кДа, 12 - ЭГ II 39 кДа, 13 - КГ 25 кДа.

2. Масс-спектрометрический анализ целлобногидролаз, эндоглюканаз и р-глюкозидазы P. verruculosum и их аминокислотные последовательности

Для идентификации и классификации ферментов P. verruculosum использовали метод MALDI-TOF масс-спектрометрии, в результате чего для выделенных белков были получены пептидные «фингерпринты» белков. Далее в белковых базах данных (SWISS-PROT, NCBI, MSDB) был проведен поиск белков, дающих пептиды с идентичными молекулярными массами.

Масс-спектрометрическим анализом пептидных фингерпринтов установлено, что ЦБГ 1Г 60 и 50 кДа являются изоформами одного и того же фермента, гомологичного целлобиогидролазе II Acremonium celhtlolyticus Y-94. Масс-спектры трипсиновых гидролизатов белков с молекулярными массами 52 и 70 кДа были практически идентичными, что позволило утверждать - это изоформы одного и того же фермента. Для них в базах данных не удалось обнаружить аналогичных белков. Ранее в нашей лаборатории методом тандемной (TOF-TOF) масс-спектрометрии с последующим поиском в белковых базах данных с помощью программы BLAST было установлено, что белок с массой 52 кДа принадлежит 7-й семье гликозид-гидролаз, поэтому эндоглюканаза с более высокой молекулярной массой была идентифицирована как эндоглюканаза 7-й семьи гликозид-гидролаз - ЭГ I 70 кДа. Подобным образом были идентифицированы все остальные выделенные ферменты.

В табл. I суммированы биохимические и физико-химические характеристики очищенных целлюлаз P. verruculosum. Следует отметить, что из всех целлюлаз только ЦБГ II 60 кДа, ЦБГ I 66 кДа и ЭГ I 70 кДа обладали целлюлозосвязывающим модулем (ЦСМ), в то время как у остальных ферментов такой модуль отсутствовал, т.е. они состояли только из каталитического домена. Отсутствие ЦСМ было установлено экспериментами по адсорбции ферментов на микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), а также с помощью ограниченного протеолиза выделенных целлобногидролаз и эндоглюканаз папаином (см. раздел 3).

Фермент Молек. масса, кДа Pi Семья гликозид-гидролаз Систематическое название Наличие ЦСМ

ЦБГ I вм* 66 4.6 7 Се)7Л да

ЦБГ1нм 55 3.7 7 Се17А нет

ЦБГ II вм 60 4.6 6 Се16А да

ЦБГ И н м 50 4.2 6 CelöA нет

ЭГ 11 39 2,0 5 Се15А нет

БГЛ 116 4,6 3 Се13А н/о

ЭГ I вм 70 4 7 Се17В да

ЭГ I нм 52 3,4 7 Се17В нет

ЭГ И 33 4,1 5 CelSB нет

ЭГ Ш 25 5,6- 12 Се112А нет

* нм и вм - низкомолекулярная и высокомолекулярная форма фермента соответственно, н/о - не определено

Путем прямой трансляций с соответствующих генов были получены аминокислотные последовательности ЦБГ II и ЦБГ I, ЭГ II 39 к Да и БГЛ 116 кДа P. verruculosum, далее мы проверяли соответствие пептидных «фингерпринтов» этим аминокислотным последовательностям с помощью программы FindPept (http://cn.cxpasy.org/tools/). Необходимо отметить, что молекулы белков ЦБГ I и II, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа обеднены остатками Lys и Arg. Поэтому в результате гидролиза трипсином образуются тяжелые пептиды со значениями молекулярных масс более 4000 m/z, которые не регистрируются прибором, и степень покрытия аминокислотной последовательности белков не превышает 30%. Белок принято считать надежно идентифицированным, если по данным масс-спектрометрии удается обнаружить не менее 4-5 специфических «трипсиновых» пептидов, согласующихся с аминокислотной последовательностью белка, и эти пептиды покрывают не менее 15% последовательности. Например, специфические пептиды из двух форм ЦБГ II покрывали 23,8% полной аминокислотной последовательности белка, при этом 9 пептидов (из них 7 общих для данных форм фермента с одинаковым значением m/z в диапазоне молекулярных масс 743,4-3290,3), соответствовали теоретически возможным специфическим «трипсиновым» пептидам из аминокислотной последовательности белка.

Далее в базе данных SwissProt (UniProtKB) с помощью программы BLAST2 (http ://kr.expasv. org/tool s/blast/) был проведен поиск белков, гомологичных изучаемым ЦБГ II и ЦБГ I, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа P. verruculosum. Гомологичные белки, найденные для каждого фермента, представлены в таблице 2. Впервые удалось установить принадлежность БГЛ 116 кДа к 3-й семье гликозид-гидролаз.

Путем сравнения (выравнивания) аминокислотных последовательностей изучаемых белков с ферментами, для которых известны их структуры, можно было выявить местоположение основных структурных доменов (модулей) в молекулах ферментов P. verruculosum. Найденные таким образом структурные

модули ЦБГ II и ЦБГ I, ЭГ II 39 кДа приведены в табл. 3. Несмотря на то, что в базах данных имеется значительное количество аминокислотных последовательностей |3-глюкозидаз 3-й семьи гликозид-гидролаз, нет практически никакой информации об их кристаллической структуре. Поэтому структурные домены БГЛ 116 кДа выявлены не были.

Таблица 2. Результаты BLAST-анализа для целлюлаз P. vermculosvm.

Ферменты Р. verruculosum Гомологичные белки UniProtKB Степень идентичности

ЦБГ II 60 кДа ЦБГ И Acremonium cellulolyticvs Y-94 ЦБГ II Aspergillus fumigatus ЦБГ II Т. reesei' 093837 Q4WFK4 P07987 84% 71% 58%

ЦБГ I 66 кДа ЦБГ I P.funiculosum ЦБГ I Talaromyces emersonii ЦБГ I T. reesei" Q8WZJ4 Q8TFL9 P62694 83% 67% 57%

ЭГ И 39 кДа ЭГ II Т. emersonii ЭГ II Thermoascus aurantiacus Q8WZD7 Q8TG26 74% 69%

БГЛ 116 кДа БГЛ A. fumigatus БГЛ Т. reesei Q4WGT3 Q12715 66% 60%

* Для белков, помеченных звездочкой, известна их кристаллическая структура.

Таблица 1. Предполагаемые структурные домены целлюлаз P. verruculosum.

Структурная Се16А Се17А Се15А

единица № остатков

Каталитический домен 72-437 1-441 1-313

Линкер 37-71 442-456 -

ЦСМ 1-36 457-500 -

ЦСМ всех известных грибных целлюлаз относятся к первой семье полисахарид-связывающих модулей (http://www.cazy.org/fam/CBMl .html): ЦСМ этой семьи обычно состоят из 36 аминокислотных остатков, включая, как правило, 4 консервативных остатка цистеина, которые образуют две S-S связи. Именно такая структура у ЦСМ ЦБГ II и ЦБГ I Р. verruculosum.

Пептидные линкеры ЦБГ II и ЦБГ I содержат много остатков Ser, Thr, и, вероятно, сильно О-гликозилированы. Этим можно объяснить различие теоретических и экспериментальных масс белков. Заметной гомологии линкеров ЦБГ II и ЦБГ I с соответствующими участками молекул других ЦБГ не обнаружено.

Поскольку из литературных данных известны ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активном центре целлобиогидролаз 6-й и 7-й семьи и эндогяюканаз 5-й семьи, оказалось возможным определить соответствующие остатки в молекулах ЦБГ И и ЦБГ I и ЭГ II 39 кДа Р. verruculosum, анализируя при этом выравненные аминокислотные последовательности белков и сравнивая трехмерные модели ферментов Р. verruculosum с известными кристаллическими структурами. Наиболее важные аминокислоты абсолютно консервативны, включая каталитическое трио Asp-Asp-Asp у ферментов 6-й семьи, Glu-Asp-Glu - 7-й

семьи и диаду Glu-Glu у эндоглюканазы 5-й семьи, а также остатки триптофана, осуществляющие т. н. «стэкинг-взаимодействие» с гликозидными кольцами молекул целлюлозы внутри «туннеля» активного центра ферментов.

Следует отметить, что в результате сравнительного моделирования трехмерных структур каталитических доменов ЦБГ II и ЦБГ I было установлено, что расстояние между петлями, образующими «туннель» -характерную особенность активного центра целлобиогидролаз, в ЦБГ II больше по сравнению с ЦБГ I P. vcrrucidosum, и они не полностью закрывают «ущелье» активного центра, по-видимому, оставляя возможность проникновения полимерной цепи глюкана в «туннель» не с конца молекулы, а напрямую (по типу действия эндоглюканаз). Такое строение активного центра ЦБГ II, вероятно, объясняет наличие КМЦазной активности у этого фермента (см. раздел 3).

3. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз P. verruculosum.

3.1. Субстратная специфичность. Для всех выделенных целлюлаз P. verruculosum была определена активность по отношению к широкому кругу субстратов (табл. 4).

Все эндоглюканазы P. veiracidosam обладали высокими активностями по отношению к КМЦ и ß-глюкаиу, причем наибольшими активностями характеризовались ЭГ I 70 кДа и 52 кДа и ЭГ II 33 кДа. Значение КМЦазной активности, измеренной вискозиметрическим методом, для ЭГ II 33 кДа, ЭГ II 39 кДа и ЭГ III 25 кДа было значительно выше, чем для ЭГ 1 70 кДа и 52 кДа. Это свидетельствует о менее упорядоченном типе действия ЭГ II и ЭГ III на полимерный субстрат по сравнению с ЭГ I. ЭГ I 70 кДа и 52 кДа обладали активностью к ксилоглюкану, причем она превышала активность к ß-глюкану примерно в два раза. Такая особенность характерна и для ЭГ I Т. reesei. Наличие такой активности объясняется строением активного центра молекул ферментов. Наибольшее число сайтов связывания остатков глюкозы у ЭГ I -7, у ЭГ II их меньше - 5. Боковые заместители (карбоксиметильные группы у КМЦ или олигосахаридные разветвления у ксилоглюкана), взаимодействуя с этими сайтами, координируют субстрат для каталитической атаки.

ЭГ II 33 кДа обладала активностью по отношению глюкуроноксилану. Обе ЭГ II имели крайне низкую активность к МКЦ. В отличие от них, обе ЭГ I проявляли значительную (для эндоглюканаз) авицелазную активность, причем наибольшая была у ЭГ 1 70 кДа. Как будет показано ниже, в структуру ЭГ I 70 кДа входит ЦСМ, вследствие чего этот белок может специфически связываться с субстратом и совершать большее количество гидролитических актов из-за увеличения эффективной концентрации фермента на поверхности целлюлозы.

Эндоглюканазы 7-й семьи гликозид-гидролаз отщепляли лактозу и целлобиозу от соответствующих я-НФ-производных.

Целлобиогидролазы Р. verruculosum ЦБГ I и ЦБГ II обладали высокой активностью к МКЦ, сравнимой с этой активностью для соответствующих

целлобиогидролаз из Т. гее5ег. Ферменты, содержащие ЦСМ (ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа), обладали большей авицелазной активностью, чем белки без ЦСМ. Активности к МКЦ у высоко- и низкомолекулярной форм ЦБГ I различались в 1,4 раза, для ЦБГ II такое различие было незначительным. В отличие от них для целлобиогидролаз Т. гее$е1 такое различие было более существенным - в 2-2,5 раза. Удельные активности целлобиогидролаз Р. меггисиЬтт по отношению к КМЦ и р-глюкану, как и следовало ожидать, были небольшими (1,5-3,2 ед/мл), причем для ЦБГ II эти значения были выше, чем для ЦБГ I, что объясняется особенностями строения ферментов.

Таблица 4. Биохимические характеристики и субстратная специфичность целлюлаз Р. УеггисШояит.

ЦБГ II 60 ЦБГ II 50 ЦБГ 166 ЦБГ 155 ЭГ 170 ЭГ 152 ЭГ 11 39 ЭГ II 33 ЭГ III 25 БГЛ 116

р1 4,6 4.2 4,6 3.7 4,0 3.4 2.0 4,1 5.6 4,6

Семья гликозид-гидролаз 6 6 7 7 7 7 5 5 12 3

Систематическое название Сс16 А Се16 А Се17 А Се17 А Сс17 В Се17 В Се15 А Се15 В СеИ 2А Се13 А

Доля секретируемого белка. % 17 17 20 15 <1 3 3 5 2 4

Удельная активность (ед/мг) к различным субстратам, рН 5,0

КМЦ (ВС) 2,0 1.5 О.Ю 0.10 98 94 48 86 56 15

Р-Глюкан 3,2 2 0,10 0,10 81 79 56 90 62 38

КМЦ (вискозим.) 0,20 0,10 0,10 0.10 2,8 3.4 20 17 18 0

МКЦ 0,20 0.19 0.21 0,15 0,02 0.01 <0,01 <0,01 <0,01 <0.01

Глюкуроноксилан 0 0 0 0 0 0 0 29 0,50 0

Ксилоглкжан 0 0 0 0 145 146 0 0 0 0

л-НФ-р-Э-Целл 0 0 0,014 0.011 0,37 0,34 I о 0 0 45

п-НФ-Р-Э-Лак 0 0 0.018 0,014 0,29 0 0 0 0

и-НФ-Р-Р-Глгок 0 0 0 0 0 0 0 0 0 65

Глубина гидролиза МКЦ. % (рН 5.0. [МКЦ]=5 г/л. 40=С. 96 ч) 54 44 66 34 20 16 9 11 10 3

Продукты гидролиза МКЦ С2* 02 02 С2 С:С2 (8:2) о-.а (8:2) в.'02 (3:7) 0:02 (4:6) 0:02 (6:4) 0**

* 02- целлобиоза, ** в - глюкоза

Активность к синтетическим хромогенным производным целлобиозы и лактозы проявляли только целлобиогидролазы 7-й семьи гликозид-гидролаз. Наличие или отсутствие ЦСМ не влияло заметным образом на активность. При этом для ЦБГ I Р. уеггисиЬзит значения активности к и-НФ-р-О-Целл и л-НФ-Р-О-Лак были ниже, чем для ЦБГ I из Т. гее$е/.

3.2. Кинетические параметры гидролиза КМЦ и р-глюкана эндоглюканазами (Кт и Утах) были определены из зависимотей начальных скоростй реаций (при 50°С и оптимальных значениях рН) от концентрации субстрата (табл. 5). С учетом концентрации белка в реакционной смеси и молекулярных масс ферментов из значений У„шх были рассчитаны каталитические константы (ксШ). Из-за невозможности определить молекулярную массу субстрата К,„ выражали в г/л.

При гидролизе КМЦ ЭГ I 70 кДа характеризовалась высоким значением кса, и низким значением К,„ по сравнению с остальными ферментами. Для ЭГ II

33 кДа наблюдалось наименьшее значение К,„ и достаточно высокое значение кш. Для обеих эндоглюканаз отношение кса1/К„, было близкое.

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза КМЦ и Р-глюкана, катализируемого эндоглюкаиазами Р. гст/сч/отт.__

Систематическое название КМЦ (?-Глюкан

/С„„ г/л к с'1 Кт, т/л П с

ЭГ 1 70 кДа Се17В 3,62 ± 0,30 109 ±2 0,52 ± 0.08 116 ±2

ЭГ I 52 кДа Се17В 4.28 ±0,31 120 ± 3 1.1 + 0,1 122 ± 2

ЭГ И 34 кДа Се15А 6,50 = 0,48 35 ± 3 22,8 ±0,2 152 ± 2

ЭГ II 33 кДа Се15В 2,40 ±0,14 48 ±4 24,4 ± 0,2 282 ±4

При гидролизе Р-глюкана для всех эндоглюканаз значения ксш были выше, чем при гидролизе КМЦ. Значения Кт значительно отличались от соответствующих констант, характеризующих гидролиз КМЦ. Для ЭГ II 39 кДа и 33 кДа увеличение каталитических констант не вызвало изменения отношения кса,/Кт; это говорит о том, что для гидролиза эндоглюкаиазами 5-й семьи гликозид-гидролаз данные субстраты не очень заметно отличаются. Отметим, что эти эндоглюканазы слабее связывались с (3-глюканом, чем с КМЦ. (З-Глюкан состоит из остатков глюкозы, связанных между собой [3-1,4 и (3-1,3-связями в соотношении 3:1, поэтому можно утверждать, что присутствие (3-1,3-связей в субстрате значительно снижает связывание с ним этих эндоглюканаз.

Для ЭГ I 70 кДа и 52 кДа при гидролизе р-глюкана были получены близкие значения кса„ при этом К,„ для ЭГ 1 70 кДа была в два раза ниже, чем для ЭГ I 52 кДа, и в семь раз ниже, чем Кт при гидролизе КМЦ. В молекуле КМЦ в среднем на ' каждые 10 остатков глюкозы приходится одна карбоксиметильная группа, которая, вероятно, препятствует эффективному связыванию субстрата в активном центре ЭГ I.

3.3. Адсорбционные характеристики. Способность целлюлаз к адсорбции на МКЦ зависит от наличия или отсутствия у них ЦСМ. В качестве адсорбционных характеристик изучаемых ферментов были определены степень их адсорбции на МКЦ и коэффициенты распределения (Кр) ферментов между поверхностью нерастворимого субстрата (МКЦ) и водной фазой.

Кр (л/г) рассчитывали как отношение адсорбированного и находящегося в растворе фермента на участке линейности изотермы адсорбции. Его определяли по тангенсу наклона прямой, построенной в координатах ([Е]()/[Е]; [Б]), где [Е]0 - содержание фермента (или его активность) в исходном растворе фермента, [Е] - содержание фермента (или активность) в супернатанте после адсорбции, [Б] - концентрация МКЦ. Чем больше Кр, тем сильнее связывание фермента с субстратом. Адсорбцию проводили в течение 15 мин при 40°С, рН 5,0, концентрацию МКЦ варьировали от 5 до 40 г/л, концентрация ферментов при этом составляла 0,2 г/л. Полученные коэффициенты распределения приведены в табл. 6.

Условия эксперимента при определении степени адсорбции белка (%) были отличными от условий определения коэффициента распределения: 4°С, рН 5,0, концентрация ферментов - 0,1 г/л (белок по Лоури), концентрация МКЦ - 25 г/л, время адсорбции - 30 мин. Степень адсорбции определяли по разнице между исходной концентрацией белка и его концентрацией после адсорбции. Степень адсорбции выражали в процентах (табл. 6).

Таблица 6. Коэффициенты распределения и степень адсорбции целлобиогидролаз и эндоглюканаз на МКЦ. _____,__

Параметр ЦБГ I ЦБГ 11 ЭГ 1 эгн ЭГ II ЭГ III

66 кДа 55 кДа 60 кДа 50 кДа 70 кДа 52 кДа 39 кДа 33 кДа 25 кДа

К'„. л/г 0.68 0.11 0,27 0.006 ^ 0,23 0,002 0.001 <0,001 0,005

Степень адсорбции, % 88 48 82 30 88 9 7 6 36

Натичие ЦСМ + - + - + - - - -

Полученные данные свидетельствуют о том, что из всех эндоглюканаз только у ЭГ I 70 кДа, характеризовавшейся высокой адсорбционной способностью, в структуре белка имеется ЦСМ. Изучаемые целлобиогидролазы также значительно различались по адсорбционной способности: ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа в большей степени связывались с МКЦ, благодаря наличию в их структуре ЦСМ. Как и следовало ожидать, ЦБГ I 55 кДа и ЦБГ II 50 кДа более слабо сорбировались на МКЦ и состояли только из каталитического домена.

3.4. Ограниченный протеолиз ферментов папаином. В условиях ограниченного протеолиза папаином обычно гидролизустся область линкера, соединяющая каталитический и целлюлозосвязывающий домены фермента. Ограниченный протеолиз ЦБГ I 66 кДа и ее формы с более низкой молекулярной массой приводил к уменьшению массы ЦБГ I 66 кДа, в то время как масса ЦБГ I 55 кДа оставалась Неизменной (рис. 2). При этом белковая полоса, отображающая подвергшуюся протеолизу ЦБГ I 66 кДа, частично стала соответствовать полосе ЦБГ I 55 кДа. Аналогичная картина наблюдалась для ферментов ЦБГ II 60 кДа и 50 кДа и ЭГ I 70 кДа и 52 кДа.

5 6 М

— 116 Рисунок 2. Ограниченный протеолиз ^ -с целлобиогидролаз и эндоглюканаз:

1 - ЦБГ I 55 кДа, 2 - ЦБГ I 66 кДа. " _ 45 3 - ЦБГ П 50 кДа. 4 - ЦБГ II 60 кДа,

5 - ЭГ I 52 кДа. 6 - ЭГ 1 70 кДа.

О о

— 25

В ходе протеолиза происходило уменьшение активности ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа по отношению к МКЦ, хотя их активности по КМЦ и и-НФ-Р-Б-Целл (для ЦБГ I 66 кДа и ЭГ I 70 кДа) не менялись, т.е.

116 66

45 35 25

М 1 2 3 4

целлюлазы, лишенные ЦСМ, сохраняют свою активность по отношению к растворимым субстратам, но обладают существенно более низкой активностью по отношению к нерастворимой целлюлозе (МКЦ). Полученные данные подтверждают, что ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа имеют двудоменную структуру.

3.5. Влияние температуры н рН на активность и стабильность целлюлаз. В табл. 7 приведены некоторые физико-химические свойства выделенных целлюлаз.

Таблица 7. Физико-химические свойства целлюлаз Р. \erniculomm.

ЦБГ II 60 ЦБГ 11 50 ЦБП 66 ЦБП 55 ЭГ1 70 ЭГ1 52 ЭГП 39 ЭГП 33 ЭГШ 25 БГЛ 116

рН-оггтимум 4 4 4 4 4,5 4.5 4.5 3,5 4 5.5

рН5С% 2,2-5,5 2-5.5 2-5,5 2-4.5 3,7-6 3,5-6 3.4-6 3-6,3 3-5.5 4.5-6.5

Т-оптимум 70 70 60 60 67 67 75 75 55 60

т*-._________ . 50-82 50-80 45-67 45-67 56-74 53-74 40-85 45-85 35-65 40-80

Остаточная активность после 3 ч инкубации. 50°С рН 5.0 100 100 100 100 92 92 93 95 90 100

рН 6.0 90 90 90 80 70 60 70 80 70 70

Остаточная активность после 3 ч инкубации, 60°С. рН 5.0 59 45 60 44 37 31 70 87 н/о н/о

Влияние рН среды на способность целлюлаз гидролизовать специфические субстраты - МКЦ в случае целлобиогидролаз и (3-тлюкан в случае эндоглюканаз - изучали при 40 и 50°С соответственно. Все ферменты имели рН-оптимумы активности в области рН 3,5-4,5. Для целлобиогидролаз оптимальным было значение рН 4,0, такое же было у ЭГ III 25 кДа, для ЭГ I 70 кДа и 52 кДа и ЭГ II 39 кДа - 4,5. ЭГ II 33 кДа характеризовалась более низким оптимальным значением рН - 3,5. Кроме того, она имела самый широкий диапазон значений рН, в котором сохраняла более половины от своей максимальной активности (рН5о»,ь), - от 3 до 6,3. Для БГЛ 116 кДа значение оптимального рН было самым высоким - 5,5.

Эндоглюканазы характеризовались температурным оптимумом, лежащим в области более высоких значений по сравнению с целлобиогидролазами. Температурные профили активности ЦБГ 6-й семьи и ЭГ 5-й семьи гликозид-гидролаз были сдвинуты в область более высоких температур по сравнению с таковыми для ЦБГ и ЭГ 7-й семьи соответственно. Все целлобиогидролазы и эндоглюканазы, как и большинство грибных целлюлаз, обладали высокой стабильностью при 50°С и значении рН 5,0. При увеличении значения рН до 6,0 (50°С) эти ферменты теряли 20-40% активности. ЦБГ I 55 кДа, ЦБГ II 50 кДа и ЭГ I 52 кДа, состоящие только из каталитического домена при повышенных температурах (рН 5,0) оказались менее стабильными по сравнению с их высокомолекулярными формами. По-

видимому, стабилизирующий эффект в полноразмерных формах целлюлаз оказывает гликозилированный линкер.

3.6. Выявление ключевых гидролитических ферментов. Для

глубокого гидролиза целлюлозосодержащих материалов необходимо разрушить высокоупорядоченную (кристаллическую) форму целлюлозы. Для выявления ключевых ферментов, способных осуществлять деструкцию кристаллической целлюлозы с образованием растворимых Сахаров, проводили гидролиз МКЦ индивидуальными целлобиогидролазами и эндоглюканазами. Для того чтобы исключить возможное ингибирование целлобиозой, процесс осуществляли в условиях избытка гомогенной целлобиазы (Р-глюкозидазы) А. ]'орошая. На рис. 3 представлены кинетические кривые образования глюкозы из МКЦ под действием индивидуальных ферментов.

40 60 ВО 100 и ^ 40 60 80 100

Время, ч Время, ч

Рисунок 3. Кинетические кривые образования глюкозы из МКЦ (5 г/л) очищенными целлобиогидролазами и эндоглюканазами (20 мг/г субстрата) в присутствии БГЛ 120 кДа А. japonicus (0,14 мг/г субстрата) при 40°С и pH 5,0.

Среди целлобиогидролаз наибольшая глубина гидролиза наблюдалась в случае ЦБГ I 66 кДа: через 4 суток образовалось 3,6 г/л глюкозы, что соответствует 66% конверсии целлюлозы. ЦБГ II 60 кДа была менее эффективна: выход глюкозы составил 3 г/л (или 54% конверсии целлюлозы). Целлобиогидролазы без ЦСМ (ЦБГ I 55 кДа и ЦБГ II 50 кДа) проявили относительно небольшую гидролитическую способность: через 4 суток содержание глюкозы не превышало 1,9 и 2,4 г/л соответственно (или 34% и 44% конверсии МКЦ).

Эндоглюканазы обеспечивали меньшую глубину гидролиза МКЦ, причем наибольший выход глюкозы наблюдали в случае ЭГI 70 кДа - 1,1 г/л (или 20% глубины гидролиза). Как и следовало ожидать, остальные эндоглюканазы, не содержащие ЦСМ, менее эффективно разрушали целлюлозу: для них степень конверсии составляла 9-16%. Отметим, что при гидролизе МКЦ БГЛ 166 кДа через 4 суток содержание глюкозы в реакционной смеси составило 0,15 г/л, или 2,7% от максимально возможного.

Следовательно, ЦБГ I 66 кДа и ЦБГ II 60 кДа наряду с ЭГ I 70 кДа представляют «ключевые» ферменты для осахаривания кристаллических форм целлюлозы.

4. Создание ферментных комплексов для эффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов

Данный раздел посвящен сравнению осахаривающей способности целлюлазных комплексов, продуцируемых различными штаммами Тг1с1юс1егта 5р. и Р. хеггисиЬзит, а также выявлению факторов, оказывающих влияние на эффективность ферментативного гидролиза. В табл. 8 приведены активности использованных ферментных препаратов.

Таблица 8. Активности ферментных препаратов, использованных для гидролиза целлюлозосодержащих материалов, по отношению к разным субстратам (ед'г препарата).

Препарат

Источник

Белок, м г/г

ФБ

5 ОТ

МКЦ

КМЦ

40°С

50°С

/гНФГ

40"С

Целло-биоза

40°С

Ксилан

50'С

В221-151

P. xerrucubsuni

826

760

578

15116

1404

603

25028

FIO

775

TW-307

Целловиридин Г20х

BioACE

Spezyme CP

580

224

147

383

193

Multifect XL ¡Novozym 188

T. reesei

A. m'ger

119

156.5

49 127

99

853_ 406

4573

35263

46663

620

10672

116

70

5162

45

4838

60

29

627

60

881

12

14

107

297

3427

30

1002

63

21 140

608

10500 51

4.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз. Гидролиз МКЦ. На рис. 4 представлены результаты ферментативного гидролиза МКЦ (50 г/л) под действием ферментных препаратов P. verriiculosum (В221-151, FIO), Т. reesei (TW-307, BioACE, Spezyme CP). Содержание белка целлюлазных препаратов в реакционной среде составляло 5 мг/г субстрата. Существенное влияние на эффективность ферментативного осахаривания целлюлозы оказывает Р-глюкозидаза, увеличивая концентрацию глюкозы в реакционной среде и уменьшая концентрацию целлобиозы, которая является сильным ингибитором целлюлолитических ферментов, особенно целлобиогидролаз. Поэтому в экспериментах лабораторные целлюлазные препараты P. verruculosum В221-151 и Т. reesei TW-307 использовались не только в индивидуальном виде, но и в смеси с (3-глюкозидазным препаратом Р. verruculosum F10, а коммерческие BioACE и Spezyme CP - с ¡3-глюкозидазным препаратом Novozym 188 (в обоих случаях дозировка белка (З-глюкозидазного препарата составляла 1,5 мг/г субстрата).

Наиболее высокий выход восстанавливающих Сахаров (ВС) при гидролизе МКЦ (72 ч) в отсутствие дополнительного количества (3-глюкозидазы обеспечивал препарат Р. verruculosum В221-151, все препараты Т. reesei обладали меньшей осахаривающей способностью. В присутствии дополнительного количества р-глюкозидазы (Novozym 188 или Р. verruculosum FIO) происходило увеличение содержания ВС в реакционной

среде в 1,7-3 раза. При этом наиболее эффективно гидролизовали МКЦ смеси лабораторных целлюлазных препаратов P. verruculosum В221-151 и Т. reesei TW-307 с Р-глюкозидазным препаратом Р. verruculosum FIO, Отметим, что вклад ¡3-глюкозидазы наиболее заметен в случае препарата Т. reesei TW-307, для которого скорость гидролиза на начальном этапе (3 ч) возросла в 5 раз, для остальных препаратов - в 2,1-2,5 раза. Смеси коммерческих препаратов целлюлаз в присутствии р-глюкозидазы образовывали на 2-4 г/л ВС меньше, чем смеси соответствующих лабораторных препаратов.

Рисунок 4. Ферментативный гидролиз МКЦ (50 г/л) под действием различных

препаратов целлюлаз (белок - 5 мг/г субстрата) в отсутствие и в присутствии Р-глюкозидазных препаратов (белок - 1,5 мг/г субстрата в реакционной среде) при 50"С и рН 5,0.

Гидролиз предобработанных паровым взрывом стеблей кукурузы (ПСК) и делигнифицированных после парового взрыва стеблей кукурузы (ДСК). Нами были использованы стебли кукурузы, предобработанные паровым взрывом (ПСК), а также подвергнутые после парового взрыва дополнительной делигнификации с помощью щелочной обработки (ДСК). Мы сравнивали эффективность действия четырех целлюлазных препаратов: коммерческих - BioACE и Spezyme CP и лабораторных - P. verruculosum В221-151 и Т. reesei TW-307 (без добавления препаратов р-глюкозидазы).

Через 72 ч ферментативного гидролиза как ПСК, так и ДСК наибольший выход ВС и глюкозы наблюдали в случае препарата Р. verruculosum В221-151 (рис. 5). Из препаратов на основе Т. reesei лучшей осахаривающей способностью характеризовался Spezyme СР. Реакционная способность ДСК (определенная по конечному выходу ВС) при гидролизе всеми ферментными препаратами была несколько выше, чем у ПСК, поскольку содержание лигнина в ПСК составляло 30%, в ДСК - 16%. В случае препаратов на основе Т. reesei, особенно TW-307, обедненного р-глюкозидазой, среди растворимых продуктов гидролиза, кроме глюкозы, наблюдали высокое содержание целлобиозы. Поэтому на следующем этапе к данным препаратам добавляли Р-глюкозидазу (Novozym 188 или Р. verruculosum FIO) в количестве 1,5 мг белка на 1 г субстрата. В результате этого выход глюкозы при действии препарата TW-307 на ДСК увеличился в 3,2 раза, на ПСК - в 3 раза, для других препаратов - в 1,6-2 раза (рис. 6). В присутствии дополнительного количества р-глюкозидазы препарат Р. verruculosum В221-151 был эффективнее остальных. Максимальная степень конверсии целлюлозы в ДСК составляла 57%, в ПСК - 55%) (от теоретического).

- О - В221-151 -О—В221-151 »F10

■ TW-3C7 ....V-.-TW-307 «-F10 ■■ - - - ВвАСЕ ---- - ВкАСЕ + NZ183

- - - - Spezyme CP

—û—Spezyme CP + NZ 1

и я : 3221-151 + FIO TUV-307 + F10 BioACE t N2 Spezyme CP +

лек ДСК 188 NZ188

Рисунок 5. Выход глюкозы и ВС через 72 ч Рисунок 6. Выход глюкозы через 72 ч гидролиза ПСК и ДСК (50 г/л) под действием ™лролиза ПСК и ДСК (50 г/л) под действием различных препаратов пеллюлаз (белок - 5 Различных препаратов целлюлаз (белок - 5 мг/г субстрата) при 50°С и рН 5,0. мг/г субстрата) в присутствии (3-глюкозидазы

Novozym 188 или Р. verntciilusiim FIO (1,5 мг/г субстрата) при 50°С и рН 5,0.

Гидролиз пергамента, свекловичного жома, пшеничных отрубей, рисовой шелухи и обессмоленных измельченных сосновых опилок. Для

увеличения реакционной способности лигноцеллюлозной биомассы требуется предварительная обработка, направленная на разрушение кристаллической структуры целлюлозы и полное или частичное удаление лигнина. Отходы целлюлозно-бумажной промышленности - обрезки пергамента - это ценный источник предобработанной целлюлозы (с содержанием целлюлозы более 95%), волокна которой в результате химической обработки потеряли кристалличность и стали доступными для целлюлолитических ферментов.

Сосновые опилки (СО) были измельчены на мельнице механоактиваторного типа. В зависимости от способа и степени измельчения СО разделялись на четыре вида (I-IV): I - не измельченные СО, II, III -степень измельчения различной интенсивности, IV - очень тонкий порошок СО. Такой способ измельчения приводит к значительному уменьшению размера частиц субстрата и увеличению его поверхности, уменьшает степень кристалличности субстрата, а также позволяет создавать реакционные смеси с большой плотностью измельченного субстрата.

Кроме того, использовали свекловичный жом, отмытые от крахмала пшеничные отруби и рисовую шелуху. Мы провели сравнительное исследование эффективности гидролитического действия отечественного коммерческого ферментного препарата Целловиридина Г20х, полученного на основе T. reesei, и лабораторного препарата P. verruculosum В221-151 при разных дозах белка - 2, 5 и 10 мг/г субстрата. К целлюлазным препаратам добавляли дополнительное количество (3-глюкозидазы Р. verruculosum F10 (содержание белка - 0,6,1,5 и 3 мг/г субстрата соответственно).

По реакционной способности субстраты можно расположить в следующем порядке: пергамент - свекловичный жом - обессмоленные сосновые опилки IV вида - пшеничные отруби - обессмоленные сосновые опилки 111 вида - обессмоленные сосновые опилки II вида - рисовая шелуха -обессмоленные сосновые опилки 1 вида (табл. 9).

Таблица 9. Выход глюкозы и ВС через 48 ч гидролиза различных целлюлозосодержащих материалов (100 г/л) ферментными препаратами Р. verruculosum В22Í-Í5Í и Целловиридин Г20х в присутствии ß-глюкозилазы (Р. verruculosum FIO) при 50°С и pH 5.0.__

Р. verruculosum B221-151 + Целловиридин Г20х +

Р. vemiculo.4i<in F10 Р. vemicubsiiiii Fl0

Субстрат Белок, мг/г субстрата* Выход, мг/г субстрата Выход, % от теор. Выход, мг/г субстрата Выход, % от теор.

Глюкоза ВС Глюкоза ВС Глюкоза ВС Глюкоза ВС

2 -г 0,06 255 263 24 24 222 246 21 22

Пергамент 5- 1,5 350 360 33 32 360 371 34 33

10-3 510 524 48 47 509 520 48 47

2 + 0,06 31 33 6 5 26 30 5 4

СО, I вид 5 + 1,5 41 50 8 7 34 40 6 6

10 + 3 44 51 8 7 46 52 9 7

2 + 0.06 40 43 8 6 38 42 7 6

СО, 11 вил 5+ 1,5 52 .74 10 10 54 55 10 8

10^3 73 84 14 12 63 87 12 12

2 + 0,06 50 56 9 8 48 60 9 8

СО,Ш вид 5 т- 1.5 79 85 15 12 64 74 12 10

10 + 3 80 87 ¡5 12 74 80 14 11

2 + 0.06 113 139 21 19 113 118 21 16

СО, IV вид 5 -г 1,5 156 163 ' 29 23 152 165 29 23

ю-з 178 196 34 27 173 188 33 26

Свекловичный жом 2 + 0,06 5 - 1,5 167 201 194 224 63 76 19 22 114 145 119 150 43 54 12 15

10 + 3 231 260 87 26 163 173 61 17

Пшеничные отруби 2 + 0,06 5+1,5 10 + 3 92 103 108 167 182 196 75 84 89 21 23 24 81 94 95 158 193 208 66 77 78 20 24 26

2 - 0,06 20 38 6 7 21 33 6 6

Рисовая шелуха 5+1,5 40 58 13 11 51 62 16 12

10 + 3 50 73 15 14 65 76 20 14

* Содержание белка целлюлазных препаратов Р. xerruculosum В221-151 или Целловиридин Г20х + Р. verruculosum FIO

По осйхаривающей способности лабораторный препарат Р. verruculosum B22Í-151 не уступал, а в некоторых случаях превосходил промышленный препарат Целловиридин Г20х. При гидролизе свекловичного жома, рисовой шелухи, пшеничных отрубей применение дозы белка целлюлазного препарата Р. verruculosum В221-151 или Целловиридина Г20х более 5 мг/г в присутствии 1,5 мг белка Р-глюкозидазного препарата Р. verruculosum FIO не приводило к увеличению выхода Сахаров. В случае пергамента значительное увеличение выхода Сахаров наблюдали при увеличении дозы целлюлазных препаратов по белку до 10 мг/г.

В целом, в большинстве случаев ферментный препарат Р. verruculosum В221-151 при осахаривании целлюлозосодержащих субстратов был более эффективным, чем коммерческие ферментные препараты, полученные на

основе Т. гееэе!. После добавления Д-глюкозидазы к препаратам Т. гее$е1 их осахаривающая способность становилась близкой к таковой для препарата Р. х'еггиси1ошп 13221-151.

4.2. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов гомогенными ферментами и их смесями. Выявление ключевых ферментов Р. \-егтси1озит, отвечающих за гидролиз целлюлозосодержащих материалов, является необходимым шагом для создания оптимального («идеального») ферментного комплекса, по эффективности превосходящего существующие коммерческие ферментные препараты. При создании такого комплекса необходимо учитывать особенности и свойства конкретного субстрата.

Процесс создания комплекса может быть разделен на несколько этапов. На первом этапе проводится гидролиз определенного целлюлозосодержащего субстрата индивидуальными ферментами, в результате чего выявляются определенные наиболее важные ферменты (целлюлазы, гемицеллюлазы), необходимые для гидролиза данного субстрата. На втором этапе с учетом эффектов синергизма составляются различные смеси из выбранных индивидуальных ферментов. При оценке эффективности действия таких смесей в качестве контроля проводят гидролиз того же субстрата различными коммерческими и лабораторными препаратами.

С помощью описанного подхода нами были созданы смеси из индивидуальных ферментов Р. уеггисиЬяит (для сравнения использовали смеси индивидуальных ферментов Т. гее&ег и С. ¡иекпо^ете, табл. 10) для эффективного гидролиза различных отходов сельского хозяйства, целлюлозобумажного производства и деревоперерабатывающей промышленности, которые рассматриваются как потенциальное сырье для биоконверсии Сахаров в этанол, бутанол и другие полезные продукты.

Таблица 10. Индивидуальные ферменты, использованные для гидролиза целлюлозосодержащих субстратов.__

Продуцент Ферменты

Р. verrueulosum ЦБГ 1 66 кДа ЦБГ II 60 кДа ЭГ170кДа ЭГ II 39 кДа ЦБГ 155 кДа ЦБГП50кДа ЭГ152кДа ЭГНЗЗкДа Ксил И 23 кДа БГЛ 116 кДа ЭГ III 25 кДа КГ 25 кДа КГ 70 кДа

Т. reesei ЦБГ 1 65 кДа ЦБГ 11 60 кДа ЭГП50кДа ЭГ157кДа Ксил II21 кДа БКС 80 кДа* ЭГ II45 кДа

С. lucknowense ЦБГ 1а 65 кДа ЦБГ IIb 70 кДа ЭГ II5 ] кДа ЭГ III 28 кДа БГЛ 106 кДа Ксил I 31 кДа Ксил II 24 кДа

А. japonicus БГЛ 120 кДа

* БКС - ß-ксилозидаза

Гидролиз измельченных обессмоленных сосновых опилок. На

первом этапе СО IV вида (50 г/л) гидролизовали индивидуальными целлюлазами и ксиланазой Р. verrueulosum (2 мг/г субстрата) и для сравнения индивидуальными ферментами Т. reesei и С. hicknowense в той же дозировке (рис. 7а). Наибольший выход Сахаров обеспечили ЦБГ I и ЦБГ II Р. verrueulosum и С. lucknowense, а также ЭГ I Т. reesei и ЭГ II и ЭГ III

С. 1искпом>ете. При этом в гидролизатах целлюлозы, полученных под действием данных ферментов, содержание целлобиозы оказалось достаточно высоким (до 40-45%). Поэтому мы провели осахаривание сосновых опилок гомогенными ферментами в присутствии гомогенной (3-глюкозидазы А. ]аротсш в количестве 0,14 мг/г субстрата (к Ксил II добавляли Р-ксилозидазу - БКС - Т. геезе1). В результате выход глюкозы и ВС значительно возрос (в среднем в 1,8 раза, рис. 76).

5 □ Глюкоза ВВС

□ Глюкоза ВВС

С о

й

Рисунок 7. Выход глюкозы и ВС через 72 ч гидролиза СО IV вида (50 г/л) очищенными ферментами Р. х-еггисгЛозит. Т. гее.че1 и С. Ыскпо\\'еп$е (2 мг/г субстрата) в отсутствие (а) и в присутствии БГЛ 120 кДа А. }аротсш (0,14 мг/г субстрата) (ксиланазы в присутствии БКС 80 кДа Т. гее5е/, 0,13 мг/г субстрата) (б) при 50°С и рН 5,0.

Примечание:

В названиях ферментов цифрами указана их массы в кДа.

Р. изгшси^ит

3 з-

С. 1искпс№еп5е

Оказалось неожиданным, что некоторые эндоглюканазы (ЭГ I 70 кДа Р. уеггисиЫит, ЭГ I 57 кДа и ЭГ II 50 кДа Т. геезе!, ЭГ II 51 кДа и ЭГ III 28 кДа С. 1искпсм>етё) проявляли сравнимую с целлобиогидролазами гидролитическую активность. Следует отметить, что целлобиогидролазы 7-й семьи гликозид-гидролаз обеспечивали более высокий выход Сахаров по сравнению с целлобиогидролазами 6-й семьи. Отметим также, что ферменты с ЦСМ (ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и ЭГ I 70 кДа Р. чеггиЫозит) были эффективнее ферментов без ЦСМ (ЦБГ I 55 кДа, ЦБГ II 50 кДа и ЭГ I 52 кДа Р. л>еггиси1ошт).

На следующем этапе из наиболее эффективных индивидуальных ферментов были составлены смеси (табл. 11). В качестве контроля проводили

гидролиз сосновых опилок коммерческим ферментным препаратом Целловиридин Г20х и лабораторным - Р. verruculosum В22\-\5\ (рис. 8).

Таблица 11. Состав лучших ферментных смесей, использованных для гидролиза обессмоленных сосновых опилок IV вида (50 г/л)._____

№ Состав Концентрация белка, мг/г субстрата

1.4 ЦБГ 1 66 + ЦБГ II 60 г ЭГ БГЛ 120* 70 + ЭГ 11 39 + 1,12 + 0,4 + 0,16 + 0,16 -г 0,16

1 1.5 ЦБГ I 66 т ЦБГ 11 60 + ЭГ 1 70 + БГЛ 120 + ЦБГ 1 55 + ЦБГ II 50 + ЭГ 1 52 ЭГ II 39 + 0.38 + 0.38 + 0.08 - 0,16 + 0,16 + 0,38 + 0.38 + 0.08

1.6 ЦБГ I 66 + ЦБГ II 50 + ЭГ I 52 + БГЛ 120 1.12 + 0,44 + 0.2 + 0,16

1.7 ЦБГ I 66 + ЦБГ 11 60 + ЭГ БГЛ 120 70 + ЭГ II 39 + 1,12 + 0.4 + 0.24 + 0,08 + 0.16

1.8 ЦБГ 1 66 + ЦБГ II 60 + ЭГ БГЛ 120 + ЭГ 11 33 70 + ЭГ 11 39 + 1 +0,4 + 0,16+0,12 + 0.16 + 0,16

1.9 ЦБГ 1 66 + ЦБГ 11 60 + ЭГ БГЛ 120 + БКС 80** + Ксил 1121 70 *** + ЭГ II 39 + 0.96 + 0,28 + 0,16 + 0.16 + 0,16 + 0,08 + 0,2

2.1 ЦБГ I 65 + ЦБГ II 60 + ЭГ БГЛ 120 57 + ЭГ 11 50 + 1.08 + 0.4 + 0,16 + 0.16 + 0,2

2 2 ЦБГ I 65 + ЦБГ II 60 + ЭГ БГЛ 120 57 + ЭГ II 50 + 1.2 + 0.32 + 0,16 + 0.16 + 0,16

2.3 ЦБГ 1 65 + ЦБГ II 60 + ЭГ БГЛ 120 +Ксил И 21 + БКС 80 57 + ЭГ II 50 + 0,96 + 0,28 + 0.16 + 0,16 + 0,16 + 0.2 + 0,08

1 3.1 ЦБГ 1а 65 + ЦБГ ПЬ 70 + ЭГ II 51 + БГЛ 120 1 +0,7 + 0,2 + 0,1

.. 1 3.2 ЦБГ 1а 65 + ЦБГ ПЬ 70 + ЭГ II 51 кДа + ЭГ III 28 + БГЛ 120 + Ксил II 24 + БКС 80 0,68 + 0.68 + 0,16 + 0.12 + 0,16 + 0,16 + 0,04

3.3 ЦБГ 1а 65 + ЦБГ lib 70 + ЭГ И 51 + БГЛ 120 0,94 + 0.7 + 0,2 + 0.16

* БГЛ ¡20 кДа A. japonicus, ** БКС 80 кДа Т. reesei. «** Ксил И 21 кДа Т. reesei

Рисунок 8. Выход глюкозы и ВС через 72 ч гидролиза СО IV вида (50 т/л) смесями ферментов Р. verruculo.ni/n, Т. геете/ и С. 1искпоуеп$е (2 мг/г субстрата) и препаратами Целловиридин Г20х и Р. \ierruculoswn В223-151 при 50°С и рН 5,0. Целл. Г20х -Целловиридин Г20х.

| Смеси №1.4-1.9 из индивидуальных целлюлаз P. verruculosum

обеспечивали выход глюкозы на уровне ферментных препаратов и были сравнимы или превышали по эффективности гидролиза смеси, составленные из ферментов Т. reesei (№2.1-2.3) и С. lucknowense (№3.1-3.3). Лучшие 1 результаты показали смеси, в составе которых преобладала ЦБГ I, содержавшая ЦС'М, а также присутствовали Ксил II и БКС, ЦБГ II (с ЦСМ), ' ЭГ I (с ЦСМ), ЭГ II, Р-глюкозидаза (БГЛ) (№1.9, №2.3 и №3.2). В смеси №3.2 вместо ЭГ I была ЭГ III. Такие же высокие выходы глюкозы и ВС наблюдали

для смеси №1.8, содержавшей ЭГ II 33 кДа с высокой собственной ксиланазной активностью, незначительно ниже - для смеси №1.5, содержавшей наибольшее количество слабо сорбирующихся ферментов в дополнение к прочно сорбирующимся.

Гидролиз предобработанных кукурузных початков (ПКП). Используя такой же подход, как и выше в случае гидролиза СО, были созданы искусственные смеси для ферментативного гидролиза ПКП (в табл. 12 представлены наиболее эффективные смеси Р. уеггисиЬзит). В каждую смесь добавляли БКС Т. гте/ для полной конверсии ксилана в ксилозу, причем содержание Ксил II, БГЛ и БКС было постоянным. В качестве контроля использовали предварительно оптимизированную для гидролиза ПКП смесь коммерческих ферментных препаратов, полученных на основе Т. геезе1 (Брегуте СР и Ми1Шес1 ХЬ).

Таблица 12. Состав ферментных смесей, использованных для гидролиза ПКП.

№ Состав Концентрация белка, мг/г субстрата

> с. 3 4 ЦБГ I 66 + ЭГ 1 70 + БГЛ 116 + Ксил 11 21* + БКС 80** ЦБГ 1 66 + ЦБГ II 60 + ЭГ I 70 + БГЛ 116 + Ксил II 21 + БКС 80 1,2 + 0.15 + 0.1 +0,4 + 0,05 0.8 + 0.4 + 0.15 + 0,1 + 0.4 + 0,05

6 ЦБГ 1 65 + ЭГ 1 57 + БГЛ 120*** -г Ксил 1! 21 + БКС 80 ЦБГ I 65 + ЦБГ II 60 + ЭГ 1 57 + ЭГ 11 50 + БГЛ 120 + Ксил 11 21 + БКС 80 1,2 + 0,15 + 0,! +6,4 + 0,05 0,7 + 0,4 + 0,15 + 0.1+0.1 + 0.4 + 0,05

Эрегуте СР + Ми1№М ХЬ 1,4 + 0,5

8 9 ЦБГ 1а 65 + ЦБГ НЬ 70 + ЭГ 11 51 + Ксил 11 24 + БГЛ 106 ^ БКС 80 ЦБГ 1 65 + ЦБГ НЬ 70 + ЭГ II 51 + Ксил II 24 + Ксил 131 + БГЛ 106 +БКС 80 0.7 + 0.5 + 0.15 + 0.4 + 0.1 + 0,05 0,7 + 0,4 + 0,15 + 0,25 + 0,25 + 0,1 + 0,05

* БКС 80 кДа Т. мп ** Ксил II 21 кДа Т. геезе/, *** БГЛ 120 кДа А.)аротсш

АО

30

20

10

□ Глюкоза В ВС

Рисунок 9. Выход глюкозы и ВС через 72 ч гидролиза ПКП (100 г/л) смесями ферментов Р. \erruculoswn, Т. геехе! и С. Iискптете (1.9 мт/г субстрата) и смесью промышленных препаратов Зрегуте СР и МиМАес! ХЬ (1,4 и 0,5 мг/г) при 50°С и рН 5,0.

№3 №4 Р. уеггисикзвит

№6

№7

Т. гееве)

№8 №9 Э+М С. 1искпо\л/еп8е

Все составленные композиции индивидуальных ферментов приводили к более высокому выходу продуктов (глюкозы и ВС), чем смесь коммерческих препаратов врегуте СР + МиШ£есГ ХЬ (рис. 9). Смеси ферментов Р. уеггисиЬэит №3 и №4 по эффективности гидролиза превосходили смеси ферментов Т. гееяег (№6 и №7) и были эквивалентны смесям ферментов С. 1искпом>ете (№8 и №9), Лучшая из комбинаций ферментов Р. чеггиайоъит (смесь №3) имела «минимальный» состав: ЦБГ I 66 кДа и ЭГ I 70 кДа (оба

фермента с ЦСМ) в соотношении 8:1. В отличие от Р. ь-еггисиЬяит для смесей ферментов Т. геие/ и С. ¡исЬюкете увеличение числа целлюлаз разных семей в композиции приводило к более глубокому гидролизу субстрата.

Используя аналогичный подход, были составлены смеси из индивидуальных ферментов Р. \-erniculosum для эффективного гидролиза ряда других целлюлозосодержащих субстратов. Смеси, которые приводили к наиболее глубокому гидролизу субстратов, представлены в табл. 13.

Таблица 13. Состав ферментных смесей Р. \erniculosum, приводивших к наиболее глубокому гидролизу различных целлюлозосодержащих субстратов. __

Субстрат Состав ферментных смесей Соотношение ферментов в смеси

Пергамент ЦБГ I 66 кДа + ЭГ I 70 кДа + БГЛ 120 кДа ЦБГ I 66 кДа + ЦБГ II 50 кДа + БГЛ 120 кДа* 67,5 : 25 : 7,5 67.5 : 25 : 7,5......

Багасса ЦБГ 1 66 кДа + ЦБГ 11 50 кДа + БГЛ 120 кДа ЦБГ I 66 кДа + ЭГ I 70 кДа + БГЛ 120 кДа (7:3) 47 :47 : 6 65 : 28 : 7....................

Кукурузные стебли ЦБГ I 66 кДа ЦБГ II 60 кДа + БГЛ 120 кДа ЦБГ 1 66 кДа + ЦБГП 50 кДа + БГЛ Í20 кДа......... 65 : 28 : 7 и 28 : 65 : 7 6528 VУи 28 ?65 : 7

Делигнифицированная пшеничная солома ЦБГ I 66 кДа + ЦБГ II 60 кДа + ЭГ I 70 кДа + ЭГ И 39 кДа + БГЛ 120 кДа 50:25: 10: 10:5

СО, IV вид ЦБГ I 66 + ЦБГ И 60 + ЭГ I 70 + ЭГ II 39 + БГЛ 120 + ЦБГ I 55 + ЦБ Г11 50 + ЭГ I 52 ЦБГ Г 66 + ЦБГ И 60 + ЭГ Í 70 + ЭГ И 39 + БГЛ 120 + ЭГ И 33 19 : 19 :4 : 8 : 8 : 19 : 19:4 50:20:8:6:8:8

Предобработанные кукуру зные початки ЦБГ I 66 + ЭГ I 70 + БГЛ 116 + Ксил II 21** + БКС 80*** ЦБГ j 66 + ЦБГ И 60 - ЭГ I 70 + БГЛ 116 + Ксил И 21 + БКС 80 63 : 8 : 5 : 21 : 3 42 : 21 : 8 : 5 : 21: 3".....

* БГЛ 120 Kj&A.japonicus. ** Ксил II 21 кДа Т. reesei, *** БКС 80 кДа Т. reesei

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что ключевой компонент всех смесей - ЦБГ I 66 кДа; как правило, необходимо, чтобы ее содержание в ферментных смесях превышало 50%. Важными компонентами являлись ЦБГ II 50 и 60 кДа, ЭГ I 70 кДа и ЭГ II 39 кДа, а также БГЛ. Отметим, что присутствие в реакционной среде ферментов без ЦСМ наряду с ферментами с ЦСМ способствовало усилению гидролиза. При осахаривании лигноцеллюлозных субстратов с высоким содержанием гемицеллюлозы возрастала роль ксиланаз, а также ЭГ И 33 кДа с высокой собственной ксиланазной активностью. При этом для достижения одинаково высокого выхода ВС ЭГ II 33 кДа требовалось в 1,7 раза меньше, чем ксиланаз, таким образом, использование ЭГ II 33 кДа позволяло увеличить концентрацию целлобиогидролаз в реакционной среде.

4.3. Изучение влияния различных эффекторов на гидролитическую способность целлюлаз. Влияние поверхностно-активных веществ. Мы изучили, как влияют неионогенные ПАВ Triton Х-100 и Неонол на гидролиз делигнифицированной пшеничной соломы (ДПС) и ДСК промышленными препаратами и индивидуальными ферментами.

При осахаривании ДСК (50 г/л) смесями лабораторных целлюлазных препаратов P. verruculosum В221-151 и Т. reesei TW-307 с р-глюкозидазным -P. verruculosum F10 в присутствии Неонола (2,5 г/л) наблюдалось

значительное увеличение выхода глюкозы по сравнению с осахариванием без ПАВ (контроль, рис. 10).

Использование Неонола в концентрации 2,5 г/л помогло сократить дозу используемых ферментов в 1,5-2,5 раза. Достигнуть 100% глубины гидролиза целлюлозы, входившей в состав ДСК, удалось при концентрации белка целлюлазных препаратов 15 мг/г субстрата в присутствии 2,5 г/л Неонола.

Далее мы исследовали влияние Triton Х-100 и Неонола в разных концентрациях (0,5 и 2,5 г/л) на осахаривание ДПС ключевыми ферментами P. verruculosum, Т. reesei и С. lucknowense (в присутствии БГЛ A. japonicus, 0,14 мг/г субстрата). Концентрация ферментов составляла 2 мг/г субстрата. Через 72 ч гидролиза ДПС выход глюкозы в реакционных системах в присутствии 0,5 и 2,5 г/л ПАВ увеличился по сравнению с контролем без ПАВ в среднем на 40-65%. При этом Неонол и Triton Х-100 способствовали возрастанию концентрации глюкозы в одинаковой степени. Наибольшее влияние оба ПАВ при концентрации 2,5 г/л оказали на процесс гидролиза ДПС индивидуальными целлюлазами Т. reesei (выход глюкозы возрос в 1,82,1 раза), меньшее - на гидролиз ферментами P. verruculosum и С. lucknowense.

100

го

15 *

nj ä

I С Ю i

s- *

80 60

40

20

О ■

----В221-151 +F10;

7W-307 + F10

0 5 10 15

Концентрация белка, мг/г субстрата

-В221-151 +F10.Í 2.5 r/л Неонола' -TW-307 + F10, 2,5 г/л Неонола ■

Рисунок 10. Зависимость глубины гидролиза целлюлозы из ДСК (50 г/л) от концентрации белка целлюлазных препаратов Г. reesei TW-307 и Р. verruculosum В221-151 в реакционной среде в отсутствие и в присутствии 2,5 г/л Неонола при 50°С и pH 5,0. Время реакции 72 ч, содержание Р. verruculosum F10 - 0,6, 1,5, 3 и 4,5 мг/г субстрата соответственно.

Влияние этанола. В последнее время большинство исследователей и разработчиков процесса биоконверсии растительного сырья склоняются к схеме одновременного осахаривания и сбраживания (SSF). Основное преимущество SSF метода заключается в том, что образующиеся в результате осахаривания моносахара, выступают в роли субстрата для дрожжевого брожения, и концентрация их в реакционной среде значительно снижается. Концентрация этанола в реакционной среде при осуществлении SSF-процесса обычно не превышает нескольких процентов (3-10%). Поэтому мы изучили влияние этанола (5 и 10%) на гидролиз ДСК препаратами Р. verruculosum В221-151 и Т. reesei TW-307, BioACE и Spezyme CP в отсутствие и в присутствии [3-глюкозидазы. Концентрация белка целлюлазных и Р-глюкозидазных препаратов составляла 5 и 1,5 мг/г субстрата соответственно. Наименьшему негативному влиянию этанола была подвержена смесь препаратов Р. verruculosum В221-151 и F10, в большей

степени спирт воздействовал на промышленные и лабораторный препараты Т. reesei и их смеси с р-глкжозидазными препаратами (рис. 11).

В случае гидролиза ДСК (50 г/л) индивидуальными ферментами Р. verruculosum, Т. reesei и С. htcknoyvense (2 мг/г субстрата, БГЛ A. japonicus -0,14 мг/г) в присутствии в реакционной среде 5% этанола наблюдали уменьшение выхода глюкозы на 5-20%, при 10% этанола - на 14-50%. Присутствие этанола в реакционной среде оказывало более сильное негативное воздействие на осахаривание субстрата индивидуальными целлюлазами Т. reesei, значительно меньшее - на индивидуальные целлюлазы Р. verruculosum и С. lucknowense. При 5% этанола в среде выход глюкозы для всех ферментов уменьшался на 11-20% по сравнению с контролем без этанола, кроме ЦБГ II 60 кДа Р. verruculosum и ЦБГ 1а 65 кДа С. lucknowense. Для них выход глюкозы снижался лишь на 5-7%. Такой же эффект наблюдали при 10% этанола в реакционной среде: выход глюкозы для целлюлаз Т. reesei снизился на 50-55%, для целлюлаз Р. verruculosum и С. lucknowense - на 2233%, кроме ЦБГ II 60 кДа и ЦБГ 1а 65 кДа, для которых концентрация глюкозы уменьшилась на 14%.

Рисунок 11. Уменьшение концентрации глюкозы в реакционной среде в присутствии этанола по сравнению с контролем без этанола через 48 ч гидролиза ДСК (100 г/л) препаратами Р. verruculosum B221-I51 и Т. reesei TW-307, BioACE и Spezyme CP без и в присутствии ¡3-глюкозидазы Р. verruculosum F10 и Novozym 188 соответственно (50°С, рН 5,0). Концентрация белка целлюлазных препаратов 5 мг/г. р-глюкозидазных - 1,5 мг/г субстрата.

выводы

1. Впервые выделены в гомогенном виде и изучены свойства внеклеточных целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа, продуцируемых грибом Р. уеггисиЫит. С помощью масс-спектрометрических методов осуществлена классификация этих ферментов как Се16А и Се17В соответственно.

2. На основе сравнения аминокислотных последовательностей выделенных ферментов Р. х-еггисгйозит и известных гомологичных грибных целлюлаз, а также с использованием данных сравнительного моделирования трехмерной структуры белков, выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз I и II, а также эндоглюканазы II 39 кДа и (3-глюкозидазы 116 кДа.

3. Показано, что ЦБГII 60 кДа и ЦБГ I 66 кДа Р. \еггиси1озит являются ключевыми ферментами для осахаривания целлюлозы: они обладают высокой гидролитической активностью и способны осуществлять глубокую конверсию кристаллической целлюлозы.

4. Разработан подход для формирования мультиферментных композиций, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов. Продемонстрирована принципиальная возможность создания на основе индивидуальных целлюлаз Р. \еггиси1о$ит мультиферментных композиций, которые превосходят по эффективности действия различные коммерческие ферментные препараты.

5. Установлено, что ключевыми компонентами ферментных смесей Р. уегп/сиЬяит, предназначенных для эффективного осахаривания целлюлозосодержащих субстратов, являются ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и 50 к Да, ЭГ I 70 к Да, ЭГ II 39 к Да и БГЛ 116 к Да. При гидролизе субстратов с высоким содержанием гемицеллюлозы возрастает роль ЭГ II 33 кДа. Присутствие в реакционной среде ферментов без ЦСМ наряду с ферментами, содержащими ЦСМ, способствует усилению гидролиза.

6. Показано, что при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов в присутствии в реакционной среде неионогенных поверхностно-активных веществ значительно возрастает выход глюкозы и восстанавливающих Сахаров. Использование неионогенных ПАВ позволяет сократить дозу используемых ферментов в 1,5-2,5 раза.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Короткова О.Г., Семенова М.В., Морозова В.В., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Снннцын А.П. Выделение и свойства грибных р-глюкозидаз. Биохимия, 2009, т. 74, № 5, е. 699-709.

2. Семенова М.В., Синнцына О.А., Морозова В.В., Федорова Е.А., Гусаков

A.В., Окуиев О.Н., Соколова Л.М., Кошелев А.В., Бубнова Т.В., Винецкмп Ю.П., Синнцын А.П. Использование препарата грибной пектин-лиазы в пищевой промышленности. Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т. 42, №6, с. 681-685.

3. Синицын А.П., Рожкова A.M., Синицына О.А., Федорова Е.А., Морозова

B.В., Зоров И.Н., Семенова М.В., Саттрутдинов А.Д., Короткова О.Г., Осипов Д.А., Середа А.С., Цурикова Н.В., Беккаревич А.О., Кошелев А.В., Окунев О.Н. Создание рекомбинантного штамма-продуцента целлобиазы ([3-глюкозидазы) для увеличения эффективности процесса ферментативного осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологиях. Сборник научных трудов под ред. Полякова В.А., 2008, Москва, с. 10-13.

4. Skomarovsky А.А., Ustinov В.В., Zorov I.N., Morozova V.V., Korotkova O.G., Dzedzyulya E.I., Okunev O.N., Sinitsyn A.P. Hydrolytic potentials of cellulases from Pénicillium verritculosum. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007: Fundamentals&Applications", June 17-22, 2007, Moscow -St.Peterburg, Russia, p. 52-53.

5. Sinitsyna O.A., Fedorova E.A., Pravilnikov A.G., Morozova V.V., Kondratieva E.G., Okunev O.N., Vinetsky Y.P., Sinitsyn A.P. Application of the recombinantenzymes from Pénicillium canescens in biotechnological processes. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007: Fundamentals&Applications", June 17-22, 2007, Moscow - St.Peterburg, Russia, p. 54-55.

6. Koshelev A.V., Matys V.Yu., Nemashkalov V.A., Skomarovsky A.A., Ustinov B.B., Zorov I.N., Morozova V.V., Korotkova O.G., Okunev O.N., Sinitsyn A.P. Biodégradation of paper parchment by mycelium fungi Pénicillium and Trichoderma and possibility of their application for production of cellulose-lytic enzymes and bioethanol. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007: Fundamentals&Applications", June 17-22, 2007, Moscow - St.Peterburg, Russia, p. 114.

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН Тираж 100 экз.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Структура и свойства основных компонентов растительной биомассы.

1.1. Целлюлоза.

1.2. Гемицеллюлозы и пектины.

1.3. Лигнин.

1.4. Предобработка целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов.

Глава 2. Ферментативный гидролиз целлюлозосодержащего сырья.

2.1. Общие сведения о целлюлолитических ферментах.

2.2. Особенности строения целлобиогидролаз и эндоглюканаз.

2.3. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз.

2.4. Механизм действия целлюлазного комплекса.

2.5. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы

2.6. Применение целлюлаз в производстве этанола.

2.7. Ферментный комплекс гриба Penicillium verrnculosum.

Экспериментальная часть.

Глава 3. Объекты исследования и методы экспериментов.

3.1 Использованные ферменты.

3.2. Субстраты и реактивы.

3.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка.

3.4. Методы выделения и очистки ферментов.

3.5. Методы определения активности ферментов.

3.6. Определение адсорбционных характеристик ферментов.

3.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов.

3.8. Изучение термостабильности ферментов.

3.9. Ограниченный протеолиз ферментов папаином.

3.10. Гель-хроматографический анализ продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

3.11. Исследование кинетики глубокого гидролиза МКЦ.

3.12. Гидролиз различных целлюлозосодержащих субстратов.

3.13. Масс-спектрометрический анализ пептидов и построение трехмерных моделей ферментов.

Результаты и их обсуждение.

Глава 4. Выделение и очистка ферментов целлюлазного комплекса P. verruculosum

Глава 5. Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз, эндоглюканаз и р-глюкозидазы P. verruculosum и их аминокислотные последовательности.

5.1. ЦБГ II 6-й семьи гликозид-гидролаз.

5.2. ЦБГ I 7-й семьи гликозид-гидролаз.

5.3. ЭГ II 5-й семьи гликозид-гидролаз.

5.4. Р-Глюкозидаза 3-й семьи гликозид-гидролаз.

Глава 6. Свойства целлобиогидролаз и эндоглюканаз P. verruculosum.

6.1. Субстратная специфичность и каталитические свойства.

6.2. Адсорбционные характеристики.

6.3. Ограниченный протеолиз ферментов папаином.

6.4. Термостабилыюсть.

6.5. Температурный и рН-оптимум действия ферментов.

6.6. Состав низкомолекулярных продуктов гидролиза Р-глюкана эндоглюканазами

6.7. Выявление ключевых гидролитических ферментов.

Глава 7. Создание ферментных комплексов для эффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов.

7.1. Сравнение осахаривающей способности различных препаратов целлюлаз.

7.2. Гидролиз целлюлозосодержащих субстратов гомогенными ферментами и их смесями.

7.3. Изучение влияния различных эффекторов на гидролитическую способность целлюлаз.

Выводы.

На сегодняшний день перед человечеством стоит проблема потенциального исчерпывания традиционного углеводородного сырья, из которого производят моторное топливо и продукты химического синтеза. Кроме того, с каждым годом увеличивается объем антропогенных выбросов парниковых газов в атмосферу, что приводит к изменению климата на Земле. В связи с этим резко возрос интерес к альтернативным источникам энергии, одним из которых является возобновляемое растительное сырье -лигноцеллюлозная биомасса, отходы промышленности и сельского хозяйства. Глюкоза и другие сахара, получаемые путем ферментативного гидролиза такой лигиоцеллюлозной биомассы, могут быть конвертированы с помощью микроорганизмов в биотопливо -этанол или бутанол.

Природная древесина, различные виды сельскохозяйственных культур и другие целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет упорядоченную (кристаллическую) структуру, и во многих случаях субстрат содержит в своем составе сопутствующие вещества (в первую очередь лигнин), которые служат физическим барьером, затрудняющим доступ ферментов к гликозидным связям. Возникает необходимость поиска возможностей увеличения реакционной способности субстрата (предобработки растительного сырья). Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Эффективность процесса получения Сахаров зависит от ряда факторов и в значительной степени - от состава комплекса целлюлолитических ферментов и взаимодействия индивидуальных ферментов в нем, стабильности целлюлаз, ингибирующего влияния па них продуктов гидролиза. Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Trichoderma (Г. reesei, Т. viride, Т. longibrachiatum и др.) играют ведущую роль [1]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Наиболее существенным недостатком данного продуцента целлюлаз является, низкое содержание Р-глюкозидазы [2], отвечающей за конверсию промежуточных продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы в конечный продукт — глюкозу.

В отличие от Trichoderma, грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью [3, 4]. Поэтому получение высокопродуктивных штаммов Penicilliiim является задачей, имеющей большое научное и прикладное значение.

Ключевые ферменты целлюлазного комплекса — эндоглюканазы и целлобиогидролазы, способные гидролизовать главным образом высокоупорядоченные области целлюлозы. Целлобиогидролазы I и II и эндоглюканазы I и II Г. reesei относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. Достаточно много информации опубликовано также о целлобиогидролазах и эндоглюканазах из таких грибных продуцентов целлюлаз, как Humicola wsolens, Phanerochaete chiysosporium, Т. emersonii, Т. aurantiacus и некоторых других, в тоже время о свойствах других грибных целлюлаз известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных белков имеется значительное количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов. Сведения, касающиеся пеницильных ферментов-карбогидраз, весьма противоречивы, а аминокислотных последовательностей, транслированных из. генов P. verruculosum, практически нет в белковых базах данных. Некоторые ферменты, продуцируемые P. verruculosum, уже изучены в нашей лаборатории. Создание новых мутантных штаммов привело к секреции новых ферментов: целлобиогидролазы 60 кДа и эндоглюканазы 70 кДа.

Целью диссертационной работы являлось изучение молекулярных и каталитических свойств целлобиогидролаз и эидоглюканаз, секретируемых" высокопродуктивным мутантпым штаммом гриба P. verruculosum В221-151, полученным в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, а также разработка подхода для создания на основе ферментов P. verruculosum смесей, способных осуществлять глубокий гидролиз растительной биомассы. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Выделить все секретируемые целлюлазы P. verruculosum;

• Исследовать биохимические и каталитические свойства целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа в сравнении с ранее описанными целлобиогидролазами и эндоглюканазами этого продуцента;

• Разработать подход для создания мультиферментных смесей на основе целлюлаз P. verruculosum для эффективного гидролиза различных целлюлозосодержащих субстратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Впервые выделены в гомогенном виде и изучены свойства внеклеточных целлобиогидролазы II 60 кДа и эндоглюканазы I 70 кДа, продуцируемых грибом P. verruculosum. С помощью масс-спектрометрических методов осуществлена классификация этих ферментов как Се16А и Се17В соответственно.

2. На основе сравнения аминокислотных последовательностей выделенных ферментов P. verruculosum и известных гомологичных грибных целлюлаз, а также с использованием данных сравнительного моделирования трехмерной структуры белков, выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз I и II, а также эндоглюканазы II 39 кДа и Р-глюкозидазы 116 кДа.

3. Показано, что ЦБГ II 60 кДа и ЦБГ I 66 кДа P. verruculosum являются ключевыми ферментами для осахаривания целлюлозы: они обладают высокой гидролитической активностью и способны осуществлять глубокую конверсию кристаллической целлюлозы.

4. Разработан подход для формирования мультиферментных композиций, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов. Продемонстрирована принципиальная возможность создания на основе индивидуальных целлюлаз P. verruculosum мультиферментных композиций, которые превосходят по эффективности действия различные коммерческие ферментные препараты.

5. Установлено, что ключевыми компонентами ферментных смесей P. verruculosum, предназначенных для эффективного осахаривания целлюлозосодержащих субстратов, являются ЦБГ I 66 кДа, ЦБГ II 60 кДа и 50 кДа, ЭГ I 70 кДа, ЭГ II 39 кДа и БГЛ 116 кДа. При гидролизе субстратов с высоким содержанием гемицеллюлозы возрастает роль ЭГ II 33 кДа. Присутствие в реакционной среде ферментов без ЦСМ наряду с ферментами, содержащими ЦСМ, способствует усилению гидролиза.

6. Показано, что при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов в присутствии в реакционной среде неионогенных поверхностно-активных веществ значительно возрастает выход глюкозы и восстанавливающих Сахаров. Использование неионогенных ПАВ позволяет сократить дозу используемых ферментов в 1,5-2,5 раза.

1. Godfrey Т., West S. Industrial enzymology, 2nd edition. Macmillan Press Ltd., Hampshire, 1996, 609 p.

2. Rosgaard L., Pedersen S., Langston J., Akerhielm D., Cherry J.R., Meyer A.S. Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulose mixtures on differently pretreated barley straw substrates. Biotechnol. Prog., 2007, v. 23, p. 1270-1276.

3. Кастельянос О.Ф. Каталитические биохимические и биотехнологические свойства целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum и его компонентов. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1995, 204 с.

4. Скомаровский А.А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006,170 с.

5. Collmer A., Keen N.T. The role of pectic enzymes in plant pathogenesis. Ann. Rev. Phytopathol., 1986, 24, p. 383-409.

6. Albersheim P., Jones T.N. Biochemistry of the cell wall in relation to infective processes. Ann. Rev. Phytopathol., 1969, 7, p. 171-194.

7. Dey P.M. and Brinston K. Plant cell-walls. Adv. in carbohydrate chem. and biochem., 1984, 42, p. 265-382.

8. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. М., Мир, 1986, 387с.

9. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995,654 р.

10. Hopkins W.G. Introduction to Plant Physiology, 2nd edition. John Wiley & Sons, Inc., New York, 1999,512 р.

11. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., МГУ, 1995, 224 с.

12. Роговин З.А. Химия целлюлозы. М., Химия, 1972, 519 с.

13. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. John Willey & Sons, Inc., New York, 1998, 454 p.

14. Stone B.A, Clarke A.E. Chemistry and biology of 1,3-p-glucans. La Trobe University Press, Bundoora, Australia, 1992, 426 p.

15. Izydorczyk M.S., Macri L.J., MacGregor A.W. Structure and physicochemical properties of barley non-starch polysaccharides. I. Water-extractable 13-glucans and arabinoxylans. Carbohydr. Polym., 1998, 35, p. 249-258.

16. Read S.M., Currie G., Bacic A. Analysis of the structural heterogeneity of laminarin by electrospray-ionisation-mass spectrometry. Carbohydr. Res., 1996, 281, p. 187-201.

17. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph., London-Chapel Hill, 1993, 4, 120 p.

18. Hayashi T. Xyloglucans in the primary cell walls. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1989, 40, p. 139-168.

19. KoimanP. Amyloids of plant seeds. Nature, 1957, 179, p. 107-109.

20. Gidley M.J., Lillford P.J., Rowlands D.W., Lang P., Dentini M., Crescenzi V., Edwards M., Fanutti C., Reid J.S.G. Structure and solution properties of tamarind-seed polysacsharide. Carbohydr. Res., 1991, 214, p. 299-307.

21. Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P.J., Curzon E.H. Linkage of p-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res., 1986, 148, p. 7185.

22. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Annu. Rev. Biochem., 1984, 53, 625 p.

23. Rombouts F.M., Thibault J.F. Feruloylated pectic substances from sugar beet pulp. Carbohydr. Res., 1986, 154, p. 177-187.

24. Закис Г.Ф., Крейцберг 3.H., Можейко JI.H., Сергеева В.Н. Лигнин. В сб.: Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии. Рига, Зинатне, 1972, с. 136-242.

25. Chang М., Chou Т., Tsao G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter A., ed.). Berlin, Heidelberg, New York, 1981, p. 15-32.

26. Gharpuray M.M., Lee Y.H., Fan L.T. Structural modification of lignocellulosics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis. Biotechnol. Bioeng., 1983, 25, p. 157-172.

27. Lin K.W., Ladisch M.R., Voloch M., Patterson J. A., Noller C.H. Effect of pretreatments and fermentation on pore size in cellulosic materials. Biotechnol. Bioeng., 1985, 27, p. 1427-1433.

28. Thompson D.N., Chen H.C., Grethlein H.E. Comparison of pretreatment methods on the basis of available surface area. Bioresour. Technol., 1992, 39, p. 155-163.

29. Reshamwala S., Shavvky B.T., Dale B.E., Ethanol production from enzymatic hydrolysatcs of AFEX-treated coastal Bermuda grass and switchgrass. Appl. Biochem. Biotechnol., 1995, 51-52, p. 43-55.

30. Boominathan К., Reddy С.A. cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1992, 89, p. 5586-5590.

31. Клесов A.A. Ферментативное превращение целлюлозы. В сб.: Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология, 1. М., ВИНИТИ, 1983, с. 63-150.

32. Синицын А.П., Клесов А. А. Влияние предобработки на эффективность ферментативного превращения хлопкового линта. Прикл. биохим. микробиол, 1981, 17, с. 682-695.

33. Rolz С., Arriola J., Villadares J. Effect of some physical and chemical pretreatmcnts on the composition, enzymatic hydrolysis and digestibility of lignocellulosic sugar cane residue. Process Biochem., 1987, 2, p. 17-23.

34. McMillan J.D. Pretreatment of lignocellulosic biomass. In: Himmel M.E., Baker J.O., Overend R.P. (Eds.), Enzymatic conversion of biomass for fuels production. American Chemical Society, Washington, DC, 1994, p. 292-324.

35. Kim Т.Н., Kim J.S., Sunwoo C., Lee Y. Y. Pretreatment of corn stover by aqueous ammonia. Bioresour. Technol., 2003, 90, p. 39-47.

36. Jeihanipour A., Taherzadeh M.J. Ethanol production from cotton-based waste textiles. Bioresour. Technol., 2009, 100, p. 1007-1010.

37. Schell D.J., Farmer J., Newman M., McMillan J.D. Dilute-sulfuric acid pretreatment of corn stover in pilot-scale reactor. Appl. Biochem. and Biotech., 2003, 105-108, p. 69-85.

38. Nguyen Q.A., Tucker M.P., Boynton B.L., Keller F.A., Schell D.J. Dilute acid pretreatment of softwoods. Appl. Biochem. Biotechnol., 1998, 70, p. 77-87.

39. Esteghlalian A., Hashimoto A.G., Fenske J.J., Penner M.H. Modeling and optimization of the dilute-sulfuric-acid pretreatment of corn stover, poplar and switchhgrass. Bioresour. Technol., 1997, 59, p. 129-136.

40. Vidal P.F., Molinier J. Ozonolysis of lignin improvement of in v/Jrodigestibility of poplar sawdust. Biomass, 1988, 16, p. 1-17.

41. Brownell H.H., Yu E.K.C., Saddler J.N. Steam-explosion pretreatment of wood: Effect of chip size, acid, moisture content and pressure drop. Biotechnol. Bioeng., 1986, 28, p. 792-801.

42. Sassner P., Martensson C.G., Galbe M., Zacchi G. Steam pretreatment of H2SC>4-impregnated Salix for the production of bioethanol. Bioresour. Technol., 2008, 99, p. 137-145.

43. Stenberg K., Tengborg C., Galbe M., Zacchi G. Optimisation of steam pretreatment of S02~impregnated mixed softwoods for ethanol production. J. Chem. Tech. Biotechnol., 1998, 71, p. 299-308.

44. Rosgaard L., Pedersen S., Meyer A.S. Comparison of different pretreatment strategies for enzymatic hydrolysis of wheat and barley straw. Appl. Biochem. Biotechnol., 2007, 143, p. 284296.

45. Duff S J.B., Murray W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresour. Technol., 1996, 55, p. 1-33.

46. Holtzapple M.T., Humphrey A.E., Taylor J.D. Energy requirements for the size reduction of poplar and aspen wood. Biotechnol. Bioeng., 1989, 33, p. 207-210.

47. Clark T.A., Mackie K.L. Steam explosion of the soft-wood Pinus radiata with sulphur dioxide addition. I. Process optimization. J. Wood Chem. Technol., 1987, 7, p. 373-403.

48. Holtzapple M.T., Jun J.H., Ashok G., Patibandla S.L., Dale B.E. The ammonia freeze explosion (AFEX) process: a practical lignocellulose pretreatment. Appl. Biochem. Biotechnol., 1991,28, p. 59-74.

49. Sharma S.K., Kalra K.L., Grewal H.S. Enzymatic saccharification of pretreated sunflower stalks. Biomass. Bioenergy., 2002, 23, p. 237-243.

50. Holtzapple M., Lundeen J.E., Sturgis R., Lewis J.E., Dale B.E. Pretreatment of lignocellulosic municipal waste by ammonia fiber explosion (AFEX). Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, 34-35, p. 5-21.

51. Clarke A.J. Biodegradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc., Lancaster, 1997, 272 p.

52. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 1993, 293, p. 781-788.

53. Henrissat В., Teeri Т., Warren R.A.J. A scheme for designating enzymes that hydrolase the polysaccharides in the cell walls of plants. FEBS Lett., 1998, 425, p. 352-354.

54. Xu В., Janson J.-C., Sellos D. Cloning and sequencing of a molluscan endo-p-l,4-glucanase gene from the blue mussel Mytilus edidis. Eur. J. Biochem., 2001, 268, p. 3718-3727.

55. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnol., 1997, 15, p. 160-167.

56. Schou C., Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat В., Schiilein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. Eur. J. Biochem., 1993, 217, p. 947-953.

57. Rouvinen J., Bergfors Т., Teeri Т., Knowles J.K.C., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science, 1990, 249, p. 380-386.

58. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. Биохимия, 2002, 67, с. 1026-1050.66. binder М., Teeri T.T. The roles and function of cellulose-binding domains. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 15-28.

59. Linder M., Lindeberg G., Reinikainen Т., Teeri Т., Pettersson G. The difference in affinity between two fungal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution. FEBS Lett., 1995, 372, p. 96-98.

60. Srisodsuk M., Lehtio J., Linder M., Margolles-Clark E., Reinikainen Т., Teeri T. Trichoderma reesei cellobiohydrolase I with an endoglucanase cellulose-binding domain: action on bacterial microcrystalline cellulose. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 49-57.

61. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbal P-l,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families. Microbiol. Rev., 1991, 55, p. 303-315.

62. Schiilein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 71-81.

63. Karlsson J., Siika-aho M., Tenkanen M., Tjerneld F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. J. Biotechnol., 2002, 99, p. 63-68.

64. Schiilein M. Protein engineering of cellulases. Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, p. 239252.

65. Imai Т., Boisset C., Samejima M., Igarashi K., Sugiyama J. Unidirectional processive action of cellobiohydrolase Cel7A on Valonia cellulose microcrystals. FEBS Lett., 1998, 432, p. 113116

66. Stahlberg J., Johansson G., Pettersson G. Trichoderma reesei has no true exo-cellulase: an intact and truncated cellulases produce new reducing end groups on cellulose. Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1157, p. 107-113.

67. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М„ МГУ, 2003, 201 с.

68. McCarter J.D., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 4, p. 885-892.

69. White A., Rose D.R. Mechanism of catalysis by retaining p-glycosyl hydrolases. Curr. Opin. Struct. Biol., 1997, 7, p. 645-651.

70. Withers S.G., Aebersold R. Approaches to labeling and identification of active site residues in glycosidases. Protein Sci., 1995, 4, p. 361-372.

71. Davies G.J., Wilson K.S., Henrissat B. Nomenclature for sugar-binding subsites in glycosyl hydrolases. Biochem. J., 1997, 321, p. 557-559.

72. Divne C., Stahlberg J., Teeri T.T., Jones A. High-resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. J. Mol. Biol., 1998, 275, p. 309-325.

73. Biely P., Vrsanska M., Claeyssens M. The endo-l,4-P-glucanase I from Trichoderma reesei. Action on p-l,4-oligomers and polymers derived from D-glucose and D-xylose. Eur. J. Biochcm., 1991, 200, p. 157-163.

74. Davies G.J., Ducros V., Lewis R.J., Borchert T.V., Schulein M. Oligosaccharide specificity of a family 7 endoglucanase: insertion of potential sugar-binding subsites. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 91-100.

75. Sandgren M., Shaw A., Ropp Т.Н., Wu S., Bott R., Cameron A.D., Stahlberg J., Mitchinson C., Jones A. The X-ray crystal structure of the Trichoderma reesei family 12 endoglucanase 3, ' Cell2A, at 1.9 A resolution. J. Mol. Biol., 2001, 308, p. 295-310.

76. Legio L.L., Larsen S. The 1,62A structure of Thermoascus aurantiacus endoglucanase: completing the structural picture of subfamilies in glycoside hydrolase family 5. FEBS Lett., 2002, 523, p. 103-108.

77. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure, 1995, 3, p. 853-859.

78. Murao S., Sakamoto R., Arai M. Cellulases of Aspergillus aculeatus. Methods Enzymol., 1988, 160, p. 274-299.

79. Tong C.C., Cole A.L., Shepherd M.G. Purification and properties of the cellulases from the thermophilic fungus Thermoascus auranticus. Biochem. J., 1980, 191, p. 83-94.

80. Шульга Т.Н. Свойства целлобиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2008, 125 с.

81. Schulein М. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. J. Biotechnol., 1997, 57, p. 71-81.

82. Tuohy M.G., Walsh D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1596, p. 366-380.

83. McCarthy J.K., Uzelac A., Davis D.F., Eveleigh D.E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-P-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. J. Biol. Chem., 2004, 279, p. 11495-11502.

84. Wong Y., Fincher G.B., McLachlan G.M. Kinetic properties and substrate specificities of two cellulases from Auxin treated Pea Epicolyls. J. Biol. Chem., 1977, 252, p. 1402-1407.

85. Reese E.T., Siu R.G.H., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J. Bacteriol., 1950, 59, p. 485-497.

86. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and some properties of a 1,4-P-D-glucan glucohydrolase associated with the cellulase from the fungus Penicillium funiculosum. Carbohydr. Res., 1982, 110, p. 291-303.

87. Wood T.M., McCrae S.I. Synergism between enzymes involved in the solubilization of native cellulose. Adv. Chem. Ser., 1979,181, p. 181-209.

88. Ryu D.D.Y., Kim C., Mandels M. Competition and sorption of cellulase components and its significance in a synergistic mechanism. Biotechnol. Bioeng., 1984, 26, p. 488-496.

89. Henrissat В., Driguez H., Viet C., Schulein M. Synergism of cellulase from Trichoderma reesei in degradation of cellulose. Bio. Technology, 1985, 3, p. 722-726.

90. Fujii M., Shimizu M. Synergism of endoenzyme and exoenzyme on hydrolysis of soluble cellulose derivatives. Biotechnol. Bioeng., 1986, 28, p. 878-882.

91. Синицын А.П., Митькевич О.В., Калюжный С.В., Клесов А.А. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса. Биотехнология, 1987, 3, с. 39-46.

92. Рабинович M.JL, Клесов А.А., Черноглазов В.М., Вьет В.Н., Березин И.В. Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментов — фактор, определяющий реакционную способность нерастворимой (кристаллической) целлюлозы. Докл. АН СССР, 1981,260, с. 1481-1486.

93. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович M.JL, Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы. Биоорг. химия, 1982, 8, с. 643-651.

94. Синицын А.П., Наджеми Б., Митькевич О.В., Клесов А.А. Взаимное усиление гидролитического действия прочно и слабо адсорбирующихся целлюлазных препаратов. Прикл. биохим. микробиол., 1986, 22, с. 333-336.

95. Klyosov А.А. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation. Biochem., 1990, 129, p. 10577-10585.

96. Гусаков А.В. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени д-ра. хим. наук, М., МГУ, 2005, 385 с.

97. Сипицын А.П., Митькевич О.В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 1987, 3, с. 227-233.

98. Eriksson Т., Karlsson J., Tjerneld F. A model explaining declining rate in hydrolysis of lignocellulose substrates with cellobiohydrolase I (Cel7A) and endoglucanase I (Cel7B) of Trichoderma reesei. Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, 101, p. 41-60.

99. Bothwell M.K., Wilson D.B., Irwin D.C., Walker L.P. Binding reversibility and surface exchange of Thermomonospora fusca E3 and E5 and Trichoderma reesei CBH I. Enzyme Microb. Technol., 1997, 20, p. 411-417.

100. Jervis E.J., Haynes C.A., Kilburn D.G. Surface diffusion of cellulases and their isolated binding domains on cellulose. J. Biol. Chem., 1997, 272, p. 24016-24023.

101. Beldman G., Voragen A.G.J., Rombouts F.M., Searle-van-Leeuven M.F., Pilnik W. Adsorption an kinetic behavior of purified endoglucanases and exoglucanases from Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng., 1987, 30, p. 251-257.

102. Ong E., Greenwood J., Gilkes N., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.AJ. The cellulase-binding domains od cellulases: tools for biotechnology. Trends Biotechnol., 1989, 7, p. 239-243.

103. Milward-Sadler S.J., Poole D., Henrissat В., Hazlewood G., Clarke J.H., Gilbert H.J. Evidence for a general role for high-affinity non-catalytic domains in microbial plant cell wall hydrolases. Mol. Microbiol., 1994, 11, p. 375-382.

104. Esteghlalian A.R., Srivastava V., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Warren R.A.J., Saddler J.N. Do cellulose binding domains increase substrate accessibility? Appl. Biochem. Biotechnol., 2001, 91-93, p. 575-592.

105. Krull L.H., Dintzis F.R., Griffin H.L., Baker F.L. A microfibril-generating factor from the cellulase of Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng., 1988, 31, p. 321-327.

106. Banka R.R., Mishra S., Ghose Т.К. Fibril formation from cellulose by a novel protein from Trichoderma reesei'. a non-hydrolytic cellulolytic component. World J. Microbiol. Biotechnol., 1998, 14, p. 551-558.

107. Banka R.R., Mishra S. Adsorption properties of the fibril forming protein from Trichoderma reesei. Enzyme Microb. Technol., 2002, 31, p. 784-793.

108. Din N., Gilkes N.R., Tekant В., Miller R.C., Warren R.A.J., Kilburn D.K. Non-hydrolytic disruption of cellulose fibers by the binding domain of a bacterial cellulase. Bio Technology, 1991, 9, p. 1096-1099.

109. Xiao Z., Gao P., Qu Y., Wang T. Cellulose-binding domain of endoglucanase III from Trichoderma reesei disrupting the structure of cellulose. Biotechnol. Lett., 2001, 23, p. 711-715.

110. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Целлюлазы микроорганизмов. Прикл. биохим. микробиол., 2002, 38, с. 355-373.

111. Клесов А.А., Рабинович M.JL, Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. П. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников. Биоорг. химия, 1980, 6, с. 1225-1241.

112. Gusakov A.V., Sinitsyn А.Р., Manenkova J.A., Protas O.V. Enzymatic sacharification of industrial and agricultural lignocellulosic wastes. Appl. Biochem. Biotechnol., 1992, 34, p. 625637.

113. Клесов А.А., Синицын А.П. Ферментативный гидролиз целлюлозы. IV. Влияние физико-химических и структурных факторов на эффективность ферментативного гидролиза Биоорг. химия, 1981, 7, с. 1801-1812.

114. Nystrom J.M., Andren R.K., Allen A.L. Enzymatic hydrolysis of cellulosic waste: the status of process technology and economic accessment. AIChE Symp. Ser., 1978, 74, p. 82-88.

115. Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов A.A. Ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса. Биохимия, 1982, 47, с. 1322-1331.

116. Синицын А.П., Митькевич О.В., Клесов А.А. Инактивация препаратов ферментов целлюлазного комплекса при перемешивании и стабилизация целлюлозой. Прикл. биохим. микробиол., 1986, 2, с. 759-765.

117. Prior В.А., Day D.F. Hydrolysis of ammonia-pretreated sugar cane bagasse with cellulase, beta-glucosidase, and hemicellulase preparations. Appl. Biochem. Biotechnol., 2008, 146, p. 151-164.

118. Sukumaran R.K., Singhania R.R., Mathew G.M. and Mathew P.A. Cellulase production using biomass feed stock and its application in lignocellulose saccharification for bio-ethanol production. Renewable Energy, 2009, 34, p. 421-424.

119. Saddler J.N. Screening of highly cellulolitic fungi and the action of their cellulase enzyme systems. Enzyme Microb. Technol., 1982,4, p. 414-418.

120. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов A.A. Влияние состава целлюлазного препарата на эффективность ферментативного гидролиза хлопкового линта. Химия древесины, 1982, 2, с. 91-96.

121. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов А.А. Ферментативное получение глюкозы из целлюлозы: влияние ингибирования продуктами и изменение реакционной способности субстрата на скорость ферментативного гидролиза. Прикл. биохим. микробиол., 1981, 17, с. 315-321.

122. Морозов A.M., Рабинович M.JI., Клесов А.А. Биотехнология непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозы. II. Гидродинамическое сопротивление аппарата колоночного типа. Биотехнология, 1986, 5, с. 52-59.

123. Chen Н., Jin S. Effect of ethanol and yeast on cellulase activity and hydrolysis of crystalline cellulose. Enzyme Microb. Technol., 2006, 39, p. 1430-1432.

124. Wu Z., Lee Y.Y. Inhibition of the enzymatic hydrolysis of cellulose by ethanol. Biotechnol. Lett., 1997, 19, p. 977-979.

125. Клесов А.А., Черноглазое B.M., Ермолова O.B., Елкин B.B. Влияние лигнина на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов. Биотехнология, 1985, 3, с. 106112.

126. Yang В., Willies D.M., Wyman С.Е. Changes in the enzymatic hydrolysis rate of avicel cellulose with conversion. Biotechnol. Bioeng., 2006, 94, p. 1121-1128.

127. Neilson M.J., Kelsey R.G., Shafizadeh F. Enhacement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulose substrates. Biotechnol. Bioeng., 1982, 24, p. 293-304.

128. Berlin A., Balakshin M., Gilkes N., Kadla J., Maximenko V., Kubo S., Saddler J. Inhibition of cellulase, xylanase and beta-glucosidase activities by softwood lignin preparations. J. Biotechnol., 2006, 125, p. 198-209.

129. Palonen H., Tjerneld F., Zacchi G., Tenkanen M. Adsorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin. J. Biotechnol., 2004, 107, p. 65-72.

130. Kristensen J.B., Borjesson J., Bruun M.H., Tjerneld F., Jorgensen H. Use of surface active additives in enzymatic hydrolysis of wheat straw lignocellulose. Enzyme Microb. Technol., 2007, 40, p. 888-895.

131. Boijesson J., Engqvist M., Sipos В., Tjerneld F. Effect of poly(ethylene glycol) on enzymatic hydrolysis and adsorption of cellulase enzymes to pretreated lignocellulose. Enzyme Microb. Technol., 2007, 41, p. 186-195.

132. Dunnett A.J., Adjiman C.S. and Shah N. A spatially explicit whole-system model of the lignocellulosic bioethanol supply chain: an assessment of decentralised processing potential. Biotechnol. Biofuels., 2008, 1, p. 13.

133. Lin Y., Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Appl. Microb. Biotechnol., 2006, 69, p. 627-642.

134. Olofsson К., Bertillson M., Liden G. A short review on SSF an interesting process option for ethanol production from lignocellulosic feedstocks. Biotechnology for Biofuels, 2008, 1, p. 7.

135. Severian D.: Polysaccharides: Structural diversity and functional versatility. Marcel Dekker, New York, 2005, p. 957-984.

136. Chung K.C., Kawai K., Yashima S., Eguchi Y. Purification of cellulolitic enzymes by Penicillium verruculosum. Hakkokogaki-kaishi., 1982, 60, p. 363-367.

137. Берлин A.X. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Penicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1999, с.

138. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М., Элвар, 2000, с. 13-288.

139. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1998,156 с.

140. Гутиеррес Родригес Б. Каталитические, биохимические и биотехнологические свойства эндоглюканазы В4 целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1997, 116 с.

141. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицын А.П. Выделение эндоглюканазы Penicillium verruculosum методом иммуноафшшой хроматографии. Биохимия, 1996, 61, с. 1658-1663.

142. Устинов Б.Б. Свойства ксиланаз Chrysosporium lucbiowense. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006, 148 с.

143. Nelson N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1944, 153, p. 375-379.

144. Somogyi M. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1952, 195, p. 19-23.

145. Ghose, Т.К. Measurement of cellulase activity. Pure Appl. Chem., 1987, 59, p. 257-268.

146. Doner L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate. Anal. Biochem., 1992, 202, p. 50-53.

147. Березин И.В., Рабинович M.JI., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, 42, с. 1631-1636.

148. Snyder L.R., Kirkland J.J. Introduction to modern liquid chromatography (2nd ed.). New York, Wiley-Interscience, 1979, 863 p.

149. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., Мир, 1991, 543 с.

150. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 25, 152 с.

151. Рабинович M.JL, Клесов А.А., Григораш С.Ю., Калнина И.А., Черноглазов В.М. Ферментативный гидролиз целлюлозы. VI. Адсорбция целлобиазы целлюлазного комплекса на целлюлозе. Биоорг. химия, 1982, 8, с. 84-94.

152. Peitsch М.С. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling. Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, p. 274-279.

153. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modelling. Electrophoresis, 1997, 18, p. 2714-2723.

154. Yattes J.R. Mass-spectrometry and age of proteome. J. Mass Spectrom., 1998, 33, p.1-19

155. Varghese J.N., Hrmova M., Fincher G.B. Three-dimensional structure of a barley P~D-glucan exohydrolase, a family 3 glycosyl hydrolase. Structure, 1999, 7, p. 179-190.

156. Dan S., Marton I., Dekel M., Bravdo B.-A., He S., Withers S.G., Shoseyov O. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger P-glucosidase. J. Biologic. Chem., 2000, 275, p. 4973-4980.