Свойства ксиланаз Chrysosporium lucknowense тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. КСИЛАНЫ И КСИЛАНОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ФЕРМЕНТОВ

1.1. Структура и распространение ксиланов

1.2. Ферменты, участвующие в конверсии ксиланов

ГЛАВА 2. Эндо-1,4-р-КСИЛАНАЗЫ

2.1. Классификация, особенности молекулярного строения и механизм действия ксиланаз

2.2. Свойства ксиланаз из различных источников

2.3. Белковые ингибиторы ксиланаз в злаках

ГЛАВА 3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КСИЛАНАЗ

3.1. Ксиланазы в целлюлозно-бумажной промышленности

3.2. Использование ксиланаз в качестве компонента кормовых добавок 38 Ь 3.4. Другие перспективные направления применения ксиланаз

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

4.1. Используемые ферменты и препараты

4.2. Субстраты и реактивы

4.3. Методы выделения ксиланаз С. Ыскпоч/епяе

4.4. Хроматографический анализ ферментных препаратов

4.5. Определение ферментативной активности, концентрации ВС и белка

4.6. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности ксиланаз

4.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов

4.8. Изучение термостабильности ксиланаз

4.9. Исследование адсорбции ферментов на МКЦ

4.10. Исчерпывающий гидролиз полимерных субстратов под действием ^ ферментов

4.11. Анализ молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов гидролиза арабиноксилана

4.12. Анализ низкомолекулярных продуктов гидролиза ксиланов

4.13. Трипсинолиз белков и подготовка проб для масс-спектрометрии

4.14. Масс-спектрометрический анализ Сахаров и трипсиновых гидролизатов белков

4.15. Метод оценки влияния белковых ингибиторов ржи на активность ксиланаз

4.16. Оценка способности ферментов снижать вязкость экстрактов ржаной муки (in vitro тест, имитирующий работу фермента в качестве кормовой добавки)

4.17. Оценка способности ферментов к биоотбеливанию небеленой целлюлозы 53 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ С. LUCKNOWENSE

5.1. Компонентный состав и общая характеристика ферментного комплекса С. lucknowense

5.2. Выделение ксиланаз и их биохимические характеристики

5.3. Свойства гомогенных ксиланаз С. lucknowense

5.3.1. Специфичность ксиланаз и механизм их действия на полимерные субстраты

5.3.2. Физико-химические свойства ксиланаз С. lucknowense

ГЛАВА 6. КЛАССИФИКАЦИЯ И МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ КСИЛАНАЗ

6.1. Масс-спектрометрический анализ выделенных белков и аминокислотные последовательности их пептидов

6.2. Аминокислотные последовательности и строение ХупЮА и ХупЮВ — гликозид-гидролаз 10-й семьи

6.3. Аминокислотные последовательности и строение Xynl 1А и Xynl 1С -гликозид-гидролаз 11-й семьи

ГЛАВА 7. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И СВОЙСТВА ПРЕПАРАТОВ С КЛОНИРОВАННЫМИ КСИЛАНАЗАМИ С. LUCKNOWENSE

7.1. Общая характеристика и свойства препаратов на основе штаммов гриба с мультикопированными генами ксиланаз

7.2. Анализ компонентного состава ферментных препаратов с увеличенным содержанием ХупЮА, Xynl 1А и ХупЮВ

ГЛАВА 8. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ КСИЛАНАЗ С. ШСШОШИБЕ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ И В ЦЕЛЛЮЛОЗНО-БУМАЖНОЙ 120 ПРОМЫШЛЕННОСТИ

8.1. Влияние белковых ингибиторов злаков на активность выделенных ксиланаз

8.2. Оценка эффективности действия индивидуальных ксиланаз и ксиланазных препаратов при их использовании в качестве добавки к кормам на основе ржи

8.3. Сравнение способности индивидуальных ксиланаз и препаратов С. 1искпо\уете к биоотбеливанию небеленой целлюлозы

ВЫВОДЫ

В настоящее время развитие современной энзимологии осуществляется по двум направлениям. Первое вкшочает в себя накопление фундаментальных знаний и углубленное изучение механизма действия ферментов. Второе связано с поиском возможности их использования в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах. Необходимость перехода на более новые экономичные и безопасные с точки зрения экологии технологические процессы способствует интенсивному изучению прикладных аспектов ферментативного катализа.

Ксиланазы и в целом ксиланолитическая система ферментов участвуют в биодеградации гемицеллюлоз, а именно ксиланов, которые являются одними из наиболее распространенных полисахаридов на Земле [1]. Источником этих ферментов служат микроскопические грибы, различные виды аэробных и анаэробных бактерий, а также дрожжи.

Фундаментальные исследования ксиланаз начались около 50 лет назад (несколько позже, чем целлюлаз). Эти ферменты в первую очередь рассматривались в качестве биокатализаторов для глубокой конверсии возобновляемого растительного сырья, ферментативного получения глюкозы и ксилозы и, в конечном счете, биотоплива — этанола [2]. Однако только к концу 1980-х годов ксиланазы заняли свою, хотя и небольшую, но прочную нишу среди промышленных ферментов. Можно выделить ряд технологических процессов, в которых ксиланазы играют ключевую роль. Среди них: биоотбеливание целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности; использование ксиланаз в качестве добавки к комбикормам; хлебопечение; производство соков и вин; переработка отходов сельскохозяйственных и пищевых производств; конверсия гемицеллюлозного сырья с целью получения ксилита и этанола [1-3,4]. Применение биокатализаторов в каждом из перечисленных процессов обосновано как с экономической, так и с экологической точки зрения.

По оценкам специалистов современный рынок промышленных ферментов составляет около 2 млрд. долларов США, при этом доля карбогидраз, гидролизующих некрахмалистые полисахариды (целлюлаз, ксиланаз и пектиназ), составляет более 20% [2,5]. Ксиланазные препараты выпускаются во многих странах ведущими компаниями — производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), PrimAlko (Финляндия), Diversa Corporation (США), BASF

ФРГ), АВ Enzymes Gmbh (ФРГ), Alltech (США) и др. Подавляющие большинство ксиланазных препаратов производится на основе различных штаммов грибов Trichoderma reesei (Т. longibrachiatum), Humicola insolens, Aspergillus niger, а также бактерий Bacillus sp. С развитием генной инженерии для получения ксиланаз широко начали использовать трансгенные конструкции, полученные путем клонирования генов бактериальных ксиланаз в грибные штаммы-продуценты.

Безусловно, от ферментов, применяемых в промышленности, требуется наличие определенных свойств, таких как высокая активность в нужном диапазоне рН, стабильность и, для некоторых процессов, устойчивость к воздействию ингибиторов растительного происхождения. Этот факт стимулирует поиск новых источников ксиланаз и поддерживает развитие фундаментальных знаний о строении, классификации и особенностях механизма действия этих ферментов.

В середине 1990-х годов в нашей лаборатории совместно с коллегами из Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН был найден новый перспективный продуцент целлюлаз и ксиланаз - мицелиальный гриб Chrysosporium lucknowense [б]. Данный продуцент обладает рядом преимуществ по сравнению с другими известными источниками карбогидраз, например, Т. reesei. Гриб способен расти в широком диапазоне рН (4,5-9,0) и температуры (25-43°С). Наиболее продуктивные штаммы С. lucknowense секретируют до 50-80 г/л внеклеточного белка, основная часть которого — ферменты, участвующие в конверсии полисахаридов. Серьезным преимуществом данного продуцента является способность секретировать карбогидразы, обладающие высокой активностью и стабильностью в нейтрально-щелочной среде, что делает его ферменты перспективными для использования в ряде биотехнологических процессов, например, в случае ксиланаз, для биоотбеливания целлюлозы в целлюлозно-бумажной промышленности.

В настоящий момент достаточно хорошо изучен лишь целлюлазный комплекс ферментов, продуцируемый С. lucknowense [7], однако системного исследования ксиланаз не проводилось. Сведения, относящиеся к ним, отсутствуют в научной литературе и белковых базах данных. Поэтому актуальность данного исследования продиктована как необходимостью системного изучения фундаментальных свойств и особенностей функционирования ксиланаз С. lucknowense, так и возможностью в перспективе использовать некоторые из них в качестве промышленных биокатализаторов.

Исходя из этого, в диссертационной работе были поставлены следующие цели и задачи:

• выделить и детально охарактеризовать все секретируемые грибом

С. Ыскпомете ксиланазы, включая изучение их субстратной специфичности, особенностей механизма действия, биохимических и физико-химических свойств;

• получить информацию по аминокислотным последовательностям белков (или отдельных пептидов), на основании которой ферменты могли бы быть классифицированы с точки зрения принадлежности к той или иной семье гликозид-гидролаз;

• исследовать свойства ферментных препаратов на основе штаммов гриба с мультикопированными генами собственных ксиланаз;

• среди выделенных ферментов выявить наиболее перспективные с точки зрения возможности их применения в целлюлозно-бумажной промышленности и в качестве добавки к комбикормам.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

выводы

1. Разработана многостадийная схема очистки ксиланаз Chrysosporium lucknowense, с помощью которой выделены в гомогенном виде 8 ферментов: 31 кДа, pi 8,9; 42 кДа, pi 7,8; 46 кДа, pi 4,3; 57 кДа, pi 4,4; 38 кДа, pi 4,8; 24 кДа, pi 7,9; 23 кДа, pi 8,4; 22 кДа, pi 6,7. На основании анализа пептидных «фингерпринтов», полученных методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, установлено, что ксиланазы с молекулярной массой 31 и 42 кДа (а также другая пара ксиланаз - 46 и 57 кДа) являются двумя формами одного и того же фермента. Показано, что высокомолекулярные формы указанных ксиланаз представляют собой полноразмерные ферменты, которые содержат каталитический домен и целлюлоз освязывающий модуль (ЦСМ), соединенные между собой пептидным линкером. У низкомолекулярных форм (31 и 46 кДа), а также у всех остальных ксиланаз ЦСМ отсутствует.

2. Подробно исследованы свойства гомогенных ксиланаз С. lucknowense — субстратная специфичность; влияние температуры и рН на активность и стабильность ферментов; механизм и кинетика деполимеризации глюкуроноксилана и арабиноксилана. Показано, что все ферменты являются эндо-деполимеразами по типу действия на полимерный субстрат, при этом большинство из них обладает высокой активностью в пейтралыю-щелочном диапазоне рН.

3. Определены аминокислотные последовательности пептидов из выделенных ксиланаз. На основании пептидного анализа и данных о субстратной специфичности ферментов установлено, что ксиланазы С. lucknowense относятся к 10-й и 11-й семьям гликозид-гидролаз, в результате чего они классифицированы как ХупЮА (31 и 42 кДа), ХупЮВ (46 и 57 кДа), ХупЮС (38 кДа), Xynl 1А (24 кДа), Xynl 1В (23 кДа), Xynl 1С (22 кДа).

4. На основании сравнительного анализа полных аминокислотных последовательностей четырех ксиланаз С. lucknowense, а также моделей их трехмерных структур, созданных с помощью программы Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/), относительно ряда известных ксиланаз, имеющихся в белковых базах данных, выявлены каталитические остатки у ХупЮА (Glu-191, Glu-302), ХупЮВ (Glu-131, Glu-239), XynllA (Glu-93, Glu-186), Xynl 1С (Glu-98, Glu-190). В случае ХупЮВ теоретически обоснована и экспериментально подтверждена устойчивость фермента к воздействию белковых ингибиторов из злаков.

Проведен анализ содержания ксиланаз в ферментных препаратах на основе различных штаммов С. 1искпом>еп8е с мультикопированными генами ху11 (ХупЮА), ху12 (Хуп11А) и ху13 (ХупЮВ). Показано, что клонирование приводит к возрастанию экспрессии целевых белков в 6-200 раз. С помощью новой, специально разработанной лабораторной методики проведена оценка способности индивидуальных ксиланаз и ферментных препаратов С. ¡искпомете снижать вязкость экстрактов ржи для выяснения возможности применения этих ферментов в качестве добавки к комбикормам для птиц. Установлено, что из всех выделенных ксиланаз только ХупЮВ способна эффективно снижать вязкость экстрактов, поскольку она не подвергается воздействию белковых ингибиторов злаков. Продемонстрирован высокий потенциал ферментного препарата на основе штамма С. Ыскпоу^епзе Ху13#121 с мультикопированным геном ху13 (ХупЮВ).

Проведены лабораторные испытания индивидуальных ксиланаз и ферментных препаратов С. 1искпом>епзе в процессе биоотбеливания целлюлозной пульпы из лиственной и хвойной древесины. Показано, что наиболее эффективными являются низкомолекулярная форма ХупЮА, а также ХупИА и Хуп11В. Установлено негативное влияние ЦСМ в случае полноразмерных форм ХупЮА и ХупЮВ. Показана высокая биоотбеливающая способность препарата на основе штамма С. Ыскпо^епзе Ху12#18 с мультикопированным геном ху12 (Хуп11А).

1. Polizeli M.L., Rizzatti A.C.S., Monti R., Terenzy H.F., Jorge J.A., Amorim D.S. Xylanases from iungi: properties and industrial applications. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. V. 67, P. 577-591.

2. Bhat M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. // Biotechnol. Adv. 2000. V. 18. P. 355-383.

3. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 56. P. 326338.

4. Jeffries T.W., Viikari L. Enzymes for Pulp and Paper Processing. // Amer. Chem. Soc. 1996. 326 p.

5. Howard R.L., Abotsi E., van Rensburg E.L.J., Howard S. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. // African J. Biotechnol. 2003. V. 2 (12). P. 602-619.

6. Соловьева И.В., Окунев O.H., Крюкова Е.Г., Попова Н.Н., Синицын А.П., Черноглазов В.М. Нейтральные целлюлазы мицеллиальных грибов: поиск продуцентов и изучение некоторых свойств. // Прикл. Биохим. Микробиол. 1997. Т. 33 (4). С. 388-392.

7. Гусаков А.В. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз: фундаментальные и прикладные аспекты. // Диссер. на соискание уч. степени доктора хим. наук. Москва. МГУ. 2005. 385 с.

8. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. // Москва. Мир. 1986. 387 с.

9. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharide and their applications. // Marcel Dekker Inc. New York. 1995. 654 p.

10. Carpita N.C., Gibeaut D.M. Structural models of primary-cell walls in flowering plants consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. // Plant J. 1993. V. 3 (1). P. 1-30.

11. Шестрем Э., Янсон Я. Гемицеллюлозы. В сб. Химия древесины, Йенсен В. (ред.). // Москва. Мир. 1982. С. 130-138.

12. Coughlan М.Р., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. // Portland Press Research Monograph. London-Chapel Hill. 1993. V. 4.120 p.

13. Collins Т., Gerday Ch., Feller G. Xylanases, xylanase families and extermophilic xylanases. // FEMS Microbiol. Rew. 2005. V. 29. P. 3-29.

14. Scalbert A., Monties B., Lallelmand J.Y., Guitted E., Rolando C. Ether linkage between phenolic acids and lignin fractions from wheat straw. // Phytochem. 1985. V. 24. P.1359-1362.

15. Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P J., Curzon E.H. Linkage ofp-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. // Carbohydr. Res. 1986. V. 148. P. 71-85.

16. Percival E.G.V. The xylan of Rhodymenia palmata. II Nature. 1950.V. 166. P. 787788.

17. Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-P-l,4-xylanase families: differences in catalytic properties. // J. Biotechnol. 1997. V. 57. P. 151-166.

18. Atkins E.D.T. Three dimensional structure, interactions and properties of xylans. In Xylan and xylanases, Visser J. (ed.). // Amsterdam. Elsevier. 1992. P. 21-39.

19. Biely P. Microbial xylanolytic systems. // Trends Biotechnol. 1985. V. 3. P. 286-290.

20. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. P-l,4-Xylan-degrading enzyme systems: biochemistry, molecular biology and applications. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. V. 17. P. 259-289.

21. Gomes M., Isorna P., Rojo M., Estrada P. Kinetic mechanism of P-xylosidase from Trichoderma. reesei QM9414. // J. Molecular Catalysis. 2001. V. 16. P. 7-15.

22. Vocadlo D.J., Wicki J., Rupitz K., Withers S.G. Mechanism of Thermoanaerobacterium saccharalyticum beta-xylosidase: kinetic studies. // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 9727-9735.

23. Beldman G., Shols H.A., Piston S.M., van Leeuwen MJ.F.S. Arabinan and arabinan degrading enzymes. // Adv. Macromol. Carbochydr. Res. 1997. V. 1. P. 1-64.

24. Kormelink FJ.M.,. van Leeuwen MJ.F.S, Wood T.M., Voragen A.G.J. Purification and characterization of a (l,4)-P-arabinoxylan arabinofiiranhydrolase from Aspergillus awamori. II Appl. Microbiol. Bitechnol. 1991. V. 35. P. 753-758.

25. Kroon P.A., Williamson G. Release of ferulic acid from sugar-beet pulp by using arabinase, arabinofuranosidase and an esterase from Aspergillus niger. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. V. 23. P. 263-267.

26. Luonteri E., Kroon P.A., Tenkanen M., Teleman A., Williamson G. Activity of an Aspergillus terreus a-arabinofuranosidase on phenolic-subtituted oligosaccharides. // J. Biotechnol. 1999. V. 67. P. 41-48.

27. Nurizzo D., Nagy T., Gilbert H J., Davies G J. The structural basis for catalysis and specificity of the Pseudomonas cellulosa alpha-glucuronidase, GlcA67A. // Structure. 2002. V. 10. P. 547-556.

28. Biely P., MacKenzie C.R., Puis J., Shneider H. Cooperativity of esterases and xylanases in the enzymatic degradation of acetyl xylan. // Biotechnol. 1986. V. 4. P. 731-733.

29. Morley K.L., Chauve G., Kazlauskas R., Dupont C., Shareck F„. Marchessault R.H. Acetyl xylan esterase-catalyzed deacetylation of chitin and chitosan. // Carbohydr. Polymers. 2006. V. 63. P. 310-315.

30. Whistler R., Masek E. Enzymatic hydrolysis of xylan. // J. Amer. Chem. Soc. 1955. V. 77. P. 1241-1243.

31. Wong K.K.Y., Tan L.U.L., Sadler J.N. Multiplicity of beta-l,4-xylanases in microorganisms: functions and applications. // Microbiol. Rev. 1988. V. 52. P. 305317.

32. Henrissat В., Claeyssens M., Tomme P., Lemesle L., Mornon J.P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. // Gene. 1989. V. 81. P. 83-95.

33. Henrissat В., Bairoch A. New families in classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. //Biochem. J. 1993. V. 293. P. 787-788.

34. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. // Biochem. J. 1996. V. 316. P. 695-696.

35. Henrissat В., Coutinho P.M. Classification of glycoside hydrolases and glycosyltransferases from hyperthermophiles. // Methods Enzymol. 2001. V. 330. P. 183-201.

36. Bourne Y., Henrissat B. Glicoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 593-600.

37. Claeyssens M., Henrissat В. Specificity mapping of cellulolytic enzymes: classification into families of structurally related proteins confirmed by biochemical analysis. //Protein Sci. 1992. V. 1. P. 1293-1297.

38. Рабинович M.JI., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлолитических ферментов. // Биохимия. 2002. Т. 67 (8). С. 1026-1050.

39. Kittur F.S., Mangala S.L., Rus'd А.А., Kitaoka M., Tsujibo H., Hayashi К. Fusion of family 2b carbohydrate-binding module increases the catalytic activity of a xylanase from Thermotoga maritima to soluble xylan. //FEBS Lett. 2003. V. 549. P. 147-151.

40. Simpson P.J., Hefang X., Bolam D.N., Gilbert H.J., Williamson M.P. The structural basis for the ligand specificity of Family 2 carbohydrate binding modules. // J. Biol. Chem. 2000 V. 275 (52). P. 41137-41142.

41. Xu G.Y., Ong E., Gilkes N., Kilburn D., Muhandiram D.R., Carver M., Kay L., Harvey T. Solution structure of a cellulose-binding domain from Cellulomonas fimi by nuclear magnetic resonance spectroscopy. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 69937009.

42. Clarke A.J. Biodegradation of cellulose. Enzymology and biotechnology. // Technomic Publishing Co Inc. Lancaster. 1997.272 p.

43. Gilks N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbal ß-l,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families. // Microbiol. Rev. 1991. V. 55. P. 303-315.

44. Langsford M.L., Singh G.B., Moser В., Miller R.C., Warren R.A.J., Kilburn D.G. Glycosylation of bacterial cellulase prevents proteolytic cleavage between functional domains. // FEBS Lett. 1987. V. 225. P. 163-167.

45. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Целшолазы микроорганизмов (обзор). // Прикл. биохим. микробиол. 2002. Т. 38 (4). С. 355-373.

46. Durand R., Rascle C., Fevre M. Molecular characterization of Xyn 3, a member of the endoxylanase multigene family of rumen fungus Neocallimastix frontalis. II Curr. Genet. 1996. V. 30. P. 531-540.

47. Zhang J.X., Martin J., Flint H.J. Identification of noncatalytic conserved regions in xylanases encoded by Xynb and Xynd genes of the cellulolitic rumen anaerobe Ruminococcus flavefaciens. II Mol. Genet. 1994. V. 245. P. 260-264.

48. Sinnot M.L. Catalytic mechanism of enzymatic glycosyl transfer. // Chem. Rev. 1990. V. 90. P. 1171-1202.

49. Rye C.S., Withers S.G. Glycosidase mechanism. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4. P. 473-580.

50. McCarter J.D., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1994. V. 4. P. 885-892.

51. Whitehead T.R. Analysis of the gene and amino acid sequence of the Prevotella ruminicola 23 xylanase reveals unexpected homology with endoglucanases from other genera of bacteria. // Curr. Microbiol. 1993. V. 27. P. 27-33.

52. Nishitani K., Nevins D.J. Glucuronoxylan xylanohydrolase. A unique xylanase with the requirement for appendant glucuronosyl units. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 6539-6543.

53. Huribert J.C., Preston 3rd J.F. Functional characterization of a novel xylanase from corn strain otErwinia chrysanthemi. II J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 2093-2100.

54. Larson S.B., Day J., Barbara de la Rosa A.P., Keen N.T., McPherson A. First crystallographic structure of a xylanase from glycoside hydrolase family 5: implications for catalysis. // Biochemistry. V. 42. P. 8411-8422.

55. Takami H., Horikoshi K. Analysis of the genome of alkaliphilic Bacillus strain from an industrial point of view. // Extermophiles. 2000. V. 4. P. 99-108.

56. Yoon K.H., Yun H.N., Jung K.H. Molecular cloning of a Bacillus sp. KK-1 xylanase gene and characterization of the gene product. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1998. V. 45. P. 337-347.

57. Biely P. Diversity of microbial endo-l,4-p-xylanases. In Applications of Enzymes to lignocellulosics, Mansfield S.D., Saddler J.N. (eds.). // Amer. Chem. Soc. Washington. 2003. P. 361-380.

58. Biely P., Vrsanska M., Kremnicky L., Tenkanen M. Stereochemistry of the hydrolysis of glycosidic linkage by endo-l,4-p-xylanases of Trichoderma reesei. II FEBS Lett. 1994. V. 356. P. 137-140.

59. Kormelink F.J.M., van Leewen M.J.F.S., Wood T.M., Voragen A.G.J. Purification and characterization of three endo-l,4-p-xylanases and one p-xylosidase from Aspergillus awamori. //J. Biotechnol. 1993. V. 27. P. 249-265.

60. Schmidt A., Schlancher A., Steiner W., Schwab H., Kratky C. Structure of the xylanase from Penicillium simplicissimum. II Protein Sci. 1998. V. 7. P. 2081-2088.

61. Leggio L.L., Kalogiannis S., Eckert K., Teixeir S.C.M., Bhat M.K., Andrei C., Pickersgill R.W., Larsen S. Substrate specificity and subsite mobility in Thermoascus aurantiacus xylanase 10A. // FEBS Lett. 2001. V. 509. P. 303-308.

62. Schmidt A., Gtibitz G., Kratky C. Xylan binding subsite mapping in the xylanase from Penicillium simplicissimum. using xylooligosaccharides as cryo-protectant. // Biochemistry. 1999. V. 38. P. 2403-2412.

63. Torronen A., Harkkil A., Rouvinen J. Three-dimensional structure of endo-l,4-P-xylanase 11 from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site. // EMBO J. 1994. V. 13 (11). P. 2493-2501.

64. Wakarchuk W.W., Campbell R.L., Sung W.L., Davoodi J., Yaguchi M. Mutational and crystallographic analyses of the active site residues of the Bacillus circulans xylanase. // Protein Sci. 1994. V. 3 P. 467-475.

65. Torronen A., Rouvinen J. Structural and functional properties of low molecular weight endo-l,4-P-xylanase. // J. Biotechnol. 1997. V. 57. P. 137-149.

66. Hakulinen N., Turunen O., Janis J., Leisola M., Rouvinen J. Three-dimensional structures of thermophilic P-l,4-xylanases from Chaetomium thermophilum and Nonomuraea flexuosa. II Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 1399-1412.

67. Havukainen R., Torronen A., Laitinen T., Rouvinen J. Covalent binding of three epoxyalkyl xylosides to the active site of e/ii/o-1,4-xylanase II from Trichoderma reesei. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 9617-9624.

68. Cleemput G., Hessing M., van Oort M., Deconynck M., Delcour J.A. Purification and characterization of p-D-xylosidase and an endo-xylanase from wheat flour. // Plant. Physiol. 1997. V. 113. P. 377-386.

69. Dekker R.F.H., Richards G.N. Purification, properties and mode of action of hemicellulase produced by Ceratocystis paradoxa. II Carbohydr. Res. 1975. V. 39. P. 97-114.

70. Kimura I., Sasahara H., Tajima S. Purification and characterization of two xylanases and an arabinofuranosidase from Aspergillus sojae. II J. Ferment. Bioengin. 1995. V. 804. P. 334-339.

71. Kitamoto N., Yoshino S., Ohmiya K., Tsukagoshi N. Purification and characterization of the overexpressed Aspergillus oryzae xylanase, XynFl. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. V. 6310. P. 1791-1794.

72. Ito K., Iwashita K., Iwano K. Cloning and sequencing of the xyn C gene encoding acid xylanase of Aspergillus kawachii. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. V. 56. P. 1338-1340.

73. Gubits G.M., Haltrich D., Latal В., Steiner W. Mode of depolymerysation of hemicellulose by varius mannanases and xylanases in relation their ability to bleach softwood pulp. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. P. 658-662.

74. Belancic A., Scarpa J., Peirano A., Diaz R., Steiner J., Eyzayuirre J. Penicillium purpurogenum produces several xylanases: purification and properties of two of the enzymes. // J. Biotechnol. 1995. V. 41. P. 71-79.

75. Singh S., Reddy P., Haarhoff J., Biely P., Janse В., Pillay В., Pillay D., Prior В .A. Relatedness of Thermomyces lanuginosus strains producing a thermostable xylanase. //J. Biotechnol. 2000. V. 81. P. 119-128.

76. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. II Диссер. на соискание уч. степени кандидата хим. наук. Москва. МГУ. 2003. 201 с.

77. Tenkanen Н., Puis J., Poutanen К. Two major xylanases of Trichoderma reesei. II Enz. Microb. Technol. 1992. V. 14. P. 566-574.

78. Dey D., Hinge J., Shendye A., Rao M. Purification and properties of extracellular endo-xy\mases from alkalophilic thermophilic Bacillus sp. // Can. J. Microbiol. 1992. V. 38. P. 436-442.

79. Ratankhanokchai K., Kyu K.L., Tantichareon M. Purification and properties of a xylan-binding endoxylanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain K-l. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 694-697.

80. Morales P., Madrarro A., Flors A., Sendra J.M., Gonzalez J.A.P. Purification and characterization of a xylanase and arabinofuranosidase from Bacillus polymyxa. II Enz. Microb. Technol. 1995. V. 17. P. 424-429.

81. Breecia J.D., Baigori M.D., Castro G.R., Sineriz F., Hatti-Kaul R. Purification and charcacterization of a thermostble xylanases from Bacillus amyloliquefaciens. //Enz. Microb. Technol. 1998. V. 22. P. 42-49.

82. Gupta S., Bhushan В., Hoondal G.S. Isolation, purification and characterization of xylanase from Staphylococcus sp, SG-13 and its application in biobleaching of kraft pulp. // J. Appl. Microbiol. 2000. V. 88. P. 325-334.

83. Winterhalter C., Liebel W. Two extremely thermostable xylanases of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritama MSB8. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 1810-1815.

84. Li X.L., Zhang Z.Q., Dean J.F.D., Eriksson K.E.L., Ljungdahl L.G. Purification and characterization of a new xylanases (APX-II) from the fungus Aureobasidium pullulans Y-2311—1. II Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 3213-3218.

85. Kesker S.S. High activity xylanase from thermotolerant Streptomyces T7, cultural conditions and enzyme properties. //Biotechnol. Lett. 1992. V. 14. P. 481-486.

86. Simpson D.J., Fincher G.B., Huang A.H.C., Cameron-Mills V. Structure and function of cereal and related higher plant (l,4)-p-xylan endohydrolases. // J. Cereal Sci. 2003. V. 37. P. 111-127.

87. Ishihara M., Tawata S., Toyama S. Purification and some properties of a thermostable xylanase from thermophilic fungus strain HG1. // J. Ferment. Bioengin. 1997. V. 83. P. 478-480.

88. Goesaert H., Elliott G., Kroon P.A., Gebruers K., Courtin C.M., Robben J., Delcour J.A., Juge N. Occurrence of proteinaceous endoxylanase inhibitors in cereals. // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1696. P. 193- 202.

89. Debyser W., Peumans W.J., van Damme E.J.M., Delcour J.A. Triticum aestivum xylanase inhibitor (TAXI), a new class of enzyme inhibitor affecting breadmaking performance. // J. Cereal Sci. 1999. V. 30. P. 39^43.

90. Gebruers K., Debyser W., Goesaert H., Proost P., van Damme J., Delcour J.A. Triticum aestivum L. endoxylanase inhibitor (TAXI) consists of two inhibitors, TAXI I and TAXI II, with different specificities. II Biochem. J. 2001. V. 353. P. 239-244.

91. Gebruers K., Goesaert H., Brijs K., Courtin C.M., Delcour J.A. Purification of TAXIlike endoxylanase inhibitors from wheat (Triticum aestivum L.) whole meal reveals a family of iso-forms. // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2002. V. 17. P. 61-68.

92. Juge N., Payan F., Williamson G. XIP-I, a xylanase inhibitor protein from wheat: a novel protein function. //Biochim. Biophys. Acta. 2004. V. 1696 (2). P. 203-211.

93. Goesaert H., Gebruers K., Courtin C.M., Proost P., van Damme J., Delcour J.A. A family of "TAXI"-like endoxylanase inhibitors in rye. // J. Cereal Sci. 2002. V. 36. P. 177-185.

94. Goesaert H., Debyser W., Gebruers K., Proost P., van Damme J., Delcour J.A. Purification and partial characterization of an endoxylanase inhibitor from barley. // Cereal Chem. 2001. V. 78. P. 453^457.

95. Sibbesen O., Sarensen J.F. // Patent application. WO 01/66711.2001.

96. Sansen S., De Ranter C.J., Gebruers K., Brijs K., Courtin C.M., Delcour J.A., Rabijns A. Structural basis for inhibition of Aspergillus niger xylanase by Triticum aestivum Xylanase Inhibitor-I. II J. Biological Chem. 2004. V. 279 (34). P. 36022-36028.

97. McLauchlan W.R., Garcia-Conesa M.T., Williamson G., Roza M., Ravestein P., Maat J. A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. // Biochem. J. 1999. V. 338. P. 441-446.

98. Elliot G.O., Highes R.K., Juge N., Kroon P.A., Williamson G. Functional identification of the cDNA coding for wheat endo-l,4-beta-D-xylanase inhibitor. // FEBS Lett. 2002. V. 519. P. 66-70.

99. Payan F., Flatman R., Porciero S., Williamson G., Juge N., Roussel A. Structural analysis of XIP-I, a xylanase proteinaceous inhibitor from wheat. // Biochem. J. 2003. V. 372. P. 399-405.

100. Payan F., Leone P., Porciero S., Furniss C., Tahir T., Williamson G., Durand A., Manzanares P., Gilbert H.J., Juge N., Roussel A. The dual nature of the wheat xylanase protein inhibitor XIP-I. II J. Biological. Chem. 2004. V. 279 (34). P. 3602936037.

101. Buchert J., Tenkanen M., Kantelinen A., Viikari L. Application of xylanases in the pulp and paper industry. // Bioresourse Technol. 1994. V. 50. P. 65-72.

102. Paice M., Gurnagul N., Page D.H., Jurasek L. Mechanism of hemicellulose-direct prebleaching ofkraft pulps. II Enz. Microbiol. Technol. 1992. V. 14. P. 272-276.

103. Buchert J., Ranua M., Kantelinen A., Viikari L. The role of two Trichoderma reesei xylanases in the bleaching of pine kraft pulp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37. P. 825-829.

104. Patel R.N., Grabski A.C., Jeffries T.W. Chromophore release from craft pulp by purified Streptomices roseiscleroticus xylanases. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 405-412.

105. Elegir G., Sykes M., Jeffries T.W. Differential and synergistic action of Streptomices endoxylanases in prebleaching of kraft pulps. // Enz. Microbiol. Technol. 1995. V. 17. P. 954-959.

106. Jeffries T.W. Conserved motifs in xylanases for pulp bleaching. // IBCs 3rd annual symposium on commercial enzymes. San Diego, С A. March 23-24, 1998. P. 212218.

107. Godfrey Т., West S. Industrial enzymology, second edition. // Macmillan Press. 1996. P. 69-382.

108. Buchert J., Ranua M., Siika-Aho M., Pere J., Viikari L. Trichoderma reesei cellulases in the bleaching of kraft pulp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 40. P. 941945.

109. Bedford M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition their current value and future benefits. // Animal Feed Sci. Technol. 2000. V. 86. P. 1-13.

110. Кислухина O.B. Ферменты в производстве пищи и кормов. // Москва. ДеЛи принт. 2002. 335 с.

111. Annison G., Choct М. Anti-nutritive activities of cereal non-starch polysacharides in broiler diets and strategies minimizing their effect. // World's Poultry Sci. J. 1991. V. 47. P. 164-172.

112. Bedford M.R. Mechanism of action and potential environmental, benefits from the use of feed enzymes. // Animal Feed Sci. Technol. 1995. V. 53. P. 145-155.

113. Girhammar U., Nair B.M. Certain physical properties of water soluble non-starch polysaccharides from wheat, rye, triticale, barley and oats. // Food Hydrocolloids. 1992. V. 6 (4). P. 329-343.

114. Vranjes M.V., Wenk C. Influence of Trichoderma viride enzyme complex on nutrient utilization and perfomance of laying hens in diets with and without antibiotic supplementation. // Poultry Sci. 1996. V. 75. P. 551-555.

115. Jroch H., Danicke S., Brutan J. The influence of enzyme preparations on the nutritional value of cereals in poultry. A review. // J. Animal and Feed Sci. 1995. V. 4. P. 263-285.

116. Chesson A. Feed enzymes. // Animal Feed Sci. Technol. 1993. V. 45. P. 65-79.

117. Супрунов Д. Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-бройлеров. // Комбикорма. 2000. Т. 1. С. 47-48.

118. Choct M., Kocher A., Waters D.L.E., Pettersson D., Ross G. A comparison of three xylanases on the nutritive value of two wheats for broiler chickens. // British J. Nutr. 2004. V. 92. P. 53-61.

119. Coon C.N., Leske K.L., Akavanichan O., Cheng Т.К. Effect of oligosaccharide-free soybean meal on true metabolizable energy and fiber digestion in adult roosters. // Poultry Sci. 1990. V. 69. P. 787-793.

120. Camacho N.A., Aguilar O.G. Production, purification and characterization of a low molecular mass xylanase from Aspergillus sp. and its application in bakery. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2003. V. 104. P. 159-172.

121. Ganga M.A., Piñaga F., Vallès S., Ramón D., Querol A. Aroma improving in micro vinification processes by the use of a recombinant wine yeast strain expressing the Aspergillus nidulans xlnA gene. // Int. J. Food Microbiol. 1999. V. 47. P. 171— 178.

122. Gilbert H.J., Hazlewood G.P. Bacterial cellulases and xylanases. // J. Gen. Microbiol. 1993. V. 139. P. 187-194.

123. Fox J.D., Robyt J.F. Miniaturization of three carbohydrate analyses using a microsample plate reader. // Anal. Biochem. 1991. V. 195. P. 93-96.

124. Garcia E., Johnson D., Whitaker J.R., Shoemaker S.P. Assessment of endo-l,4-P-glucanase activity by a rapid colorimetric assay using disodium-2,2'-bicinchoninate. //J. Food Biochem. 1993. V. 135. P. 135-145.

125. Зоров И.Н., Дубасова М.Ю., Синицьш А.П. Применение бицинхонинатного метода анализа восстанавливающих Сахаров для определения КМЦазной активности целлюлаз с использованием микроплашечного ридера. // Биохимия. 1997. Т. 62. С. 826-832.

126. Donor L.W., Irwin P.L. Assay of reducing end-groups in oligosaccharides homologues with 2,2'-bicinchoninate. // Anal. Biochem. 1992. V. 202. P. 50-53.

127. Somogyi M.J. Notes on sugar determination. // J. Biol. Chem. 1952. V. 195. P. 19-23.

128. Синицьш А.П., Черноглазов B.M., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Под ред. Варфоломеева С.Д. // Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. 1993. Т. 25. ВИНИТИ. 152 с.

129. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // Мир. Москва. 544 с.

130. Гусаков А.В., Марков А.В., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицьш А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. // Биохимия. 2002. Т. 67 (6). С. 815822.

131. Chaplin M.F., Kennedy J.F, Carbohydrate analysis. A practical approach. // Oxford University Press. 1994. 324 p.

132. Smith B.E. Protein sequencing protocols. // Humana Press. Totowa. 1997. 392 p.

133. James P. Proteome research: mass spectrometry. // Springer-Verlag. Berlin. 2001. 274 p.

134. Бухтояров Ф.Е. Выделение и свойства целлюлаз мицеллиального гриба Chrysosporium lucknowense. II Диссер. на соискание уч. степени кандидата хим. наук. Москва. МГУ. 2004.125 с.

135. FPLC ion exchange and chromatofocusing: principles and methods. // Pharmacia Fine Chemicals. S -75182 Uppsala. Sweden.1985. 171 p.

136. Henrissat В., Teeri T.T., Warren R.A.J. A scheme for designating enzymes that hydrolyse the polysaccharides in the cell walls of plants. // FEBS Lett. 1998. V. 425. P. 252-354.

137. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, р-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus. II Диссер. на соискание уч. степени кандидата хим. наук. Москва. МГУ. 2004. 170 с.

138. Синицына О.А. Свойства рекомбинантных эндоглюканазы и ксиланазы пенициллов. // Диссер. на соискание уч. степени кандидата хим. наук. Москва. МГУ. 2002. 187 с.