Свойства целлюбиогидролаз из грибов Chrysosporium lucknowense и Trichoderma reesel тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

ШУЛЬГА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

СВОЙСТВА ЦЕЛЛОБИОГИДРОЛАЗ ИЗ ГРИБОВ СНЛ УБОБРОШиМ ЬIIСКИО \VENSE И ТМСНОВЕЯМА ЯЕЕБЕ!

02 00 15 - катализ 03 00 23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2008

□□317 1847

003171847

Работа выполнена на кафедре химической энзимотогии Химическо1 о факультета Московского государственного университета им М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор химических наук Гусаков Л В

Официачъные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Максименко А В кандидат химических наук Черноглазое В M

Велушая организация

Институт Биохимии и Физиотогии Микроорганизмов РАН, Пущино

Защита состоится » июня 2008 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501 001 59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени M В Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет кафедра химической энзимотогии, аудитория 202

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени M В Ломоносова

Автореферат разослан € мая 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Сакодынская И К

Актуальность темы Сжигание огромного количества ископаемых видов топлива, таких как нефть, газ и уголь, привело в последние десятилетия к так называемому «парниковому эффекту» и общему ухудшению экологической обстановки на Земле Кроме того, в последнее время резко возросли цены на нефть и другие энергоносители В связи с этим возник интерес к альтернативным источникам топлива, например, этанолу и бутанолу, которые можно получить из возобновляемой растительной биомассы путем ее ферментативного гидролиза с последующим сбраживанием получаемых Сахаров Ферменты, осуществляющие биодеградцию целлюлозы в природе, продуцируются в основном микроскопическими грибами и бактериями Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз различные штаммы грибов ТпскснЗегта (Т геезег, Т long^brachшtum) играют ведущую роль В научной литературе преобладает точка зрения, чго целлюлазные комплексы, продуцируемые мутантными штаммами Г геезег, являются наиболее эффективными разрушителями природной целлюлозы и их практически невозможно превзойти по скорости и глубине гидролиза субстрата Однако, существенным недостатком этого продуцента целлютаз является низкая секреция р-глюкозидазы, отвечающей за конверсию промежуточных целлоолигосахаридов в конечный продукт — глюкозу

Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз кристаллическои целлюлозы, являются целлобиогидролазы (ЦБГ, КФ 3 2 191), основным продуктом действия которых является целлобиоза Целлобиогидролазы 1 и II Г гееьех являются наиболее изученными ферментами Довольно много информации также опубликовано о ферментах данного типа действия из грибов Нитюо1а ярр, Ркапегоскае(е скгузоБрогшт и некоторых других О свойствах целлобиогидролаз из других грибных продуцентов (особенно термофильных) известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных имеется довольно большое количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов

В результате совместных исследований, проведенных в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН и на кафедре химической энзимологии МГУ, был найден перспективный термофильный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз — гриб СИгузозрогшт 1искпом/ете, на основе которого были получены мутантные штаммы, отличающиеся высокой секреторной способностью Ранее в нашей лаборатории были изучены свойства ксиланаз и эндоглюканаз из С Iискпом'ете, в то время как исследования целлобиогидролаз не проводилось, несмотря на то, что были получены предварительные данные об их наличии в составе целлюлазного комплекса данного продуцента Актуальность данного исследования продиктована как необходимостью системною изучения свойств целлобиогидролаз из новых источников (в частности С 1искпом>ете), так и возможностью в перспективе использовать их для гидролиза целлюлозосодержащего сырья

Цель и задачи исследования Целью работы являлось изучение биохимических и физико-химических свойств всех целлобиогидрол

секретируемых грибом С ¡исЬгоюепзе, а также оценка эффективности

действия на различные виды целлюлозосодержащих материалов

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

• Выделить все секретируемые грибом С lucknowense целлобиогидролазы в гомогенном виде и изучить их свойства в сравнении со свойствами ЦБГ I и II Т reesei, которые являются типичными и наиболее изученными представителями данного класса ферментов

• Исследовать возможный синергизм между целлобиогидролазами и эндоглюканазами С lucknowense

• Оценить эффективность действия различных целлобиогидролаз на целлюлозные субстраты, разработать подход для создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов С lucknowense ферментных композиций (смесей) для высокоэффективного гидролиза лигноцеллюлозных материалов

Научная новизна. Впервые выделены и охарактеризованы целлобиогидролазы из С lucknowense две формы ЦБГ 1а (Се17А), ЦБГ Ib (Се17В), ЦБГ IIa (Се16А) и ЦБГ IIb (Се 16В) На основании анализа субстратной специфичности и аминокислотных последовательностей ферменты классифицированы по их принадлежности к 6-и и 7-й семьям гликозид-гидролаз Показано, что высокомолекулярная форма ЦБГ 1а и ЦБГ IIb состоят из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером, в то время как у ЦБГ Ib, ЦБГ IIa и низкомолекулярной формы ЦБГ 1а, образующейся путем частичного прогеолиза полноразмерного фермента, ЦСМ отсутствует Выявлены ключевые аминокисчотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз С lucknowense Выявлен ярко выраженный синергизм между ЦБГ 1а и ЦБГ IIb при гидролизе хлопка, сопоставимый по масштабу с синергизмом между целлобиогидролазами и эндоглюканазами

Практическая значимость работы. Найдены термостабильные высокоактивные целлобиогидролазы С lucknowense (ЦБГ 1а, ЦБГ IIb), существенно превосходящие по стабильности ферменты Т reesei ЦБГ IIb также превосходила все изученные целлобиогидролазы (включая Т reesei) по эффективности гидролиза кристаллической целлюлозы Разработан подход для рационального дизайна ферментных смесей способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов Показана принципиальная возможность создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов С lucknowense мультиферментных композиций, превосходящих то гидролитической эффективности ферментные препараты Т reesei, а в ряде случаев и искусственные смеси, составленные из наиболее активных целлюлаз Т reesei

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях международной конференции «Биокатализ-2007» (Москва-Санкт-Петербург, 2007), четвертом международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), международных конференциях «Биокатализ-2005» (Санкт-Петербург, 2005), «Энергия из

биомассы» (Киев, 2004), 22-й конференции по генетике грибов (Асиломар, Калифорния, США, 2003), Седьмой Европейской конференции по генетике грибов (Копенгаген, Дания, 2004)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 1J печатных работ, в том числе 3 статьи

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (две главы), экспериментальной части (одна глава), четырех глав, в которых приведены результаты и их обсуждение , выводов и списка цитируемой литературы, включающего 160 источников Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, включает 47 рисунка и 20 таблиц.

Целлобиогидролазы выдетяли из культуральной жидкости гриба С lucknowense (штамм UV18-25), по схеме, приведенной на рис 1, с помощью различных видов хроматографии и хроматофокусирования, используя систему FPLC По результатам ДДС-гечьэлектрофореза и изоэлектрофокусирования ферменты были гомогенными (рис 2) Были также выделены целлобиогидролазы I и II Г reesei по разработанной ранее схеме (Марков, 2003)

Таким образом, в высокоочищенном виде были получены четыре целлобиогидролазы С lucknowense ЦБГ 1а (65 и 52 кДа), ЦБГ Ib (60 кДа), ЦБГ IIb (70 кДа) Еще один фермент С lucknowense (ЦБГ На с молекулярной массой 43 кДа) был выделен ранее и предоставлена аспирантом нашей лаборатории Ф Е Бухтояровым

Основные результаты работы

1 Выделение и очистка целлобиогидролаз

Препарат С lucknowense

1

Source15Q, pH 6,2, 20 мМ Bis-Tris-HCI

/

(несв ) Фракция 1

(0,2-0,25 М NaCI) (0,65 0,75 М NaCI) Фракция 2 Фракция 3

I

I

I

Source 15!so pH 5,0

1,6 М (NHJjS04

Source 15lso pH 5,0

1,6 M (NH4)2SO,

MonoP PB 74 pH 5,5-3,5

(25% сопи) ЦБГ IIb 70 кДа pl 5,6

(60% и 18 % соли) (pH 3,7 4 0)

ЦБГ la 65 кДа ЦБГ Ib 60 кДа

ЦБГ la 52 кДа р! 3,8 pl 4,5

Рисунок 1 Схема выделения целлобиогидропаз С. lucknowense

и 6

96 бб ш

6)

96 '"■■■'i" ;{J:

8,2

pl М р| м

6А„

■.¿. S.'i,

45 мир 5.1 *

36 ««t»

Ж

6,6 ^' л.О -

' * 1 3 4

Рисунок 2. ДДС-электрофорез (а) и ИЭФ (б) очищенных целлобиогидролаз С. lucknowense: 1 ЦБГ 1а (вм) 65 кДа, 2 - ЦБГ 1а (им) 52 кДа, 3 - ЦБГ Ib 60 кДа, 4 - ЦБГ IIb 70 кДа.

2. Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз С.lucknowense и их аминокислотные последовательности

Для идентификации и классификации ферментов С. lucknowense использовали следующий метод. Полосы на гельэлектрофореграмме, соответствующие изучаемым белкам, вырезали и обрабатывали трипсином. Далее смесь полученных пептидов анализировали методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, в результате чего были получены пептидные «фингерпринты» белков. Поскольку были секвенированы и транслированы в аминокислотные последовательности 4 гена, кодирующие целлобиогидролазы С. lucknowense, далее с помощью программы FindPept (http://cn.expasy.org/lools/) полученные пептидные «фингерпринты» анализировали на их соответствие транслированным аминокислотным последовательностям. Подобным образом были идентифицированы все целлобиогидролазы С. lucknowense, которые, как оказалось, кодируются генами cbhl, cbh2, cbh3, cbh4. Биохимические и физико-химические характеристики очищенных целлобиогидролаз С. lucknowense и Т. reesei суммированы в таблице 1, где сокращения «нм» и «вм» обозначают соответственно низкомолекулярную и высокомолекулярную формы фермента ЦБГ 1а. Следует отметить, что только две целлобиогидролазы обладали целлюлозосвязывающим модулем (ЦСМ): ЦБГ Та (вм) и ЦБГ IIb, в то время как у остальных ферментов С. lucknowense такой модуль отсутствует, т. е. они состоят только из каталитического домена.

Табчица 1 Молекулярные характеристики целлобиогидролаз С lucknowense

Фермсш Ген Мочек масса, кДа Pi Семья гликозид-гидролаз Систематическое название Наличие ЦСМ

ЦБГ 1а (вм) С lucknowense cbhl 65 4,5 7 Сс17А да

ЦБГ 1а (им) С lucknowense cbhl 52 4,5 7 Се17А нет

ЦБГ lb С lucknowense cbh2 60 3,8 7 Се17В нет

ЦБГ Па С lucknowense cbh3 43 4,2 6 Се16А пег

ЦБГ lib С lucknowense cbh4 70 5,6 6 Сс16В да

ЦБГ I Т reesei cbhl 65 4,2 7 Се17А да

ЦБГ II Т ¡eesei cbhl 60 5,7 6 Се16А да

1 QNACTLTAENHPSLTWSKCTSGGSCTSVCGSITIDMIWRWTHRTDSATNCYEGNKWDTSY 60 61 CSDGPSCASKCCIDGADYSSTYGITTSGNSLNLKFVTKGQYSTNIGSRTYLMESDTKYQM 120

121 FQLLGNEFTFDVDVSNLGCGLNGALYFVSMDADGG4SKYSGNKAGAKYGTGYCDSQCPRD 180 181 LKFINGEANVENVJQSSTNDANAGTGKYGSCCSEMDVWEANNMAAAFTPHPCTVIGQSRCE 240 241 GDSCGGTYSTDRYAGICDPDGCDFNSYRQGNKTFYGKGMT VDTTKKITWTQFLKNSAGE 300 301 LSEIKRFYVQNGKVIPNSESTIPGVEGNSITQDWCDRQKAAFGDVTDFQDKGGMVQMGKA 360 361 LAGPMVLVMSIWDDHAVNMLWLDSTWPIDGAGKPGAERGACPTTSGVPAEVEAEAPNSNV 420 421 IFSNIRFGPIGSTVSGLPDGGSGNPNPPVSSSTPVPSSSTTSSGSSGPTGGTGVAKHYEQ 480 481 CGGIGFTGPTQCESPYTCTKLNDWYSQCL 509

Рисунок 3 Аминокислотная последовательность ЦБГ la С lucknowense Пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрни в двух формах фермента, выделены жирным цветом Одинарной линией подчеркнуты пептиды, относящиеся к ЦСМ и обнаруженные только в спектре ЦБГ с массой 65 кДа, двойной лишни подчеркнуты возможные С-концевые пептиды ЦБГ с массой 52 кДа

Следует отметить, что две целлобиогидролазы С \uckna\vense, кодируемые одним геном — сЬЪ1 — и имеющие одинаковые значения р1 4,5, обладали разными массами 65 и 52 кДа Масс-спектры этих ферментов оказались практически идентичными В них обнаружены 18 пептидов с одинаковой массой, которые соответствовали теоретическим трипсиновым пептидам из аминокислотной последовательности, транслированной из гена сЪМ Идентифицированные пептиды из высокомолекулярной (65 кДа) и низкомолекулярной (52 кДа) форм ЦБГ I покрывали 71 и 61% полной

аминокислотной последовательности белка, соответственно (рис 3) В то же время в спектрах были обнаружены и некоторые отличия Так, два С-концевых пептида, образуемых аминокислотными остатками 477-500 (HYEQCGGIGFTGPTQCESPYTCTK) и 501-509 (LNDWYSQCL) и относящихся к ЦСМ, были обнаружены только в масс-спектре ЦБГ 1а (вм) С другой стороны, два пептида, соответствующих по молекулярным массам остаткам 427-441 (FGPIGSTVSGLPDGG) и 427-448 (FGP1GSTVSGLPDGGSGNPNPP), проявились только в случае ЦБГ 1а (нм) Если принять во внимание специфичность трипсина, эти пептиды могли появиться, если представляли собой С-концевые пептиды низкомолекулярной формы фермента

Принимая во внимание указанные различия в масс-спектрах ЦБГ 1а (вм) и ЦБГ 1а (нм), можно сделать вывод, что высокомолекулярный белок (65 кДа) представляет собой полноразмерную форму фермента, в то время как низкомолекулярная ЦБГ 1а (52 кДа) является его фрагментом, полностью содержащим каталитический домен, но не имеющим ЦСМ и значительной части линкера Отсутствие ЦСМ в ЦБГ 1а (нм) было затем подтверждено экспериментами по адсорбции ферментов на микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) (см раздел 3) По-видимому, ЦБГ 1а (нм) образуется в результате ограниченного протеолиза полноразмерной ЦБГ 1а в процессе ферментации или хранения кулыуральной жидкости

Далее в базе данных SwissProt (UmProtKB) с помощью программы BLAST2 (http //kr expasy org/tools/blast/) был проведен поиск белков, гомологичных изучаемым целлобиогидролазам С lucknowense Согласно данным BLAST-анализа, три целлобиогидролазы попали в 7-ю семью гликозид-гидролаз, и две - в 6-ю (табл 1) Гомологичные белки, найденные для каждой из целлобиогидролаз, представлены в табл 2

Таблица 2. Результаты BLAST-анализа для целлобиогидролаз С. lucknowense

Ферменты С lucknowense Гомологичные белки UniProtKB Степень идентичности

ЦБГ la ЦБГ I (Се17А) Я grísea Q12621 74%

ЦБГ I Neurospora crassa Q7SA23 67%

ЦБГ I (Се17А) Т reesei* P62694 56%

ЦБГ-58 (Cel7D) Р chrysosporium* Q09431 56%

ЦБГ Ib ЦБГ1 N crassa Q872Y1 79%

ЦБГ I (Се17А) Я grísea Q12621 56%

ЦБГ На Экзоглюканаза 3 N crassa Q7RXI7 79%

ЦБГ IIb Белок Chaetomium globusum Q2GMP2 73%

ЦБГ II Я insolens* Q9C1S9 72%

ЦБГ II T reesei* P07987 60%

* Для белков, помеченных звездочкой, известна их кристаллическая структура

Путем сравнения (выравнивания) аминокислотных последовательностей изучаемых белков с ферментами, для которых известны их структуры, можно было выявить местоположение основных структурных доменов (модулей) в молекулах ферментов С lucknowense Найденные таким образом структурные модули ЦБГ Ia, Ib, IIa и IIb приведены в таблице 3

Таблица 3 Предполагаемые структурные домены целлобиогилро1аз С lucknowense

ЦБГ 1а ЦБГ Ib* ЦБГ IIa* ЦБГ IIb Структурная

№ остатков единица

1-438 1-430 1-367 88-458 Каталитический домен

439-473 - - 39-87 Линкер

474-509 - - 1-38 ЦСМ

* ЦСМ и линкер в мочекутах ЦБГ Ib и ЦБГ IIa отсутствуют

ЦСМ ЦБГ 1а и ЦБГ IIb С lucknowense гомологичны друг другу и проявляют высокую степень гомологии с соответствующими модулями молекул известных грибных целлюлаз (до 93%) ЦСМ всех известных грибных целтюлаз относятся к первой семье полисахарид-связывающих модулей (http //www cazy org/fam/CBMl html) большинство из них состоят из 36 аминокислотных остатков, включая, как правило, 4 консервативных остатка цистеина, которые образуют две S-S связи Именно такая структура ЦСМ наблюдается в случае ЦБГ 1а С lucknowense В отличие от ЦСМ ЦБГ 1а, в структуру ЦСМ ЦБГ IIb вместо четырех входят шесть остатков цистеина (также как и в ЦСМ ЦБГ II Н insolens), которые потенциально могут образовать на одну S-S связь больше, давая в результате три дисульфидных мостика

В случае пептидных линкеров ЦБГ 1а и ЦБГ IIb заметной гомологии с соответствующими участками молекул других известных цешполаз обнаружено не было Линкеры, как и у других грибных целлюлаз, содержат много остатков Ser, Thr, Pro и Gly, однако эти остатки расположены неупорядоченно

Поскольку из литературных данных известны ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активном центре целлобиогидролаз 7-й и 6-й семей, оказалось возможным дискриминировать соответствующие остатки и в молекулах целлобиогидролаз С lucknowense, анализируя при этом выравненные аминокислотные последовательности белков и сравнивая трехмерные модели ферментов С lucknowense с известными кристаллическими структурами Наиболее важные аминокислоты абсолютно консервативны, включая каталитическое трио (Glu-Asp-Glu у целлобиогидролаз 7-й семьи и Asp-Asp-Asp у ферментов 6-й семьи), остатки триптофана, осуществляющие т н «стэкинг-взаимодействие» с гликозидными кольцами молекул целлюлозы внутри «туннеля» активного центра ферментов, а также ряд других важных остатков, функции которых суммированы в табл 4 и 5

Таблица 4. Аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах грибных целлобногидролаз из 7-й семьи гликозид-гидролаз (неконсервативные остатки подчеркнуты)

С ¡искпоште Се17А С \искпошп$е Се17В Т геезег Се17А Р сИгузозропит СеМЪ Роль остатка

аи-213 01и-2П 01и-212 01и-207

Азр-215 Ст1и-218 Азр-213 01и-216 Аэр-214 аи-217 Аэр-гОЭ аи-212 Катализ

Тгр-38 Тгр-40 Тф-372 Тгр-381 Тгр-38 Тгр-40 Тгр-366 Тгр-375 Тгр-38 Тгр-40 Тгр-367 Тгр-376 Тгр-38 Тгр-40 Тгр-364 Тгр-373 «Стэкинг-взаимодействие» ароматического остатка с плоскостью гликозидного кольца

Туг-51 Туг-82 Азп-201 Туг-50 Туг-80 А5П-199 'Гуг-51 Туг-82 Аэп-гОО Туг-51 Туг-82 Азп-195 Возможное участие в связываний

Н13-375 А1а-376 Тгр-386 Н15-369 Туг-370 Туг-380 Т\т-370 Туг-371 Туг-381 Н1Б-367 А1а-368 Туг-378 низкомотекупярных и почимерных субстратов

Таблица 5. Аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах грибных целлобио1идролаз из 6-й семьи гликозид-гидролаз (некопсервативные остатки подчеркнуты).___

С Ыскпоунепче Се!6А С Ыскпотлете Се16В II ¡токт Се1бА Т ггезе/ Се16А Рочь остатка

Авр-95 АБР-МО Азр-322 Азр-188 Авр-234 Авр-413 Азр-180 Азр-226 А5Р-405 А5Р-175 Азр-221 Азр-401 Катализ

Тгр-61 Тгр-188 Тгр-288 Тгр-145 Тгр-282 Тгр-379 Тгр-137 Тгр-274 Тф-371 Тгр-135 Тф-269 Тф-367 «Стэкинг-взаимодейавие» ароматического остатка с плоскостью гликозидного котьца

Тгр-191 Тгр-285 Тгр-277 Тф-272 Направчение полимерной цепи глюкаиа в «туннель» активного центра

Туг-89 ТЪг-147 Азп-148 АБП-194 01и-284 Гуг-182 №-241 Азп-242 Азп-288 01п-375 Ту г-174 ТЬг-233 А5П-234 Азп-280 01и-367 Туг-169 ТЬг-228 Аэп-229 Азп-275 Ип-ЗбЗ Фиксация полимерной цепи глюкана за счет водородных связей

Азп-144 РЬе-29 Тгр-285 РЬе-335 Азп-238 Туг-113 Тгр-376 Нгз-426 Аэп-230 Туг-104 1гр-368 Н15-418 Азп-225 Туг-103 Тф-364 № 5-414 Возможное участие в связывании субстратов

3 Свойства целлобиогидролаз С. lucknowense н Т reesei

Субстратная специфичность. Целтобиогидролазы разрушают целлюлозу, последовательно отщепляя целлобиозные остатки с невосстанавливающего (б-я семья) или восстанавливающего (7-я семья) конца молекулы полимера по процессивному механизму, поэтому молекулярный вес и вязкость полимерного субстрата меняется незначительно при небольших глубинах гидролиза (в отличие от эндоглюканаз) По сравнению с последними, ЦБГ достаточно эффективно гидротизуют кристаллические субстраты, такие как фильтровальная бумага или МКЦ (Авицел) Авицел наиболее часто используют для определения активности целлобиогидролаз Кроме того, известно, что ферменты, относящиеся к 7-й семье гликозид-гидролаз, обладают активностью по отношению к синтетическим я-нитрофенильным производным дисахаридов -

и-НФ-Р-О-целлобиозиду и п-НФ-Р-О-лактозиду

Удельные активности различных ЦБГ по вышеуказанным субстратам представлены в табл 6 Ферменты, в молекулах которых имеется ЦСМ (ЦБГ 1а 65 кДа, ЦБГ IIb С lucknowense, ЦБГ I, ЦБГ II Т reesei) обладали более высокой активностью по МКЦ, чем ферменты без ЦСМ В целом, высокомолекулярные целлобиогидротазы С lucknowense обладали несколько более высокой активностью по МКЦ, чем соответствующие ферменты Т reesei

Таи шца 6 Удельные активности (ед/чг бечка) целлобиогидролаз С lucknowense и Т reesei (40 °С, pH 5,0)______

Субстрат ЦБГ 1а С1 52 кДа ЦБГ 1а С165 кДа ЦБГ Ib С1 60 кДа ЦБГ IIa С / 43 кДа ЦБГ IIb С / 70 кДа ЦБГ I Тг 65 кДа. ЦБГ II Тг 60 кДа

МКЦ (Авицел) 0,10 ± 0,01 0,21 ± 0,01 0,12 ± 0,02 0,08 ± 0,02 0,22 ± 0,02 0,18 ± 0,02 0,14 ± 0,01

КМЦ* 0,2 ± 0,02 0,2 х 0,02 0,5 х 0,05 1,1 ±0,1 0,1 ± 0,01 0,1 ± 0 01 1,7 ± 0,2

л-НФ-ß-D- целлобиозид 0,021 ± 0,002 0,025 ± 0,002 0,020 ± 0,002 0 0 0,016 ± 0,002 0

л-НФ-ß-D лактозид 0,11 ± 0,01 0,12 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0 0 0,09 ± 0,01 0

Сокращения С 1 - С 1искпоч>еп$е, Т г - Т геезег * Активность опредетяли при 50 °С

Удельные активности по отношению к карбоксиметилцеллючозе (КМЦ) у изучаемых целлобиогидролаз, как и следовало ожидать, были небольшими - 0,11,7 ед/мг Для сравнения отметим, что для очищенных грибных эндоглюканаз типичными являются величины КМЦ азной активности 10-50 единиц на 1 мг белка

Активностью по синтетическим хромогенным субстратам (и-НФ-Р-О-целтобиозиду и «-НФ-Р-Б-лактозиду) обладали только ЦБГ 7-й семьи (ЦБГ I) При этом наличие или отсутствие ЦСМ не влияло заметным образом на активность

Кинетические параметры гидролиза низкомолекулярных субстратов. Ингибирование целлобиозой. Как уже отмечалось выше, синтетические п-нитрофенильные производные дисахаридов, такие как и-НФ-р-О-целлобиозид (и-НФ-02) и к-НФ-р-Б-лактозид (н-НФ-Ь), широко используются в качестве модельных субстратов при изучении свойств целлобиогидролаз 7-й семьи Кинетические пэрямбтры {кСах, Кт) гидролиза этих субстратов представлены в табл 7 Поскольку известно, что продукт гидролиза (целлобиоза) является конкурентным ингибитором целлобиогидролаз, также были определены константы конкурентного ингибирования (К,) из начальных скоростей реакций гидролиза га-НФ-производных дисахаридов в присутствии различных концентраций добавленной целлобиозы (50-200 мкМ) К сожалению, нам не удалось получить достоверные кинетические параметры для ЦБГ 1Ь С ¡искпожете, так как полностью не смогли избавиться от примеси эндоглюканазы (ЭГ I), которая обладает молекулярной массой и р! практически такими же, как и ЦБГ 1Ь, и в то же время ее удельная активность по п-НФ-р-В-целлобиозиду и «-НФ-Р-Б-лактозиду более, чем в 10 раз превышает активность ЦБГ 1Ь

Таблица 7 Кинетические параметры гидролиза синтетических хрочогенных субстратов, катализируемого целлобио! идролазами из 7-й семьи гликозид-гидролаз (рН 5,0, 40°С)

Фермент* Субстрат Кт (мМ) кш^Кт (М.'с1) К, (мМ)

ЦБГ 1а (вм) С / л-НФ-Ог 0,027 ¿0,005 0,16 ±0,04 165 0,09 ± 0,02

ЦБГ I Т г «-НФ-02 0,010 ±0,001 0,06 ±0,01 176 0,05 ±0,01

ЦБГ 1а (вм) С 1 и-НФ-Ь 0,72 ± 0,04 2,8 ± 0,3 258 -

ЦБГ 1а (нм) С / я-НФ-Ь 0 69 ±0,05 3,6 ±0,2 192 0,14 ±0,03

ЦБГ I Т г и-НФ-Ь 0,36 ±0,04 1,5 ±0,2 242 -

Сокращения С 1 - С 1искпо\\'ете, Т г - Т гееяег

Как видно из данных табл 7, для всех ферментов характерно очень низкое значение кСд: при гидролизе и-НФ-С2, что хорошо согласуется с литературными данными (Ког^ап^шскБ, 1993) ЦБГ 1а С 1искпоч>ете характеризовалась более высокой кш по сравнению с ЦБГ I Т геауег, однако, имела Кт также пропорционально выше Поэтому, если сравнивать два фермента по отношению констант ксЛ/Кт, то для них эти значения очень близки

В случае гидролиза п-НФ-Ь для всех изученных целлобиогидролаз значения £са1 во много раз выше, чем каталитические константы, характеризующие гидролиз п-НФ-вг Однако, константы Михаэлиса при

гидролизе п-НФ-Ь также во много раз выше Поэтому, если оценивать отношение констант ксз1/Кт, то оба хромогенных субстрата отличались межд> собой не очень заметно (в 1,4-1,6 раза) Обе формы ЦБГ 1а С \ucknowense имели близкие кинетические параметры, то есть наличие или отсутствие ЦСМ не влияю заметным образом на кинетику гидролиза низкомолекулярных субстратов

Все указанные целлобиогидролазы конкурентно ингибировались продуктом реакции (целлобиозой) Обе формы ЦБГ 1а С Ыскпсмгте характеризовались более высокими константами ингибирования (0,09 и 0,14 мМ) по сравнению с ЦБГ I Т >ееяег (0,05 мМ), т е ингибирование было слабее в случае ЦБГ 1а С ¡иекпоъепзе, что может иметь важное значение при гидролизе целлюлозосодержащих материалов Причины такого различия в ингибировании (анализ остатков в активных центрах ферментов) обсуждаются в диссертации

Адсорбционные характеристики. Способность целлобиогидролаз к адсорбции на МКЦ зависит от наличия или отсутствия у них ЦСМ В качестве адсорбционных характеристик выделенных ферментов были определены степень адсорбции и коэффициенты распределения (Кр) ферментов между поверхностью субстрата и водной фазой

Коэффициент распределения Кр (л/г) рассчитывали как отношение адсорбированного и находящегося в растворе фермента на участке линейности изотермы адсорбции Его определяли по тангенсу наклона прямой, построенной в координатах ([Е]о/[Е], [Б]), где [Е]0 - концентрация белка (или его активность) в исходном растворе, [Е] - концентрация белка (или активность) в супернатанте после адсорбции, [Б] - концентрация МКЦ Чем больше Кр, тем сильнее связывание фермента с субстратом Адсорбцию проводили в течение 15 мин при 40 °С, рН 5,0, концентрацию МКЦ варьировали от 5 до 40 г/л, концентрация ферментов при этом составляла 0,2 г/л Полученные данные представлены в табл 8

Условия эксперимента при определении степени адсорбции белка (%) были следующими 6 °С, рН 5,0, концентрация ферментов - 1 г/т (белок по Лоури), концентрация МКЦ - 25 г/л, время адсорбции - 30 мин Степень адсорбции определячи по разнице между исходной концентрацией белка и его концентрацией после адсорбции Степень адсорбции выражали в процентах (табл 8)

Таблица 8 Коэффициенты распределения и степень адсорбции целлобиогидролаз на

МКЦ

Параметр С 1искпо'«еП8е Т гее$е1

ЦБГ 1а ЦБГ 1Ь ЦБГ На ЦБГ ПЬ ЦБГ I ЦБГ II

65 кДа 52 кДа 60\Ца 43 кДа 70 кДа 65 кДа 60 кДа

Кр, л/г 0,5 0,072 0,088 0,01 0,26 0,14 0,11

Степень адсорбции, % 89 59 60 32 88 91 85

Наличие ЦСМ + - + ■У

Как видно из представленных данных, выделенные ферменты заметно различались по способности адсорбироваться на целлюлозе Целлобиогидролазы 1а (65 кДа) и ПЬ С 1искпо\\'ете, а также ЦБГ I и II Г геехы в большей степени связывались с МКЦ, благодаря наличию у них ЦСМ Как и следовало ожидать, наиболее слабо сорбировались ферменты, не имеющие ЦСМ

Влияние температуры и рН на активность и стабильность целлобиогидролаз Влияние рН на активность ферментов изучали при 40 °С, при этом у целлобиогидролаз 6-й семьи (ЦБГ И) измеряли активность по МКЦ, а у ферментов 7-й семьи (ЦБГ I) - по и-НФ-Р-ГЗ-лактозиду Температурные зависимости авицелазной активности изучаемых ферментов определяли при рН 5, реакцию проводили в течение 1 ч Термостабильность ферментов исследовали при рН 5,0 в диапазоне температур 50 - 70 °С (концентрация белка лежала в диапазоне 0,2-0,4 г/л) Через определенные промежутки времени из инкубируемот о при заданной температуре раствора фермента отбирали пробы и определяли в них остаточную активность по МКЦ в стандартных условиях (40 °С, рН 5,0)

В табл 9 приведены рН- и температурные оптимумы активности целлобиогидролаз, а также время полуинактивации ферментов при различных температурах

Таблица 9. Влияние температуры и рН на активность и стабильность целлобиогидролаз С 1искпон>еп$е и Т геехе!

Фермент рН-оптимум Т-оптимум Время полуинактивации, мин

50° 60° 65° 70"

ЦБГ 1а (вм) С ¡иекпоч'ете 5,2 65 Ст Ст 40 8

ЦБГ 1а (нм) С ¡иекпоыеше 5,2 60 Ст 60 5 Не ст

ЦБГ 1Ь С 1искпом>епзе 4,5 65 Ст 30 Не ст Не ст

ЦБГ Па С 1искпотюе 5,0 - Ст - - -

ЦБГ ПЬ С ¡иекпошгае 5,0 65 Ст Ст 160 23

ЦБГ I Т гегвех 4,5-4,8 55 Ст 50 5 Не ст

ЦБГ II Т гее5в1 4,5-5,0 60 Ст 60 13 Не ст

ст - фермент стабилен более грех часов инкубации

не с г - фермент полиостью инакгивируется меньше, чем за 1 минуту

Все ферменты проявляли максимальную активность в слабокислой среде (рН-оптимум при рН 4,5 -5,2) Температурные профили активности высокомолекулярных целлобиогидролаз С ¡иекпомете были сдвинуты в область более высоких температур по сравнению с таковыми для ферментов Г (65° и 55-60° соответственно), что коррелирует с более высокой термостабильностью высокомолекулярных целлобиогидролаз С 1искпо\уете

При 60 "С ЦБГ 1а (вм) и ЦБГ IIb С. lucknowense полностью сохраняли активность в течение 3 часов, в то время как ферменты Т. reesei теряли половину активности за 50-60 мин. При 65 и 70 °С две целлобиогидролазы С. lucknowense также были существенно стабильнее ферментов Т. reesei (табл. 9).

4. Рациональный дизайн мультиферментных смесей для высокоэффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов

Способность целлобиогидролаз к глубокому осахариванию целлюлозы изучали на примере гидролиза чистых (не содержащих примесей других полисахаридов и лигнина) целлюлозных субстратов - МКЦ и хлопке. На рис. 4 представлена кинетика гидролиза МКЦ целлобиогидролазами С. lucknowense и Т. reesei. Для того чтобы избежать ингибирования ферментов продуктом реакции — целлобиозой - гидролиз проводили в присутствии избытка очищенной неллобиазы Aspergillus japonicus.

Как и ожидалось, ферменты без ЦСМ (ЦБГ lb и ЦБГ Па С. lucknowense) проявляли невысокую гидролитическую способность: только 23 и 21% конверсии целлюлозы было достигнуто за 5 суток реакции. Высокомолекулярные целлобиогидролазы 1а и ИЬ С. lucknowense, а также ЦБГ I и II Т. reesei продемонстрировали более высокую гидролитическую способность (46, 58, 50 и 36%, соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале целлобиогидролаз 1а и lib С. lucknowense при гидролизе кристаллических форм целлюлозы.

Рисунок 4. Кинетика гидролиза МКЦ (5 г/л) целлобиогидролазами (0,1 г/л) в присутствии БГЛ A.japonicus (0,5 ед/мл), 40°С, pH 5,0

60 90

Время, ч

Синергизм при гидролизе хлопка. Синергизм между целлобиогидролазами и эндоглюканазами при гидролизе кристаллической целлюлозы (в частности, между ферментами Г, гееяег) - хорошо известное явление. Под синергизмом понимают увеличение выхода продукта реакции при

действии смеси ферментов по сравнению с теоретическим выходом, рассчитанным на основании данных о суммарном действии индивидуальных ферментов. Количественной характеристикой эффекта синергизма является коэффициент синергизма, который вычисляют как отношение экспериментально полученных величин к рассчитанным теоретически. Гораздо меньше информации можно найти о синергизме между целлобиогидролазами из разных семей, и о причинах такого вида синергизма до сих пор в литературе ведется дискуссия.

Мы изучили возможный синергизм при гидролизе хлопка между различными целлюлазами С. lucknowense на примере двух наиболее активных целлобиогидролаз (1а и IIb) и основных (мажорных) эндоглкжаназ данного гриба: ЭГ II (Се15А, 51 кДа), ЭГ V (Се145А, 25 кДа) и ЭГ VI (Се16С, 47 кДа), из которых только ЭГ II имела ЦСМ. Эндоглюканазы были выделены и предоставлены аспирантами нашей лаборатории Б. Б. Устиновым и А. И. Антоновым.

В качестве примера на рис. 5 показаны экспериментальные кинетические кривые образования конечного продукта (глюкозы) при гидролизе хлопка при совместном действии ЦБГ IIb и других целлюлаз С. lucknowense. На том же рисунке приведены теоретические кривые, рассчитанные как сумма концентраций продуктов, полученных под действием индивидуальных ферментов. Во всех случаях в реакционную систему добавляли избыток очищенной ß-глюкозидазы (БГЛ) А. japonicus, чтобы полностью конвертировать образующиеся под действием целлюлаз целлобиозу и олигосахариды в глюкозу.

—э—ЦБГ 1а и ЦБГ IIb -^—ЦБГ IIb и EG II ЦБГ IIb и EG VI — ЦБГ lib и EG V . 4- - ЦБГ la + ЦБГ IIb - - ЦБГ lib + EG V . .ЦБГ IIb* EG II . -д. • ЦБГ IIb + EGV

Время, ч

Рисунок 5. Синергизм между ЦБГ lib и другими целлюлазами С, lucknowense при гидролизе хлопка (5 г/л) в присутствии очищенной БГЛ A. japonicus (0,5 ед/мл), 40 °С, рН 5,0. Концентрации ЦБГ и ЭГ составляли 0,15 и 0,05 г/л, соответственно. Экспериментальные данные для пар ферментов показаны незакрашенными символами (непрерывные кривые),

теоретические суммы — закрашенными символами (прерывистые линии).

Концентрации глюкозы, полученные после 140 ч гидролиза хлопка под действием индивидуальных целлобиогидролаз и эндоглюканаз, а также их комбинаций суммированы в табл. 10. Коэффициент синергизма (Кст) был рассчитан как отношение экспериментально полученной концентрации глюкозы

при действии смеси компонентов (колонка 2) к теоретически рассчитанной сумме концентраций глюкозы, полученных под действием индивидуальных компонентов (колонка 3)

Таблица 10. Синергизм между целлюлазами С 1искпоя]ете при гидрочизе хлопка (условия см в подписи к рис 5) Во второй колонке в скобках приведены степени конверсии субстрата____

Концентрация глюкозы Концентрация глюкозы

Фермент после 140 ч гидротиза, после 140 ч гидролиза, Ксин

экспериментальная, г/т теоретическая*, г/т

ЦБГ 1а 0,8 (15%) - -

ЦБГ ПЬ 1,2 (22%) - -

ЭГ II 0,6 (11%) - -

ЭГУ 0,7 (13%) - -

ЭГ VI о" - -

ЦБГ 1а + ЭГ II 4,1 (75%) 1,5 2,8

ЦБГ 1а + ЭГ V 3,7 (67%) 1,5 2,4

ЦБГ 1а + ЭГ VI 3,9 (71%) 1,2 3,3

ЦЬГ ПЬ + ЭГ II 4,7 (85%) 1,8 2,6

ЦБГ ПЬ + ЭГУ 3,8 (69%) 1,9 2,0

ЦБГ ИЬ + ЭГ VI 4,1 (75%) 1,6 2,6

ЦЬГ 1а + ЦБГ Ilb 5,5 (99%) 2,0 2.8

* Сумма концентрации глюкозы, полученных при гидролизе хлопка индивидуальными

ферментами

Большинство индивидуальных ферментов гидролизовали хлопок не очень эффективно достигая не более 22% степени конверсии субстрата При совместном действии двух целлобиогидролаз разных семей (ЦБГ 1а 7-й семьи и ЦБГ ИЬ 6-й семьи) наблюдали ярко выраженный синергизм (Ксин=2,75), при этом в присутствии БГЛ достигли практически полной конверсии хлопка (99%) до глюкозы за 140 ч гидролиза Обе целлобиогидролазы также проявляли синергизм со всеми изучаемыми эндоглюканазами Наибольший выход глюкозы (75 - 85 %) был достигнут при комбинации какой-либо из целлобиогидролаз с ЭГII, коэффициент синергизма составил при этом 2,8 - 2,6

Таким образом, было показано, что комбинации целлобиогидролаз и эндоглюканаз С lucknowense могут обеспечивать эффективный гидролиз хлопка Далее на основе наиболее активных целлобиогидролаз и эндоглюканаз С lucknowense были сконструированы искусственные мультиферментные смеси, которые при гидролизе МКЦ, хлопка и предобработанной органозольвом хвойной древесины (25-50 г/т) при одинаковой дозе по белку (0,5 г/л) превзошли по выходу глюкозы за 3 сут гидролиза грубый (промышленный) препарат NCE L-600 (С lucknowense), а также промышленные и лабораторные целлюлазные препараты на основе мутантных штаммов Т reeseï (Целловиридин Г20Х, Промфермент, Россия, и ВюАсе Dyadic, США) и Pénicillium verruculosum #6 и #151 (ИБФМ РАН) Искусственные смеси ферментов С lucknowense содержали 80% целлобиогидролаз, до 16% эндоглюканаз и 4% (3-глюкозидазы В качестве

примера на рис 6 приведены данные по гидролизу МКЦ смесью очищенных ферментов №1 С lucknowense (0,2 г/л ЦБГ 1а + 0,2 г/л ЦБГ IIb + 0,08 г/л ЭГ II + 0,02 г/л БГЛ) и различными препаратами целлюлаз

Время, ч

Рисунок 6 Кинетика гцдролиза МКЦ (50 г/л) различными целлюлазными препаратами и комбинацией №1 целлюлаз С. Ыскпоште (0,5 г/л), 50 °С, рН 5,0.

Гидролиз целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства.

Известно, что состав оптимального ферментного комплекса может различаться в зависимости от вида целлюлозосодержащего материала Реальные виды растительного сырья (как правило, предобработанного) для биоконверсии в различные полезные продукты обычно содержит в своем составе не только целлюлозу, но также гемицеллюлозы (30-35%) и лигнин (до 20-25%) Поэтому рациональный дизайн высокоэффективных мультиферментных композиций (смесей) ферментов должен выполняться с учетом свойств и особенностей конкретного субстрата В частности, в случае заметного содержания в сырье гемицеллюлоз (ксиланов) ферментные смеси должны содержать не только целлюлазы, но и, как минимум, ксиланазу и Р-ксилозидазу

Процесс рационального дизайна мультиферментных смесей можно разделить на разные этапы На первом этапе проводится гидролиз конкретного целлюлозосодержащего субстрата индивидуальными ферментами, относящимися к разным семьям карбогидраз, с учетом состава, свойств и способа предобработки конкретного субстрата В результате выявляются конкретные ферменты (целлюлазы, гемицеллюлазы и сопутствующие ферменты), необходимые для гидролиза данного субстрата На втором этапе с учетом эффектов сиьергизма и структуры субстрата составляются различные комбинации из выбранных ферментов При оценке эффективности действия искусственно созданных мультиферментных композиций в качестве контроля проводят гидролиз того же субстрата промышленными ферментными препаратами от различных производителей

С использованием указанного подхода были разработаны композиции из ферментов С 1искпом/еп$е (и для сравнения Т ree.se;) для гидролиза отходов сахарного тростника (багассы, предобработанной известью) и кукурузных початков, предобработанных паровым взрывом Данные сельскохозяйственные отходы рассматриваются в качестве возможного сырья для биоконверсии в этанол и другие полезные продукты

Гидролиз кукурузных початков. Данный субстрат содержит значительное количество гемицеллюлозы, представленной в основном ксиланом Поэтому на первом этапе предобработанные кукурузные початки (50 г/л) гидролизовали индивидуальными целлюлазами и ксиланазами из Т гевБЫ и С ¡искпоугете при одинаковой концентрации белка (2 мг/г субстрата) На втором этапе из наиболее эффективных целлюлаз и ксиланаз были составлены комбинации из ферментов С 1искпсмепье и Т геевег (табл 11) Кроме того, в каждую смесь была добавлена [3-ксилозидаза (из Т геехег) для полной конверсии ксилана и ксилоолигосахаридов в ксилозу В качестве контроля в данном случае использовали смесь промышленных препаратов Брегуте СР и МиМе^ (оба препарата на основе мутантных штаммов Т геезег) производства фирмы вепепсог (США), которая предварительно была оптимизирована для гидролиза данного конкретного субстрата

Таблица 11 Состав ферментных смесей, использованных при гидролизе предобработанных кукурузных початков__

Состав Концентрация белка (г/л)

С 1 №1 ЦБГ 1а + ЦБ1 IIb + ЭГII + Ксич II + БГЛ + 0,07 + 0,05 + 0,015 +0 04 + 0,01

БКС* 0,005

С.1 №2 ЦБГ 1а + ЦБГ Ib + ЦБГ IIb + ЭГ II + ЭГ V 0 04 + 0,045 + 0,03 + 0,01 + 0,01 +

+ Ксил II + БГЛ + БКС* 0,04 + 0,01 + 0,005

С 1 № ЦБГ 1а -г ЦБГ IIb + ЭГ II + Ксил II + Ксич I 0,07 + 0,04 + 0,015 + 0,025 + 0,025 +

+ БГЛ + БКС* 0,01 + 0,005

С 1 №4 ЦБГ 1а + ЦБГ IIb + ЭГ 11 + Ксил I + БГЛ + 0,07 + 0,04 + 0,015 + 0,05 + 0,01 +

БКС* 0,005

Т г №5 ЦБГ I + ЭГ I + Ксич II + БГЛ** + БКС* 0,12 + 0,015 + 0,04 + 0,01 + 0,005

Т г №6 ЦБГ I + ЦБГ II + ЭГ I + ЭГ II + Ксил II + 0,07 - 0,04 + 0,015 + 0,01 + 0,04 +

БГЛ** + БКС* 0,01 + 0,005

Т г №7 ЦЬГI + ЦБГ II + ЭГ I + ЭГ II + Ксич II С 1 0,07 + 0,04 + 0,015 + 0,01 + 0,04 + 0,01

+ БГЛ** + БКС* + 0,005

Spezyme CP + Multifect 0,14 + 0,05

* БКС - ß-ксилозидаза Т reesei

** БГЛ Л japonicus

19

Выходы восстанавливающих Сахаров (ВС) через 72 ч гидролиза кукурузных початков показаны на рис. 7. Анализируя результаты эксперимента, следует отметить, что все составленные нами искусственные смеси ферментов приводили к более глубокому выходу Сахаров при гидролизе, чем контрольная смесь препаратов 8ре2уте СР и Мик^ей, при этом мультиферментная композиция №3, составленная из целлюлаз и ксиланаз С. Ыскпоыете, превосходила по эффективности действия не только контрольную смесь, но и композиции, составленные из очищенных ферментов Т. гееяе1.

Рисунок 7. Выход ВС после 72 ч гидролиза предобработаиных кукурузных початков (100 г/л) мультиферментными композициями СЛискпоюепэе и Т. гее$Ы (0,19 г/л) и смесью промышленных препаратов

8регуте и МиКИе« (0,14 и 0,05 г/л), 50 "С, рН 5,0.

Гидролиз багассы. Используя такой же подход, как и в случае гидролиза кукурузных початков, были созданы искусственные мультиферментные композиции для ферментативного гидролиза предобработанной багассы. Следует отметить, что их состав и нумерация были отличны от тех, которые были использованы для гидролиза кукурузных початков (на рис. 7.) При гидролизе багассы индивидуальные целлюлазы С. 1искпом>ете были в целом более эффективными, чем целлюлазы Т. геезег. Эндоглюканазы, в основном, проявляли меньшую гидролитическую эффективность, чем целлобиогидролазы.

На рис. 8 приведены выходы ВС через 5 суток гидролиза багассы под действием мультиферментных композиций №1-5 С. 1искпом>ете, №6-8 Т. гееъег, а также различных грубых ферментных препаратов (контролей). В качестве контролей для сравнения использовали те же промышленные и лабораторные препараты, что указаны на рис. 7. К препаратам Т. гее^ег, которые обладали низкой (3-глюкозидазной активностью, была добавлена в избытке очищенная БГЛ А. )аротст (0,0? г/л).

Смеси №1 и 2 С. 1иск.по\чете, составленные только из целлюлаз, превосходили по эффективности действия смеси №6-8, составленные из очищенных целлюлаз Т. гее$е1, однако уступали большинству грубых ферментных препаратов, содержащих не только целлюлазы, но и ксиланазы и

,С.1*И сии С.1М31С1Ш Т.Г. №5|Т.Г. №6|Т.г. №7 !5регутс{

| ' ! 1 ! ! I |миИеа| ! С. |]1скпп\\'спзе ; *Г ;

другие сопутствующие ферменты. В то же время, смеси ферментов С.1искпо\мете №3-5, в которые дополнительно входили ксиланаза II и не содержащие ЦСМ ЦБГ ГЬ и ЭГ V, давали выход ВС, сравнимый с тем, что обеспечивали грубые ферментные препараты на основе Т. гее$е'1 и Р. \erruculosum. Эти результаты свидетельствуют о важности присутствия ксиланаз и других сопутствующих ферментов в составе мультиферментных композиций.

15 г

г з ^ г

Рисунок 8. Выход ВС через 5 сут гидролиза предобработанной багассы (50 г/л) мультиферментнымн композициями ферментов С. ¡искпокепхе и Т. геете/, а также промышленными и лабораторными препаратами целлюлаз (0,5 г/л), 50 "С, рН 5.

Таким образом, результаты, изложенные в последнем разделе, показали принципиальную возможность получения на основе целлобиогидролаз и других ферментов С.1искпо\»еп&е мультифермернтных композиций, которые при действии на различные целлюлозосодержащие материалы не уступают, а иногда и превосходят по эффективности не только грубые ферментные препараты на основе мутантных штаммов промышленных грибных продуцентов, но, в ряде случаев, и искусственно составленные смеси из наиболее активных очищенных целлюлаз Т. гееяе1. Если затем удастся с помощью методов генной инженерии экспрессировать оптимальную композицию ферментов С. ¡искпометне, то учитывая крайне высокую продуктивность этого продуцента по секреции белка (до 80 г/л в культуральной жидкости), а также высокую активность и термостабильность продуцируемых ферментов, потенциал этого гриба для осахаривания растительного сырья будет очень высок.

Выводы

1 Впервые выделены и охарактеризованы внеклеточные целлобиогидролазы, продуцируемые грибом Chrysosporium lucknowense, который является важным промышленным продуцентом целлюлаз и гемицеллюлаз С помощью масс-спектрометрических методов осуществлены идентификация и соотнесение ферментов с кодирующими их генами Проведена классификация ферментов в 7-ю и 6-ю семьи гликозид-гидролаз ЦБГ 1а (Се17А, две формы), ЦБГ Ib (Се17В), ЦБГ IIa (Се16А), ЦБГ IIb (CeI6B) Показано, что высокомолекулярная ЦБГ 1а и ЦБГ IIb предсталяют собой полноразмерные ферменты, состоящие из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером, в то время как у низкомолекулярной формы ЦБГ 1а, а также ЦБГ Ib и ЦБГ IIa ЦСМ отсутствует

2 На основе сравнения (выравнивания) аминокислотных последовательностей выделенных ферментов и известных гомологичных грибных целлюлаз, а также используя данные сравнительного моделирования трехмерной структуры белков, выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз С lucknowense

3 В результате сравнительного исследования свойств целлобиогидролаз С lucknowense и Trichoderma reesei (субстратная специфичность, влияние температуры и pH на активность и стабильность ферментов, кинетика гидролиза полимерных и низкомолекулярных субстратов) установлено, что ЦБГ 1а и ЦБГ IIb С lucknowense существенно превосходят по термостабильности целлобиогидролазы I и II Г reesei Показано, что ЦБГ 1а С lucknowense в меньшей степени ингибируется продуктом (целлобиозой), чем ЦБГ I Т reesei При гидролизе кристаллических форм целлюлозы (хлопка и микрокристаллической целлюлозы) ЦБГ IIb С lucknowense превосходила по эффективности действия все остальные указанные целлобиогидролазы

4 Выявлен ярко выраженный синергизм между ЦБГ 1а и ЦБГ IIb С lucknowense при гидролизе хлопка, который был сравним по масштабу с синергизмом между целлобиогидролазами и эндоглюканазами данного гриба (коэффициент синергизма для комбинации целлобиогидролаз составил 2,75, для других парных комбинаций ферментов Ксин находился в диапазоне 2,0-3,3)

5 Разработан подход для рационального дизайна мультиферментных композиций, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов Продемонстрирована принципиальная возможность создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов С lucknowense мультиферментных композиций, которые сравнимы или превосходят по эффективности действия на различные целлюлозосодержащие субстраты промышленные препараты на основе мутантных штаммов гриба Т reesei, а в ряде случаев и искусственные смеси, составленные из наиболее активных очищенных ферментов Т reesei

Список публикаций

1 Бухтояров Ф Е , Устинов Б Б , Салановнч (Ш> тьга) ТН , Антонов А И , Гусаков А В , Окунев О Н, Синицын А П (2004) Целлюлазный комплекс гриба Chrysosporium luckncmense выделение и характеристика эндоглюканаз и цетлобиогидролаз Биохимия, т 69, N5, с 666-677

2 Gusakov, AV, Smitsyn, АР, Salanovich (Shulga), I.N., Bukhtojarov, ГЕ, Markov, AV, Ustinov BB, van Zeij], C, Punt, P, Burhngame, R (2005) Purification, cloning and characterization of two forms of thermostable and highly active cellobiohydrolase I (Ccl7A) produced by the industrial strain of Chrysosporium lucknoM-ense Enz>me Microb Technol, v36, No l,pp 57-69

3 Gusakov, AV, Salanovich (Shulga), IN, Antonov, AI, Ustinov, BB, Okunev, ON, Burhngame, R, Emalfarb, M , Baez, M , Smitsyn, A P (2007) Design of highly efficient cellulase mixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose Biotcchnol Bioeng v97, No 5, pp 1028-1038

4 Gusakov, \ V , Salanovich (Shulga), T N , Bukhtojarov, F E, Markov, A V , Ustinov, В В , van Zeijl, С , Punt, P , Burhngame, R , Smitsyn, A P Cloning of the Chrysosporium lucknowense CBH1 (Cel7A) gene and characterization of the encoded enzyme Abstracts of 22nd Fungal Genetics Conference, March 18-23, 2003, Asilomar, California, USA, p 413

5 Синицын A , Ok>iicb О , Ц>рикова H , Гусаков А , Марков А , Скомаровский А , Зоров И , Устинов Б, Гришугин С, Кондратьева Е, Саланович (Шульга) Т, Дзедзголя Е Промышленные ферчешные препараты карбогидраз Материалы II Московского международного конгресса "Биотехнология Состояние и перспективы развития", 10-14 ноября, 2003, Москва, с 264

6 Gusakov, А V, Salanovich (Shulga), T.N , Bukhtojarov, FF Markov, A V, Ustinov, В В van Zejl, С , Punt, P, Burhngame, R, Smitsjn, A P Purification and characterisation of two forms of cellobiohydrolase I (Cel7A) fiom Chrysosporium lucbiov-ense Abstracts of 7th European Conference on Fungal Genetics, 17-20 April, 2004, Copenhagen, Denmark, p 188

7 Синицын А П , Гусаков А В , Марков А В , Скомаровский A A , Саланович (Шульга) T Н Кондратьева Е Г , Окунев О II, Сочовьева И В , Вечьков В В , Беккаресич А О Новые целлюлазы для высокоэффективного гидролиза лигноцечлючозной биомассы Тезисы докладов Второй в Украине международной конференции "Энергия из биомассы', 20-22 сентября, 2004, Киев, Украина, с 276-277

8 Gusakov, А V , Grishutm, S G , Ustinov, В В , Antonov, АI, Skomarovsky, А А , Salanovich (Shulga), IN, Fedoro\d, EA, Zoiov, IN, Simts>n, AP Mass spectrometry approaches for characterization of glycoside hydrolases Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2005 Fundamentals & Applications", June 19-23, 2005, St Petersburg, Russia, p 21

9 Markov, A V , Skomarovsky, A A, Berlin, AII, Salanovich (Shulga), T N , Okunev, О N , Gusakov, A V, Smitsyn, A P Novel cellulases for highly effective sacchanfication of lignocellulosic biomass Abstracts of International Conference "Brocatalysis-2005 Fundamentals & Applications", June 19-23, 2005, St Petersburg, Russia, p 34

10 Salancmch (Shulga), T N., Gusakov, A V , Smitsyn, A P Cellobiohydrolases from Trichoderma reesei and Chrysosporium lucknowense Properties and use at the key stage of bioethanol production Abstracts of The rourth Moscow International Congress "Biotechnology State of the Art and Prospects of Development", March 12-16, 2007, Moscow, Russia, p 301

11 Salanovich (Shulga), T.N , Gusakov, A V, Smitsyn, A P Hydrolysis oi natural cellulose by fungal cellobiohydrolases Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007 Fundamentals & Applications", June 17-22,2007, Moscow - St Petersburg, Russia, p 120-121

Подписано в печать 16 05 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 424 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1 Состав и строение растительной биомассы.

1.1 Основные компоненты растительной биомассы.

1.2 Строение и физико-химические свойства целлюлозы.

1.3 Гемицеллюлозы и пектины.

1.4 Лигнин.

Глава 2 Свойства и роль целлобиогидролаз.

2.1 Целлюлазы и их место в классификации гликозид-гидролаз.

2.2 Особенности структуры целлобиогидролаз.

2.3 Строение активных центров целлобиогидролаз.

2.4 Структура и роль ЦСМ.

2.5 Функция линкера.

2.6 Механизм действия целлюлазного комплекса.

2.7 Молекулярные и физико-химические характеристики грибных целлобиогидролаз.

Экспериментальная часть.

3.1 Объекты исследования и реактивы.

3.2 Выделение и очистка ферментов.

3.3 Аналитические методы.

3.4 Определение физико-химических и каталитических параметров ферментов

3.5 Гидролиз различных целлюлозосодержащих субстратов.

3.6 Масс-спектрометрический анализ пептидов и построение трехмерных моделей ферментов.

Результаты и их обсуждение.

Глава 4 Выделение и очистка целлобиогидролаз C.lucknowense и Т. reesei.

4.1 Выделение целлобиогидролаз С. lucknowense.

4.2 Выделение целлобиогидролаз Т. reesei.

Глава 5 Масс-спектрометрический анализ целлобиогидролаз С. h/cknowense и их аминокислотные последовательности.

5.1 ЦБГ 1а и Ib 7-й семьи гликозид-гидролаз.

5.2 ЦБГ IIa и IIb 6-й семьи гликозид-гидролаз.

Глава 6 Свойства целлобиогидролаз С. hicknowense и Т. reesei.

6.1 Субстратная специфичность и каталитические свойства целлобиогидролаз

6.2 Адсорбционные характеристики целлобиогидролаз.

6.3 Термостабильность ферментов.

6.4 Влияние температуры и pH на активность ферментов.

Глава 7 Рациональный дизайн мультиферментных смесей для высокоэффективного гидролиза целлюлозосодержащих материалов.

7.1 Сравнение эффективности действия различных целлобиогидролаз на МКЦ

7.2 Синергизм между целлюлазами С. lucknowense.

7.3 Гидролиз целлюлозных субстратов комбинациями целлюлаз.

7.4 Гидролиз целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства смесями очищенных целлюлаз.

Выводы.

Сжигание огромного количества нефти, угля и газа приводит к так называемому «парниковому эффекту» вследствие выбросов двуокиси углерода в атмосферу и общему ухудшению экологической обстановки на Земле. Кроме того, в последнее время резко возросли цены на нефть и другие энергоносители. Одним из решений этих проблем является использование альтернативных видов топлива (этанола, бутанола и др.), получаемых из возобновляемой растительной биомассы путем ее ферментативного гидролиза с последующим сбраживанием получаемых Сахаров [1, 2]. Это помогло бы решить еще одну мировую проблему, такую как утилизация целлюлозосодержащих отходов промышленности и сельского хозяйства.

Главным компонентом растительной биомассы является целлюлоза. Ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы, занимают центральное место в круговороте органического углерода. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются микроскопические грибы - возбудители мягкой, белой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий.

Среди промышленных микробных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз различные штаммы грибов рода Тпс\ю(1ггта (Т. гееяе1, Т. ут4е, Т. 1ощ\ЪгасЫаШт) играют ведущую роль [3]. Это обусловлено их высокой секреторной способностью, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной , специфичностью, что делает эти продуценты универсальным объектом для использования по различным направлениям. Известно, что эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов зависит от качественного состава мультиферментного целлюлазного комплекса и свойств его компонентов [4]. В свою очередь, среди свойств индивидуальных компонентов основными являются: удельная активность фермента по отношению к целлюлозному субстрату, его стабильность, а также толерантность по отношению к продуктам реакции, которые могут ингибировать активность фермента. Активность целлюлаз по различным целлюлозосодержащим субстратам может существенно различаться в зависимости от степени кристалличности субстрата, наличия в его составе примесей (лигнина и гемицеллюлоз), а также ряда других факторов. Поэтому, по-видимому, не существует идеального целлюлазного комплекса, который является оптимальным для любого вида целлюлозосодержащего сырья. Тем не менее, в литературе весьма распространена точка зрения, что целлюлазные комплексы, продуцируемые мутантными штаммами гриба Т. ггезег (71 longibrachiatum) являются наиболее эффективными разрушителями природной целлюлозы и их практически невозможно превзойти по скорости и глубине гидролиза субстрата [5, б]. Целлюлазные комплексы Т. ге.е$е\ (Т. 1оп&ЬгасШаШт) в основном состоят из двух целлобиогидролаз - ЦБГ I (40-60% от общего количества секретируемого белка) и ЦБГ II (12-20%), и двух эндоглюканаз - ЭГ I и ЭГ II, суммарное содержание которых составляет 10-20%. Наиболее существенным недостатком данного продуцента целлюлаз является, как правило, низкое содержание р-глюкозидазы [7], отвечающей за конверсию промежуточных продуктов ферментативного гидролиза целлюлозы в конечный продукт - глюкозу.

Ключевыми ферментами целлюлазного комплекса, ответственными за глубокий гидролиз нерастворимой целлюлозы в растворимые сахара, являются целлобиогидролазы. Основным продуктом действия этих ферментов является целлобиоза (димер глюкозы) Целлобиогидролазы I и II Г. геехе1 относятся к наиболее изученным ферментам, разрушающим природные полисахариды. Только по этим двум ферментам в литературе можно найти сотни публикаций. Достаточно много информации опубликовано также о целлобиогидролазах из таких грибных продуцентов целлюлаз, как НитгсоЫ тяокт, РкапегосЬаеЫ скгузохрогпип и некоторых других, в тоже время о свойствах других грибных целлобиогидролаз известно значительно меньше, несмотря на то, что в базах данных белков имеется значительное количество их аминокислотных последовательностей, транслированных из генов.

В результате совместных исследований ИБФМ РАН и кафедры химической энзимологии МГУ был найден перспективный продуцент целлюлаз и гемицеллюлаз -гриб СЪгузояорогшт Ыскпоыете, на основе которого были получены новые мутантные штаммы, отличающиеся высокой секреторной способностью. По уровню секреции внеклеточного белка (50-80 г/л) некоторые штаммы С. \ucknoweme не уступают, либо превосходят лучшие известные промышленные продуценты целлюлаз. Ранее в нашей лаборатории (физнко-химии ферментативной трансформации полимеров кафедры химической энзимологии МГУ) были выделены и детально исследованы эндоглюканазы и ксиланазы С. 1искпо\чете [8, 9], однако свойства целлобиогидролаз не изучались, хотя были получены предварительные данные об их наличии в составе ферментного комплекса данного гриба.

Учитывая актуальность исследования целлобиогидролаз, продуцируемых различными микроорганизмами, как ключевых ферментов при гидролизе природной целлюлозы, а также необходимость поиска новых целлюлаз, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов, в данной работе были поставлена следующая цель: выделить и изучить биохимические и физико-химические свойства всех целлобиогидролаз, секретируемых грибом С. 1искпо\\'ете, а также оценить

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Впервые выделены и охарактеризованы внеклеточные целлобиогидролазы, продуцируемые грибом Chrysosporium lucknowense, который является важным промышленным продуцентом целлюлаз и гемицеллюлаз. С помощью масс-спектрометрических методов осуществлены идентификация и соотнесение ферментов с кодирующими их генами. Проведена классификация ферментов в 7-ю и 6-ю семьи гликозид-гидролаз: ЦБГ 1а (Се17А, две формы), ЦБГ Ib (Се17В), ЦБГ IIa (Се16А), ЦБГ IIb (Се16В). Показано, что высокомолекулярная ЦБГ 1а и ЦБГ IIb предсталяют собой полноразмерные ферменты, состоящие из каталитического домена и целлюлозосвязывающего модуля (ЦСМ), соединенных пептидным линкером, в то время как у низкомолекулярной формы ЦБГ 1а, а также ЦБГ Ib и ЦБГ IIa ЦСМ отсутствует.

2. На основе сравнения (выравнивания) аминокислотных последовательностей выделенных ферментов и известных гомологичных грибных целлюлаз, а также используя данные сравнительного моделирования трехмерной структуры белков, выявлены ключевые аминокислотные остатки, отвечающие за катализ и связывание субстрата в активных центрах целлобиогидролаз С. lucknowense.

3. В результате сравнительного исследования свойств целлобиогидролаз С. lucknowense и Trichoderma reesei (субстратная специфичность, влияние температуры и pH на активность и стабильность ферментов, кинетика гидролиза полимерных и низкомолекулярных субстратов) установлено, что ЦБГ 1а и ЦБГ IIb С. lucknowense существенно превосходят по термостабильности целлобиогидролазы I и II Т. reesei. Показано, что ЦБГ 1а С. lucknowense в меньшей степени ингибируется продуктом (целлобиозой), чем ЦБГ I Т. reesei. При гидролизе кристаллических форм целлюлозы (хлопка и микрокристаллической целлюлозы) ЦБГ IIb С. lucknowense превосходила по эффективности действия все остальные указанные целлобиогидролазы.

4. Выявлен ярко выраженный синергизм между ЦБГ 1а и ЦБГ IIb С.lucknowense при гидролизе хлопка, который был сравним по масштабу с синергизмом между целлобиогидролазами и эндоглюканазами данного гриба (коэффициент синергизма для комбинации целлобиогидролаз составил 2,75, для других парных комбинаций ферментов Ксп„ находился в диапазоне 2,0-3,3).

5. Разработан подход для рационального дизайна мультиферментных композиций, способных осуществлять высокоэффективный гидролиз целлюлозосодержащих материалов. Продемонстрирована принципиальная возможность

107 создания на основе целлобиогидролаз и других ферментов СЛискпоууете мультиферментных композиций, которые сравнимы или превосходят по эффективности действия на различные целлюлозосодержащие субстраты промышленные препараты на основе мутантных штаммов гриба Т. гее.чси, а в ряде случаев и искусственные смеси, составленные из наиболее активных очищенных ферментов Т. гееяег.

1. McMillan J. Bioethanol production: status and prospects. II Renewable Energy, 1997, v. 10, No 2/3, p. 295-302.

2. Sanchez O.J., Cardona C.A. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. // Bioresource Technology, 2008, v. 99, p. 5270-5295.

3. Godfrey T., West S. (eds) Industrial enzymology, // 2nd edition, / Macmillan Press Ltd., Hampshire, 1996, 609 p.

4. Синнцын А. П., Гусаков А. В., Черноглазое В. M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. // М: Издательство Московского университета, 1995, с. 219.

5. Mandels M., Weber J. The production of cellulases. // Adv. Chem. Ser., 1969, v. 95, p. 391-414.

6. Rosgaard L., Pedersen S., Langston J., Akerhielm D., Cherry J.R.T Meyer A.S.

7. Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulose mixtures on differently pretreated barley straw substrates. // Biotechnol. Prog., 2007, v. 23, p. 1270-1276.

8. Бухтояров Ф. Выделение и свойства целлюлаз мицелального гриба Chrysosporium lucknowense. // Дисс. на соискание ученой степени кхн, Москва, МГУ, 2004, 125 с.

9. Устинов Б. Свойства ксиланаз Chrysosporium lucknowense, Н Дисс. на соискание ученой степени кхн, Москва, МГУ, 2006, 148 с.

10. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. // М: Мир, 1986, 387 с.

11. И. Sing J., Panesar B.S., Sharma S.K. Energy potential through agricultural biomass using geographical information system—A case study of Punjab. // Biomass and Bioenergy, v. 32/4, p. 301-307.

12. Байклз И., Сегал Л. Целлюлоза и ее производные. // М: Мир, 1974, в 2-х томах, т. 1 ,500 е., т. 2,510 с.

13. Bhattacharya D., Germinario L.T., Winter W.T. Isolation, preparation and characterization of cellulose microfibers obtained from bagasse. // Carbohydrate Polymers, v. 73/3, 2008, p. 371-377.

14. Zhao H., Kwak J.H., Zhang Z.C., Brown H.M., Arey B.W., HoIIaday J.E. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. // Carbohydrate Polymeis, v. 68/2, 2007, p. 235-241.

15. Clarke A.J. Biodegradation of cellulose. Enzymology and biotechnology. // Lancaster: Technomic Publishing Company Inc., 1997, 272 p.

16. Роговин З.А. Химия целлюлозы. // M: Химия, 1972, 519 с.

17. Никитин В.М., Оболенская А.В, Щеголев В.П. Химия древесины и целлюлозы. //М.5 1978, 363 с.

18. Taylor R.E., French A.D., Gamble G.R., Himmelsbach D.S., Stipanovic R.D., Thibodeaux D.P., Wakelyn P.J., Dybowski C. *H and I3C solid-state NMR of Gossypium barbadense (Pima) cotton. //Journal of Molecular Structure, v. 878/1-3, 2008, p. 177-184.

19. O'SuIlivan A. C. Cellulose: the structure slowly unravels. // Cellulose, 1997, v. 4, p. 173-207.

20. Ishikawa A., Okano T. Fine structure and tensile properties of ramie fibres in the crystlline form of cellulose I, II, III and IV. // Polymer, 1997, v.38/2, p. 463-468.

21. Ranby B.G. Cellulose and their applications. // W., 1969, p. 139- 210.

22. Coughlan M.P., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. // Portland Press Research Monograph, London-Chapel Hill, 1993, v. 4, 120 p.

23. Uhlig H. Industrial enzymes and their applications. // New York: John Willey & Sons, Inc., 1998,454 p.

24. Scalbert A., Monties В., Lallemand J.Y., Guitted E., Rolando C. Ether linkage between phenolic acids and lignin fractions from wheat straw. // Phytochemistry, 1985, v.24. p. 1359-1362.

25. Vivas N., Nonier M.-F., Pianet I., de Gaulejac N.V., Fouquet Ё. Structure of extracted lignins from oak heartwood. // (Quercus petraea Liebl., Q. Robur L.) Comptes Rendus Chimie, v. 9/ 9, 2006, p. 1221-1233.

26. Закис Г.Ф., Крейцберг 3.H., Можейко JI.H., Сергеева В.Н. Лигнин. // В сб.: Клеточная стенка древесины и ее изменения при химическом воздействии, Р: Зинатне, 1972, с. 136-242.

27. Родионова Н.А. Ферментативное расщепление целлюлозы. // В сб.: Целлюлазы микроорганизмов (под ред. В.Л.Кретович), М.: Наука, 1981, с.4-40.

28. Dumitru I.E., Iordachescu D. Partial characterization of a cellulase preparation purified from the sea mollusc Mya arenaria L. // Rev. Roum. Biochim., 1978, v. 5, p. 265271.

29. Клесов A.A., Рабинович М.Л., Чурилова И.В., Мартьянов В.А., Гусаков А.В., Елякова Л.А. Ферментативный гидролиз целлюлозы. V. Целлюлазные комплексы морских организмов Японского моря. // Биоорг. химия, 1982, т. 8/11, с. 1490-1496.

30. Tokuda G., Lo, N., Watanabe H., Slay tor M., Matsumoto Т., Noda H. Metazoan cellulase genes from termites: intron/exon structures and sites of expression. // Biochim. Biophys. Acta, 1999, v. 1447, p. 146-159.

31. Coutinho P.M., Stam M., Blanc E., Henrissat B. Why are so many carbohydrate-active enzyme-related genes in plants? // Trends Plant Sci., 2003, v. 8/12, p. 563-565.

32. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. //Trends Biotechnol., 1997, v. 15, p. 160-167.

33. Hrmova M., Fincher G.B. Structure-function relationships of p-D-glucan endo- and exohydrolases from higher plants. // Plant Mol. Biol. 2001, v. 47, p. 73-91.

34. Opassiri R., Hua, Y., Wara-Aswapati O., Akiyama T., Svasti J., Esen A., Ketudat Cairns J.R. Beta-glucosidase, exo-P-glucanase and pyridoxine transglucosylase activities ofriceBGlul.//Biochem. J, 2004, v. 379, p. 125-131.

35. McCarthy J.K., Uzelac A., Davis D.F., Eveleigh D.E. Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-P-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution. // J. Biol. Chem., 2004, v. 279, p. 11495-11502.

36. Himmel M.E., Tucker M.P., Lastick S.M., Oh K.K., Fox J.W., Spindler D.D., Grohmann K. Isolation and characterization of a 1,4-P-D-glucan glucohydrolase from the yeast, Torulopsis wickerhamii. II J. Biol. Chem., 1986, v. 261, p. 12948-12955.

37. Wood T.M., McCrae S.I. Purification and some properties of a 1,4-P-D-glucan glucohydrolase associated with the cellulase from the fungus Penicillium funiculosum. // Carbohydr. Res., 1982, v. 110, p. 291-303.

38. Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemessle L., Mornon J.-P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. // Gene, 1989, v. 81, p. 83-95.112

39. Van Tilbeurgh H., Tomrae P., Claeyssens M., Bhikhabhai R., Pettersson G.1.mited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of the functional domains. I IFEBS Lett., 1986, v. 204, p. 223-227.

40. Gilkes N.R., Henrissat В., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Domains in microbal p-l,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families. // Microbiol. Rev., 1991, v. 55, p. 303-315.

41. Henrissat B. A Classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. // Biochem. J., 1991, v. 280, p. 309-316.

42. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. // Structure, 1995, v. 3, p. 853-859.

43. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. // Biochem. J., 1996, v. 316, p. 695-696.

44. Рабинович M.JI., Мельник M.C., Болобова A.B. Целлюлазы микроорганизмов. // Прикл. биохим. микробиол., 2002, т. 38/4, с. 355-373.

45. Schulein М. Protein engineering of cellulases. // Biochim. Biophys. Acta, 2000, v. 1543, p. 239-252.

46. Henrissat В., Teeri Т., Warren R.A.J. A scheme for designating enzymes that hydrolase the polysaccharides in the cell walls of plants. // FEBS Lett., 1998, v. 425, p. 352-354.

47. Nevalainen H., Penttila M. Molecular biology of cellulolytic fungi. In: U. Kuck (Ed.),

48. The Mycota II. Genetics and Biotechnology. // Berlin: Springer-Verlag, 1995, p. 303-319.113

49. Shoemaker S., Schweickart V., Lander M., Gelfand D., Kwok S., Myambo K., Innis M. Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. H Bio. Technology, 1983, v. 1, p. 691-695.

50. Fagerstam L., Pettersson G., Engstrom J.A. The primary structure of a 1,4-p-glucan cellobiohydrolase from the flingus Trichoderma reesei QM 9414. // FEBS Lett., 1984, v. 167, p. 309-315.

51. Schmuk M., Piliz I., Hayn M., Esterbaner H. Investigation of cellobiohydrolase from Trichoderma reesei by small angle X-ray scattering. // Biotechnol. Lett., 1986, v. 8, p. 397-402.

52. Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C.Jr., Warren R.A.J. Structural and functional analysis of a bacterial cellulase by proteolysis. // J. Biol. Chem., 1989, v. 264, p. 1780217808.

53. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K.C., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. // Science, 1990, v. 249, p. 380386.

54. Hoffren A.M., Teeri T., Teleman O. Molecular dynamic simulation of fungalcellulose-binding domains: differences in molecular rigidity but a preserved cellulosebinding surface. // Protein Eng., 1995, v. 8, p. 443-450.114

55. Linder M., Teeri T.T. The roles and function of cellulose-binding domains. // J. Biotechnol., 1997, v. 57, p. 15-28.

56. Lee H.J., Brown M., Jr. A comparative structural characterization of two cellobiohydrolases from Trichoderma reesei: a high resolution electron microscopy study. //J. Biotechnol., 1997, v. 57, p. 127-136.

57. Suominen P., Reinikainen T. (eds.) Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research. // Finland: Helsinki, v. 8,1993, 314 p.

58. Beguin P., Aubert J.P. The biological degradation of cellulose. // FEMS Microbiol. Rev., 1994, v. 14, p. 5-58.

59. Varrot A., Schulein M., Davies G.J. Structural changes of the active site tunnel of Humicola insolens cellobiohydrolase, Cel6A, upon oligosaccharide binding. // Biochemistry, 1999, v. 38, p. 8884-8891.

60. Ubhayasekera W., Munoz I.G., Vasella A., Stahlberg J., Mowbray S.L. Structures of Phanerochaete chrysosporium Cel7D in complex with product and inhibitors. // FEBS J., 2005, v. 272 (8), p. 1952-1964.

61. Knowles J., Lehtovaara P., Murray M. , Sinnott M. Stereochemical course of the action of the cellobioside hydrolases I and II of Trichoderma reesei // J. Chem. Soc., Chem. Comm., 1988, p. 1401-1402.

62. Claeyssens M., Tomme P., Brewer C. , Hchre E. Stereochemical course of hydrolysis and hydration reactions catalysed by cellobiohydrolases I and II from Trichoderma reesei II J. FEBS Lett., 1990, v. 263/1, p. 89-92.

63. Ruohonen L. "Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases" (P. Suominen and T. Reinikainen, Eds.), // Helsinki: Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, 1993, v. 8, p. 87-93.

64. Konstantinidis A.K., Marsden I., Sinnott M.L. Hydrolyses of a- and p-cellobiosyl fluorides by cellobiohydrolases of Trichoderma reesei. // Biochem. J., 1993, v. 291, p. 883-888.

65. Stahlbcrg J., Divne C., Koivula A., Piens K., Claeyssens M., Teeri T.T., Jones T.A.

66. Activity studies and crystal structures of catalytically deficient mutants of cellobiohydrolase I from Trichodermct reesei. // J. Mol. Biol., 1996, v.264, p.337-349.

67. Vrsanska M., Biely P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cellooligosaccharides. // Carbohydr. Res., 1992, v. 227, p. 19-27.

68. Srisodsuk M., Lehtio J., Linder M., Margollcs-Clark E., Reinikainen T., Teeri

69. T.T. Trichoderma reesei cellobiohydrolase I with an endoglucanase cellulose-binding domain: action on bacterial microcrystalline cellulose. I I J, of Biotech., 1997, v. 57, p. 4957.

70. Linder M., Lindeberg G., Reinikainen T., Teeri T., Pettersson G. The difference in affinity between two fimgal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution. // FEBS Lett., 1995, v. 372, p. 96-98.

71. Tomme P., Warren R. A.J., Gilkes N. Cellulose degradation by bacteria and fungi. // Adv. Microb. Physiol., 1995, v. 37, p. 1-81.

72. Stahlberg J, Johansson G, Pettersson G. A new model for enzymatic hydrolysis of cellulose based on the two-domain structure of cellobiohydrolase I. // Bio. Technology, 1991, v. 9, p. 286-290.

73. Boraston A.B., Bolam D.N., Gilbert H.J., Davies G.J. Carbohydrate-binding modules: fine tuning polysaccharide recognition. // Biochem. J., 2004, v. 382, p. 769-81.

74. Reinikainen Т., Teleman O., Teeri T.T. Effects of pH and high ionic strength on the adsorption and activity of native and mutated cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. // Proteins, 1995, v. 22/4, p. 392-403.

75. Рабинович M.JI., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. // Биохимия, 2002, т. 67/8, с. 1026-1050.

76. Langsford M.L., Singli G.B., Moser В., Miller R.C., Jr., Warren R.A.J., Kilburn

77. D.G. Glycosylation of bacterial cellulases prevents proteolytic cleavage between functional domains. // FEBS Lett., 1987, v. 225, p. 163-167.

78. Srisodsuk M., Reinikainen Т., Penttila M., Teeri T.T. Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose. // J. Biol. Chem., 1993, v. 268, p. 20756-20761.

79. Reese E.T., Siu R.G.H., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. // J. Bacterid., 1950, v. 59, p. 485-497.

80. Wood T.M., McCrae S.I. Synergism between enzymes involved in the solubilization of native cellulose. //Adv. Chem. Ser., 1979, v. 181, p. 181-209.

81. Ryu D.D.Y., Kim C., Mandels M. Competition and sorption of cellulase components and its significance in a synergistic mechanism. // Biotechnol. Bioeng., 1984, v. 26, p. 488496.

82. Henrissat В., Driguez H., Viet C., Schulein M. Synergism of cellulase from Trichoderma reesei in degradation of cellulose. // Bio. Technology, 1985, v. 3, p. 722-726.

83. Fujii M., Shimizu M. Synergism of endoenzyme and exoenzyme on hydrolysis of soluble cellulose derivatives. // Biotechnol. Bioeng., 1986, v. 28, p. 878-882.

84. Синицын А.П., Митькевич O.B., Калюжный C.B., Клесов А.А. Изучение синергизма в действии ферментов целлюлазного комплекса. // Биотехнология, 1987, т. 3/1, с. 39-46.

85. Рабинович M.JL, Клесов А.А., Черноглазов В.М., Вьет В.Н., Березин И.В.

86. Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментов фактор, определяющий реакционную способность нерастворимой (кристаллической) целлюлозы. // Докл. АН СССР, 1981, т. 260/6, с. 1481-1486.

87. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы. //Биоорг. химия, 1982, т. 8/5, с. 643-651.

88. Синицын А.П., Наджеми Б., Митькевич О.В., Клесов А.А. Взаимное усиление гидролитического действия прочно и слабо адсорбирующихся целлюлазных препаратов. // Прикл. биохим. микробиол., 1986, т. 22/3, с. 333-336.

89. Klyosov A.A. Trends in biochemistry and enzymology of cellulose degradation. // Biochemistry, 1990, v. 129, p. 10577-10585.

90. Гусаков A.B. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы). // Диссертация на соискание ученой степени к. х. н., Москва: МГУ, 1984, 192 с.

91. Синицын А.П., Митькевич О.В. Различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. // Биотехнология, 1987, т. 3/2, с. 227-233.

92. Bothwell M.K., Wilson D.B., Irwin D.C., Walker L.P. Binding reversibility and surface exchange of Thermomonospora fusca E3 and E5 and Trichoderma reesei CBH 1.11 Enzyme Microb. Technol., 1997, v. 20, p. 411-417.

93. Jervis E.J., Haynes C.A., Kilburn D.G. Surface diffusion of cellulases and then-isolated binding domains on cellulose. // J. Biol. Chem., 1997, v. 272, p. 24016-24023.

94. Beldman G., Voragen A.G.J., Rombouts F.M., Searle-van-Leeuven M.F., Pilnik

95. W. Adsorption an kinetic behavior of purified endoglucanases and exoglucanases from Trichoderma reesei. //Biotechnol. Bioeng., 1987, v. 30, p. 251-257.

96. Ong E., Greenwood J., Gilkes N., Kilburn D.G., Miller R.C., Warren R.A.J. Thecellulase-binding domains od cellulases: tools for biotechnology. // Trends Biotechnol., 1989, v. 7, p. 239-243.

97. Mihvard-Sadler S.J., Poole D., Henrissat B., Hazlewood G., Clarke J.H., Gilbert

98. H.J. Evidence for a general role for high-affinity non-catalytic domains in microbial plant cell wall hydrolases. // Mol. Microbiol., 1994, v. 11, p. 375-382.

99. Esteghlalian A.R., Srivastava V., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Warren R.A.J., Saddler J.N. Do cellulose binding domains increase substrate accessibility? // Appl. Biochem. Biotechnol. 2001, v.91-93, p.575-592.

100. Krull L.H., Dintzis F.R., Griffin H.L., Baker F.L. A microfibril-generating factor from the cellulase of Trichoderma reesei. II Biotechnol. Bioeng., 1988, v. 31, p. 321-327.

101. Banka R.R., Mishra S., Ghose T.K. Fibril formation from cellulose by a novel protein from Trichoderma reesei: a non-hydrolytic cellulolytic component. // World J. Microbiol. Biotechnol., 1998, v. 14, p. 551-558.

102. Banka R.R., Mishra S. Adsorption properties of the fibril forming protein from Trichoderma reesei. II Enzyme Microb. Technol., 2002, v. 31, p. 784-793.

103. Din N., Gilkes N.R., Tekant B., Miller R.C., Jr., Warren R.A.J., Kilburn D.K.

104. Non-hydrolytic disruption of cellulose fibers by the binding domain of a bacterial cellulase. //Bio. Technology, 1991, v. 9, p. 1096-1099.

105. Xiao Z., Gao P., Qu Y., Wang T. Cellulose-binding domain of endoglucanase III from Trichoderma reesei disrupting the structure of cellulose. // Biotechnol. Lett., 2001, v. 23, p. 711-715.

106. Shulien M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola ins ol ens. I I J. of Biotech., 1997, v. 57, p. 71-81.

107. Varrot A., Frandsen T.P., von Ossowski I., Boyer V., Cottaz S., Driguez H., Schulein M., Davies G.J. Structural basis for ligand binding and processivity in cellobiohydrolase Cel6A from Humicola insolens. И Structure, 2003, v. 11, p. 855-864.

108. Tuohy M.G., Walsh D. J., Murray P.G., Claeyssens M., Cue M. M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. II Biochim. at Biophis. Acta, 2002, v. 1596, p. 366-380.

109. Maheshwari R., Bharadwaj G., Bhat M.K. Thermophilic fungi: their physiology and enzymes. // Mic. And Mol. Biology, 2000, v. 64, 3, p. 461-488.

110. Boer H., Koivula A. The relationship between thermal stability and pH optimum studied with wild-type and mutant Trichoderma reesei cellobiohydrolase Cel7A. // Eur. J. Biochem., 2003, v. 270, p. 841-848.

111. Jimenez J., Dominguez J.M., Castillon M., Acebal C. Thermoinactivation of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414. I I Carbohydrate Research, v. 268/2, p. 257-266.

112. Chen C.M., Gritzali V., Stafford D.W. Nucleotide sequence and deduced primary structure of cellobiohydrolase II of Trichoderma reesei. // Bio. Technol., 1987, v. 5, p. 274278.

113. Limam F., Chaabouni S.E., Ghrir R., Marzouki N. Two cellobiohydrolases of Penicillium occitanis mutant Pol 6: Purification and properties. // Enzyme and Microbial Technology, 1995, v. 17/4, p. 340-346.

114. Итоги науки и техники. Биотехнология, т. 25, с. 148.

115. Peitsch M.C. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling. //Biochem. Soc. Trans., 1996, v.24, p.274-279.

116. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an environment for comparative protein modelling. // Electrophoresis, 1997, v. 18, p.2714-2723.

117. Марков А. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. // Дисс. на соискание ученой степени кхн, Москва, МГУ, 2003, 201 с.

118. Скомаровский А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicilliwn verruculosum. II Дисс. на соискание ученой степени кхн, М.: МГУ, 2006, 179 с.

119. Rappsilber J., Moniatte М., Nielsen M.L., Podtelejnikov A.V., Mann M.

120. Experiences and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research. // Int. J. Mass Spectrometry, 2003, v. 226, p. 223-237.

121. Stals I., Sandra K., Geysens S., Contreras R., van Beeumen J., Claeyssens M.

122. Factors influencing glycosylation of Thichoderma reesei cellulases. I. Postsecretorial changes of the O- and N-glycosylation pattern of Cel7A. // Glycobiology, 2004, v. 14, p.713-724.

123. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // М: Мир, 1991, с. 543.

124. James P. (ed.). Proteome research: mass spectrometry. // Berlin: Springer-Verlag, 2001,274 p.

125. Varrot A., Hastrup S., Schulein M., Davies G.J. Crystal structure of the catalytic core domain of the family 6 cellobiohydrolase II, Cel6A, from Humicola insolens, at 1.92 A resolution, II 1999, v. 337, p. 297-304.

126. Nidetzky B., Zachariae W., Gercken G., Hayn M., Stcincr W. Hydrolysis of cellooligosaccharides by Trichoderma reesei cellobiohydrolases: experimental data and kinetic modeling. // Enzyme Microb. Technol., 1994, v. 16, p. 43-52.

127. Wang L., Liu J., Zhang Y., Zhao Y., Gao P. Comparison of domains function between cellobiohydrolase I and endoglucanase I from Trichoderma pseudokoningii S-38 by limited proteolysis. // J. of Mol. Cat. B: Enzymatic, 2003, v. 24-25. p. 27-38.

128. Nidetzky B, Stciner W., Hayn M., Claeyssens M. Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei: a new model for synergistic interaction. // Biocem. J., 1994, v. 298, p. 705. 710.

129. Medve J., Stahlberg J., Tjerneld F. Adsorption and synergism of cellobiohydrolase I and II of Trichoderma reesei during hydrolysis of microcrystalline cellulose. // Biotechnol. Bioeng., 1994, v. 44, p. 1064-1073.

130. Barr B.K., Hsieh Y.L., Ganem B., Wilson D.B. Identification of two functionally different classes of exocellulases. // Biochemistry, 1996, v. 35, p. 586-592.

131. Valjamae P., Sild V., Pettersson G., Johansson G. The initial kinetics of hydrolysis by cellobioydrolases I and II is consistent with a cellulose surface erosion model. // Eur. J. Biochem., 1998, v. 253, p. 469-475.

132. Imaia T., Boisset C., Samejimab M., Igarashib K., Sugiyamaa J. Unidirectional processive action of cellobiohydrolase Cel7A on Valonia cellulose microcrystals. // FEBS Letters, 1998, v. 432, p. 113-116.

133. Kurabi A., Berlin A., Gilkes N., Kilburn D., Bura R., Robinson J., Markov A., Skomarovsky A., Gusakov A., Okunev O., Sinitsyn A., Gregg D., Xie D., Saddler J.

134. Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolv-pretreated Douglas-fir by novel and commercial fungal cellulases. // Appl. Biochem. Biotechnol., 2005, v. 121-124, p. 219-230.

135. Sinitsyn A.P., Nadzhemi B., Mit'kevich O.V., Klesov A.A. Mutual enhancement of the hydrolytic action of tightly and loosely adsorbed cellulose preparations. // Appl. Biochem. Microbiol (Moscow), 1986, v. 22, p. 275-278.

136. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Klyosov A.A. Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose. 1. A mathematical model for a batch reactor process. // Enzyme Microb. Technol., 1985, v. 7, p. 346-352.

137. Gusakov A.V., Snitsyn A.P., Manenkova J.A., Protas O.V. Enzymatic conversion of industrial and agricultural lignocellulosic wastes: Main features of the process. // Appl. Biochem. Biotehcnol., 1992, v. 34, p. 625-637.