Свойства ксиланаз, β-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правахрукописи

ГРИШУТИН СЕРГЕИ ГЕННАДЬЕВИЧ

СВОЙСТВА КСИЛАНАЗ, Э-ГЛЮКАНАЗ И КСИЛОГЛЮКАНАЗ ASPERG1LLUS JAPONICUS.

02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2004

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын А.П. Научный консультант:

кандидат химических наук Гусаков А.В.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков ИА кандидат химических наук Черноглазое В.М.

Ведущая организация:

Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина, Пущино

Защита состоится «2.2» июня 2004 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В .Ломоносова

Автореферат разослан 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета, Ца**-^

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

Актуальность темы. В настоящее время ферменты, расщепляющие полисахариды (карбогидразы), находят все более широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства: для конверсии растительной биомассы, обработки текстильных изделий, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой промышленности, в качестве добавок, улучшающих питательные свойства кормов для животных и т.д. Поэтому важной и актуальной задачей является изучение состава ферментных комплексов микроорганизмов, являющихся продуцентами карбогидраз.

Как известно, одними из самых распространенных природных полимеров являются полисахариды клеточных стенок растений. Среди них ксиланы занимают значительное место, например, их содержание в древесине лиственных пород составляет до 20-30%. Оснозная цепь ксилана построена из остатков Б-ксилозы, соединенных р-1,4-связями, и может содержать различные заместители (или короткие боковые цепи) такие как Ь-арабинофуранозу, Б-глюкуроновую кислоту, Б-ксшюзу, а также ацетил- ферулоил- и п-кумароильные группы. Ферменты - ксиланазы расщепляют гликозидные связи в основной цепи (3-1,4-ксилана. Массированное изучение ксиланаз происходит на протяжении более 50 лет. Тем не менее, задача поиска новых ферментов, не имеющих гомологии с известными ксиланазами и, возможно, обладающих новыми важными свойствами и особенностями дейстзия на сложный гетерополисахарид, остается актуальной. Ярким примером является недавнее обнаружение в паках белковых ингибиторов ксиланаз. Большинство известных ксиланаз (которые группируются в две различные семьи гликозил-гидролаз: 10-ю и 11-ю) ингибируются белковыми ингибиторами. Только единичные ксиланазы проявляют устойчивость к этим ингибиторам.

Ксилоглюканы и Р-глюканы - полисахариды растений, выполняющие структурные и запасные функции. Основная цепь этих полисахаридов содержит остатки Б-глюкозы, соединенные (в случае ксилоглюкана) или остатки глюкозы, соединенные

1,4- и Р-1,3-связями (в случае р-глюканов). Большая часть остатков глюкозы в ксилоглюкане содержит боковые заместители - остатки Б-ксилозы, Б-галактозы и иногда других Сахаров - Ь-фукозы, и Ь-арабинозы. Основную цепь этих полисахаридов могут расщеплять по эндо-деполимеразному механизму многие

(целлюлазы). Однако, ферменты, специфичные только к данному полисахариду (Р-глюкану или ксилоглюкану) и неактивные по отношению к другим крайне мало

изучены. Исключением являются бактериальные лихеназы (эндо-|М,3-1,4-глюканазы), расщепляющие В случае же ксилоглюканаз довольно хорошо изучены лишь

специфические ферменты растений - ксилоглюкан-эндо-трансгликозилазы. Только недавно

(в 1999-2004 гг.) появились первые сообщения о специфичных грибных ксилоглюканазах.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ]

БИБЛИОТЕКА I 3

В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб Aspergillus japonicus - продуцент ксиланаз, р-глюканаз, пектиназ и других карбогидраз. Однако, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось и сведения, касающиеся ферментов, которые он продуцирует, в научной литературе практически отсутствуют.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось изучение состава ферментного комплекса, секретируемого грибом Ajaponicus и выявление наиболее важных и перспективных ферментов. Далее мы поставили цель подробно изучить свойства обнаруженных нами ксиланаз, Р-глюканазы и ксилоглкжаназы и сравнить их со свойствами аналогичных ферментов из других источников. Для двух последних ферментов в качестве «стандарта для сравнения» выбрали хорошо изученные эндо-р-1,4-глюканазы I, II и III мицелиального гриба Trichoderma reesei и лихеназу (эндо-(3-1,3-1,4-глюканазу) из Bacillus subtilis, а также мало изученные ксилоглюканазы из T.reesei и Chrysosporium lucknowense.

Для достижения указанных целей в рамках диссертационной работы было необходимо решить следующие задачи:

• Выделить основные (мажорные) карбогидразы ферментного комплекса Ajaponicus.

• Разработать схему экспрессного хроматографического анализа качественного и количественого состава ферментных препаратов, продуцируемых мутантными штаммами Ajaponicus.

• Изучить свойства и механизм действия специфичных Р-глюканазы и ксилоглюканазы A. japonicus и сравнить их действие с эндо-Р-1,4-глюкаяазами T.reesei и лихеназой В. subtilis, а также ксилоглюканазами T.reesei и C.lucknowense.

Научная новизна. Охарактеризован состав ферментного комплекса, секретируемого мутантными штаммами Ajaponicus. Изучены биохимические и физико-химические свойства ксиланаз 35 и 22 кДа, Р-глюканазы 28 кДа, ксилоглюканазы 32 кДа, арабиноксилан-арабинофурангидролазы 33 кДа. Выявлены особенности действия Р-глюканазы Ajaponicus, классифицированной как

глюканаза. Исследован механизм действия ксилоглюканазы Ajaponicus, классифицированной как ксилоглюкан-специфичная эндо-Р-1,4-глюканаза. Проведено сравнительное изучение степени упорядоченности действия на полимерный ячменя ряда и эндоглюканаз. Обнаружен процессивный (экзо-деполимеразный)

тип действия малоизученных ксилоглюканаз T.reesei и Clucknowense при гидролизе ксилоглюкана.

Практическая значимость работы. Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава ферментных комплексов, продуцируемых грибом А.}аротсш. Исследован компонентный состав трех ферментных препаратов, полученных с помощью различных мутантных штаммов гриба. Выяснена причина исключительно высокой удельной ксиланазной активности препаратов на основе двух мутаптных штаммов - увеличение содержания в белковом комплексе ксиланазы 22 кДа в 6-7 раз и одинаковый уровень продукции другой мажорной ксиланазы - 35 кДа. Выяснена причина высокой Р-глюканазной активности (и при этом низкой целлюлазной активности) препаратоз А.}аротсш - значительное содержание специфичной Р-глюканазы 28 кДа (10-12% от общего содержания белка). Обнаружена полигалактуроназа, обуславливающая высокую пектиназную активность некоторых препаратов А.7аротеш. Детальное знание состава ферментного комплекса, сектетируемого этим перспективным продуцентом ксиланаз, глюканаз и пектиназ позволит эффективно применять эти ферментные препараты при производстве кормов, биоотбеливании целлюлозной пульпы, обработке текстильных материалов и в других областях биотехнологии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), международных конференциях «Биокатализ-2000» (Москва, 2000) и «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), втором международном конгрессе «Биотехнология: состояние и развитие» (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 139 источников. Работа изложена на машинописного текста, включает 82 рисунка и 27 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Выделение и очистка ксиланаз, р-глюканазы и ксилоглюканазы А7аротеш. Ферментный препарат, являющийся комплексом внеклеточных ферментов А7аротеш, обладал активностью по отношению к р-1,4- и Р-1,3-1,4-глюканам (КМЦ и Р-глюкану ячменя), ксилоглюкану, ксилану и пектину. Таким образом, в состав ферментного препарата входят р-глюканазы, ксилоглюканазы (или эндоглюканазы), ксиланазы и пектиназы. Нами была разработана схема выделения этих ферментов, приведенная на рис. 1, позволившая получить препаративное количество гомогенных белков, достаточное для изучения их

свойств. Все разделение и очистку проводили с использованием хроматографической системы для белковой хроматографии FPLC (Pharmacia, Швеция).

Обессоленный ферментный препарат, рН 5,5

т

нгсвязавшаяся фракция

I

АОХ. Source 150.20 мМ Пиперазин-НС1._^Н 5.5.

I \

фр.З фр.7

i

ФР-37

ГХ. Phenvl-Superose ГХ. Phenvl-Superose АОХ. Mono О. рН 4.1

ГХ. Source 15 Isopropvl 1

АОХ. Mono О. рН 7.4. ^ \

ксилана» р-глюканаза арабиноксилан-гкдролаза ксиланаза (Ху135) (ВС 28) (АХНЗЗ) (Ху122)

35 кДа ■ 28 кДа 33 кДа 22 кДа

pi 7,0 р! 4,1 р! 4,0 р! 3,9

ксклоглюканаза (XG32) 32 кДа pi 2»

Рис. 1. Схема выделения ферментов из препарата А. ]аротеш. АОХ - анионообменная хроматография, ГХ - гидрофобная хроматография. . .

0 100 200 300 400 500

Объем, кл

Рис. 2. Анионообменная хроматография препарата A.japonicus на колонке Source 15Q при рН 5,5.

На первой стадии разделения мы применяли анионообменную хроматографию на колонке Source 15Q (1,6x5,0 см) объемом 10 мл при рН 5,5 (рис. 2). Эти условия были подобраны в ходе предварительных экспериментов на колонке меньшего объема (1 мл) и они, с одной стороны, обеспечивали связывание и хорошее разделение большинства белков комплекса, а с другой - сохранение активности белков комплекса, нестабильных при рН>7.

Во фракциях, полученных в результате хроматографии, определяли активность по отношению к различным субстратам - карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), р-глюкану ячменя, ламинарину, ксилоглкжану, глюкуроноксилану березы и арабиноксилану пшеницы, полигалактуроновой кислоте, ламинарину, растворимому крахмалу, галактану ф-1,4-галактан из картофеля), свекловичному разветвленному арабинану (активности определяли при рН 5 и 50°С, концентрация субстрата 5 г/л). Определение восстанавливающих Сахаров (ВС) проводили бицинхонинатным методом (БЦХ). Определяли также активность по отношению к л-нитрофенильным производным Сахаров (пНФ-Р-Г)-глюкопиранозиду, пНФ-p-D-галактопиранозиду, пНФ-a-D галактопиранозвду, пНФ-а-Ь-арабииофуранозиду, пНФ-p-D-ксилопиранозиду, пНФ-р-О-целлобиозиду) и целлобиозе (при помощи глюкозооксидазно-пероксидазного метода) при рН 5 и 40 °С. Для определения активности во фракциях использовали 96-луночные планшеты.

В результате анализа активностей во фракциях после Source 15Q (рис. 2) установили, что ксияаназная активность препарата обусловлена двумя мажорными ксиланазами - Ху122, и Ху1 35, которые выделили в гомогенном состоянии. Была обнаружена также одна минорная кислая ксиланаза, которую в гомогенном виде не выделяли - она характеризовалась в 2,6 раза большей активностью при рН 3,3, чем при рН 5. Высокая Р-глюканазная активность препарата была обусловлена наличием мажорной р-глюканазы 28 хДа (BG 28), которая была выделена в гомогенном состоянии и характеризовалась высокой удельной активностью по Р-глюкану ячменя (262 ед/мг) и очень низкой активностью по КМЦ (3,8 ед/мг). Был обнаружен также фермент арабиноксилан-арабинофурангидролаза 33 кДа (АХН 33). Он содержался во фракции Source 15Q, которая проявляла высокую активность по арабиноксилану (21 ед/мл) и низкую по глюкуроноксилану (1,1 ед/мл), что является не характерным для эндо-р-1,4-ксиланаз. В конце градиента Source 15Q была обнаружена фракция, обладавшая высокой ксилоглюканазной активностью, но не обладавшая активностью по отношению к Р-глюкану и КМЦ. Из нее в гомогенном состоянии был выделен минорный компонент внеклеточного ферментного комплекса A.japonicus - ксилоглюканаза 32 кДа (XG 32). Были обнаружены также глюкоамилаза 140 кДа (GA 140), арабинофуранозидаза 64 кДа (AF 64) .и две полигалактуроназы: в несвязавшейся фракции (PG) и в конце градиента Source I5Q. Однако, свойства последних

подробно не изучали, поскольку это выходило за рамки диссертационной работы Картины ДДС-электрофореза и ИЭФ для выделенных индивидуальных белков приведены на рис 3

М I 2 3 М 4 5 6 М

116 —

45 «<» 36 ««»

24

20

В

66 5,9

5.1

46

4.2 36

«и>

«К? «*

М 1 2 3 М 4 5 6

Рис 3 ДДС-электрофорез (А) и ИЭФ в диапазоне рН 3-8 (Б) ферментов А ]арогисиз (М) - белки-маркеры (кДа, р1)

(1) - ксиланаза 22 кДа (Ху122),

(2) - ксиланаза 35 кДа (Ху135),

(3) - арабиноксилан-арбинофурангидролаза 33 кДа(АХНЗЗ),

(4) - р-глкжаназа 28 кДа (Вв 28),

(5) - ксилоглюканаза 32 кДа (Хв 32),

(6) - а-Ь-арабинофуранозидаза 64 кДа (АР 64).

2. Идентификация выделенных ферментов по данным масс-спектрометрии.

Метод МЛЬБ1-ТОР масс-спектрометрии трипсиповых гидролизатов белков с дальнейшим поиском белков, дающих пептиды с идентичными молекулярными массами, в базах данных является мощным инструментом для идентификации белков с уже известной аминокислотной последовательностью. Как правило, в случае, когда находят 4-5 или более пептидов с идентичной молекулярной массой в ферменте (белке) с такой же субстратной специфичностью, можно утверждать об идентичности белков или их высокой степени гомологии (>90%).

В нашем случае была проведена обработка белковых полос с ДЦС-электрофорезных гелей трипсином и получены масс-спектры пептидного фингерпринта выделенных белков (эти эксперименты проводилась в отделе протеомпых исследований НИИ Биомедицинской

химии РАМН). Поиск в базах данных NCBI и Swiss-Prot осуществляли с помощью программы MASCOT (www.matrixscience.com).

Масс-спектрометрический анализ пептидных фингерпринтов показал, что ксиланазы A.japonicus идентичны или проявляют высокую гомологию с уже известными аспергильными ферментами. Xyl 35 идентифицировалась как ксиланаза 10-ой семьи гликозил-гидролаз с высокой гомологией к XylA из A.kawachii (а также к одной из ксиланаз A.niger), Xyl 22 идентифицировалась как ксиланаза 11-ой семьи и имела высокою гомологию с Xyl В из A. niger. АХН 33 идентифицировалась как арабиноксилал-арабинофурангидролаза и была гомологична к АХН из A. tubingensis (табл. 1).

Таблица 1. Идентификация ферментов по данным масс-спектрометрии.

Выделенный белок

Xyl 22 Ä japomcus Xyl 35 A japomcus АХН 33 A japomcus BG 28 Д japomcus XG32 A-japomcus EG I T reesei

Семья

Идентифицированный гликозил-6enolt гидролаз**

11 10 62

EG II

T reesei

exo-Glu T reesei

Xyl В А шдег * Xyl A A kawachu* АХН A tubingensis * не найдено не найдено

EG I (Cel 7 В) Т reesei* (Hypocrea jeconna"*") EG II (Cel 5A) T reesei' (H jeconna) Bgl1 ß-глюкозидаза из T reesei '(H jeconna)

Кол-во совпавших пептидов***

5 (36%)" "

17(64%)

11(50%)

5 (19%) 5 (27%) 20(35%)

MASCOT Score

" 91 262 144

55

53

225

Номер по базе данных Swiss-Prot

Q8TG22 Р33559 Р79021

Р07981 Р07982 Q12715

Примечания *) предшественник белка - аминокислотная последовательность, транслированная с гена, содержащая в том числе сигнальном пептид

**) классификация по семьям гликозил-гидролаз на основании гомологии аминокислотных последовательностей, текущее состояние отражено в базе данных CAZY (http //afmb cnrs-mrsfr/CAZY)

***) В скобках - доля аминокислотной последовательности идентифицированного белка, содержащаяся в совпавших пептидах, по данным поиска с помощью программы MASCOT.

****) Вероятностный параметр, отражающий надежность проведенной идентификации

*****) Нуросгеа jeconna - недавно принятое название гриба, традиционно называемого Tnchoderma reesei (анаморфа аскомицета Нуросгеа jeconna)

Этот результат находится в соответствии с принадлежностью A japonicus, A niger и Л. ШЫщвт1$ к группе близкородственных черных аспергиллов, аналогичные ферменты которых часто имеют высокую гомологию (80-100%) друг с другом. Необходимо отметить,

что в настоящее время в базах данных находится очень много аминокислотных последовательностей аспергильных белков, полученных в результате массированого изучения этих продуцентов и частичного секвенирования их геномов. По видимому, именно этим объясняется идентификация большинства выделенных нами белков Л. japonicus, как аналогичных белков других видов черных аспергиллов. Тем не менее, следует отметить, что в случае р-глюканазы и ксилоглюканазы аналогичных белков в базах данных не было обнаружено и, таким образом, выделенные нами ферменты являются новыми, не описанными в литературе (базах данных).

Для сравнительного изучения свойств ВО 28 и ХО 32 нами были использованы эндоглюканазы (ЕО) и экзоглюкозидаза (ехо-О1и) T.reesei, правильность идентификации которых также подтверждали с помощью данного метода (табл. 1).

3. Биохимические свойства ксиланаз и арабиноксилан-арабинофурангицролазы.

Из комплекса внеклеточных ферментов, секретируемых Л japonicus, нами было зыделено две мажорные ксиланазы (Ху1 22 и Ху1 35) и арабиноксилан-арабинофурангидролаза (АХН 33). Основные свойства этих ферментов представлены в табл. 2.

Выделенные ксиланазы имели высокую активность по глюкуроно и арабиноксилану, что характерно для большинства ксиланаз. Отношение для

глюкуроно- и арабиноксилана было приблизительно одинаковым для Ху1 35, но в случае Ху1 22 для глюкуроноксилана оно было в 1,8 раза больше для глюкуроноксилана. Это говорит о том, что глюкуроноксилан, имеющий меньшую степень замещения боковыми группами, является лучшим субстратом для Ху1 22, а для Ху1 35 - по крайней мере, на начальном этапе гидролиза - оба субстрата равнозначны. Выявленное различие находится в соответствии с современными представлениями о том, что для ксиланаз 11-ой семьи (Ху1 22) для гидролиза требуются более длинные участки незамещенного чем для

ксиланаз 10-ой семьи (Ху1 35). Отличием Ху1 22 была невысокая термостабильность (период полуинактивации при 50°С - 42 мин, см. табл.2). Характерным свойством АХН 33 было отсутствие активности по глюкуроноксилану. Данный фермент отщеплял арабинофуранозу боковых цепей арабиноксилана и не гидролизовал основную цепь ксилака. Ферменты именно с такой специфичностью составляют в настоящее время 62-ю семью гликозил-гидролаз (Йф://аМхспБ-тБЛ/СА2\/).

Таблица 2. Свойства ксиланаз и арабиноксилан-арабинофурангидролазы.

Свойство Xyl 3S Xyl 22 АХНЗЗ

молекулярная масса, кДа 35 22 33

Pl 7.0 3.9 4,0

Км (по глюкуроноксилану), г/л 1,6t03 2,450,1 -

kcat (по глюкуроноксилану), 1/с 117±9 260S6 -

Км (по арабиноксилану), г/л 2,6±0,4 4,0*Я,8 2.2Î0.4

kcat (по арабиноксилану), 1/с 163-11 242 ±23 43 ±2,6

рН - оптимум 5,6 5,0 4.9

рН 50% • 4.0-7,4 3,8-6.4 3,2-6,7

период полуинастивации 40С, ч >23 >23 >23

период полуинактивации БОС. ч >23 0,7 20

период полуинактивации 60С, ч 2,3 0,15 0,20

остаточная активность после Зч при ДОС, % 100 94 98

остаточная активность после Зч при 50С, % 97 8 83

остаточная активность после Зч при 60С, % 39 0 0

активность по глюкуроноксилану, ед/мг 165 348 0,56

активность по арабиноксилану пшеницы, ед/мг 168 332 49

активность по арабиноксилану овса, ед/мг - - 37

активность по р-глюкану, ед/мг 0,18 3.8 0

активность по карбоксиметилцеплюлозе, ед/мг 0,09 0,17 0

активность по ксилоглюкану, ед/мг 0 0 0

активность по ламинарину, ед/мг 0 0 0

активность по галакгоманнану, ед/мг 0 0 0

активность по арабинану разветвл., ед/мг 0 0 0

активность по галактану, ед/мг 0 0 0

активность по полигалактуроновой кислоте, ед/мг 0 0 0

активность по крахмалу, ед/мг 0 0 0

активность по пНФ-p-Glc, ед/мг 0 0 0

активность по пНФ-3-Celt, ед/мг 0,95 0 0

|активность по пНФ-p-Lac, ед/мг 0.04 0 0

[активность по оНФ-p-Xyl, ед/мг 0,03 0 0

¡активность по пНФ-a-Xyl, ед/мг 0 0 0

¡активность по пНФ-a-Araf, ед/мг 0 0 0,04

|актианость по пНФ-a-Arap, ед/мг 0 0 0

Примечания: активность по отношению к полисахаридным субстратам измерена бицинхонинатным методом определения ВС.

*) рН 5 0 % - интервал рН при котором фермент сохраняет более 5 0 % активности от максимального значения.

4. Биохимические свойства |}-глюканази ксилоглюканаз.

Наибольший интерес среди выделенных белков А.}аротсш представляли р-глюканаза (BG 28) и ксилоглюканаза (XG 32), поскольку они относятся к малоизученным грибным ферментам. В нашей работе основное внимание мы уделили изучению именно их свойств. Как было описано ранее, активность по Р-глюкану и ксилоглкжану проявляют не только соответствующие специфичные ферменты, но также

некоторые эндо-(5-1,4-глюканазы (целлюлазы) и другие ферменты. Поэтому мы сравнили свойства выделенной нами BG 28 с EG I, EG II, EG III и ехо-Glu из T.reesei, а также со специфичной эндо-р-1,3-1,4-глюканазой (лихеназой) из B.subtilis (см. табл. 3). Необходимо отметить, что для BG 28 была характерна высокая активность по ß-глюкану и крайне низкая по КМЦ и ксилоглюкану. Похожими свойствами обладала бацильная лихеназа. Эндоглюканазы T.reesei имели близкие активности по всем трем субстратам (кроме EG II, не имеющей активности по ксилоглюкану). exo-Glu Т. reesei имела наибольшую активность пор-глюкану ячменя, л а м и ф-а,;рпш>1шну)и пНФ-Р-О-глюкопиранозиду.

В ходе изучения ксилоглюканазы XG 32 мы использовали для сравнения также EG I и III Т. reesei, но кроме этого использовали недавно обнаруженные нами ксилоглюканазы из Т. reesei и С. lucknowense. Характерным свойством XG 32 была крайне незначительная активность по КМЦ и Р-глюкану. В отличие от нее специфичные ксилоглюканазы Т. reesei и С. lucknowense имели заметный уровень активности по эгим субстратам.

4.1. Механизм действия ß-глюканазы A.japonicm на ß-глюкан ячменя.

Было проведено сравнительное изучение механизма деполимеризации Р-глюкана ячменя под действием BG 28 и выбранных нами для сравнения ферментов, обладающих глюканазной активностью. С помощью гель-проникающей хроматографии (ГПХ) следили за изменением молекулярной массы р-глюкана в ходе гидролиза (до 10-15% глубины гидролиза по ВС); колонку калибровали декстранами. Оказалось, что BG 28 A.japonicus демонстрировала такой же характер изменения средней молекулярной массы как

лихеназа B.subtilis и эндоглюканазы T.reesei, действуя как эндо-дсполимераза (рис. 4). В ходе гидролиза этими ферментами высокомолекулярный пик

«размывался» и сдвигался в низкомолекулярную область. Экзо-р-глюкозидаза T.reesei действовала совершенно иначе, мало изменяя среднюю молекулярную массу с

увеличением глубины но приводя к образованию значительного количества

мономера - глюкозы.

Для изучаемых ферментов мы определили отношение активностей по р-глюкану ячменя, определенных с помощью вискозиметрического метода, и одновременно по выходу ВС (глубина гидролиза при этом не превышала 0,1-0,2%) Оказалось, что эндо-деполимеразы (BG 28 Ajaponicus, эндоглюканазы T.reesei, лихеназа B.subtilis) характеризовались высоким значением отношения вискозиметрической активности к активности по выходу ВС (20-33), см. табл.4, тогда как для exo-Glu T.reesei это отношение было равно 0,29.

Таблица 3. Основные свойства р-глюканаз и ксилоглкжаназ.

Свойство BG 28 лихеназа XG32 XG XG 78

S и S In с 1

1 1 к 1 8- 2 S 0 1

-=» ей к:

« < о'

молекулярная масса, кДа 28 24 32 75-100 78

р! 4 8,1, 8А оде,s 4,1-4,3 4

Км (по основному субстрату), г/л 3,3 БГ 0,84 БГ 0,67 ТКГ 0,31 ТКГ 0,31 ТКГ

kcat (по основному субстрату), 1/с 152 БГ 98 БГ 53ТКГ 50 тКГ 78ТКГ

рН - оптимум 4,7 6,6 5,0 5,3 6,0

рН 50% * 3,3-5.9 4,9-8.6 3,8-6,1 3.3-6,9 4,5-7.2

период полуинактивации 40С, ч >22 - >30 >25 >25

период полуинактивации 50С, ч >22 - >30 23 23

период полуинаюивации 6QC, ч 3,5 - 28 0,25 0.3

остаточная активность после Зч при 40С, % 100 - 100 100 100

остаточная активность после Зч при 50С, % 95 - 97 85 81

остаточная активность после Зч при 60С, % 64 - 73 2 2

активность по р- глюка ну, ед/мг 262 176 0,7 3,5 6.0

активность по КМЦ, ед/мг 3,8 0 0 2,6 4,0

активность по ксилоглюкану, ед/мг 0 0 94 44 62

активность по лихенану, ед/мг 267 200 - 4,3 -

активность по ламинарину, ед/мг 0 О 0 0 0

активность по арабиноксилану, ед/мг 6,5 0,59 0,82 0 1,4

активность по глюкуроноксилану, ед/мг 2.5 0 0 0 0

активность по галактоманнану, ед/мг 0 0 0 0 0

активность по арабинану разветал., ед/мг 0 О 0 0 0

активность по галактану, ед/мг 0 0 0 0 0

активность по полигалактуроновой кислоте, ед/мг 0 О 0 0 0

активность по крахмалу, ед/мг 0 О 0 0 0

активность по пНФ-p-Glc, ед/мг 0 О 0 0 0

активность по пНФ-p-Cell, ед/мг 0 0 0 0 0

активность по пНФ-p-Gal, ед/мг 0 0 0 0 0

активность по оНФ-p-Xyl, ед/мг 0 О * 0 0 0

активность по лНФ-a-Xyl, ед/мг 0 0 0 0 0

активность по пНФ-a-Araf, ед/мг 0 0 0 0 0

активность по пНФ-в-Агар. ед/мг 0 0 0 0 0

Примечания: активность по отношению к полисахаридным субстратам измерена бицинхонинатным методом определения ВС.

БГ- кинетические параметры определены по ]}-ГЛЮКану в качестве субстрата, тКГ - по ксилоглюкану тамаринда.

*) рН 50% - интервал рН при котором фермент сохраняет более 50% активности от максимального значения.

Можно заключить, что все изученные ферменты (за исключением ехо-в1и) действовали практически одинаково на р-глюкан, то есть по механизму, близкому к чисто эндо-деполимеразному (в отличие от возможного смешанного эндо-экзо механизма, при

котором можно было ожидать более значительного выхода ВС), снижая среднюю молекулярную массу полимера одинаково при одной и той же глубине гидролиза (см. рис. 4) и имея приблизительно одинаковые вискозиметрические активности при одинаковой активности по выходу ВС.

Ферменты Продуцент ВискУ ВС ВискУ ВС

(по Ь-глкжану) (по КМЦ)

КЗ 28 А ¿аропсиэ 27

лихеназа В. эиЫШз 20 -

Ев1 Т. (веж 26 21

ЕО11 Т. геевЫ 33 54

Ев III Т. геев® 32 23

ехо-Ои Т. геезе/ 0,29 -

Таблица 4. Отношение вискози-метрической активности к активности по выходу ВС при гидролизе р-глюкана и КМЦ различными ферментами.

Структуру ячменя можно представить как последовательность из блоков

целлотри- и целлотетраозы, соединенных единичными связями (рис. 5), в

соотношении целлотриозащеллотетраоза Содержание более длинных гомологов

(целлопентаозы и других) составляет менее 10% по массе.

Действие бацильных лихеназ на Р-гЛЮКан хорошо изучено. Они расщепляют Р-1,4-гликозидную связь, следующую за Р-1,3 связью (см. рис 5). Конечными. продуктами гидролиза Р-глюканов лихеназами являются в основном три- и тетрасахарид с р-1,3-СВЯЗЬЮ на восстанавливающем конце. Нами были изучены продукты исчерпывающего гидролиза Р-глюкана ячменя, исследуемыми ферментами с помощью ВЭЖХ (колонка с привитой аминофазой Диасорб^^, элюент ацетонитрил:вода = 70:30). р-Глюканаза Л.]аротсиз давала схожие с лихеназой продукты: трисахарид (А) и тетрасахарид (Б), отличающиеся от целлотри- и целлотетраозы. Остальные ферменты давали другие продукты, в том числе глюкозу и целлобиозу, ни один из ферментов не давал ламинарибиозы, целлотриозы или целлотетраозы. Экзо-Р-глюкозидаза Т.гееяег давала единственный продукт гидролиза -глюкозу.

Более детальный анализ структуры три- и теграсахаридов — продуктов гидролиза лихеназой и BG 28 показал, что в случае лихеназы Р-1,3-СВЯЗЬЮ присоединен восстанавливающий остаток глюкозы, как это и следует из литературных данных. Однако, в случае BG 28 Л.japonicus р-1,3- связью был присоединен невосстанавливающий остаток глюкозы:

Р-Ос-О—3)-Р-С1с-(1—■4>Р-С1с (А) и Р-С1с-(1-»3)-Р-С1с-(1—4)-Р-С1сЧ1-4)-Р-С]с (Б).

Исходя из полученных данных, можно заключить, что в случае гидролиза Р-глюкана ячменя р-глюканазой Л.1ароп1сых происходит расщепление Р-1,4 гликозидной связи перед р-1,3-связью (рис. 5). Этим объясняется и отсутствие активности по КМЦ (Р-1,4-ППОКану) и ламинарину у данного фермента. Выделенный нами фермент

классифицировали как

4.2. Механизм действия ксилоглюканазы Ajaponicus на ксилоглюкан.

При изучении механизма действия ксилоглкжаназ был применен подход, аналогичный использованному при изучении ß-ГЛЮканаз.

Показано, что XG 32 Ajapomcus снижала среднюю молекулярную массу ксилоглюкана (так же, как и эндоглюканазы I и III T.reesef), действуя как эндо-деполимераза (рис. 6). Характер изменений картины ГПХ был аналогичен вышеописанному для ß-глюкана под действием эндо-деполимераз. Ксилоглюканазы Treesei и C.lucknowense действали иначе - как экзо-деполимеразы, либо как ферменты промежуточного типа. В ходе гидролиза происходило небольшое уменьшение средней молекулярной массы и некоторое «размывание» пика высокомолекулярного ксилоглюкана и одновременное накопление олигомеров (последнее в случае эндо-деполимераз не наблюдалось).

Структуру ксилоглюкана тамаринда, который мы использовали в работе, можно представить как последовательность из блоков гептасахарида (XXXG), октасахарида (XXLG или XLXG) и нонасахарида (XLLG). На рис. 7 представлена часть молекулы ксилоглюкана, состоящая из нона- и гептасахарида. Краткие обозначения замещенных остатков глюкозы и типа замещения даны по Фраю: незамещенный остаток обозначают буквой G, остаток, несущий ксилозильный заместитель - X, и остаток, содержащий присоединенную ксилозу и галактозу - L (см. рис. 7).

Анализ продуктов исчерпывающего гидролиза ксилоглюкана с помощью ВЭЖХ (колонка с привитой аминофазой Диасорб-NH^ элюент ацетонитрил: вода = 60.40) показал, что все изучаемые ферменты дают три основных (одинаковых во всех случаях) олигосахарида в качестве продукта. Обнаруженные олигосахариды (А, В, С) имели степень полимеризации более 4 и выходили с колонки позже целлотетраозы. Время удерживания первого из элюируемых пиков (А) совпадало с таковым для стандарта - гептасахарида ксилоглюкана XXXG (Megazyme, Австралия), два других олигосахарида В и С выходили позже.

Продукты полного гидролиза ксилоглюкана под действием XG 32 Ajapomcus гидролизовали Р-галактозидазой Penicilhum canescens для удаления присоединенной галактозы. В ходе гидролиза наблюдали постепенную конверсию олигосахаридов В и С в продукт XXXG (А), не содержащий галактозы, и накопление D-галактозы. Таким образом, В и С отличались от А наличием и количеством присоединенной галактозы.

По-видимому, продуктами полного гидролиза ксилоглюкана всеми сравниваемыми ферментами являются олигосахариды строения XXXG (A), XXLG / XLXG (В), XLLG (С) или изомерные им, с другим положением незамещенного остатка глюкозы.

Рис. 6. Изменение молекулярной массы ксилоглюкана (полимерной фракции) в процессе гидролиза под действием ферментов.

Рис. 7. Схема строения ксилоглюкана тамаринда. Строка внизу - однобуквенные обозначения структурных единиц ксилоглюкана по Фраю. Фигурная скобка показывает единичный строительный блок. Glc - D-глкжоза, Gal - D-галактоза, Xyl - D-ксилопираноза.

Сделанные выводы в случае XG 32 мы дополнительно подтвердили с помощью масс-спектрометрического анализа восстановленных олигосахаридов — конечных продуктов гидролиза ксилоглюкана. Было обнаружено три основных продукта, о которых шла речь выше, и кроме этого - небольшое количество их димеров (рис. 8).

Исходя из полученных данных, ксилоглюканаза XG 32 Л.]аротсш была классифицирована как ксилоглюкан-специфичная эндо-Р-Г,4-глюканаза. Ксилоглюканазы

C.lucknowense и T.reesei проявляют свойства т.н. процессивных ферментов (по аналогии с целлобиогидролазами T.reesei) и требуют дальнейшего изучения.

5. Анализ качественного и количественного состава ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Л.)аротсш.

Состав секретируемых белков одного и того же продуцента отличается в зависимости от вида мутантного штамма и условий его культивирования. Поэтому содержание различных ферментов в разных ферментных препаратах может сильно варьировать. Важной задачей является мониторинг качественного и количественного состава препаратов в процессе оптимизации условий культивирования и мутагенеза. Зная состав препарата и свойства основных ферментов, можно прогнозировать поведение ферментных препаратов при применении их в разных областях биотехнологии.

На примере трех ферментных препаратов, полученных в ИБФМ РАН на основе трех различных мутантных штаммов A.japonicus, нами был разработан экспресс-метод анализа состава ферментных комплексов A.japonicus (ДДС-электрофорез этих препаратов приведен нарис. 9).

Метод включал следующие этапы:

• Хроматографическое фракционирование препарата в одинаковых условиях (две стадии); препараты нормируются по содержанию белка (10 мг по Лоури).

• Анализ активности фракций и ДДС-электрофорез.

• Идентификация ферментов во фракциях, определение качественного состава ферментного комплекса и количественного содержания его компонентов.

Рис. 9. ДДС-электрофорез препаратов A.japonicus. (М) - белки маркеры (масса в кДа);

(1) - препарат #34932.1, мутант Aj 426-24-153xyl, 100-л ферментер, ультрафильтрат КЖ;

(2) - препарат #349.34.2, мутант Aj 306-388xyl, 10-л ферментер, лиофильно - высушенный ультрафильтрат КЖ;

(3) - препарат #349.84.2, мутант Aj 178-1049рес, 1-л ферментер,, лиофильно высушенный ультрафильтрат КЖ.

Хроматографическое фракционирование препарата включало две стадии. На первой -обессоленный препарат наносили на колонку Mono Q HR 5/5 при рН 5,5 в 20 мМ пиперазин-HCl буфере (эта стадия была аналогична первой стадии, использованной при выделении гомогенных ферментов). Колонка Mono Q (объемом 1 мл) была использована вместо Source 15Q (объемом 10 мл), поскольку она обеспечивала несколько лучшее разрешение пиков и в то же время - давала достаточно материала для анализа активностей. На второй стадии песвязавшуюся фракцию разделяли на той же колонке при рН 7,4 в 20 мМ буфере имидазол-HCl. Полученные хроматограммы приведены на рис. 10,11. На рисунках справа представлена первая стадия разделения, слева - вторая стадия.

Далее определяли активности фракций, элюируемых с колонок, по отношению к различным полисахаридным субстратам (на 96-луночных планшетах) и представляли полученные результаты в виде гистограмм, отображающих общую активность фракции по отношению к тому или иному субстрату (количество единиц активности во фракции). Примеры гистограмм для ксиланазной и Р-ГЛЮканазнОЙ активности показаны на рис. 12.

А

Б

Рис. 10. Хроматографический анализ исходного препарата Л.]аротсш #349.32.1 (мутант Д 426-24-153ху1) (А) и Л. ]аротсш #349.34.2 (мутант Д 306-388ху1) (Б).

Рис. 11. Хроматографический анализ препарата A. japonicus #349.84.2 (мутант Aj 178-1049 pec).

Для идентификации ферментов во фракциях использовали данные об их специфической активности, а также информацию, приведенную выше в разделе 1. Принимали также в расчет положение соответствующего пика на хроматограмме, которое хорошо воспроизводилось (концентрация соли, при которой выходили ферменты, повторялась с точностью ± 0,01-0,02 М), кроме того, использовали данные ДДС-электрофореза фракций.

Основываясь на данных хроматографического разделения и значениях активности во фракциях, можно сделать выводы о количественном содержании в ферментном препарате того или иного фермента. При этом важно, что не происходило заметной инактивации ферментов в условиях хроматографии. Это подтвердили расчетами выходов всех активностей на первой и второй стадиях.

Рис. 12. Общая активность фракций после первой стадии разделения препаратов по А) #349^2°1 (АИ2б^24-153ху1), Б) #349.34.2 (А] 306-388ху1), В) #349.84.2 (А] 178-1049 рес); Г) #349.32.426-24-153ху1), Д) #349.34.2 (А] 306-388ху1), Е) #349.84.2 ^ 178-1049 рес).

Используя полученные данные об активности индивидуальных ферментов во фракциях (общее количество единиц) и зная величину удельной активности соответствующего фермента (в единицах специфической активности на мг белка, см. выше), мы определяли количество каждого из ферментов (в мг белка). Учитывая, что на колонку наносили 10 мг препарата (по белку), рассчитывали процентное содержание фермента в препарате по белку (табл. 5). Представлял интерес также расчет вклада фермента в специфическую активность препарата - для этого делили количество единиц активности фермента в данной фракции на общее количество единиц активности по специфическому субстрату, собранной во всех фракциях (табл. 5).

Таблица 5. Содержание ферментов и их вклад в соответствующую активность препаратов при рН 5,0 и 50°С.

1Ю 28 Ху135 Ху122 кислая ксиланаза АХН 33 Хв 32 вА 140

#34932.1 (426-24153 ху!) содержание, % 10 14 га -2,3 2,9 0,5 10

вклад в активность препарата,% 80 67* 22* 4* 3,8** 40 78

#34934.2 (306-388 ху!) содержание, % 12 18 16 ~9,0 3,7 0,6 6,8

вклад в активность препарата,% 86* 31* 61* 6* 2,0** 60 89

£349.84.2 (178-' 1049 рее) содержание, % 11 19 15 0 V. 0,7 13

вклад в активность препарата, % 81* 36* 61* 0 2,8** 51 83

Примечания: * активность по глюкуронокеилану

** активность по арабиноксилану

Остановимся на наиболее интересных результатах, полученных в результате анализа состава ферментных препаратов Л.]ароп1сы^.

Активность препаратов по р-глкжану обусловлена, в основном, содержанием BG 28 (вклад в активность препарата 80-86%). Доля данного фермента в препаратах варьирует незначительно (10-12% от общего содержания белка).

Активность препаратов по глюкуроно- и арабиноксилану обусловлена, в основном, содержанием двух мажорных ксиланаз - Xyl 35 и Xyl 22. По количеству Xyl 35 все три препарата близки (14, 18 и 19%, соответственно). Содержание более активной Xyl 22 в препаратах мутантных штаммов #349.34.2 Aj 306-388xyl и #349.84.2 Aj 178-1049pec по белку сравнимо с содержанием Xyl 35, и составляет 16 и 15%. В препарате #349.32.1 Aj 426-24-153xyl содержание Xyl 22 значительно меньше и составляет 2,2 %.

Содержание АХН 33 варьирует от 2,9 до 4,7% по белку, вклад данного фермента в общую активность препаратов по арабиноксилану невелик и составляет от 2,0 до 3,8% (остальная активность обусловлена Xyl 22 и Xyl 35).

Обнаружена новая «кислая ксиланаза», выходящая при 0,21 М NaCl на первой стадии разделения. Она содержится в препарате #349.32.1 Aj 426-24-153xyl (содержание около 2,3% по белку) и, по-видимому, является мажорным компонентом в препарате «ксиланазного» штамма #349.34.2 Aj 306-388xyl (содержание около 9 % по белку). Данная ксиланаза отсутствует в препарате #349.84.2 Aj 178-1049 pec.

Одним из мажорных белков ферментного комплекса A.japonicus является глюкоамилаза 140 кДа, содержание которой в препаратах варьировало от 7 до 13% по белку.

Препарат #349.84.2 Aj 178-1049 pec, продуцируемый «пектиназным» штаммом, обладает в 10-20 раз более высокой удельной полигалактуроназной активностью, чем два других препарата. Данная активность обусловлена, главным образом, увеличением содержания полигалактуроназы PG из несвязавшейся фракции в 10-20 раз.

Ксилоглюканаза XG 32 является минорным белком комплекса и единственной ксилоглюканазой, ее содержание в разных препаратах составляет 0,5-0,7% от общего количества белка.

Была обнаружена минорная эндоглюканаза (неизв.ЕС), выходящая при 0,27 М NaCl и проявляющая активность по КМЦ и Р-ГЛЮКану, но не активная по ксилоглюкану. Ее содержание в препаратах отличается до 3-5 раз, наибольшее содержание этой эндоглюканазы обнаружено з препарате #349.84.2 Aj 178-1049pec.

ВЫВОДЫ

1. Разработан экспрессный метод определения компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью мутантных штаммов Ajaponicus. Метод основан на FPLC-хроматографии на колонке Mono Q. Определено содержание мажорных компонентов в трех препаратах, продуцируемых мутантными штаммами A.japonicus. Показано, что основными белками комплекса являются: Р-ГЛЮКаназа 28 кДа - BG 28 (10-12% по белку), ксиланаза 35 кДа - Xyl 35 (14-19%), ксиланаза 22 кДа - Xyl 22 (2-16%) а также глюкоамилаза 140 кДа - GA 140 (7-13%) и арабиноксилан-арабинофурангидролаза 33 кДа - АХН 33 (35%). Содержание минорной ксилоглюканазы 32 кДа - XG 32 составляет 0,5-0,7%. Препараты содержат также полигалактуроназы, точное содержание которых не определено.

2. В гомогенном состоянии выделены ВО 28, Xyl 35, Xyl 22, ЛХН 33, ХО 32. Изучены биохимические и физико-химические свойства выделенных ферментов, определена их субстратная специфичность.

3. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов выделенных белков показал, что ксиланазы Л.japonicus идентичны или проявляют высокую гомологию с известными аспергильными ферментами. Xyl 35 идентифицировалась как ксиланаза 10-ой семьи гликозил-гидролаз (Ху1А), Xyl 22 - как ксиланаза 11-ой семьи (Ху1 В), АХН 33 - как арабиноксилан-арабинофурангидролаза (АХН) 62-ой семьи. Ферментов, похожих на ВО 28 и ХО 32, в базах данных не обнаружено.

4. Установлено, что ВО 28 Л.japonicus является эндо-Р-1,4-глюканазой, специфичной к Р-1,3-1,4-глюканам. Сравнение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана ячменя и лихенана под действием изучаемого фермента и лихеназы ВжЫШх выявило отличия в субстратной специфичности этих ферментов. ВО 28 Л.japonicus, расщепляет р-1,4-гликозидную связь перед в то время как бацильные лихеназы расщепляют связь после

5. Проведено сравнение степени упорядоченности действия ВО 28 Лjaponicus, эндоглюканаз I, II, Н1 T.reesei и лихеназы ВжЪИШ при гидролизе Р-глюхана ячменя. Методом ГПХ показано, что все ферменты снижают среднюю молекулярную массу полимера примерно одинаково при одинаковой глубине гидролиза (до глубины гидролиза 10-15%). Методом вискозиметрии с одновременным измере'нием выхода восстанавливающих Сахаров (ВС) показано, что все ферменты дают близкие значения отношения вискозиметрической активности к активности по выходу ВС. Полученные данные свидетельствуют об одинаковом эндо-деполимеразном механизме гидролиза глюкана всеми исследованными ферментами.

6. Изучено действие ХО 32 на ксилоглюкан тамаринда. Фермент является Эндо-р-1,4-глкжаназой, специфичной к ксилоглюкану, и практически не обладает активностью по отношению к КМЦ и р-глюкану. Взятые для сравнения специфичные ксилоглюканазы T.reesei и С.Ыскпо^етг отщепляли от полимерного субстрата олигосахариды, содержащие четыре глюкозных остатка в основной цепи, по экзо-деполимеразному или промежуточному типу действия. Таким образом, две последние ксилоглюканазы проявляли свойства т.н. процессивных ферментов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Зоров И.Н., Устинов Б.Б., Бухтояров Ф.Е., Скомаровский АЛ., Марков А.В., Синицына О-А., Гришутин С.Г., Синицын А.П. Оценка действия целлюлаз на полимерные растворимые субстраты по изменению молекулярно-массового распределения. Тезисы

стендовых сообщений школы-конференции "Горизонты Физико-Химической Биологии ", 28 мая - 2 июня 2000, Пущино, с. 119

2. Скомаровский АА, Зоров И.Н., Гришутин С.Г., Марков А.В., Синицын А.П., Гусаков А.В., Рябов АД., Гнеденко Б.Б. Электрохимическое определение эндо-деполимеразной активности целлюлаз. Биохимия, 2000, т. 65, вып. 10, с. 1415-1420

3. Markov AV., Sinitsyn A.P., Kondratyeva E.G., Grishutin S.G. A comparison study of composition of the multienzymatic complexes of different Trichoderma reesei mutants by the use of preparative chromatofocusing. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2000: Fundamentals & Applications", June 10-15,2000, Moscow, Russia, p.123

4. Sinitsyn A.P., Gusakov AV., Grishutin S.G., Sinitsyna OA, Ankudimova N.V. Application of microassays for investigation of cellulase abrasive activity and backstaining J. BiotechnoL, 2001,89,233-238

5. Grishutin S.G, Ustinov B.B., Semenova M.V. Bukhtoyarov F.E., Sinitsyn A.P. Analysis of composition of different Ajaponicus and Clucknowense preparations by means of ionexchange MonoQ chromatography. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications", June 22-27,2002, Moscow, Russia, p.l 12

6. Markov A.V., Grishutin S.G., Salanovich T.N., Kondratyeva E.G., Sinitsyn A.P. Cotton bioscouring by the different enzyme preparations. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications", June 22-27, 2002, Moscow, Russia, p.l 12113

7. Гусаков А.В., Марков A.B., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 2002, т. 67, выл. 6, с. 815-822

8. Семенова М.В. Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из грибаAspergillusjaponicus. Биохимия, 2003, т.68, вып. 5, с.686-697

9. Гришутин С.Г., Дзедзюля Е.И., Марков А.В., Гусаков А.В., Синицын А.П. Поиск ксиланаз, устойчивых к действию белковых ингибиторов пшеницы, ржи, ячменя и кукурузы. Материалы II Московского Международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября 2003, Москва, с. 200

ООП МГУ. Заказ 70-100-04

110152

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Современные представления о классификации карбогидраз.

1.2. Структура и функции ксилоглюкана клеточных стенок растений.

1.3. Ферменты гидролизующие ксилоглюкан.

1.4. Структура и функции нецеллюлозных р-глюканов.

1.5. Ферменты гидролизующие Р-глюканы.

1.6. Ферменты Aspergillus.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты исследования и методика эксперимента.

2.1. Использованные вещества.

2.2. Хроматографическое фракционирование и очистка ферментов.

2.2.1. Разделение препарата A.japonicus.

2.2.2. Хроматографический анализ препаратов A.japonicus.

2.2.3. Разделение препарата T.reesei.

2.3. Определение ферментативной активности и белка.

2.4. Определение биохимических характеристик ферментов.

2.5. Определение рН-зависимости активности ферментов.

2.6. Изучение термостабильности ферментов.

2.7. Определение кинетических параметров действия ферментов.

2.8. Проведение гидролиза Р-глюкана, ксилоглюкана и арабиноксилана под действием ферментов.

2.9. Исследование изменения молекулярно-массового распределения полисахаридов.

2.10. Исследование состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полисахаридов.

2.11. Определение вискозиметрической активности по р-глюкану и карбоксиметилцеллюлозе с одновременным определением выхода ВС.

2.12. Масс спектрометрический анализ пептидного фингерпринта выделенных белков.

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Глава 3. Выделение и очистка ферментов A.japonicus.

3.1. фракционирование исходного препарата A.japonicus с помощью ионообменной хроматографии на Source 15Q.

3.2. Очистка р-глюканазы 28 кДа и ксиланазы 35 кДа.

3.3. Очистка ксиланазы 22 кДа с помощью гидрофобной хроматографии на Phenyl-Superose.

3.4. Очистка ксилоглюканазы 32 кДа с помощью ионообменной хроматографии на Mono Q.

3.5. Очистка арабиноксилан-арабинофурангидролазы 33 кДа.

Глава 4. Идентификация выделенных ферментов с помощью протеолиза трипсином с последующей масс-спектрометрией пептидов.

Глава 5. Изучение свойств выделенных ферментов Ajaponicus.

5.1. Активность и кинетические параметры действия ферментов на различные субстраты.

5.2. рН - зависимости и термостабильность ферментов.

5.3. Механизм гидролиза р-глюкана под действием Р-глюканаз, эндоглюканаз и экзо-Р-глюкозидазы.

5.3.1. Изучение продуктов гидролиза с помощью ГПХ.

5.3.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана.

5.3.3. Сравнение продуктов исчерпывающего гидролиза р-глюкана BG 28 Ajaponicus и лихеназой B.subtilis.

5.3.4. Изучение начальной стадии гидролиза Р-глюкана с помощью вискозиметрии.

5.4. Механизм гидролиза ксилоглюкана под действием ксилоглюканаз и эндоглюканаз.

5.4.1. Изучение продуктов гидролиза ксилоглюкана с помощью ГПХ. щ 5.4.2. Изучение продуктов исчерпывающего гидролиза ксилоглюкана.

Глава 6. Анализ качественного и количественного состава ферментных препаратов A.japonicus.

6.1. Характеристики исходных препаратов.

6.2. Хроматографическое разделение и определение активности фракций.

6.3. Анализ состава и содержания ферментов в препаратах.

6.3.1. Идентификация известных ферментов Ajaponicus.

6.3.2. Оценка количественного содержания индивидуальных ферментов.

ВЫВОДЫ.

В настоящее время ферменты, расщепляющие полисахариды (карбогидразы), находят все более широкое применение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства: для конверсии растительной биомассы, обработки текстильных изделий, в целлюлозно-бумажной промышленности, в пищевой промышленности, в качестве добавок, улучшающих питательные свойства кормов для животных [1, 2, 3, 4].

Широкое разнообразие и повсеместная распространенность ферментов-карбогидраз обуславливается разнообразием структур полисахаридов, встречающихся в природе, а также узкой субстратной специфичностью ферментов к типу моносахаридного остатка, типу связи между остатками, и ближайшему окружению расщепляемой связи. Одними из самых распространенных в природе являются полисахариды клеточных стенок растений. Они могут быть условно разделены на три группы: целлюлоза, гемицеллюлозы и пектины [5].

Целлюлоза является основным компонентом клеточной стенки и представляет собой линейный полимер, состоящий из остатков D-глюкозы, соединенных р-1,4-связями. Полимеры целлюлозы присутствуют как упорядоченные структуры (арматура) и их основная функция — обеспечение жесткости клеточной стенки растений [5, 6].

Гемицеллюлозы - группа структурно различных гетерополисахаридов, часто встречающихся вместе с целлюлозой. Основным гемицеллюлозным полимером злаков и лиственных деревьев является ксилан. Основная цепь ксилана построена из остатков D-ксилозы, соединенных (3-1,4-связями, и может содержать различные заместители (или короткие боковые цепи), такие как L-арабинозу, D-глюкуроновую кислоту, D-ксилозу, а также ацетил- ферулоил- и и-кумароильные группы [7].

Другими распространенными гемицеллюлозными полимерами являются галактоманнаны и галактоглюкоманнаны. Они составляют основную фракцию гемицеллюлоз хвойных деревьев [8], а также служат запасными полисахаридами, например, в семенах бобовых [9].

К гемицеллюлозам относят также ксилоглюканы и р-глюканы, основная цепь которых содержит остатки D-глюкозы, соединенные |3-1,4-связями в случае ксилоглюкана,- и большое количество боковых заместителей или остатки глюкозы, соединенные 0-1,4, р-1,3-связями в случае р-глюканов злаков. В семенах некоторых растений эти полисахариды выполняют также функцию углеводного запаса [5, 9].

Пектины образуют следующую группу гетерополисахаридов. В зависимости от растительного источника структура пектинов может достаточно сильно различаться. Общим в структуре пектинов является линейная последовательность а-1,4-галактуронана, которая перемежается встроенными участками линейного рамногалактуронана, к которому в свою очередь присоединены боковые цепи, что делает структуру пектинов разветвленной. В качестве боковых цепей наиболее часто присутствуют линейные и разветвленные а-1,5-арабинофурананы, несущие ответвления в позициях 02 и 03, а также арабино-р-1,4-галактаны и арабино-р-1,3-1,6-галактаны, которые содержат большее или меньшее количество арабинофуранозы в виде боковых заместителей и в виде последовательностей а-1,5-арабинофуранана. Указанные арабинаны и галактаны часто содержатся и в ковалентно-несвязанном с пектином виде [5,6,9].

На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое количество ферментов - карбогидраз из различных источников. На основании гомологии их первичной аминокислотной последовательности они разбиты на семьи гиликозил-гидролаз [10, 11], причем, часто микроорганизм продуцирует несколько ферментов одного типа действия. Например, гриб-продуцент целлюлаз Trichoderma reesei продуцирует 5 эндоглюканаз (I - V), две целлобиогидролазы (I, П) и три ксиланазы (I, II, III) [11,12]. Представители рода Aspergillus часто продуцируют по нескольку разных ксиланаз и полигалактуроназ [13].

Ксиланазы расщепляют гликозидные связи в основной цепи Р-1,4-ксилана. Массированное изучение ксиланаз происходит на протяжении более 50 лет. В настоящее время становится все более актуальной фундаментальная задача выявления особенностей действия на субстрат ферментов с одинаковой специфичностью, но принадлежащих к разным семьям гликозил-гидролаз. Кроме этого, задача поиска новых ферментов, не имеющих гомологии с известными ксиланазами и, возможно, обладающих новыми важными свойствами и особенностями действия на сложный гетерополисахарид, остается актуальной.

Основную цепь таких полисахаридов как ксилоглюкан и р-глюкан злаков могут расщеплять по эндо-деполимеразному механизму многие эндо-Р-1,4-глюканазы (целлюлазы). Однако, ферменты, специфичные только к данному полисахариду (Р-глюкану или ксилоглюкану) и неактивные по отношению к другим р-1,4-глюканам, крайне мало изучены. Исключением являются бактериальные лихеназы (эндо-р-1,3-1,4глюканазы), расщепляющие |3-глюканы. В случае же ксилоглюканаз довольно хорошо изучены лишь специфические ферменты растений - ксилоглюкан-эндо-трансгликозилазы. Только недавно (в 1999-2004 гг.) появились первые сообщения о специфичных грибных ксилоглюканазах и р-глюканазах.

В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб Aspergillus japonicus — продуцент ксиланаз, р-глюканаз, пектиназ и других карбогидраз. Однако, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось и сведения, касающиеся ферментов, которые он продуцирует, в научной литературе практически отсутствуют.

Целью работы являлось изучение состава ферментного комплекса, секретируемого грибом A.japonicus и выявление наиболее важных и перспективных ферментов. Далее мы поставили цель подробно изучить свойства обнаруженных нами ксиланаз, [3-глюканазы и ксилоглюканазы и сравнить их со свойствами аналогичных ферментов из других источников. Для двух последних ферментов в качестве «стандарта для сравнения» выбрали хорошо изученные эндо-р-1,4-глюканазы I, II и III мицелиального гриба Trichoderma reesei и лихеназу (эндо-(3-1,3-1,4-глкжаназу) из Bacillus subtilis, а также мало изученные ксилоглюканазы из T.reesei и Chrysosporium lucknowense.

Для достижения указанных целей в рамках диссертационной работы было необходимо решить следующие задачи:

• Выделить основные (мажорные) карбогидразы ферментного комплекса A.japonicus.

• Разработать схему экспрессного хроматографического анализа качественного и количественого состава ферментных препаратов, продуцируемых мутантными штаммами Ajaponicus.

• Изучить свойства и механизм действия специфичных р-глюканазы и ксилоглюканазы A.japonicus и сравнить их действие с эндо-Р-1,4-глюканазами T.reesei и лихеназой В.subtilis, а также ксилоглюканазами T.reesei и C.lucknowense.

выводы

1. Разработан экспрессный метод определения компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью мутантных штаммов A.japonicus. Метод основан на FPLC-хроматографии на колонке Mono Q. Определено содержание мажорных компонентов в трех препаратах, продуцируемых мутантньши штаммами Ajaponicus. Показано, что основными белками комплекса являются: (3-глюканаза 28 кДа -BG 28 (10-12% по белку), ксиланаза 35 кДа - Xyl 35 (14-19%), ксиланаза 22 кДа - Xyl 22 (2-16%) а также глюкоамилаза 140 кДа - GA 140 (7-13%) и арабиноксилан-арабинофурангидролаза 33 кДа - АХН 33 (3-5%). Содержание минорной ксилоглюкаиазы 32 кДа - XG 32 составляет 0,5-0,7%. Препараты содержат также полигалактуроназы, точное содержание которых не определено.

2. В гомогенном состоянии выделены BG 28, Xyl 35, Xyl 22, АХН 33, XG 32. Изучены биохимические и физико-химические свойства выделенных ферментов, определена их субстратная специфичность.

3. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов выделенных белков показал, что ксиланазы Ajaponicus идентичны или проявляют высокую гомологию с известными аспергильными ферментами. Xyl 35 идентифицировалась как

Ф ксиланаза 10-ой семьи гликозил-гидролаз (XylA), Xyl 22 - как ксиланаза 11-ой семьи (Xyl

В), АХН 33 — как арабиноксилан-арабинофурангидролаза (АХН) 62-ой семьи. Ферментов, похожих на BG 28 и XG 32, в базах данных не обнаружено.

4. Установлено, что BG 28 A.japonicus является эндо-Р-1,4-глюканазой, специфичной к р-1,3-1,4-глюканам. Сравнение продуктов исчерпывающего гидролиза Р-глюкана ячменя и лихенана под действием изучаемого фермента и лихеназы B.subtilis выявило отличия в субстратной специфичности этих ферментов. BG 28 A.japonicus, расщепляет Р-1,4-гликозидную связь перед Р-1,3-связью в Р-глюканах, в то время как бацильные лихеназы расщепляют Р-1,4-гликозидную связь после р-1,3-связи.

5. Проведено сравнение степени упорядоченности действия BG 28 Ajaponicus, эндоглюканаз I, II, III T.reesei и лихеназы B.subtilis при гидролизе р-глюкана ячменя. Методом ГПХ показано, что все ферменты снижают среднюю молекулярную массу полимера примерно одинаково при одинаковой глубине гидролиза (до глубины гидролиза 10-15%). Методом вискозиметрии с одновременным измерением выхода восстанавливающих Сахаров (ВС) показано, что все ферменты дают близкие значения отношения вискозиметрической активности к активности по выходу ВС. Полученные данные свидетельствуют об одинаковом эндо-деполимеразном механизме гидролиза Р-глюкана всеми исследованными ферментами.

6. Изучено действие XG 32 на ксилоглюкан тамаринда. Фермент является эндо-р-1,4-глюканазой, специфичной к ксилоглнжану, и практически не обладает активностью по отношению к КМЦ и Р-глюкану. Взятые для сравнения специфичные ксилоглюканазы T.reesei и C.lucknowense отщепляли от полимерного субстрата олигосахариды, содержащие четыре глзокозных остатка в основной цепи, по экзо-деполимеразному или промежуточному типу действия. Таким образом, две последние ксилоглюканазы проявляли свойства т.н. процессивных ферментов.

1. Godfrey Т., West S.: Industrial enzymology, 2nd ed. Macmillan Press, London, 1996, 609p

2. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое B.M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Москва, Изд-во МГУ, 1995, 224с

3. Bhat М.К. Cellulases and related enzymes in biotechnology //Biotech. Adv., 2000, 18, 355-383.

4. Clarke A J.: Biodegradation of cellulose. Enzymology and Biotechnology.

5. Technomic Publishing Company, Inc., 1997, 261 p

6. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений, Москва, Мир, 1986,Т.1, с 92

7. Carpita N.C., Gibeaut D.M Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth //Plant J., 1993, 3,1-30

8. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. (editors) Hemicellulose and Hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London and Chapel Hill. Vol. IV, 1993, 120p

9. Азаров В.И., Буров A.B., Оболенская A.B. Химия древесины и синтетических полимеров. СПб, СПбЛТА, 1999,628с.

10. Food Polysaccharides and Their Applications (Ed. by A.M. Stephen), Marcel Dekker, Inc., New York, 1995.

11. Henrissat В., Davies G. Structural and sequence-based classification of hydrolases //Curr. Opin. Struct. Biol., 1997, 7, 637-644.11. http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/

12. Рабинович M.JI., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов //Биохимия, 2002, 67, 1026-1050

13. De Vries R. P. Accessory enzymes from Aspergillus involved in xylan and pectin degradation. PhD thesis, The Wageningen Agricultural University, Wageningen, Netherlands, 1999

14. NC-IUBMB Enzyme nomenclature 1992. Recommendations of the nomenclature committee of the International Unoin of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, Orlando, 1992

15. Henrissat В A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities //Biochem. J., 1991, 280, 309-316

16. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. //Biochem. J., 1993, 293, 781-788

17. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. //Biochem. J., 1996, 316, 695-696

18. Henrissat В., Teeri T.T., Warren R.A.J. A scheme for desingating enzymes that hydrolyse the polysaccharides in the cell walls of plants //FEBS Lett., 1998, 425, 352-354

19. Sinnott M.L. Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer // Chem. Rev., 1990,90, 1171-1202.

20. McCarter J.D., Whithers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis //Curr. Opin. Struct. Biol., 1994,4, 885-892.

21. Hayashi Т., Xyloglucans in the primary cell walls// Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1989,40, P.139-168.

22. Reid J.S.G., Edwards M.E., Galactomannans and other cell wall storage polysaccharides in seeds / in Food Polysaccharides (Ed. by A.M. Stephen), Marcel Dekker, N.-Y.,1995, P. 155-186

23. KoimanP. Amyloids of plant seeds //Nature, 1957, 179,107-109.

24. Koiman P. On the occurence of amyloids in plant seeds //Acta Bot. Neerl., 1960, 9, 208-219.

25. Gidley M.J., Lillford P.J., Rowlands D.W., Lang P., Dentini M., Crescenzi V., Edwards M., Fanutti C., Reid J.S.G., Structure and solution properties of tamarind-seed polysacsharide// Carbohydr. Res., 1991, 214, P. 299.

26. York W.S., van Halbeek H., Darvill A.G., Albershaim P., Structural analysis of xyloglucan olygosaccharides by ^-nmr spectroscopy and fast atom bombardment mass spectrometry // Carbohydr. Res., 1990, 200,9.

27. Fanutti C., Gidley M.J., Reid J.S.G., Action of a pure xyloglucan endo-transglycosylase (formely called xyloglucan specific endo (1—>4) (3-D-glucanase) from the cotyledons of germinated nasturtium seeds // Plant J., 1993, 3, P.691.

28. Hayashi Т., Delmer D.P., Xyloglucan in the cell walls of cotton fiber // Carbohydr. Res. 1988, 181,273-277.

29. Vincken J.P., Beldman G., Niessen W.M.A., Voragen A.G.J., Degradation of apple fruit xyloglucan by endoglucanase // Carbohydr. Polymers, 1996, 29, 75-85.

30. Vincken J-P., York W.S. Beldman G., Voragen A.G.J. Two general branching patterns of xyloglucan, XXXG and XXGG // Plant Physiol., 1997,114, 9-13

31. York W.S., Kolli V.S.C, Orlando R., Albersheim P., Darwill A.G. The structures of arabinoxyloglucans produced by solanaceous plants // Carborbohydr. Res., 1996, 285, 99-128

32. Ray В., Loutelier-Bourhis C., Lange C., Condamine E., Driouich A., Lerouge P // Structural investigation of hemicellulosic polysaccharides from Argania spinosa: characterization of a novel xyloglucan motif// Carbohydr. Res., 2004, 339,201-208

33. York W.S., Oates J.E., van Halbeek H., Darvill A.G., Albershaim P. et al., Location of the O-acetyl substituents on a nonasaccharide repeating unit of sycamore extracellular xyloglucan//Carbohydr. Res., 1988,173,113-132.

34. Darley C.P., Forrester A.M., McQueen-Mason SJ. The molecular basis of plant cell wall extension. //Plant Mol. Biol., 2001, 47, 179-195

35. Pauly M., Albersheim P., Darvill A., York W.S. Molecular domains of the cellulose/xyloglucan network in the cell walls of higher plants // The Plant J.,1999, 20(6), 629-639

36. Усов А.И. Олигосахарины новый класс сигнальных молекул в растениях // Успехи химии, 1993, 62, 1119

37. Долгих Ю.И., Шайкина Е.Ю., Усов А.И. Трисахаридный фрагмент ксилоглюкана как регулятор морфогенеза у растений //Докл. АН/РАН, 1998, 360,3,417-419

38. Edwards М., Dea I.C.M., Bulpin P.V., Reid J.S.G., Purification and properties of a novel xyloglucan-specific endo (1—>4) P-D-glucanase from germinated nasturtium seeds (Tropaeolum majus L.) II J. Biol. Chem., 1986,261, 9489.

39. De Silva J., Jarman C.D., Arrowsmith D.A., Stronach M.S., Chengappa S., Reid J.S.G., Molecular characterization of a xyloglucan specific endo (l-»4) P-D-glucanase (xyloglucan endo-transglycosylase) from nasturtium seeds// Plant J. 1993,3,701.

40. Fanutti C., Gidley M.J., Reid J.S.G., A xyloglucan-olygosaccharide-specific a-D-xylosidase or exo-olygoxyloglucan-a-hydrolase from germinated nasturtium (Tropaeolum majus ) seeds // Planta, 1991, 184, 137

41. Edwards M., Bowman Y.J.L., Dea I.C.M., Reid J.S.G., A P-galactosidase from nasturtium (Tropaeolum majus L.) cotyledons purification, properties and demonstration that xyloglucan is the natural substrate // J. Biol. Chem., 1988, 263,4333

42. Pauly M., Qiang Qin, Albersheim P., Darvill A., York W.S Changes in the structure of xyloglucan during cell elongation // Planta, 2001, 212, 842-850

43. Schulein M., Outtrup H., Jorgensen; P. L. Bjornvad M. E. Xyloglucan-specific alkaline xyloglucanase from bacillus //US patent, 6,268,197, My 7, 1998

44. Irwin D.C., Cheng M, Bosong Xiang, Rose J.K.C, Wilson D.B. Cloning, expression and characterisation of family-74 xyloglucanase from Thermobillda fusca//Eur. J. Biochem., 2003, 270, 3083-3091

45. Hasper A. A, Dekkers E., van Mil M, van de Vondervoort PJ.I, de Graaf L. H. EglC, a new endoglucanase from Aspergillus niger with major activity towards xyloglucan. //Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68 (4), 1556-1560

46. Yaoi K., Mitsuishi Y. Purification, characterization, cloning, and expression of a novel xyloglucan-specific glycosidase, olygoxyloglucan reducing end-specific cellobiohydrolase.//J. Biol. Chem., 2002, 277, 48276-48281.

47. Yaoi K., Mitsuishi Y. Purification, characterization, cDNA cloning, and expression of a xyloglucan endoglucanase from Geotrichum sp. M128. //FEBS Lett., 2004, 560, 45-50

48. Yincken J.P., Beldman G., Yoragen A.G.J., Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? // Carbohydr. Res., 1997,298, P.299-310

49. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание степени канд. хим. наук., Москва, МГУ, 2003,201 с.

50. Dalboge Н., Andersen L.N., Kofod L.V., Kauppinen M.S., Christgau S./ World Pat.W094/14953 (1994)

51. Бухтояров Ф.Е.,. Устинов Б. Б, Саланович Т. Н., Антонов А. И., Гусаков А. В, Окунев О. Н, Синицын А. П. Целлюлазный комплекс гриба Chrysosporium lucknowensei выделение и характеристика эндоглюканаз и цел лобиогидрол аз .//Биохимия, 2004, 69, 666-677

52. Cahhabra S.R., Kelly R.M., Biochemical characterization of Thermotoga maritima endoglucanase Cel 74 with and without a carbohydrate binding module (CBM) // FEBS Lett., 2002, 531, 375-380

53. Biely P., Vrsanska M., Claeyssens M.// Eur. J. Biochem., 1991, 200,157-163

54. Claeyssens M., van Tilbeurgh H., Kamerling J.P., Berg J.,Vrsanska M., Biely P. Studies of the cellulolytic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei

55. QM 9414. Substrate specificity and transfer activity of endoglucanase I

56. Biochem. J., 1990,270, 251-256

57. Macarron R., Acebal C., Castillion M.P., Domingues J.M., de la Mata I., Petterson G., Tomme P., Claeyssens MУ/ Biochem. J., 1993, 289, 867-873

58. Claeyssens M., Nerinckx W., Piens K. (editors) Carbohydrases from Trichoderma reesei and other microorganisms. Structure, biochemistry, genetics and applications. The Royal Society of Chemistry., 1998, 238p

59. Stone B.A, Clarke A.E., Chemistry and biology of 1,3-P-glucans/ La Trobe University press, Bundoora, Australia, 1992

60. Peat S., Whelan W.J., Roberts J.G. The structure of lichenan.// J. Chem. Soc., 1957, 3916-3924

61. Pitson S.M., Seviour R.J., McDougall B.M.: Noncellulolytic fungal (i-glucanases: Their physiology and regulation.// Enzyme Microbial Technol., 1993, 15, 178-192

62. Read S.M., Currie G., Bacic A. Analysis of the structural heterogenuity of laminarin by electrospray- ionisation-mass spectrometry // Carbohydr. Res., 1996, 281,187-201

63. Chizhov A.O., Dell A., Morris H.R., Reason A.J., Haslam S.M., McDowell R.A., Chizhov O.S., Usov A.I. Structural analysis of laminarans by MALDI and FAB mass spectrometry // Carbohydr. Res., 1998,' 310, 203-210

64. Izydorczyk, M. S., Macri, LJ. and MacGregor, A.W. Structure and physiochemical properties of barley non-starch polysaccharides I. Water-extractable fi-glucans and arabinoxylans. //Carbohydr. Polymers, 1998, 35, 249-258.

65. Izydorczyk, M. S., Macri, L J. and MacGregor, A.W. Structure and physiochemical properties of barley non-starch polysaccharides П. Alkali-extractable B-glucans and arabinoxylans.//Carbohydr. Polymers, 1998, 35, 259-269.

66. Reese E.T, Mandels M. p-1,3 Glucanases in Fungi //Can. J. Microbiol., 1959, 5, 173-185

67. Planas A. Bacterial 1,3-1,4-P-glucanases: structure, function and protein engeneering.// Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1543, 361-382

68. Hrmova M., Fincher G.F. Structure-function relationships of p-glucan endo-and exohydrolases from higher plants // Plant Mol. Biol., 2001, 47, 73-91

69. MacCleary B.V. Lichenase from Bacillus subtilis //Methods Enzymol., 1988, 160, 572-575

70. Lichenase from Bacilus subtilis, Product Data Sheet, Megazyme, Australia, 11,1999 (www.megazyme. com)

71. Hahn M., Pons J., Planas A., Querol E., Heinemann U. Crystal structure of Bacillus licheniformis 1,3-1,4-p-D-glucan 4-glucanohydrolase at 1.8A resolution //FEBS Lett., 1995, 374, 221-224

72. Hahn M., Olsen O., Politz O., Borris R., Heinemann U. Crystal structure and site-directed mutagenesis of Bacillus macerans endo-l,3-l,4-beta-glucanase.//J. Biol. Chem., 1995, 270, 3081-3088

73. Keitel Т., Simon O., Borris R., Heinemann U. Molecular and active-site structure of a Bacillus 1,3-1,4-beta-glueanase//Procl. Natl. Acad.Sci. USA, 1993, 90, 1287-1291

74. Hahn M., Keitel Т., Heinemann U. Crystal and molecular structure at 0.16-nm resolution of the hybrid Bacillus endo-l,3-l,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase H(A16-M) //Eur. J. Biochem., 1995,232, 849-58.

75. Keitel Т., Meldgaard M, Heinemann U. Cation binding to a Bacillus (l,3-l,4)-beta-glucanase. Geometry, affinity and effect on protein stability //Eur. J. Biochem., 1994, 222, 203-214

76. Viladot J.L., de Ramon E., Durany O., Planas A. Probing the mechanism of Bacillus 1,3-1,4-p-D-glucan 4-glucanohydrolases by chemical rescue of inactive mutants at catalytically essential residues //Biochemistry, 1998,37,11332-11342

77. Planas A., Malet C. Contribution of subsites to catalysis and specificity in the extended binding cleft of Bacillus 1,3-1,4-b-D-glucan 4-glucanohydrolase /in

78. Pettersen S.B., Svensson В., Pedersen S. Carbohydrate Bioengineering, Elsevier, Amsterdam, 1995, 85-95

79. Malet C., Planas A. Mechanism of Bacillus 1,3-1,4-P-D-glucan 4-glucanohydrolase: kinetics and pH studies with 4-methyIumbelliferyI P-glucan oligosaccharides//Biochemistry, 1997, 36, 13838-48

80. Viladot J.L., Stone B.A., Driguez H., Planas A. Expeditious synthesis of a new hexasaccharide using transglycosilation reaction catalyzed by Bacillus 1,3-1,4-P-D-glucan 4-glucanohydrolase // Carbohydr. Res., 1998, 311, 95-99

81. Malet C., Planas A. From P-glucanase to p-glucansynthase: glycosyl transfer to a-glycosyl fluorides catalyzed by a mutant endoglucanase lacking its catalytic nucleophile//FEBS Lett., 1998,440,208-212

82. Fort S., Boyer V., Grefee L., Davies G.J., Moroz O., Cristiansen L., Shulein M., Cottaz S., Driguez H.// J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 5429-5437

83. Parenicova L. Pectinases of Aspergillus niger: a molecular and biochemical characterization. PhD thesis, The Wageningen Agricultural University, Wageningen, Netherlands, 2000.

84. Verbruggen M.A., Beldman G., Voragen A.G.J. Enzymic degradation of sorghum glucuronoarabinoxylan leading to tentative structures. // Carbohydr. Res., 1998, 306, 275-282

85. Verbruggen M.A., Spronk B.A., Shcols H.A., Beldman G., Voragen A.G.J., Thomas J.R., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. Structures of enzymically derivedoligosaccharides from sorghum glucuronoarabinoxylan // Carbohydr. Res., 1998, 306, 265-274

86. Fujimoto H., Ooi Т., Wang S.-L., Takiwaza Т., Hidaka H., Murao S., Arai M. Purification and properties of three xylanases from Aspergillus aculeatus II Biosci., Biotech., Biochem., 1995, 59, 538-540

87. Kormelink F.J.M., Searle-van Leeuwen M.J.F., Wood T.M., Voragen A.G.J. Purification and characterization of three endo-l,4-p-xylanases and one xylosidase from Aspergillus awamori//J. Biotechnol., 1993, 27, 249-265

88. Ito K., Ikemasu Т., Ishikawa T. Purification and properties of acid stable xylanases from Aspergillus kawachii //Biosci., Biotech., Biochem., 1992, 56, 547-550

89. Gorbacheva I.V., Rodionova N.A. Studies on xylan degrading enzymes. I Purification and characterization of endo-l,4-p-xylanase from Aspergillus niger strain 14.// BBA, 1977, 484, 79-93

90. Frederick M.M., Frederick J.R., Frayzke A.R., Reilly P.J. Purification and characterization of a xylobiose- and xylose-producing endo-xylanase from Aspergillus niger II Carbohydr. Res., 1981,97, 87-103

91. Saha B.C. a-L-Arabinofuranosidases: biochemistry, molecular biology and application in biotechnology. Research review paper. //Biotechnology Advances, 2000, 18, 403-423

92. Beldman G., Searle-van Leeuwen M.J.F., de Ruiter G.A., Siliha H.A., Voragen A.G.J. Degradation of arabinans by arabinases from Aspergillus aculeatus and Aspergillus niger. //Carbohydr. Polymers, 1993, 20, 159-168

93. Luonteri E., Siika-aho M., Tenkanen M., Viikari L. Purification and characterization of three alpha-arabinofuranosidases from Aspergillus terreus. //J. Biotechnol., 1995, 38, 279-291

94. Kormelink F.J.M., van Leewan M.J.F.S., Wood T.M., Voragen A.G.J.: Purification and characterization of a (l,4)-P-arabinixylan arabinofuranohydrolase from Aspergillus awamori. //Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991,35,753-758

95. Gielkens M.M.C., Visser J., de Graaf L.H. Arabinoxylan degradation by fungi: characterization of the arabinoxylan-arabinofuranhydrolase encoding genes from Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis //Curr. Genet., 1997, 31, 22-29

96. Pitson S.M., Voragen A.G.J., Beldman G. Stereochemical course of hydrolysis catalysed by arabinofuranosyl hydrolases //FEBS Lett., 1996,398, 7-11

97. Flipphi M.J. A., Visser J., Veen van der P., de Graaf L.H. Cloning of the Aspergillus niger gene encoding a-L-arabinofuranosidase A //Appl. Microbiol. Biotech., 1993, 39, 335-340

98. Flipphi M.J.A., van Heuvel M., Veen van der P., Visser J., de Graaf L.H. Cloning and characterisation of the abfB gene coding for the major a-L-arabinofuranosidase (AbfB) of Aspergillus niger И Curr. Genet., 1993,24, 525-532

99. Kormelink F.J.M., Gruppen H., Voragen A.G. J Mode of action of (l,4)-p-D-xylan arabinoxylan arabinofuranhydrolase and a-L-arabinofuranosidases on alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan //Carbohydr. Res., 1993, 249, 345-353

100. Остерман JI.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М. Наука, 1985, 536с.

101. Protein Purification Techniques. A practical approach (Ed. by S.Roe)/Oxford University Press, 2001

102. Инструкции фирм производителей оборудования.

103. Medve J., Lee D., Tjerneld F. Ion-exchange chromatographic purification and quantitative analysis of Trichoderma reesei cellulases cellobiohydrolase I, П and endoglucanase П by fast protein liquid chromatography //J. Chromatogr., 1998, 808, 153-165

104. Fox J.D., Robyt J.F. Miniaturization of Three Carbohydrate Analyses Using a Microsample Plate Reader // Anal. Biochem., 1991, 195, 93-96.

105. Garcia E., Johnson D.,Whitaker J.R.,Shoemaker S.P. Assesement of endo-1,4-beta glucanase activity by a rapid colorimetric assay using disodium-2,2'-bicinchoninate.//J. Food Biochem., 1993,17, 135-145.

106. Doner L.W, Irwin P.L Assay of reducing end-groups in olygosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate //Anal. Biochem., 202 (1992), 50-53

107. Somogui M.J. Notes on sugar determination//!. Biol. Chem., 1952,195,19-23.

108. Синицын А.П., Черноглазов B.M., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов (под ред. Варфоломеева С.Д.)//Итоги науки и техники, сер. Биотехнология, т.25, ВИНИТИ, 1993 г, 152 с118. Лабораторная методика

109. Досон Р., Эллиот Д. Эллиот У, Джонс К. (1991) Справочник биохимика, Мир, Москва, 544 с.

110. Chaplin M.F., Kennedy J.F (eitors) Carbohydrate Analysis. A practical approach Oxford University Press, 1994, 324 p.

111. Гусаков A.B., Марков A.B., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. //Биохимия, 2002, 67, 6, 815-822

112. В.Е. Smith, Protein sequencing protocols, Humana Press, Totowa, 1997

113. Семенова M.B. Выделение и изучение свойств ферментов пектиназного комплекса из гриба Aspergillus japonicus, Дипл. работа, Химич. ф-т, МГУ, 2001.

114. Федорова Е.А. Выделение и изучение глюкоамилаз из аспергилльных источников. Дипл. работа, Химич. ф-т, МГУ, 2003

115. Семенова М.В., Федорова Е.А., Синицын А.П и др. Сравнение «тяжелых» и «легких» форм глюкоамилаз из аспергиллов. Материалы II Московского Международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября 2003, Москва, С.6.23

116. Семенова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба Aspergillus japonicus. Биохимия, 2003, 68, 5,686-697

117. Yatesin J.R. Mass spectrometry and the age of proteome I I J. Mass Spectrom., 1998, 33,1-19

118. James P. (Ed.), Proteome research: mass spectrometry, Springer-Verlag, Berlin, 2001

119. Rappsilber J., Moniatte M., Nielsen M.L., Podtelejnikov A.V., Mann M. Experienses and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research // Int. J. Mass Spectrom., 2003, 226,223-237

120. Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-P-xylanase families: differences in catalytic properties.// J. Biotechnol., 1997, 57, №1-3,151-166

121. Barley Beta-Glucan (medium viscosity), Product Data Sheet, Megazyme, Australia, 11, 1999 (www.megazyme.com)

122. Faure D. The family-3 glycoside hydrolases: from housekeeping functions to host-microbe interactions //Appl. Environmental Microbiol., 2002, 68, 4, 1485-1490.

123. Клесов A.A., Рабинович M.JL, Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. I. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников. //Биоорган, химия, 1980, 6, №8, 1225-1242

124. Hulme М.А. Viscometric determination of carboxymethylcellulase activity. In: Methods in Enzymology Vol. 160 (Eds. Wood W.A., Kellogg S.T.) Academic Press, NY, 1988, 130-135.

125. Wilhelmi C., Morgan K. The hydrolysis of barley P-glucan by cellulase EC 3.2.1.4 under dilute conditions is identical to that of barley solubilase //Carbohydr. Res., 2001, 330, 373-380.

126. Николаев И.В., Ходова O.M., Тимохина E.A., Винецкий Ю.П. Молекулярные характеристики секретируемой Р-галактозидазы Penicillium canescens. //Биохимия, 1989, 54,1294-1299

127. Николаев И.В., Беккер О.Б., Серебрянный В.А., Чулкин А.М., Винецкий Ю.П. Суперпродукция секретируемой Р-галактозидазы мицелярным грибом Penicillium canescens: структура гена и конструкция мультикопийного продуцента. //Биотехнология, 1999, № 3, 3-13.

128. Xyloglucan (tamarind), Product Data Sheet, Megazyme, Australia, 11, 1999 (www.megazyme.com)