Свойства рекомбинантных целлюлаз и гемицеллюлаз Chrysosporium lucknowense тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ДОЦЕНКО ГЛЕБ СЕРГЕЕВИЧ

Свойства рекомбинантных целлюлаз и гемицеллюлаз аиуяоБропит Шскпомете

02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2012

005047920

005047920

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Синицын Аркадий Пантелеймонович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук Ямсков Игорь Александрович

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией молекулярных основ биотрансформаций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук Королева Ольга Владимировна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

РАН, г. Пущино

Защита состоится «¿Ъ> ноября 2012 года в 15°° часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 25 » октября 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие человеческой цивилизации во все времена было тесно связано с освоением и использованием различных источников энергии. При этом для сохранения темпов развития требовалось поддержание определённого уровня энергозатрат, а для открытия новых горизонтов оказывалось необходимым увеличение энерговложений. Поэтому поиск новых источников энергии и их эффективное использование всегда являлось актуальной задачей, стоящей перед человечеством. Не стало исключением и наше время, суть этой задачи сохранилась, однако 21 век всё же внёс свою специфику в постановку этой задачи и в требования к её предлагаемым решениям. Так, современный источник энергии должен удовлетворять критериям доступности, мощности, экологичности, возобновляемости, а также конкурентоспособности с традиционными углеводородными энергоносителями. Растительное сырьё удовлетворяет всем выдвинутым критериям, и усилия биотехнологов направлены на разработку наиболее эффективных способов его использования.

Промышленная технология ферментов начала развиваться в первой четверти 20 века, и довольно скоро стало понятным, что большое разнообразие ферментов и их характеристик предоставляет широкие возможности не только для эффективной переработки растительного сырья, но и для всевозможных контролируемых модификаций различных растительных биополимеров с последующим получением продуктов, обладающих ценными, заранее определёнными свойствами. В настоящее время интенсивный поиск новых продуцентов ферментов по-прежнему продолжается, а изучение свойств этих ферментов и их генно-инженерных модификаций является неотъемлемой частью современной биотехнологии.

В результате совместных исследований, проведённых на кафедре химической энзимологии МГУ имени М. В. Ломоносова, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина и нашими зарубежными коллегами, был найден перспективный продуцент ферментов, обладающих ценными биотехнологическими свойствами и способных гидролизовать различные углеводсодержащие субстраты - гриб СИгу.чо.чропит 1ис knowen.se, в последнее время известный также под названием МусеНорЫкога /ИегторкИа. Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства некоторых эндоглюканаз, целлобиогидролаз и ксиланаз этого гриба. Дальнейшее изучение свойств новых ферментов САискпомепзе (как, впрочем, и ферментов любого другого перспективного продуцента) является важной и актуальной задачей, поскольку получаемые сведения имеют как теоретическую ценность, так и практическое значение, расширяющее потенциал современной биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Целью данной диссертационной работы являлось изучение свойств новых, не исследованных ранее ферментов гриба СЛискпомете. Выбор этой цели был продиктован как необходимостью систематизировать знания о составе и свойствах индивидуальных компонентов, входящих в состав ферментного комплекса С.lucknowen.se, так и перспективой

их использования в процессах трансформации углеводсодержащего растительного сырья.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) Изучить биохимические свойства десяти новых ферментов: СЛискпоу/ете: трёх эндоглюканаз, двух а-галактозидаз, Р-маннаназы, Р-маннозидазы, двух р-ксилозидаз и а-арабинофуранозидазы.

2) Исследовать возможности модификации полисахаридных субстратов гомогенными ферментами, их смесями между собой и с ферментами других грибных продуцентов.

3) Исследовать возможности гидролиза биотехнологического растительного сырья гомогенными ферментами, их смесями между собой и с ферментами других грибных продуцентов.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы биохимические свойства - субстратная специфичность, каталитические параметры гидролиза специфических субстратов, рН- и температурные зависимости активности, термостабильность, характер изменения молекулярно-массового распределения (ММР) полимерного субстрата в процессе его гидролиза - десяти новых, не изученных ранее ферментов, кодируемых молчащими генами СЛискпстепБе -трёх эндоглюканаз, двух а-галактозидаз, Р-маннаназы, р-маннозидазы, двух Р-ксилозидаз и а-арабинофуранозидазы. Предложена новая, не рассмотренная ранее в литературе статистическая модель, описывающая распределение замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи галактоманнанов, позволяющая характеризовать как структуру этих полисахаридов, так и субстратную специфичность галактоманнан-гидролизующих ферментов.

Практическая значимость работы. Изучены возможности практического применения исследованных ферментов как в гомогенном виде, так и в составе смесей с другими ферментами (секретируемыми как С.1искпом>епзе, так и другими грибными продуцентами) для модификации специфических субстратов, а также для осахаривания целлюлозосодержащего сырья. В результате проведённых исследований обнаружена уникальная эндоглюканаза С.Ьскпомепяе ЭГ6, являющаяся, по-видимому, белком-энхансером. Показано, что комбинированное применение двух а-галактозидаз (аГал1, аГал2), р-маннаназы (рМан2) и р-маннозидазы (РМнз9) САискпоъ/ете позволяет эффективно трансформировать как полисахаридные, так и олигосахаридные галактозо- и маннозосодержащие субстраты в продукты с определённой степенью полимеризации (СП) и структурой. Обнаружена уникальная Р-ксилозидаза (рКсз5), обладающая нехарактерной для ферментов своего класса широкой субстратной специфичностью, способная с высокой степенью конверсии гидролизовать не только ксилозо-, но и глюкозосодержащие полисахаридные и олигосахаридные субстраты по механизму экзо-деполимеризации.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на XVII, XVIII и XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010, 2011, 2012» (Москва, 2010, 2011, 2012), на VI московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011) и на международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи.

Структура к объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора (две главы); отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; трёх глав, в которых приведены результаты и их обсуждение; выводов; списка литературы, содержащего ссылки на 196 источников, и приложения. Объем диссертации составляет 135 страниц и включает 54 рисунка и 29 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор посвящен рассмотрению состава и структуры основных компонентов растительной биомассы, а также описанию общих свойств карбогидраз. Рассмотрено общее строение и свойства целлюлозы и гемицеллюлоз, особое внимание уделено ксилансодержащим полисахаридам, а также полисахаридам, содержащим галактозу и маннозу. С учётом последних литературных данных описаны основные свойства эндоглюканаз, Р-ксилозидаз, а-галактозидаз, р-маннаназ, Р-маннозидаз и а-арабинофуранозидаз.

Отдельная глава посвящена описанию использованных в работе методов исследования, приводится список использованных субстратов, реактивов, ферментов и ферментных препаратов.

В последующих главах для всех исследуемых ферментов по единому плану приводятся результаты исследования и их обсуждение. Так, сначала описывается субстратная специфичность гомогенных ферментов, затем приводятся каталитические параметры гидролиза ими специфических субстратов, после этого рН- и температурные зависимости активности, термостабильность. Затем полученные данные дополняются информацией о характере изменения ММР полимерного субстрата в процессе его ферментативного гидролиза, а также сведениями о составе конечных продуктов гидролиза этого субстрата. В заключение обсуждаются возможности практического применения исследуемых ферментов как в гомогенном виде, так и в составе смесей с другими ферментами для контролируемой модификации специфических субстратов, а также для осахаривания целлюлозосодержащего сырья.

1. СВОЙСТВА ЭНДОГЛКЖАНАЗ ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7 САискпоыете

Все три эндоглюканазы СЛискпо-мете (ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7) обладали активностями по карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ), р-глюкану и ламинарину. Для ЭГ7 была характерна более высокая активность по ламинарину, чем по 1,4-р-глюкану ячменя, то есть гидролиз 1,3-Р-0-глюкозидных связей для этого фермента является более предпочтительным, чем гидролиз 1,4-Р-О-глюкозидных связей (табл. 1).

Таблица 1. Удельные активности и биохимические параметры эндоглкжаназ ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7 (40°С и рН5,0 для я-нитрофенил-гликозидов; 50°С и рН5,0 для

Субстрат Активность, ед/мг

ЭГ1 ЭГ6 ЭГ7

я-нитрофенил-р-О-целлобиозид 3,3 0,01 0,00

я-нитрофенил-Р-Б-глюкопиранозид 0,01 0,01 0,00

и-нитрофенил-р-Э- 7,3 0 0,00

лактопиранозид

КМЦ (выход восстанавливающих Сахаров) 71 0,5 4

КМЦ (вискозиметрия) 413 2 39

1,4-Р-глюкан ячменя 1300 1,0 16

ламинарин 6 0,3 21

ксилоглюкан 1 0 0

ксилан березы 2 0,1 3

м икрокристаллическая целлюлоза 0,00 0,01 0,01

Биохимические параметры

Молекулярный вес, кДа 55 40 43

р1 4,8 4,7 5,9

Тип действия эндо эндо эндо

Семья гликозилгидролаз 7 6 6

Значение КМЦ-азной активности, измеренной вискозиметрическим методом, для ЭГ1 (413 ед/мг) было значительно выше, чем для ЭГ6 и ЭГ7 (2 и 39 ед/мг, соответственно). Это свидетельствует о менее упорядоченном механизме действия ЭГ1 на полимерный субстрат по сравнению с ЭГ6 и ЭГ7. Отсутствие активности ЭГ1 по микрокристаллической целлюлозе (МКЦ), а также низкая активность ЭГ6 и ЭГ7 по этому субстрату, свидетельствует об отсутствии целлюлозосвязывающего модуля в структуре молекул этих ферментов.

ЭГ6 характеризовалась относительно низким значением УМ/[Е] (табл. 2), а ЭГ1, напротив, обладала повышенной каталитической эффективностью по

сравнению с большинством описанных в литературе эндоглюканаз. Ингибирования исследуемых эндоглюканаз продуктом гидролиза целлюлозы -О-глюкозой - до концентрации Э-глюкозы 10 мг/мл - обнаружено не было.

Таблица 2. Каталитические параметры гидролиза КМЦ эндоглюканазами

С.1искпо\уете (рН5,0; 50°С).

Эндоглюканаза Км, мг/мл У„/[Е], 1/с

ЭГ1 5,9±0,4 208±11

ЭГ6 2,9±0,2 0,7±0,1

ЭГ7 2,0±0,1 14±1

рН- и температурные оптимумы активности ферментов являются их важными биохимическими параметрами, используемыми для сравнения свойств ферментов между собой и учитываемыми при выборе оптимальных условий биотехнологических процессов. В табл. 3 приведены обобщенные результаты проведённых исследований рН- и температурных зависимостей активности эндоглюканаз САискпохчете. Согласно полученным данным, эндоглюканазы ЭГ6 и ЭГ7 обладали схожими рН- и температурными оптимумами КМЦ-азной активности.

Таблица 3. рН- и температурные оптимумы активности эндоглюканаз

С.lucknowen.se, определенные по гидролизу КМЦ.

Эндоглюканаза Оптимальные значения

Топт, °С (рН5,0) рНопт (50°С)

ЭГ1 64 4,9

ЭГ6 60-65 5,3

ЭГ7 60-66 5,4

Помимо исследования зависимости активности эндоглюканаз СЛискпо-юете от температуры и рН, определенных при кратковременном (10 мин) инкубировании ферментов в выбранных условиях, была изучена способность ЭГ1, ЭГ6 и ЭГ7 сохранять свою активность при продолжительном инкубировании при 50, 60, 65 и 70°С (рН5,0). ЭГ1 проявила большую стабильность при 50 и 60°С, чем ЭГ6 и ЭГ7. При этом ЭГ1 сохраняла почти 100% активности при инкубировании при этих температурах в течении 5 ч, в то время как ЭГ6 и ЭГ7 за 4 ч инкубирования при 50°С теряли 20-40% исходной активности, а при увеличении температуры до 60°С активность обеих эндоглюканаз уменьшалась на 75% за 30 мин. При 65 и 70°С стабильность всех трёх эндоглюканаз заметно снижалась - полная потеря активности происходила менее чем за 30 минут.

Для классификации эндоглюканаз С.¡iicknowen.se по типу действия на полимерный субстрат было проанализировано изменение ММР р-глюкана в процессе его гидролиза. Полученные данные подтверждают, что исследуемые ферменты являются эндо-деполимеразами. Основными низкомолекулярными

продуктами исчерпывающего гидролиза Р-глкжана ЭГ1, ЭГ6 и ЭГ7 СЛискпохчете, общими для всех трех эндоглюканаз, являлись глюкоза и целлобиоза в различных соотношениях; ЭГ7 образовывала так же небольшое количество целлотетраозы, а ЭГ6 - целлотриозы и целлотетраозы.

Помимо исчерпывающего гидролиза растворимых полисахаридных субстратов эндоглюканазами CJucknowen.se было проведено исследование возможности осахаривания нерастворимых целлюлозосодержащих субстратов -МКЦ и предобработанных паровым взрывом кукурузных стеблей (ПКС) как гомогенными ферментами, так и их смесями с другими гомогенными ферментами (целлобиогидролазой ЦБГ1 Р.уеггиси1озит, 66 кДа и р-глюкозидазой рГлз А.]аротст) и с ферментными препаратами СЛискпомгете (С3#1821.3 и С5#1821.2). Эти препараты были получены на основе

рекомбинантных штаммов СЛискпом/еюе, продуцирующих полноценный целлюлазный ферментный комплекс и несущих дополнительные копии генов либо одного фермента (гомологичной Р-глюкозидазы в случае ферментного препарата С3#1821.3), либо двух ферментов (гомологичных р-глюкозидазы и эндоглюканазы II, препарат С5#1821.2). На рис. 1 приведено сравнение выходов ВС (%), полученных в ходе этих экспериментов.

Было установлено, что использование индивидуальных гомогенных эндоглюканаз СЛискттете для гидролиза нерастворимых целлюлозосодержащих субстратов нецелесообразно. Однако следует отметить, что ряд композиций ЭГ6 с другими ферментами целлюлазного комплекса приводил к значительному увеличению выхода гидролиза растительного сырья по сравнению с аналогичными смесями с остальными эндоглюканазами ЭГ1, ЭГ7. Это позволяет предположить, что ЭГ6 является т.н. белком-энхансером (недавно открытым ферментом, обладающим достаточно низкой собственной гидролитической активностью, но при этом способным значительно увеличивать эффективность гидролиза нерастворимых субстратов другими ферментами).

Ферментные препараты С3#1821.3 и С5#1821.2 оказались близки по способности гидролизовать целлюлозосодержащие субстраты и обеспечивали глубину гидролиза в выбранных экспериментальных условиях 16-19% для МКЦ и 25-29% для ПКС. Для достижения наиболее высоких выходов ВС при гидролизе МКЦ достаточно использовать только ферментные препараты С3#1821.3 и С5#1821.2, а при гидролизе ПКС можно рекомендовать использовать смеси на основе препарата С3#1821.3 или С5#1821.2 с эндоглюканазой ЭГ6 СЛискпом/епзе «ЭГ6 + СЗ/5» или с ЦБГ1 Р. чеггиси1о$ит «ЦБГ1 +СЗ/5».

20 18 16 14

о" 10 Щ 8

6 4 2 О

XXX

<<ь <л ф ф

Фермент (ферментная смесь)

б)

50 45 40 35 й? 30

со 20

15 10 5 0

^ &П> & # <*> & ^У^ЩуУ ¿У

<1оХ <Л х о4 о4

Фермент (ферментная смесь)

Рисунок 1. Сравнение выходов ВС (%), полученных при гидролизе МКЦ (а) и ПКС (б), 100 мг/мл; рН5,0, 50°С. Общая концентрация гомогенных ферментов составляла 2мг на 1г субстрата, концентрация белка ферментного препарата -5мг белка на 1г субстрата. При этом концентрации гомогенных ферментов в смесях «ЭГ1/6/7 + РГлз + ЦБГ1», «ЦБГ1+ рГлз», и «ЭГ1/6/7 + рГлз» относились как 3:1:6, 6:1 и 3:1, соответственно.

а)

г р г

р

Г

р

;

-1-1-г п

р 1

- —

- - - - - -

-

г -

- - - - -

г-1 П Г-1 п п П Г1

2. СВОЙСТВА р-МАННАНАЗЫ рМан2, р-МАННОЗИДАЗЫ 0Мнз9 и а-ГАЛАКТОЗИДАЗ аГал1, аГал2 СЛискпопете

р-Маннаназы и р-маннозидазы относятся к ферментам, гидролизующим основную полимерную цепь маннанов, при: этом Р-маннаназы действуют неупорядоченно, осуществляя разрыв цепи полимера по статистическому механизму, а Р-маннозидазы катализируют отщепление концевых остатков маннозы на невосстанавливающем конце полимерной цепи.

Исследование субстратной специфичности рМан2 СЛискпоч/ете проводили в сопоставлении со свойствами р-маннаназы ТпсИос1егта гееяе1 (табл. 4).

Таблица 4. Удельные активности и биохимические параметры рМан2 С.lucknowen.se, рМан Т.гее.че1 и рМнз9 СЛискпо\чете (40°С и рН5,0 для п-нитрофенил-гликозидов, 50°С и рН5,0 для прочих субстратов)._

Субстрат Активность, ед/мг

рМан2 СЛискпоыепяе РМан Т. ree.se 1 РМнз9 СЛискпсмете

и-нитрофенил-а-Б-галактопиранозид 0,1 0,22 0

л-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид 0,00 0,02 0

я-нитрофенил-Р-О-маннопиранозид 0,00 0,00 6

КМЦ 0,4 0,5 0

ксилан березы 0,4 0,0 0

Р-глюкан ячменя 4,3 0,0 0

карубин 76 25 0

гуаран 52 23 0

тараГМ 56 19 0

глюкоманнан 41 12 0

Вискозиметрическая активность (ед/мг)

карубин 288 126 0

гуаран 1225 1395 0

тараГМ 1838 2512 0

Биохимические параметры

Молекулярный вес, кДа 48 52 97

Р1 6,2 5,1 5,2

Тип действия эндо эндо -

Семья гликозилгидролаз 5 5 2

Обе Р-маннаназы были активны преимущественно по полимерным маннозид-содержащим субстратам галактоманнанам (ГМ) со способностью резко снижать вязкость растворов ГМ, что свидетельствует об эндо-деполимеразном механизме действия ферментов. рМан2 C.lucknowense отличалась от фермента T.reesei более высокими (в 2-3 раза) значениями удельных активностей, определенных по выходу ВС при гидролизе ГМ, в то время как рМан T.reesei превосходила фермент C.lucknowense по способности снижать вязкость растворов галактоманнанов гуарана и тараГМ. Оба фермента оказались инертными по отношению к и-нитрофенил-Р-О-маннопиранозиду (иНФМ), что также свидетельствует об их специфичности к полимерным субстратам. Качественный и количественный состав низкомолекулярных продуктов исчерпывающего гидролиза карубина Р-маннаназами C.lucknowense и T.reesei был почти идентичным (в исследованных пробах присутствует манноза и различные олигосахариды), а сходство состава продуктов исчерпывающего гидролиза гуарана и тараГМ этими ферментами оказалось менее выраженным. При гидролизе всех трёх субстратов Р-маннаназами C.lucknowense и T.reesei образовывались олигосахариды со СП>3. Для классификации исследуемых ферментов по типу действия на полимерный субстрат было проанализировано изменение ММР карубина в процессе его гидролиза. Полученные данные подтверждают, что Р-маннаназы C.lucknowense и T.reesei относятся к эндо-деполимеразам.

Р-Маннозидаза C.lucknowense (РМнз9) проявила активность исключительно по пНФМ.

Исследование субстратной специфичности двух а-галактозидаз C.lucknowense (аГал! и аГал2) проводили в сравнении с двумя а-галактозидазами Pénicillium canescens, аГалА и аГалС, свойства которых были исследованы в нашей лаборатории ранее. В табл. 5 приведены удельные активности четырёх а-галактозидаз, определенные по отношению к различным олигосахаридным и полимерным субстратам.

аГал1 C.lucknowense проявила наибольшую активность по синтетическому субстрату и-нитрофенил-а-О-галактопиранозиду («НФГал) и по полимерным галактозидсодержащим субстратам - галактоманнанам, отличающимся друг от друга происхождением из различных растительных источников и характером распределения заместителей (галактоза) в основной полимерной цепи. Фермент также обладал небольшой активностью по галактоолигосахаридам раффинозе и стахиозе, что является востребованным свойством галактозидаз в биотехнологических процессах. Как видно из табл. 5, субстратная специфичность аГал! весьма схожа со специфичностью аГалА P.canescens, с тем различием, что аГалА характеризуется несколько большей активностью по мНФГал (~ в 4 раза). Таким образом, аГал1 C.lucknowense, также как и аГалА P.canescens, может быть отнесена к типу галактозидаз, гидролизующих преимущественно полисахаридные субстраты.

Таблица 5. Удельные активности и биохимические параметры аГал1 и аГал2 СЛискпоч/ете, а также аГалА и аГалС Р.сапеисет (40°С и рН5,0 для и-нитрофенил-гликозидов, 50°С и рН5,0 для прочих субстратов)._

Субстрат Активность, ед/мг

аГал! аГал2 аГалА- аГалС

СЛискп<тете Р.сапезсет

и-нитрофенил-а-О-галактопиранозид 26 65 98 1255

я-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид 0 0 0 0

я-нитрофенил-Р-Б-маннопиранозид 0 0 0 0

я-нитрофенил-а-О-ксилопиранозид 0 0 0 0

я-нитрофенил-Р-О-ксилопиранозид 0 0 0 0

и-нитрофенил-р-О-глюкопиранозид 0 0 0 0

и-нитрофенил-а-Ь-рамнопиранозид 0 0 0 0

сахароза 0,0 0 0 0

раффиноза 0,6 0,3 1,2 296

стахиоза 0,2 0,7 0,52 256

арабинан неразветвл. 0 0 0 0

арабинан 0 0 0 0

арабиноксилан 1,1 0 0 0

гапактан 1,1 0 0 0

арабиногалактан 1,3 0 0 0

карубин 16,8 0 20 2

гуаран 11,0 0 И 4

тараГМ 25,3 0 15 2

Биохимические параметры

Молекулярный вес, кДа 60 43 61 80

Р1 4,6 4,6 5,1 4,8

Тип действия экзо - экзо экзо

Семья гликозилгидролаз 27 27 27 36

аГал2 CAucknowen.se проявила основную активностью по синтетическому субстрату иНФГал и характеризовалась относительно низкой активностью по олигосахаридным субстратам раффинозе и стахиозе, оставаясь инертной по отношению к полимерным галактозидсодержащим субстратам. Таким образом, аГал2 отличается от исследованных ранее аГалА и аГалС, и может быть

отнесена к третьему типу а-гапактозидаз, которые высокоспецифичны к иНФГал. Продуктами исчерпывающего гидролиза стахиозы аГал2 СЛискпо^ете являлись галактоза, сахароза и раффиноза. Основным низкомолекулярным продуктом исчерпывающего гидролиза карубина, гуарана и тараГМ а-галактозидазами Р.сапе.чсет и аГал1 СЛискпомепяе была галактоза. Характер изменения ММР карубина в ходе его гидролиза аГалА Р.сапеБсет и аГал1 СЛискпон'епзе соответствовал действию экзо-деполимераз на полимерный субстрат.

Полученные значения Км (табл. 6) свидетельствуют о достаточно высокой субстратной специфичности исследуемых ферментов.

Таблица 6. Каталитические параметры гидролиза специфических субстратов аГал1, аГап2, рМнз9 и рМан2 СЛискпоыете (рН5,0 и 40°С для иНФГал и

Фермент/субстрат км

а Гал1/иНФГал 0,08±0,01 мМ 35±21 1/с

осГал2/«НФГал 0,47±0,03 мМ 81±7 1/с

РМнз9/иНФМ 0,39±0,03 мМ 15±1 1/с

рМан2/карубин 1,3±0,1 мг/мл 67±5 1/с

рН-оптимумы аГал1, рМан2 и (ЗМнз9 располагались в слабокислой области (рН5,0-5,5), что типично для большинства гликозилгидролаз из грибных источников и позволяет использовать данные ферменты совместно для одновременного проведения различных процессов модификации и трансформации субстратов, а рН-оптимум аГал2 оказался смещён относительно них в кислую область. Температурные оптимумы а-галактозидаз аГал1 и аГал2 оказались идентичными, а температурные оптимумы рМан2 и рМнз9 отличались друг от друга (табл. 7).

Таблица 7. рН- и температурные оптимумы активности аГал1, аГап2,

ЗМан2 и РМнз9 СЛискпаи'епхе.

Фермент Субстрат Оптимальные значения

Топт, °С (рН5,0) рНопт

аГал1 иНФГал 60 4,9-5,1 (40°С)

аГал2 иНФГал 60 3,6-4,1 (40°С)

рМан2 карубин 69 5,3 (50°С)

рМнз9 «НФМ 40 5,3 (40°С)

Несмотря на идентичные значения температурных оптимумов активности, аГал1 и аГал2 обладали различной устойчивостью к длительному воздействию повышенной температуры. В диапазоне температур 40-65°С аГал1 более стабильна, чем аГал2. рМан2 оказалась гораздо более устойчива к действию повышенных температур, чем РМнз9. Было показано, что при длительной

инкубации рМан2 при 40 и 45°С в течении 10 часов исходная активность фермента практически не менялась, в то время как рМнз9 при аналогичном температурном воздействии сохраняла менее 20% исходной активности за 20 и 90 минут соответственно.

Был исследован процесс исчерпывающего гидролиза галактоманнанов из различных источников (карубина, гуарана и тараГМ) индивидуальными гомогенными рМан2 и аГал1 С.1иекпом>ете, а также аГалА и аГалС Р.сапезсет. В качестве объекта сравнения для рМан2 CJucknowen.se была выбрана рМан Г.геехе/. Независимо от источника ГМ, выход ВС при применении аГалА Р.сапезсет и аГал1 С.lucknowen.se более чем в десять раз превосходил выход ВС при использовании аГалС Р.сапезсет. Наибольшей степени конверсии ГМ (независимо от его источника) в ходе исчерпывающего гидролиза при индивидуальном действии двух исследованных Р-маннаназ удалось добиться при использовании рМан 7>ее.?е/.

Из литературных данных известно, что довольно часто в биотехнологических процессах р-маннаназы и а-галактозидазы применяют совместно, что обусловлено различными сайтами гидролиза ГМ данными ферментами и взаимным синергетическим эффектом. Поэтому были проведены соответствующие эксперименты с совместным использованием этих ферментов. При составления ферментных композиций для гидролиза карубина использовали рМан2 CJucknowen.se, РМан 7>еауе/, аГал1 CJucknowen.se (<хГал2 СЛискпо-юете не использовали, т.к. этот фермент не проявляет активности по полимерным субстратам, табл. 5) и аГалА Р.сапезсет (значительно более эффективную в процессе гидролиза ГМ, чем аГалС Р.сапезсет). Были исследованы возможности гидролиза карубина при одновременном, а также последовательном использовании р-маннаназ и а-галактозидаз (в том числе при различном порядке добавления этих ферментов). В проведённых экспериментах глубина гидролиза карубина при совместном применении Р-маннаназ и а-галактозидаз увеличивалась относительно глубины исчерпывающего гидролиза этого субстрата индивидуальными ферментами (табл. 8).

Для изучения возможностей гидролиза глюкоманнана были выбраны РМан Т.геезе1, рМан2, рМнз9, р-глюкозидаза (далее рГлз) и ЭГ1 С.1искпом>ете. Было установлено, что гомогенные ферменты неспособны обеспечить гидролиз этого субстрата на существенную глубину, а гидролитическая способность наиболее эффективных ферментативных смесей достигала 55%.

В результате действия ЭГ1 и смеси ЭГ1 с рГлз на глюкоманнан образовывался ряд олигосахаридов различной СП (было обнаружено, по крайней мере, 9 таких олигосахаридов). Действие Р-маннаназ на глюкоманнан также приводило к образованию олигосахаридных продуктов, которые в присутствии р-маннозидазы и Р-глюкозидазы почти полностью конвертировались в глюкозу и маннозу. Возможность полного превращения природного полимерного субстрата в моносахариды широко востребована в биотехнологических процессах конверсии растительной биомассы.

Таблица 8. Выход ВС (% от максимально возможного) в ходе исчерпывающего гидролиза галактоманнана карубина и глюкоманнана (Послед - последовательно, Одновр - одновременно; ДО - до выпадения осадка, ПО - после выпадения осадка частично дегалактозилированного

Фермент (последовательность действия ферментов) при гидролизе карубина Выход ВС, %

рМан2 С. lucknowen.se 16

рМан Т.геехе! 23

аГалА Р.сапе.чсепь- 18

аГал1 С.1искпом>ете 16

рМан2 С. lucktwwen.se + аГалА Р.сапеясет; Послед 36

РМан Т.гее.че1 + аГалА Р .сапевсепБ', Послед 44

аГалА Р.сапеясепя + рМан2 С.lucknowen.se-, Послед, ДО 48

аГалА Р.сапе.чсепъ + РМан Т.гее.чег, Послед, ДО 43

аГалА Р.сапе.ъсеп$ + рМан2 СЛискпомепзе', Послед, ПО 31

аГалА Р.сапе.чсепз + рМан Т.геезе'г, Послед, ПО 27

(РМан2 + аГал1) C.lucknowense; Послед 42

РМан Т.гее.че1 + аГал1 C.lucknowense; Послед 48

(аГал1 + рМан2) C.lucknowense; Послед, ДО 51

аГал1 C.lucknowense + РМан 7".ree.se/; Послед, ДО 48

(аГал1 + рМан2) C.lucknowense•, Послед, ПО 30

аГал1 СЛискпоу/ете + РМан 7>ееле/; Послед, ПО 28

(РМан2 + аГал1) СЛискпомеюе-, Одновр 50

РМан 7>ее.?е/ + аГал1 C.lucknowense; Одновр 43

рМан2 C.lucknowense + аГалА Р.сапеясепя; Одновр 42

РМан Т. гее$е1 + аГалА Р.саиезсеях; Одновр 48

Фермент (ферментная смесь) при гидролизе глюкоманнана

ЭГ1 C.lucknowense 7

рМан2 CЛllcknowense 26

РМан Г.геехе/ 31

РМнз9 С.lucknowen.se 2

РГлз CЛucknowense 2

(рМан2 + ЭГ1) C.lucknowense•, Одновр 30

рМан Г.геехе/ + ЭГ1 C.lucknowense■, Одновр 34

(рМан2 + рМнз9) CЛucknowense■, Одновр 34

РМан Г.гее^е/ + рМнз9 CЛucknowense; Одновр 37

(ЭГ1 + РГлз) CЛltcknowense■, Одновр 10

(рМан2 + РМнз9 + ЭГ1) CЛucknowense; Одновр 43

РМан Г.ree.se;' + (РМнз9 + ЭГ\) C.lucknowense•, Одновр 52

(РМан2 + РМнз9 + РГлз) C.lucknowense•, Одновр 51

РМан Т.ree.se 1 + (РМнз9 + РГлз) С.lucknowen.se-, Одновр 54

Согласно полученным ранее экспериментальным данным (табл. 4), РМнз9 С.1искпо\мепзе проявила активность исключительно по синтетическому субстрату яНФМ, оставаясь при этом инертной к маннозид-содержащим полимерным субстратам (галактоманнанам). Тем не менее, представляло интерес изучить влияние этого фермента на эффективность гидролиза галактоманнана эндо-деполимеразами (рМан2 С.lucknowen.se и рМан Т.геезеГ). Было установлено, что добавление РМнз9 С. lucknowen.se приводит к увеличению глубины гидролиза карубина (16 и 23% при использовании индивидуальных рМан2 CJucknowen.se и рМан Т.гееве1 и 21 и 29% при добавлении РМнз9 соответственно). Анализ низкомолекулярных продуктов гидролиза свидетельствовал о том, что добавление РМнз9 к рМан2 CJucknowen.se и РМан Г.геехе/ приводит к увеличению выхода маннозы, в то время как качественный состав продуктов гидролиза остаётся почти неизменным.

Для описания распределения замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи ГМ была предложена новая, не рассмотренная ранее в литературе статистическая модель, позволяющая характеризовать как структуру ГМ, так и субстратную специфичность ГМ-гидролизующих ферментов. В соответствии с этой моделью, вероятность обнаружения т замещенных остатков (Гал/Ман)т в полимерной цепи ГМ, следующих подряд и окруженных незамещенными остатками задаётся формулой:

Р[(Гал/Ман)т]=Ч2*(1-ЧГ, а вероятность обнаружения п незамещенных остатков (Ман)„ следующих подряд и окруженных замещенными остатками - формулой:

Р[(Ман)п]=(1-Ч)2хчп, где ц является долей незамещенных звеньев в полимерной цепи, (1-ц) - долей замещенных звеньев, ш - числом последовательных замещенных звеньев (Гал/Ман)т, окруженных незамещенными звеньями, а П - числом последовательных незамещенных звеньев (Ман)п, окруженных замещенными звеньями. На основании предложенной модели было показано, что РМан Т.геезе/' способна гидролизовать цепь ГМ в участках с четырьмя и более незамещенными остатками маннозы, в то время как рМан2 CJucknowen.se более специфична и гидролизует полимерную цепь в участках с пятью и более незамещенными остатками маннозы.

3. СВОЙСТВА Р-КСИЛОЗИДАЗ РКсз1, рКсз5 и а-Ь-АРАБИНОФУРАНОЗИДАЗЫ АФ7 С.Шскпоыепхе

На основании анализа а.к. последовательностей РКсз1 и РКсз5 CJucknowense было установлено, что эти ферменты принадлежат к 3-ей семье гликозилгидролаз. Для представителей этой семьи характерно проявление либо глюкозидазной, либо ксилозидазной активности. С учетом этого было проведено исследование субстратной специфичности рКсз! и РКсз5

С.1искпом>ете по широкому спектру низкомолекулярных (синтетических и природных) и полисахаридных субстратов, содержащих как ксилозидные, так и глюкозидные группы. Как видно из табл. 9, исследуемые ферменты проявляли одновременно как глкжозидазную, так и ксилозидазную активности, что нехарактерно для известных р-ксилозидаз из 3-ей гликозилгидролазной семьи. Глюкозидазная и ксилозидазная активности различались между собой примерно на три порядка для каждого фермента, причем для рКсз! ксилозидазная активность превышала глкжозидазную, а для рКсз5, наоборот - глюкозидазная активность превышала ксилозидазную. Для рКсз5 эта закономерность наблюдалась не только для синтетических субстратов - иНФ-производных ксилозы и глюкозы, но и для олигосахаридных и растворимых полимерных субстратов, содержащих фрагменты этих Сахаров.

Таблица 9. Удельные активности и биохимические параметры РКсз1 и рКсз5

С.1искпом>ете (рН5,0 и 40°С для и/о-нитрофенил-гликозидов; рН5,0 и 50°С

Субстрат Активность Активность

РКсз1, ед/мг РКсз5, ед/мг

о-нитрофенил-Р-О-ксилопиранозид 2,0 1,0

я-нитрофенил-Р-О-целлобиозид 0,2 5,3

и-нитрофенил-Р-Э-глюкопиранозид 0,1 18,8

я-нитрофенил-Р-Э-ксилопиранозид 5,0 0,03

я-нитрофенил-а-Ь-арабинофуранозид 0,03 0,004

ксилобиоза 6,2 0

целлобиоза 0,0 15,5

а-софороза 0,0 17,7

Р-гентиобиоза 0,0 43,5

ксилан берёзы 1,8 0,5

ксилан бука 1Д 0,6

ксилоглюкан од 0,05

Р-глюкан ячменя 0,1 5,1

ламинарин 0,0 74,6

КМЦ 0,0 0,5

крахмал 0,0 0,0

арабиноксилан 1,2 0,3

Биохимические параметры

Молекулярный вес, кДа 78 120

р1 5,6 4,9

Тип действия экзо экзо

Семья гликозилгидролаз 3 3

рКсз5 была способна гидролизовать не только 1,3-Р-О-глюкозидные связи (ламинарин), но также 1,4- (целлобиоза, КМЦ), 1,2- (а-софороза) и 1,6- (Р-гентиобиоза) р-Э-глюкозидные связи, хотя наибольшая активность соответствовала всё же гидролизу 1,3-р-0-глюкозидных связей.

Следует отметить, что впервые в практике нашей лаборатории была обнаружена истинная Р-ксилозидаза (РКсз1) с ксилобиазной активностью, преобладающей над ксиланазной. В соответствии с проявленной субстратной специфичностью Р-ксилозидаз, следует заключить, что РКсз1 является Р-1,4-ксилозидазой (истинной ксилобиазой), а рКсз5 - Р-1,3/1,4-экзо-глюкозидазой, проявляющей Р-ксилозидазную активность. Изменение ММР ксилана в ходе его гидролиза исследуемыми р-ксилозидазами свидетельствовало об экзо-деполимеразном действии этих ферментов на полимерный субстрат.

Для изучения субстратной специфичности АФ7 был выбран широкий спектр возможных субстратов, включающий низкомолекулярные (синтетические яНФ-производные) и полисахаридные субстраты. Полученные результаты приведены в табл. 10.

Таблица 10. Удельные активности и биохимические параметры АФ7 СЛискло-юете (рН5,0 и 40°С для и-нитрофенил-гликозидов; рН5,0 и 50°С для

Субстрат Активность АФ7, ед/мг

и-нитрофенил-а-О-галактопиранозид 0

и-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид 0

«-нитрофенил-а-Ь-арабинофуранозид 0,02

и-нитрофенил-а-Ь-арабинопиранозид 0

КМЦ 0

ламинарин 3,5

Р-глюкан 0

ксилоглюкан 0

ксилан берёзы 0

арабиноксилан пшеницы 39,9

арабинан 1,8

арабиногалактан 0

гуаран 0

тара ГМ 0

карубин 0

арабинан неразветвл. 0

Биохимические параметры

Молекулярный вес, кДа 61

Р1 4,9

Тип действия экзо

Семья гликозилгидролаз 43

Исследуемый фермент обладал высокой специфичностью к полимерному субстрату арабиноксилану и характеризовался весьма небольшими активностями (или их отсутствием) по другим арабинозо-содержащим субстратам - как по низкомолекулярным синтетическим субстратам п-нитрофенил-а-Ь-арабинофуранозиду и и-нитрофенил-а-Ь-арабинопиранозиду,

так и по высокомолекулярным - арабинану и арабиногалактану. Характер изменения ММР арабиноксилана в ходе его гидролиза АФ7 соответствовал действию экзо-деполимераз на полимерный субстрат.

Каталитические параметры исследуемых ферментов приведены в табл. 11. По сравнению с описанными в литературе ферментами, рКсз5 характеризовалась повышенной эффективностью гидролиза иНФГ.

Таблица 11. Каталитические параметры гидролиза яНФК, иНФГ и арабиноксилана под действием рКсз1, РКсз5 и АФ7 СЛискпо\\>ете (рН5,0 и

Фермент/субстрат км УМ/ГЕ1

рКсз1 / лНФК 1,5±0,1 мМ 15±1 1 /с

РКсз5 / «НФГ 0,3±0,1 мМ 88±7 1 /с

АФ7 / арабиноксилан 1,7±0,1 мг/мл 44±3 1 /с

рН- и температурные зависимости активности рКсз1, РКсз5 и АФ7 СЛискпсмете были исследованы на примере гидролиза иНФК, «НФГ и арабиноксилана, полученные результаты обобщены в табл. 12.

Таблица 12. рН- и температурные оптимумы активности РКсз1, РКсз5 и АФ7 СЛискпоч/ете.

Фермент Субстрат Оптимальные значения

Топт,°С (рН5,0) рНопт

РКсз1 яНФК 60 4,8 (40°С)

рКсз5 иНФГ 75 4,6 (40°С)

АФ7 арабиноксилан 70 4,0-5,5 (50°С)

Согласно полученным экспериментальным данным, рН-оптимумы исследованных ферментов располагались в слабокислой области (рН4,5-5,0). Температурные оптимумы активности этих ферментов оказались различными — наиболее высокотемпературный оптимум соответствовал РКсз5, а наиболее низкотемпературный - рКсз1.

Исследование процессов температурной инактивации РКсз1, РКсз5 и АФ7 СЛискпочгепхе показало, что температурная стабильность этих ферментов уменьшается в ряду РКсз5, АФ7 и рКсз1, что полностью согласуется со значениями температурных оптимумов этих ферментов.

Исчерпывающий гидролиз Р-глюкана и ламинарина под действием рКсз5 СЛискпомете приводил к практически количественному выходу глюкозы. Ферменты экзо-деполимеразного действия, способные проводить конверсию полимерного субстрата подобным образом (по т.н. процессинговому механизму) весьма интересны с точки зрения потенциального использования в биотехнологических процессах. По сравнению с почти полной конверсией р-глюкана и ламинарина рКсз5, степень исчерпывающего гидролиза ксилана и

арабиноксилана гомогенными рКсз! и АФ7 оказалась значительно меньше (50% и 13% соответственно).

На примере гидролиза ксилана берёзы была изучена возможность глубокой деструкции ксиланов под действием смесей исследуемых ксилозидаз и ксиланазы рКсил1 С. lucknowen.se, свойства которой были ранее изучены в нашей лаборатории. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что гомогенная РКсз1 обеспечивает более высокую степень конверсии ксилана берёзы при исчерпывающем гидролизе, чем гомогенная рКсз5 (50% и 20% соответственно), при этом эффективность смесей этих ферментов с РКсил! оказалась примерно одинаковой (60% и 64% соответственно). Анализ низкомолекулярных продуктов гидролиза показал, что единственным конечным продуктом гидролиза ксилана берёзы РКсз1 и рКсз5, а также их смесями с рКсил 1 является ксилоза. При этом действие гомогенной РКсил 1 на этот субстрат приводит к образованию ксилозы и ксилобиозы.

Была изучена возможность использования АФ7 для гидролиза арабиноксилана пшеницы совместно с РКсил 1 и рКсз1 (показавшей себя более эффективной, чем РКсз5 при гидролизе ксилана берёзы). Полученные данные свидетельствуют о значительной эффективности АФ7, как компонента ферментной смеси, осуществляющей кооперативную деструкцию арабиноксилана. При гидролизе растительного сырья (багасса, ПКС) АФ7 оказалась менее эффективной, чем при гидролизе арабиноксилана, что объясняется относительно небольшим содержанием арабиноксиланов в этих видах растительного сырья.

выводы

1. Определена субстратная специфичность, каталитические и биохимические параметры десяти ферментов, кодируемых молчащими генами С/пуяоярогшт ¡искпомепяе: трёх эндоглюканаз (ЭГ1 гликозилгидролазная семья (ГС) 7; ЭГ6 ГС6; ЭГ7 ГС6), двух а-галакггозидаз (аГал1, аГал2 ГС27), р-маннаназы (рМан2 ГС5), р-маннозидазы (рМнз9 ГС2), двух р-ксилозидаз (РКсз1, рКсз5 ГСЗ) и а-Ь-арабинофуранозидазы (АФ7 ГС43).

2. Показано, что эти ферменты отличаются от продуцируемых грибом СЛискпомепяе целлюлаз и гемицеллюлаз и представляют широкий спектр гликозилгидролаз, обладающих различной субстратной специфичностью и свойствами.

3. Среди гликозилгидролаз, кодируемых молчащими генами СЛискпсгмепяе, обнаружены ЭГ6, являющаяся, по-видимому, белком-энхансером, увеличивающим эффективность гидролитического действия других целлюлаз на нерастворимые целлюлозосодержащие субстраты, и рКсз5, обладающая нехарактерной для ферментов своего класса широкой субстратной специфичностью и способная гидролизовать до высоких степеней конверсии не только ксилозо-, но и глюкозосодержащие полисахаридные и олигосахаридные субстраты по механизму экзо-деполимеризации.

4. Показано, что комбинированное применение двух а-галактозидаз (аГал1, аГал2), Р-маннаназы (рМан2) и Р-маннозидазы (РМнз9) С.lucknowen.se позволяет эффективно трансформировать как полисахаридные, так и олигосахаридные галактозо- и маннозосодержащие субстраты в продукты с определённой химической структурой и степенью полимеризации.

5. Предложена новая статистическая модель, описывающая распределение замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи галактоманнанов (ГМ), позволяющая характеризовать как структуру ГМ, так и субстратную специфичность ГМ-гидролизующих ферментов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Klyosov A.A., Dotsenko G.S., Hinz S.W.A., Sinitsyn A.P. Structural features of 1,4-ß-D-galactomannans of plant origin as a probe for 1,4-ß-mannanase polymeric substrate specificity. Carbohydrate Research, 2012, v. 352, p. 65-69.

2. Dotsenko G.S., Sinitsyna O.A., Hinz S.W.A., Wery J., Sinitsyn A.P. Characterization of a GH family 3 ß-glycoside hydrolase from Chrysosporium lucknowense and its application to the hydrolysis of ß-glucan and xylan. Bioresource Technology, 2012, v. 112, p. 345-349.

3. Доценко Г.С., Семёнова M.B., Синицына O.A., Хинц C.B.A., Вери Я., Зоров И.Н., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Клонирование, выделение и характеристика галактоманнан-гидролизующих ферментов Myceliophthora thermophila. Биохимия, 2012, т. 77, с. 1556-1566.

4. Доценко Г.С., Синицын А.П. Свойства а-галактозидазы, ß-ксилозидазы и арабинофуранозидазы микромицетного гриба Chrysosporium lucknowense. Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2011, часть 1, с. 317-318.

5. Доценко Г.С. Исследование свойств а-галактозидазы, маннаназы и эндоглкжаназ гриба Chrysosporium lucknowense. Материалы XVII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», секция «Химия», Москва, 2010.

6. Доценко Г.С. Свойства а-галактозидазы, ß-ксилозидазы и арабинофуранозидазы гриба Chrysosporium lucknowense. Материалы XVIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011 », секция «Химия», Москва, 2011, с. 400.

7. Доценко Г.С., Клёсов A.A., Синицын А.П. Использование 1,4-ß-D-галактоманнанов различного строения для изучения специфичности действия l,4-ß-MaHHaHa3, Материалы XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012», секция «Химия», Москва, 2012, с. 524.

8. Доценко Г.С., Синицын А.П. Эндоглюканазы ЭГ1, ЭГ6 и ЭГ7 Chrysosporium lucknowense: биохимические свойства и применение для осахаривания целлюлозосодержащего сырья. Материалы международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии», Саранск, 2012, с. 138.

Подписано в печать 19.10.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 120 экз. Заказ № 1255 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. Основные компоненты растительной биомассы.

1.1. Строение и свойства целлюлозы.

1.2. Свойства гемицеллюлоз.

1.2.1. Природные ксилансодержащие полисахариды.

1.2.2. Природные полисахариды, содержащие галактозу и маннозу.

ГЛАВА 2. Свойства некоторых ферментов, гидролизующих целлюлозу и гемицеллюлозы.

2.1. Свойства эндоглюканаз.

2.2. Свойства (3-ксилозидаз.

2.3. Свойства а-галактозидаз.

2.4. Свойства (3-маннаназ.

2.5. Свойства (3-маннозидаз.

2.6. Свойства а-Ь-арабинофуранозидаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 3. Объекты исследования и методы экспериментов.

3.1. Ферменты и ферментные препараты.

3.2. Субстраты.

3.3. Реактивы.

3.4. Хроматографические сорбенты.

3.5. Определение концентрации белка.

3.6. Определение молекулярной массы ферментов.

3.7. Определение концентрации Сахаров.

3.8. Определение активности ферментов.

3.9. Определение каталитических параметров действия ферментов (Км и V ).

3.10. Изучение зависимости активности ферментов от рН и температуры.

3.11. Изучение термостабильности ферментов.

3.12. Исчерпывающий гидролиз полисахаридных субстратов.

3.13. Анализ продуктов исчерпывающего гидролиза с помощью ВЭЖХ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 4. Свойства эндоглюканаз ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7 С.1искпом>ете.

4.1. Субстратная специфичность эндоглюканаз ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7.

4.2. Каталитические параметры гидролиза КМЦ эндоглюканазами ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7.

4.3. Зависимости активности эндоглюканаз ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7 от рН и температуры.

4.4. Стабильность эндоглюканаз ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7.

4.5. Изменение ММР р-глюкана под действием эндоглюканаз ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7.

4.6. Состав низкомолекулярных продуктов исчерпывающего гидролиза Р-глюкана эндоглюканазами ЭГ1, ЭГ6, ЭГ7.

4.7. Осахаривание целлюлозосодержащего сырья.

ГЛАВА 5. Свойства Р-маннаназы рМан2, Р-маннозидазы рМнз9 и а-галактозидаз аГал1 и аГал2 С.1искпом>ете.

5.1. Субстратная специфичность рМан2, рМнз9, аГал1 и аГал2.

5.2. Каталитические параметры гидролиза специфических субстратов рМан2, РМнз9, аГал1 и аГал2.

5.3. Зависимости активности рМан2, РМнз9, аГал1 и аГал2 от рН и температуры.

5.4. Стабильность рМан2, РМнз9, аГал1 и аГал2.

5.5. Исчерпывающий гидролиз галактоманнанов.

5.6. Изменение ММР карубина под действием аГал1 и аГал2 СЛискпоуоете, аГалА и аГалС Р.сапезсет и рМан2 С.1искпом>ете и рМан Т.геезе1.

5.7. Состав низкомолекулярных продуктов исчерпывающего гидролиза карубина и стахиозы.

5.8. Галактоманнаны различной структуры как инструмент для изучения субстратной специфичности р-маннаназ.

ГЛАВА 6. Свойства Р-ксилозидаз рКсз1 и рКсз5 и а-Ь-арабинофуранозидазы АФ

С.1искпом>ете.

6.1. Субстратная специфичность рКсз1, рКсз5 и АФ7.

6.2. Каталитические параметры рКсз1, рКсз5 и АФ7.

6.3. Зависимости активности рКсз1, рКсз5 и АФ7 от рН и температуры.

6.4. Стабильность рКсз1, рКсз5 и АФ7.

6.5. Исчерпывающий гидролиз специфических субстратов и растительного сырья РКсз1, рКсз5 и АФ7.

6.6. Изменение ММР специфических субстратов под действием рКсз1, рКсз5 и

АФ7 СЛискпоч/ете.

ВЫВОДЫ.

Развитие человеческой цивилизации во все времена было тесно связано с освоением и использованием различных источников энергии. При этом для сохранения темпов развития требовалось поддержание определённого уровня энергозатрат, а для открытия новых горизонтов оказывалось необходимым увеличение энерговложений. Поэтому поиск новых источников энергии и их эффективное использование всегда являлось актуальной задачей, стоящей перед человечеством. Не стало исключением и наше время, и суть этой задачи сохранилась, однако 21 век всё же внёс свою специфику в постановку этой задачи и в требования к её предлагаемым решениям. Так, современный источник энергии должен удовлетворять критериям доступности, мощности, экологичности, возобновляемости, а также конкурентоспособности с традиционными углеводородными энергоносителями. Растительное сырьё удовлетворяет всем выдвинутым критериям, и усилия биотехнологов направлены на разработку наиболее эффективных способов его использования.

Промышленная технология ферментов начала развиваться в первой четверти 20 века и довольно скоро стало понятным, что большое разнообразие ферментов и их характеристик предоставляет широкие возможности не только для эффективной переработки растительного сырья, но и для всевозможных контролируемых модификаций различных растительных биополимеров с последующим получением продуктов, обладающих ценными, заранее определёнными свойствами. В настоящее время интенсивный поиск новых продуцентов ферментов по-прежнему продолжается, а изучение свойств этих ферментов и их генно-инженерных модификаций является неотъемлемой частью современной биотехнологии.

В результате совместных исследований, проведённых на кафедре химической энзимологии МГУ имени М. В. Ломоносова, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина и нашими зарубежными коллегами, был найден перспективный продуцент ферментов, обладающих ценными биотехнологическими свойствами и способных гидролизовать различные углеводсодержащие субстраты - гриб СЬгуъозрогтт lucknowen.se, в последнее время известный также под названием Mycelioph.th.or thermoph.Ua [1, 2].

Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства некоторых эндоглюканаз, целлобиогидролаз [3, 4] и ксиланаз [5], секретируемых этим грибом, в то время как другие целлюлазы и гемицеллюлазы подробно не исследовались. Поэтому целью данной диссертационной работы являлось изучение свойств новых, не исследованных ранее ферментов гриба СЛискпом/ете. Выбор этой цели был продиктован как необходимостью систематизировать знания о составе и свойствах индивидуальных компонентов, входящих в состав ферментного комплекса, секретируемого С.1искпоч>ете, так и перспективой их использования в процессах трансформации углеводсодержащего растительного сырья.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Изучить биохимические свойства десяти новых ферментов СЛискпом^ете: трёх эндоглюканаз, двух а-галактозидаз, Р-маннаназы, Р-маннозидазы, двух Р-ксилозидаз и а-арабинофуранозидазы (субстратная специфичность, каталитические параметры гидролиза специфических субстратов, рН- и температурная зависимости активности, термостабильность, характер изменения ММР в процессе гидролиза полимерных субстратов).

2) Исследовать возможности модификации полисахаридных субстратов этими гомогенными ферментами, их смесями между собой и с ферментами других грибных продуцентов.

3) Исследовать возможности гидролиза биотехнологического растительного сырья гомогенными ферментами, их смесями между собой и с ферментами других грибных продуцентов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ

БИОМАССЫ

Основной частью органической материи на Земле являются клеточные стенки растений. Общие запасы растительной биомассы составляют около одного триллиона тонн, что делает данный материал привлекательным возобновляемым сырьем для получения различных видов топлива и других полезных продуктов [6, 7].

Наиболее важные химические компоненты клеточных стенок растений - это полисахариды [8, 9], которые можно разделить на две большие группы. Полисахариды первой группы - длинные неразветвленные молекулы, существующие в основном в кристаллической форме, которые в клеточной стенке агрегированы в пучки, называемые микрофибриллами. Наиболее распространенным микро-фибриллярным полисахаридом растительной биомассы является целлюлоза. Микрофибриллы заключены в матрикс, состоящий из полисахаридов второй группы, которые не имеют кристаллической структуры. Полисахариды матрикса, в свою очередь, делятся по химической структуре и растворимости на пектины и гемицеллюлозы. Пектины хорошо экстрагируются кипящей водой, в то время как гемицеллюлозы растворимы лишь в 6М растворе №ОН (микрофибриллярные полисахариды не растворимы ни в кипящей воде, ни в щелочи) [10].

Также в состав клеточных стенок большинства высших растений входят лигнин, белки и, в некоторых случаях, неорганические включения (главным образом карбонаты и силикаты кальция [11].

выводы

1. Определена субстратная специфичность, каталитические и биохимические параметры десяти ферментов, кодируемых молчащими генами Скгуъозрогшт 1искпом>ете\ трёх эндоглюканаз (ЭГ1 гликозилгидролазная семья (ГС) 7; ЭГ6 ГС6; ЭГ7 ГС6), двух а-галактозидаз (аГал1, аГал2 ГС27), (3-маннаназы фМан2 ГС5), (3-маннозидазы (РМнз9 ГС2), двух Р-ксилозидаз (рКсз1, рКсз5 ГСЗ) и а-Ь-арабинофуранозидазы (АФ7 ГС43).

2. Показано, что эти ферменты отличаются от продуцируемых грибом СЛискпом>ете целлюлаз и гемицеллюлаз и представляют широкий спектр гликозилгидролаз, обладающих различной субстратной специфичностью и свойствами.

3. Среди гликозилгидролаз, кодируемых молчащими генами СЛискпоучете, обнаружены ЭГ6, являющаяся, по-видимому, белком-энхансером, увеличивающим эффективность гидролитического действия других целлюлаз на нерастворимые целлюлозосодержащие субстраты, и РКсз5, обладающая нехарактерной для ферментов своего класса широкой субстратной специфичностью и способная гидролизовать до высоких степеней конверсии не только ксилозо-, но и глюкозосодержащие полисахаридные и олигосахаридные субстраты по механизму экзо-деполимеризации.

4. Показано, что комбинированное применение двух а-галактозидаз (аГал1, аГал2), р-маннаназы (рМан2) и Р-маннозидазы (РМнз9) СЛискпом>ете позволяет эффективно трансформировать как полисахаридные, так и олигосахаридные галактозо- и маннозосодержащие субстраты в продукты с определённой химической структурой и степенью полимеризации.

5. Предложена новая статистическая модель, описывающая распределение замещенных и незамещенных звеньев полимерной цепи галактоманнанов (ГМ), позволяющая характеризовать как структуру ГМ, так и субстратную специфичность ГМ-гидролизующих ферментов.

1. Hinz S.W.A., Pouvreau L., Joosten R., Bartels J., Jonathan M.C., Wery J., Schols H.A. Hemicellulase production in Chrysosporium lucknowense CI. J. Cereal Sci., 2009, v. 50, p. 31823.

2. Бухтояров Ф.Е. Выделение и свойства целлюлаз мицелиального гриба Chrysosporium lucknowense. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 2004, 125 с.

3. Шульга Т.Н. Свойства целлобиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 2008, 125 с.

4. Устинов Б.Б. Свойства ксиланаз Chrysosporium lucknowense. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 2006, 148 с.

5. Sims R.E.H., Mabee W., Saddler J.N., Taylor M. An overview of second generation biofuel technologies. Biores. Technol., 2010, v. 101, p. 1570-1580.

6. Peralta-Yahya P.P., Keasling J.D. Advanced biofuel production in microbes. Biotechnol. J., 2010, v. 5, p. 147-162.

7. Abramson M., Shoseyov O., Shani Z. Plant cell wall reconstruction toward improved lignocellulosic production and processability. Plant Sci., 2010, v. 178, p. 61-72.

8. Stephen A.M. (ed.) Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., New York, 1995, 654 pp.

9. Stephen C.F. Cell wall polysaccharide composition and covalent crosslinking. In Annual Plant Reviews, edited by Peter Ulvskov. Plant polysaccharides, biosynthesis and bioengineering. Blackwell Publishing, 2011, v. 41, p. 1-42.

10. O'Neill M.A., York W.S. The composition and structure of plant primary cell walls. In Annual Plant Reviews, edited by Rose J.K.C. The Plant Cell Wall, Blackwell Publishing, 2003, v. 8, p. 1-54.

11. Pérez S., Samain D. Structure and engineering of celluloses. Advan. Carbohyd. Chem. Biochem., 2010, v. 64, p. 25-116.

12. Роговин З.А. Химия целлюлозы, M., Химия, 1972, 519 с.

13. Целлюлоза и ее производные (ред. И.Байклз, Л.Сегал), М., Мир, 1974, в 2-х томах, т.1 -500 е., т.2- 510 с.

14. Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В. Химия древесины и синтетических полимеров, СПб., СПбЛТА, 1999, 628 с.

15. Jarvis M.J. Plant cell walls: supramolecular structures. Food Hydrocolloid., 2011, v. 25, p. 257-262.

16. Peng F., Peng P., Xu F., Sun R.-C. Fractional purification and bioconversion of hemicelluloses. Biotechnol. Adv., 2012, v. 30, p. 879-903.

17. Xu F. Structure, ultrastructure and chemical composition. In Cereal Straw as a Resource for Sustainable Bio Materials and Biofuels. First edition. Elsevier, 2010, p. 9-47.

18. Ren J.-L., Sun R.-C. Hemicelluloses. In Cereal Straw as a Resource for Sustainable Bio Materials and Biofuels. First edition. Elsevier, 2010, p. 73-130.

19. Samanta A.K., Jayapal N., Kolte A.P., Senani S., Sridhar M., Suresh K.P., Sampath K.T. Enzymatic production of xylooligosaccharides from alkali solubilized xylan of natural grass (Sehima nervosum). Biores. Technol., 2012, v. 112, p. 199-205.

20. Sedlmeyer F.B. Xylan as by-product of biorefineries: characteristics and potential use for food applications. Food Hydrocolloid., 2011, v. 25, p. 1891-1898.

21. Fundadora N.G.V., Enomoto-Rogersa Y., Takemura A., Iwata T. Acetylation and characterization of xylan from hardwood kraft pulp. Carbohyd. Polym., 2012, v. 87, p. 170- 176.

22. Hayashi T. Xyloglucans in the primary cell walls. Annu. Rev. Plant. Physiol., 1989, v. 40, p. 139-168.

23. Bimalendu R., Corinne L.B., Catherine L., Eric C., Azeddine D., Patrice L. Structural investigation of hemicellulosic polysaccharides from Argania spinosa: characterization of a novel xyloglucan motif. Carbohyd. Res., 2004, v. 339, p. 201-208.

24. Makaravicius T., Basinskiene L., Juodeikiene G., van Gool M.P., Schols H.A. Production of oligosaccharides from extruded wheat and rye biomass using enzymatic treatment. Catal. Today., 2012, DOI 10.1016/j.cattod.2012.02.053.

25. Nishitani K., Donald J.N. An enzyme probe for the resolution of glucuronoxylan and glucuronoarabinoxylan structures. Food Hydrocolloid., 1991, v. 5, p. 197-207.

26. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases, Portland Press Research Monograph, London-Chapel Hill, 1993, v.4,120 pp.

27. Vries R.P., Broeck H.C., Dekkers E., Manzanares P., Graaff L.H., Visser J. Differential expression of three a-galactosidase genes and a single a-galactosidase gene from Aspergillus niger. AEM, 1999, v. 65, p. 2453-2460.

28. Luonteri E., Tenkanen M., Viikari L. Substrate specifities of Penicillium simplicissium alpha-galactosidases. Enzyme Microb. Technol., 1998, v. 22, p. 192-198.

29. Teixeira J.S., McNeill V., Ganzle M.G. Levansucrase and sucrose phoshorylase contribute to raffinose, stachyose, and verbascose metabolism by lactobacilli. Food Microbiol., 2012, v. 31, p. 278-284.

30. Song D., Chang S.K.C. Enzymatic degradation of oligosaccharides in pinto bean flour. J. Agr. Food Chem., 2006, v. 54, p. 1296-1301.

31. Painter T.J. Structural evolution of glycans in algae. Pure Appl. Chem., 1983, v. 55, p. 677694.

32. Simoes J., Nunes F.M., Domingues P., Coimbra M.A., Domingues M.R. Mass spectrometry characterization of an Aloe vera mannan presenting immunostimulatory activity. Carbohyd. Polym., 2012, v. 90, p. 229-236.

33. Simxes J., Nunes F.M., Domingues M.R.M., Coimbra M.A. Structural features of partially acetylated coffee galactomannans presenting immunostimulatory activity. Carbohyd. Polym., 2010, v. 79, p. 397^102.

34. An N.T., Thien D.T., Dong N.T., Dung P.L., Du N.V. Characterization of glucomannan from some Amorphophallus species in Vietnam. Carbohyd. Polym., 2010, v. 80, p. 308-311.

35. Tatirat O., Charoenrein S. Physicochemical properties of konjac glucomannan extracted from konjac flour by a simple centrifugation process. LWT Food Science and Technology, 2011, v. 44, p. 2059-2063.

36. Ademark P., Larsson M., Terneld F., Stalband H. Multiple a-galactosidases from Aspergillus niger. purification, characterization and substrate specificities. Enzyme Microb. Technol., 2001, v. 29, p. 441-448.

37. Xu C., Leppanen A.-S., Eklund P., Holmlund P., Sjoholm R., Sundberg K., Willfor S. Acetylation and characterization of spruce (Picea abies) galactoglucomannans. Carbohyd. Res., 2010, v. 345, p. 810-816.

38. Pollard M.A., Eder В., Fischer P., Windhab E.J. Characterization of galactomannans isolated from legume endosperms of Caesalpinioideae and Faboideae subfamilies by multidetection aqueous SEC. Carbohyd. Polym., 2010, v. 79, p. 70-84.

39. Щербухин В.Д., Анулов О.В. Галактоманнаны семян бобовых (обзор). Прикладная биохимия и микробиология, 1999, т. 35, с. 257-274.

40. Williams J., Villarroya H., Petek F. a-Galactosidases II, III and IV from seeds of Trifolium repens. Biochem. J„ 1978, v. 175, p. 1069-1077.

41. Simxes J., Nunes F.M., Domingues M.R., Coimbra M.A. Demonstration of the presence of acetylation and arabinose branching as structural features of locust bean gum galactomannans. Carbohyd. Polym., 2011, v. 86, p. 1476- 1483.

42. Cerqueira M.A., Souza B.W.S., Simoes J., Teixeira J.A., Domingues M.R.M., Coimbra M.A., Vicente A.A. Structural and thermal characterization of galactomannans from non-conventional sources. Carbohyd. Polym., 2011, v. 83, p. 179-185.

43. Funami T., Kataoka Y., Omoto T., Goto Y., Asai I., Nishinari K. Effects of non-ionic polysaccharides on the gelatinization and rétrogradation behavior of wheat starch. Food Hydrocolloid., 2005, v. 19, p. 1-13.

44. Clarke A.J. Biodégradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc., Lancaster, 1997, 272 pp.

45. Vlasenko E., Schulein M., Cherry J., Xu F. Substrate specificity of family 5, 6, 7, 9, 12 and 45 endoglucanases. Biores. Technol., 2010, v. 101, p. 2405-2411.

46. Tong C.C., Cole A.L., Shepherd M.G. Purification and properties of the cellulases from the thermophilic fungus Thermoascus auranticus. Biochem. J., 1980, v. 191, p. 83-94.

47. Schulein M. Enzymatic properties of cellulases from Humicula insolens. J. Biotechnol., 1997, v. 57, p. 71-81.

48. Lindenmuth B.E., McDonald K.A. Production and characterization of Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in Pichia pastoris. Protein Express. Purif., 2011, v. 77, p. 153-158.

49. Mansfield S.D., Saddler J.N., Guebitz G.M. Characterization of endoglucanases from the brown rot fungi Gloeophyllum sepiarium and Gloeophyllum trabeum. Enzyme and Microbial Technology, 1998, v. 23, p. 133-140.

50. Bhat M.K., McCrae S.I., Wood T.M. The endo-l,4-P-D-glucanase system of Pénicillium pinophilum cellulase: isolation, purification and characterization of five major endoglucanase components. Carbohyd. Res., 1989, v. 190, p. 279-297.

51. Takashima S., Iikura H., Nakamura A., Hidaka M., Masaki H., Uozumi T. Overproduction of recombinant Trichoderma reesei cellulases by Aspergillus oryzae and their enzymatic properties. J. Biotechnol., 1998, v. 65, p. 163-171.

52. Claeyssens M., Nerinckx W., Piens K. Carbohydrases from Trichoderma reesei and other microorganizms. Structure, biochemistry, genetics and applications. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, 1998, 238 pp.

53. Elvan H., Ertunga N.S., Yildirim M., Colak A. Partial purification and characterisation of endoglucanase from an edible mushroom, Lepista flaccida. Food Chem., 2010, v. 123, p. 291— 295.

54. Zhang F., Chen J.J., Ren W.Z., Nie G.H., Ming H., Tang S.K., Li W.J. Cloning, expression and characterization of an alkaline thermostable GH9 endoglucanase from Thermobifida halotolerans YIM 90462T. Biores. Technol., 2011, v. 102, p. 10143-10146.

55. Nakanishi A., Kuroda K, Ueda M. Direct fermentation of newspaper after laccase treatment using yeast codisplaying endoglucanase, cellobiohydrolase and P-glucosidase. Renewable Energy, 2012, v. 44, p. 199-205.

56. Delabona P.S., Pirota R.D.P.B., Codima C.A., Tremacoldi C.R., Rodrigues A., Farinas C.S. Using Amazon forest fungi and agricultural residues as a strategy to produce cellulolytic enzymes. Biomass Bioenerg., 2012, v. 37, p. 243-250.

57. Girio F.M., Fonseca C., Carvalheiro F., Duarte L.C., Marques S., Bogel-Lukasik R. Hemicelluloses for fuel ethanol: A review. Biores. Technol., 2010, v. 101, p. 4775-4800.

58. Henrissat B., Bairoch A. Updated the Sequence-Based Classification of Glycosyl Hydrolases. Biochem. J., 1996, v. 316, p. 695-696.

59. Juturu W., Wu J.C. Microbial xylanases: Engineering, production and industrial applications. Biotechnol. Adv., 2011, DOI 10.1016/j.biotechadv.2011.11.006.

60. Voremen S., Heldens J., Boyd C., Henrissat B., Keen N.T. Cloning and characterization of the bgx4 gene from Erwinia chryzanthemi D1 which encodes a P-glucosidase/xylosidase. Mol. Gen. Genet., 1995, v. 246, p. 465-477.

61. De Vries R.P. Acessory enzymes from Aspergillus involved in xylan and pectin degradation. PhD Dissertation, Agricultural University, Wageningen, Netherlands, 1992.

62. Bergquist P.L., Saul D.J., Gibbs M.D., Morris D.D., Te'o V.S.J., Morgan H.W. Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria. FEMS Microbiol. Ecol., 1999, v. 28, p. 99-110.

63. Oh H., Choi Y. Sequence analysis of P-xylosidase gene from Bacillus stearothermophilus. Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 1994, v. 22, p. 134-142.

64. Kiss T., Kiss L. Purification and characterization of an extracellular P-D-xylosidase from Aspergillus carbonarius. World J. Microbiol. Biotechnol., 2000, v. 16, p. 465-470.

65. Kumar S., Ramon D. Purification and regulation of the synthesis of a P-xyiosidase from Aspergillus nidulans. FEMS Microbial. Lett., 1996, v. 135, p. 287-293.

66. Ransom R.F., Walton J.D. Purification and characterization of extracellular P-xylosidase and a-arabinosidase from the plant pathogenus fungus Cochliobolus carbonum. Carbohyd. Res., 1997, v. 297, p. 357-364.

67. Saha B.C. Purification and characterization of an extracellular P-xylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J. Ind. Microbial. Biotechnol., 2001, v. 27, p. 241-245.

68. Saha B.C. Purification and properties of an extracellular P-xylosidase from a newly isolated Fusariumproliferatum. Biores. Technol., 2003, v. 90, p. 33-38.

69. Almeida E.M.D., Lourdes M.D., Polizeli T.M., Terenzi H.F., Jorge J.A. Purification and biochemical characterization of P-xylosidase from Humicola grisea var. Thermoidea. FEMS Microbial. Lett., 1995, v. 130, p. 171-176.

70. Garcia-Campayo V., Wood T.M. Purification and characterization of a P-D-xylosidase from the anaerobic rumen fungus Neomallimastix frontalis. Carbohyd. Res., 1993, v. 242, p. 229-245.

71. Rasmussen L.E., Sorensen H.R., Vind J., Vikso-Nielsen A. Mode of action and the properties of the P-xylosidases from Talaromyces emersonii and Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng., 2006, v. 94, p. 869-876.

72. Stutzenberger F., Bodine A.B. Thermostable P-xylosidase from Thermomonospora curvata. J. Ind. Microbial. Biotechnol., 1998, v. 20, p. 55-60.

73. De A.Ximenes F., Paula Silveria F.Q., Filho E.X. Production of P-xylosidase activity by Trichoderma harzianum strains. Curr. Microbiol., 1996, v. 33, p. 71-77.

74. Herrmann M.C., Vrsanska M., Jurikova M., Hirrsch J., Biely P., Kubicek C.P. The p-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional P-D-xylan xylohydrolase. Biochem. J., 1997, v. 321, p. 375-381.

75. Ohta K., Fujimoto H., Fujii S., Wakiyama M. Cell-associated P-xylosidase from Aureobasidium pullulans ATCC 20524: Purification, properties, and characterization of the encoding gene. J. Biosci. Bioeng., 2010, v. 110, p. 152-157.

76. Teng C., Jia H., Yan Q., Zhou P., Jiang Z. High-level expression of extracellular secretion of a b-xylosidase gene from Paecilomyces thermophila in Escherichia coli. Biores. Technol., 2011, v. 102, p. 1822-1830.

77. Gottschalk L.M.F., Oliveira R.A., Bon E.P.S. Cellulases, xylanases, P-glucosidase and ferulic acid esterase produced by Trichoderma and Aspergillus act synergistically in the hydrolysis of sugarcane bagasse. Biochem. Eng. J., 2010, v. 51, p. 72-78.

78. Polizeli M.L., Rizzatti A.C., Monti R., Terenzi H.F., Jorge J.A., Amorim D.S. Xylanases from fungi: properties and industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005, v. 67, p. 577-591.

79. Dumona C., Songa L., Bozonneta S., Faurea R., O'Donohuea M.J. Progress and future prospects for pentose-specific biocatalysts in biorefining. Process Biochem., 2012, v. 47, p. 346357.

80. Anisha G.S., John R.P., Prema P. Substrate specificities and mechanism of action of multiple a-galactosidases from Streptomyces griseoloalbus. Food Chem., 2011, v. 124, p. 349-353.

81. Baik S., Saito K., Yokota A., Asano K., Tomita F. Molecular cloning and high-level expression in E.coli of fungal a-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084. J. Biosci. Bioeng., 2000, v. 90, p. 168-173.

82. Bahl O., Agrawal K. Glycosidases of Aspergillus niger. J. Biol. Chem., 1969, v. 244, p. 2970-2978.

83. Manzanares P. Characterization of galactosidase from Aspergillus niger. purification of a novel a-galactosidase activity. Enzyme Microb. Technol., 1998, v. 22, p. 383 -390.

84. Lee Y.C., Wacek V. Galactosidases from Aspergillus niger. Arch. Biochem. Biophys., 1970, v. 138, p. 264-271.

85. Puchart V., Vrsanska M., Bhat M.K., Biely P. Purification and characterization of a-galactosidase from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Biochimica et Biophysica Acta, 2000, v. 1524, p. 27-37.

86. Shivam K., Mishra S.K. Purification and characterization of a thermostable a-galactosidase with transglycosylation activity from Aspergillus parasiticus MTCC-2796. Process Biochem., 2010, v. 45, p. 1088-1093.

87. Kurakake M., MoriyamaY., Sunouchi R., Nakatani S. Enzymatic properties and transglycosylation of a-galactosidase from Penicillium oxalicum SO. Food Chem., 2011, v. 126, p. 177-182.

88. Синицына О.А., Федорова E.A., Вакар И.М., Кондратьева Е.Г., Рожкова A.M., Соколова J1.M., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Чулкин A.M., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства а-галактозидаз Penicillium canescens. Биохимия, 2008, т. 73, с. 127138.

89. Kumar S.K.P., Mulimani V.H. Continuous hydrolysis of raffinose family oligosaccharides in soymilk by fluidized bed reactor. LWT Food Science and Technology, 2010, v. 43, p. 220225.

90. Cao Y., Yuan T., Shi P., Luo H., Li N., Meng K., Bai Y., Yang P., Zhou Z., Zhang Z., Yao B. Properties of a novel a-galactosidase from Streptomyces sp. S27 and its potential for soybean processing. Enzyme Microb. Technol., 2010, v. 47, p. 305-312.

91. Kaneco R., Kusakabe I., Sakai Y., Murakami K. Substrate specifity of alpha-galactosidase from Mortierella vinacea. Agricultural and Biological Chemistry, 1990, v. 54, p. 237-238.

92. Mohamad S.N., Ramanan R.N., Mohamad R., Ariff A.B. Improved mannan-degrading enzymes'production by Aspergillus niger through medium optimization. New Biotechnology, 2010, v. 28, p. 146-152.

93. Zahura U.A., Rahman M.M., Inoue A., Tanaka H., Ojima T. An endo-ß-l,4-mannanase, AkMan, from the common sea hare Aplysia kurodai. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 2010, v. 157, p. 137-143.

94. Kumagai Y., Usuki H., Yamamoto Y., Yamasato A., Arima J., Mukaihara T., Hatanaka T. Characterization of calcium ion sensitive region for ß-mannanase from Streptomyces thermolilacinus. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, v. 1814, p. 1127-1133.

95. Phama T.A., Berrina J.G., Recorda E., Tob K.A., Sigoillot J.C. Hydrolysis of softwood by Aspergillus mannanase: role of a carbohydrate-binding module. J. Biotechnol., 2010, v. 148, p. 163-170.

96. Ademark P., Varga A., Medve J., Harjunp V., Drakenberg T., Tjerneld F., Stelbrand H. Soft-wood hemicellulose-degrading enzymes from Aspergillus niger. purification and properties of p-mannanase. J. Biotechnol., 1998, v. 63, p. 199-210.

97. Wua M., Tang C., Li J., Zhang H., Guo J. Bimutation breeding of Aspergillus niger strain for enhancing P-mannanase production by solid-state fermentation. Carbohyd. Res., 2011, v. 346, p. 2149-2155.

98. Ferreira H.M., Filho E.X.F. Purification and characterization of a b-mannanase from Trichoderma harzianum strain T4. Carbohyd. Polym., 2004, v. 57, p. 23-29.

99. Stalbrand H., Siika-aho M., Tenkanen M., Viikari L. Purification and characterization of two P-mannanases from Trichoderma reesei. J. Biotechnol., 1993, v. 29, p. 229-242.

100. Kurakake M., Sumida T., Masuda D., Oonishi S., Komaki T. Production of galacto- manno-oligosaccharides from guar gum by beta-mannanase from Penicillium oxalicum SO. J. Agr. Food Chem., 2006, v. 54, p. 7885-7889.

101. Cai H., Shi P., Luo H., Bai Y., Huang H., Yang P., Yao B. Acidic P-mannanase from Penicillium pinophilum CT. cloning, characterization and assessment of its potential for animal feed application. J. Biosci. Bioeng., 2011, v. 112, p. 551-557.

102. Wang Y., Shi P., Luo H., Bai Y., Huang H., Yang P., Xiong H., Yao B. Cloning, overexpression and characterization of an alkali-tolerant endo-P-l,4-mannanase from Penicillium freii F63. J. Biosci. Bioeng., 2012, v. 113, p. 710-714.

103. Katrolia P., Zhou P., Zhang P., Yan Q., Li Y., Jiang Z., Xu H. High level expression of a novel P-mannanase from Chaetomium sp. Exhibiting efficient mannan hydrolysis. Carbohyd. Polym., 2012, v. 87, p. 480- 490.

104. Wang H., Luo H., Li J., Bai Y., Huang H., Shi P., Fan Y., Yao B. An a-galactosidase from an acidophilic Bispora sp. MEY-1 strain acts synergistically with ß-mannanase. Biores. Technol., 2010, v. 101, p. 8376-8382.

105. Blibech M., Chaari F., Bhiri F., Dammak I., Ghorbel R.E., Chaabouni S.E. Production of manno-oligosaccharides from locust bean gum using immobilized Penicillium occitanis mannanase. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2011, v. 73, p. 111-115.

106. Ozturk B., Cekmecelioglu D., Ogel Z.B. Optimal conditions for enhanced ß-mannanase production by recombinant Aspergillus sojae. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2010, v. 64, p. 135-139.

107. Jiang Z., Wei Y., Li D., Li L., Chai P., Kusakabe I. High-level production, purification and characterization of a thermostable ß-mannanase from the newly isolated Bacillus subtilis WY34. Carbohyd. Polym., 2006, v. 66, p. 88-96.

108. Turner P., Mamo G., Karlsson E.N. Potential and utilization of thermophiles and thermostable enzymes in biorefining. Microb. Cell. Fact., 2007, v. 6, p. 1-9.

109. Sachslehner A., Foidl G., Foidl N., Gubitz G., Haltrich D. Hydrolysis of isolated coffee mannan and coffee extract by mannanases of Sclerotium rolfsii. J. Biotechnol., 2000, v. 80, p. 127-134.

110. Kote N.V., Patil A.G., Mulimani V.H. Optimization of the production of thermostable endo-beta-1,4 mannanases from a newly isolated Aspergillus niger gr and Aspergillus flavus gr. Appl. Biochem. Biotech., 2009, v. 152, p. 213-223.

111. Ethier N., Talbot G., Sygusch J. Gene cloning, DNA sequencing, and expression of thermostable beta-mannanase from Bacillus stearothermophilus. AEM, 1998, v. 64, p. 44284432.

112. Bourgault R., Oakley A.J., Bewley J.D., Wilce M.C. Three-dimensional structure of (1,4)-beta-D-mannan mannanohydrolase from tomato fruit. Protein Sci., 2005, v. 14, p. 1233-1241.

113. Ademark P., Lundqvist J., Hagglund P., Tenkanen M., Torto N., Tjerneld F., Stalbrand H. Hydrolytic properties of a beta-mannosidase purified from Aspergillus niger. J. Biotechnol., 1999, v. 75, p. 281-289.

114. Andreotti G., Giordano A., Tramice A., Mollo E., Trincone A. Purification and characterization of a P-D-mannosidase from the marine anaspidean Aplysia fasciata. J. Biotechnol., 2005, v. 119, p. 26-35.

115. Bauer M.W., Bylina E.J., Swanson R.V., Kelly R.M. Comparison of a P-glucosidase and a P-mannosidase from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus. The J. Biol. Chem., 1996, v. 271, p. 23749-23755.

116. Zahura U.A., Rahman M.M., Inoue A., Ojima T. Characterization of a P-D-mannosidase from a marine gastropod, Aplysia kurodai. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 2012, v. 162, p. 24-33.

117. Bouquelet S., Spik G., Montreuil J. Properties of a beta-D-mannosidase from Aspergillus niger. Biochimica et Biophysica Acta, 1978, v. 522, p. 521-530.

118. Zhao W., Zheng J., Zhou H. A thermotolerant and cold-active mannan endo-l,4-P-mannosidase from Aspergillus niger CBS 513.88: Constitutive overexpression and high-density fermentation in Pichia pastoris. Biores. Technol., 2011, v. 102, p. 7538-7547.

119. Wan C.C., Muldrey J.E., Li S.-C., Li Y.-T. P-Mannosidase from the mushroom Polyporus sulfurous. J. Biol. Chem., 1976, v. 251, p. 4384-4388.

120. Sone Y., Misaki A. Purification and characterization of P-D-Mannosidase and P-N-Acetyl-D-Hexosaminidase of Tremella fuciformis. Journal of Biochemistry, 1978, v. 83, p. 1135-1144.

121. Prendecka M., Buczynska A., Rogalski J. Purification and characterization of beta-mannosidases from white rot fungus Phlebia radiate. Pol. J. Microbiol., 2007, v. 56, p. 139-147.

122. Lim Y.R., Yeom S.J., Kim Y.S., Oh D.K. Synergistic production of L-arabinose from arabinan by the combined use of thermostable endo- and exo-arabinanases from Caldicellulosiruptor saccharolyticus. Biores. Technol., 2011, v. 102, p. 4277^-280.

123. Ravanal M.C., Rosa L., Eyzaguirre J. a-L-Arabinofuranosidase 3 from Penicillium purpurogenum (ABF3): potential application in the enhancement of wine flavour and heterologous expression of the enzyme. Food Chem., 2012, v. 134, p. 888-893.

124. Luonteri E. Fungal a-arabinofuranosidases and a-galactosidases acting on polysaccharides. VTT Publications, 1998, v. 371, p. 113-121.

125. Kaneko S., Arimoto M., Ohba M., Kobayashi H., Ishii T., Kusakabe I. Purification and substrate specificities of two a-L-arabinofuranisidases from Aspergillus awamori IFO 4033. AEM, 1998, v. 64, p. 4021-4027.

126. Ramon D., van der Veen P., Visser J. Arabinan degrading enzymes from Aspergillus nidulans: induction and purification. J. Biotechnol., 1993, v. 113, p. 15-22.

127. Kimura I., Sasahara H., Tajima S. Purification and characterization of two xylanases and an arabinofuranisidase from Aspergillus sojae. Journal of Fermentation and Bioengineering, 1995, v. 80, p. 334-339.

128. Luonteri E., Siika-Aho M., Tenkanen M., Viikari L. Purification and characterization of three a-arabinosidases from Aspergillus terreus. J. Biotechnol., 1995, v. 38, p. 279-291.

129. Renner M.J., Breznak J.A. Purification and properties of Arfl, an a-L-arabinofuranosidase from Cytophaga xylanolytica. AEM, 1998, v. 64, p. 43-52.

130. Poutanen K. An a-L-arabinofuranosidase of Trichoderma reesei. J. Biotechnol., 1998, v. 7, p. 271-282.

131. Weinstein L., Albersheim P. Structure of plant cell walls. Purification and partial characterization of a wall degrading endo-arabanase and arabinosidase from Bacillus subtilis. Plant Phisiol., 1979, v. 63, p. 425-432.

132. Hespell R.B., O'Bryan P.J. Purification and characterization of an a-L-arabinofuranosidase from Butyrivibrio fibrisolvens GS13. AEM, 1992, v. 58, p. 1082-1088.

133. Komae K., Kaji A., Sato M. An a-L-arabinofuranosidase from Streptomyces purpurascens IFO 3389. Agricultural and Biological Chemistry, 1982, v. 46, p. 1899-1905.

134. Yan Q., Tang L., Yang S., Zhou P., Zhang S., Jiang Z. Purification and characterization of a novel thermostable a-l-arabinofuranosidase (a-l-AFase) from Chaetomium sp. Process Biochem., 2012, v. 47, p. 472-478.

135. Guerfali M., Gargouri A., Belghith H. Catalytic properties of Talaromyces thermophilus a -1-arabinofuranosidase and its synergistic action with immobilized endo-b-l,4-xylanase. J. Mol. Catal. B-Enzym., 2011, v. 68, p. 192-199.

136. Nogawa M., Yatsui K., Tomioka A., Okada H., Morikawa Y. An a-L-arabinofuranosidase from Trichoderma reesei containing a noncatalytic xylanbinding domain. AEM, 1999, v. 65, p. 3964-3968.

137. Beldman G., Searle-Van Leewen M.J.F., Deuter G.A., Siliha H.A., Voragen A.G.J. Degradation of arabinans by arabinanases from Aspergillus aculeatus and Aspergillus niger. Carbohyd. Polym., 1993, v. 20, p. 159-168.

138. Pitson S.M., Voragen A.G.J., Beldman G. Stereochemical course of hydrolysis catalyzed by arabinofuranosyl hydrolases. FEBS Letters, 1996, v. 398, p. 7-11.

139. Kaji A. L-Arabinosidases. Advan. Carbohyd. Chem. Biochem., 2000, v. 42, p. 383-394.

140. Saha B.C. a-L-Arabinofuranosidases: biochemistry, molecular biology and application in biotechnology. Biotechnol. Adv., 2000, v. 18, p. 403-423.

141. Tuohy M.G., Laffey C.D., Coughlan M.P. Characterization of the individual components of the xylanolytic enzyme system of Talaromyces emersonii. Biores. Technol., 1994, v. 50, p. 3742.

142. Saha B.C., Bothast R.J. Purification and characterization of a novel thermostable a-L-arabinofuranosidase from a color-variant strain of Aureobasidium pullulans. AEM, 1998, v. 64, p. 216-220.

143. Bezalel L., Shoham Y., Rosenberg E. Characterization and delignification activity of a thermostable a-L-arabinofuranosidase from Bacillus stearotermophilus. AEM, 1993, v. 40, p. 57-62.

144. Синицын А.П., Черноглазов B.M., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Итоги науки и техники, сер. Биотехнология, М., 1993, т. 25, 152 с.

145. Verdoes J.C., Punt P.J., Burlingame R.P., Pynnonen C.M., Olson P.T., Wery J., Visser J.H., Emalfarb M.A., Visser J. New fungal production system., Int. Patent W0/2010/107303, 2010.

146. Jorgensen H., Kristensen J.В., Felby C. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities. Biofuels Bioprod. Biorefining., 2007, v. 1, p. 119-134.

147. Sánchez С. Lignocellulosic residues: Biodégradation and bioconversion by fungi. Biotechnol. Adv., 2009, v. 27, p. 185-194.

148. Бухтояров Ф.Е., Устинов Б.Б., Саланович Т.Н., Антонов А.И., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Синицын А.П. Целлюлазный комплекс гриба Chrysosporium lucknowen.se: выделение и характеристика эндоглюканаз и целлобиогидролаз. Биохимия, 2004, т. 69, с. 666 677.

149. Linder M., Teeri Т.Т. The roles and function of cellulose-binding domains. J. Biotechnol., 1997, v. 57, p. 15-28.

150. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends of Biotechnology, 1997, v. 15, p. 160-167.

151. Chaplin M.F., Kennedy J.F. Carbohydrate Analysis: A Practical Approach (second ed.), Oxford University Press Inc., New York, 1994, 324 pp.

152. Merino S.T., Cherry J. Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization. Adv. Biochem. Engin./Biotechnol., 2007, v. 108, p. 95-120.

153. Gusakov A.V., Antonov A.I., Ustinov B.B. N-Glycosylation in Chrysosporium lucknowense enzymes. Carbohyd. Res., 2008, v. 343, p. 48-55.

154. Margolin A.L. Enzymes in the synthesis of chiral drugs. Enzyme Microb. Technol., 1993, v. 15, p. 266-280.

155. Pallmann T., Jonas U., Wagner M., Thevis M., Kaeferstein H., Rothschild M.A., Bender K. Enzyme-assisted synthesis and structural characterization of pure benzodiazepine glucuronide epimers. Eur. J. Pharm. Sci., 2010, v. 39, p. 233-240.

156. Gübitz G.M., Hayn M., Sommerauer M., Steiner W. Mannan-degrading enzymes from Sclerotium rolfsii: Characterization and synergism of two endo P-mannanases and a P-mannosidase. Biores. Technol., 1996, v. 58, p. 127-135.

157. Dhawan S., Kaur J. Microbial mannanases: an overview of production and applications. Crit. Rev. Biotechnol., 2007, v. 27, p. 197-216.

158. Продукты гидролиза карубина (ЗМан2 СЛискпом>ете с последующим добавлением аГалА Р. сапеясет

159. Продукты гидролиза карубина рМан2 СЛискттете с последующим добавлением аГал! CJucknowen.se1. Гад Ман

160. Продукты гидролиза карубина рМан Т.гееяег с последующим добавлением аГалА Р.сапеьсет1. Гал1. Ман

161. Продукты гидролиза карубина РМан Т.геезег с последующим добавлением аГал! СЛискпом/ете1. Ман