Свойства рекомбинантных эндоглюканазы и ксиланазы пенициллов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Список русских сокращений.

Список латинских сокращений названий штаммов.

Введение.

I. Литературный обзор.

ГЛАВА 1. ПОЛИСАХАРИДЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ.

1.1. Целлюлоза и р-глюканы.

1.2. Гемицеллюлозы.

ГЛАВА 2. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ, (З-ГЛЮКАНАЗНЫХ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ.

2.1. Целлюлазы.

2.2. (3-глюканазы.

2.3. Гемицеллюлазы.

ГЛАВА 3. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ЦЕЛЛЮЛАЗ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗ.

3.1. Особенности каталитического механизма действия.

3.2. Доменная структура.

3.3. Современные представления о классификации карбогидраз.

ГЛАВА 4. ЦЕЛЛЮЛАЗЫ И ГЕМИЦЕЛЛЮЛАЗЫ В СОВРЕМЕННЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ.

4.1. Целлюлазы и гемицеллюлазы в текстильной и целлюлозо-бумажной промышленности.

4.2. Целлюлазы и гемицеллюлазы в пищевой и кормовой промышленности.

II. Экспериментальная часть.

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Использованные вещества.

5.1.1. Ферментные препараты.

5.1.2. Субстраты и реактивы.

5.1.3. Хроматографические сорбенты.

5.2. Методы.

5.2.1. Аналитические методы.

5.2.2. Методы определения активности ферментов.

5.2.3. Определение рН- и температурных оптимумов активности гомогенных ферментов.

5.2.4. Изучение стабильности гомогенных ферментов.

5.2.5. Определение кинетических параметров гомогенных ферментов

Км, VM).

5.2.6. Изучение эффекта синергизма.

5.2.7. Изучение адсорбционной способности ферментов на нерастворимых субстратах.

5.2.8. Исчерпывающий гидролиз полисахаридных субстратов.

5.2.9. Хроматографическое исследование состава продуктов гидролиза полисахаридных субстратов.

5.2.10. Выделение и очистка индивидуальных ферментов Penicillium ccmescens.

5.2.11. Определение биохимических параметров индивидуальных ферментов.

5.2.12. Оценка тополигических свойств целлюлаз.

5.2.13. Методы компьютерного моделирования структуры белка.

III. Результаты и их обсуждение.

ГЛАВА 6. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА Pen. canescens КАК ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ.

ГЛАВА 7. ИЗУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ДЕЛЛЮЛАЗНОГО

КОМПЛЕКСА ДИКОГО ШТАММА Pen. canescens.

7.1. Выделение основных («мажорных») компонентов ферментного комплекса Pen.canescens.

7.1.1. Разделение ферментного комплекса на белковые фракции.

7.1.2. Оптимизация метода выделения ферментов из белковых фракций.

7.2. Свойства «мажорных» компонентов ферментного комплекса Pen. canescens.

7.2.1. Биохимические характеристики.

7.2.2. Субстратная специфичность и классификация выделенных ферментов.

7.2.3. рН- и температурные оптимумы активности, стабильность, устойчивость к термошоку.

7.2.4. Кинетические характеристики.

7.2.5. Адсорбционная способность.

7.2.6. Синергетическое взаимодействие между ферментами.

ГЛАВА 8. СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ ШТАММАМИ Pen.canescens, НЕСУЩИМИ ГЕН ЭНДОГЛЮКА-НАЗЫ (ЭГ-3) Pen. verruculosum.

8.1. Штамм Pen.canescens R201.

8.2. Штамм Pen.canescens R 201-151.

8.3. Штаммы Pen.canescens серий «R 201-151-UV5-105»,

R 1000» и «R 3000».

ГЛАВА 9. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАТИВНОЙ И РЕКОМБИ

НАНТНОЙ ЭГ-3.

9.1. Выделение гомогенных ЭГ-Зреки ЭГ-Знат из ферментных комплексов Pen.canescens R 201 и Pen.verruculosum.

9.2. Сравнительное исследование свойств гомогенных ЭГ-Зрек и

9.3 Тополитическая активность ЭГ-Зрек (на примере удаления индиго из джинсовой ткани).

ГЛАВА 10. РЕКОМБИНАНТНАЯКСИЛАНАЗА Pen.canescens.

10.1. Выделение гомогенной Ксил-31рекиз ферментного комплекса Pen. canescens.

10.2. Свойства гомогенной Ксил-31рек.

Выводы.

В настоящее время карбогидразы, в первую очередь — целлюлазы и гемицеллюлазы - находят широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства: для обработки текстильных изделий, в целлюлозно-бумажной промышленности, в моющих средствах, в пищевой промышленности, в качестве кормовых добавок, для осахаривания целлюлозных отходов и т.д.

В целом ряде случаев (например, при обработке текстильных изделий) от ферментов требуется «мягкое» воздействие на ткань, которое проводит к изменению цвета, удалению микроворсинок (биополировка), каким-либо другим изменениям поверхности ткани; однако при этом необходимо, чтобы не происходило глубокой деструкции растительных волокон и потери прочности ткани. Иными словами, необходимо, чтобы ферменты обладали так называемой «тополитической» активностью, в отличие от «сахаролитической» активности, когда происходит глубокая деструкция субстрата с образованием большого количества растворимых Сахаров - то, что происходит при осахаривании целлюлозы. Существуют и некоторые другие особенности, с которыми приходится считаться: например, при удалении пигмента индиго с поверхности ткани идеальным считается случай, когда не происходит ресорбции красителя на целлюлозных волокнах.

Следует подчеркнуть, что «тополитическая» активность - явление среди целлюлаз достаточно редкое. Тем не менее, в результате исследований, проведенных в нашей лаборатории, нам удалось обнаружить эндоглюканазу Pemcillium verruculosum, обладающую нужными свойствами: среди нескольких целлюлаз, продуцируемых Pen. verruculosum, только данный фермент обладал ярко выраженной «тополитической» активностью [1]. Эта эндоглюканаза была выделена и охарактеризована, ген ее клонирован. Она получила название «ЭГ-3». Особенностью ЭГ-3 оказалось то, что она (в том числе по структуре гена) не имеет целлюлозосвязывающего домена (ЦСД), что является достаточно редким свойством целлюлолитических ферментов и что, по-видимому, является одной из причин высокой «тополитической» активности.

Достоверно известно, что ЭГ-3 эффективно удаляет индиго из джинсовой ткани практически без его ресорбции, а также прекрасно «полирует» поверхность ткани, т.е. в определенном смысле является идеальным «тополитическим» ферментом. Однако препятствием для практического применения фермента в биотехнологических процессах оказался низкий уровень секреции ЭГ-3 штаммом Pen.verruculosum. Один из подходов, который позволяет эффективно решать подобную проблему, заключается в клонировании гена интересующего фермента в клетку специально подготовленного «штамма-хозяина» с тем, чтобы добиться высокого уровня секреции именно этого целевого фермента (например, с получением монокомпонентных ферментных препаратов, как нельзя лучше приспособленных к выполнению определенной функции, в данном случае — для обработки поверхности текстильных изделий).

В нашей лаборатории была поставлена цель создать ферментный препарат на основе рекомбинантной ЭГ-3, который мог бы эффективно использоваться для обработки хлопчатобумажных тканей. Весьма важным вопросом являлся выбор микроорганизма-«хозяина», который должен был обладать способностью к биосинтезу высокого уровня целевого белка, а также способностью экспрессировать гликозилированные белки, гены которых имеют интроны. С нашей точки зрения таким микроорганизмом-«хозяином» мог быть какой-либо грибной штамм. Следует отметить, что число возможных грибных «хозяев», способных к секреции большого («промышленно значимого») количества рекомбинантного белка крайне ограничено - к ним относятся некоторые штаммы Aspergillus, Trichoderma, Humicola, использовать которые весьма затруднительно, например, из-за патентной ситуации. Совместно с группой исследователей из ФГУП «ГНИИ Генетика» мы пришли к выводу, что можно использовать в качестве возможного «хозяина» гриб Penicillium canescens [2], который был селекционирован ранее как продуцент (3-галактозидазы («Р-Гал», [3-6]). Аргументами в пользу такого выбора послужили следующие факты:

1) ранее был обнаружен промотор р-Гал (jpbgaS, относится к немногочисленной группе сильных грибных промоторов) и получен штамм Pen. canescens с амплифицированным геном собственной Р-Гал, в котором уровень продукции фермента увеличен на порядок [3, 7, 8], 2) Pen.canescens секретирует относительно узкий по составу спектр внеклеточных ферментов, 3) не секретирует собственных целлюлаз, 4) практически не продуцирует внеклеточные протеазы, 5) имеет более высокие скорость роста культуры и биосинтеза внеклеточных ферментов, чем другие грибные штаммы, 6) растет на простой по составу и не дорогой питательной среде, 7) процесс ферментации легко масштабируется [9].

Для достижения цели создания на основе Pen.canescens эффективного суперпродуцента рекомбинантных ферментов, сохраняющих свойства нативных ферментов, в рамках диссертационной работы необходимо было решить следующие задачи:

• Выделить и изучить свойства основных («мажорных») компонентов ферментного комплекса, продуцируемого исходным штаммом Pen.canescens (ранее была исследована лишь Р-Гал). Информация о составе внеклеточных ферментов, секретируемых клеткой-хозяином Pen.canescens, важна для выбора генов клонируемых гетерогенных белков. С другой стороны, обнаружение другого или других (помимо р-Гал) мажорных секретируемых белков Pen. canescens дает возможность использовать их промоторы в дополнение к bgaS. Наконец, внеклеточные ферменты могут выполнять регуляторную функцию, а также найти практическое применение.

• Исследовать активность и состав ферментных препаратов, полученных на основе новых штаммов Pen.canescens, несущих ген рекомбинантной ЭГ-3 из Pen.verruculosum, и провести селекцию штаммов, обладающих наиболее высокой продукцией рекомбинантной ЭГ-3.

• Выделить рекомбинантную ЭГ-3 и исследовать ее биохимические и кинетические характеристики, субстратную специфичность, тополитические свойства, возможность практического применения и сравнить их со свойствами нативного фермента.

• Дополнительно в ходе выполнения диссертационной работы возникла задача изучить свойства рекомбинантной эндо-Р-1,4-ксиланазы, полученной с помощью гомологичной экспрессии в Pen.canescens.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1. ПОЛИСАХАРИДЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

Полисахариды - целлюлоза и гемицеллюлозы - совместно с лигнином составляют основную часть органической материи на нашей планете. Они формируют клеточные стенки растений и, следовательно, являются важным структурным компонентом древесины, хлопка и травянистых растений. Целлюлоза -идеальный возобновляемый источник сырья для целлюлозно-бумажной и текстильной промышленности, а также для производства синтетических материалов. В перспективе, с дальнейшим развитием промышленных ферментных технологий, целлюлоза может стать незаменимым источником углеводов для производства пищевых продуктов и топлива. Наряду с целлюлозой, древесина содержит большое количество гемицеллюлоз (одним из основных компонентов которых являются ксиланы). Эти полисахариды и их мономерные строительные блоки - глюкоза, манноза, галактоза, ксилоза, арабиноза - являются сырьевой базой промышленных процессов, направленных на получение разнообразных полезных продуктов микробиологического синтеза. В данной главе будут рассмотрены свойства полисахаридов клеточной стенки растений.

Растительная клетка состоит из цитоплазмы, окруженной клеточной мембраной (стенкой). Клеточная стенка плотно прилегает к внешней поверхности цитоплазматической мембраны. Толщина клеточной стенки варьирует от 0.1 до нескольких мкм. У многоклеточных организмов оболочки соседних клеток скреплены между собой пектиновыми веществами, образующими срединную пластинку, пронизанную сетью каналов для циркуляции жидкости по всей клеточной ткани [10].

Срединная пластинка образуется при делении меристематических клеток. Протопласт каждой дочерней клетки откладывает со своей стороны на срединную пластинку собственную оболочку, состоящую главным образом из гемицеллюлоз. При этом новая клетка растет, растягиваясь в одном направлении (измерении), а новые порции целлюлозы и гемицеллюлозы «внедряются» в растягивающуюся оболочку. Оболочки делящихся и растущих клеток называют первичными. Они богаты водой и содержание целлюлозы в них относительно невелико (не более 30%). Для многих видов растительных клеток образование новых слоев оболочки прекращается с прекращением роста клетки. У некоторых клеток отложение оболочки изнутри продолжается и после окончания роста. При этом толщина и жесткость клеточной стенки увеличивается, а объем полости клетки сокращается. Такой процесс носит название вторичного утолщения оболочки, а сама оболочка называется вторичной (см. рис.1а, [11]). Вторичная оболочка выполняет главным образом механическую функцию. Наиболее обычна она в клетках опорных тканей. Химический состав вторичной оболочки иной, чем у первичной. В ней содержится меньше воды, а количество целлюлозы достигает 40-50% от массы сухого вещества. Вторичная оболочка иногда формируется неравномерно, что позволяет клеткам сохранять способность к растяжению в длину. Стенки клеток, имеющие вторичные утолщения, часто одревесневают вследствие образования в их матриксе лигнина [10].

Основные полисахариды клеточной стенки растений, их структура и состав представлены ниже в таблице (см. также рис. 16, [11]).

Основные полисахариды клеточных стенок высших растений [11] Полисахарид Структура Основные мономеры

Целлюлоза (5-1,4-О-Глюкан Глюкоза

Пектины Полигалактуроновые кислоты Галактуроновая кислота и ее метиловый эфир

Рамногалактуроновые кислоты Рамноза, галактуроновая кислота

Галактан, арабиногалактан Арабиноза, галактоза

Гемицеллюлозы Ксилан (арабиноксилан, Ксилоза, арабиноза, глюкуроновая глюкуроноксилан) кислота

Ксилоглюканы Ксилоза, глюкоза

3-1,3-; 0-1,3;1,4-О-Глюканы Глюкоза

Галактоманнаны Галактоза, манноза

Глюкурономаннаны Глюкуроновая кислота, манноза

Клеточная мембрана

Цитоплазма н Срединная пластинка шш Первичная клеточная стенка

Вакуоль

Вторичная клеточная стенка

Рисунок 1а. Изменения, происходящие в клеточной стенке в процессе ее развития [11].

Рисунок 16. Схематичное изображение первичной клеточной стенки растений [11].

включение) bgaS-)(xylA+)

R 2Q1-151-UV5-105| ^

Суперпродуцент ЭГ-3 Дерепрессирован по глюкозе р bgaSr.egl + рxylAr.egl А

R3020| (bgaS -) Суперпродуцент ЭГ-3

PCA-Xyl 23|

Суперпродуцент Ксил-31

УФ-мутагенез

DR 2011 р bgaS::egl (замещение) 1

R 201-1511 (bgaS-) Суперпродуцент ЭГ-3

Рисунок 27. Эволюция штаммов Pen. canescens.

ГЛАВА 9. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НАТИВНОЙ И РЕКОМБИНАНТНОЙ ЭГ-3

Целью данного этапа исследования было препаративное выделение рекомбинантной ЭГ-3 в гомогенном виде и изучение ее свойств в сравнении со свойствами нативной ЭГ-3, секретируемой Pen.verruculosum.

9.1. Выделение гомогенных ЭГ-Зрек и ЭГ-Знат из ферментных комплексов Pen.canescens R 201 и Pen.verruculosum

Рекомбинантную ЭГ-3 (ЭГ-Зрек) выделяли из ферментного препарата Pen.canescens R 201 (# 379.2.1) по стандартной схеме, включавшей стадии предварительной очистки и грубого фракционирования ферментного комплекса и последующую стадию тонкого разделения о.ф., содержащей искомый белок. Результаты первой стадии - хроматофокусирования препарата Pen.canescens R 201 -изложены в разделе 7.1.1. Напомним, что ЭГ-Зрек элюировалась в самом начале градиента рН 7.8-7.5 в составе первых трех мажорных фракций (см. рис. 24а, на котором ЭГ-Зрек отвечает серия пиков, заштрихованных красным цветом, и рис. 286(1)). Однако,согласно данным ДЦС-ЭФ (см. рис. 25), наряду с ЭГ-Зрек (мажорная полоса в районе 22-24 кД) эти фракции содержали ряд других минорных белков, от которых теперь предстояло избавиться. Мы провели серию предварительных экспериментов по оптимизации методики выделения ЭГ-Зрек в гомогенном виде, итогом которых стала следующая схема:

• 1-ая стадия: хроматофокусирование ЭГ-Зрек-содержащей фракции на колонке Mono Р HR 5/20 в диапазоне рН 8.0-6.0;

• 2-ая стадия: ГПХ среднего давления на колонке Superose 12 HR 10/30.

Хроматограмма, полученная в ходе первой стадии, представлена на рис. 286 окно с маркировкой «И»). ЭГ-Зрек (степень гомогенности «80-85%) содержалась в 4 фракциях (пики, выделенные на рисунке красной линией). Как показал ДЦС-ЭФ, в

Рисунок 28. Выделение гомогенных ферментов ЭГ-3ШТ и ЭГ-Зрек:

Окна «I» - хроматограммы разделения ферментных комплексов (хроматофокусирование УФ-концентратов культуральной жидкости на колонке Mono Р HR 5/20, «Pharmacia», Швеция), секретируемых штаммами: а) Pen.verruculosum (градиент рН 7.3-5.5); б) Pen.canescens R 201 (градиент рН 8.0-3.0).

Окна «II» - хроматограммы хроматофокусирования на колонке Mono Р HR 5/20 («Pharmacia», Швеция) фракций, содержащих: а) ЭГ-Знат (градиент рН 6.3-5.3; стартовый буфер - 0.025 М имидазол-HCl, рН 6.0; элюент - полибуфер РВ 74, рН 5,5; скорость потока - 0.6 мл/мин). Синие обозначения - значения рН элюции данной фракции. б) ЭГ-3 рек (градиент рН 8.0-6.0; стартовый буфер - 0.075 М ТРИС-ацетат, рН 8.4; элюент - полибуфер РВ 96, рН 6.5; скорость потока - 0.6 мл/мин). Синие обозначения - значения рН элюции данной фракции. в) дополнительная очистка фракций, содержащих ЭГ-Зрек, методом ГПХ среднего давления на колонке Superose 12 HR 10/30 («Pharmacia», Швеция; элюент - 0.1 М ацетатный буфер, рН 5.0; скорость потока - 0.5 мл/мин. результате этой стадии удалось полностью отделить белки «соседней», более щелочной фракции (в том числе и «мажорную» Ксил-31). Однако в составе рабочей фракции все еще присутствовали белки, элюирующихся при более кислых, чем ЭГ-Зрек, значениях рН. Попытки избавиться от них с помощью повторного хроматофокусирования не принесли успеха в связи с близостью изоточек (pi). Поэтому для отделения ЭГ-Зрек от примесей минорных белков мы решили применить иной подход, основанный на разнице размеров белковых молекул. Наиболее продуктивным оказался метод ГПХ среднего давления. В ходе разделения фракции, обогащенной ЭГ-Зрек, на колонке Superose 12 HR 10/30 (см. рис. 28в), мы получили фракцию, содержащую ЭГ-Зрек в гомогенном - согласно данным ДДС-ЭФ с применением высокочувствительного метода окраски AgN03 (см. рис. 29а) и ИЭФ (см. рис. 296) - виде; степень гомогенности >99%. Именно эту фракцию и использовали в дальнейших исследованиях субстратной специфичности и иных свойств ЭГ-Зрек.

Mr

• 97

Ц 66

• 45

• 36

29

• 24

• 2U

14

2 i 4. г 2 м с> а) р!

5,4 1

5.1

46 i

4.2 «I

3.6 М эг з,» эг-з,. б)

Рисунок 29. ДДС-ЭФ (1% ДДС-Na, 0.1% p-меркапто этанол, 12% гель, окрашивание AgN03) и ИЭФ ЭГ-Зрек и ЭГ-Знат, полученных в ходе фракционирования ферментных комплексов Pen.canescens R 201 и Pen.verruculosum, соответственно: а) ДДС-ЭФ; б) ИЭФ.

М» - стандартные маркеры для ДДС-ЭФ и ИЭФ.

Нативная ЭГ-3 (ЭГ-Знат) была выделена нами из ферментного препарата Pen.verruculosum (# 3.55.1.1) по методике, разработанной ранее в нашей лаборатории и изложенной в работе [1]. Ферментный комплекс Pen.verruculosum осаждали 80% (от насыщения) раствором сульфатом аммония. Осадок центрифугировали и перерастворяли в буфере имидазол-НС1 (0.025 М, рН 7.4). Полученный раствор обессоливали гель-фильтрацией на колонке с носителем «Биогель Р6», уравновешенной тем же имидазольным буфером. Обработанный таким образом препарат подвергали хроматофокусированию на колонке Mono Р HR 5/20 в градиенте рН 7.3-5.5 (см. рис. 28а, окно «I»). Далее фракцию, обогащенную искомым ферментом (рН фракции 6.3, степень гомогенности «93%), наносили на колонку Mono Р и проводили повторное элюирование в градиенте рН 6.3-5.3 (см. рис. 28а, окно «II»). В результате была собрана фракция, содержащая ЭГ-Знат с удовлетворительной - согласно данными ДДС-ЭФ (окрашивание AgN03, см. рис. 29а) и ИЭФ (см. рис. 296) - степенью гомогенности, пригодной для исследования субстратной специфичности и иных свойств фермента (степень гомогенности >99%). Таким образом, для ЭГ-Знат дополнительной третьей стадий очистки (такой как ГПХ для ЭГ-Зрек) не потребовалось.

9.2. Сравнительное исследование свойств гомогенных ЭГ-Зрек и ЭГ-Знат

Свойства ЭГ-Зрек изучали в сопоставлении со свойствами нативного фермента. Основные подходы к исследованию свойств ферментов изложены нами в начале раздела 7.2. Приведенную там общую схему мы дополнили следующими пунктами:

• исследование тополитической активности ферментов;

• определение состава углеводной части молекулы;

• определение а.к. состава полипептидной молекулы;

• моделирование третичной структуры молекулы белка.

Сравнение биохимических параметров показало, что оба белка обладали очень близкими Mr, равными 24 кД для ЭГ-Знат и 22-23 кД для ЭГ-Зрек (по данным ДЦС-ЭФ, см. рис. 29а), но отличались своими pi и степенями гликозилирования. ЭГ-Зрек характеризовалась более щелочной изоточкой (pi 6.1), чем ЭГ-Знат (pi 5.4, см. рис. 296). По-видимому, именно разницей в значениях pi ферментов объясняется тот факт, что в процессе хроматофокусирования фракция, содержащая ЭГ-Зрек, элюировалась при более высоких значениях рН, чем ЭГ-Знат (см. рис 28, окна «II»). Разница в значениях pi белков может быть связана с различием в их углеводном составе. Было установлено, что оба белка гликозилированы (общее содержание углеводов в ЭГ-Зреки ЭГ-Знат составило 1.8 и 2.1%, соответственно). ЭГ-Зрек имела в составе углеводной части галактозу, маннозу и глюкозу (в мол. соотношении 15.6 : 1.1 : 1), сиаловая кислота в составе углеводной части ЭГ-Зрек обнаружена не была. ЭГ-Знат имела в углеводной части галактозу и маннозу (в соотношении 1 : 1.7), а также сиаловую кислоту, содержание которой составило 0.065% от массы белковой части молекулы (анализ углеводной части ферментов был осуществлен в ИБХ РАН д.б.н. Н.В.Бовиным). Наличие сиаловой кислоты в составе ЭГ-Знат может, на наш взгляд, служить объяснением более высокого значения pi этого фермента по сравнению с pi ЭГ-Зрек.

Сравнение субстратной специфичности не выявило принципиальной разницы между исследуемыми ферментами (см. Табл. 9). Как ЭГ-Зрек, так и ЭГ-Знат проявляли свойства, типичные для эндо-1,4-Р-глюкозилгидролаз: они активно гидролизовали растворимые полимерные целлюлозные субстраты, содержащие (5-1,4-глюкозидные связи (КМЦ и ее производные, Р-глюканячменя^лихенан), но оставались инертными по отношению к р-1,3-глюканам (ламинаран, курдлан), а также к нерастворимым целлюлозным (ФБ и МКЦ) и низкомолекулярным синтетическим (пНФГ, пНФЦ и др.) субстратам. Ни ЭГ-Знат, ни ЭГ-Зрек не гидролизовали ксилан, арабинан, галактоманнан и другие высоко- и низкомолекулярные гемицеллюлозные субстраты. Различие между двумя ферментами заключалось в более высоких удельных значениях специфических активностей ЭГ-Зрек: вискозиметрическая, Р-глюканазная (как по Р-глюкану овса, так и по лихенану) и КМЦ-азная (как по КМЦ, так и по ее окрашенным производным) активности ЭГ-Зрек превысили таковые ЭГ-Знат в 1.8, 1.4 и 1.3-1.4 раза, соответственно.