Выделение и свойства целлюлаз мицелиального гриба Chrysosporium Lucknowense тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

БУХТОЯРОВ ФЕДОР ЕВГЕНЬЕВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛА3 МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА CHRYSOSPORIUMLUCKNOWENSE

02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын А.П. Консультант: кандидат химических наук Гусаков А. В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Максименко А.В. кандидат химических наук Черноглазое В.М.

Ведущая организация:

Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН, Пущино

совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан «¿» апреля 2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук Сакодынская И.К.

Защита состоится

1 ¿00

16 час на заседании диссертационного

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость проблемы.

Целлюлазы находят все более широкое применение в текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой и других отраслях промышленности. В начале истории изучения целлюлаз основной целью исследований был поиск ферментов, приводящих к глубокому гидролизу субстрата. В последнее время усилия исследователей направлены на поиск целлюлолитичееких ферментов, способных мягко воздействовать на поверхность целлюлозного субстрата, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз используют термин «тополитическая» активность). Обнаружение целлюлаз с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации джинсовых изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных материалов с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т. д. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные позволяет проводить процессы в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде. Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения процесса - как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и повышенная температура. В связи с этим наиболее перспективными для использования являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, демонстрирующие высокую активность и стабильность при значениях рН, близких к нейтральным (рН 6-8), и температурах 50°С и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение высокопродуктивных мутантных штаммов при помощи методов мутагенеза или генной инженерии, а также выделение и исследование свойств ключевых топояитических целлюлаз.

В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН совместно с кафедрой Химической этимологии МГУ был осуществлен скрининг продуцентов целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН, в результате чего был найден мицелиальный гриб Скгуяояропит ¡искпомвтв, целлюлазный комплекс которого практически не исследован. Гриб С. Шскпо'мгтг, относящийся к классу аскомицетов, был выделен из щелочной почвы Дальнего Востока, и далее, путем мутагенеза был получен мутантный штамм, отличающийся повышенным уровнем секреции целлюлаз и гемицеллюлаз. Ферментные препараты, полученные с помощью С. ¡искпомвтв, продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажной ткани. Однако данные, касающиеся состава и свойств ферментов, продуцируемых С. Шскпомете в научной литературе практически отсутствуют. , ¡'ОС. 11

лционлльнла|

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выделение и изучение свойств ферментов целлюлазного комплекса, продуцируемого мутантпым штаммом гриба С. Шскпомвтв, а также выявление ключевых целлюлаз, отвечающих за высокую эффективность ферментных препаратов С. 1искпоч>етг при обработке хлопчатобумажной ткани.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Определить компонентный состав ферментного комплекса С. Шскпо'мгтг.

• Выделить в гомогенном виде все целлюлолитические ферменты комплекса и изучить их свойства.

• Выявить ключевые тополитические целлюлазы С. Шскпо'мгтг.

• Проанализировать свойства ферментных препаратов, полученных на основе штаммов С 1искпоч>етг с увеличенной гомологичной экспрессией целлюлаз, обладающих наибольшей тополитической активностью.

Научная новизна.

В ходе работы были - впервые выделены целлюлазы ферментного комплекса С Шскпо'мгтг: шесть эндоглюканаз (ЭГ 25 кДа р/4,0; ЭГ 28 кДа р/ 5,7; ЭГ 44 кДа р/ 6,0; ЭГ 47 кДа р/ 5,7; ЭГ 51 кДа р/ 4,8; ЭГ 60 кДа р/ 3,8) и три целлобиогидролазы (ЦБГ1 65 кДа р/ 4,4; ЦБГ1 52 кДа р/ 4,4; ЦБГ II 43 кДа р/ 4,2) и изучены их свойства. Для некоторых из выделенных целлюлаз была установлена их принадлежность к известным семьям гликозид-гидролаз: Се16А (ЦБГ II), Се17А (ЦБГ I), Се112А (ЭГ 11128 кДа), Се145А (ЭГ V 25 кДа). Показано, что ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа представляют собой две формы одного фермент.

Предложены теоретические модели вторичной и третичной структур ЭГ 25 кДа и ЭГ 28 кДа. С помощью методики хроматографического аналитического фракционирования показано увеличение уровня биосинтеза ЭГ 25 кДа и ЭГ 28 кДа в штаммах С. Шскпо'мгтг Eg3#la и Eg5#27 с увеличенной экспрессией генов Се145А и Се112А, соответственно.

Практическая значимость работы. Разработан хроматографический экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов, полученных на основе мутаптных штаммов С. Шскпо'мгтг. Метод включает двухстадийное хроматографическое фракционирование, анализируемого препарата, определение ферментативных активностей полученных фракций по отношению к широкому кругу природных и синтетических субстратов, а также аналитический гель-электрофорез и изоэлектрофокусирование фракций. По разработанной схеме проанализирован ряд ферментных препаратов, полученных- с помощью различных штаммов С. Шскпо'метг. Предложена оптимальная схема препаративного выделения целлюлаз С. lucknowense.

Показана высокая активность и стабильность целлюлаз С. lucknowense в нейтральной области рН, что имеет важное значение при применении данных ферментов в различных биотехнологических процессах. Установлено, что наибольшей тополитической активностью обладает ЭГ 25 кДа (ЭГ V). Ферментные препараты, изученные с помощью С. lucknowense с увеличенной экспрессией гена ЭГ 25 кДа могут быть рекомендованы для применения в текстильной промышленности. У ЭГ 28 кДа (ЭГ III) обнаружен крайне высокий уровень р-глюканазной активности, что открывает возможности использовать препараты с повышенным содержанием ЭГ III для обработки субстратов, содержащих р-глюканы.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), "Биокатализ-2000" (Москва, 2000), "Биокатализ-2002" (Москва, 2002), "22 Fungal Genetics Conference", (Asilomar-2003, USA).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 206 ссылок. Работа изложена на 125 странице машинописного текста, содержит 40 рисунков и 12 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ 1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КОМПОНЕНТОВ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА

С lucknowense

1.1. Определение компонентного состава ферментного комплекса С lucknowense.

Для анализа состава ферментного комплекса была разработана методика хроматографического разделения, состоящая из двух стадий ионообменной хроматографии. Так как ферментные препараты С. lucknowense обладают заметной протеазной активностью при рН 7-10, при разработке схемы хроматографического разделения мы пытались избегать использования буферов с высоким значением рН.

На рис. 1 представлены результаты ДЦС-ПААГ-электрофореза и изоэлектрофокусирования препарата С. lucknowense CL1-09 #648.2.2, выбранного для оптимизации условий хроматографического разделения (препарат представлял собой УФ-концентрат культуральной жидкости штамма С. lucknowense UV18-25). Как видно из рисунка в секретируемом ферментном комплексе С. lucknowense преобладают белки с pi в кислой области, поэтому в качестве первой стадии была выбрана анионообменная хроматография при рН>6. Не связавшуюся при этих условиях фракцию подвергали катионообменной хроматографии.

Рисунок 1. ДЦС-ПААГ-электрофорез и изоэлекгрофокусирование ферментного препарата препарата CLI-09 #648.2.2, полученного с помощью штамма С lucknowense UV 18-25.

В результате оптимизации условий хроматографического разделения ферментного комплекса была предложена следующая схема. На первой стадии препарат в количестве 10 мг белка по Лоури подвергали разделению на анионообменной колонке HR 5/5 с носителем Source 15 Q (Pharmacia, Швеция), уравновешенной при рН 6,6 0,02 М Bis-Tris-HCl буфером, после чего не связавшуюся фракцию количественно наносили на колонку с катионообменным носителем Mono S HR 5/5, уравновешенную 0,05 М формиатным буфером, рН 3,7. В полученных после хроматографического разделения фракциях определяли активности по отношению к различным природным и синтетическим субстратам. Белковый состав фракций был проанализирован с помощью ДЦС-ПААГ-электрофореза и изоэлектрофокусирования.

Разделение несвязавшейся фракции на Mono S при рН 3,7 Разделение на Source 15 (}прирН6,6

0 >0 20 30 о 10 - 20 30 40

объем, мл

объем,мл

Рисунок 2. Хроматографическое разделение препарата CL1-09 #648.2.2, полученного с помощью штамма С. lucknowense UV 18-25.

б

В результате проведенного анализа были обнаружены 9 целлюлолитических ферментов (см. рис.2): 3 целлобиогидролазы (ЦБГ 43 кДа, ЦБГ 52 кДа, ЦБГ 65 кДа) и 6 эвдоглюканаз ( ЭГ 25 кДа, ЭГ 28 кДа, ЭГ 44 кДа, ЭГ 47 кДа, ЭГ 51 кДа, ЭГ 60 кДа). Следует отметить, что данный подход позволил только установить присутствие во фракции того или иного фермента, обладающего активностью по отношению к использованным для анализа фракций субстратам, предположить его pi и молекулярную массу. Подробное изучение свойств обнаруженных целлюлаз было осуществлено после их выделения в гомогенном виде. -

U. Анализ увеличения гомологичной экспрессии целлюлаз С lucknowense.

Ферментные препараты С. lucknowense продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажных тканей. В экспериментах с индивидуальными ферментами наилучший эффект при обработке джинсовой ткани показала эпдоглюканаза ЭГ 25 кДа (см. раздел 3.7). Нашими коллегами из TNO Nutrition and Food Reseach (Голландия) была увеличена экспрессия гена Се145А (ЭГ V), ответственного за синтез ЭГ 25 кДа. Был получен штамм С. lucknowense Eg5#27 с увеличенным числом копий гена Се145А под контролем эффективного промотора ЦБП (pcbhl). В ходе этих исследований в геноме С. lucknowense был также обнаружен ген эндоглюканазы из 12 семьи гликозид-гидролаз (Се112А, или ЭГ Ш). Было установлено, что ЭГ III соответствует ранее выделенной нами ЭГ 28 кДа. Был получен штамм С. lucknowense Eg3#la, имеющий увеличенное число копий гена CeИ2А, ответственного за биосинтез ЭГ 25 кДа под контролем промотора ЦБП (pcbhl).

На основе указанных штаммов были получены ферментные препараты с увеличенным содержанием соответствующих ферментов: препарат #836.6, представляющий собой культуральную жидкость штамма С. lucknowense Eg3#la с увеличенной экспрессией гена Се112А (ЭГ Ш) и препарат #837, представляющий собой культуральную жидкость штамма С. lucknowense Eg5#27 с увеличенной экспрессией гена Се145А (ЭГ V). Эти ферментные препараты были проанализированны по изложенной в предыдущем разделе методике. Кроме того, для сравнения, был проанализирован препарат #838, полученный на основе исходного штамма С. lucknowense UV18-25.

На рис. 3 представлены данные ДДС-ПААГ-электрофореза, на рис. 4 результаты хроматографического разделения исследуемых препаратов. На рис. 3 видно увеличение интенсивности полос соответствующих ЭГ 25 кДа и ЭГ 28 кДа, а на рис. 4 заметно увеличены площади и высота пиков соответствующих этим ферментам. Для оценки увеличения экспрессии эндоглюканаз ЭГ 25 кДа и ЭГ 28 кДа сравнивали общую активность соответствующих им белковых фракций по отношению к специфическим субстратам (КМЦ и р-глюкапу) в ферментных препаратах, полученных с помощью штаммов С. lucknowense: Eg3#la и Eg5#27. Данные отображены в таблице 1.

Для препарата С. 1искпоу*ете Eg5#27 (#837) наблюдали почти трехкратное увеличение общей КМЦ-азной и р-глюканазной активности фракции, содержащей ЭГ 25 кДа (ЭГ V) по сравнению с соответствующими фракциями препарата С. 1искпоу*ете UV 18-25 (#838). При анализе препарата С. 1искпоу*ете Eg3#la (#836.6) наблюдали более чем 10-кратное увеличение общей КМЦ-азной и р-глюканазной активности фракции, содержащей ЭГ 28 кДа.

Рисунок 3:

• 1 - штамм С. 1искпшеюе 1ГУ 18-25 (#648.2.2)

2 - штамм С. 1искпо\*еп5е ЦУ 18-25 (#838)'

3 - штамм С. ¡искпамеюе (#837) М ^ 4 - штамм С. ¡искпошпэе (#836.6)

Таблица 1. Общие активности фракций, соответствующих изучаемым эндоглюканазам, ед.

Штамм, препарат « и и <п т Й ы 00 г* и О § «л ГЧ &Г (О си л ЭГ 60 кДа

ОТ 18-25, #838 38,9 0,5 6,7 4,4- 5,0.

КМЦаза #837 24,9 0,8 203 3,6 6,6

#836.6 30,4 8,6 11,4 10,6 4,7

1 X з г 5 ЦУ 18-25, #838 52,0 3.1 4,6 4,6 7Л

Ее5#27, #837 23,0 3,2 123 4,6 5,6

<а EgЗ#la, #836.6 42,0 303 6,0 6,2 7,0

Рисунок 4. Хроматограммы аналитического разделения препаратов штаммов С. lucknowense: А) #838 (штамм UV18-25), Б) #837 (штамм Eg5#27), В) #836.6 (штамм Eg3#la).

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО

КОМПЛЕКСА.

Для препаративного выделения ферме1ггов целлюлазного комплекса С. 1искпон:еже на первой стадии хроматографического разделения использовали анионообменную хроматографию при тех же условиях что и при определении компонентного состава комплекса, но с использованием колонок большего объема. В результате удалось достичь удовлетворительного разделения ферментов комплекса, что позволило выделить из полученных белковых фракций гомогенные целлюлазы, в большинстве случаев используя одну или две дополнительные стадии. Схема препаративного выделения целлюлаз С. 1искпон:еже приведена на рис. 6. Данные ДЦС-ПААГ-электрофореза и ИЭФ, характеризующие выделенные ферменты представлена на рис. 5.

12 М 3 4 М 5 6 7 8

123М4567М 8 М ¿4

т*

' М «И

205 ¿-~205

116 116

_ 66 4ММГ 66

к» 45

45 ~ 36

36 т»29

,29 «и

•. 24

8.9

8.6 -

«Л —

«V

4.2 Wi*.

М 20 20

А) Б)

Рисунок 5. А) ДДС-ПААГ-электрофорез выделенных ферментов: 1 - ЭГ 44 кДа, 2 - ЭГ 51 кЦа, 3 -ЦБГП 43 кДа, 4-ЭГ 25 кДа(ЭГ V), 5 - ЦБГ 165 кДа, 6 - ЭГ 47 кДА, 7-ЭГ 60 кДа, 8-ЭГ 28 кДа (ЭГ П1). Б) Изоэлектрофокусироваиие: 1 - ЭГ 44 кДа, 2 - ЭГ 51 кДа, 3 - ЭГ 47 кДа, 4 - ЭГ 60 кДа, 5 -ЭГ 25 кДа (ЭГ V), 6 - ЭГ 28 кДа (ЭГ III), 7-ЦБГII43 кДа, 8 -ЦБГ 165 кДа.

3. СВОЙСТВА ЭНДОГЛЮКАНАЗ С lucknowense. 3.1. Субстратная специфичность и классификация целлюлаз комплекса.

Для выделенных целлюлаз были определены удельные активности по отношению к ряду

полисахаридных субстратов, а также по отношению к синтетическим хромогенным производным

целлобиозы и лактозы: пНФ-Целл и пНФ-Лак. Данные представлены в таблице 2.

Согласно современным представлениям о классификации целлюлаз, для эндоглюканаз

характерна высокая активность отношению к КМЦ (определенная как с помощью

визкозиметрического метода, так и по выходу ВС) и ß-ГЛЮКану. Для целлобиогидролаз

характерны высокая активность по микрокристаллической целлюлозе (МКЦ) и низкая

активность при действии на КМЦ. Кроме того известно, что целлобиогидролазы из 7 семьи

гликозид-гидролаз обладают активностью по отношению к пНФ-Целл и пНФ-Лак.

10

Препарат CL1-09 #648.2.2 штамм С lucknowense UV18-25

I

SourcelSQ, рН 6,6,20 мМ Bis-Tris-HCI

Фр.1

/ \

Source 15Q Mono Q MonoP

рН 7,6, 20mM pH 7,1,20 мМ PB 74, имидазол-HCl имидазол-HCl рН 6,5-5,0

Mono P

PB 96 pH 7,6-6,0

Фр.2 Фр. 3 Фр. 4 Фр. 5

MonoQ MonoP Superose 12

рН 5,5,25 мМ PB 74, рН 5,0

риперазин-НО рН 5,0-3,5

МопоР PB 74, рН 5,0-3,5

Фр. б

Фр. 7

\

lu p Mono Р

РВ74рН5,5^,0 PB 74, рН 4,0-3,5

ЭГ44кДа ЭГ 28 кДа ЭГ51кДа ЦБГН43кДа ЭГ25кДа ЦБГ152кДа ЦБГ165кДа ЭГ47кДа ЭГбОкДа р!6,0 р! 5,7 р! 4,8 pi 4,2 р! 4,0 р!4,4 р!4,4 р!5,7 р!3,8

Рисунок 6. Схема препаративного выделения и очистки эндоглюканаз и целлобиогидролаз С. lucknowense.

Таблица 2. Удельная активность выделенных целлюлаз по отношению к разным субстратам (ед/мг).

Фермент КМЦ (ВС) КМЦ (визкозим) я я Ё А. МКЦ (Авицел) Ксилоглюкан 1 Ламинарии Ксилан § X Я Я а а Арабинан Галактан пНФ-Лакт © "с

ЭГ Ш 28 кДа 11 19 125 0,02 15,6 0 0,2 0 0 0 0 0

ЭГ V 23 кДа 17 20 5,3 0,055 1,9 0 0 0,13 0 0,01 0 0

ЭГ44кДа 59 39 74 0,064 0 0,13 0,07 и. 0 0 0 0

ЭГ 47 кДа 14 6 18 0,072 0 0 0,08 0 0 0,1 0 0

ЭГ51 кДа 52 46 75 0,19 0 0,1 0,18 1,11 0 0 0 0

ЭГбОкДа 12 4,9 18 0,075 0 0 0 0 0 0 0,27 0,12

ЦБГ165 кДа 0,7 0,01 и.о. 0,19 0 0 0 0 0 0 0,06 0,02

ЦБГ132 кДа 0,6 0,01 и.о. 0,11 0 0 0 0 0 0 0,09 0,03

ЦБГ II43 кДа 1.1 0,63 2,0 0,079 0 0 1,4 0 0 0 0 0

ЭГ 28 кДа обладала наименьшей КМЦ-азной активностью среди выделенных эндоглкжаназ (11 ед/мг), однако для нее была характерна рекордно высокая удельная активность по отношению к Р-глюкану (125 ед/мг). Так как Р-глюкан представляет собой линейный полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, соединенных Р-1,4- и Р-1,3-связями, данный фермент мог бы быть классифицирован как р-(1,3;1,4)-глюканаза. Однако, поскольку у ЭГ 28кДА полностью отсутствовала активность по ламинарину (Р-1,3-глюкану), очевидно, что данный фермент строго специфичен к Р-1,4-связям. Окончательно отнести фермент к эвдо-1,4-Р-глкжаназам (КФ 3.2.1.4) позволил анализ первичной структуры (см. Раздел 4.1). Набор специфических активностей остальных изученных эндоглюканаз, а именно высокие КМЦ-азная и активность, а также способность эффективно снижать вязкость КМЦ, позволили отнести их к эндо-1,4-р-глюканазам (КФ 3.2.1.4).

Ферменты с молекулярными массами 65 кДа и 52 кДа обладали высокой активностью по отношению к МКЦ, при этом проявляли низкую КМЦ-азную активность (по ВС) и крайне низкую визкозиметрическую активность (таблица. 2). Такое соотношение активностей позволяет однозначно классифицировать ферменты как экзо-целлобиогидралазы (КФ 3,2.1.91). Кроме того, ферменты проявляли активность по отношению к низкомолекулярным синтетическим субстратам: пНФ-Целл и пНФ-Лак, что характерно для ферментов из 7 семьи гликозил-гидролаз. Фермент с молекулярной массой 43 кДа проявлял невысокую активность по отношению к КМЦ и

что не позволило отнести его к эндоглюканазам, при этом фермент проявлял

12

умеренную активность по отношению к МКЦ и был не активен по отношению к низкомолекулярным синтетическим субстратам. Таким образом, субстратная специфичность не позволяла однозначно классифицировать выделенный фермент. Только после секвенирования гена, кодирующего данный белок, осуществленного в ТМО (Голландия), исходя из анализа гомологии с другими известными целлюлазами, фермент является целлобиогидролазой II и относится к 6 семье гликозил-гидролаз (КФ 3.2.1.91). Было установлено, что ЦБГ II С. 1ыскпон>ете проявляла сравнительно низкую активность по отношению к МКЦ по причине отсутствия в гене участка, кодирующего целлюлозосвязывающий домен (ЦСД). Отсутствие активности по отношению к пНФ-Целл и пНФ-Лак характерно для целлобиогидролаз 6 семьи.

ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа обладали высокой активностью по отношению к КМЦ и р-глюкану. Выделенные из препарата С. 1искпон:ете ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа имели удельную КМЦ-азную активность 59 и 52 ед/мг, что является признаком крайне активных эндоглкжаназ. Следует отметить, что ЭГ 51 кДа отличается от ЭГ 44 кДа высокой, сравнимой с ЦБГ 65 кДа, активностью по отношению к МКЦ, что косвенно указывает на наличие в ее структуре ЦСД.

По сравнению с другими выделенными эндоглюканазами, для ЭГ 25 кДа и ЭГ 28 кДа характерно более высокое отношение активности при гидролизе КМЦ, детектируемой вискозиметрическим методом, к КМЦ-азной активности, определяемой по образованию ВС. Это свидетельствует об их мало упорядоченном типе действия на полимерный субстрат. Следует отметить способность ЭГ 25 кДа и ЭГ 28 кДа гидролизовать ксилоглюкан (Р-1,4-глюкан, содержащий в качестве заместителей в боковой цепи остатки ксилозы), причем для ЭГ 28 кДа характерна достаточно высокая ксилоглюканазная активность - 15,6 ед/мг белка. Данное свойство относительно редко встречается среди грибных эндоглкжаназ.

Эндоглюканазы ЭГ 47 кДа и ЭГ 60 кДа обладали типичными для грибных эндоглюканаз набором ферментативных активностей. Ативность по отношению к р-глюкану одинакова для обоих ферментов и составляет 18 ед/мг, активность по КМЦ чуть ниже и составляет 14 и 12 ед/мг, и активность по отношению к МКЦ 0,072 и 0,075 ед/мг, соответственно. Для обоих ферментов характерно отсутствие ксилоглкжаназной активности.

Необходимо отметить, что ЭГ 51 кДа является не только наиболее активной, но и мажорной эндоглюканазой ферментного комплекса С. 1искпон:еже (таблицы 2 и 3). Содержание фермента в препарате #648.2.2 вместе с ЭГ 44 кДа, являющейся по нашему предположению каталитическим доменом ЭГ 51 кДа, составляет 6-7 %, что сравнимо с содержанием другой мажорной эндоглюканазы - ЭГ 47 кДа. При этом активность ЭГ 51 кДа в четыре раза выше, чем активность ЭГ 47 кДа.

Таблица 3. Свойства целлюлаз С. lucknowense.

Фермент i s X X X s s КМЦ ß-Глюкан

3 8 В § 2 5 я I ^ о «гу Ii *s s о СП ь pH 5,0 50 "С pH 5,0 50 °С

ч * S «л с Z Ö !# 1 о 5 2 'S. Я й • If* rr 4 1Л я ii s £ g J J 'о J

ЭГ Ш 28 кДа 12 28 5,7 2 22 но. Ii 19 0,12 64

ЭГ V 25 кДа 45 25 4,0 2 20 и.о. 5,4 15 3,0 3,8

ЭГ44 кДа н.о. 44 6,0 0,6 10 и.о. и 54 1,14 76

ЭГ 47 кДа и.о. 47 5.7 7 29 0,003 6,8 27 0,46 16

ЭГ51 кДа и.о. 51 4,8 6 98 0,22 2,4 54 1,8 84

ЭГбОкДа н.о. 60 3,8 1 14 0 4,6 22 0,17 18

ЦБГ 152 кДа 7 52 4,4 5-15' 93 0,072 И.о. и.о. н.о. н.о.

ЦБГ165 кДа 7 65 4,4 5-15- 99 0,74 И.о. H.O. и.о. н.о.

ЦБГ И 43 кДа 6 43 42 2 32 н.о. Н.о. и.о. H.O. H.O.

* Соотношение двух форм ЦБГ I варьируется в зависимости от препарата и, по-видимому, зависит от условий ферментации и приготовления препарата. Суммарное содержание обоих форм составляет 20%. " ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом ЭГ 51 кДа (подробно данные обсуждаются в разделе 3.2).

3.2. Масс-спектрометричесюш анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа..

В ходе изучения свойств выделенных эндоглюканаз было сделано предположение о том, что ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом полноразмерной ЭГ 51 кДа без ЦСД. Ферменты проявляли очень похожие свойства при гидролизе растворимых субстратов (удельные активности и, кинетические параметры, состав низкомолекулярных продуктов, гидролиза полисахаридных субстратов рН-профили активности) и отличались только степенью адсорбции и активностью при гидролизе МКЦ (подробнее эти данные обсуждаются ниже). Для подтверждения данной гипотезы была проведена обработка белковых полос гелей после ДДС-ПААГ-электрофореза, соответствующих. ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа, трипсином с последующей экстракцией смеси пептидов из геля и их анализом методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (эти эксперименты проводились в отделе протеомных исследований НИИ Биомедицинской химии РАМН). Анализ полученных масс-спектров с помощью программы MASCOT (http://www.matrixscience.com) в базе данных NCBI (США) не выявил какой-либо идентичности полученых пептидов фрагментам трипсиновой деструкции известных ферментов из других источников. Однако полученные данные позволили однозначно установить, что ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа представляют собой две формы одного фермента, так как масс-спектры трипсиновых гидролизатов данных ферментов оказались практически идентичными. Молекулярные массы мажорных пептидов из обоих ферментов полностью совпадали (пептиды с m/z: 980,5, 1029,6, 1304,7, 1415,7, 1533,8, 1839,0, 2355,0,2367,0,2560,0 и 3284,1).

3 J. Влияние рН и температуры на активность эндоглюканаз.

С. 1ыскпон>еже был обнаружен в ходе поиска продуцентов нейтральных целлюлаз. Высокая активность при нейтр&тьных и щелочных значениях рН не является свойством, типичным для грибных целлюлаз, однако оно имеет важное значение в случае применения ферментов в некоторых биотехнологических процессах, в частности, при ферментативной обработке хлопчатобумажных тканей, а также при использовании целлюлаз в качестве добавок к моющим средствам.

Таким образом, важно было понять, какие именно ферменты ответственны за общую высокую целлюлазную активность ферментных препаратов С. 1искпон:ете в нейтральной и щелочной среде. Зависимости активности очищенных эндоглюканаз и целлобиогидролаз от рН представлены на рис. 7. Все выделенные эндоглкжаназы проявляли максимальную активность при рН 4,5 - 6,0. При рН 7 все выделенные эндоглюканазы проявляли заметную активность (>50%). Два фермента (ЭГ 25 кДа и ЭГ 47 кДа) сохраняли высокую активность в слабощелочной среде - 66 % и 67 % при рН 8,0, соответственно.

Температурные оитимумы активности по отношению к КМЦ для всех исследованных в работе эндоглюканаз лежали в диапазоне 60-70°С. Полученные температурные зависимости представлены на рис. 7. ЭГ 25 кДа, ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа характеризуются относительно «узкими» зависимостями активности от температуры, а оптимумы активности лежат существенно выше 50°С. Таким образом, стандартная КМЦ-азная активность, измеренная при температуре 50°С (таблица 2), составляет для этих ферментов, соответственно, всего 55%, 35% и 31% от максимальной активности. ЭГ 28 кДа, ЭГ 47 кДа и ЭГ 60 кДа, напротив, проявляют высокую активность в существенно более широком диапазоне температур. При температуре 50° С все три фермента проявляют свыше 80% активности.

Следует отметить, что зависимости активности ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа от темепературы были идентичны. Для этих ферментов получены похожие рН-профили.

Особое внимание следует обратить на температурную зависимость активности ЭГ 28 кДа. Фермент сохраняет свыше 50% активности при температуре 30°С, в то время как все остальные целлюлазы комплекса проявляют не более 25% активности в таких условиях. Высокая активность при умеренных температурах имеет большое значение в некоторых биотехнологических процессах.

Исследование термостабильности ферментов показало, что все выделенные эндоглюканазы обладают высокой стабильностью при 50°С и значениях рН 5,0 и 7,0 (таблица 4). При указанных условиях ферменты сохраняли более 90% активности в течение 5 часов, за исключением ЭГ 28 кДа и ЭГ 47 кДа. ЭГ 28 кДа была стабильна при рН 5,0, однако при рН 7,0 фермент терял 25% активности через 5 часов инкубации. Наименее термостабильным ферментом оказалась ЭГ 47 кДа. В течение 5 часов инкубации при рН 5,0 и рН 7,0 фермент терял 40% и 20 % активности соответственно. Следует обратить внимание на то, что данный фермент был более стабилен при рН 7,0, в то время как большинство грибных целлюлаз, в том числе и все остальные целлюлазы комплекса С. 1ыскпон>ете, обладали более высокой термостабильностью в слабокислой области, чем при нейтральном значении рН.

Таблица 4. Стабильность эндоглюканаз при инкубаци при 50°С.

Время ЭГ44 кДа ЭГ51 кДа ЭГ28 кДа ЭГ 25 кДа ЭГ47 кДа ЭГбОкДа

нкубаци, мин

рН5,0 рН7,0 РН5,0 рН7,0 рН 5,0 рН 7,0 рН 5,0 рН 7,0 рН 5,0 рН 7,0 рН 5.0 рН7,0

0 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100%

75 97% 95% 98% 97% 96% 91% 98% 100% 79% 97% 96% 96%

150 94% 92% 97% 95% 95% 85% 97% 100% 77% 89% 94% 94%

225 92% 90% 95% 94% 93% 76% 96% 98% 67% 82% 87% 85%

300 91% 88% 93% 93% 92% 74% 95% 96% 58% 77% 80% 77%

3.4. Кинетические параметры действия выделенных эндоглюканаз.

Кинетические параметры (Кт И VmK) действия эндоглюканаз были определены из зависимостей начальных скоростей реакций гидролиза КМЦ и р-ГЛЮКана (при 50°С и оптимальных значениях рН) от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Бсрка. С учетом концентрации белка в реакционной смеси и молекулярных масс ферментов из значений были рассчитаны каталитические константы Найденные значения кинетических

параметров приведены в таблице 2. Из-за невозможности определить молекулярную массу субстрата Кт выражали в г/л. ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа характеризовались наименьшими значениями Кт и наиболее высокими k«t (по обоим субстратам) по сравнению с остальными ферментами. Важно отметить, что для обеих эндоглюканаз были получены близкие значения кси, при этом Кт для ЭГ 51 кДа была несколько больше. Для ЭГ 28 кДа Кщ по (5-ГЛЮКану была меньше Кт но КМЦ на два десятичных порядка, при этом kot по Р-ГЛЮКану была более чем в три раза выше. Полученные кинетические параметры объясняют причину крайне высокой р-ГЛЮКаназИОЙ активности ЭГ 28 кДа.

Для ЭГ 47 кДа и ЭГ 60 кДа получены высокие значения Кт по КМЦ, при этом Кт по р-глкжану были на порядок меньше. КМЦ является синтетическим субстратом, в среднем на каждые 10 остатков глюкозы приходится одна карбоксиметилъная группа, которая, по-видимому, препятствует эффективному связыванию субстрата в активном центре данных эндоглюканаз.

3.5. Состав низкомолекулярпых продуктов при исчерпывающем гидролизе Р-глюкапа.

С помощью ВЭЖХ на колонке с привитой аминофазой был определен состав низкомолекулярных продуктов при исчерпывающем гидролизе кана очищенными эндоглюкана-зами. Полученные хроматограммы представлены на рис. 8. Как видно из сравнения со стандартом (глюкоза, целлобиоза и мальто-олигосахариды), в качестве низкомолекулярных продуктов гидролиза образовывались олигосахариды со степенью полимеризации от 2 до 4, а также глюкоза. Полученные хроматограммы можно разделить на

Ржуиок&Хроматограммыпрсщук^

под действием эчаоглюканаз С lucknowense. В качестве стандартов

использованы ппскоза, ирллобисва, мальтотркиа и мальтагепрасва.

два типа. В одном случае среди продуктов гидролиза преобладает дисахарид и практически отсутствует трисахарид, в другом основными продуктами являются ди- и трисахарид, причем трисахарид преобладает. Так, главными продуктами действия ЭГ 44 кДа, ЭГ 51 кДа, ЭГ 28 кДа и ЭГ 47 кДа являлись ди- и трисахариды, при этом также в заметном количестве образовывался тетрасахарид и относительно мало образовывалось глюкозы. ЭГ 25 кДа и ЭГ 60 кДа образовывали смесь глюкозы с дисахаридом и тетрасахаридом. При этом среди продуктов практически полностью отсутствовал трисахарид. Данную закономерность можно объяснить различием строения активных центров эндоглюканаз, а именно разным количеством субсайтов связывания субстрата на входе и на выходе в активные центры ферментов.

З.б. Адсорбционная способность целлюлоз. Действие ферментов на МКЦ.

Адсорбционную способность ферментов оценивали, определяя количество фермента, связавшегося с микрокристаллической целлюлозой при избытке субстрата (4 мг фермента на 1 г носителя). Из всех эндоглюканаз только ЭГ 51 кДа характеризовались высокой адсорбционной способностью на МКЦ - степень адсорбции белка составила 98%, для остальных эндоглюканаз степень адсорбции не превышала 30% (таблица 2). Эти данные позволяют предположить, что у ЭГ 51 кДа в структуре белка имеется целлюлозосвязывающий домен. Отсутствие ЦСД у ЭГ 28 кДа и ЭГ 25 кДа было подтверждено анализом структуры генов, кодирующих их синтез (см. раздел 4). Для хорошо адсорбирующихся ферментов была определена константа распределения Кр (таблица 2). Для ЭГ 51 кДа Кр составила 0,22 л/г.

Для сравнения осахарива-ющей способности очищенных эндоглюканаз и целлобиогидролаз проводили ими гидролиз МКЦ (рис. 9). При этом.кон-центрация всех целлюлаз в реакционной смеси была одинакова (0,1 мг/мл по белку). Эксперимент про-водили при 40°С, рН 5,0, начальная концентрация МКЦ - 5 г/л. Гидролиз МКЦ проводили в присутствии избытка высоко-

очищенной целлобиазы (из Азрег£;Шш]аротсш) для того, чтобы конвертировать образующуюся целлобиозу и целлоолигосахариды с более высокой степенью полимеризации в глюкозу (которую определяли глюкозооксидазно-пероксидазным методом). Наиболее высокую эффективность при гидролизе МКЦ проявила ЦБГ165 кДа, для которой концентрация глюкозы через 7 суток реакции составила 2,5 г/л (степень конверсии МКЦ 45%). Меньшей осахаривающей способностью характеризовались ЭГ 51 кДа, ЦБГ II и ЭГ 60 кДа (степень конверсии МКЦ -1923%). Эндоглюканазы с молекулярной массой 44, 28, 25 и 47 кДа проявили крайне низкую осахаривающую способность (степень конверсии МКЦ не превышала 12%). Невысокая для целлобиогидролаз эффективность действия ЦБГ П объясняется отсутствием в структуре фермента ЦСД. Из эндоглюканаз наиболее высокой осахаривающей способностью обладали ЭГ 51 кДа и ЭГ 60 кДа. Эндоглюканаза Eg51 кДа имеет ЦСД, что объясняет ее относительно высокую осахаривающую способность. ЭГ 60 кДа обладает низкой адсорбционной способностью и, по-видимому, не имеет ЦСД, поэтому относительно высокая осахаривающая способность является неожиданной (этот факт требует дальнейшего исследования).

3.7. Тополитические свойства ферментов.

Тополитическая активность отражает способность целлюлаз к "мягкому" действию па поверхность субстрата без глубокой деструкции целлюлозной матрицы. Результатом этого является, например, удаление ферментом красителя, микроворсинок, загрязнений с поверхности целлюлозы или целлюлозной ткани. Тополитическую активность фермента можно охарактеризовать по эффективности удаления красителя с поверхности джинсовой ткани (депигаентирующая способность, или абразивность). Эксперименты по изучению депигменти-рующей способности целлюлаз С. ¡ыскпо^/ете проводили, нормируя ферменты по активности по отношению к КМЦ (КМЦ-азная активность эндоглюканаз в реакционной смеси составляла 2 ед/мл). Так как С. ¡ыскпо^/ете представляет интерес как источник нейтральных целлюлаз, депигментирующую способность эндоглюканаз определяли не только при рН 5,0 но и при рН 7,0 (50°С, время обработки 60 мин). Депигментирующую способность (абразивность) выражали в условных единицах, соответствующих интенсивности синего цвета на цветовой гистограмме изображения, полученного после сканирования образца джинсовой ткани, обработанной ферментом. Полученные данные представлены на рис. 10.

Среди изученных целлюлаз наибольшей тополитической активностью обладала ЭГ 25 кДа. Фермент показывал одинаковую абразивность как при рН 5,0 так и при рН 7,0. Важно отметить, что ЭГ 28 кДа и ЭГ 47 кДа демонстрировали более высокую депигментирующую способность при рН 7,0. Как уже отмечалось выше, нашими коллегами из фирмы TNO (Голландия) были получены штаммы С. ¡ыскпо^/ете Eg3#la с увеличенной экспрессией генов ЭГ Ш28 кДа, С. ¡ыскпо-п/ете Eg5#27 с увеличенной экспрессией гена ЭГ V 25 кДа. Была изучена

депигментирующая способность ферментных препаратов #836.6 и #837, полученных на основе указных штаммов, а так же, для сравнения, препарат #838, полученный на основе штамма С. 1ыскпон>ете ЦУ 18-25. Из полученных данных видно, что увеличение экспрессии ЭГ 25 кДа привело к увеличению депигментирующей способности препаратов С. 1ыскпон:ете, особенно в нейтральных условиях.

Рисунок 10. Депигментирующая способность (абразивность) эндоглюканаз и ферментных препаратов мутантных штаммов С. 1ыскпон:ете.

3.8. Изучение влияния целлюлаз С Ыскпоювшв на ресорбцию индиго.

При ферментативной обработке джинсовой ткани серьезную проблему представляет ресорбция индиго на белых нитях ткани, что ухудшает потребительские свойства джинсовых изделий. Эксперименты по изучению ресорбции индиго на поверхности ткани проводили по разработанному ранее в нашей лаборатории методу с использованием образцов белой хлопчатобумажной ткани. Для каждого фермента определяли индекс ресорбции индиго (ИРИ), соответствующий интенсивности окраски ткани красителем в присутствии данного фермента (концентрация белка 0,05 мг/мл, 50°С, рН 5,0, 30 мин). В качестве контроля использовали ферментный препарат ТпсИоёегта гееяег (АСЕ 210.27), дающий высокий ИРИ. Полученные данные представлены на рис. 10. Чем ниже ИРИ фермента (ферментного препарата), тем более

30

I

ш

высокое потребительское качество ткани может быть получено при обработке данным ферментом.

Для ЭГ 25 кДа, показавшей высокую тополитическую активность, был характерен достаточно низкий ИРИ. То же можно сказать о ЭГ 60 кДа, ЦБГ152 кДа, ЭГ 28 кДа, ЭГ 44 кДа. Наибольшими ИРИ обладали ЭГ 51 кДа, ЭГ 47 кДа и ЦБГ I 65 кДа. Необходимо отметить, что все три фермента являются мажорными белками комплекса и таким образом должны оказывать влияние на ИРИ ферментного препарата С. Шскпо'мгтг.

4. МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ ЭГ 111И ЭГ V С. lucknowense. 4.1 Аминокислотные последовательности ЭГ III и ЭГ V С lucknowense

Нашими коллегами из TNO (Голландия) были секвенированы гены, кодирующие синтез

ЭГ V 25 кДа (Се145А) и ЭГ Ш 28 кДа (Се112А). На основании полученной генетической

информации нами была расчитана аминокислотная последовательность обоих белков.

Полученные аминокислотные последовательность были проанализированы с помощью

программы SignalP, входящей в состав пакета программ ExPAZy Proteomics tools Швейцарского

Института Биоинформатики. ЭГ V 25 кДа состоит из 207 а.о., наиболее вероятный сайт

посттрансляционного протеолитического отщепления сигнального пептида: ala-QL.

21

lsattgflalpalala 1 QLSGSGQTTRYWDCCKPSCAWPGKGPSSPVQACDKNDNPLNDGGSTRSGC 50 51 DAGGSAYMCSSQSPWAVSDELSYGWAAVKLAGSSESQWCCACYELTFTSG 100 101 PVAGKKMIVQATNTGGDLGDNHFDLAIPGGGVGIFNACTDQYGAPPNGWG 150 151 DRYGGIHSKEECESFPEALKPGCNWRFDWFQNADNPSVTFQEVACPSELT 200 201 SKSGCSR 207

Рисунок. 12. Аминокислотная последовательность ЭГ 25 кДа (ЭГ V) С. lucknowense, курсивом отмечена последовательность сигнального пептида.

ЭГ Ш 28' кДа состоит из 223 а.о., наиболее вероятный сайт постгрансляционного протеолитичсского отщеплеггая сигнального пептида: dkr-QQ

mqpflllflssvtaaspltaldkr 1 QQATLCEQYGYWSGNGYEVNNNNWGKDSASGGHQCTYVDSSSSSGVAWHT 50 51 TWQWEGGQNQVKSFANCGLQVPKGRTISSISNLQTSISWSYSNTNIRANV 100 101 AYDLFTAADPNHATSSGDYELMIWLARFGDVYPXGSSQGHVNVAGQDWEL 150 151 WTGFNGNMRVYSFVAPSPRNSFSANVKDFFNYLQSNQGFPASSQYLLIFQ 200 201 AGTEPFTGGETTLTVNNYSARVA 223

Рясуиок 13. Аминокислотная последовательность ЭГ 28 кДа (ЭГ Ш) С. lucknowense, курсивом отмечена последовательность сигнального пептида.

С помощью программы BLAST2 мы провели сравнение полученных аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями, имеющимися в базе данных Swiss-Prot Для последовательности ЭГ V 25 кДа была выявлена гомология с большим количеством эндоглюканаз из 45 семьи гликозил-гидролаз (в ряде случаев степень гомологии достигала 82%). Поиск аминокислотных последовательностей, гомологичных последовательности ЭГ Ш 28 кДа выявил большое количество гомологичных эндоглюканаз из 12 семьи гликозид-гидролаз. Степень гомологии найденных ферментов с эндоглюканазой Ш 28 кДа С. lucknowense составляла 56%-59%. Гомологии с эндоглюканазами других семей не было обнаружено.

4.2. Моделирование вторичной и третичной структур ЭГ III и ЭГ V С lucknowense.

В последнее время,, благодаря современным методам компьютерного моделирования, стало возможным построение моделей вторичной и третичной структур белков, основываясь на их аминокислотной последовательности. Моделирование осуществляется по аналогии с известными структурами гомологичных белков, определенными экспериментально. Мы воспользовались программой Swiss-Model (http://www.expazy.org/swissmod/SWISS-MODEL.btml), чтобы получить на основе аминокислотных последовательностей ЭГ III 28 кДа и ЭГ V 25 кДа

модели их третичных структур. В качестве шаблонов для моделирования эндоглюканазы ЭГ III 28 кДа из С. Iucknowense были использованы известные третичные структуры ЭГ III из Т. reesei и A. niger, адля моделирования ЭГ 25 кДа были использована структура ЭГ V из Humicola insolens. Полученные трехмерные модельные структуры представлены на рис. 14. Потенциальная энергия полученных моделей, рассчитанная с помощью автоматизированного сайта Swiss-Model составила -4405 кДж/моль для ЭГ III28 кДа и -3096 кДж/моль для ЭГ V 25 кДа.

Анализ гомологии аминокислотных последовательностей ЭГ III28 кДа и ЭГ V 25 кДа С. Iucknowense с известными первичными структурами эндоглюканаз 12 и 45 семей гликозил-гидролаз позволили предположить какие аминокислотные остатки ЭГ III28 кДа и ЭГ V 25 кДа С. Iucknowense участвуют в катализе. Так, каталитическими остатками ЭГ Ш 28 кДа, согласно нашему предположению, являются Glu-120 и Glu-204 а каталитическими остатками ЭГ V 25 кДа являются Asp-13 и Asp-124. Данные аминокислотные остатки в моделях ЭГ III28 кДа и ЭГ V 25 кДа С. Iucknowense полностью совпадают с известными каталитическими остатками ЭГ III Т. reesei и ЭГ УН. insolens при наложении соответствующих трехмерных структур белков друг на друга. Отклонение Са-атомов не превышло 0,4 А. Также наблюдали удовлетворительное совпадение остатков, участвующих в связывании субстрата, в активных центрах указанных ферментов.

Рисунок 14. Модели третичной структуры ЭГ III 28 кДа (слева) и ЭГ V 25 кДа (справа) С. lucknowense. Показаны каталитические остатки в активных центрах ферментов.

выводы.

1. Разработан экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью гриба С lucknowense. Метод основан на двухстадийной ионообменной хроматографии. В составе ферментных препаратов С. lucknowense обнаружены шесть эндоглюканаз (25 кДа, р/ 4,0; 28 кДа, р/ 5,7; 44 кДа, р/ 6,0; 47 кДа, р/ 5,7; 51 кДа, р/ 4,8; 60 кДа, р/3,8) и три целлобиогидролазы (65 кДа, р/4,4; 52 кДа, р/4,4; 43 кДа, р/4,2).

2. Методом двухстадийной ионообменной хроматографии определен качественный и количественный состав ферментных препаратов, полученных с помощью разных штаммов С lucknowense. Показано трехкратное увеличение биосинтеза ЭГ V 25 кДа в препарате на основе штамма С. lucknowense Eg5#27 с увеличенной экспрессией гена ЭГ V, а также десятикратное увеличение биосинтеза ЭГ III28 кДа в препарате на основе штамма С. lucknowense Eg3#la с увеличенной экспрессией гена ЭГ Ш, по сравнению с препаратами на основе исходного штамма С. lucknowense UV18-25.

3. Разработана схема препаративного выделения гомогенных индивидуальных целлюлаз С. lucknowense. Изучены свойства очищенных целлюлаз - субстратная специфичность, температурные и рН-зависимости активности, термостабильность, адсорбционная способность на целлюлозе, кинетика глубокого гидролиза микрокристаллической целлюлозы, состав низкомолекулярных продуктов при исчерпывающем гидролизе Р-глюкана.

4. Показано, что ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа представлют собой две формы одного фермента. ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом полноразмерной ЭГ 51 кДа, лишенной ЦСД.

5. Для некоторых из выделенных целлюлаз установлена их принадлежность к известным семьям гликозид-гидролзз: Се16А (ЦБГП43 кДа), Се17А (ЦБП, две формы: 65 кДа и 52 кДа), Се112А (ЭГ III28 кДа), Се145А (ЭГ V 25 кДа).

6. Используя метод компьютерного моделирования, предложены модели трехмерных структур ЭГ Ш 28 кДа и ЭГ V 25 кДа. Основываясь на гомологии аминокислотных последовательностей ЭГ Ш 28-кДа и ЭГ V 25 кДа с известными последовательностями эндоглюканаз 12 и 45 семей гликозил-гидролаз, установлены каталитические аминокислотные остатки указанных ферментов: Glu-120 и Glu-204 (ЭГ III) и Asp-13 и Asp 124 (ЭГ V).

7. Проведено сравнение эффективности депигментации джинсовой ткани очищенными целлюлазами С. lucknowense в процессе депигментации джинсовой ткани (тополитической активности). Показано, что наиболее высокой индивидуальной тополитической активностью обладает ЭГ V 25 кДа. Продемонстрирована более высокая эффективность депигментации джинсовой ткани под действием ферментного препарата, полученного с помощью штамма С. lucknowense с увеличенной экспрессией гена ЭГ V 25 кДа по сравнению с препаратом, полученным на основании исходного штамма С. lucknowense UV 18-25.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Зоров И.Н., Устинов Б.Б., Бухтояров Ф.Е., Скомаровский А.А., Марков А.В., Синицына О.А., Гришутин С.Г., Синицын А.П. Оценка действия целлюлаз на полимерные растворимые субстраты по изменению молскулярно-массового распределения. Тезисы стендовых сообщений школы-конференции "Горизонты Фшико-Химической Биологии", 28 мая - 2 июня 2000, Пущино, с. 119.

2. Bukhtojarov F.E., Markov A.V., Skomarovsky A.A., Sinitsyna O.A., Sinitsyn A.P. The degradation. of arabinoxylan by xylanases and a-L-arabinofuranosidases, isolated from Trichoderma reesei and Penicillium canescens. Abstracts of International Conference 'Biocatatysis-2000: Fundamentals & Applications", June 10-15,2000, Moscow, Russia, p.77.

3. Bukhtojarov F.E., Ustinov B.B., Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. Purification and properties of alkaline pectate-lyase from Chrysosporium lucknowense "BIOCATALYSIS-2002", June 22-27, 2002, Moscow, p. 75.

4. Semenova M.V., Ustinov B.B., Grishutin S.G., Bukhtojarov F.E., Sinitsyna O.A. Fast Analysis of fungal multienzyme compositions using ion-exchange chromatography "BIOCATALYSIS-2002 ", June 22-27,2002, Moscow, p. 133.

5. Gusakov A.V., Salanovich T.N., Bukhtojarov F.E., Markov A.V., Ustinov B.B., C. van Zeijl, P. Punt, R. Burlingame, Sinitsyn A.P. Clonining of the Chrysosporium lucknowense CBH1 (ce!7A) gene and characterisation ofthe encoded enzyme, "22 Fungal Genetics Conference", March 1823,2003, Asilomar, California, USA, p. 89-90.

6. Бухтояров Ф. Е., Устинов Б. Б., Саланович Т. П., Антонов Л. И., Гусаков А. В., Синицын. А. П. Целлюлазный комплекс гриба Chrysosporium lucknowense: выделение и характеристика индивидуальных эндоглюканаз и целлобиогидролаз комплекса. Биохимия 2004, т 69, вып. 5, с. 666-677.

Принято к исполнению 30/03/2004 Исполнено 31/03/2004

Заказ № 111 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

р-7 36 6

Список сокращений.

Введение.

I. Литературный обзор.

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗА И р-ГЛЮКАНЫ.

ГЛАВА 2. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ И СВОЙСТВА ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ.

2.1. Классификация, субстратная специфичность и биохимические свойства целлюлаз.

2.2. Механизм действия целлюлаз

2.3. Доменная структура целлюлаз.

2.4. Современные представления о классификации гликозил-гидролаз.

ГЛАВА 3. ГРИБНЫЕ И БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ «НЕЙТРАЛЬНЫХ»

ЦЕЛЛЮЛАЗ.

ГЛАВА 4. ПРИМЕНЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛАЗ В ТЕКСТИЛЬНОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ.

II. Экспериментальная часть.

ГЛАВА 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1. Ферментные препараты.

5.2. Субстраты и реактивы.

5.3. Определение концентрации белка.

5.4. Хроматографическое разделение ферментов.

5.5. Определение биохимических характеристик индивидуальных ферментов, титрование белков ферментного комплекса.

5.6. Методы определения активности ферментов.

5.6.1. Определение активности по отношению к полисахаридным субстратам.

5.6.2. Определение активности по полисахаридным субстратам с помощью планшетного метода.

5.6.3. Определение активности по л-нитрофенильным производным Сахаров.

5.6.4. Определение активности по и-нитрофенильным производным Сахаров на планшете.

5.7. Изучение зависимостей активности ферментов от рН и температуры.

5.8. Изучение термостабильности ферментов.

5.9. Определение состава низкомолекулярных продуктов гидролиза полимерных субстратов.

5.10. Адсорбционная способность ферментов.

5.11. Изучение кинетики гидролиза хлопка и МКЦ.

5.12. Определение тополитической активности целлюлаз.

5.13. Оценка влияния целлюлаз на ресорбцию индиго.

5.14. Масс-спектрометрический анализ пептидов.

5.15. Методы компьютерного моделирования структуры белка.

III. Результаты и их обсуждение.

ГЛАВА 6. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА С. LUCKNOWENSE

6.1. Определение компонентного состава ферментного комплекса С. lucknowensе.

6.2. Анализ увеличения экспрессии мультикопированных ферментов.

ГЛАВА 7. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ

ЦЕЛЛЮЛАЗНОГО КОМПЛЕКСА С. LUCKNOWENSE

ГЛАВА 8. СВОЙСТВА ЭНДОГЛЮКАНАЗ С. LUCKNOWENSE

8.1. Субстратная специфичность и классификация целлюлаз.

8.2. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов ЭГ 44 кДа и ЭГ 51 кДа.

8.3. Основные биохимические свойства эндоглюканаз.

8.4. Кинетические параметры действия выделенных эндоглюканаз.

8.5. Состав низкомолекулярных продуктов при глубоком гидролизе р-глюкана.

8.6. Адсорбционная способность целлюлаз. Действие ферментов на МКЦ.

8.7. Тополитические свойства ферментов.

8.8. Изучение влияния целлюлаз С. lucknowense на ресорбцию индиго.

ГЛАВА 9. МОЛЕКУЛЯРНОЕ СТРОЕНИЕ ЭГIIIИ ЭГ V С. lucknowense.

9.1. Аминокислотные последовательности ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense.

9.2. Моделирование вторичной и третичной структур ЭГ III и ЭГ V С. lucknowense.

Выводы.

Целлюлолитические ферменты, осуществляющие биодеградацию целлюлозы, самого распространенного биополимера на Земле, занимают центральное место в круговороте органического углерода [1]. Основными микроорганизмами, продуцирующими целлюлазы, являются грибы - возбудители мягкой и бурой гнили, а также различные виды аэробных и анаэробных бактерий. История исследования целлюлаз насчитывает уже более 50 лет. В течение этого периода важнейшим свойством, характеризующим целлюлазный комплекс, считалась его способность к глубокой деструкции целлюлозосодержащих субстратов (так называемая «сахаролитическая» активность). Поэтому исследования, в основном, были направлены на поиск ферментных препаратов и их продуцентов, эффективно осуществляющих гидролиз целлюлозы до глюкозы. Целлюлазы, выделенные из этих препаратов, как правило, проявляли максимальную активность в кислой среде (рН 4-5) [2], но различались по субстратной специфичности, адсорбционной способности и термостабильности [3,4, 5].

Целлюлазы находят все более широкое применение в текстильной, целлюлозно-бумажной, пищевой и других отраслях промышленности [6]. В последнее время усилия щ исследователей направлены на поиск целлюлолитических ферментов, способных мягко воздействовать на поверхность целлюлозного субстрата, не приводя к глубокой деструкции целлюлозной матрицы (для обозначения этой способности целлюлаз мы предлагаем использовать термин «тополитическая» активность) [7, 8]. Обнаружение ферментов с тополитической активностью открыло новые возможности их применения: например, для депигментации джинсовых изделий с целью придания им более привлекательных потребительских свойств (альтернатива традиционным химическим способам «варки», а также обработке пемзой); для биополировки текстильных материалов с целью удаления микродефектов и ворса; как компонента моющих средств и т. д. [9, 10, И, 12]. Важно отметить, что замена известных химических способов обработки целлюлозных материалов на ферментативные приводит к проведению процесса в более мягких условиях и уменьшает ущерб, наносимый окружающей среде.

Следует подчеркнуть, что для упомянутых выше целей предпочтительны ферменты, сохраняющие высокую активность и стабильность в условиях проведения процесса - как правило, это нейтральные или щелочные значения рН и повышенная температура [11, 13]. В связи с этим наиболее перспективными для использования являются так называемые «нейтральные» целлюлазы, демонстрирующие высокую активность и стабильность при значениях рН, близких к нейтральным, (рН 6-8) и температурах 50°С и выше. Поэтому актуальными направлениями исследований в этой области становятся поиск новых штаммов-продуцентов «нейтральных» целлюлаз, получение мутантных штаммов при помощи методов классического мутагенеза или генной инженерии, а также выделение и исследование свойств ключевых тополитических ферментов.

В Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН был осуществлен скрининг продуцентов целлюлаз, высокоактивных и стабильных при нейтральных и щелочных значениях рН, в результате чего был найден мицелиальный гриб Chrysosporium lucknowense, целлюлазный комплекс которого ранее не исследовался. Гриб С. lucknowense, относящийся к классу аскомицетов, был выделен из щелочной почвы Дальнего Востока, и далее путем классического мутагенеза были получены мутантные штаммы, отличающиеся повышенным уровнем секреции целлюлаз и гемицеллюлаз. Ферментные препараты на основе данного продуцента продемонстрировали высокую эффективность при обработке хлопчатобумажной ткани [14]. Однако данные, касающиеся состава и особенностей функционирования ферментного комплекса С. lucknowense, а также сведения по ферментам, продуцируемым другими видами грибов рода Chrysosporium, практически отсутствуют в научной литературе.

Основной целью данной работы было выделение и изучение свойств ферментов целлюлазного комплекса, продуцируемого мутантным штаммом гриба С. lucknowense. В цели работы также входило выявление ключевых целлюлаз, отвечающих за высокую эффективность ферментных препаратов С. lucknowense при обработке хлопчатобумажной ткани с целью создания ферментных препаратов с улучшенными биотехнологическими характеристиками.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Определить компонентный состав ферментного комплекса С. lucknowense

• Выделить в гомогенном виде все целлюлазные ферменты комплекса и изучить их свойства.

• Выявить ключевые тополитические целлюлазы С. lucknowense.

• Получить и проанализировать свойства ферментных препаратов на основе штаммов С. lucknowense с мультикопированными генами собственных целлюлаз, обладающих наибольшей тополитической активностью.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Выводы.

Разработан экспресс-метод анализа компонентного состава ферментных препаратов, полученных с помощью гриба С. lucknowense. Метод основан на двухстадийной ионообменной хроматографии. В составе ферментных препаратов С. lucknowense обнаружены шесть эндоглюканаз (25 кДа, р/ 4,0; 28 кДа, р/ 5,7; 44 кДа, р/ 6,0; 47 кДа, р/5,7; 51 кДа, р/4,8; 60 кДа, р/3,8) и три целлобиогидролазы (65 кДа, р/4,4; 52 кДа, р/4,4; 43 кДа, р/4,2).

Методом двухстадийной ионообменной хроматографии определен качественный и количественный состав ферментных препаратов, полученных с помощью разных штаммов С. lucknowense. Показано трехкратное увеличение биосинтеза ЭГ V 25 кДа в препарате на основе штамма С. lucknowense Eg5#27 с увеличенной экспрессией гена ЭГ V, а также десятикратное увеличение биосинтеза ЭГ III 28 кДа в препарате на основе штамма С. lucknowense Eg3#la с увеличенной экспрессией гена ЭГ III, по сравнению с препаратами на основе исходного штамма С. lucknowense UV 18-25. Разработана схема препаративного выделения гомогенных индивидуальных целлюлаз С. lucknowense. Изучены свойства очищенных целлюлаз - субстратная специфичность, температурные и рН-зависимости активности, термостабильность, адсорбционная способность на целлюлозе, кинетика глубокого гидролиза микрокристаллической целлюлозы, состав низкомолекулярных продуктов при исчерпывающем гидролизе р-глюкана.

Показано, что ЭГ 51 кДа и ЭГ 44 кДа представлют собой две формы одного фермента. ЭГ 44 кДа является каталитическим доменом полноразмерной ЭГ 51 кДа, лишенной ЦСД.

Для некоторых из выделенных целлюлаз установлена их принадлежность к известным семьям гликозид-гидролаз: Се16А (ЦБГ II 43 кДа), Се17А (ЦБГ I, две формы: 65 кДа и 52 кДа), Се112А (ЭГ III28 кДа), Се145А (ЭГ V 25 кДа). Используя метод компьютерного моделирования, предложены модели трехмерных структур ЭГ III 28 кДа и ЭГ V 25 кДа. Основываясь на гомологии аминокислотных последовательностей ЭГ III 28 кДа и ЭГ V 25 кДа с известными последовательностями эндоглюканаз 12 и 45 семей гликозил-гидролаз, установлены каталитические аминокислотные остатки указанных ферментов: Glu-120 и Glu-204 (ЭГ III) и Asp-13 и Asp 124 (ЭГ V).

Проведено сравнение эффективности депигментации джинсовой ткани очищенными целлюлазами С. lucknowense в процессе депигментации джинсовой ткани (тополитической активности). Показано, что наиболее высокой

110 индивидуальной тополитической активностью обладает ЭГ V 25 кДа. Продемонстрирована более высокая эффективность депигментации джинсовой ткани под действием ферментного препарата, полученного с помощью штамма С. lucknowense с увеличенной экспрессией гена ЭГ V 25 кДа по сравнению с препаратом, полученным на основании исходного штамма С. lucknowense UV 18-25.

1. Рабинович МЛ., Мельник М.С., Болобова А.В. (2002) Прикл. биохим. микробиол., 38,355-373.

2. Клесов А.А. (1988) В кн. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы, т.12, ВИНИТИ, Москва, с.53-59.

3. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Чурилова И.В., Синицын А.П. и др. (1980) Ферментативный гидролиз целлюлозы П. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников. Биоорган, химия, 6, с. 1377-1395.

4. Клесов А.А., Черноглазое В.М., Рабинович М.Л., Синицын А.П. и др. (1982) Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации аморфной и кристаллической целлюлозы. Биоорган, химия, 8, с. 643-651

5. Рабинович М.Л., Черноглазое В.М., Клесов А.А. (1983) Изоферменты эндоглюканазы в целлюлазных комплексах: различное сродство к целлюлозе и неодинаковая роль в гидролазе нерастворимого субстрата. Биохимия, 48, с. 369379

6. Bhat М.К. (2000) Biotechnol. Adv., 18, 355-383.

7. Берлин А.Х., Тихомиров Д.Ф., Гутьеррес Б.Р., Попова Н.Н., Синицын А.П. (1998)

8. Оценка топоферментной активности целлюлаз и ксиланаз. Прикл. биохим. и микробиол., 34, с.382-387

9. Гусаков А.В., Синицын А.П. (1998) О механизме действия ферментов-целлюлаз на текстильные материалы: взгляд энзимологов. Текстильная химия, 2(14), с. 68-72

10. Tikhomorov, D.F., Baraznenok, V.A., Becker, E.G., Sinitsyn, A.P. (1996) Novel Enzymes and Technologies in Denim Wash. 213th ACS National Meeting, Abstracts of papers, part I, #105.

11. Traore, and Buschle-Diller, G. (1996) Cellulase activity and effect of mechanical action during enzymatic hydrolysis of dyed cotton fabrics. 213th ACS National Meeting, Abstracts of papers, part I, #106.

12. Rasmussen G., Mikkelsen J., Schulein M. (1991) A Cellulase Preparation Comprising an Endoglucanase Enzyme. International Application published under the Patent Cooperation Treaty, International Publication Number WO 91/17243.