Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

СЕМЕНОВА МАРГАРИТА ВИКТОРОВНА

СВОЙСТВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПЕКТИНАЗ ГРИБОВ POM ASPERGILLUS

02.00.15-катализ 03.00.23 -биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын А.П. Научный консультант:

кандидат химических наук Гусаков А. В.

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Римарева Л.В. доктор химических наук, профессор Ямсков И.А.

Ведущая организация:

Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пушино

Защита состоится « февраля 2005 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В Ломоносова.

Автореферат разослан «23» декабря 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

Актуальность темы. Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX века. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве позволило существенно повысить глубину переработки пищевого сырья, улучшить органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов, повысить усвояемость кормов и расширить сырьевую базу кормопроизводства. В настоящее время при использовании в пищевой промышленности и фармакологии лидирующее место занимают препараты на основе грибов рода Aspergillus. Они используются как продуценты внеклеточных ферментов широкого спектра действия (пектиназ, амилаз, протеаз), а также для получения метаболитов (органических кислот, витаминов, жирных кислот и аминокислот).

Пектиназы, продуцируемые промышленными штаммами грибов A. foetidus и A.niger, незаменимы при работе с ягодами, овощами и фруктами, а также с продуктами их переработки. Пектиназы используются при приготовлении осветленных соков, соков с мякотью и пюре. Широкое распространение пектиназные препараты получили в виноделии. При приготовлении как соков, так и вин пектиназы используются на разных стадиях технологического процесса: при мацерации растительных тканей, при получении сока и для увеличения его выхода, при подготовке сусла к брожению (в виноделии), при осветлении сока и вина и для стабилизации готового продукта.

Перспективным является применение ферментных препаратов в сельском хозяйстве в качестве добавок к кормам животных и птиц. При использовании кормовых диет, включающих бобовые (в первую очередь - сою), возрастает роль ферментов пектолитического действия, так как пектин является основным компонентом полисахаридной части бобовых. Известно также, что пектиназные препараты A. oryzae в настоящее время широко используются в пищевой промышленности Юго-Восточной Азии при получении продуктов на основе сои.

Ряд положительных характеристик грибов рода Aspergillus - широкий спектр продуцируемых гидролитических ферментов, высокий уровень белковой секреции, а также безопасность их использования в пищевой промышленности и фармакологии (некоторые аспергиллы получили GRAS-статус) - способствует увеличению интереса к ним как к продуцентам промышленных ферментов. В связи с этим растет потребность в фундаментальных знаниях о механизмах действия и свойствах индивидуальных ферментов, продуцируемых этими грибами, чтобы понимать механизмы функционирования ферментного препарата и иметь возможность управлять каталитическим процессом при его практическом использовании.

В нашей лаборатории совместно с ИБФМ РАН на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб A japonicus - продуцент различных карбогидраз, в том числе пектиназ Получен ряд мутантных высокопродуктивных штаммов этого гриба До сих пор гриб Ajaponicus рассматривался только как источник гемицеллюлаз (ксиланаз и Р-глюканаз), его пектиназный комплекс не изучался и в научной литературе не описан Перспективным продуцентом пектиназ является гриб A foetidus, в ИБФМ также получен ряд мутантных штаммов этого гриба Несмотря на то, что ферментные препараты на основе A foetidus успешно используются в России в пищевой промышленности уже несколько десятков лет, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось

Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение состава ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами грибов A japonicus и A foetidus, выделение в гомогенном виде основных ферментов пектиназного комплекса, изучение их биохимических и каталитических свойств, а также эффективности их действия на природные объекты (пектины из разных источников и яблочный сок) Важная роль отведена изучению взаимодействия пектиназ разной специфичности и выявлению эффектов синергизма или антагонизма между ними В качестве эталона пектиназного препарата был взят промышленный препарат Рапидаза Пресс ("Gist-Brocades", Нидерланды), производимый на основе гриба A niger, были выделены и изучены его основные пектолитические ферменты

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи

• Выбрать штаммы-продуценты пектиназ и получить с их помощью ферментные препараты с высокими пектиназными активностями

• Разработать эффективный и экспрессный метод анализа состава препаратов на основе Aspergillus и сравнить их ферментные комплексы

• Разработать схему выделения в чистом виде основных пектиназ и изучить их свойства

• Исследовать взаимодействие пектиназ различной специфичности при действии на пектины с разной степенью этерификации

• Разработать лабораторную методику оценки эффективности действия пектиназ в процессе осветления яблочного сока На основе разработанной методики сравнить эффективность действия индивидуальных пектиназ, их комбинаций, а также ферментных препаратов

Научная новизна Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава ферментных комплексов, продуцируемых различными грибами рода Aspergillus Охарактеризован ферментный состав препаратов, продуцируемых грибами Ajaponicus и A foetidus, проведен анализ компонентного состава пектиназ, гемицеллюлаз и

амилаз этих ферментных препаратов. Пектиназный комплекс гриба А. ]аротсш охарактеризован впервые. Изучены биохимические и физико-химические свойства полигалактуроназ и пектинэстераз из А^'аротсш и А. [овййш, пектинлиазы из А. ]аротсш. В коммерческом препарате на основе гриба А. niger обнаружен новый фермент -полигалактуроназа 59 кДа, не идентифицированный в белковых базах данных по результатам масс-спектрометрического анализа его трипсиновых гидролизатов; изучены свойства данного фермента. Обнаружена высокая термостабильность некоторых гомогенных пектиназ (пектинлиаз и полигалактуроназы 59 кДа) в противовес общепринятому мнению о низкой термостабильности грибных пектиназ. Показана возможность гомогенных пектиназ осветлять яблочный сок; впервые обнаружена способность ксиланаз усиливать действие пектиназ в этом процессе.

Практическая значимость работы. С помощью разработанного экспресс-метода проведен анализ ферментного состава препаратов на основе ряда мутантных штаммов грибов А. ]аротси и А. /овНёш, полученных в ходе многоступенчатого мутагенеза и селекции исходных штаммов А. ¡аротст Б-2092 и А. /оеййш М-45. Найдены мутантные штаммы с повышенной секрецией ферментов пектиназного, гемицеллюлазного и/или амилазного комплексов. Исследован ферментный состав промышленного пектиназного препарата на основе А. niger. Сравнение состава ферментных препаратов из различных аспергиллов позволяет дать практические рекомендации для применения конкретных препаратов в биотехнологических процессах.

Обнаружено присутствие в препаратах А. ]аротсш и А. /овйёш полигалактуроназы 38 кДа, обладающей исключительно высокой удельной активностью, что делает перспективным дальнейшее увеличение секреции данного фермента. Найдены пектинлиаза и полигалактуроназа 59 кДа, обладающие высокой термостабильностью по сравнению с остальными пектиназами, высокой стабильностью в диапазоне рН от 2,0 до 6,0 и способные эффективно осветлять яблочный сок.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), втором международном конгрессе «Биотехнология: состояние и развитие» (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 5 статей.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 143 источника. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 75 рисунков и 16 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Поиск и создание продуцента пектина!

В ходе многоступенчатого мутагенеза исходного дикого штамма A. japonicus F-2092 (регистрационный номер ВКМ F-3743D) в ИБФМ РАН был получен ряд мутантных штаммов (рис. 1). Нами был проведен анализ ферментативных активностей в культуральных жидкостях (кж) мутантных штаммов по широкому кругу субстратов. Ввиду большого количества анализируемых образцов, были использованы гак называемые "плашечные" методы определения активностей, разработанные в пашей лаборатории. Это позволило выделить наиболее перспективную ветвь генеалогического древа мутантных штаммов A.juponicus: pec 45-79-178, pec 178-354, pec 354-284, pec 178-541 (правая ветвь, рис. 1). Для препаратов этих штаммов относительно исходного штамма наблюдали увеличение в 30-50 раз активности по отношению к полигалактуроновой кислоте (ПГК) (рис. 2). Кроме того, для них было характерно также увеличение в 3-10 раз ксиланазной, Р-глкжаназной и амилазной активностей.

Мутанты левой ветви (рис. 1. поколение штамма Aj xyl 113-87) имели высокую ксиланазную активность. Однако изучение ксиланазного комплекса A. japonicus не входило в приоритеты данной работы; подробнее анализ ксиланаз и других гемицеллюлаз A. japonicus проведен в работе (Гришутин С.Г., 2004).

Рис. I. Мутагенез штамма A.juponicus F-2092.

□ крахмал

Рис. 2. Относительное изменение полигалактуроназной, р-глюканазной, ксиланазной и амилазной активностей в кж мутантных штаммов А. ]аротеш в ходе мутагенеза. Для препарата исходного штамма К-2092 величины всех активностей приняты за 1.

Для детального анализа ферментного состава препаратов был разработан метод, в основе ко трот лежало двухсгадийное хроматографическое фракционирование препаратов с использованием FPLC-системы ("Pharmacia". Швеция). В начале препарат (10 мг белка) наносился на анионообменник Mono Q при рН 5,5 (при этом примерно 2/3 белков связывалось с носителем), затем на второй стадии несвязавшаяся фракция подвергалась разделению при более высоком рН 7.3. Такой подход позволил упростить работу с мультиферментными препаратами и одновременно сохранить активности ферментов, лабильных при нейтрально-щелочных значениях рН. В полученных фракциях определялись активности к ряду субстратов, используя "плашечные" методы. Также проводился ДДС-электрофорез полученных фракций.

Предложенный метод анализа ферментного состава препаратов представляется достаточно экспрессным (анализ одного препарата занимает 3-4 дня) и одинаково эффективным для различных видов Aspergillus. Благодаря строгой воспроизводимости результатов полученные данные можно считать "паспортом" ферментного препарата и на этом уровне сравнивать препараты разных нпаммов и разных видов Aspergillus между собой.

Рис. 3. Аналитическое фракционирование ферментных препаратов на основе штаммов А. japonicus F-2092 (A), A. japonicus pec 45-79-178 (Б) и A. foetidus рес 70а (В). (В скобках указан вклад полигалактуроназ в общую активность препарата.)

Результаты аналитического фракционирования препаратов на основе исходного 2092) и одного из лучших мутантных штаммов (рее 45-79-178) представлены на рис. ЗА, ЗБ.

В ходе мутагенеза произошли серьезные изменения ферментного состава А, ]аротеы$. Так, во фракциях препарата исходного штамма А F-2092 были найдены как минимум четыре полигалактуроназы (PG): основная активность (76% от общей активности) была обнаружена во фракции, собранной при 0,12 М №0 на второй стадии разделения препарата. Во фракциях первой стадии, кроме того, были найдены три минорные полигалактуроназы, элюирующиеся при 0,05, 0,16 и 0,3 М №0. При фракционировании препарата мутантного штамма реc 45-79178 было обнаружено только две полигалактуроназы: по-прежнему основной была PG, которая элюировалась на второй стадии (для нее вклад в общую активность увеличился до 85%) - в дальнейшем из аналогичной фракции была выделена полигалактуроназа 38 кДа (PG 38 А]). Из полигалактуроназ, выходящих на первой стадии разделения, осталась только одна минорная, собранная при 0,3 М №0. Таким образом, увеличение в десятки раз полигалактуроназной активности препарата мутантного штамма (рис. 2) обусловлено, в основном, увеличением продукции PG 38 А].

Также во фракциях первой стадии разделения обоих препаратов были обнаружены пектинэстеразная (РЕ А]) и пектинлиазная активности (PL А]).

В ИБФМ на основе исходного штамма гриба А. АоеПёт M-45 (штамм предоставлен д.т.н. Бравовой Г.Б.) в ходе мутагенеза был получен мутантный штамм А/ реc 70а. Препарат на его основе обладал примерно в 10 раз большей удельной полигалактуроназной активностью по сравнению с препаратами "лучших" мутантных штаммов А. ]аротст (табл. 1). Было проведено двухстадийное хроматографическое фракционирование ферментного препарата А/pec 70а (рис. ЗВ). Его пектиназный комплекс состоял из 4 полигалактуроназ, пектинэстеразы (РЕ А/) и пектинлиазы. Основная полигалактуроназная активность (96%) соответствовала PG, элюирующейся на второй стадии разделения препарата -полигалактуроназе 38 кДа (PG 38 А/).

Сравнение ферментных составов препаратов грибов А. ]аротст и А. /огНйш свидетельствует об их определенной идентичности. В обоих случаях при сходных концентрациях №0 элюировались PG 38 (0,12-0,14 М на второй стадии), РЕ (0,24-0,27 М) и PL (0,35-0,39 М). Сходство наблюдалось также при сравнении гемицеллюлазных комплексов препаратов (результаты не приводятся). Различие заключалось в том, что гриб А./огНйш был продуцентом преимущественно пектиназ, а ферментный комплекс гриба А. ]аротст наряду с пектиназами имел высокое содержание ксиланаз, Р-глюканазы и амилазы (табл. 1).

2. Выделение гомогенных пектина) В качестве источников пектиназ были использованы препарат на основе мутантного штамма A. japonicus pec 178-1049 (поколение мутантного штамма рес 45-79-178: ферментные составы препаратов обоих штаммов не отличались) и препарат на основе A. fuetidus pec 70a. Как эталон для сравнения был взят коммерческий препарат Рапидаза Пресс ("Gist-Brocades". Нидерланды), рекомендованный производи гелем для получения и осветления соков. Препарат производится на основе гриба A. niger. В табл. 1 приведены основные активности использованных препаратов.

Предварительно было проведено аналитическое фракционирование препарата A. niger (рис. 4), которое выявило его существенное отличие от препаратов A. japonicus и A. fnetidus n распределении полигалактуроназной активности во фракциях. Только 1% от общей активности содержался во фракции.

Таблица 1. Удельные активности препаратов Aspergillus -источников пектиназ, ед/мг.

га г» я X о я «о « со я Я

препарат £ С г S с; о с S с Г S £ Ф с ф ь о п X S £ 4> С я I п с X о ас z га ж S са п СО С X г а

A. japonicus рес 178-1049 7,7 0,06 0.21 99,5 42.0 9,5

A. foetidus рес 70а 51,8 0.03 0.56 5.0 7,5 3.3

A. niger, Рапидаза Пресс 47,6 0,07 33,8 2,1 12,8 18,9

Стадия 2: Mono Q, рН 7.3

Стадия 1: Mono Q, рН 5.5

Рис. 4. Аналитическое фракционирование препарата Рапидаза Пресс на основе гриба А. niger. (Указан вклад полигалактуроназ в общую активность препарата.)

несвязавшейся с носителем на первой стадии (в случае препаратов А. ]иротсш и А. /игН-ёт в аналогичной фракции содержалось более 80% от общей активности). Основная активность к ПГК (68%) соответствовала фракции, злюиру-ющейся на первой стадии при 0,25-0.27 М №01. из аналогичной фракции позже были

выделены полигалактуроназы 55 и 57 кДа (РО 55 и РО 57 Ап). Минорные полигалакту-роназы были обнаружены также при 0.06, 0.16 и 0,35 М №С1 на первой стадии фракционирования препарата (последняя по времени злюции нолигалактуроназа РО 59 Ап была позже выделена в гомогенном виде). При аналогичных концентрациях соли, что

и н случае препаратов A. japonicus и A. foetidus. на первой стадии были собраны фракции с высокими пектинзетеразной (0,23 М NaCI. PL An) и псктиилиазной активностями (0,29 М NaCl, PL An). Иек1иназы были мажорными белками препарата A. niger, их суммарное содержание составляло около 20%.

Для препаративного разделения препаратов Aspergillus масштабировали хорошо зарекомендовавшую себя схему их аналитического фракционирования (рис. 5). На первой стадии применяли анионообменную хроматографию (АОХ) при рН 5,5. использовав при этом колонку с носителем Source 15Q большего объема и фактически увеличив загрузку по белку в 10 раз. Далее, избегая более высоких значений рН, вместо повторной анионообменной хроматографии использовали гидрофобную хроматографию (ГХ) на колонках с носителем

несвязавшаяся фракция

ГХ на Phenyl Sepharose

объединение фракций после трех туров ГХ

ГХ на Phenyl Superóse

I PG Ís Aj I

Обессоленный препарат A. japonicus pec 178-1049 АОХ на Sourie 150. рН 5,5__

фракция 9 фракция 14

три тура^АОХ и объединение аналогичных фракций

Supcrob!

¿X на Phenyl

1 I

ЛОХ на Mono о. р H 4,0

ünk

Обессоленный препарат A. _ foetidus pec 70а АОХ на Source ! 5Q, pi I 5,5

несвяэавшаяся фракция Г Х на Phenyl Sepharose

1

I PG 38 л71

фракция 12 ГХ на Phenyl Superóse ДОХ па Mono (1 рН 4,0

[ргЬ

Обессоленный препарат A. niger

Рис. 5. Схема выделения пектиназ из препаратов Aspergillus.

Phenyl Sepharose (объем колонки 10 мл) и/или Phenyl Superose (1 мл) с последующей, если по было необходимо, очисткой на анионообменнике Mono Q при рН 4,0.

Результаты ДЦС-электрофореза и ИЭФ выделенных белков приведены на рис. 6.

Таким образом, в высокоочищенном виде были выделены следующие пектиназы. Пять полигалактуроназ; по одной из препаратов A. japonicus и A. foetidus с одинаковыми молекулярными массами 38 кДа и три из А. niger - PG 57 и PG 55 (две формы одного фермента) и PG 59. Из препаратов A. japonicus и A. niger были выделены PL с одинаковыми молекулярными массами 50 кДа и pl 3,75. Из всех трех препаратов Aspergillus были выделены РЕ, которые представляли собой набор белковых полос с близкими значениями массы и pl.

Б

Рис. 6. ДДС-электрофорез (А) и ИЭФ (Б) выделенных пектиназ: / - PG 38 Aj, 2 - PG 38 Af 3 -PG 57 An, 4 - PG 55 An, 5 - PG 59 An. 6-PE Aj, 7- PE Af. 8 - PE An, 9 - PL Aj, 10 - PL An; M-белки-маркеры. приведена масса в кДа или значения pi.

3. Идентификации пектиназ с помощью масс-снсктрометрического анализа их гринсиновых гидролизатов

Грибы А. japonicus, А /осШш и А. niger принадлежат группе близкородственных черных аспергиллов. аналогичные по специфичности ферменты которых часто имеют высокую гомологию (80-100%). В настоящее время в белковых базах данных находится

много аминокислотных последовательностей белков из аспергиллов, полученных в результате массированного изучения этих продуцентов и секвенирования их геномов. Для идентификации выделенных ферментов был использован метод MALDI-TOF масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов ферментов с дальнейшим поиском в базах данных белков, дающих пептиды с идентичными молекулярными массами. Этот метод является мощным инструментом для идентификации белков с уже известной аминокислотной последовательностью, а также для нахождения гомологичных белков из других организмов, выполняющих ту же самую функцию.

Анализу подвергали следующие выделенные пектиназы: PG 38 Aj, PG 38 Af, PG 57 и PG 59 An, PE An (белковые полосы 46 и 47 кДа), PL Aj. Была проведена обработка белковых полос с ДДС-электрофорезных гелей трипсином и получены MALDI-TOF масс-спектры гидролизатов (эти эксперименты проводилась в отделе протеомных исследований НИИ Биомедицинской химии РАМН). Поиск пептидов в базе данных MSDB осуществляли с помощью программы MASCOT (www.matrixscience.com).

Оказалось, что PG 38 Aj была высокогомологична полигалактуроназе Х2 A. awamori (номер в базе данных MSDB JC7374); PG 38 Af- полигалактуроназе II A. niger (1CZFA). На масс-спектрах трипсиновых гидролизатов обеих полигалактуроназ 38 кДа присутствовали пептиды с одинаковыми массами (m/z): 691,3, 1121,5, 1969,9 (идентифицированные программой MASCOT) и 3235,2, 3714,4, 3876,3 (не идентифицированные программой MASCOT, возможно из-за их гликозилирования или другой модификации), при этом все они соответствовали мажорным пикам на спектрах. Таким образом, PG 38 Aj и PG 38 Af -ферменты с очень высокой гомологией между собой.

PG 57 An была идентифицирована как полигалактуроназа I A. niger (SI7980), PL Aj была высокогомологична пектинлиазе A A. niger (1IDK).

РЕ An (белковая полоса 46 кДа) была идентифицирована как пектинэстераза A. niger (JT0589), при этом было найдено 5 пептидов с массами (m/z) 1247,6, 1459,6, 1529,6, 2891,9, 4629,4. Четыре из перечисленных пептидов (1247,6, 1459,6, 1529,6, 2891,9) также присутствовали на масс-спектре гидролизата полосы 47 кДа РЕ An. Поэтому, несмотря на то, что этот белок не был четко идентифицирован программой MASCOT, мы полагаем, что белок 47 кДа, как и белок 46 кДа, представляет собой фермент, высокогомологичный пектинэстеразе A. niger (JT0589), а присутствие на масс-спектре "лишних" пептидов объясняется загрязнением образца белком, не относящимся к полосе 47 кДа. Т.е. наиболее вероятно, что белки с массами 46 и 47 кДа являются двумя формами одной РЕ A. niger.

В случае PG 59 An похожих белков в базах данных обнаружено не было.

4. Свойства выделенных псктиназ

В ходе разделения трех препаратов АрипШш (А.]ыротсш. А. /огНёш и А. niger) было выделено десять ферментов пектиначпого комплекса, которые можно отнести к трем группам по механизму их действия на субстрат. Во-первых, полигалактуроназы (ЕС 3.2.1.15). которые являются типичными гидролазами и относятся к 28-й семье гликочилгидролаз. Во-вторых, псктинметилэстеразы (ЕС 3.1.1.11), гидроличуюнше сложный эфир галактуроновой кислоты и метанола и принадлежащие к 8-й семье карбогидратэстсраз. И, наконец, пектинлиачы (ЕС 4.2.2.10), расщепляющие основную цепь высокометилированного пектина по механизму |3-элиминирования и относящиеся к 1-й семье полисахаридлиаз.

4.1. Субстратная специфичность и кинетические параметры действия ферментов

Для выделенных ферментов были определены активности по отношению к пектинам с разной степенью этерификации (СЭ): 0% - полигалактуроновая кислота (ПГК). пектинам со СЭ 26. 65 и 89% (табл. 2, рис. 7). Для специфических субстратов, кроме того, в условиях рН-оптимума действия ферментов, были определены кинетические параметры ферментативного гидролиза (К,„ и ^Д).

Как и следовало ожидать, для всех гомогенных полигалакгуроназ наиболее специфичным субстратом являлась ПГК: относительная активность возрастала по мере уменьшения С'З субстрата и достигала максимума в случае ПГК (рис. 7). PG 38 А} и PG 38 А/ имели наибольшую удельную активность по отношению к ПГК (около 4000 ед/мг). PG 57 Ап и PG 55 Ат - меньшую удельную активность (около 700 ед/мг) и, наконец, PG 59 Ап обладала самой низкой удельной активностью (230 ед/мг) (табл. 2). Значения кса, составляли 1100-1300 с"' для полигалактуроназ с Mг 38 кДа и лежали в диапазоне 355-514 с-1 в случае ферментов из

Рис. 7. Влияние степени этерификации пектина на начальную скорость деструкции субстрата под действием индивидуальных полигалактуроназ (Л), пектинлиаз и пектинэстераз (Б). Условия ферментативной реакции: рН 4,2, 25°С, 0,5% раствор субстрата.

Таблица 2. Свойства псктинач.

параметр PG 38 Aj PG 38 Af PG 57 An PG 55 An PG 59 An

активность к ПГК, ед/мг 3900 4100 690 680 230

Km (ПГК). Г/л 0.45 0,45 0.22 0,25 0,35

кса (ПГК). 1/с 1100 1300 387 355 514

общая (вискозиметрическая) активность по пектину, ер/иг:

цитрусовому яблочному _ свекловичному pH-оптимум / pH504l* Т-оптимум / Tjo^', °С

5400 3500 30200

4.5/3,5-5,5 55 / 30-67

5300 3500

29900 _ _ 4 5 / <3.5-5,0 55/30-70

2200 2600 1690 4 О | 3.6-5.0 50 / 30-60

2200 2600 1400 Л С I л.6-5.2 50 / 30-60

Стабильность при разных значениях рН (остаточная активность после 3 ч инкубации при 22 С. %):

pH 2,0 pH 3,0 pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0

100 100 100 100 97 64

100 100 100 100 92 59

84 100 100 92 78 0

82 100 100 85 65 О

660 600 680 4,01 <3,5-4,6 70/42-74

100 100 93 87 О

Стабильность при разных значениях температуры (остаточная активность после 3 ч инкубации при рН 4,2, %).

30°C 53 57 44 45 74

40°C 44 49 0 0 62

50°C 0 0 0 0 60

параметр PL Aj PL An РЕ Aj РЕ Af РЕ An

активность к пектину**, ед/мг 19 22 330 404 400

Kfл (пектин СЭ 89%), г/п 2.84 2,72 н. о. н. 0. Н. 0.

кся (пектин СЭ 89%). 1/с 80 172 н О- н. о. Н 0.

Km (пектин СЭ 65%). г/л 4.8 4,6 н 0. н. 0. Н, 0.

kcal (пектин СЭ 65%). 1/с 71 120 I Н. 0. н, 0. Н. 0,

общая (вискозиметрическая) активность по пектину, ед/мг:

цитрусовому яблочному кловичному рИ-оптимум / рН50%* Т-оптимум / Твд%*. ÜC

960 1050 О

1180 1390 О

4.5 / 3.9->5,9 55 / <30-67

4,5/4,0-5,9 55 / <30-67

4.5/<3,5-5,3 4,5/<3,5-5,2

О

О 0__ 4.5; <3 5 5.2'

н. о.

Стабильность при разных значениях рН (остаточная активность после 3 ч инкубации РЬ при 40°С, РЕ при 30°С, %)

pH 2,0 рНЗ.О pH 4,0 pH 5,0 рНб.О pH 7,0

93 100 100 100 83 О

90 100 100 100 75 О

н. 0. н о. н. о. н. о. н. о. н. о.

н. о. н. о. н. о. н. 0. н о. н. о.

98 100 85 61

Стабильность при разных значениях температуры (остаточная активность после 3 ч инкубации Р1. при рН 5,0,

РЕ при pH 4.5, %):

40°С 100 100 Н. 0. н. 0. 73

50°С 87 89 н. 0 К. 0 44

60°С 40 5.9 н. 0. Н. 0. 0

* рН50% (Т50%) ' интервал рН (температур), в котором фермент сохраняет более 50% активности от максимального значения: если этот интервал выходил за пределы интервала значений рН (температуры), используемых в эксперименте, это указано знаками "<" и '•>".

** - Актипность к высокомолекулярному цитрусовому пектину, определенная по увеличению концентрации ненасыщенного продукт (для пектинлиаз) или свободных карбоксильных групп (для пектинэстераз).

А. niger. Величины ^ для PG 55 и PG 57 Ап были почти в два раза меньше, чем для PG 38 А] и PG 38 А/. При небольших степенях гидролиза пектина со СЭ 26% полигалактуроназы проявляли 87-75% от активности по отношению к ПГК. Незначительно они гидролизовали пектин с высокой СЭ (рис. 7).

Пектинлиазы А] и Ап наибольшую активность проявляли по отношению к высоко-этерифицированным пектинам со СЭ 89 и 65% (рис. 7). Особенностью этих ферментов были высокие значения констант Михаэлиса: около 2,8 г/л для пектина со СЭ 89% и более 4,6 г/л для пектина со СЭ 65% (табл. 2). Уменьшение СЭ до 26% сильно сказывалось на их способности разрушать субстрат (проявляли 1/4 от максимальной активности). Пектинлиазы вообще не разрушали ПГК с образованием ненасыщенного продукта (рис. 7).

Несмотря на различный белковый состав выделенных пектинэстераз (рис. 6), все три фермента имели близкие значения удельной активности по отношению к высокоэтерифици-рованному цитрусовому пектину: 330-404 ед/мг (табл. 2). Максимальную активность они проявляли при гидролизе пектина со СЭ 89%; 75-86% от нее - при действии на пектин со СЭ 65% и менее 10% - при действии на пектин со СЭ 26% (рис. 7).

Была изучена способность пектиназ уменьшать вязкость растворов цитрусового, яблочного и свекловичного пектинов (табл. 2). Цитрусовый и яблочный пектины имели высокую СЭ (около 70%), свекловичный пектин обладал меньшей по сравнению с ними СЭ (менее 60%) и высокой степенью ацилирования (около 35%).

Способностью уменьшать вязкость раствора пектина обладают ферменты, гидролизу-ющие внутренние связи основной цепи. Пектинэстеразы не проявляли вискозиметрической активности по отношению ко всем пектинам, что согласуется с их механизмом действия на субстрат. PG 38 А] и PG 38 А] в 6-10 раз эффективнее снижали вязкость низкоэтерифициро-ванного свекловичного пектина по сравнению с высокоэтерифицированными цитрусовым и яблочным пектинами. Интересно, что PG 57, PG 55 и PG 59 Ап проявили себя не как типичные полигалактуроназы, т.к. имели меньшую активность по отношению к свекловичному пектину, чем к цитрусовому и яблочному. Возможно, ацилирование субстрата препятствует действию на него данных ферментов. Пектинлиазы не были способны разрушать свекловичный пектин, по-видимому, в связи с его низкой СЭ и, возможно, ацилированием, но эффективно разрушали цитрусовый и яблочный пектины.

Для полигалактуроназ (и пектинлиаз) был оценен вклад одной единицы активности, определенной по скорости накопления ВС (по скорости накопления ненасыщенного продукта) при действии на пектин с аналогичной СЭ в тех же условиях, в общую деполимеразную (вискозиметрическую) активность. В случае наиболее "типичных" полигалактуроназ PG 38 А] и PG 38 А/1 ед. гидролазной активности соответствовала 2-3 ед.

вискозиметрической активности, для менее "типичных" РО 57, РО 55 и РО 59 Ап - 4-7 ед. В то же время 1 сд. пектинлиазной активности соответствовала 51 -63 ед. общей деполимераз-ной (вискозиметрической) активности. Полагаем, что именно эти данные являются количественным критерием специфичности пектиназ по отношению к высокомстилирован-ным субстратам.

4.2. Влияние температуры и рН

Важными характеристиками ферментов и ферментных препаратов являются их температурные и рН-профили активности, а также их стабильность при длительном воздействии различных температур и рН (табл. 2). Эти параметры являются важными показателями при выборе ферментных препаратов для конкретных биотехнологических процессов.

В первую очередь интересно было исследовать влияние кислых значений рН на активность и стабильность пектиназ. так как известно, что природные объекты для применения этих ферментов (ягоды и фрукты) имеют естественный рН менее 5. Полигалактуроназы проявляли максимум активности в диапазоне рН 4.0-4,5. псктинлиазы и пектинэстеразы - в диапазоне рН 4,5-5,0. Важным показателем является также величина рН50% - это интервал, в котором фермент сохраняет более 50% активности от максимального значения. По этому параметру пектинлиазы обладали наиболее широким рН-профилем.

Температурные онти.мумы активности пектиназ лежали в интервале 45-50°С (РО 55 и РО 57 Ли). 50-55°С (РО 38 Л и РО 38 Л/, РЬ Л и РЬ Ли) и около 70°С (в случае РО 59 Ли). Особенность обеих пектинлиаз заключалась в том, что они проявляли высокие активности (около 60% от максимума) уже при 30°С.

При разных температурах (при оптимальных значениях рН) была изучена стабильность ферментов в течение 3 ч (табл. 2). Наибольшей термостабильностью обладали пектинлиазы. Умеренную стабильность показали РЬ Лп и РО 59 Ли. Все полигалактуроназы. кроме РО 59 Лп, оказались наиболее нестабильными ферментами. Например, при 40°С через 3 ч инкубации РО 38 Л] и РО 38 Аf теряли около 50% активности, а РО 55 и РО 57 Лп инактивировались полностью.

В интервале рН 2.0-7,0 с шагом 1.0 была изучена стабильность индивидуальных ферментов. При этом температура инкубации полигалактуроназ составляла 22°С, нектинлиаз - 40°С. а РЕ Лп - ЗО°С. В интервале рН 3,0-5,0 все иектиназы можно считать стабильными, их активность уменьшалась незначительно. При нейтральных рН стабильность пектиназ была значительно ниже. Проявление пектиназами высокой рН-стабильности в силыюкислой области является положительным моментом при их промышленном использовании.

4.3. Изучение механизма гидролиза пектинов под действием пекгиназ Для определения типа действия пектиназ было исследовано изменение молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов гидролиза ПГК под действием полигалактуроназ и пектинов со (") 65 и 89% под действием пектинлиаз. Анализ продуктов гидролиза проводили с помощью гельпроникающей хроматографии (ГПХ) на колонке Protein Pak 125 ("Waters", США), используя систему для ВЭЖХ Chromatography Workstation 700 ("Bio-Rad", США) (рис. 8).

Во всех случаях наблюдалось быстрое (даже при небольших глубинах гидролиза) исчезновение высокомолекулярного пика исходного субстрата, смещение основного пика в более низкомолекуляриую область и накопление олигомерных продуктов со временем удерживания, отличным от времени удерживания мономера (галактуроновой кислоты). Такая картина характерна для ферментов, обладающих эндо-деполимеразным типом действия на полимерный субстрат-. Идеально к механизму неупорядоченного (статистического) эндо-типа действия подходили PG 38 Aj и PG 38 Af. PG 59 An. а также обе пектиилиазы. В случае PG 55 и PG 57 An можно отметить появление пика олигомерных продуктов еще при сохранении пика высокомолекулярного субстрата. Возможно, эти полигалактуроиазы обладали более упорядоченным механизмом действия, например, отщепляя от полимерной цепи субстрата крупные олигомерные звенья.

s

2,2% J.I% 4.2% 6,64

' 2,9\

- ..... _ <..<*»

•— — - - __ 4,2%

,-----. _ 7,OK

Í\ " _¡ \ _J'U

mm mm min

Рис. 8. Изменение ММР продуктов гидролиза ПГК иод действием PG 38 Af (A), PG 55 An (Б) и пектинов со СЭ 89 и 65 % под действием Р!. Aj (В). Указана глубина гидролиза субстрата (% расщепленных связей) для каждой хроматограммы. S - исходный субстрат, gal A -галактуроновая кислота. Условия ферментативной реакции: рН 4,2 (для полигалактуроназ) или рН 5.0 (для пектинлиаз). 25 'С. 0,5% раствор субстрата. Условия ГПХ: колонка Protein Pak 125 ("Waters". США), элюент - 50 мМ ацетатный буфер рН 4,2/5.0, содержащий 0.1 М NaCI. скорость элюции - 0.5 мл/мин.

5. Взаимодействие ферментов при деструкции пектинов Ферменты псктолитического комплекса при разрушении высокоперифицироканного пектина могут действовать в синергизме. Причина возникновения синергизма заключается в том, что сложноэфирные группы пектина мешают действию полигалактуроназ. Их удаление в результате действия РЕ ускоряет гидролиз основной цени пектина под действием РО.

Используя вискозиметрический метод определения общей дсполимеразной активности пектиназ, исследовали взаимодействие РО 38 и РЕ из препарата А. /оеШш в соотношении по белку 1:10, 1:30 и 1:100. Данные, характеризующие изменение вязкости раствора высокоэте-рифицированного (СЭ -70%) цитрусового пектина под действием индивидуальных РО 38 и РЕ и их смеси (1:10) приведены на рис. 9. РЕ самостоятельно не изменяла вязкость раствора пектина. Индивидуальная РО 38 обладала деполимеризующей активностью и уменьшала вязкость раствора пектина, однако при добавлении в реакционную смесь РЕ скорость уменьшения вязкости раствора пектина значительно возрастала, т.е. общая пектиназная активность увеличивалась, что свидетельствовало о наличии синергизма между этими ферментами. Максимальная величина коэффициента синергизма была получена для системы РО:РЕ = 1:100 и составила 4.5.

С другой стороны, можно предположить, что РЕ, дсметилируя пектин, должна уменьшать скорость и глубину деструкции пектина под действием РЬ. В этом случае мы имеем дело с явлением антагонизма при функционировании ферментов.

Для изучения взаимодействия РЬ и РЕ использовали ферменты, выделенные из препарата А ]арытет. Кинетические кривые деструкции высокоэтерифицированного (СО -70%) цитрусового пектина в присутствии индивидуальных РЬ и РЕ и их смеси в

Рис. 9. Кривые изменения вязкости раствора пектина (С") - 70%) под действием индивидуальных РО 38 и РЕ и их смеси в соотношении по белку 1:10. Условия: рН 5,0, 40°С, 0,5% раствор субстрата.

Рис. 10. Проявление антагонизма при действии смеси Р1 А[ и РН А[ на пектин (СЭ -70%). Условия: рР 5,0, 40°С. 0,23% раствор субстрата.

соотношении по белку 1:1 представлены на рис. 10. За деструкцией следили, определяя концентрацию ненасыщенного продукта. РЕ была не способна разрушать пектин с образованием ненасыщенного продукта. РЬ эффективно разрушала пектин, и через 2,5 ч после начала реакции степень конверсии субстрата достигала 9%. Присутствие в реакционной смеси РЕ приводило к понижению скорости деструкции пектина под действием РЬ и уменьшению степени конверсии субстрата до 6%.

5.1. Глубокий гидролиз пектинов

Известно, что структура природного пектина, в том числе и степень этерификации, варьирует в широких пределах и зависит от многих факторов: вида растения, его возраста, степени зрелости плодов и др. Универсальной пектиназы, одинаково эффективно разрушающей основную цепь низко- и высокоэтерифицированного пектина, по-видимому, не существует. Для этой цели микроорганизмы секретируют комплекс пектолитических ферментов.

Нами был изучен глубокий гидролиз пектинов с разной СЭ (0, 26, 65 и 89%) под действием индивидуальных ферментов и их различных комбинаций, а также под действием исходных ферментных препаратов (табл. 3). Гидролиз проводили при температуре 25°С и рН 4,2, при этом, с одной стороны, пектиназы функционировали в оптимуме активности, с другой стороны, инактивация ферментов сводилась к минимуму. За гидролизом следили, определяя концентрацию ВС.

Индивидуальные ферменты разрушали разные пектины в соответствии со своей специфичностью. Наибольшие значения степеней конверсии субстрата были достигнуты при гидролизе ПГК и пектина со СЭ 26% под действием полига-лактуроназ (20-39%) и при деструкции пектинов со СЭ 89 и 65% под действием пектинлиаз (9-19%).

Интересные результаты были получены при ^-Приведена степень конверсии субстрата через 24/48 ч.

Таблица 3. Глубокий гидролиз пектинов.

ферментный соотношение степень конверсии пектинов со СЭ:

состав по белку 0% (ПГК) 26% 65% 89%

резеду 37 20 5.7 2,5

Рв 38 М 37 20 5,9 2.5

Рб 57 Ап 39 23 6.6 2,6

раввлп - 38 24 6.7 2,6

Рв 59 Ап 38 22 6 2,4

Р 0 1.4 9,2 19

Р\-Ап 0 1,4 9,4 19 """

А. ¡аропки*, препарат 37 26 10

А. /Ье№А15, препарат 37 24 6,9 3

А. п1дег, препарат - 51 48 46 45

Рв 38 А{ * РЕ А1 1:1 30 19 8,7 6,6

Рв 38 АГ + РЕ А1 1.40 32 29 29 30

1} РЕ А/ + 2) Рв 38 А1 40:1 0/33* 0/31' 0/31* 0/27*

РвЗаА/ + Р\-А/ 1:140 31 19 14 18

РвЗв АГ* Р\-А] +■ РЕ А1 1 140:40 34 29 25 27

1|Р1-А;+2)(РС38ДГ ♦ РЕ ЛЯ 140 1:40 0/36* 1.6/29* 11/28* 16/30*

анализе гидролиза пектинов исходными препаратами. Дозирование препаратов в реакционной смеси проводили, уравнивая полигалактуроназную активность препаратов. Гидролиз ПГК протекал одинаково под действием препаратов А. iaponicыs и А. foetidыs и соответствовал действию их основной полигалактуроназы 38 кДа (степень конверсии достигала 37%). Степени конверсии пектинов со СЭ 26 и, особенно, 65 и 89% были заметно ниже. В отличие от препаратов А. iaponicыs и А, foetidыs препарат А. niger разрушал пектины с разной СЭ примерно одинаково; степени конверсии субстратов достигали 45-51%. Вероятно, он представлял собой оптимальное сочетание пектиназ различной специфичности. Кроме того, исходный препарат А. niger более полно разрушал ПГК (степень конверсии 51 %), чем выделенные из него индивидуальные полигалактуроназы (степень конверсии 38-39%). Можно предположить, что одна из минорных полигалактуроназ препарата (рис. 4), которую мы не выделяли, обладала иным типом действия на субстрат.

Для более детального исследования разрушения субстрата под действием комплекса пектолитических ферментов был проведен глубокий гидролиз пектинов разными комбинациями пектиназ (табл. 3). При этом фиксировали концентрацию РО 38 А[ и варьировали концентрацию добавляемых РЕ Л/и/или РЬ А].

При разрушении пектинов смесью РО и РЕ (в соотношении по белку РО:РЕ = 1:1) степень конверсии высокоэтерифицированных субстратов по сравнению с действием индивидуальной РО увеличилась незначительно (табл. 3). При увеличении концентрации РЕ (соотношение РО:РЕ - 1:40) степень конверсии всех пектинов достигала 29-32%. При этом по ходу гидролиза пектинов со СЭ 65 и 89% на кинетической кривой наблюдался изгиб, вероятно, связанный с тем, что в начальный период РЕ не успевала подготовить субстрат для действия РО (рис. ПА).

Была проведена предобработка пектинов РЕ в течение 24 ч, и лишь затем в реакционную смесь была внесена РО (рис. 11 Б). Предобработка субстратов РЕ привела к тому, что сразу после внесения в реакционную смесь РО происходила деструкция пектинов с высокой СЭ (65 и 89%). Степени конверсии субстратов при совместном и последовательном внесении РЕ и РО в реакционную смесь были близки (табл. 3).

При действии на пектины смесью РО и РЬ в соотношении по белку РО:РЬ = 1:140 (соотношение по специфическим активностям 1:1) произошло разделение приоритетов между двумя пектиназами: ПГК и пектин со СЭ 26% гидролизовала РО, пектины со СЭ 65 и 89% разрушала РЬ (были достигнуты те же значения степеней конверсии, что и для индивидуальных ферментов).

Рис. 11. Взаимодействие пектиназ при глубоком гидролизе пектинов. Условия ферментативной реакции: рН 4,2, 25°С, 0,5% раствор субстрата.

Действие триады ферментов PG+Pl+PL (в соотношении по белку PG:PL:PE = 1:140:40) по сравнению с парой PG:PI. - 1:140 привело к увеличению на 9-11% степени конверсии пектинов со СЭ 26, 65 и 89% (табл. 3, рис. 11В).

Сравнение результатов

действия триады ферментов PG:PL:PE = 1:140:40 (рис. 11В) с действием пары PG:PE = 1:40 (рис. 11Л) позволило выявить роль РЕ Под действием PL уже на начальном участке гидролиза происходило глубокое разрушение высокоэте-рифицированных пектинов. На соответствующих кинетических кривых наблюдался "выброс" образования ВС (действие PL), затем гидролиз протекал более плавно (действие РЕ и PG). Вероятно. PL превращает субстрат в олигосаха-риды с высокой СЭ. Затем в действие вступает РЕ, которая снижает СЭ полученных олигосахаридов. и на последней стадии олигогалакту-ронаны гидролизуст PG.

Была проведена предобработка пектинов PL в течение 24 ч.

при этом происходило разрушение только пектинов со СЭ 65 и 89% (рис. 11Г). Затем в реакционную смесь были внесены PG и РЕ - при этом начинался гидролиз ПГК и пектина со СЭ 26%, не затронутых РЦ а также продолжалось разрушение высокоэтерифицированных пектинов. Таким образом, предварительная обработка пектинов индивидуальной PL не препятствует действию пары ферментов - PG+PE - закончить разрушение субстратов.

6. Применение пектиназ для осветлении яблочного сока В настоящее время препараты кислых пектиназ успешно используются в пищевой промышленности при работе с ягодами и фруктами. Одной из стадий при получении некоторых соков и вин является их осветление. Эффект осветления достигается за счет разрушения высокомолекулярных соединений, в первую очередь пектина. При осаждении изо-пропанолом в случае неосветленного сока образуется осадок, обработанный пектиназами (осветленный) сок не дает осадка.

Мы определяли минимальную дозу пектиназного препарата, при которой после 2,5 ч обработки сока не наблюдалось образования осадка высокомолекулярных полимеров при осаждении спиртом. Соответственно, чем меньше была доза препарата (или чем больше величина 1/доза - далее на рисунках будет приведена именно эта величина), тем выше его потенциал осветлять яблочный сок. На рис. 12А представлены результаты освещения яблочного сока препаратами на основе пектиназных мутантных штаммов А. iaponicыs и A.foeiidыs, а также двух коммерческих пектиназных препаратов на основе гриба А. niger.

Рис. 12. Результаты осветления яблочного сока. Условии: 45°С, рН яблочного сока (-3,5).

Наилучшей способностью осветлять сок обладали оба коммерческих препарата. На основе сравнительного анализа ферментных комплексов грибов Aspergillus (разделы 2 и 3) можно дать рекомендации по увеличению эффективности осветления сока препаратами Ajaponicus и A. foetidus: например, ферментный препарат на основе штамма Afpec 70а станет вполне конкурентоспособным при увеличении содержания РЕ.

Проводили также осветление яблочного сока индивидуальными пектиназами (рис. 12Б). Наибольшей способностью осветлять сок обладали пектинлиазы. Интересно, что полигалактуроназы также были способны к осветлению сока, при этом PG 59 An не уступала в действии пектинлиазам и обладала в 3,5 раза большим эффектом по сравнению с PG 38 Aj и PG 38 Af, которые, в свою очередь, в 5-6 раз превосходили PG 57 и PG 55 An.

Все пектинэстеразы самостоятельно не осветляли яблочный сок, но они существенно увеличивали эффективность действия полигалактуроназ. Осветляли яблочный сок смесями PG 38 Af и РЕ Af в соотношении по белку PG:PE = 1:1,6, 1:10, 1:30 и 1:100 (рис. 12В). Способность осветлять сок смеси PG:PE = 1:1,6 была в 60 раз больше по сравнению с индивидуальной PG. Кроме того, эффективность действия данной смеси была эквивалентна эффективности действия коммерческих пектиназных препаратов (рис. 12А).

В присутствии пектинэстеразы способность пектинлиазы осветлять яблочный сок уменьшалась (результаты не приводятся).

Известно также, что использование наряду с пектиназами ферментов, расщепляющих нейтральные полисахариды, способствует увеличению выхода сока из ягод и фруктов. Мы исследовали влияние трех ксиланаз, выделенных в гомогенном виде из препарата Ксиланаза AN на основе гриба A. niger ("Biovet", Болгария), на способность PL An осветлять яблочный сок. Использовали смеси ксиланаз с PL An в соотношении по белку 1:1 и определяли минимальную дозу каждой смеси, необходимую для осветления яблочного сока (рис. 12Г). Во всех трех случаях наблюдали уменьшение количества пектинлиазы, необходимого для осветления, при этом индивидуальные ксиланазы способностью осветлять яблочный сок не обладали.

ВЫВОДЫ

1. Разработан хроматографический экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов грибов рода Aspergillus. С помощью этого метода определен ферментный состав лабораторных препаратов на основе ряда пектиназных штаммов A. foetidus (Af) и A. japonicus (Aj) и коммерческого пектиназного препарата гриба A niger (An) и проведено их сравнение. Показано, что грибы A. foetidus и A. niger продуцируют

преимущественно пектиназы, гриб A. japonicus - гемицеллюлазы и пектиназы. Основное отличие заключалось в преобладании разных полигалактуроназ: установлено, что в ферментных комплексах A. japonicus и A. foetidus основная полигалактуроназная активность соответствовала ферменту с молекулярной массой 38 кДа (PG 38), в препарате A. niger -ферментам с молекулярными массами 57, 55 и 59 кДа (PG 57, PG 55 и PG 59).

2. Выделены в гомогенном виде пять полигалактуроназ (PG 38 Aj, PG 38 Af, PG 57 An, PG 55 An и PG 59 An), три пектинэстеразы (РЕ Aj, РЕ Af, РЕ An) и две пектинлиазы (PL Aj, PL An). Изучены свойства выделенных пектиназ (субстратная специфичность по отношению к разным пектинам, кинетические параметры действия ферментов, влияние температуры и рН на активность и стабильность ферментов).

3. С помощью масс-спектрометрического анализа трипсиновых гидролизатов выделенных белков показана их высокая гомология с известными ферментами грибов Aspergillus. Установлена высокая гомология между PG 38 Aj и PG 38 Af. Обнаружен новый фермент - PG 59 An, не идентифицированный в белковых базах данных по молекулярным массам трипсиновых пептидов.

4. Исследован гидролиз цитрусовых пектинов с разной степенью этерификации (СЭ), а также пектинов из других растительных источников под действием гомогенных пектиназ. Показана высокая гидролитическая активность полигалактуроназ при их действии на полигалактуроновую кислоту и пектин со СЭ 26%, а также их способность снижать вязкость растворов цитрусового, яблочного и свекловичного пектинов. Пектинлиазы обладали высокой активностью при действии на высокоэтерифицированные цитрусовый и яблочный пектины и практически не разрушали низкоэтерифицированные субстраты. Установлено, что полигалактуроназы и пектинлиазы обладают эндо-деполимеразным типом действия на полимерные субстраты.

5. Исследовано взаимодействие ферментов разной специфичности при деструкции пектинов с разной СЭ. Показано, что при деструкции высокоэтерифицированного пектина (СЭ -70%) полигалактуроназы проявляют синергизм с пектинэстеразами, а пектинлиазы и пектинэстеразы действуют в антагонизме.

6. Проведены испытания способности пектиназ осветлять яблочный сок. Показано, что индивидуальные полигалактуроназы и пектинлиазы способны осветлять сок, при этом добавление пектинэстеразы существенно увеличивает эффективность действия полигалактуроназы и уменьшает способность пектинлиазы осветлять сок. Обнаружено, что добавки ксиланаз приводят к увеличению эффективности действия пектинлиазы в данном процессе.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Гусаков А.В., Марков А.В., Гришутин СТ., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 2002, т. 67, вып. 6, с. 815-822.

2. Semenova M.V., Ustinov B.B., Grishutin S.G., Bukhtoyarov F.E., Sinitsyna O.A., Fedorova E.A., Okunev O.N., Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. Fast analysis of fungal multienzyme compositions using ion-exchange chromatography. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications", June 22-27,2002, Moscow, Russia, p. 133.

3. Семенова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Выделение и свойства пектиназ из гриба Aspergillusjaponicus. Биохимия, 2003, т.68, вып. 5, с.686-697.

4. Семенова М.В., Федорова Е,А., Синицын А.П., Гусаков А.В., Цурикова Н.В., Окунев О.Н. Сравнение "тяжелых" и "легких" глюкоамилаз из аспергиллов. Материалы II Московского Международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября, 2003, Москва, с. 214.

5. Матыс В.Ю., Бубнова Т.В., Кошелев А.В., Бельков В.В., Окунев О.Н., Бравова Г.Б., Шишкова Э.А., Семенова М.В., Синицын А.П. Сверхпродуцент Aspergillus foetidus 70a: управляемое культивирование и характеристика синтезируемого пектиназного комплекса. В сб.: Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК, под ред. Полякова В.А. ПИЩЕПРОМИЗДАТ, Москва, 2004, с. 33-37. .

6. Синицын А.П., Марков А.В., Семенова М.В., Цурикова Н.В. Новые подходы для определения состава, свойств и возможностей применения мультиферментных препаратов. В сб.: Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК, под ред. Полякова В.А. ПИЩЕПРОМИЗДАТ, Москва, 2004, с. 95-99.

7. Grishutin S.G., Gusakov A.V., Markov A.V., Ustinov B.B., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes. Biochimica et BiophysicaActa, 2004, v. 1674, vol. 3, p. 268-281.

ООП МГУ. Заказ 149-100-04

oz.oo

/

hi / 117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Структурные полисахариды клеточных стенок растений.

1.1. Строение пектина.

1.1.1. Основная цепь пектина.

1.1.2. Боковые цепи пектина.

1.1.3. Неуглеводные заместители в пектине.

Глава 2. Биодеградация пектина.

2.1 .Полигалактуроназы.

2.1.1. Гены, кодирующие синтез полигалактуроназ.

2.1.2. Структура и механизм действия полигалактуроназ.

2.1.3. Биохимические свойства энгЬ-полигалактуроназ A. niger.

2.2. Пектинэстеразы.

2.2.1. Структура и механизм действия пектинэстераз.

2.2.2. Влияние различных факторов на активность пектинэстераз. щ 2.3. Пектин- и пектатлиазы.

2.3.1. Структура и механизм действия пектин- и пектатлиаз.

2.3.2. Биохимические свойства пектин- и пектатлиаз.

Глава 3. Распространение в природе и использование пектиназ.

Глава 4. Грибы рода Aspergillus.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 5. Объекты исследования и методика эксперимента.

5.1. Материалы.

5.1.1. Микроорганизмы и условия культивирования.

5.1.2. Ферментные препараты.

5.1.3. Субстраты и реактивы.

5.2. Хроматографическое разделение препаратов и выделение ферментов.

5.3. Определение концентрации белка.

5.4. Определение биохимических характеристик ферментов.

5.5. Методы определения активности ферментов.

5.5.1. Определение активности к полисахаридным субстратам.

5.5.2. Определение активности к л-нитрофенильным производным Сахаров.

5.5.3. Определение пектинлиазной активности.

5.5.4. Определение пектинэстеразной активности.

5.5.5. Вискозиметрический метод определения общей пектиназной активности.

5.6. Определение кинетических параметров действия ферментов.

5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от рН и температуры.

5.8. Изучение рН- и термостабильности ферментов.

5.9. Исследование изменения ММР продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

5.10. Проведение гидролиза пектинов под действием ферментов.

5.11. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков.

5.12. Оценка способности ферментов к осветлению яблочного сока.

5.13. Оценка способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов. 59 III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Поиск и создание продуцентов пектиназ.

6.1. Мутагенез и селекция гриба A. japonicus.

6.2. Сравнение ферментного состава препаратов на основе исходного и мутантного штаммов A. japonicus.

6.3. Мутагенез и селекция гриба A. foetidus.

Глава 7. Выделение гомогенных пектиназ.

7.1. Выделение пектиназ A. japonicus.

7.1.1. Очистка полигалактуроназы.

7.1.2. Очистка пектинэстеразы.

7.1.3. Очистка пектинлиазы.

7.2. Выделение пектиназ A. foetidus.

7.2.1. Очистка полигалактуроназы.

7.2.2. Очистка пектинэстеразы.

7.3. Анализ препаратов A. niger и выделение основных пектиназ.

7.3.1. Субстратная специфичность препаратов A. niger.

7.3.2. Аналитическое фракционирование препарата A. niger.

7.3.3. Препаративное разделение препарата A. niger.

7.3.4. Очистка полигалактуроназ.

7.3.5. Очистка пектинэстеразы.

7.3.6. Очистка пектинлиазы.

Глава 8. Идентификация пектиназ с помощью масс-спектрометрического анализа их трипсиновых гидролизатов.

Глава 9. Свойства выделенных пектиназ.

9.1. Субстратная специфичность и кинетические параметры действия ферментов.

9.2. Влияние температуры и рН на активность и стабильность пектиназ.

9.3. Изучение механизма гидролиза пектинов под действием полигалактуроназ и пектинлиаз.

Глава 10. Взаимодействие ферментов при действии на пектины.

10.1. Явления синергизма и антагонизма в системах полигалактуроназа : пектинэстераза и пектинлиаза : пектинэстераза.

10.2. Глубокий гидролиз пектинов.

10.2.1. Гидролиз пектинов под действием индивидуальных пектиназ.

10.2.2. Гидролиз пектинов под действием исходных препаратов Aspergillus.

10.2.3. Взаимодействие пектиназ (PG 38 Af, РЕ А/и PL Aj) при глубокой деструкции пектинов.

10.2.4. Взаимодействие пектиназ A, niger при глубокой деструкции пектинов.

Глава 11. Испытания пектиназ in vitro.

11.1. Использование пектиназ для осветления яблочного сока.

11.2. Выявление способности пектиназных препаратов к увеличению питательной ценности кормов in vitro.

ВЫВОДЫ.

Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов [1]. Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве позволило существенно повысить глубину переработки пищевого сырья, улучшить органолептические свойства и создать новые виды пишевых продуктов, повысить усвояемость кормов и расширить сырьевую базу кормопроизводства.

Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения. Большую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят на основе культивирования бацилл (прежде всего, Bacillus subtilis), микроскопических грибов родов Aspergillus, Pénicillium, Trichoderma, а также актиномицетов Actinomyces, Streptomyces. При использовании в пищевой промышленности и фармакологии лидирующее место занимают препараты на основе ф/ грибов рода Aspergillus. Они используются как продуценты внеклеточных ферментов широкого спектра действия (пектиназ, амилаз, протеаз), а также для получения метаболитов (органических кислот, витаминов, жирных кислот и аминокислот) [2].

Пектиназы, продуцируемые промышленными штаммами грибов A. foetidus и A.niger, незаменимы при работе с ягодами, овощами и фруктами, а также с продуктами их переработки [3]. Пектиназы используются при приготовлении осветленных соков (яблочного, грушевого, виноградного), соков с мякотью (цитрусового, сливового, томатного) и пюре. Широкое распространение пектиназные препараты аспергиллов получили в виноделии. При приготовлении как соков, так и вин пектиназы используются на разных стадиях технологического процесса: при мацерации растительных тканей, при получении сока и увеличении его выхода, при подготовке сусла к брожению (в виноделии), при осветлении сока и вина и стабилизации готового продукта.

Ферментные препараты широко используются в птицеводстве и животноводстве в качестве добавок к кормам для повышения их питательной ценности, улучшения усвояемости кормов, а также для сохранения продуктивности при включении в корма дешевых, но трудноусвояемых или содержащих антипитательные вещества компонентов [4]. При использовании кормовых диет, включающих бобовые, возрастает роль ферментов пектолитического действия, так как пектин является основным компонентом полисахаридной части бобовых. Известно также, что пектиназные препараты на основе A. oryzae в настоящее время широко используются в пищевой промышленности Юго-Восточной Азии при получении продуктов на основе сои [5].

Ряд положительных характеристик грибов рода Aspergillus - широкий диапазон продуцируемых гидролитических ферментов [6], высокий уровень белковой секреции, а также безопасность их использования в пищевой промышленности и фармакологии [7] - способствует увеличению интереса к ним как промышленно значимым объектам. В связи с этим растет потребность в фундаментальных знаниях о механизмах действия и свойствах индивидуальных ферментов, чтобы понимать механизмы функционирования ферментного препарата и иметь возможность управлять каталитическим процессом при его практическом использовании.

На сегодняшний день наиболее полно описаны свойства внеклеточных ферментов пектиназного комплекса гриба A. niger [8-9]. В настоящее время ведутся поиски продуцентов ферментов пектолитического действия среди других видов Aspergillus.

В нашей лаборатории совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН на протяжении ряда лет изучается мицелиальный гриб A.japonicus - продуцент различных карбогидраз. До сих пор он рассматривался только как источник гемицеллюлаз (ксиланаз и ß-глюканаз), его пектиназный комплекс не изучался и в научной литературе не описан. Кроме того, перспективным продуцентом пектиназ является гриб A. foetidus-, в ИБФМ получен ряд мутантных штаммов этого гриба. Несмотря на то, что ферментные препараты на основе A. foetidus успешно используются в России в пищевой промышленности уже несколько десятков лет, систематического изучения ферментного комплекса данного гриба ранее не проводилось.

Целью работы являлось изучение состава ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами грибов A, japonicus и A. foetidus, выделение в гомогенном виде основных ферментов пектиназного комплекса, изучение их биохимических и каталитических свойств, эффективности их действия на природные объекты (пектины из разных источников и яблочный сок), а также изучение взаимодействия пектиназ разной специфичности и выявление эффектов синергизма или антагонизма между ними. В качестве эталона для сравнения был использован промышленный пектиназный препарат Рапидаза Пресс ("Gist-Brocades", Нидерланды), производимый на основе гриба A. niger, были выделены и изучены его основные пектолитические ферменты.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Выбрать мутантные штаммы-продуценты пектиназ и получить с их помощью ферментные препараты с высокими пектиназными активностями.

• Разработать эффективный и экспрессный метод анализа состава препаратов на основе грибов Aspergillus и сравнить их ферментные комплексы.

• Разработать схему выделения в гомогенном виде основных пектиназ и изучить их свойства.

• Исследовать взаимодействие пектиназ различной специфичности при действии на пектины с разной степенью этерификации.

• Разработать лабораторную методику оценки эффективности действия пектиназ в процессе осветления яблочного сока. На основе разработанной методики сравнить эффективность действия индивидуальных пектиназ, их комбинаций, а также ферменшых препаратов.

выводы

1. Разработан хроматографнческий экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов грибов рода Aspergillus. С помощью этого метода определен ферментный состав лабораторных препаратов на основе ряда пектиназных штаммов A. foetidus (AJ) и A. japonicus (Aj) и коммерческого пектиназного препарата гриба A. niger {An) и проведено их сравнение. Показано, что грибы A. foetidus и A. niger продуцируют преимущественно пектиназы, гриб A. japonicus - гемицеллюлазы и пектиназы. Основное отличие заключалось в преобладании разных полигалактуроназ: установлено, что в ферментных комплексах A. japonicus и A. foetidus основная полигалактуроназная активность соответствовала ферменту с молекулярной массой 38 кДа (PG 38), в препарате A. niger - ферментам с молекулярными массами 57, 55 и 59 кДа (PG 57, PG 55 и PG 59).

2. Выделены в гомогенном виде пять полигалактуроназ (PG 38 Aj, PG 38 Af PG 57 An, PG 55 An и PG 59 An), три пектинэстеразы (РЕ Aj, РЕ Af, РЕ An) и две пектинлиазы (PL Aj, PL An). Изучены свойства выделенных пектиназ (субстратная специфичность по отношению к разным пектинам, кинетические параметры действия ферментов, влияние температуры и рН на активность и стабильность ферментов).

3. С помощью масс-спектрометрического анализа трипсиновых гидролизатов выделенных белков показана их высокая гомология с известными ферментами грибов Aspergillus. Установлена высокая гомология между PG 38 Aj и PG 38 Af. Обнаружен новый фермент - PG 59 An, не идентифицированный в белковых базах данных по молекулярным массам трипсиновых пептидов.

4. Исследован гидролиз цитрусовых пектинов с разной степенью этерификации (СЭ), а также пектинов из других растительных источников под действием гомогенных пектиназ. Показана высокая гидролитическая активность полигалактуроназ при их действии на полигалактуроновую кислоту и пектин со СЭ 26%, а также их способность снижать вязкость растворов цитрусового, яблочного и свекловичного пектинов. Пектинлиазы обладали высокой активностью при действии на высокоэтерифицирован-ные цитрусовый и яблочный пектины и практически не разрушали низкоэтерифициро-ванные субстраты. Установлено, что полигалактуроназы и пектинлиазы обладают эндо-деполимеразным типом действия на полимерные субстраты.

5. Исследовано взаимодействие ферментов разной специфичности при деструкции пектинов с разной СЭ. Показано, что при деструкции высокоэтери-фицированного пектина (СЭ -70%) полигалактуроназы проявляют синергизм с пектинэстеразами, а пектинлиазы и пектинэстеразы действуют в антагонизме.

6. Проведены испытания способности пектиназ осветлять яблочный сок. Показано, что индивидуальные полигалактуроназы и пектинлиазы способны осветлять сок, при этом добавление пектинэстеразы существенно увеличивает эффективность действия полигалактуроназы и уменьшает способность пектинлиазы осветлять сок. Обнаружено, что добавки ксиланаз приводят к увеличению эффективности действия пектинлиазы в данном процессе.

1. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. A Wiley-Interscience Publication. John Wiley & Sons. Inc., 1998, 454 p.

2. Oxenboll K. Aspergillus enzymes and industrial uses. In: Powell K.A., Renwick A., Peberdy J.F. The genus Aspergillus: From Taxonomy and Genetics to Industrial Applications. Plenum Press, London, 1994, p. 147-154.

3. Grassin C., Fauquembergue P. Applications of pectinases in beverages. In: Visser J., Voragen A.G.J. Pectin and pectinases. Elsevier, Amsterdam, 1996, p. 453-462.

4. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. ДеЛи принт, Москва, 2002, 336 с.

5. Parzia M.W., Foster E.M. Determing the safety of enzymes used in Food Processing. J. Food Protection, 1983, 46, p. 453-468.

6. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. Мир, Москва, 1986, т.1, с. 71108.

7. И.Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. Изд-во МГУ, Москва, 1995, 224 с.

8. Stephen A.M. Food Polysaccharides and Their Applications. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong 1995, 654 p.

9. Whitaker J.R., Voragen A.G., Wong D.W.S. Handbook of food enzymology. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, 2003, 1108 p.

10. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. The pectic polysaccharides of primary cell walls. Methods Plant Biochem., 1990, 2, p. 415.

11. Schols H.A., Bakx E.J., Schipper D., Voragen A.G.J. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin. Carbohydr. Res., 1995, 279, p. 265-279.

12. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Ann. Rev. Biochem., 1984, 53, p. 625-663.

13. Thakur B.R., Singh R.K., Handa A.K. Chemistry and uses of pectin a review. Critical Reviews in Food Science and Nitrition, 1997, 37, p. 47-73.

14. Beldman G., Searle-van Leeuwen M.J.F., de Ruiter G.A., Siliha H.A., Voragen A.G.J. Degradation of arabinans by arabinases from Aspergillus aculeatus and Aspergillus niger. Carbohydr. Polymers, 1993, 20, p. 159-168.

15. Guillon F., Thibault J.-F. Enzymatic hydrolysis of the "hairy" fragments of sugarbeet pectins. Carbohydr. Res., 1989, 190, p. 97-108.

16. Oosterveld A., Grabber J.H., Beldman G.J.R., Voragen A.G.J. Formation of ferulic acid dehydrodimers through oxidative cross-linking of sugar beet pectin. Carbohydr. Res., 1997, 300, p. 179-189.

17. Sakai T., Sakamoto T., Hallaert J., Vandamme E.J. Pectin pectinases, and protopectinases: production, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol., 1993, 39, p. 213-294.

18. Pickersgill R., Smith D., Worboys K., Jenkins J. Crystal structure of polygalacturonase from Erwinia carotovora spp. Carotovora. J. Biol. Chem., 1998, 273, p. 24660-24664.

19. Petersen T.N., Kauppinen S., Larsen S. The crystal structure of rhamnogalacturonase A from Aspergillus aculeatus: a right-handed parallel beta helix. Structure, 1997, 5, p. 533544.

20. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of polygalacturonases produced by the hyphal fungus Aspergillus niger. Biotechnol. Appl. Biochem., 1990, 12, p. 150-160.

21. Bussink H.J.D., Kester H.C.M., Visser J. Molecular cloning, nucleotide sequence and expression of the gene encoding prepro-polygalacturonase II of Aspergillus niger, FEBS Lett, 1990, 273, p. 127-130.

22. Bussink H.J.D., Brouwer K.B., de Graaff L.H., Kester H.C.M., Visser J. Identification and characterization of a second polygalacturonase gene of Aspergillus niger. Curr Genet, 1991,20, p. 301-307.

23. Parenicova L., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. pgaA and pgaB encode constitutively expressed members of the Aspergillus niger endopolygalacturonase gene family. Biochem. J., 2000, 345, p. 637-644.

24. Parenicova L., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. pgaE encodes a fourth member of the endopolygalacturonase gene family from Aspergillus niger. Eur. J. Biochem., 1998, 251, p. 72-80.

25. Parenicova L., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. Characterization of novel endopolygalacturonase from Aspergillus niger with unique kinetic properties. FEBS Lett., 2000, 467, p. 333-336.

26. Ruttkowski E., Labitzke R., Khanh N.Q., Loffler F., Gottschalk M„ Jany K.-D. Cloning and DNA sequence analysis of a polygalacturonase cDNA from Aspergillus niger RH5344. Biochem. Biophys. Acta, 1990, 1087, p. 104-106.

27. Kester H.C.M., Küsters-Van Someren M.A., Muller Y., Visser J. Primary structure and characterization of an exopolygalacturonase from Aspergillus tubingensis. Eur. J. Biochem., 1996, 240, p. 739-746.

28. Baker D., Shiau A.K., Agard D.A. The role of pro regions in protein folding. Current Opinion in Cell Biology, 1993, 5, p. 966-970.

29. Yang Y., Bergmann C., Benen J., Orlando R. Identification of the glycosilation site and glycan structures of recombinant endopolygalacturonase II by mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1997, 11, p. 1257-1262.

30. Colangelo J., Licon V., Benen J., Visser J., Bergmann C., Orlando R. Characterization of the glycosilation of recombinant endopolygalacturonase I from Aspergillus niger. Rapid Commun. Mass Spectrom., 1999, 13, p. 1448-1453.

31. Stratilova E., Mislovicova D., Kacurakova M., Machova E., Kolarova N., Markovic O., Jornvall H. The glycoprotein character of multiple forms of Aspergillus polygalacturonase. J. Protein Chem., 1998, 17, p. 173-179.

32. Rao M.N., Kembhavi A.A., Pant A. Implication of tryptophan and histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation of the reaction mechanism. BBA, 1996, 1296, p. 167-173.

33. Whitehead M.P., Shieh M.T., Cleveland T.E., Cary J.W., Dean R.A. Isolation and characterization of polygalacturonase genes (pecA and pecB) from Aspergillus flavus. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61, p. 3316-3322.

34. Bussink H.J.D., Buxton F.P., Visser J. Expression and sequence comparison of the Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis genes encoding polygalacturonase II. Curr. Genet., 1991, 19,467-474.

35. Biely P., Benen J.A.E., Heinrichova K., Kester H.C.M., Visser J. Inversion of configuration during hydrolysis of alpha-1,4-galacturonidic linkage by three Aspergillus polygalacturonases. FEBSLett., 1996, 382, p. 249-255.

36. Rexova-Benkova L., Mrackova M. Active groups of extracellular endo-D-polygalacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. Biochem. Biophys. Acta, 1978, 523. p. 162-169.

37. Stratilova E., Dzurova M., Markovic O., Jornvall H. An essential tyrosine residues of Aspergillus polygalacturonase. FEBS Lett., 1996, 382, p. 164-166.

38. Pages S., Heijne W.H.M., Kester H.C.M., Visser J., Benen J.A.E. Subsite mapping of Aspergillus niger endopolygalacturonase II by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 2000, 275, p. 29348-29353.

39. Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J. Kinetic characterization of Aspergillus niger N400 endopolygalacturonases I, II and C. Eur. J. Biochem., 1999, 259, p. 577-585.

40. D'hallewin G., Schirra M., Powell A.L.T., Greve L.C., Labavitch J.M. Properties of a polygalacturonase-inhibiting protein isolated from "Oroblanco" grapefruit. Physiol. Plant.,120, p. 395-404.

41. Shevchik V.E., Condemine G., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Baudouy J. Characterization of pectin methylesterase B, an outer membrane lipoprotein of Erwinia chrysanthemi 3937. Mol. Microbiol., 1996, 19, p. 455-466.

42. Markovic O., Jarosova A., Machova E., Slezarik A. Effect of oligomeric and polymeric D-galacturonans on the activity of pectinesterase from tomato, Aspergillus foetidus and Trichoderma reesei. Biología, Bratislava, 1996, 51, p. 293-297.

43. Oosterveld A., Beldman G., Searle-Van Leeuwen M.J.F., Voragen A.G.J. Effect of enzymatic deacetylation on gelation of sugar beet pectin in the presence of calcium. Carbohydr. Polymers, 2000, 43, p. 249-256.

44. Molgaard A., Kauppinen S., Larsen S. Rhamnogalacturonan acetylesterase elucidates the structure and function of a new family of hydrolases. Structure, 2000, 8, p. 373-383.

45. Lee M., Macmillan J.D. Mode of action of pectic enzymes. I. Purification and certain properties of tomato pectinesterases. Biochemistry, 1968, 7, p. 4005-4010.

46. Versteeg С. Pectinesterases from the orange fruit their purification, general characteristics and juice cloud destabilizing properties. PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, 1979.

47. Whitaker J.R. Microbial pectolytic enzymes. In: Fogarty W.M., Kelly C.T. Microbial Enzymes and Biotechnology. Elsevier Applied Science, London & New York, 1991, p. 133-175.

48. Roy C., Kester H.C.M., Visser J., Shevchik V.E., Hugouvieux-Cotte-Pattat N., Robert-Baudouy J., Benen J.A.E. Mode of action of five different endo-pectate lyases from Erwinia chrysantemi. J. Bacterial., 1999, 181, p. 3705-3709.

49. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Свойства пектинолитических лиаз Bacillus macerans. Биохимия, 2002, 2, с. 20-29.

50. Vitali J., Schick В., Kester H.C.M., Visser J., Jurnak F. The three-dimensional structure of Aspergillus niger pectin lyase В at 1.7-Â resolution. Plant Physiol., 1998, 116, p. 69-80.

51. Yonder M.D., Jurnak F. The refined three dimensional structure of pectate lyase С from Erwinia chrysantemi at 2.2 Â resolution implications for an enzymatic mechanism. Plant Physiol., 1995, 107, p. 349-364.

52. Pickersgill R., Jenkins J., Harris G., Nasser W., Robert-Baudouy J. The structure of Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1994, 1, p. 717723.

53. Linhardt R.J., Galliner P.M., Cooney C.L. Polysaccharide Lyases. Biotechnol. Appl. Biochem., 1986, 12, p. 135-179.

54. Scavetta R.D., Herron S.R., Hotchkiis A.T., Kita N„ Keen N.T., Benen J.A.E., Kester H.C.M., Visser J., Jurnak F. Structure of plant cell wall fragment complexed to Pel C. Plant Cell, 1999, 11, p. 1081-1092.

55. Attalah M.T., Nagel C.W. The role of calcium ions in the activity of an endo-pectic acid lyase on olygogalacturonides. J. Food Biochem., 1979, 1, p. 185-206.

56. Tardy F., Nasser W., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Comparative analysis of the five major Erwinia chrysantemi pectate lyases: enzyme characteristics and potential inhibitors. J. Bacteriol., 1997, 179, p. 2503-2511.

57. Lojkowska E., Masclaux C., Boccara M., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Characterization of the pelL gene encoding a novel pectate lyase of Erwinia chrysantemi 3937. Mol. Microbiol., 1995, 16, p. 1183-1195.

58. Shevchik V.E., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Pectate lyase Pel I of Erwinia chrysantemi 3937 belongs to a new family. J. Bacterial., 1997, 179, p. 73217330.

59. Pissavin C., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Biochemical characterization of the pectate lyase Pel Z of Erwinia chrysantemi 3937. Biochem. Biophys. Acta., 1998, 1383, p. 188-196.

60. Shevchik V.E., Kester H.C.M., Benen J.A.E., Visser J., Robert-Baudouy J., Hugouvieux-Cotte-Pattat N. Characterization of the exo-pectate lyase Pel X of Erwinia chrysantemi. J. Bacteriol., 1999, 181, p. 1652-1663.

61. Barras F., van Gysegem F., Chatterjee A.K. Extracellular enzymes and pathogenesis of soft rot Erwinia. Annu Rev. Phytopathol., 1994, 32, p. 221-234.

62. Harmsen J.A.M., Kusters-van Someren M.A., Visser J. Cloning and expression of a second Aspergillus niger pectin lyase gene (PELA): Indications of a pectin lyase gene family in Aspergillus niger. Curr. Genet., 1990, 18, p. 161-166.

63. Gysler C., Harmsen J.A.M., Kester H.C.M., Visser J., Heim J. Isolation and structure of the pectin lyase D-encoding gene from Aspergillus niger. Gene, 1990, 89, p. 101-108.

64. Kusters-van Someren M.A., Flipphi M.J.A., de Graaff L.H., van den Broek H.C., Kester H.C.M., Hinnen A., Visser J. Characterization of the Aspergillus niger pelB gene: structure and regulation of expression. Mol. Gen. Genet., 1992, 234, p. 113-120.

65. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of pectin lyase B, a novel pectinolytic enzyme from Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett., 1994, 120, p. 63-68.

66. Voragen A.G.J. Characterization of pectin lyases on pectins and methyl oligogalacturonates. PhD thesis, Wageningen University, Wageningen, Netherlands, 1972.

67. Mutenda K.E., Korner R., Christensen T.M.I.E., Mikkelsen J., Roepstorff P. Application of mass spectrometry to determine the activity and specificity of pectin lyase A. Carbohydr. Res., 2002, 337, p. 1213-1223.

68. Nasuno S. Further evidence on differentiation of Aspergillus sojae from Aspergillus oryzae by electrophoretic patterns of cellulose, pectin-Iyase, and acid proteinase. J. Microbiol, 1974, 20, p. 413-416.

69. Pilnik W., Voragen A.G.J. The significance of endogenous and exogenous pectic enzymes in fruit and vegetable processing. In: Fox P.F., ed. Food Enzymology. Applied Science, London, 1991, p. 303-336.

70. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. Элевар, Москва, 2000,512 с.

71. Беленко Е.Л., Иванченко В.И., Левченко С.В. Исследование качественного и количественного и количественного состава биополимеров в ягодах столового винограда. Виноград и вино России, 1994, 2, с. 23-25.

72. Godfrey Т., West S. Industrial enzymology, 2nd edition. Macmillan Press, London, 1996, 609 p.

73. Бойко В.А. Разработка и внедрение способов профилактики коллоидных помутнений шампанских вин. Автореферат дисс. канд. техн. наук, Ялта, 1989, 24с.

74. Miller N.J., Rice-Evans С.A. A novel method for measuring antioxidant capacity and application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clinical Science, 1993,84, p. 407-412.

75. Кислухина О.В., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Технология, Каунас, 1997, 184 с.

76. Will F., Schulz К., Ludwig М., Otto К., Dietrich Н. The influence of enzymatic treatment of mash on the analytical composition of apple juice. Internat. J. of Food Science and Technol., 2002, 37, p. 653-660.

77. Кислухина О.В., Доронин А.Ф., Жданова М.Л. Получение сока из яблок с применением цитолитических ферментных препаратов. Пищевая промышленность, 1994, 9, с. 28-29.

78. Will F., Bauckhage K., Dietrich H. Apple pomance liquefication with pectinases and cellulases analytical data of the corresponding juices. Eur. Food Res. and Technol., 2000, 211, p. 291-297.

79. Троян 3.A., Корастилева H.H., Юрченко H.B. Динамика пектиновых веществ при производстве яблочного сока. Пищевая промышленность, 1996, 11, с. 36-37.

80. Дульнева И.П., Каражия В.Ф., Тарыца В.Ф. Ферментные препараты для осветления сока. Пищевая промышленность, 1988, 7, с. 25-26.

81. Сахаров Ю.В., Линецкая А.Е. Средства для осветления и стабилизации и эффективноть их использования при обработке плодовых соков и вин. Виноград и вино России, 1999, 6, с. 31-34.

82. Салманова Л.С., Филонова Г.Л., Соболевская Т.Н. Применение ферментативного гидролиза в производстве плодово-ягодных, овощных соков и экстрактов из растительного сырья. Хранение и переработка сельхозсырья, 1995, 2, с. 38-44.

83. Rechner A. Influence of processing techniques on polyphenols and antioxidative capacity of apple and berry juices. PhD thesis, University of Giessen, Giessen, 2001.

84. Thorn C., Raper K.B. A manual of the Aspergilli. Williams and Wilkins, Baltimore, 1945.

85. Nikkuni S., Kosaka N., Suzuki C., Mori K. Comparitive sequence analysis on the 18S rRNA gene of Aspergillus oryzae, A. sojae, A. flavus, A. parasiticus, A. niger, A. awamori and A. tamari.J. Gen. Appl. Microbiol., 1996, 42, p. 181-187.

86. Parenicova L., Benen J.A.E., Samson R.A., Visser J. Evaluation of RELP analysis of the classification of selected black Aspergilli. Mycol. Res., 1997, 101, p. 810-814.

87. Naidu G.S.N., Panda T. Production of pectolytic enzymes — a review. Bioprocess Engineering, 1998, 19, p. 355-361.

88. Antier P., Minjares A., Roussos S., Viniegra-Gonzalez G. New approach for selecting pectinases producing mutants of Aspergillus niger well adapted to solid state fermentation. Biotech. Adv., 1993, 11, p. 429-440.

89. Maldonado M.C., de Saad A.M. Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid state fermentations. J. Industr. Microbiol. Biotech., 1998, 20, p. 34-38.

90. Galiotou-Panayotou M., Rodis P., Kapantai M. Enhanced polygalacturonase production by Aspergillus niger NRRL-362 grown on supplemented citrus pectin. Lett. Appl. Microbiol., 1993, 17, p. 145-148.

91. Cavalito S.F., Areas J.A., Hours R.A. Pectinase production profile of Aspergillus foetidus in solid state cultures at different acidities. Biotech. Lett., 1996, 18, p. 251-256.

92. Bussink H.J.D., van den Homberg J.P.T.W., van den Ussel P.R.L., Visser J. Characterization of polygalacturonase-overproducing Aspergillus niger transformants. Appl. Microbiol. Biotech., 1992, 37, p. 342-329.

93. Bowman S.B., Zaman Z., Collinson L.P., Brown A.J.P., Dawes I.W. Positive regulation of the LPD\ gene of Saccharomyces cerevisiae by the HAP2/HAP3/HAP4 activation system. Mol. & Gen. Genet., 1992, 231, p. 296-303.

94. Bussink H.J.D., Buxton F.P., Fraaye B.A., de Graaff L.H. Visser J. The polygalacturonases of Aspergillus niger are encoded by a family of diverged genes. Eur. J. Biochem., 1992, 208, p. 83-90.

95. Остерман Jl.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва, 1985,536 с.

96. Roe S. Protein Purification Techniques. A practical approach. Oxford University Press, 2001.

97. Инструкции фирм производителей оборудования к приборам Econo System, Model 111 Cell, Mini Protean и Chromatography Workstation 700 ("Bio-Rad", США) и FPLC ("Pharmacia", Швеция).

98. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Мир, Москва, 1991, 544 с.

99. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. В: Варфоломеев С.Д. Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. ВИНИТИ, 1993, 25, 152 с.

100. Garcia Е., Johnson D.,Whitaker J.R., Shoemaker S.P. Assesement of endo-l,4-beta glucanase activity by a rapid colorimetric assay using disodium-2,2'-bicinchoninate. J. Food Biochem., 1993, 17, p. 135-145.

101. Collmer A., Reid J. Assay methods for pectic enzymes. In: Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 1988, 161, part B, p. 329-335.

102. Pitt D. In: Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 1988, 161, part B, p. 353.г

103. Schejter A., Marcus L. In: Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 1988, 161, part B, p. 366.

104. Гусаков А.В., Марков А.В., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 2002, 67, 6, с. 815-822

105. В.Е. Smith. Protein sequencing protocols. Humana Press, Totowa, 1997.

106. Донченко Л.В. Технология пектина и пектинопродуктов. ДеЛи, Москва, 2000, 256 с.

107. Pectinase assay. Dyadic International, Inc.

108. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, р-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus. Диссертация на соискание степени канд. хим. наук, МГУ, Москва, 2004, 177 с.

109. James P. Proteome research: mass spectrometry. Springer-Verlag, Berlin, 2001.

110. Rappsilber J., Moniatte M., Nielsen M.L., Podtelejnikov A.V., Mann M. Experienses and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research. Int. J. Mass Spectrom., 2003, 226, p. 223-237.