Рекомбинантные α-галактозидазы А и С, пектинлиаза и фитаза Penicillium canescens тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ФЁДОРОВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

0031-Р447в

РЕКОМБИНАНТНЫЕ а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ А и С, ПЕКТИНЛИАЗА И ФИТ АЗА Pénicillium canescens

02 00 15 - катализ 03 00 23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 2007

003174478

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического Факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научные руководители:

доктор химических наук, проф Синицын Аркадий Пантелеймонович кандидат химических наук Синицына Ольга Аркадьевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович кандидат химических наук Скляр Владимир Ильич

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина

РАН, г Пущино

Защита состоится « ЪО » октября 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119991, ГСП-1 г. Москва, Ленинские горы, д 1, стр 11, МГУ имени M В Ломоносова, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан « » сентября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат химических наук

Сакодынская И К

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Промышленная технология ферментных препаратов начала активно развиваться в последней четверти XX века К настоящему времени ферменты стали мощным средством переработки практически любого вида биологического сырья

Одним из основных компонентов кормов животных и птиц является соя, которая служит незаменимым источником белка Однако в ее составе присутствуют такие антипитательные факторы, как галактоолигосахариды, галактоманнаны, пектины, а также фитаты Галактоолигосахариды сбраживаются микроорганизмами кишечника и приводят к газообразованию Пектины и галактоманнаны при набухании увеличивают вязкость корма и затрудняют перевариваемость белков сои Фитаты образуют нерастворимые комплексы с микроэлементами, белками и жирами Таким образом, для повышения усвояемости кормов на основе сои требуется целый комплекс ферментных препаратов, основными компонентами которых являются а-галактозидазы, пектинлиазы и фитазы

Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения Большую часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят с помощью культивирования микроскопических грибов, при этом все более значимое место занимают ферментные препараты на основе грибов рода Pénicillium Рост интереса к этим продуцентам как к промышленно значимым объектам вызван тем, что штаммы Pénicillium sp продуцируют внеклеточные ферменты широкого спектра действия, в том числе ксиланазы, целлюлазы, пектиназы, амилазы, фитазы, протеазы и пр

В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучаются состав и свойства внеклеточного ферментного комплекса мицелиального грибного штамма Pénicillium canescens Среди секретируемых им ферментов нами в том числе были обнаружены две а-галактозидазы различной специфичности, пектинлиаза и фитаза Однако препятствием - как для изучения свойств, так и для последующего практического применения этих ферментов в биотехнологических процессах - оказался низкий уровень секреции Для получения ферментных препаратов с высокими содержанием перечисленных выше ферментов совместными усилиями с нашими коллегами из ФГУП ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов были созданы рекомбинантные штаммы Р canescens с повышенной продукцией собственных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы

Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось выделение и изучение свойств рекомбинантных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы, а также оценка эффективности их действия в прикладных испытаниях in vitro

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- Провести скрининг трансформантов Р сапезсет и выбрать среди них оптимальные для получения промышленных ферментных препаратов с высокими активностями а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы

- Разработать (оптимизировать) схему выделения в гомогенном виде рекомбинантных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы из ферментных комплексов, секретируемых новыми рекомбинантными штаммами Р сапезсет

- Исследовать свойства выделенных ферментов

- Оценить эффективность применения а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы Р сапейсет (а также их смесей) для нужд кормовой и пищевой промышленности, используя в качестве эталонов для сравнения коммерческие промышленные а-галактозидазные, пектинлиазные и фитазные ферментные препараты

Научная новизна работы. Впервые выделены две гомогенные рекомбинантные а-галактозидазы, полученные путем гомологичной экспрессии в Р сапеьсет а-галактозидаза А (61 кДа, р1 5,1, 27-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к полимерным галактоманнанам, и а-галактозидаза С (80 кДа, р! 4,8, 36-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к галактоолигосахаридам

Впервые выделена гомогенная рекомбинантная Са2+-независимая пектинлиаза А (38 кДа, р1 6,7), полученная путем гомологичной экспрессии в Р сапезсет и относящаяся к 1-ой семье полисахаридлиаз Определены кинетические параметры гидролиза различных пектинов и показано, что пектинлиаза А наиболее специфична по отношению к высокоэтери-фицированным пектинам

Впервые выделена гомогенная рекомбинантная фитаза А (63 кДа, р1 6,3), полученная путем гомологичной экспрессии в Р сапеБсет Показано, что фитаза А имеет широкую субстратную специфичность и обладает при этом высокой удельной активностью по отношению к фитатам, в которых способна осуществлять гидролиз пяти из шести имеющихся фосфатных групп

Необходимо отметить, что информация об а-галактозидазах, пектинлиазах и фитазах Р сапевсет, касающаяся, в том числе, особенностей их функционирования, в научной литературе практически отсутствует Таким образом, представленные в работе результаты впервые позволяют подробно охарактеризовать вышеперечисленные ферменты данного продуцента

Практическая значимость работы. В ходе кормовых тестов т уНго на примере гидролиза кукурузной и соевой муки продемонстрирована высокая эффективность ферментных препаратов на основе рекомбинантных а-галактозидазы А и фитазы А Р сапезсет для повышения питательной ценности растительных кормов Показано, что комплексное воздействие а-галактозидазы А, фитазы А, и пектинлиазы А позволяет значительно повысить эффективность обработки растительного сырья и, следовательно,

4

снизить расход ферментных препаратов, используемых в качестве биодобавок

Показана высокая эффективность действия ферментного препарата, содержащего рекомбинантную а-галактозидазу С, при гидролизе «Soy Solubles» — вторичного продукта, образующегося при переработке сои и содержащего галактоолигосахариды Установлено, что максимальная степень конверсии «Soy Solubles» до моносахаридов может быть достигнута в комбинации с инвертазой Р canescens

На примерах получения сока из клюквы и осветления яблочного сока продемонстрирована высокая эффективность ферментного препарата, содержащего рекомбинантную пектинлиазу А, в процессах производства соков и показана ключевая роль пектинлиазы в этих процессах

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях «Биокатализ-2007» (Москва -Санкт-Петербург, 2007), «Биокатализ-2005» (Санкт-Петербург - Кижи -Валаам, 2005), «Биокатализ-2002» (Москва, 2002), «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2005 и 2007), «4th European Young Cereal Scientists and Technologists Workshop» (Vienna, Austria, 2005)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 6 статей

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (четыре главы), главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав, в которых приведены результаты и их обсуждение, выводов и списка литературы, содержащего ссылок на публикации в отечественных и зарубежных журналах Объем диссертации составляет 45L страниц и включает*/2. рисунка и таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первых трех главах литературного обзора подробно рассматриваются вопросы, связанные с субстратной специфичностью, классификацией и свойствами а-галактозидаз, пектинлиаз и фитаз Уделено внимание практическому применению этих ферментов Глава IV содержит характеристику штаммов Р canescens как продуцентов рекомбинантных ферментов

Отдельная глава (Глава V) посвящена описанию использованных в работе методов исследования, в ней приводится также список субстратов, реактивов, ферментных препаратов

В последующих трех главах изложены результаты исследований и их обсуждение

I. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТОЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ А И ФИТАЗЫ А

1.1 Создание новых штаммов /'.сяиехсеи« — продуцентов гомологичных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы

В ходе исследований ферментного комплекса, секретируемого мицелиальным грибом Р сапеБсет, в нашей лаборатории было обнаружено присутствие в нем следовых ос-галактозидазной, пектинлиазной и фитазной активностей Поскольку соответствующие ферменты секретировались исходным штаммом Р сапехсет РСА 10 в минорных количествах, было решено создать на его основе штаммы-суперпродуценты Р сапеясет с высоким уровнем секреции перечисленных выше рекомбинантных ферментов. Основные этапы таких исследований включают в себя 1) выделение генов интересующих ферментов, 2) создание экспрессионных плазмид с включенной структурной частью гена, совмещенной с нуклеотидными последовательностями, кодирующими выбранные промотор-ные области и сигнальные пептиды, и получение трансформированных штаммов, 3) проведение ферментаций и отбор лучших трансформантов, 4) получение и изучение свойств рекомбинантного фермента

Первый и второй этапы были успешно осуществлены в ходе исследований, проводившихся совместно с ФГУП ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов В геном штамма-реципиента Р сапевсет РСА 10 путем котрансформации по маркеру {таО) были включены гены целевых ферментов а-галактозидазы А {¿¡¿М) и галактозидазы С (aglC) под контролем промотора и лидерной последовательности гена собственной ксиланазы Ксил А (рху1А), а также пектинлиазы А (ре1А) и фитазы А (ркуА) под контролем промотора и лидерной последовательности гена собственной Р-галактозидазы Р-Гал (pbgaS) Полученные трансформанты были названы штаммами Р сапезсет серий АГЛ(А) - для а-галактозидазы А (а-Гал А), АГЛ(С) - для а-галактозидазы С (а-Гал С), Рес-23 - для пектинлиазы А (Пел А) и РЬу-2ХХ -для фитазы А (Фит А)

Нам предстояло провести селекцию новых трансформантов Р сапезсепэ, характеризующихся наиболее высокой продукцией рекомбинантных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы

1.2 Характеристика ферментных комплексов, продуцируемых рекомбинантными штаммами Р сапеБсею, несущими гены гомологичных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы

Поскольку дикий штамм Р сапевсепз обладал крайне невысокими а-галактозидазной, пектинлиазной и фитазной активностями, в качестве критерия отбора наиболее удачных рекомбинантных штаммов была выбрана способность гидролизовать соответствующие специфические субстраты

Таблица 1 Основные признаки рекомбинантных штаммов Р сапе$сеп$ и используемых генно-инженерных конструкций_

Штамм Ген Промотор Полученный фермент

рху1А

АГЛ(А)-4-20 agIA - + а-Гал А (61 кДа, р1 5,1, 27 семья гликозил-гидролаз)

АГЛ(С)-4-6 аё1С - + а-Гал С (80 кДа, р1 4,8, 36 семья гликозил-гидролаз)

Рес 23-10 ре/А + - Пел А(38кДа, р16,7, 1 семья полисахаридлиаз)

РЬу-215 ркуА + - Фит А (63 кДа, р1 6,3, гистидиновые кислые фосфатазы)

/7-нитрофенил-а-£)-галактопиранозид (иНФГ) - для а-галактозидазных трансформантов, пектин — для пектинлиазных трансформантов, и фитат Ыа -для фитазных трансформантов Другим критерием отбора служили данные ДДС-ЭФ ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов Р сапезсет

В результате скрининга культуральных жидкостей Р сапезсет в каждой из четырех серий трансформантов были выбраны лучшие представители, отличавшиеся наиболее высоким уровнем экспрессии целевого фермента, это АГЛ(А)-4-20, АГЛ(С)-4-6, Рес 23-10 и РЬу-215 в сериях АГЛ(А), АГЛ(С), Рес-23 и РЬу-2ХХ, соответственно (см табл 1)

С использованием отобранных, наиболее продуктивных штаммов, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им Г К Скрябина были проведены ферментации в ферментерах объемом 10 и 100 л и

Таблица 2 Активности (ед/мг белка) ферментных препаратов по отношению к разным субстратам (рН 5)_

Название препарата #911 2 #АГЛ(А)-4 2 #АГЛ(С)-6 2 #П-1 2 #Ф-17 2

Штамм-продуцент РСА 10 АСЬ(А)-4-20 АСЦС)-4-6 Рес 23-10 РЬу-215

Содержание белка, мг/г 400 235 360 490 500

Полигалактуроновая кислота (ПГК), 50°С 4,2 - - 0,5 -

Цитрусовый пектин', 40°С 0,05 - - 10,6 -

Галактоманнан0, 50°С 0,84 6,7 2,2 - -

с. Раффиноза, 50°С 0,65 2,6 31 - -

и Стахиоза, 50°С 0,16 0,5 33 - -

и л-Нитрофенил-а-£)-галакто-пиранозид (гсНФГ), 40°С 0,7 16 52 - -

Фитат № из риса, 40°С 0,08 - - - 46

и-Нитрофенил фосфат (лНФФ), 40°С 0,06 - - - 1,9

апектин со степенью метилирования (СМ) 70% бгалактоманнан с соотношением манноза/галактоза «М/Г» = 2,4 1

Isr

у

**** 29

йЛГЛ-1,2 >1 f:

иЛ*

£7" —-v.. it;.

■Ч »Й^Ч! ■ , Н isiy »»»И Щщ

\ i tea* я »11-1. i м

й)

¿0

<0

Рисунок 1. ДДС-ЭФ ферментных комплексов, декретируемых различными штаммами Р-са^сепг. штаммом-ретшппентом РСА 10 (о); АОЦА)-4-20 (б); АОЦС)-4-6 (в); Рес 2310 (г); Рг.у-215 (:».

получены сухие ферментные препараты (лиофильно высушенные ультрафильтраты культуральных жидкостей, обогащенные р с ко мби н ан т ными от Г ал А, а-Гал С, Пел А и Фит А). Активности этих препаратов приведены в табл. 2, а ДДС-ЭФ - на рис. 1 (для сравнения приведены также аналогичные результаты для препарата исходного штамма Р. еснЩсет РСА 10).

Таким образом, гз результате сравнительного исследования ферментных препаратов, полученных с помощью новых трансформантов Р.сапехсет с ампяифицированными гомологичными генами двух а-галахтозидаз, пектин-лиазы и фитазы, нами были отобраны лучшие штаммы, отличавшиеся максимальной продукцией целевых ферментов и получены ферментные препараты, обогащенные рскомбинантиыми а-Гал А, а-Гал С, Пел А и Фит А.

И. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГЛЛ А, а-ГАЛ С, ПЕЛ А И ФИТ А Р.сетехсепх

2.1 Выделение ферментов и определение их молекулярных характеристик

Была разработана принципиальная схема эффективного и быстрого выделения индивидуальных ферментов из ферментных препаратов P.ccmescens. Схема включает три основные стадии:

- стадию предварительной очистки ф ер мен та ти si (ого комплекса от небелковых примесей (нерастворимых веществ, углеводов, пигментов и т.д.), включающую осаждение белка 80% (от насыщения) раствором сульфата шШкш, и ен грифу ги ров тте, растворение осадка п буфере и обессоливав ия полученного раствора на носителе Акрилекс П-2;

стадию грубого фракционирования ферментного комплекса, включающую ИОХ на носителе Source 15Q и анализ специфических активностей собранных белковых фракций, а также их анализ с помогцью ДДС-ЭФ и ИЭФ;

- стадию глубокой («тонкой») очистки, включающую дополнительное фракционирование (с помощью различных хроматографических методов) белковых фракций, отобранных в ходе предыдущей стадии и содержащих искомый фермент.

В результате были выделены гомогенные по данным ДДС-ЭФ и И ЭФ а-Гал А, а-Гал С, Пел А и Фит А (см. рис. 2).

й)

кДн кДя

¿ЙЙ 4А ■ ■■ щ ■ш«

Мм? №

..3*8!!

м м

« кДа

1|л

Л

Ш

м

1

12 3 4

Рисунок 2. ДДС-ЭФ (¿г) и ИЭФ (б) выделенных индивидуальных ферментов- 1 - а-Гал Л; 2 - а-Гал С; 3 - Пел Л; 4 - Фит А,

Значения Мг и р! выделенных ферментов представлены в табл. 3. Самыми «кислыми» (р1 4,8 и 5,1) оказались а-галахтозидазы. Пел А и Фит А обладали «нейтральными» значениями щ (р! 6,7 и 6,3). В целом, молекулярные массы и значения р1 выделенных ферментов лежат в диапазоне значений, характерном для ферментов данных классов.

Таблица 3. Биохимические характеристики выделенная ферментов.

¡Фермент Мг, кДи 1 р!

; а-Гял А 61 | 5.1

а-Гал С 80 | 4,8

Пел А 38 6,7

| Фит А 63 ] 6,3

2,2 Субстратная специфичность ферментов

Для того чтобы провести точную классификацию выделенных гомогенных ферментов мы проанализировали их субстратную специфичность, используя для этого широкий круг субстратов. Для установления механизма действия ферментов использовали данные о составе продуктов гидролиза различных субстратов, данные по изменению полимерных субстратов в ходе гидролиза, а также данные, характеризующие общий выход продуктов при глубоком (исчерпывающем) гидролизе субстратов.

а-Гал А и а-Гал С. Данные, характеризующие специфичность действия а-галактозидаз, приведены в табл. 4. Оба фермента проявляли высокую

Таблица 4 Активность (ед/мг белка) а-Гал А и а-Гал С по отношению к разным субстратам_

Субстрат Условия Активность

реакции а-Гал А а-Гал С

I иНФ-а-£>-галактопиранозид («лНФГ») 98 1255

1 иНФ-Р-£)-галактопиранозид 0 0

| иНФ-а-^-арабинофуранозид 0 0

| иНФ-а-£>-арабинопиранозид 0 0

1 пНФ-а-£>-ксилопиранозид 0 0

иНФ-(3-1)-ксилопиранозид рН 5 0 0

1 лНФ-а-£)-маннопиранозид 40°С 0 0

| иНФ-(3-£)-маннопиранозид 0 0

лНФ-а-£)-глюкопиранозид 0 0

| пНФ-Р-£)-глюкопиранозид 0 0

иНФ-а-Х-рамнопиранозид 0 0

| иНФ-а-£>-фукопиранозид 0 0

1 Сахароза рН 5 50°С 0 0

1 Раффиноза 1,2 296

| Стахиоза 0,5 256

| Галактоманнан3 6,2 0

| Галактоманнан6 рН 5 3,5 0

| Галактан картофеля' 50°С 0 0

| Арабиногалактан лиственницы 0 0

"галактоманнан с соотношением манноза/галактоза «М/Г»=2,4 1 6галактоманнан с соотношением манноза/галактоза «М/Г»=1,72 1 'содержание галактозы 87%

специфичность по отношению к а-галактозидной связи среди всех протестированных и-НФ-гликозидных субстратов обнаружена активность только по отношению к иНФ-а-£>-галактопиранозиду При этом удельная активность по данному субстрату для а-Гал С выше, чем у а-Гал А более чем на порядок

Различие в свойствах двух а-галактозидаз проявляется при воздействии на природные галактозосодержащих субстраты а-Гал А более специфична по отношению к полимерным галактоманнанам, а-Гал С, напротив, высоко специфична по отношению к галактоолигосахаридам (раффиноза, стахиоза) и не гидролизует галактоманнан (ГМ) а-Гал А наиболее эффективно гидролизует менее разветвленный ГМ (ГМ с меньшим относительным содержанием галактозы) Снижение удельной активности при переходе к более высоко замещенному ГМ можно объяснить стерическими затруднениями Следует отметить, что а-галактозидазы не способны гидролизовать полимерные субстраты, содержащие галактозу в составе основной цепи полимерной молекулы (галактан, арабиногалактан)

Процесс гидролиза стахиозы, раффинозы и ГМ под действием обеих а-галактозидаз был исследован более подробно Мы изучили характер изменения ММР полимерного ГМ в ходе гидролиза а-Гал А методом высокоэффективной ГПХ Средняя молекулярная масса ГМ при воздействии а-Гал А менялась незначительно при сравнительно быстром росте содержания низкомолекулярных продуктов в реакционной смеси Это свидетел-ствует о действии фермента по механизму экзо-деполимеризации Глубина исчерпывающего гидролиза ГМ а-Гал А была достаточно высока и составила 50%, а единственным низкомолекулярным продуктом была £)-галактоза (по данным ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой)

а-Гал С эффективно гидролизовала стахиозу и раффинозу, проявляя по этим субстратам на два (и выше) порядка более высокую активность по сравнению с а-Гал А Анализ качественного состава низкомолекулярных продуктов гидролиза этих галактоолигосахаридов под действием а-галактозидаз (методом ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой) показал, что оба фермента гидролизовали раффинозу, давая в качестве продуктов сахарозу и галактозу, в случае стахиозы наблюдался ее последовательный гидролиз до раффинозы и галактозы, далее шел гидролиз раффинозы до сахарозы и галактозы

Пел А Наибольшую активность Пел А Р сапехсет проявляла к высокоэтерифицированному пектину со степенью метилирования (СМ) 89%, причем высокая активность Пел А по отношению к этому субстрату наблюдалась как при детекции специфической лиазной реакции, так и при использовании вискозиметрического метода (см табл 5) При переходе к менее замещенным субстратам (СМ 70 и 65%) активность фермента падала, а по отношению к пектину с самым низким значением СМ (26%) активность фермента была на порядок меньше, чем по отношению к наиболее высокоэтерифицированному субстрату По отношению к полностью деметилированному субстрату - полигалактуроновой кислоте (ПГК) - Пел А оставалась инертной Такой тип субстратной специфичности (предпочтительный гидролиз высокометилированных пектинов) характерен для всех пектинлиаз, описанных на данный момент в литературе Был проведен исчерпывающий гидролиз пектинов с разной СМ под действием Пел А Р сапеБсет Наибольшая глубина гидролиза наблюдалась для наиболее высокометилированного пектина при исчерпывающей деструкции степень конверсии субстрата для пектинов со СМ О (ПГК), 26, 65 и 89% (различные пектины) составила соответственно 0, 2, 16 и 23%

Из литературы известно, что ионы кальция могут оказывать влияние на каталитические свойства пектинлиаз, в том числе, увеличивать активность этих ферментов при значениях рН выше оптимальных Исследовав поведение Пел А Р сапезсет в присутствии СаС12 (0-1 М растворы), а также в присутствии хелатирующего агента ЭДТА, мы пришли к выводу, что Са2+ не оказывает влияния на способность Пел А гидролизовать высокоме-

Таблица 5. Активность (ед/мг белка) Пел А по отношению к разным субстратам (40°С)

Субстрат Источник рн Эффекторы Активность Способ измерения активности

Пектин, СМ* 70% Цитрусовые 5 ЭДТА 28,0 Образование Д-4,5-ненасыщенных продуктов

- 27,2

8 ЭДТА 2,2

- 2,1

ПГК -»- 5 СаСЬ 0,007 -»-

- 0,006

8 СаСЬ 0,004

- 0,003

ПГК -»- 5 - 0,3 Образование восстанавливающих Сахаров

Пектин, СМ 89% -»- -»- - 48,2 Образование Д-4,5-ненасыщенных продуктов

Пектин, СМ 65% - 26,5

Пектин, СМ 26% - 6,6

Пектин, СМ 70% -»- -»- - 360 Уменьшение вязкости

Пектин, СМ 56% Яблоки - 380

Пектин, СМ 30% Свекла - 0,7

*СМ - степень метилирования

тилированный цитрусовый пектин (см табл 5)

Фит А Определение субстратной специфичности выделенной фитазы проводили с использованием ряда фосфат-содержащих субстратов (см табл 6) Наибольшую удельную активность (152 ед/мг белка) Фит А проявляла по отношению к фитату № из риса Активность известных грибных фитаз по этому субстрату варьирует от 20 до 195 ед/мг Таким образом, удельную активность Фит А Р сапезсет можно считать достаточно высокой Кроме фитата Ыа из риса, фермент активно гидролизовал фитаты из других источников (фитат Ыа из кукурузы, фитаты Са и Отметим, что Фит А

обладала способностью гидролизовать и-нитрофенил-фосфат (иНФФ), а также высвобождать фосфатную группу из £>-фруктозо-1,6-дифосфата £>-глюкозо-6-фосфата Ыа, 1- и 2-нафтилфосфатов, те проявлял свойства неспецифической кислой фосфомоноэстеразы (наличие примеси фосфо-эстеразы мы исключили, проведя высоко чувствительный ДЦС-ЭФ с окраской серебром) Помимо этого, Фит А гидролизовала о-фосфо-£-серин -это важное с прикладной точки зрения свойство, весьма редко встречающееся в ряду фитаз грибного происхождения Таким образом, можно заключить, что Фит А Р сапезсет, с одной стороны характеризовалась высокой удельной активностью по отношению к фитатам, а с другой - весьма широкой субстратной специфичностью

Процесс гидролиза фитатов Фит А Р сапезсет был изучен подробнее Было обнаружено, что глубина исчерпывающего гидролиза фитата №

Таблица 6. Активность (ед/мг белка) Фит А по фит А составляет 83%, что соответствует отщеплению пяти из шести имеющихся фосфатных групп Анализ качественного состава продуктов гидролиза этого субстрата (методом высокоэффективной ТСХ) показал, что фермент последовательно отщепляет от молекулы фитата пять из шести имеющихся фосфатных групп, образуя в качестве конечного продукта мио-инозит-2-монофосфат Этот факт, в совокупности с отсутствием влияния на активность Фит А хелатирующего агента ЭДТА (косвенное свидетельство в пользу того, что молекула фермента не содержит в своем составе ионы металлов, принимающие участие в катализе), позволил отнести ее к группе гистидиновых кислых фосфатаз

2.3 Кинетические параметры ферментов

Кинетические параметры гомогенных ферментов, выделенных из препаратов Р сапевсет, были определены по зависимости начальной скорости образования продуктов реакции от исходной концентрации специфического субстрата в координатах Лайнуивера-Берка С учетом концентрации белка в реакционной смеси и молекулярных масс ферментов из значений ¥тах были рассчитаны каталитические константы (£са()

Для а-Гал А и а-Гал С Р сапеясепз были определены кинетические параметры гидролиза иНФГ, галактоолигосахаридов и ГМ, см табл 7 Величины Кт при гидролизе лНФГ и галактоолигосахаридов для а-Гал А и а-Гал С лежат в диапазоне значений, характерном для а-галактозидаз из других источников Значения кинетических параметров хорошо согласуются со значениями специфических активностей для обеих а-галактозидаз (ср табл 4 и табл 7) Так, удельная активность а-Гал С по иНФГ на порядок превышала значение для а-Гал А — та же закономерность наблюдалась при сравнении величин ксм/Кт а-Гал С, в отличие от а-Гал А, была высоко специфична по отношению к галактоолигосахаридам - отношение ксМ/Кт для этого фермента при гидролизе раффинозы и стахиозы выше значений для а-Гал А более чем на три порядка

Из литературы известно, что многие а-галактозидазы ингибируются продуктом реакции гидролиза - Д-галактозой Нами было обнаружено, что в присутствии 1,25 М £>-галактозы а-Гал А Р сапевсет теряет 50% исходной активности а-Гал С была существенно менее чувствительна к этому

отношению к разным субстратам (рН 5,0, 40°С)

Субстрат Активность

Фитат Ыа из риса 152

Фитат Ыа из кукурузы 102

Фитат 80

Фитат Са 81

Глицеро-2-фосфат Ыа 4,4

Пиридоксаль-5'-фосфат 2,9

/)-Глюкозо-6-фосфат Ыа 34

£>-Фруктозо-6-фосфат № 1,3

£>-Фруктозо-1,6-дифосфат Ыа 47

1-Нафтилфосфат № 24

2-Нафтилфосфат № 33

и-Нитрофенил-фосфат (иНФФ) 92

о-Фосфо-Х-серин 0,15

Субстрат Фермент Кт, мМ &сяЬ С км!Кт, с"'*м!УГ'

гсНФГ (40°С) а-Гал А 0,48±0,05 7,25±1,05 15,1

а-Гал С 0,61±0,05 1824±250 2990

Раффиноза (50°С) а-Гал А 0,49±0,06 0,89±0,05 1,8

а-Гал С 22,8±2,4 1145±95 50,2

Стахиоза (50°С) а-Гал А 0,22±0,04 0,57±0,02 2,6

а-Гал С 20,6±1,9 1250±80 60,7

ГМа (50°С) а-Гал А 0,034±0,002 9,75±1,05 290

а-Гал С 0 0 0

ГМб (50°С) а-Гал А 0,044±0,003 6,92±0,85 160

а-Гал С 0 0 0

йгалактоманнан с соотношением манноза/галактоза «М/Г»=2,4 1

бгалактоманнан с соотношением манноза/галактоза «М/Г»=1,72 1

эффектору при концентрации £>-галактозы в растворе 30 мМ активность фермента падала на 28% Исследование зависимости кинетических параметров реакции гидролиза иНФГ от концентрации £>-галактозы в реакционной смеси показало, что £)-галактоза является конкурентным ингибитором для обоих ферментов с константами ингибирования /£,=1,0±0,3 мМ для а-Гал А и А",=30±5 мМ для а-Гал С

Значения кинетических параметров Пел А Р сапезсет, определенных по пектинам с разной СМ, приведены в табл 8 Отметим уменьшение значений Кт и увеличение значений /сса1 с увеличением СМ пектина от 26 до 89% Отношение ксл/Кт, определенное по пектину со СМ 89%,

Таблица 8. Кинетические параметры Пел А Р сапезсею (рН 5,40°С)

Субстрат Кт, г/л *са1, С"' л*г-"*с-1

Пектин, СМ 26% 2,9±0,4 24,8±0,7 8,6

Пектин, СМ 65% 2,5±0,3 90,5±4,7 36,2

Пектин, СМ 70% 1,7±0,2 95,2±7,1 56,0

Пектин, СМ 89% 1,2±0,1 133,3±9,5 111,1

на порядок выше значения, полученного для пектина со СМ 26%, т е Пел А высокоспецифична по отношению к высокометилированному пектину

В случае Фит А Р сапеясет, обладавшей широкой специфичностью, значения каталитических констант (кс.м и Кт) были определены для всех использованных субстратов (см табл 9) Самыми высокими значениями соотношения кса1/Кт характеризовались реакции гидролиза фитатов они превышали аналогичные значения для реакций гидролиза других

Субстрат Асаь С Кт мМ кш/Кт, с"'*мМ"'

Фитат Иа из риса 210±5 0,08+0,01 2625

Фитат № из кукурузы 165+5 0,04±0,01 4125

Фитат К-Мд 130+4 0,03±0,01 4333

Фитат Са 120±10 0,06±0,02 2000

Глицерин-2-фосфат № 45±5 15+4 3,0

Пиридоксаль-1,5 '-фосфат 26±4 17±4 1,5

¿)-Глюкозо-6-фосфат Ыа 230±15 7±1 33

£>-Фруктозо-6-фосфат Ыа 40±10 0,27±0,06 148

/)-Фруктозо-1,6-дифосфат № 190+10 3,9+0,5 49

1-Нафтил-фосфат № 650±50 20±1 32

2-Нафтил-фосфат № 240+40 12±3 20

лНФФ 260+40 5+1 52

о-Фосфо -¿-серии 0,29±0,03 0,08±0,05 3,6

исследованных субстратов на 2-3 порядка (что, согласно литературным данным, является отличительным свойством большинства известных грибных фитаз) Другой характерной особенностью грибных фитаз является заметная (иногда на несколько порядков) разница значений Кт реакций гидролиза «НФФ и фитатов В случае Фит А Р сапезсет значение Кт реакции гидролиза «НФФ (Кт = 5 мМ) на два порядка превысило значения Кт для фитатов (0,03-0,08 мМ, что соответствует нижней границе значений Кт известных грибных фитаз, варьирующих от 0,01 до 0,50)

2.4 Влияние рН и температуры на активность ферментов

Значения рН- и температурных оптимумов активности гомогенных ферментов представлены в табл 10 Все ферменты проявляли максимальную активность при слабокислых значениях рН 4,5-5,7 и температурах 50-65°С, что хорошо коррелирует с литературными данными Следует отметить высокий уровень активности а-Гал А в кислой области (рН 2,5), а а-Гал С и Пел А — в нейтрально-щелочной (рН 6-8)

Помимо исследования влияния рН и температуры на активность ферментов в течение непродолжительного времени (время определения активности 10-30 мин, табл 10), нами была изучена способность а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы сохранять свою активность при продолжтель-ном (несколько часов) воздействии повышенных температур при различных значениях рН Эти характеристики важны, в первую очередь, с точки зрения практического применения

Таблица 10 Значения рН- и температурных оптимумов активности а-Гал А, а-Гап С, Пел А и Фит А_

Свойства рНопт т °г * опт, ^

а-Гал А" 4,5 55

а-Гал Са 5,0 65

Пел А0 5,0-5,5 60

Фит А" 5,7 50

Определены по лНФГ Определены по пектину со СМ 70% 'определены по фитату Ыа риса

ферментов

Наибольшую стабильность а-Гал А и а-Гал С проявляли при значении рН 4-6 они сохраняли не менее 70% активности при 40 и 50°С после 3 ч инкубации При кислом значении рН а-Гал С оказалась менее стабильной, чем а-Гал А Так, при 50°С и рН 3 а-Гал А за 3 ч инкубации теряла 32% исходной активности, тогда как а-Гал С практически полностью инактивировалась При повышении температуры до 60°С стабильность а-Гал А заметно снижалась - фермент сохранял лишь 5-25% исходной активности после 1 ч инкубирования при рН 3-6 а-Гал С при 60°С проявляла себя иначе в растворе с рН 5 за 3 ч инкубации сохраняла 90% исходной активности, период полуинактивации при рН 6 и 4 оказался 2 ч и 30 мин, соответственно, при рН 3 а-Гал С полностью инактивировалась за 10 мин

Наибольшую стабильность Пел А проявляла при рН 5, сохраняя через 3 ч инкубации при 40 и 50°С 80 и 60% активности, соответственно Сдвиг рН в более кислую область (рН 4) несколько снижал стабильность фермента через

3 ч инкубации при 40 и 50°С Пел А сохраняла 70 и 40% исходной активности, соответственно При 60°С фермент быстро инактивировался терял 50% исходной активности за 15 мин при значениях рН 5-6, и за 10 мин - при рН 4

Фитазы применяются в качестве кормовых добавок, поэтому важной характеристикой является стабильность фермента при 37-39°С в течение 2-3

4 (время прохождения корма через пищевой тракт) При 37°С Фит А Р сапезсет сохраняла значительную часть (не менее 95%) исходной активности в диапазоне рН 4-6 через 2 ч инкубации, однако при рН 7 фермент практически полностью терял активность уже за 5 мин инкубации При повышении температуры до 50 и 60°С период полуинактивации фермента при рН 4-5 составил 5 и 3 мин, соответственно

Нами было исследовано Таблица 11 Влияние различных добавок на влияние на стабильность Фит А стабильность Фит А Р сапехсеп* в растворах ряда веществ, которые традиционно применяются для повышения стабильности ферментов в водных растворах (см табл И) Наилучшие результаты по стабилизации Фит А были получены при использовании сорбита, сахарозы, лактозы и арабинозы -стабилизационный эффект составил от 40 до 55% (в сравнении с экспериментом без добавок стабилизатора)

(60°С, рН 5, время инкубации 15 мин)

Вещество- Концен- Стабилизацион-

стабилизатор трация,% ный эффект, %

Сорбит 30 55

Сахароза 30 46

Лактоза 15 43

Арабиноза 30 42

Глицерин 30 38

Галактоза 10 38

Крахмал 10 34

Мальтоза 30 16

III. ПРИКЛАДНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ФЕРМЕНТОВ

3.1 Оценка эффективности применения ферментного препарата на основе ре ком б ива нтн ой Пел A P.canescens в процессах получения соков

Оценку эффективности возможного применения ферментного препарата на основе рскомбинантной Пел A P.canescens при производстве соков проводили на примерах получения сока из клюквы и осветления яблочного сока. В качестве внутренних стандартов были взяты два известных на рынке коммерческих ферментных препарата, созданные специально для производства соков - «Rapidase Press» и «Rapidase С-SOL» компании «Gist-Brocades/DSM».

Получение сока из ягодного сырья — особенно в случае ягод дикорастущих сортов с большим содержанием пектина — без применения ферментативной обработки затруднительно: ягодная мезга обладает низкой дренажной способностью, что затрудняет сокоотдачу. Использование ферментов позволяет увеличивать выход сока и значительно уменьшить его вязкость. В экспериментах по получению сока из клюквы ягодную массу (50 г гомогенизированной клюквы) обрабатывали (1.5 ч при 40°С) ферментным препаратом #П-1.2, содержавшим рекомбинантную Пел А (дозирование препарата проводили по массе - в % относительно ягодного сырья), и определяли объем н вязкость полученного сока. Преимущество ферментативной обработки по сравнению с контролем (в отсутствие фермента) очевидно: выход сока в контрольном образце составил 1 мл, а его вязкость - 7,5 м11а*с; после обработки клюквы препаратом Пел А выход сока увеличился до 4-16 мл в зависимости от дозы препарата, а вязкость уменьшилась до 3,3-1,4 мПа*с (см. рис. 3). Для сравнения па рис. 3 приведены результаты обработки клюквы коммерческим ферментным препаратом «Rapidase Press»: препарат Пел А #П-1.2 не уступал коммерческому препарату в исследуемом диапазоне дозировок ферментных препаратов.

§

ts

16

j

- i4

я 12

3 10

I Í щ д А о

О |

о 4 2

а

ш-1.г

"Rnpádase Presa"

ГЙ

2 3 4

2 3 4

б)

2 3 4

2 3 4

Рисунок- 3. Выход сока (о) и его вязкость (б) при обработке 50 г клюквы (1,5 ч, 40°С) ферментными препаратами Ш-1.2 и «Rapidase Press». Массовая доля ферментных препаратов Относительна ягодного сырья составила 0,05% (2), 0.01% (3), 0,002% (4) и 0% -контроль в отсутствии фермента (1%

m-i.2

с Press11

Была исследована способность ферментного препарата #П-1 2 осветлять (депектинизировать) коммерческий неосветленный яблочный сок Осветление сопровождалось уменьшением вязкости сока и его депектинизацией с последующей флокуляцией коллоидных частиц Критерием эффективности действия ферментов служила минимально возможная доза ферментного препарата, которая за 2,5 ч при 45°С полностью разрушала бы высокомолекулярную фракцию сока (Донченко JIВ , 2000) Было установлено, что минимальная доза пектинлиазного препарата #П-1 2, необходимая для эффективной обработки 1 л сока, составляет 0,5 мг по белку (рекомендуемая производителем доза коммерческого ферментного препарата «Rapidase С-80L», выбранного нами для сравнения, составляет 0,43-0,57 мг белка на 1 л сока)

3.2 Гидролиз вторичного продукта переработки сои ферментным препаратом на основе рекомбинантной а-Гал С

Вторичный продукт, образующийся при переработке сои («Soy Solubles»), содержит, по данным ВЭЖХ, 35,5% моно- и олигосахаридов (в том числе 2,8% раффинозы и 12% стахиозы) Одна из возможностей утилизации данного продукта заключается в переработке его в легко сбраживаемые сахара

Для гидролиза «Soy Solubles» были использованы ферментный препарат #АГЛ(С)-6 2, содержащий рекомбинантную а- Гал С, ферментный препарат

#911 2, полученный с помощью исходного штамма-реципиента Р canes-cens PC А 10 и коммерческий а-галактозидаз-ный препарат «a-Gala-ctosidase DS» компании «Amano Enzyme Inc» В ходе эксперимента следили за изменением качественного состава «Soy Solubles» методом ВЭЖХ (результаты, полученные через 48 ч гидролиза при 40°С, приведены на рис 4) Обработка «Soy Solubles» препаратом #АГЛ(С)-6 2 привела к исчезновению пиков стахиозы и раффинозы и значительному увеличению содержания

з

Рисунок 4 Состав продуктов гидролиза «Soy Solubles» (а) ферментными препаратами #АГЛ(С)-6 2 (б), «a-Galactosidase DS» (s), #911 2 (г), и смесью препаратов #911 2 и #АГЛ(С)-6 2 (д), определенный методом ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой 1 - фруктоза, 2 - галактоза + глюкоза, 3 - сахароза, 4 — раффиноза, 5 - стахиоза Гидролиз вели 48 ч при 40°С

галактозы (рис 4 б) Коммерческий ферментный препарат «a-Galactosidase DS» полностью прогидролизовал все галактоолигосахариды, включая сахарозу (рис 4 в), что объясняется наличием в нем инвертазной активности (сахараза гидролизует сахарозу до глюкозы и фруктозы) Ферментный препарат исходного штамма-реципиента Р canescens #911 2 также обладает инвертазной активностью (рис 4 г), поэтому при совместном действии на «Soy Solubles» препаратов #АГЛ(С)-6 2 и #911 2 были полностью прогидролизованы все галактоолигосахариды, а также сахароза (рис 4 <Э) Таким образом, исполь-зование а-Гал С в комбинации с инвертазой позволяет с высокой эффектив-ностью перерабатывать галактоолигосахариды в моносахариды

3 3 Оценка способности ферментов Р canescens повышать питательную ценность кормов in vitro

Основными источниками растительного белка в кормовых рационах сельскохозяйственных животных и птиц служат бобовые (соя, горох и др), которые характеризуются высоким содержанием галактоолигосахаридов (раффиноза, стахиоза), не усваиваемых организмом, но легко сбраживаемых микрофлорой кишечника с образованием газообразных продуктов Решить эту проблему позволяет использование в качестве кормовой добавки ферментных препаратов, обладающих а-галактозидазной активностью Пектины выполняют функцию структурного полисахарида клеточных стенок бобовых Обработка кормов ферментными препаратами, способными активно разрушать пектин, способствует более полному разрушению клеточной стенки бобовых и тем самым приводит к повышению усвояемости кормов Одним из недостатков кормов растительного происхождения является также присутствие в них фитатов, образующих нерастворимые комплексы с полисахаридами, микроэлементами и белками снижающих, таким образом, питательную ценность корма (наибольшее содержание фитатов наблюдается у бобовых) Введение фитазы в корма животных приводит к гидролизу фитатов с высвобождением значительного количество фосфора, а также кальция, необходимых для правильного развития животных

Для того, чтобы оценить целесообразность применения в качестве кормовой добавки ферментного препарата #АГЛ(А)-4 2, содержащего рекомбинантную а-Гал А Р canescens, мы провели ряд модельных испытаний IV vitro, где в качестве субстрата использовали измельченные соевые бобы (соевую муку) На роль внутреннего стандарта был выбран коммерческий а-галактозидазный препарат «a-Galactosidase DS» Отметим, что оба ферментных препарата обладали практически одинаковой удельной активностью по отношению к иНФГ (14 ед/мг белка и 15 ед/мг белка для «а-Galactosidase DS» и #АГЛ(А)-4 2, соответственно) Критерием эффективности действия а-галактозидазы на соевую муку служил итоговый выход ВС (г/л) в раствор за 3 ч инкубации ферментного препарата, взятого в различных дозировках (5-100 единиц активности по лНФГ на 1 г муки), с водной суспензией соевой муки (50 г/л) при 37°С Как видно из рис 5, ферментный

Рисунок 5. Выход ВС при гидролизе соевой муки (50 г/л, 3 ч при 37"С) ферментными препаратами

#АГЛ(А)-4.2 и «a-Gal acto s id ase DS». Дозировка препаратов - 5 (/), 7.5 (2), 10 (У), 20 00, 40 (Я и 100 (tí) единия а-галактозидазной активности (определенной. па иНФГ) lia 1 г муки, соответственно.

препарат а-Гал А Р canescem не уступал, а при высокой дозировке -превосходил коммерческий а-галактозидазный препарат (взятый в тех же дозировках) в способности разрушать сосвуго муку с образованием ВС.

Мы также исследовали способность ферментного препарата #Ф-17.2, содержащего рекомбннантную Фит A P.canescens, шдролизовать фитаты, входящие в состав природных субстратов (кукурузной и соевой муки). Критерием эффективности действия фитазы служил выход Р; (в % от максимально возможного) в раствор за 3 ч инкубации ферментного препарата с волной суспензией муки (50 г/л) при 37°С. различных значениях рН (от 2,5 до 7,0) и различной дозировке ферментного препарата (75-150 единиц фитазной активности на 1 кг муки), В качестве положительного контроля был взят коммерческий препарат «Natuphos 5000G» компаний «BASF» (монокомпонентный ферментный препарат, содержащий фитазу A A.niger), уже зарекомендовавший себя на рынке ферментных препаратов как эффективная кормовая добавка, способствующая повышению усвояемости фосфора сельскохозяйственными животными. Оба ферментных препарата обладали практически одинаковой удельной активностью (55 ед/мг белка и 46 ед/мг белка по фитату Na для «Natuphos 5000G» и #Ф-17.2, соответственно). Как видно из рис. б, препарат #Ф-17.2 не только не уступал, но в ряде случаев и превосходил коммерческий фитазный препарат по способности гидролизовать фитат, входящий в состав природных субстратов в широком диапазоне значений рН.

Ш

6)

"Ñaruchos S ПО« G"

О "i 5С сд/ifr-муки __________ J

Ш 100 здЧ" w>rn 75 bjtfr.r мум-i

"Natuphos 5ÜÜ0r.',>

□ 15C ÇA1*: --m Q '.К ел/кг муки

□ 75 с-л/кг муки

2.Б 4.0 5.5 Б.О 7J3

Рисунок 6, Выход Pi при гидролизе соевой (а) и кукурузной (б) муки (50 г/л, 3 ч при 37°С) ферментными препаратами ЯФ-17.2 и «Natuphos 5000G» при различных значениях рН. Дозировка препаратов - 75, 100 и 150 единиц фитазной активности (определенной по фитату Na) на I кг муки.

Критерием эффективности in vitro тестов, проводимых на соевой муке, является увеличение выхода не только ВС, но и белка. Пехтинлиаза сама по себе практически не обладала способностью увеличивать выход ВС или белка, однако в сочетании с а-галактозидазой и/или фитазой, приводила к положительным результатам m vitro тестов, причём с заметным синерги-тическим эффектом. Мы провели эксперименты по обработке соевой муки смесями g-Гал А с Пел А (ферментные препараты #АГЛ(А)-4.2 и §П-1.2, взя'ше в соотношении 1:1 по содержанию белка), Фит А С Пел А (ферментные препараты АО-17.2 и #11-1.2, в соотношении 1:1 по белку), а также а-Гал А с Пел А и Фит А (ферментные препараты #АГЛ(А)-4.2, #П> 1.2 и ИФ-\1.2 в соотношении 1:1:1 но белку). В ходе испытаний измеряли выход ВС (г/л) и белка (г/л) в раствор за 3 ч инкубации смеси ферментных препаратов с водной суспензией соевой муки (50 г/л) при 37°С и сравнивали результаты с теоретически ожидаемыми значениями (их получали сложением величин, найденных из экспериментальных данных при индивидуальном использовании каждого из ферментных препаратов в отдельности). Как видно из рис. 7, для всех смесей наблюдался эффект синергизма, т.е. реальный результат значительно превысил теоретически ожидаемое значение. Так, при одновременном действии на водную суспензию соевой муки ферментных препаратов, содержащих рекомбннантные а-Гал А и Пел А, общий выход RC и белка оказался, соответственно, в полтора и два раза выше теоретически определенной величины. В случае смеси, состоявшей из ферментных препаратов рекомбинантных Фит А и Пел A P.canescens, выход ВС превысил теоретически рассчитанное значение примерно в полтора раза, а белка - в три раза. При использовании смеси, содержавшей одновременно три ферментных препарата, выход ВС был на 27% выше, а выход белка — в 4,2 раза выше теоретически ожидаемого значения.

а) б)

Рисунок 7, Теоретически, ожидаемой (свет л не бары) и эксперимента лън с найденный (темные бары) выход ВС (а) и белка (б) при гидролизе соевой муки (50 г/л, 3 ч при 37°С) смесями ферментных препаратов #АП1(А)-4.2 и #ГЫ.% (/); #Ф-17.2 и #П-1.2 (2); #АГЛ(А)-4,2, Щ-1.2 и #Ф-!7.2 У).

выводы

1 Исследована активность и состав ферментных препаратов, полученных с помощью новых штаммов Р canescens, созданных на основе гомологичной экспрессии амплифицированных генов а-галактозидаз А и С, пектинлиазы А и фитазы А, находящихся под контролем промоторов (3-галактозидазы (pbgaS) и ксиланазы (рxylA) Р canescens Доказан высокий уровень экспрессии рекомбинантных ферментов и найдены наиболее активные штаммы продуценты соответствующих ферментов AGL(A)-4-20, AGL(C)-4-6, Pec 23-10 и Phy-215

2 Впервые выделены гомогенные рекомбинантные а-галактозидазы Р canescens а-галактозидаза А (61 кДа, pi 5,1, 27-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к полимерным галактоманнанам, а-галактозидаза С (80 кДа, pi 4,8, 36-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к галактоолигосахаридам

3 Впервые выделена гомогенная рекомбинантная пектинлиаза А (38 кДа, pi 6,7) Р canescens, относящаяся к 1-ой семье полисахаридлиаз Определены кинетические параметры гидролиза различных пектинов и показано, что пектинлиаза А наиболее специфична по отношению к высоко-этерифицированным пектинам

4 Впервые выделена гомогенная рекомбинантная фитаза А (63 кДа, pi 6,3) Р canescens Показано, что фитаза А имеет широкую субстратную специфичность и обладает при этом высокой удельной активностью по отношению к фитатам, в которых способна осуществлять гидролиз пяти из шести имеющихся фосфатных групп

5 С помощью кормовых тестов in vitro продемонстрирована высокая эффективность использования ферментных препаратов рекомбинантных а-галактозидазы А и фитазы А Р canescens для повышения питательной ценности растительных кормов Показано, что применение этих ферментных препаратов в сочетании с препаратом рекомбинантной Пел А Р canescens позволяет значительно улучшить результаты кормовых тестов in vitro

6 Показана высокая эффективность применения ферментного препарата рекомбинантной а-галактозидазы С для конверсии в моносахариды вторичного продукта переработки сои, содержащего галакто-олигосахариды («Soy Solubles») Максимальная степень конверсии галактоолигосахаридов достигается при совместном действии а-галактозидазы С и инвертазы Р canescens

7 На примерах получения сока из клюквы и осветления яблочного сока продемонстрирована возможность эффективного использования ферментного препарата рекомбинантной пектинлиазы А в пищевой промышленности

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Дзедзюля Е И, Федорова ЕА , Гусаков А В, Синицын А П Водные экстракты злаков и активность ферментных препаратов Комбикорма, 2003, 7, с 51

2 Синицына О А , Федорова Е А , Гусаков А В, Упоров И В, Соколова ЛM, Бубнова Т M, Окунев ОН, Чулкин AM, Винецкий ЮП, Синицын А17 Выделение и свойства внеклеточной фитазы A Pénicillium canescens Биохимия, 2006, том 71, вып 9, с 1260 -1268

3 Серебряный В А, Синицына OA, Федорова ЕА, Окунев ОН, Беккаревич OA, Соколова Л M, Вавилова ЕА , Винецкий ЮЛ, Синицын А П Синтез ксиланолитических ферментов и других карбогидраз в трансформантах гриба Pénicillium canescens с измененным числом копий гена транскрипционального активатора xlnR Прикладная биохимия и микробиология, том 42, № 6,2006, с 665-673

4. Семенова MB, Синицына OA, Морозова ВВ, Федорова Е.А, Гусаков А В, Окунев ОН, Соколова ЛМ, Кошелев АВ, Бубнова ТМ, Винецкий ЮЛ, Синицын АП Использование препарата грибной пектинлиазы в пищевой промышленности Прикладная биохимия и микробиология, том 42, № 6,2006, с 681-685

5. Синицына OA , Федорова ЕА., Семенова MB, Гусаков А В, Соколова ЛМ, Бубнова ТМ, Окунев ОН, Чулкин A M, Вавилова Е А , Винецкий Ю П, Синицын А П Выделение и свойства внеклеточной пектинлиазы Pénicillium canescens Биохимия, 2007, том 72, вып 5, с 699 - 706

6. Синицына OA, Фёдорова Е А., ВакарИМ, Кондратьева Е Г, РожковаА М, Соколова Л M, Бубнова ТМ, Окунев О H, Чулкин A M, Винецкий Ю П, Синицын А П Выделение и свойства а-галактозидаз Pénicillium canescens В печати (2007 г )

7. Semenova MV, Ustinov В В, Grishutm S G, Bukhtoyarov FE, Simtsyna OA, Fedorova EA, Okunev ON, Gusakov AV, Simtsyn A P Fast analysis of fungal multienzyme composition using ion-exchange chromatography International Conference Biocatalysis-2002 'Fundamentals&Applications', June 22-27, 2002, Moscow, Russia, p 133

8 Синицына OA, Федорова ЕА, Вакар ИМ, Семенова MB, Соколова Л M, Окунев ОН, Вавилова ЕА, Бубнова ТМ, Чулкин A M, Винецкий ЮП, Синицын А П Свойства фитазы, пектинлиазы и а-галактозидазы Pénicillium canescens Третий московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития», Март 1418,2005, Москва, Россия, с 212

9. Gusakov А V, Grishutin S G, Ustinov В В, Antonov A I, Skomarovski A A , Salanovich TN, Fedorova EA , Zorov IN, Simtsyn A P Mass spectrometry approaches for characterization of glucoside hydrolases International Conference Biocatalysis-2005

'Fundamentals&Applications', June 19-23, 2005, St Petersburg-Kizhi-Valaam, Russian Federation, p 21

10 Fedorova EA , Simtsyna OA , Vakar IM, Semenova M V, Sokolova L M, Okunev ON, Vmetsky YP, Simtsyn AP Properties of Phytase, Pectin lyase and a-Galactosidase of Pénicillium canescens 4th European Young Cereal Scientists and Technologists Workshop, June 21-July 1,2005, Vienna, Austria

11 Федорова EA, Правильников А Г, Синицына OA, Соколова ЛМ, Окунев ОН, Вавилова ЕА , Бубнова ТМ, Чулкин A M, Винецкий ЮП, Синицын А П Рекомбинантные ферменты Pénicillium canescens а-галактозидаза С and a-i-арабинофуранозидаза А Четвертый московский международный конгресс «Биотехнология состояние и перспективы развития», март 12-16,2007, Москва, Россия, с 273

12. Simtsyna О А , Fedorova Е.А , A G Pravilmkov, Morozova V V, Kondratieva E G, Okunev ON, Vmetsky YP, Simtsyn AP Applications of the recombinant enzymes from Pénicillium canescens m biotechnological processes International Conference Biocatalysis-2007 'Fundamentals&Applications', June 17-22, 2007, Moscow-St Petersburg, Russian Federation, p 54

Подписано к печати Тираж 100 Заказ ПК

Отпечатано на ризографе в ОНТИ ГЕОХИ РАН

Список русских и английских сокращений

Список латинских сокращений названий микроорганизмов

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10

ГЛАВА I. а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 10

1. Природные галактозосодержащие соединения 10

1.1 Галактоолигосахариды 10

1.2 Галактоманнаны, галактоглюкомапнаны 11

2. а-Галактозидазы 14

2.1 Продуценты а-галактозидаз 14

2.2 Гликозил-гидролазные семьи а-галактозидаз 17

2.3 Биохимические свойства а-галактозидаз 17

2.4 Каталитические свойства а-галактозидаз 20

3. Применение а-галактозидаз 25

3.1 Кормовая промышленность 25

3.2 Пищевая промышленность 25

3.3 Целлюлозно-бумажная и текстильная промышленность 26 ГЛАВА II. ПЕКТИНЛИАЗЫ 27

1. Пектин 27

1.1 Основная цепь молекулы пектина 27

1.2 Боковые цепи молекулы пектина 29

1.3 Неуглеводные заместители в молекуле пектина 29

2. Пектин- и пектатлиазы 31

2.1 Структурная характеристика пектин- и пектатлиаз 33

2.2 Каталитические свойства пектин- и пектатлиаз 35

3. Применение пектина и пектинлиаз 37

3.1 Пищевая промышленность 37

3.2 Кормовая промышленность 39

3.3 Текстильная и целлюлозно-бумажная промышленность 39 ГЛАВА III. ФИТАЗЫ 41

1. Фитиевая кислота и её соли 41

1.1 Строение фитиевой кислоты 41

1.2 Содержание лшо-инозит фосфатов в растительном сырье 41

1.3 Физико-химические методы определения содержания фитиевой кислоты в образцах 43

2. Фитазы 44

2.1 Продуценты фитаз 44

2.2 Классификация фитаз 46

2.3 Биохимические свойства фитаз 50

2.4 Каталитические свойства фитаз 53

3. Применение фитаз^58

3.1 Кормовая промышленность 58

3.2 Пищевая промышленность 61

3.3 Медицина 62 ГЛАВА IV. ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ PENICILLIUM CANESCENS

КАК ПРОДУЦЕНТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ 63

ЭКПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 66

ГЛАВА V. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 66

1. Использованные вещества 66

1.1 Ферментные препараты 66

1.2 Субстраты 66

1.3 Прочие реактивы 67

1.4 Хроматографические сорбенты 68

2. Методы 69

2.1. Выделение и очистка индивидуальных ферментов P.canescens 69

2.2 Определение концентрации белка 71

2.3 Определение биохимических характеристик ферментов 71

2.4 Методы определения активности ферментов 71

2.4.1 Определение активности по полисахаридным субстратам 71

2.4.2 Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров 72

2.4.3 Определение пектинлиазной активности 73

2.4.4 Определение фитазной и фосфатазной активности 75

2.5 Определение температурного и рН-оптимума действия ферментов 76

2.6 Изучение термо- и рН-стабильности ферментов 77

2.7 Определение кинетических параметров действия ферментов (Кт, Vm, К.) 77

2.8 Исчерпывающий гидролиз специфических субстратов 78

2.9 Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) продуктов гидролиза фитата Na 78

2.10 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов гидролиза ГМ и галактоолигосахаридов 79

2.11 Изучение влияния эффекторов на активность ферментов 79

2.12 Изучении влияния соков желудочно-кишечного тракта свиней на свойства фитазы 80

2.13 Прикладные испытания ферментов 80

2.13.1 Оценка способности пектинлиазы осветлять яблочный сок 80

2.13.2 Изучение способности пектинлиазы увеличивать выход сока из ягод 81

2.13.3 Конверсия вторичного продукта переработки сои а-галактозидазами 81

2.13.4 Оценка способности ферментов увеличивать питательную ценность кормов /V vitro 82

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 83 ГЛАВА VI. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТО-ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ НА ОСНОВЕ НОВЫХ

ШТАММОВ P.canescens 83

1. Создание новых конструкций на основе штаммов P.canescens 83

2. Характеристика ферментных препаратов, полученных с помощью штаммов P.canescens, несущих гены гомологичных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы 86 ГЛАВА VII. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ а-ГАЛАКТО

ЗИДАЗ А И С, ПЕКТИНЛИАЗЫ И ФИТАЗЫ P.canescens 88

1. Выделение гомогенных ферментов 88

2. Свойства гомогенных ферментов 93

2.1 а-Галактозидазы А и С 94

2.1.1 Субстратная специфичность и классификация 94

2.1.2 рН- и температурные оптимумы активности 98

2.1.3 Стабильность 100

2.1.4 Устойчивость к «термошоку» 102

2.1.5 Кинетические характеристики 104

2.1.6 Влияние эффекторов на активность 1 Об

2.2 Пектинлиаза А 107

2.2.1 Субстратная специфичность 107

2.2.2 рН- и температурные оптимумы активности 109

2.2.3 Стабильность 110

2.2.4 Устойчивость к «термошоку» 110

2.2.5 Кинетические характеристики 112

2.2.6 Влияние эффекторов на активность 112 2.3 Фитаза А 114

2.3.1 Субстратная специфичность 114

2.3.2 рН- и температурные оптимумы активности 116

2.3.3 Стабильность 119

2.3.4 Устойчивость к «термошоку» 121

2.3.5 Кинетические характеристики 122

2.3.6 Влияние эффекторов на активность 122 ГЛАВА VIII. ПРИКЛАДНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ФЕРМЕНТОВ 129

1. Оценка эффективности применения ферментного препарата рекомбинантной

Пел А Р. canescens в процессах получения соков 129

1.1 Получение сока из клюквы 129

1.2 Осветление яблочного сока 131

2. Гидролиз вторичного продукта переработки сои ферментным препаратом рекомбинантной а-Гал С Р.canescens 132

3. Оценка способности ферментов Р.canescens повышать питательную ценность кормов in vitro 135

ВЫВОДЫ 142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК РУССКИХ СОКРАЩЕНИЙ а.к. - аминокислота

БЦХ - бицинхопинантный реагент

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВС - восстанавливающие сахара

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография а-Гал - а-галактозидаза

-Гал - ß-галактозидаза

ГМ - галактомаппан

ГПХ - гельпропикающая хроматография

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ИЭФ - изоэлектрофокусировапие

ИОХ - ионообменная хроматография кж - культуральпая жидкость

КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

Ксил - ксиланаза

К.Ф. - классификация ферментов

ММР - молекулярномассовое распределение o.e. - единицы оптического поглощения

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГК - полигалактуроновая кислота (калиевая соль)

Пел - пектинлиаза и-НФ - и-нитрофенил иНФГ - и-нитрофенил-а-£>-галактопиранозид яНФФ - я-нитрофепил фосфат

САц - степень ацетилирования

СМ - степень метилирования

СП - степень полимеризации

СЭ - степень этерификации

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

Фит - фитаза

ЭГ - эндо-глюканаза

СПИСОК АНГЛИЙСКИХ СОКРАЩЕНИЙ

Fru - фруктоза

Gal - галактоза

Glc - глюкоза

Man - манноза

P¡ - неорганический фосфат

СПИСОК ЛАТИНСКИХ СОКРАЩЕНИЙ НАЗВАНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ

A S

Arxula-Arx. Saccharomyces - Sac.

Aspergillus -A. Streptococcus - Str.

B T

Bacillus - B. Thermoanaerobacterium - Ther.

C Thermomyces - Therm.

Candida - Can. Thermologa - Th.

E Trichoderma - Tr.

Emericella - Em. Eschericia - E. K

Klebsiella-Kl. L

Lactobacillus - Lact. M

Mortierella - Mort. P

Pénicillium - P. Pichia - Pich.

Pseudoalteromonas - Pseud. R

Rhizopus - Rh. Rhodothermus - Rhod.

ВВЕДЕНИЕ

Промышленная технология ферментных препаратов начала активно развиваться в последней четверти XX века. К настоящему времени ферментные препараты стали мощным средством трансформации практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов [1]. Применение ферментных препаратов в сельском хозяйстве, кормовой и пищевой промышленности позволило существенно повысить усвояемость кормов, расширить сырьевую базу кормопроизводства, увеличить глубину переработки пищевого сырья, а также улучшить органолептические свойства и создать новые виды пищевых продуктов.

Использование промышленных g-галактозидазных препаратов делает возможным более широкое использование различных соевых продуктов в качестве пищи животных и человека [2-4]. а-Галактозидазы применяются для модификации галактомапнанов с целью придания им требуемых в пищевом производстве реологических свойств, а также в процессах конверсии растительных отходов.

Добавка фитаз к кормам животных на основе семян является эффективным способом повышения доступности фосфора и, таким образом, позволяет сэкономить неорганический фосфат при составлении рационов и снизить содержание непереваренного фосфора на 30-60% [1, 5-10]. Применение промышленных фитазных препаратов улучшает костную минерализацию, усвоение белков и аминокислот в организме животных [11].

Пектинлиазные препараты незаменимы при переработке ягод, овощей и фруктов [12]. Пектинлиазы используют на разных стадиях технологических процессов изготовления пюре, соков с мякотью и осветленных соков. Широкое распространение эти ферменты получили в виноделии для стабилизации вин.

Ферментная промышленность выпускает большой ассортимент препаратов микробного происхождения. Значительную часть валового количества ферментов, особенно гидролитических, производят с помощью культивирования микроскопических грибов. При этом все более значимое место занимают препараты на основе грибов рода Pénicillium. Рост интереса к этим продуцентам как к промышленно значимым объектам вызван тем, что Pénicillium sp. продуцируют внеклеточные ферменты широкого спектра действия, в том числе ксиланазы, целлюлазы, пектиназы, амилазы, фитазы, протеазы и др. Известны механизмы, с помощью которых можно добиться высокого уровня белковой секреции этими штаммами. Следует отметить безопасность их использования в пищевой и кормовой промышленности и в фармакологии.

В нашей лаборатории на протяжении ряда лет изучаются состав и свойства внеклеточного ферментного комплекса мицелиалыюго грибного штамма Pénicillium canescens. Среди секретируемых им ферментов нами были обнаружены, в том числе, две а-галактозидазы различной специфичности, пектинлиаза и фитаза, однако уровень секреции этих ферментов оказался низким. Для получения препаратов с высокими содержанием перечисленных выше ферментов, пригодных для промышленного применения, совместными усилиями с нашими коллегами из Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН и из ФГУП ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов были созданы рекомбинантные штаммы P.canescens с повышенной продукцией собственных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы. Новые штаммы P.canescens содержали мультикопированные гены гомологичных ферментов под контролем сильных промоторов.

Целью данной работы явилось изучение биохимических, физико-химических характеристик и каталитических свойств рекомбинаптиых а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы, получепных на основе новых штаммов P.canescens, а также оценка эффективности их действия на природные объекты, содержащие галактоолигосахариды, галактоманнапы, пектины и фитаты.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести скрининг новых трапсформаптов P.canescens и выбрать среди них оптимальные для получения промышленных ферментных препаратов с высокими активностями а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы;

- разработать (оптимизировать) схему выделения в гомогенном виде рекомбинантных а-галактозидаз, пектинлиазы и фитазы из ферментных комплексов, секретируемых новыми штаммами P.canescens-,

- исследовать свойства выделенных ферментов;

- разработать лабораторные методики оценки эффективности применения а-галактозидаз, пектиплиаз и фитаз в различных процессах переработки и модификации растительного сырья;

- с помощью разработанных методик оцепить эффективность применения а-галактозидаз, пектиплиазы и фитазы P.canescens (а также их смесей и препаратов на их основе) для нужд кормовой и пищевой промышленности, используя в качестве эталонов для сравнения коммерчески доступные промышленные а-галактозидазные, пектинлиазные и фитазные препараты.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА I. а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ 1. Природные галактозосодержащие соединения

Остатки £>-галактозы (см. рис. 1) существуют в природе в виде двух основных форм [13, 14]: во-первых, как звенья боковых цепей различных полисахаридов (р-1,4-маипанов и Р-1,4-глюкомаинанов, занимающих второе место по распространённости в древесине мягких пород деревьев после целлюлозы); во-вторых, как составляющая часть олигосахаридов (мелибиозы, раффинозы, стахиозы, вербаскозы и пр.). Олигосахариды, содержащие а-£)-галактозидные остатки, широко распространены у растений (в составе семян, корней, клубней) [4]. Также Л-галактоза входит в состав углеводной части гликопротеинов и гликолипидов.

Рисунок 1. Строение а-.0-галактозы.

1.1 Галактоолигосахариды

В молекулах олигосахаридов галактоза присоединена к невосстанавливающим концам молекул: мелибиоза (01с(а1,6)-0а1), раффиноза (Рги(а1,2)-01с(а1,6)-0а1), стахиоза (Рги(а1,2)-01с(а1,6)-0а1(а1,6)-0а1) [4, 15]. Самым распространенным галактозосодержащим олигосахаридом растений является раффиноза (см. рис. 2а, [4]). Многие растения содержат также более сложные олигосахариды, например стахиозу и вербаскозу. Последние имеют сходное строение (см. рис. 26).

Раффиноза, стахиоза и вербаскоза являются основными олигосахаридами сои [16]. Необработанные соевые бобы содержат 0.38 и 3.34% сухого веса раффинозы и стахиозы, соответственно [3]. Сухое соевое молоко содержит 10.25, 1.33 и 8.47% по массе сахарозы, раффинозы и стахиозы, соответственно [17]. а) б)

СНгОН

ОН

-а н

ОН О

ОН

-а ноне

О. щон ш он он н он он щ ш4

I/ он

-О н он он он ОН щ

СИзОН он н ноне о. он

НС)\ сцон

ОН он п

Рисунок 2. Строение раффинозы (а), стахиозы и вербаскозы (б); п=1-2.

1.2 Галактоманнаны, галактоглшкоманнаны

Галактоглюкоманнан/О-ацетилгалактоглюкоманнан - преобладающий (до 25% сухого веса) компонент гемицеллюлоз мягких (хвойных) пород деревьев, см. табл. 1. Основная цепь галактоглюкоманнаиа сформирована Р-1,4-связанными остатками £)-маннопиранозы и £>-глюкопиранозы, а боковые цепи -а-1,6-присоедипенными остатками £)-галактозы. Кроме того, в среднем каждое четвёртое звено основной цепи (0-глюкопираноза) ацетилировано по С-2 или С-3 атомам. Выделяют два типа галактоглюкоманнанов: с высоким и низким содержанием галактозы. В первом, составляющем 5-10% сухой массы хвойной древесины, соотношение «галактоза : глюкоза : мапноза» можно представить как 1:1:3; во втором, составляющем 10-15% от сухой массы хвойной древесины, - как 0.1:1:4 [ 18-20].

Таблица 1. Состав галактоглюкоманнанов мягких пород деревьев [19].

Содержание, Состав мономеров

Галактоглнжоманпан % от массы Гликозидныс Соотно- Тип присо- 6 СП6 сухой древесины остатки шение единения

Р-О-Мап ра 3 1->4

Растворим в воде 5-10 р-£М31с р 1 1—+4 >100 сх-0-Са1 р 1 1->6

О- Ас 0.24 р-£>-Мап р 3 1—+4

Растворим в щелочи 10-15 р-£М31с п 1 1—+4 >100 а-Я-ва! р 0.1 1—6

О-Ас 0.24

Подчеркнуто звено основной цепи б«СП» - степень полимеризации

Галактоманнан («ГМ») имеет сходную, но более простую структуру [18, 20, 21]. ГМ представляют собой гетерополисахариды, построенные из остатков D-галактозы и D-маппозы. Основная цепь ГМ состоит из р-1,4-связанпых остатков D-маннозы, а боковые ветви - из единичных звеньев D-галактозы, присоединённых а-1,6-связями (см. рис. 3). Главная цепь макромолекул ГМ построена, как правило, из мапнозных остатков двух типов: C-4-замещённых и С-4,6-дизамещённых. ГМ в изобилии присутствуют в эпдосперме и зрелых семенах растений [21-23]. Например, они обнаружены в семенах растений из 11 семейств: Annonaceae, Compositae, Comolvulaceae, Ebenaceae, Fabaceae, Lagoniaceae, Malvaceae, Palmae, Solanaceae, Tiliceae, Umbelliferae и, возможно, Cuscutaceae. Особое положение занимают ГМ семейства бобовых (Fabaceae), поскольку на их долю приходится более 90% общего числа исследованных ГМ (см. табл. 2) [24]. В семенах растений ГМ выполняют энергетическую (при прорастании), водоудерживающую (при набухании семян) и защитную функции. Энергетическая функция является основной, поэтому ГМ относятся к группе запасных полисахаридов [24]. Важнейшей характеристикой ГМ, определяющей их физико-химические свойства (плотность, растворимость, вязкость растворов и др.), является соотношение числа маннозных и галактозиых остатков («М:Г») в полимерной молекуле [21, 24]. Этот параметр сильно варьирует в зависимости от источника галактоманнаиа. Так, у ГМ бобовых соотношение «М:Г» варьируется от 1:1 до 5.7:1 (т.е. максимальное содержание галактозы - 50%, а минимальное - 15%), а ГМ некоторых пальм описываются соотношением «М:Г» 50(или 90): 1 (их иногда относят к манпапам).

Отсутствие прочной связи с другими полимерами клетки позволяет извлекать ГМ водной экстракцией. Измельчённые тем или иным способом семена бобовых экстрагируют холодной или горячей водой, после чего полисахариды осаждают этиловым спиртом [24]. В настоящее время в промышленном масштабе производятся три ГМ: из эндосперма семян бобового растения, повсеместно выращиваемого в Индии и Пакистане, - Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub, (гуар) - получают гуараи (guar gum); из плодов Ceratonia siliqua (кароб, рожковое дерево) - карубин (locust bean gum), а из плодов Caesalpinia spinosa L. (дерево тара) получают - в меньших объёмах - тарагалактоманпан (tara gum) [24-26]. Карубин является нейтральным, не образующим гелей полисахаридом с соотношением «М:Г» 3.5-3.8:1 [27, 28]. Степень полимеризации («СП») молекул гуарана больше, чем СП тарагалактоманпаиа, и оба они превышают по СП молекулы карубина [29].

D-Гал i 6 a аН| iD-MaHi m n

Рисунок 3. Схема строения галактоманпанов («классическая»); т - число незамещенных остатков маннозы, может принимать значения от 0 до 4; и - степень полимеризации [24].

Таблица 2. ГМ семян некоторых видов семейства Fabaceae Lindl, или Leguminosae Juss [241.

Вид растения, таксон Выход, % Соотношение £>-маннозы и £>-галактозы

Подсемейство 1. Caesalpinioideae - цельзапиниевые

Caesalpinia cacalaco Humb et Bonpl. 23 2.5

Gleditsia amirphoides Taub 30 2.5

Gleditsia ferox Desf. - 3.8

Cassia alata L. - 2.69

Senna multijuga 23 2.3

Подсемейство 2. Mimosoideae - мимозовые

Lagonichium (Prosopis) farctum 14.2 1.97

Mimosa platyphylla Benth 18.5 0.9

Prosopis cineraria (L.) Druce - 4.65

Подсемейство 3. Faboideae - мотыльковые

Clotalaria verrucosa L. 17.2 2

Sesbania aegyptiaca Poiret 23.3 1.66

Indigofera tinctoria L. 21.3 1.66

Galega orientalis Lam. 11.0 1.07

Anthyllis vulneraria L. 1.8 1.32

Triflorium pretense L. 3.5 1.28

2. а-Галактозидазы

В 1895 году из дрожжей был выделен фермент, способный гидролизовать дисахарид мелибиозу, названный мелибиазой [30, 31]. Позднее, изучение специфичности действия этого фермента на различные углеводные субстраты, содержащие концевые а-О-галактозидные группы, дало основание Вайденхагену изменить название «мелибиаза» на «а-галактозидаза» [4]. а-Галактозидазы (а-Л-галактозид галактогидролазы, КФ 3.2.1.22) катализируют реакцию гидролиза а-1,6-присоединённых галактозных остатков во многих субстратах, включая линейные и разветвлённые олигосахариды, полисахариды и синтетические субстраты [18,20,31-33]. Схема реакции гидролиза представлена на рис. 4.

Рисунок 4. Схема реакции гидролиза, катализируемой а-галактозидазами.

2.1 Продуценты а-галактозидаз

К продуцентам а-галактозидаз относятся большое число микроорганизмов (микроскопические грибы, дрожжи, бактерии), множество растений и ряд животных. а-Галактозидазы широко представлены в растительном мире (табл. 3 [17, 18, 32, 34]). Высокая а-галактозидазпая активность наблюдается в прорастающих семенах [35], где а-галактозидазы осуществляют конверсию олигосахаридов раффинозной семьи. Авторами [17] было продемонстрировано, что при прорастании бобов количество олигосахаридов раффинозной группы уменьшается. Одновременно с этим увеличивается содержание фруктозы, что подтверждает гидролиз фруктозо-содержащих олигосахаридов. Другая функция а-галактозидаз растений - это участие в модификации текстуры созревающих плодов. Например, при созревании папайи (Carica papaya L.) существует прямая корреляция между содержанием и активностью собственной а-галактозидазы и потерей фруктом твёрдости [36].

Большое число исследований посвящено а-галактозидазам микроорганизмов. Среди них основная часть работ касается внеклеточных ферментов, в том числе, а-галактозидаз, секретируемых грибными штаммами родов Aspergillus, Penicililum, Thermomyces, Trichodema (см. табл. 3).

Таблица 3. Свойства а-галактозидаз из различных источников.

Источник I Тип, Мг(кДа)" Pl Оптимум Гидр. Лите

1 семья pH Т,°С субстр. ратура

Грибы

Absidia corymbifera 36 82 [37]

A.awamori 4.7 [2]

A.awamori NRRL 4869 36 5.0 60 О6 [3]

A.ficuum NRRL 3135 -/70.8/- 6.0 60 [38]

A.fumigatus IMI 385708 27/36 [39]

A.niger a-Gal I AglC,36 350/94/-80 4.15 4.5 60 О a-Ga! II a-Gal III AglB,27 AglB,27 I17/64/-52 117/64/-52 4.5 1.7 4.5 4.5 60 60 ГМ>0° ГМ>0 [18,14] a-Ga! IV AglB,27 117/64/-52 4.8 4.5 60 ГМ>0

A.niger a-Gal I AglB,27 -/67.5/~54 4.2 4.5 50-55 0>ГМ a-Gal II AglB,27 -/67.5/~54 4.4 4.5 50-55 0>ГМ [2,40] a-Gal III AglB,27 -/66/~54 4.6 4.5 50-55 0>ГМ

Art/gerNRRL 326 27/26 5.0 55-60 [3]

A.niger Novozymes ALPHA-GAL 27/36 4.0 50 [41]

A.niger AglC,36 -/79.7/102.3 4.56(т.)г, 4.15(э.) [20]

A.niger AglB,27 -/54/48.8 4.6(т.), 4.2,4.4, 4.6(э.) [14]

A.oryzae NRRL 447 27/36 4.5-5.0 50-55 [3]

A.tamarii a-Gal I 265 a-Gal II a-Gal III 254 -/56/- 4.8 ГМ,0 [42,43]

Candida guilliermondii H-404 a-Gal I a-Gal II 270/64/270/64/- 6.16 6.21 [44, 45]

Cladosporium cladosporodies (Fres.) de Vr. 7.0/5.0Д О [33]

Mortierella vinacea 27 60/51-62/41.3 ГМ,0 [46,47]

P.purpurogenum 27 -/67/- 4.1 ГМ,0 [48,2]

P.ochrochloron 57.5/60.2/- 4.5 50 [26]

P.simplicissium, a-Gal I a-Gal II a-Gal III 27 ГМ,0 О ГМ,0 [30, 15]

Therm. lanuginosus 27 57 5.2 4.5-5.0 65-70 о,гм [13,49]

Tr.reesei RUT C-30 50/50/- 5.2 4.0 60 ГМ,0 [2, 50]

Бактерии

Bacillus ovatus a-Gal I a-Gal II 255/85/241.5/80.5/- 5.9-6.4 6.3-6.5 [51]

B.stearothermophilus 246/82/- 7.0-7.5 60 [51]

320.9/80.3/- 6.0-7.5 75 [32,51]

Bifidobacterium sp. 27/36 О [521

Eschericia coli 36 -50 6.8 37 [51,53]

E.coli Raf A 36 324.8/81.2/- 7.2 80-85 [51]

E.coli Mel A 36 101.2/50.6/- 8.1 [51]

Lactobacillus salivarius 36 80/80/- 5.5-6.0 50 [51]

Источник Тип, семья Mr (кДа)" Pi Оптимум Гидр, субстр. Литература pH Т,°С

Pseudoal tero monas sp. KMM701 36 195/-/- 6.7-7.7 Í54]

Pseud.fl uorescens AglA,27 46/46/45,9 8.2 50 ГМ>0 [22]

Руспороги.ч cinnabarinus 210/52/- 5.0 75 о [55]

Rhodothermus marinus 200/50/- 8.5 85 ГМ>0 Г31]

Rhizopus oligosporus 27/36 5.0 55 [3]

Streptococcus mutans 36 320/80/82.022 6.5 80-85 [51,56]

Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum 36 176/-80/- 8.0 77.5 0 [51]

Th. maritima 27/36 124/62/63.6 5.0-5.5 90-95 0 [31,32,51,57

Th.neapolitana 5068 36 61/61/- 7.0-7.5 100-105 [51]

Th.neapolitana NS-E 36 61/61/- 7.0 93 [51,58,59]

Thermus sp. T2 36 >400/55/53.5 6.0 75 ГМ,0 [32]

Thermus brockianus 36 Тетрамер/-/53.8 5.5-6.5 90-93 О(только) [31,32,60]

Дрожжи

Sac.carlsbergensis f 300/150/- [45]

Растения

Carica papaya (папайя) ^ а-ОаШ(мажор) 170/52/- 7.3 [36]

Coffea arabica (кофе) f 27 -/41/- [61,62]

Cucumis meló L. (дыня) a-Gal I a-Gal II 36 36 -/83/82.8 -/84/84.6 7.5-8.5 7.5-8.5 40 40 О О [23]

Glycine max L. (соя) PI P2 27/36 33 31 и 33 5.0 5.5 45 50 О О [17,34]

Lens culinaris (чечевица) a-Gal I a-Gal II 160/40/40 8.0 6.1 4.7 [63]

Lycopersicon esculentum (томат) 27 39.8 4.91 [35]

Oryza sativa (рис) 27/36 40 45 [64]

Phaseolus aureus (золотистая фасоль) тетрамер [65]

Phaseolus vulgaris (фасоль) 27 149.3/38.6-39.6/- [17,66]

Sesbania margínala (сесбания) I II 27/36 40 160 [17]

Trifolium repens (белый клевер) a-Gal I a-Gal II a-Gal III a-Gal IV 41-43/41-43/-/41/ /41/ /41/ 5.5 3.6-4.4 4.2-4.8 4.2-4.6 О ГМ,0 ГМ,0 ГМ,0 [21]

Vigna unguiculata (фасоль) 33 Г17]

Vitis labruscana (виноград) J 40-45 7.0 [67]

Человек

Homo sapiens (плацента) А В 27 27 103/57.7/ 117/47.7 4.7 4.4 4.4 4.4 [68] а) Молекулярная масса, определенная по данным гельфильтрации/ДДС-фореза/теоретических расчетов (на основании анализа аминокислотного состава) б) О - олигосахариды в) ГМ>0 - фермент более активен по отношению к полимерным галактоманнанам, чем по отношению к олигосахаридам г) т-теоретические данные (на основании анализа аминокислотного состава), э - экспериментальные данные д) рН-профиль активности определяли по гидролизу иНФ-а-О-галактопиранозида/мелибиозы

2.2 Гликозил-гидполазпые семьи а-галактозидаз

На основании сходства первичной структуры и гидрофобного кластерного анализа большинство а-галактозидаз были отнесены к двум различным семьям гликозил-гидролаз - 27-ой и 36-ой. Практически все а-галактозидазы эукариот, включая AglA и AglB A.niger, принадлежат 27-ой семье. 36-ая семья в основном состоит из бактериальных а-галактозидаз, а также некоторых ферментов грибного происхождения, например AglC A.niger и Agl2 T.reesei [14]. а-Галактозидазы 27-ой семьи проявляют высокую степень гомологии а.к. последовательностей; а ферменты 36-ой семьи - низкую [23, 32] (за исключением AglC A.niger и Agl2 T.reesei, для которых гомология составляет 64% [14]). Сравнение ферментов 27-ой и 36-ой семей показало, что они отдалённо родственны и образуют суперсемью (superfamily) [18,22,23,32].

Сравнительно недавно в литературе стала появляться информация о существовании а-галактозидаз, которые - согласно филогенетическому анализу на основе аминокислотных последовательностей - пе могут быть отнесены ни к одной из двух вышеупомянутых семей гликозил-гидролаз. К таким ферментам относится а-галактозидаза Agl3 Tr.reesei, не содержащая консервативных областей ни 27-ой, ни 36-ой семьи [28]. Другой пример - группа щелочных а-галактозидаз растений, гены которых проявляют низкую гомологию с известными про- и эукариотическими а-галактозидазами, принадлежащими 27-ой и 36-ой семьям, по высоко гомологичны семье т.п. «белков набухания семян» (seed imbibition proteins, «SIP»): степень гомологии внутри кластера «щелочные а-галактозидазы/SIP» составляет порядка 56-76%. Эта, до сих пор практически не охарактеризованная а-галактозидазная семья растительных гликозил-гидролаз с пейтралыю-щелочиым pH-оптимумом, участвует в ключевом процессе метаболизма галактозилолигосахаридов, происходящем во время прорастания семян и транслокации первичных продуктов фотосинтеза олигосахаридов раффинозпой группы [23].

2.3 Биохимические свойства а-галактозидаз

Молекулы бактериальных а-галактозидаз, как правило, обладают большим размером (50-80 кДа), чем молекулы грибных (40-50 кДа) и растительных (30-40 кДа) ферментов (см. табл. 3, [4,13]).

У большинства ферментов 36-ой семьи гликозил-гидролаз (например у а-галактозидаз Str.mutans и Raf A E.coli) молекулярная масса мономера составляет -80 кДа. Они - вместе с другими а-галактозидазами, молекулярная масса которых -80-85 кДа объединены в одну группу бактериальных а-галактозидаз. Молекулы представителей другой группы характеризуются меньшими массами ~50-65 кДа. Большинство ферментов второй группы были выделены из экстремально термофильных бактерий, растущих при Т>80°С, - в основном из родов Thermus и Thermotoga [31, 51]. а-Галактозидазы растительного происхождения обычно представлены двумя формами: высокомолекулярной 120-170 кДа и низкомолекулярной 20-50 кДа (например, a-Gal II Carica papaya [36], a-Gal I Lens culinaris и а-галактозидаза Phaseolus vulgaris), в то время как для микробных а-галактозидаз характерна лишь одна молекулярная форма (как, например в случае ферментов Lact.salivarius [51], P.ochrochloron [26], Mort.vinacea [46, 47], Tr.reesei [50], Thermotoga sp. [32], Ps.fluorescens [22]). Однако существует ряд исключений из этого правила. К таковым относится, например, ферменты грибного происхождения - a-Gal II, III и IV A.niger, гомогенные по данным хроматографии на сефадексе G-200 и ДЭАЭ-целлюлозе, по распадавшиеся на две активные формы при прохождении через колонку с карбоксиметилцеллюлозой [4, 14, 18]. К тетрамерам среди грибных а-галактозидаз относятся a-Gal I A.niger и a-Gal I и II Can.guilliermondii [14, 18, 44, 45]. Результаты исследований бактериальных а-галактозидаз дают основание утверждать, что молекулы а-галактозидаз Mel A E.coli, Th. maritime и Ther.polysaccharolyticum - димеры [31, 51, 57], молекулы a-Gal I и II B.ovatus, а также фермента B.stearothermophilus построены из трёх субъединиц [51], а-галактозидаз E.coli К-12, Raf A E.coli и Str.mutans [51, 56] - из четырех субъединиц, а а-галактозидаза Thermus sp. Т2 - вообще октамер [32]. Олигомерная структура доказана и для дрожжевой а-галактозидазы Sac. carlsbergensis.

Большая часть описанных грибных а-галактозидаз - кислые белки, значения р! которых лежат в слабокислой области pi 4-6 (см. табл. 3). Среди ферментов растительного происхождения встречаются представители с щелочным значением pi: например, a-Gal II Lens culinaris (чечевица) с pi 8.0 [63], а также а-галактозидазы 36-ой семьи гликозил-гидролаз - a-Gal I и II Cucumis meló и Cucumis sativus (дыня), а-галактозидаза Zea mays (кукуруза, [http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/fam/GH36.html], [4]). а-Галактозидазы являются, как правило, гликопротеинами [2]. Степень гликозилирования и состав углеводной части зависит от происхождения фермента. Так, например, а-галактозидаза Sac.carlsbergensis (степень гликозилирования 57%) содержит в составе углеводного компонента маннозу (90-95%), глюкозу (7%) и глюкозамин (~1%) [42]. а-Галактозидаза A.niger также является гликопротеином и содержит маннозу и N-ацетилглюкозамин в соотношении 3:1. Изучение связи между белковой и углеводной

частью молекулы этого фермента указывает на то, что белковая часть молекулы связана с N-ацетилглюкозамином через остаток аспарагина [69]. Фермент из семян чечевицы Lens culinaris - гликопротеин, гликозидная часть которого содержит глюкозу и маннозу и связана с белковой частью также через аспарагин [63]. a-Gal I, II, III из A.tamarii являются гликопротеипами и содержат N-ацетилглюкозамин, маннозу и галактозу в молярной пропорции 1:6:1.5 [45].

Целый ряд исследований указывает па присутствие в молекулах а-галактозидаз дисульфидных S-S связей, образуемых SH-группами. Подтверждением служит тот факт, что ферменты полностью ингибируются ионами Ag+, Hg+ [4, 3, 13, 59], а также хлормеркурибензоатом.

Температурный оптимум активности большинства грибных а-галактозидаз лежит в диапазоне 50-60°С, растительных - в диапазоне 40-50°С, в то время как среди бактериальных ферментов, например из Thermoanaerobacterium sp., не редко встречаются термофильные с температурным оптимумом 75-105°С (см. табл. 3). рН-Оптимум активности бактериальных а-галактозидаз лежит в слабощелочной области значений рН 6.0-8.5, а для грибных и дрожжевых ферментов характерен кислый рН-оптимум активности (рН 3.5-5.0). Ферменты растительного происхождения проявляют максимум активности как в кислой, так и в щелочной области (от рН 4.2 до рН 8.5). Интересно, что а-галактозидаза Physarum polycephalum обладает двумя рН-оптимумами активности (при значениях рН 3.5 и рН 6.75 [70]). По предположению авторов это указывает на наличие двух молекулярных форм фермента.

Наибольшую стабильность а-галактозидазы обнаруживают при температурах 30-50°С и рН 4-5. Однако в литературе встречаются примеры более термо- и рН-стабильных ферментов: так, а-галактозидаза термофильного микромицета P.duponti при 60°С сохраняла активность в течение 2 ч [71]. Самыми термотолерантными являются а-галактозидазы бактериального происхождения. Фермент из Th.polysaccharolyticum при рН 7.0 через 36.5 ч сохраняет 88% исходной активности при 65°С, и 84% - при 70°С [51]. а-Галактозидаза Th.neapolitana сохраняет 75% активности после инкубации в течение 4 ч при 80°С [58]. Период полуинактивации а-галактозидазы Thermus .brockianus ITI360 при 80°С оказался равным 17 ч, а при 92°С - 1.5 ч, для ферментов Th.maritime и Th.neapolitana 5068 этот показатель при 85°С составил 6.5 и 9 ч, соответственно [57, 59].

2.4 Каталитические свойства а-галактозидаз

Установлено, что для проявления активности а-галактозидазой субстрат должен удовлетворять двум основным требованиям: наличию пиранозного кольца и соответствию расположения -Н и -ОН групп при С-1, С-2, С-3 и С-4 атомах a-D-галактозной конфигурации (см. рис.4). Этим требованиям отвечают такие соединения, как, например: синтетические производные D-галактозы (метил-, этил-, фенил-, о/л/лмштрофенил- и 4-метилумбеллиферил-а-/)-галактопирапозиды), галакто-олигосахариды (мелибиоза, раффиноза, галакипол, стахиоза, лихиоза, вербаскоза), а также галактомапнаны, галактолипиды, вещество крови В [4,13, 61, 72] и пр.

Существуют две схожие системы классификации a-галактозидаз в соответствии с субстратной специфичностью. Согласно первой системе, a-галактозидазы могут быть разделены на две группы. В первую группу входят ферменты, проявляющие активность только по отношению к олигосахаридам с низкой СП (мелибиоза, раффиноза, стахиоза и фрагменты прогидролизованпых галактоглюкомапнанов). К ним относятся а-галактозидазы 36-ой семьи гликозил-гидролаз. Ко второй группе относят ферменты, активные по отношению к полимерным субстратам (при гидролизе которых может выпадать полимерный осадок [13,21, 49]). При этом они, как и a-галактозидазы из первой группы, могут гидролизовать «короткие» олигосахариды. Это ферменты 27-ой семьи гликозил-гидролаз [13, 18, 31]. По другой системе классификации эукариотические а-галактозидазы могут быть разделены на три группы. В первую группу входят ферменты (например, бактериальная a-галактозидаза Thermus sp., a-Gal I Morí.vinacea и a-галактозидазы дрожжей), действующие только па «концевые» a-галактозидные группы (присоединённые с невосстанавливающего конца молекулы ГМ). Ферменты из второй группы (например, a-галактозидазы P.purpurogenum и A.niger) гидролизуют только «внутренние» a-галактозидные остатки [32]. Последняя группа содержит ферменты (например, AGL I P.simplicissium, a-Gal II M.vinaceä), действующие па оба типа галакгозных групп [15, 32, 46]. В целом, на специфичность а-галактозидаз, гидролизующих полимерный субстрат, влияют два фактора: соотношение мопомерных звеньев «М:Г» в полисахариде и распределение остатков галактозы вдоль главной (маннозной) цепи ГМ [24]. Добавим, также, что различия в субстратной специфичности и активности ферментов из разных гликозил-гидролазных семей могут быть обусловлены особенностями третичной и четвертичной структуры их молекул. Так, большинство ферментов 36-ой семьи (например, AGLII Tr.reesei) - преимущественно крупные белки с тетрамерной структурой, а а-галактозидазы 27-ой семьи, как правило - мономеры небольшого размера [18],

Для определения активности а-галактозидаз используют как природные (мелибиоза, раффиноза и стахиоза), так и синтетические (и-нитрофенил- и 4-метилумеллиферил-а-О-галактопиранозиды) субстраты. Однако наиболее часто используемым («модельным») субстратом для определения а-галактозидазной активности является л-нитрофенил-а-Д-галактопиранозид («гсНФГ»). Как правило, гидролиз лНФГ протекает по простой кинетической схеме, описываемой уравнением Михаэлиса-Ментен (Кт по иНФГ для а-галактозидаз из различных источников варьируют в пределах 0.05-10 мМ, а значения Ут -в пределах 0.1-30 мкМ/с, см. табл. 4). Однако отмечались случаи более сложной кинетики, не подчиняющейся классическому уравнению (например, в случае а-галактозидаз из A.niger и АЛатаги, для которых наблюдалось ингибирование субстратом при концентрациях выше 1.26 мМ) [45].

Помимо гидролазной а-галактозидазы могут обладать трансферазной активностью, т.е. способностью осуществлять реакцию переноса галактозного остатка на молекулу акцептора, которыми могут быть как углеводы, так и другие соединения (спирты, фенолы). Следует отметить, что трансгликозилирование обычно проявляется в заметной л | степени при достаточно высоких (10" -10' Ми выше) концентрациях акцептора. В 1979 г. Дей предложил следующую схему трансгалактозилазной активности а-галактозидазы сладкого миндаля [4]:

Гликозил—О-И + Е-Н ->■ Гликозил—Е + Я-ОН

Донор Фермент Промежуточный продукт

Гликозил—Е + Я'-ОН-*- Гликозил-О-Я' + Е-Н

Акцептор Продукт

Дейем также была высказана мысль о возможности катализа реакций переноса тем же центром фермента, который отвечает за его основную (гидролазную) активность, и по тому же механизму действия. Это подразумевает соответствующую модель активного центра фермента: он должен иметь два галактозо-связывающих сайта, а так же гидрофобный сайт [73].

Приведем некоторые известные из литературы примеры трансгликозидазной активности а-галактозидаз. а-Галактозидаза дрожжей, действующая на

Продуцент иНФ-a-D-Gal p оНФ-a-D-Gal p ГМ" Мелпбпоза Раффиноза Стахноза Лнтее

A'm, MM Vm Km, мМ vm A'm vm Km, мМ Ут Кт, мМ vm Кт, мМ У,п ратура

Грибы

A.ficitum 1.462 0.839 [381

A.niger a-Gal I 1.4 1800 6 1 1600 6 a-Gal II 0.22 3600 6 0.39 65 6 [18] a-Gal III 0.27 3000 6 Н.о н.о. a-Gal IV 0.24 2000 6 Н.о н.о.

A. tam art i a-Gal III 1.3 505" 26.3 80' 33.3 1.1° [45]

Therm, lanuginosus 0.5 49.8 r 2.4 2.3 г 11.3 32.4г [13]

Бактер in

В. ovatus a-Gal I a-Gal II 0.2 0.4 20.8 2.3 98.1 5.9

B.stearothermophilus 0.38 12 16.4

E.coli 1.07*10"4 2.33*10"3 3.65*10"4 [51]

E.coli Raf A 0.14 60

E. coli Mel A o j 10

Lact, sal ivarius 0.25 193°

Pseudoalteromonas sp. KMM701 0.29 [54]

Str. mutans 4.4 9.1 197

Ther.polysaccharolyticum 0.29-0.345 200-232B [51]

Th.maritima 0.075 2.1

Thermus sp. T2 4.7 [32]

Thermus brockianus 4.1 11 [60]

Растения

Cucumis meló L. a-Gal I 6 1.8 1.9 [23]

Glycine max L. Pl 1.55 2.43 д [17]

P2 0.76 1.76д 5.34 0.13 д 5.53 0.43 д

Trifolium repens a-Gal II 1.1 212в 7 435" 1/5/10 59/235/333 67 48 в 83 8е a-Gal III 2.7 196в 1/7/1.4 60/250/38 1000 100° [21] a-Gal IV 11.1 476' 5/5/10 125/167/17 120 29°

Человек

Homo sapiens (плацента) A В 1.55 13.1 [68] а) галактоманнаны с соотношением «М:Г» 1:1/1.1:1/1.4:1, Кт — г/100мл, Ут — в мкмоль/(мг*мин) б) Ут - нкат/мг; в) Ут — мкмоль/(мг*мин); г) Ут - ед/мг д) Ут — мкмоль/(мл*мин) концентрированный раствор .D-галактозы, дает олигомерные продукты, 60% которых представлено 6-0-а-/)-галактозил-/)-галактозой. Среди других продуктов обнаружены а-1,3-, а-1,4- и а-1,5-галактобиозы [4]. Во многих работах в качестве донора и акцептора D-галактозной группы используют субстрат яНФГ [2, 21, 39, 43, 45, 49], при этом a-Gal I Trifolium repens и а-галактозидаза A.fumigatus в качестве продукта образуют яНФ-a-Gah (галактобиозид), а ферменты A.niger и Tr.reesei помимо галактобиозида синтезируют еще и «НФ-a-Gab (галактотриозид) [2, 21, 39, 73]. Помимо D-галактозы и яНФГ в качестве акцептора могут выступать другие мопо- и олигосахариды. Например, а-галактозидаза из Can.guilliermondii, используя мелибиозу как акцептор, образует 0-a-D-Gal(l ,6)-0-a-D-Gal(l,6)-D-Glc. Роль акцепторов в реакциях трансгликозилирования для этого фермента могут играть также: D-глюкоза, .D-галактоза, мальтоза, мальтит, 1,4-бутандиол. Кроме того, эта а-галактозидаза способна переносить D-галактозные группы на пентозы (L-арабипозу, D-ксилозу и D-рибозу) и метилпептозы (D-фукозу и Z-рамнозу). Основными продуктами переноса на лактозу, мальтозу и сахарозу являются 0-a-D-Gal(l,6)-0-ß-D-Gal(l,4)-D-Glc, 0-a-D-Gal(l,6)-0-a-D-Glc(l,4)-D-Glc и 0-a-D-Gal(l,6)-0-a-D-Glc(l,2)-ß-D-Fru (раффиноза) [45]. а-Галактозидаза Mort.vinaceae также способна переносить D-галактозильную группу от молекулы мелибиозы-допора на вторую молекулу мелибиозы-акцептора с образованием вербаксотетраозы; если же вместо мелибиозы использовать раффинозу, то образуются стахиоза и вербаскоза [72]. а-Галактозидаза A.fumigatus в качестве акцепторов эффективно использует не только ди-, три- и тетрасахариды, но и олигосахариды с более высокой СП: а-1,4-глюко(мальтоолигосахариды), р-1,4-глюко-(целлоолигосахариды) и Р-1,4-манноолигосахариды, причем последние участвовали в двух последовательных реакциях переноса донора. Для манноолигосахаридов выход продукта достигал 50% при степени полимеризации акцептора 4-6. У олигосахаридов с большей СП галактозилировались внутренние звенья углеводной цепи. Все галактозпые остатки эффективно переносились на первую гидроксильную группу(ы) в С-6 положении олигосахаридного акцептора (это находится в соответствии с неспособностью фермента переносить галактозу на р-1,4-присоединённые ксилоолигосахариды) [39]. Акцептором D-галактозы для а-галактозидазы Tr.reesei могут быть алифатические спирты. Продуктами в этом случае являются алкил-галактозиды [73]. Аналогично, обнаруженный в клубнях Stachey affinis метил^-галактопираиозид, по предположению Като [4], может синтезироваться за счет трансферазпой активности собственной а-галактозидазы.

Продукт реакции (D-галактоза) является ингибитором некоторых а-галактозидаз, причем возможны различные типы ингибирования. Например, конкурентный тип ингибироваиия продуктом реакции был обнаружен для а-галактозидаз A. a\v amor i, A.ficuum, A.ficuum NRRL 3135, Ther.polysaccharolyticum и Tr.reesei, для a-Gal I, II, III и IV A.niger, а также для а-галактозидазы фракции Р2 Glycine max L (K¡=0.65 мМ) [2, 17, 18, 38, 50, 51]. Неконкурентный механизм ингибироваиия продуктом описан для a-Gal I и a-Gal

II A.tamarii, а смешанный - для a-Gal III из того же источника и для а-галактозидазы Mort.vinace [45]. Кроме ингибироваиия продуктом реакции описано ингибирование а-галактозидаз субстратом. Например, иНФГ ингибирует ферменты A.niger (при концентрации иНФГ> 1.26 мМ) [2], Ps.fluorescem subsp. cellulose и Ph.chrysosporium [22], а мелибиоза - а-галактозидазу Glycine max L (ÁT¡ 10 мМ, [45]). Также известны случаи ингибироваиия а-галактозидаз моно- и олигосахаридами, не содержащими в своем составе D-галактозидной группы: а-галактозидаза A.ficuum NRRL 3135 ингибировалась фруктозой (по конкурентному типу), глюкозой и мапнозой (по неконкурентному типу); а-Gal I A.niger ингибировалась в присутствии всех этих моносахаридов, а активность a-Gal

III A.tamarii падала в присутствии фукозы и арабинозы [18,2, 38, 45].

Многими исследователями отмечалась зависимость а-галактозидазпой активности от присутствия ионов металлов. Так, сильный ингибирующий эффект па а-галактозидазы из различных источников оказывают Cu2+, Cd2+, Со2+, Hg2+, Zn2+ и Ag+ (в концентрации от

3+ 2+

0.02 до 10 мМ, [17, 32, 38, 45, 51, 74]). К слабым ингибиторам можно отнести FeJT Fe Mn2+, Ni2+, Ca2+ и Mg2+ [51,44, 74]. Интересно отметить, что в ряде случаев металлы могут служить активаторами а-галактозидазной активности. Например, показано, что а-галактозидазам бактерий для проявления активности необходимо присутствия в л, реакционной среде ионов Мп [4]. Ингибирование некоторых а-галактозидаз органическими соединениями (как, например, SDS) и солями переходных металлов (HgCl2, CdCh и т.п.) объясняется тем, что перечисленные соединения взаимодействуют с сульфгидрильпыми группами молекулы фермента [51, 54]. Например, а-галактозидаза Thermus sp. Т2 ингибировалась и-хлорбензоатом ртути, однако, в результате точечной замены цистеина па аланин эффект ингибироваиия пропал [32]. Наряду с этим, известны случаи ингибироваиия а-галактозидаз органическими соединениями по иному механизму. Было обнаружено, что специфичными ингибиторами а-галактозидаз могут быть N-метилкалистегины (выделены из корней Lucium chínense) - соединения, относящиеся к группе норпсевдотропиповых алкалоидов. Калистегин В2 и N-метилкалистегин В2 конкурентно ингибировали а-галактозидазу Coffea arabica с .£¡=0.86 и 0.47 мкМ, a N-метилкалистегины A3 и В4 - с Кг5.2 и 36 мкМ, соответственно [75].

3. Применение сс-галактозидаз

3.1 Кормовая промышленность

Введение ферментных препаратов в корма преследует две основные цели -повышение их усвояемости и включение в корма трудно усвояемых компонентов [4].

Применение а-галактозидазных препаратов делает возможным более широкое использование различных соевых продуктов в качестве пищи животных и человека. Соя -наиболее часто используемый источник растительного белка в кормах [16, 76] - содержит 55% процентов белка, причем по составу аминокислот соевый белок близок к животному и усваивается на 90% [4]. Одним из недостатков питания бобовыми является присутствие галактозосодержащих олигосахаридов (раффинозы, стахиозы, вербаскозы) [3, 17, 34]. Из-за отсутствия а-галактозидаз в пищеварительной системе млекопитающих галактоолигосахариды сбраживаются анаэробными микроорганизмами кишечника, что приводит к интенсивному газообразованию [3, 13, 17, 31, 41, 51]. Предобработка соевой муки и соевого молока сс-галактозидазами вызывает расщепление раффинозы и стахиозы до усвояемых пищевой системой сахарозы и галактозы и тем самым устраняет этот недостаток соевых продуктов [2-4].

В ряде работ [3, 17, 41, 77, 78] сравнивали эффективность удаления олигосахаридов раффинозной группы в ходе процессов проращивания, замачивания, варки, автоклавирования и ферментативной обработки бобов. Худшие результаты дало замачивание (10-30% гидролиза). Более эффективными было кипячение и автоклавирование (удалялось от 50 до 60% олигосахаридов в зависимости от сорта бобов). Самыми эффективными способами оказались ферментативная обработка сс-галактозидазами (50-100%) и проращивание (60-70%). Проращивание осуществлялось во влажной, тёплой среде. При этом происходила активация ряда собственных ферментов бобов (в том числе и а-галактозидазы), принимающих участие в разрушении олигосахаридов. Для коммерческих целей оптимальной является ферментативная обработка, т.к. она по сравнению с проращиванием требует меньших затрат времени и энергии [41].

3.2 Пищевая промышленность а-Галактозидазы находят применение в пищевой промышленности, например при утилизации отходов производства. Отходом производства сахара из сахарной свеклы является меласса. Расщепляя присутствующую в мелассе раффинозу, а-галактозидаза не только увеличивает выход сахара, но и одновременно способствует формированию

25 кристаллов сахара (небольшие количества олигосахаридов ингибируют процесс кристаллизации сахарозы) [2, 13, 18, 31, 47, 51]. Во многих странах для этой цели используются препараты а-галактозидаз из АЬх1сИа ьрр., ОгстеНа $рр., МоММпасеае [4]. Другой пример использования а-галактозидаз для трансформации отходов пищевой промышленности - гидролиз побочного продукта производства тофу (соевого творога). Ферментативная деструкция сыворотки соевого творога позволяет избежать загрязнения воды, что является критическим фактором для производства тофу [3].

Как упоминалось в начале текущей главы (см. раздел 1.2), в настоящее время в промышленном масштабе производятся три ГМ, используемых в качестве пищевых добавок и гелеобразователей (загустителей): гуараи, карубин и тарагалактоманнап [18, 23, 24, 28, 31, 79]. Изменение реологических свойств таких загустителей осуществляется с помощью галактоманнап-деградирующих ферментов [2, 24, 31, 80-82]. Частично гидролизовапные ГМ (например, гуаровая смола [83]) представляют собой растворимые в воде пищевые волокна, которые включены в группу биологически активных пищевых добавок (БАД) и имеют множество применений в питании. Известно, что Р-манпаиазная цепь не подвержена действию ферментов человека и расщепляется лишь бактериальной флорой толстого кишечника. Набухший ГМ, обволакивая стенки и ворсинки верхних отделов кишечника, замедляет всасывание компонентов пищи, уменьшает последствия диареи, снижает раздражимость пищеварительного тракта, а также увеличивает образование бифидобактерий в кишечнике. Замедленное всасывание липидов в кишечнике снижает и поступление предшественников холестерина в печень, а вследствие этого снижается синтез холестерина [24].

3.3 Целлюлозно-бумажная и текстильная промышленность

Применения а-галактозидаз в целлюлозно-бумажной промышленности обусловлено тем, что они могут усиливать отбеливающий эффект, достигаемый с помощью эпдо-1,4-Р-маннаназ на небелёной сульфатной хвойной целлюлозе [13]. Эффект био-отбеливания может быть повышен также за счёт комбинирования а-галактозидаз с ксиланазами [24, 31]. В текстилыюй промышленности производные ГМ, полученные путем модификации а-галактозидазами, используют как компоненты паст для придания стойкости цветной печати на тканях [24, 84].

выводы

1. Исследована активность и состав ферментных препаратов, полученных с помощью новых штаммов P.canescens, созданных иа основе гомологичной экспрессии амплифицированпых генов а-галактозидаз Л и С, пектиплиазы А и фитазы А, находящихся под контролем промоторов р-галактозидазы (рbgaS) и ксилапазы (рxylÁ) P.canescens. Доказан высокий уровень экспрессии рекомбииантных ферментов и найдены наиболее активные штаммы продуценты соответствующих ферментов: AGL(A)-4-20, AGL(C)-4-6, Pec 23-10 и Phy-215.

2. Впервые выделены гомогенные рекомбннантные а-галактозидазы P.canescens: а-галактозидаза А (61 кДа, pi 5.1, 27-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к полимерным галактоманнанам; а-галактозидаза С (80 кДа, pi 4.8, 36-ая семья гликозил-гидролаз), специфичная по отношению к галактоолигосахаридам.

3. Впервые выделена гомогенная рекомбинантная пектинлиаза А (38 кДа, pi 6.7) P.canescens, относящаяся к 1-ой семье полисахаридлиаз. Определены кинетические параметры гидролиза различных пектинов и показано, что пектинлиаза А наиболее специфична по отношению к высоко-этерифицированным пектинам.

4. Впервые выделена гомогенная рекомбинантная фитаза А (63 кДа, pi 6.3) P.canescens. Показано, что фитаза А имеет широкую субстратную специфичность и обладает при этом высокой удельной активностью по отношению к фитатам, в которых способна осуществлять гидролиз пяти из шести имеющихся фосфатных групп.

5. С помощью кормовых тестов in vitro продемонстрирована высокая эффективность использования ферментных препаратов рекомбинаптных а-галактозидазы А и фитазы A P.canescens для повышения питательной ценности растительных кормов. Показано, что применение этих ферментных препаратов в сочетании с препаратом рекомбинантной Пел A P.canescens позволяет значительно улучшить результаты кормовых тестов in vitro.

6. Показана высокая эффективность применения ферментного препарата рекомбинантной а-галактозидазы С для конверсии в моносахариды вторичного продукта переработки сои, содержащего галактоолигосахариды («Soy Solubles»), Максимальная степень конверсии галактоолигосахаридов достигается при совместном действии а-галактозидазы С и ипвертазы P.canescens.

7. На примерах получения сока из клюквы и осветления яблочного сока продемонстрирована возможность эффективного использования ферментного препарата рекомбинантной пектинлиазы А в пищевой промышленности.

1. Uhlig Н. Industrial enzymes and their applications. John Wiley & Sons, Inc, 1998, 123137, 192-193,396.

2. Manzanares P., Graaff L.H., Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger. purification of a novel a-galactosidase activity. Enzyme and Microbial Technology, 22,1998,383-390.

3. Song D., Chang S.K.C. Enzymatic Degradation of Oligosaccharides in Pinto Bean Flour. J ournal of Agricultural and Food Chemistry, 54,2006, 1296-1301.

4. Вакар И.М. Изучение свойств пативной и рекомбипантной а-галактозидазы А Penicillium canescens. Диплом, МГУ, 2005.

5. Pandey A., Szakacs G., Soccol C.R., Rodriguez-Leon J.A., Soccol V.T. Production, purification and properties of microbal phytases. Bioresource Technology, 77,2001, 203-214.

6. Zyla K. Mould phytases and their application in the food industry. World of Journal of Microbiology and Biotechnology, 8, 42-1-1992,467-472.

7. Cromwell G.L., Coffey R.D., Moneguc H.J., Randolph J.II. Efficacy of Low-Activity, Microbal Phytase in Improving the Bioavailability of Phosphorus in Corn-Soybean Meal Diets for Pigs. J. Anim. Sci., 73,1995,449-456.

8. Соболев A.M. Энзиматичсский гидролиз фитина in vitro и в прорастающих семенах. Физиология растений, 9, выпуск 3, 1962, 334-341.

9. Edited by Whitaker J.R., Voragen A.G.J., Wong D.W.S. Handbook of Food Enzymology. 2003. Marcel Dekker, Inc. 687-707, 829-866, 1029-1041.

10. Zyla K. Phytase applications in poultry feeding: Selected issues. Journal of Animal and Feed Sciences, 10, 2001,247-258.

11. Grassin C., Fauquembergue P. Applications of pectinases in beverages. In: Visser J., Voragen A.G.J. Pectin and pectinases. Elsevier, Amsterdam, 1996, 453-462.

12. Puchart V., Vrsanska M., Bhat M.K., Bicly P. Purification and characterization of a-galactosidase from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Biochimica et Biophysica Acta, 1524, 2000, 27-37.

13. Vries R.P., Broeck H.C., Dekkers E., Manzanares P., Graaff L.H., Visser J. Differential Expression of Three a-Galactosidase Genes and a Single P-Galactosidase Gene from Aspergillus niger. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 2453-2460.

14. Luonteri E., Tenkanen M., Viikari L. Substrate specifities of Pénicillium simplicissium alpha-galactosidases. Enzyme and Microbial Technology, 22(3), 1998, 192-198.

15. Guimaraes V.M., Rezende S.T., Morcira M.A., Barros E.G., Felix C.R. Characterization of a-galactosidases from germinating soybean seed and their use for hydrolysis of oligosaccharides. Phytochemistry 58,2001, 67-73.

16. Ademark P., Larsson M., Tjerneld F., Stalband H. Multiple a-galactosidases from Aspergillus niger: purification, characterization and substrate specificities. Enzyme and Microbial Technology, 29,2001, 441-448.

17. Сипицина О.А. Свойства рекомбинантпых эндоглюкопазы и ксилаиаза пенициллов. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, 2002.

18. Ademark P., de Vries R.P., Hagglund P., Stalbrand H., Visser J. Cloning and characterization of Aspergillus niger genes encoding an a-galactosidase and P-mannosidase involved in galactomannan degradation. FEBS. Eur. J. Biochem. 268, 2001, 2982-2990.

19. Williams J., Villarroya H., Petck F. a-Galactosidases II, III and IV from Seeds of Trifolium repens. Biochem J., 175,1978, 1069-1077.

20. Щербухин В.Д., Анулов O.B. Галактоманнапы семян бобовых (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 35(3), 1999,257-274.

21. Patel M.B., McGinnis J. The Effect of Autoclaving and Enzyme Supplementation of Guar Meal on the Performance of Chicks and Laying Hens. Poultry Science, 64, 1985, 11481156.

22. Dey P.M., Patel S., Brownleader M.D. Induction of alpha-galactosidase in Pénicillium ochrochloron by guar (Cyamopsis tetragonobola) gum. Biotechnology and Applied Biochemistry, 17(Pt3), 1993,361-371.

23. Goycoolea F.M., Milas M., Rinaudo M. Associative phenomena in galactomannan-deacetylated xanthan systems. International Journal of Biological Macromolecules, 29, Issue 3, 2001,181-192.

24. Tavares C., da Silva J.A.L. Rheology of galactomannans-vvhey protein mixed systems. International Diary Journal, 13,2003, 699-706.

25. Funami T., Kataoka Y., Omoto T., Goto Y., Asai I., Nishinari K. Effects of non-ionic polysaccharides on the gelatinization and rétrogradation behavior of wheat starch. Food Hydrocolloids, 19, Issue 1,2005,1-13.

26. Ulezlo I.V., Zaprometova O.M., Ozerskaya S.M., Bezborodov A.M. Microorganisms that produce alpha-galactosidase, alpha-mannosidase, alpha-fucosidase and beta-acetylglucosaminidase. Mikrobiologia, 49(2), 1980, 265-268.

27. Blucher A., Karlsson E.N., Hoist O. Substrate-dependent production and some properties of a thermostable, a-galactosidase from Rhodolhermus marinus. Biotecnology Letters, 22,2000, 663-669.

28. Cruz R., Batistela J.C., Wosiacki G. Microbal alpha-Galactosidase for Soymilk Processing. Journal of Food Science, 46(4), 1981, 1196-1200.

29. Falco A.L.P., Durrant L.R., Franco T.T. Purification of a-galactosidase from seeds of Sesbania marginata. Braz. J. Chem. Eng., Vol.17, No.4-7, 2000,4-7.

30. Feurtado J.A., Banik M., Bewley J.D. The cloning and characterization of a-galactosidase present during and following germination of tomato (Lycopersicon escidentum Mill.) seed. Journal of Experimental Botany, 52(356), 2001, 1239-1249.

31. Soh C.-P., Ali Z.M., Lazan H. Characterization of an a-galactosidase with potential relevance to ripening related texture changes. Phytochemistry, 67, Issue 3, 2006,242-254.

32. Baik S., Saito K., Yokota A., Asano K. Molecular cloning and high-level expression in E. coli of fungal a-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084. Journal of Bioscience and Bioengineering, 90, Issue 2,2000, 16-173.

33. Zapater I.G., Ullah A.H., Wodzinski R.J. Extracellular alpha galactosidase (E.C. 3.2.1.22) from Aspergillus ficuum NRRL 3135 purification and characterization. Preparative Biochemistry, 20(3-4), 1990, 263-296.

34. Puchart V., Biely P. Glycosylation of internal sugar residues of oligosaccharides catalyzed by a-galactosidase from Aspergillus fumigatus. Biochimica et Biophysica Acta, 1726, Issue 2,2005,206-216.

35. Manzanares P., de Graaff L.H., Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger: purification of a novel alpha-galactosidasc activity. Enzyme and Microbal Technology, 22(5), 1998, 383-390.

36. Matella N.J., Dolan K.D., Stoeckle A. W„ Bennink M.R., Lec Y.S., Uebersax M.A. Use of Hydration, Germination, and a-Galactosidasc Treatments to Reduce Oligosaccharides in Dry Beans. Journal of Food Science, 70(3), 2005, 203-207.

37. Lazo P.S., Ochoa A.G., Gascon S. A-Galactosidase from Saccharomyces carlsbergensis. Cellular Localization, and Purification of the External Enzyme. Eur. J. Biochem., 77,1997,375-382.

38. Civas A., Eberhard R., Le Dizet P., Pctek F. Glycosidases induced in Aspergillus tamarii. Biochem J., 219,1984, 857-863.

39. Hashimoto H., Katayama C., Goto M., Kitahata S. Purification and some properties of alpha-galactosidase from Candida guilliemondii II-404. Bioscicnce, Biotechnology, and Biochemistry, 57(3), 1993,372-378.

40. Hashimoto H., Katayama C., Goto M., Okinaga T., Kitahata S. Transglalactosylation catalyzed by alpha-galactosidase from Candida guilliermondii H-404.Bioscicnce, Biotecnology, and Biochemistry, 59(4), 1995, 619-623.

41. Kaneco R., Kusakabe I., Sakai Y., Murakami K. Substrate specifity of alpha-galactosidase from Mortierella vinacea. Agricultural and Biological Chemistry, 54(1), 1990, 237-238.

42. Shibuya H., Kobayashi H., Park G.G., Komatsu Y., Sato T., Kaneko R., Nagasaki H. Purification and some properties of alpha-galactosidase from Penicillium purpurogenum. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 59(12), 1995, 2333-2335.

43. Puchart V., Vranska M., Bhat M.K., Bicly P. Purification and characterization of alpha-galactosidase from a thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Biochimica et Biophysica Acta, 1524(1), 2001,27-37.

44. Zeilinger S., Kristufek D., Arisan-Atac I., Hodits R., Kubicek C.P. Conditions of formation, purification, and characterization of an alpha-galactosidase og Trichoderma reesei RUT C-30. Applied and Environmental Microbiology, 59(5), 1993, 1347-1353.

45. Scalabrini P., Rossi M., Spettoli P., Mattcuzzi D. Characterization of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation. International Journal of Food Micribiology, 39, Issue 3, 1998,213-219.

46. Nagao Y., Nakada T., Imoto M., Shimamoto T., Sakai S., Tsuda M., Tsuchiya T. Purification and analysis of the structure of alpha-galactosidase from Eschericia coli. Biochemical and Biophysical Research Communication, 151(1), 1988,236-241.

47. Bakunina I.Y., Sova V.V., Ncdashkovskaya O.I., Kuhlmann R.A., Likhosherstov L.M., Martynova M.D., Mihailov V.V., Elyakova L.A. Alpha-galactosidase of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701. Biochemistry, 63(10), 1998, 1209-1215.

48. Ohtakara A., Mitsutomi M., Uchida Y. Purification and enzymatic properties of alpha-galactosidase from Pycnoporus cinnabarinus. Agricultural and Biological Chemistry, 48(5), 1984,1319-1327.

49. Aduse-Opoku J., Tao L., Ferretti J.J., Russell R.R. Biochemical and genetic analysis of Streptococcus mutants alpha-galactosidase. J Gen Micribiol., 137(4), 1991, 757-764.

50. King M.R., Yemool D.A., Eveleigh D.E., Chassy B.M. Thermostable a-galactosidase from Thermotoga neapolitana: cloning, sequencing and expression. FEMS Microbiology Letters, 163, 1998,37.

51. Fridjonsson O., Watzlawick H., Gehweiler A., Rohrhirsch T., Mattes R. Cloning of the Gene Enciding a Novel Thermostable a-Galaclosidase from Thermus brockianus ITI360. Applied and Environmental Microbiology, 65(9), 1999, 3955-3963.

52. Zhu A., Monahan C., Zhang Z., Hurst R., Leng L., Goldstein J. High-Level Expression and Purification of Coffee Bean a-Galactosidase Produced in the Yeast Pichia pastoris. Archives of Biochemistry and Biophysics, 324(1), 1995, 65-70.

53. Zhu A., Wang Z.K., Goldstrein J. Identification of tyrosine 108 in coffee bean alpha-galactosidase as an essential residue for the enzyme activity. Biochimica et Biophysica Acta, 1247(2), 1995, 260-264.

54. Dey P.M., Del Campillo E.M., Lezica R.P. Characterization of a glycoprotein alpha-galactosidase from lentil seeds (Lens culinaris). J. Biol. Chcm, 258, Issue 2, 1983,923-929.

55. Kobayashi 0., Kaneco S., Tanaka II. a-Galactosidase from cultured rise cells. Phytochemistry, 61, Issue 6, 2001, 621-630.

56. Dey P.M. Characteristics of an alpha-galactosidase from mung beans. European Journal of Biochemistry, 140,1984, 385-390.

57. Dhar M., Mitra M., Hata J., Butnariu O., Smith D. Purification and characterization of Phaseolus vulgaris alpha-D-galactosidase isomers. Biochemistry and Molecular Biology International, 34(5), 1994,1055-1062.

58. Kang H., Lee S. Characteristics of an ra-galactosidase associated with grape flesh. Phytochemistry, 58, Issue 2, 2001,213-219.

59. Kusiak J.W., Quirk J. M., Brady R.O., Mook G.E. Purification and Properties of the Two Major Isozymes of a-Galactosidase from Human Placenta. The Journal of Biological Chemistry, 253(1), 1998,184-190.

60. Surekha A., Elbein A. Glycoprotein enzymes secrctcd by Asp.niger. Purification and characterisation of a-galactosidases. J. Bacteriol., 129, 1977, 850.

61. Dey P. M., Pridham J. B. Biochemistry of a-galactosidases. Adv. Enzymol., 15, 1977,91.

62. Arnaud N., Bush D. A. Study of intracellular cx-galactosidase from the thermophilic fungus Penicillium duponli. Biotechnol. Bioeng., 8, 1976, 581.

63. Suzuki H., Li Y. a-Galactosidase from Mortierella vinaceae. Crystallization and properties. J. Biol. Chem., 245, 1970, 781.

64. Eneskaya E.V., Golubev A.M., Kachurin A.M., Savel'ev A.N., Neustroev K.N. Transglycosylation activity of alpha-D-galactosidase from Trichodcrma reesei. An investigation of the active site. Carbohydrate Research, 305(1), 1997, 83-91.

65. Eivazi F., Tabatabai M.A. Factors affecting glucosidase and galactosidase activities in soils. Soil Biology and Biochemistry, 22(7), 1990, 891-897.

66. Edited by Godfrey T.& West S. Industrial enzymology. Second edition. 1996. 71-80, 84-85.

67. Mulimani V.H., Devendrá S. Effect of soaking, cooking and crude a-galactosidase treatment on the oligosaccharide content of red gram flour. Food Chemistry, 61, Issue 4, 1998, 475-479.

68. Goncalves M.P., Torres D., Andrade C.T., Azero E.G., Lefebvre J. Rheological study of the effect of Cassia javanica galactomannans on the heat-set gelation of a whey protein isolate atpH 7. Food Hydrocolloids, 18, Issue 2, 2004, 181-189.

69. Pai V.B., Khan S.A. Gelation and rheology of xanthan/enzyme-modified guar blends. Carbohydrate Polymers, 49, Issue 2, 2002, 207-216.

70. McCleary B.V. Enzymatic modification of plant polysaccharides. International Journal of Biological Macromolecules, Vol. 8, Issue 6,1986, 349-354.

71. Daas P.J., Grolle K., Van Vliet Т., Schols H.A., De Jongh H.H. Towards the recognition of structure-function relationships in galactomannans. J Agrie Food Chem, 50(15), 2002,4282-4289.

72. Slavin J.L., Greenberg N. A. Partially hydrolyzed guar gum. Nutrition, 19, Issue 6, 2003,549-552.

73. Whitney S.E.C., Brigham J.E., Darke A.H., Reid J.S.G., Gidley M.J. Structural aspects of the interaction of mannan-based polysaccharides with bacterial cellulose. Carbohydrate Research, 307, Issues 3-4,1998,299-309.

74. Оводова Р.Г., Бушпева O.A., Шашков A.C., Чижов А.О., Оводов. Ю.С. Структурное изучение пектина сабельника болотного Comarum palustre L. Биохимия, 70, вып. 8,2005,1051-1062.

75. Пищевая химия, ГИОРД, Спб, 2004, 182-185, 385-391.

76. Stephen A.M. Food Polysaccharides and Their Applications. Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong, 1995, 654.

77. McNeil M., Darvill A.G., Albersheim P. The pectic polysaccharides of primary cell walls. Methods Plant Biochem., 2,1990, 415.

78. Schols H.A., Bakx E.J., Schipper D., Voragen A.G.J. A xylogalacturonan subunit present in the modified hairy regions of apple pectin. Carbohydr. Res., 279, 1995,265-279.

79. Бушпева O.A., Оводова P.Г., Шашков А.С., Чижов А.О., Оводов Ю.С. Строение силенаиа, пектина из смолёвки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garcke. Биохимия, 68, вып. 12,1687-1696.

80. Thakur B.R., Singh R.K., Handa A.K. Chemistry and uses of pectin a review. Critical Reviews in Food Science and Nitrition, 37, 1997,47-73.

81. Семёнова M.B. Свойства внеклеточных пектиназ грибов рода Aspergillus. Дисс. канд. хим. паук, МГУ, 2005.93. de Vries J.A., Hansen М., Soderberg J., Glahn P.E., Pedersen J.K. Distribution of methoxyl groups in pectins. Carbohydr. Polym., 6, 1986,165.

82. Oosterveld A., Grabber J.H., Beldman G.J.R., Voragen A.G.J. Formation of ferulic acid dehydrodimers through oxidative cross-linking of sugar beet pectin. Carbohydr. Res., 300, 1997, 179-189.

83. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Разделение и характеристика ферментного комплекса культуры Bacillus macerans. Биотехнология, 1, 2002,21-27.

84. Mikhailova R.V., Sapunova L.I., Lobanok A.G. Biosynthesis of pectinlyases in Penicillium adametzii, P. citrinum and P. janthinellum. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 10,1994,457-461.

85. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Свойства пектинолитических лиаз Bacillus macerans. Биохимия, 2,2002,20-29.

86. Семёнова М.В., Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Сипицын А.П. Выделение и свойства иектиназ из гриба Aspergillus japonicus. Биохимия, 68, вып. 5, 2003, 686-397.

87. Alana A., Alkorta I., Dominguez J.B., Llama M.J., Serra J.L. Pectil Lyase Activity in a Penicillium italicum Strain. Applied and Environmental Microbiology, 56(12), 1990, 37553759.

88. Kashyap D.R., Vohra P.K., Chopra S., Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: a review. Bioresource Technology, 77, Issue 3,2001,215-227.

89. Abelson J.N., Simon M.I. Editors-in-chief. Methods in Enzymology, Volume 161, 1988, Academic Press, Inc, 350-354.

90. Vitali J., Schick В., Kester H.C.M., Visser J., Jurnak F. The three-dimensional structure of Aspergillus niger pectin lyase В at 1.7-A resolution. Plant Physiol, 116, 1998, 6980.

91. Pickersgill R., Jenkins J., Harris G., Nasser W., Robert-Baudouy J. The structure of Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1, 1994, 717-723.

92. Kusters-van Someren M.A., Flipphi M.J.A., de Graaff L.H., van den Broek H.C., Kester H.C.M., Hinnen A., Visser J. Characterization of the Aspergillus niger pelB gene: structure and regulation of expression. Mol. Gen. Genet., 234, 1992,113-120.

93. Kester H.C.M., Visser J. Purification and characterization of pectin lyase B, a novel pectinolytic enzyme (ют Aspergillus niger. FEMSMicrobiol. Lett., 120, 1994, 63-68.

94. Mutenda K.E., Korner R., Christensen T.M.I.E., Mikkelsen J., Roepstorff P. Application of mass spectrometry to determine the activity and specificity of pectin lyase A. Carbohydr. Res., 337, 2002,1213-1223.

95. Williams P.A., Sayers C., Viebke C., Scnan C., Mazoyer J., Boulenguer P. Elucidation of the Emulsification Properties of Sugar Beet Pectin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53,2005, 3592-3597.

96. Румянцева Г.Н., Варфоломеева О.А. Влияние карбогидраз и лиаз микробного происхождения на субстраты пектиисодержащего сырья. Храпение и переработка сельхозсырья, 8,2004, 30-32.

97. Румянцева Г.Н., Варфоломеева О.А. Технологические режимы биокатализа в процессе выделения пищевого пектина. Храпение и переработка сельхозсырья, 4, 2004, 30-33.

98. Will F., Schulz К., Ludvvig М., Otto К., Dietrich Н. The influence of enzymatic treatment of mash on the analytical composition of apple juice. International Journal of Food Science and Technology, 37, 2002, 653-660.

99. Ceci L., Lozano J. Determination of enzymatic activities of commercial pectinases for the clarification of apple juice. Food Chemistry, 61, Issues 1-2, 1998,237-241.

100. Alana A., Gabilondo A., Hernando F., Moragues M.D., Dominguez J.B., Llama M.J., Serra J.L. Pectil Lyase Production by a Penicilliitm italicum Strain. Applied and Environmental Microbiology, 55(6), 1989,1612-1616.

101. Vaillant F., Millan P., O'Brien G., Dornier M., Decloux M., Reynes M. Crossflow microfiltration of passion fruit juice after partial enzymatic liquefaction. Journal of Food Engineering, 42, Issue 4,1999, 215-224.

102. Fundira M., Blom M., Pretorius I.S., Van Rensburg P. Comparison of Commercial Enzymes for the Processing of Marula Pulp, Wine, and Spirits. Journal of Food Science, 67(6), 2002,2346-2351.

103. Ежова А.Ю., Шишкова Э.А., Бравова Г.Б., Нестеренко Е.А. Использование мембранной технологии для концентрирования и очистки ферментных растворов пектинлиазы. Биотехнология, 5,2001,45-50.

104. Revilla I., Gonzalez-San Jose M.L. Addition of pectolytic enzymes: an enological practice which improves the chromaticity and stability of red wines. International Journal of Food Science and Technology, 38,2003,29-36.

105. Rogerson F.S.S., Vale E., Grande H.J., Silva M.C.M. Alternative processing of port-wine using pectolytic enzymes. Cienc. Tecnol. Aliment, 2(5), 2000, 222-227.

106. Ranalli A., Gomes Т., Delcuratolo D., Contento S., Lucerna L. Improving Virgin Olive Oil Quality by Means of Innovative Extraction Biotechnologies. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 2003,2597-2602.

107. Angayarkanni J., Palaniswamy M., Murugesan S., Swaminathan K. Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp. pectinases. Journal of Bioscience and Bioengineering, 94, Issue 4,2002, 299-303.

108. Murugesan G.S., Angayarkanni J., Swaminathan K. Effect of tea fungal enzymes on the quality of black tea. Food Chemistry, 79, Issue 4,2002,411-417.

109. Antier P., Minjares A., Roussos S., Riambault M., Viniegra-Gonzalez G. Pectinase-hyperproducting mutants of Aspergillus niger C28B25 for solid-state fermentation of coffee pulp. Enzyme Microb. Technol., 15,1993,254-260.

110. Colombatto D., Mould F.L., Bhat M.K., Owen E. Use of fibrolytic enzymes to improve the nutritive value of ruminant diets. A biochemical and in vitro rumen degradation assessment. Animal Feed Science and Technology, 107, Issues 1-4, 2003,201-209.

111. Tripodo M.M., Lanuzza F., Micali G., Coppolino R., Nucita F. Citrus waste recovery: a new environmentally friendly procedure to obtain animal feed. Bioresource Technology, 91, 2004,111-115.

112. Ossola M., Galante Y.M. Scouring of flax rove with the aid of enzymes. Enzyme and Microbial Technology, 34, Issue 2,2004,177-186.

113. Wodzinski R.J., Ullah A.H.J. Phytase. Advances in Applied Microbiology, 42, 1996, 263-302.

114. Hou H.J., Chang K.C. Yield and Tcxtural Properties of Tofu as Affected by the Changes of Phytate Content During Soybean Storage. Journal of Food Science, 68(4), 2003, 1185-1191.

115. Соболев A.M. Распространение, образование и использование фитина у высших растений. Успехи биологической химии, IV, 1962, 248-260.

116. Vohra A., Satyanarayana Т. Phytases: Microbal Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications. Critical Reviews in Biotechnology, 23(1), 2003,29-60.

117. Туе A.J., Siu F.K.Y., Leung T.Y.C., Lim B.L. Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B. subtiilis 168 and B. licheniformis. Appl Microbiol Biotechnol, 59,2002, 190-197.

118. Rasmussen S.K., Hatzack F. Identification of two low-phytate barley (Hordeum vulgare L.) grain mutants by TLC and genetic analysis. Hereditas, 129,1998,107-112.

119. Carlsson N.-G., Bergmann E.-L., Skoglund E., Hasselband K., Sandberg A.-S. Rapid Analysis of inositol Phosphates. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, 16951701.

120. Phillippy B. Q., Bland J.M., Evens T.J. Ion Chromatography of Phytate in Roots and Tubers. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 2003, 350-353.

121. Phillippy B.Q., Wyatt C.J. Degradation of Phytate in Foods by Phytases in Fruit and Vegetable Extracts. Journal of Food Science, 66(4), 2001, 535-539.

122. Fruhbeck G., Alonso R., Marzo F., Santidrian S. A Modified Method for the Inderect Quantitative Analysis of Phytate in Foodstuffs. Analytical Biochemistry, 225,1995,206-212.

123. Greiner R. Purification and Characterization of Three Phytases from Germinated Lupine Seeds (Lupinus albas Var. Amiga). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2002,6858-6864.

124. Greiner R., Alminger M.L., Carlsson N.-G. Stereospecificity of myoinositol Hexakisphosphate Dephosphorylation by a Phytate-Degrading Enzyme of Baker's Yeast. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 2001, 2228-2233.

125. Casey A., Walsh G. Identification and characterization of a phytase of potential commercial interest. Journal of Biotechnology, 110,2004, 313-322.

126. March J.G., Simonet B.M., Grases F. Determination of phytic acid by gas chromatography-mass spectroscopy: application to biological samples. Journal of Chromatography B, 757,2001,247-255.

127. Isiguro T., Ono T., Nakasato K., Tsukamoto C. Rapid measurement of Phytate in Soy Products by Mid-infrared Spectroscopy. Journal of Food Science, 70(1), 2005, 63-66.

128. Hatzack F., Rasmussen S.K. High-performance thin-layer chromatography method for inositol phosphate analysis. Journal of Chromatography B, 736, 1999,221-229.

129. Shin S., Ha N.-C., Oh B.-C., Oh T.-K., Oh B.-H. Enzyme Mechanism and Catalytic Property of p Propeller Phytase. Structure, 9, 2001, 851-858.

130. Vohra A., Satyanarayana T. Purification and characterization of a thermostable and acid-stable phytase from Phichia anomala. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 18, 2002,687-691.

131. Bryant R.J., Dorsch J.A., Peterson K.L., Rutger J.N., Raboy V. Phosphorus and Mineral Concentrations in Whole Grain and Milled Low Phytic Acid (Ipa) 1-1 Rice. Cereal Chemistry, 82(5), 2005, 517-521.

132. Peers F.G. The Phytase of Wheat. The Biochemical Journal, 53(1), 1953, 102-110.

133. Ullah A.H J., Phillippy B.Q. Substrate Selectivity in Aspergillus ficuum Phytase and Acid Phosphatases Using wyo-Inositol Phosphates. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42, 1994,423-425.

134. Casey A., Walsh G. Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresource Technology, 86,2003, 183-188.

135. Zini N.V., Serkina A.V., Gelfand M.S., Shevelev A.B., Sineoky S.P. Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus. FEMS Microbiology Letters, 236, Issue 2, 2004,283-290.

136. Sajidan A., Farouk A., Greiner R., Jungblut P., Muller E.C., Borriss R. Molecular and physiological characterization of a 3-phytase from soil bacterium Klebsiella sp. ASR1. Appl Microbiol Biotechnol., 65(1), 2004, 110-118.

137. Shah V., Parekh L.J. Phytase from Klebsiella Sp. No. PG-2: Purification and properties. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics, 27,1990, 98-102.

138. Berka R.M., Rey M.W., Brown K.M., Byun T., Klotz A.V. Molecular Characterization and Expression of a Phytase Gene from the Thermophilic Fungus Thermomyces lanuginosus. Applied and Environmental Microbiology, 64(11), 1998, 4423-4427.

139. Ullah A.H.J., Sethumadhavan K., Lei X.G., Mullaney E.J. Biochemical Characterization of Cloned Aspergillus fumigalus Phytase (phyA). Biochemical and Biophysical Research Communicatios, 275, Issue 2, 2000,279-285.

140. Tomschy A., Brugger R., Lehmann M., Svendsen A., Vogel K., Kostrewa D., Lassen S.F., Burger D., Kronanberg A., van Loon A.P.G.M., Pasamontes L., Wyss. M. Engineering of

141. Phytase for Improved Activity at Low pH. Applied and Environmental Microbiology, 68(4), 2002,1907-1913.

142. Rogriguez E., Mullaney E.J., Lei X.G. Expression of the Aspergillus fumigatus Phytase Gene in Pichia pastoris and Characterization of the Recombinant Enzyme. Biochemical and Biophysical Research Communications, 268, Issue 2, 2000, 373-378.

143. Peng R.H., Xiong A.S., Li X., Fan H.Q., Yao Q.H., Guo M.J., Zhang S.L. Article in Chinese. High expression of a heat-stable phytase in Pichia pastoris. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai), 34(6), 2002, 725-730.

144. Pasamontes L., Haiker M., Wyss M., Tessier M., van Loon A.P. Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol., 63(5), 1997, 1696-1700.

145. Xiang Т., Liu Q., Deacon A.M., Koshy M., Kriksunov I.A., Lei X.G., Hao Q., Thiel D.J. Crystal structure of a heat-rcsilient phytase from Aspergillus fumigatus, earring a phosphorylated histidine. J Mol Biol, 339(2), 2004,437-445.

146. Skowronski T. Some Properties of Partially Purified Phytase from Aspergillus niger. Acta Microbiologica Polonica, 27(1), 41-48.

147. Glahn R.P., Wortley G.M., South P.K., Miller D.D. Inhibition of Iron Uptake by Phytic Acid, Tannic Acid, and ZnCh: Studies Using an In Vitro Digestion/Caco-2 Cell Model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 2002, 390-395.

148. Bio Times 3/99 Novo Nordisk. New phytase could make a world of difference.

149. Авт. свидетельство СССР 1065476,1984.

150. Авт. свидетельство СССР 1120700, 1982.

151. Николаев И.В., Ходова О.М., Тимохииа Е.А., Алексепко АЛО., Винецкий Ю.П. Молекулярные характеристики секретируемой |3-галактозидазы Penicillium canescens. Биохимия, т.54, № 8, 1989,1294-1299.

152. Корнеева О.С., Жеребцов НА., Черемушкина И.В.: Идентификация каталитически активных групп |3-галактозидазы Penicillium canescens F-436. Биохимия. т.66,№ 3,2001,412-418.

153. Абелян В.А. Ферментативная обработка молочной сыворотки с получением галактоолигосахаридного сиропа. Прикл. Биохим. Микробнол. т.34, №4,1998, 365-369

154. Патент РФ 2126049,10.02.1999.

155. Николаев И.В., Беккер О.Б., Серебряный В.А., Чулкин A.M., Винецкий Ю.П.: Суперпродукция секретируемой бета-галактозидазы мицелиальным грибом Penicillium canescens: структура гена и конструкция мультикопийного продуцента. Биотехнология,. 3, 1999,3-13.

156. Coughlan М.Р., Hazlewood G.P., Hemicellulose and Hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London and Chapel Hill, Vol. IV, 1993, 120p.

157. US Patent 60,001,639. December 14, 1999.

158. Suominen P., Reinikainen Т., Trichoderma reesei cellulase and other Hydrolases. Proceedings of The TRICEL93 Symposium, Espoo, Finland. June 2-5,1993, 314p.

159. Bhat M.K., Cellulase and related enzymes in biotechnology. Biotechnol. Advances. 18,2000, 355-383.

160. Jeffries T.W., Viikari L., Enzymes for pulp and paper processing. ACS Symp. Ser. № 655, 1996,326p.

161. Harman G.F., Kubicek C.P., Trichoderma and Gliocladium enzymes, biological control and commercial applications. Taylor @ Francis, London. Vol.2, 1998, 201p.

162. Rosenber I.M., Protein Analysis and Purification, Benchtop Technics. Birkhauser, Boston, 1996,434p.

163. Alexander R.R., Griffiths J.M., Basic Biochemical Methods, 2nd ed., Wiley-Liss, Inc. 1993, 353p.187. Лабораторная методика.

164. Досон P., Эллиот Д., Джойс К., Справочник биохимика. М: Мир, 1991,466с.

165. Сипицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. В: Варфоломеев С.Д. Итоги пауки и техники, сер. Биотехнология. ВИНИТИ, 1993,25, 152с.

166. Garcia Е., Johnson D.,Whitaker J.R., Shoemaker S.P. Assesement of endo-l,4-beta glucanase activity by a rapid colorimctric assay using disodium-2,2'-bicinchoninate. J. Food Biochem., 17, 1993, 135-145.

167. Collmer A., Reid J. Assay methods for peetie enzymes. In. Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 161(B), 1988, 329-335.

168. Pitt D. In. Purich D.L. Methods in enzymology. Academic Press, 161(B), 1988, 353.

169. Гусаков A.B., Марков A.B., Гришутип С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискознметрическнй метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 67(6), 2002, 815-822.

170. Engelen A.J., van der Heeft F., Randsdorp P.H., Smit E.L., J. AOAC Int., 77, 1994, 760-764.

171. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.:- Высш. шк., 1976, 278с.

172. Desjobert A., Petek F., Bull. Soc. Chim. Biol., 1956, 38, 871-883.

173. Синицын А.П., Гусаков A.B., Чсриоглазов B.M., Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учеб. Пособие, М: Изд-со МГУ. 1995,224с.

174. Chaplin M.F., Kennedy J.F., Carbohydrate Analysis: A Practical Approach, 2nd ed. IRL PRESS, Oxford University Press, 1994, 324p.

175. Донченко JI.B. Технология пектина и пектипопродуктов. ДеЛи, Москва, 2000, 256 с.

176. Pectinase assay. Dyadic International, Inc.

177. Берлин X.A., Исследование тополитичсских эпдоглюканаз и ксилапаз ферментных комплексов Pénicillium verrucidosum и Trichoderma reesei. Дисс. канд. хим. наук, МГУ, 1999.

178. Кислухипа О.В., Кюдулас И. Биотехпологические основы переработки растительного сырья, Технология, Каунас, 1997, 184с.1. Алр225

179. Пространственная модель а-галактозидазы А Р. сапезсет

180. Пространственная модель пектинлиазы А Р. сипенсет

181. Пространственная модель фитазы А P.canescensа) карта плазмиды PAglAlполилинкер

182. КАХ ^И А 1\ с И КИ И И 1 1 1 1ху1А промотор а%1А -> ху!А терм.рШиееспр! ^б) карта плазмиды pAglCполилинкер

183. А Ара\; АХ - АаШ; В - ВатШ; В^ - II; С - СМ; Н - НтсПП; К - КрпI; N0 - МтЛ: N1) - №еI; N - ЫоЛ\ К - ЕсоЯЛ; $ - &еП; 8с - БасЬ, 8т - £/ж/1; ХЪ-ХЬа1; Х- Х1ю\.