Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

МАРКОВ АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

СВОЙСТВА ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ МУТАНТНЫМИ ШТАММАМИ ТШСНООЕНМА КЕЕБЕ!

02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2003

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Синицын А.П. Научный консультант: кандидат химических наук Гусаков A.B.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков И. А. кандидат химических наук Черноглазое В.М.

Ведущая организация:

Институт Биохимии и Физиологии Микроорганизмов РАН, Пущино

Защита состоится «¿3» декабря 2003 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Автореферат разослан ноября 2003 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

2о<ьз~А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. История развития фундаментальных знаний о ферментах неразрывно взаимосвязана с разработкой и оптимизацией способов практического использования этих уникальных биокатализаторов. С одной стороны, открытие высокоселективных реакций, катализируемых специфическими ферментами, приводит к появлению новых промышленных процессов. С другой - возрастающие потребности современных отраслей промышленности, а также необходимость внедрения экологически безопасных производственных схем, способствуют целенаправленному поиску новых ферментов. В течение последних 15 лет мировое производство промышленных ферментов выросло более, чем в два раза, а объем их продаж превысил 1 млрд. долларов. Среди используемых в современной биотехнологии ферментов целлюлазы и гемицеллюлазы, продуцируемые микроскопическими грибами, отличаются необычайно широким диапазоном применения.

Можно выделить следующие основные области применения целлюлаз и гемицеллюлаз:

глубокая биоконверсия возобновляемого растительного сырья, позволяющая, в конечном итоге, получить топливо, кормовые и пищевые продукты; пищевая промышленность - такие отрасли, как виноделие, пивоварение, производство осветленных соков;

биополировка и "биоотварка" (биоскоринг) текстильных изделий, приводящие к умягчению их поверхности, а также увеличению их смачиваемости; ферментативная "отварка" (биодепигментация) хлопчатобумажных и льняных изделий, сопровождающаяся изменением их цветности;

биоотбеливание целлюлозной массы, позволяющее уменьшить вредные выбросы хлорных производных разложения лигнина и сократить расход хлора; использование ферментов в качестве добавок к кормам животных и птиц. Среди микроскопических грибов - продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз, ТНс!ю<1егта геезег занимает ведущую роль. Это обусловлено высоким уровнем развития секреторной способности данного продуцента, а также разнообразием продуцируемых ферментов различной субстратной специфичности. Несмотря на указанные достоинства, масштабы использования ферментных комплексов, продуцируемых Т. гее.уе/, недостаточны и во многом не соответствуют их высокому потенциалу. В значительной степени это объясняется двумя причинами: во-первых, недостаточны фундаментальные знания о протеоме секретируемых в различных условиях ферментных комплексов Т. геегег. Во-вторых, применение целлюлаз и гемицеллюлаз в разных биотехнологических процессах часто связано с диаметрально отличным типом воздействия на субстрат и предъявляет различные требования к свойствам компонентов, определяющих действие комплекса в целом, поэтому каждая область применения требует создания ферментных комплексов с определенным компонентным составом. В связи-V У1

I Р 'библиотека 1

! ггавд

г о 2 4о

любого из вышеперечисленных ферментативных процессов с участием целлюлаз и гемицеллюлаз невозможна без выявления компонентов, играющих ключевую роль в конкретном биотехнологическом процессе, детального изучения физико-химических и биохимических свойств данных компонентов, а также оценки их вклада в действие ферментного комплекса в целом.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование компонентного состава новых ферментных комплексов на основе мутантных штаммов Т. геезег, сравнение в лабораторных условиях их эффективности при практическом применении в различных биотехнологических процессах, выявление ферментов, играющих ключевую роль в данных процессах, изучение их физико-химических и биохимических свойств, а также определение их вклада в эффективность действия ферментного комплекса в целом. Среди широкого спектра различных промышленно значимых процессов с участием ферментных комплексов Т. гееяег в данной работе для детального изучения были выбраны следующие: биодепигментация, биоотварка и биополировка хлопчатобумажных тканей, биоотбеливание целлюлозной пульпы, использование ферментов в качестве кормовых добавок. Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

• Разработать эффективный и экспрессный метод сравнения компонентного состава ферментных комплексов Т. геезег.

• Исследовать с помощью данного метода компонентный состав современных ферментных препаратов на основе мутантных штаммов Т. геаег, изучить влияние условий ферментации на компонентный состав получаемых ферментных препаратов.

• Разработать и оптимизировать способ препаративного выделения и очистки индивидуальных компонентов выбранных ферментных комплексов.

• Изучить физико-химические и биохимические свойства выделенных ферментов.

• Разработать методики оценки в лабораторных условиях эффективности действия ферментов и препаратов при практическом применении их в процессах биообработки текстильных материалов, биоотбеливания целлюлознобумажной пульпы, а также при использовании ферментов в качестве кормовых добавок.

• На основе предложенных методик провести исследование препаратов Т. геехе1 и их индивидуальных компонентов с целью сравнения эффективности их действия по указанным направлениям.

• На основе данных о компонентном составе оценить вклад индивидуальных компонентов в эффективность действия ферментного комплекса в целом. Определить взаимосвязь между компонентным составом и высокой эффективностью отдельных препаратов в рассмотренных биотехнологических процессах.

" ' 4

"Г. .1

Научная новизна. Исследован компонентный состав ряда лабораторных и промышленных ферментных препаратов на основе новых мутантных штаммов Т. reesei. Установлено наличие модифицированных форм эндоглюканазы I (mod. EG I), эндоглюканазы II (mod. EG II), целлобиогидролазы I (mod. CBH I), не содержащих целлюлозосвязываюгций домен (ЦОД), в ферментных комплексах, продуцируемых некоторыми мутантными штаммами Т. reesei. Изучено влияние условий ферментации на компонентный состав ферментных комплексов Т. reesei. Показано, что препараты Т. reesei по особенностям ферментационного процесса могут быть разбиты на две группы: "целлюлазные" и "ксиланазные". Установлено существенное различие в содержании отдельных ферментов в "целлтолазных" и "ксиланазных" препаратах. Изучены биохимические и физико-химические свойства (субстратная специфичность, температурный и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях, адсорбционая способность, кинетика исчерпывающего гидролиза полимерных субстратов) индивидуальных очищенных ферментов: EG I, EG И, EG III, CBH I, CBH II, mod. EG I, mod. EG II, mod. CBH I, ксиланазы I (XYL I), ксиланазы II (XYL II), ß-ксилозидазы (ß-XYL), a-L-арабинофуранозидазы (a-L-Ага), а также двух наименее изученных ферментов Т. reesei - полигалактуроназы (PGU) и экзо-р-1,3-глюкозидазы (exo-ß-l,3-Glu). Обнаружен синергизм при совместном действии на арабиноксилан эндоксиланаз, с одной стороны, и a-L-Ага и ß-XYI, с другой, а также антагонизм при совместном действии на ппокуроноксилан некоторых эндоксиланаз и a-L-Ara.

Практическая значимость работы. Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава внеклеточных ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Т. reesei. Исследованы активности по различным субстратам и состав ферментных препаратов, полученных на основе широкого круга новых штаммов Т. reesei, включая современные промышленные препараты ведущих мировых производителей ферментов. Предложена схема препаративного разделения ферментных комплексов, позволяющая выделить все основные целлюлазы и гемицеллюлазы, а также exo-ß-l,3-Glu и PGU Т. reesei. Разработаны лабораторные методы оценки способности ферментов к биоотварке и биоополировке хлопчатобумажной ткани, а также in vitro "кормовые" тесты, позволяющие сравнивать способность ферментов к увеличению питательной ценности кормов. Проведено сравнение эффективности очищенных ферментов Т. reesei в процессах ферментативной обработки текстильных изделий (биодепигментации джинсовой ткани, биоотварки суровой хлопчатобумажной ткани, биополировки окрашенной хлопчатобумажной ткани), в процессах биоотбеливания целлюлознобумажной пульпы, а также при действии ферментов на корма. Оценен вклад индивидуальных ферментов в эффективность действия ряда промышленных ферментных препаратов при их применении в вышеуказанных процессах. В результате проведения in vitro "кормовых" тестов выявлено, что эффективность ферментных препаратов при использовании их в качестве кормовых добавок определяется двумя факторами. С одной

5

стороны, ферменты, входящие в состав данных препаратов, должны обладать способностью к существенному гидролизу некрахмальных полисахаридов, с другой - быть устойчивыми к действию ингибиторов, содержащихся в кормовых злаках. Даны рекомендации по применению конкретных ферментных препаратов на основе Т. reesei в кормовых рационах, содержащих в качестве основных питательных компонентов пшеницу, пшеничные отруби, ячмень, рожь.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: 219 совещании Американского Химического Общества (Сан-Франциско, США, 2000), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), международных конференциях "Биокатализ-1998" (Пущино, 1998), "Биокатализ-2000" (Москва, 2000) и "Биокатализ-2002" (Москва, 2002), втором международном симпозиуме "Биотехнология в текстильной промышленности" (Афины, США, 2002), втором Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и развитие" (Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части (1 глава), изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 191 ссылку. Работа изложена на 201 странице машинописного текста, содержит 80 рисунков и 16 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. ИЗУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ МУТАНТНЫМИ ШТАММАМИ TRICHODERMA REESEI

1.1. Разработка экспресс-метода эффективного разделения ферментных комплексов Т. reesei на компоненты.

Была разработана принципиальная схема разделения изучаемых ферментных комплексов, включающая две основных стадии:

• стадия предварительной очистки ферментного комплекса от небелковых примесей (нерастворимых веществ, углеводов, пигментов и т.д.), включающая последовательные стадии осаждения белка препарата насыщенным раствором сульфата аммония, центрифугирования, растворения осадка в 0,025 М имидазол/HCl буфере, рН 7,5, и обессоливания полученного раствора методом гель-фильтрации низкого давления на колонке с носителем Биогель Р-4 (элюент - 0,025 М имидазол/HCl буфер, рН 7,5, скорость потока - 1 мл/мин);

• стадия тонкой очистки, включающая хроматофокусирование в диапазоне рН 7,5-4-3 на колонке Mono Р (Pharmacia, Швеция) с использованием хроматографической системы среднего давления FPLC (Pharmacia, Швеция).

Полученные в ходе стадии тонкой очистки фракции подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях (ДЦС-ЭФ) и изоэлектрофокусированию (ИЭФ), а также в них анализировали специфические активности по широкому ряду субстратов.

Исходным ферментным препаратом Т. reesei, проанализированным при помощи данной схемы, был препарат SA 210.29. После первой стадии предварительной очистки его подвергли топкой очистке с помощью хроматофокусирования. Для создания градиента использовали систему из трех буферов: стартовый буфер - 0,025 М имидазол/HCJ, рН 7,5, элюирующие буферы - полибуфер 74, рН 4,0 и рН 3,0. В ходе хроматофокусирования было собрано 30 белковых фракций. Для анализа субстратной специфичности полученных фракций было выбрано 13 специфических субстратов целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ: карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), fi-глюкан, глюкуроноксилан, галактоманнан, полигалактуроновая кислота (ПГУ), ксилоглюкан, л-нитрофенил-р-О-глюкопиранозид (ПНФ-P-G), ПНФ-р-О-целлобиозид (П11Ф-[3-G2), ПНФ-р-О-лактопиранозид (ПНФ-p-Lac), ПНФ-а-Ь-арабинофуранозид (ПНФ-a-L-Ara), о-нитрофенил-р-О-ксилопиранозид (ОНФ-p-Xyl), ПНФ-а-О-галактопиранозид (ПНФ-a-Gal), ПНФ-ацетат. Фракции, обладавшие одинаковым набором активностей, объединяли. В результате было получено 17 объединенных белковых фракций. На основании проявляемых фракциями активностей по отношению к различным субстратам, данных ДЦС-ЭФ и ИЭФ, а также имеющихся литературных данных было установлено наличие следующих ферментов в препарате Т. reesei SA 210.29: EGI, EGII, CBH I, CBH П, exo-P-l,3-Glu, a-L-Ara, маннаназы (Man), PGU, а-галактозидазы (a-Gal), p-XYL, ксилоглюканазы (XG) (рис. 1).

Рисунок 1. Профиль хроматофокусирования препарата SA 210.29.

t, мин

Следует заметить, что метод показал отсутствие в препарате таких известных из

литературы ферментов Т. гееБе1, как Ей III, ХУЬ I и ХУЬ II. В дальнейшем, в ходе оптимизации

препаративного метода разделения целлюлаз и гемицеллюлаз, было установлено, что указанные

7

ферменты все же содержатся в препарате БА 210.29, однако их содержание составляет менее 0,1%, вследствие чего они вносят ничтожно малый вклад в свойства данного препарата.

Схема анализа компонентного состава, отработанная на препарате Т. ree.se; в А 210.29, дала возможность достаточно быстро установить факт наличия определенного набора целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ в данном ферментном комплексе, кроме того полученный профиль хроматофокусирования, дополненный анализом активностей во фракциях, по сути стал "паспортом" этого базового препарата. В ходе последующей работы с помощью хроматофокусирования были получены аналогичные "паспорта" для других ферментных препаратов, позволив сравнивать их компонентный состав между собой.

1.2. Сравнительный анализ компонентного состава препаратов мутантных штаммов Т. геехеи

В работе был использован широкий круг как лабораторных, так и промышленных коммерческих препаратов Т. геезег. Условия получения некоторых промышленных препаратов были недоступны. На рис. 2 приведены известные нам сведения по генеалогии мутантов Т. гее$е\, ферментные комплексы которых изучались в представленной работе.* Данные мутанты были получены методом классического мутагенеза и селекции.

Штамм (}М9414 (родительский)

* Отечественные промышленные препараты Т. геезег под названием Целловиридин были созданы на основе штамма 18 2КК, лабораторный препарат Т\У-1 был создан на основе штамма TW-l. Оба штамма были получены в ходе многоступенчатого классического мутагенеза штамма (ЗМ9414.

Препараты штамма А13. Указанный штамм были получен в результате классического мутагенеза штамма Т. геезег М1, отбор проводился по увеличению целлюлазных активностей (табл. 1). В работе были изучены несколько препаратов, полученных на основе данного штамма, однако их компонентный состав оказался близким, поэтому остановимся на особенностях компонентного состава промышленного препарата ВА 210.89 штамма А13. ДЦС-ЭФ препарата ВА 210.89 представлен на рис. 3. Нетрудно заметить, что данный препарат по набору белковых полос крайне незначительно отличается от препарата ЭА 210.29. Профили хроматофокусирования препаратов качественно были также похожи между собой. Основные

Рисунок 2. Схема получения мутантов Т. геезе!,

ферменты которых изучены в настоящей работе. В скобках

приведены названия соответствующих промышленных препаратов.

X (АШ-Ь 592.1, С-ХЬ 592.2, Х-Х1,592.3)

отличия компонентного состава от препарата ЗА 210.29 заключались в увеличенном содержании Ев I, Ев II и ХУЬI.

Таблица 1. Удельные активносги (ед/мг) препаратов по отношению к различным субстратам.

Препарат Штамм/тип ферментации КМЦ ПГУ Ксилан ГМ КГ а-Гал р-Глюко-зидаза ФБ

БА 210.29 М1/Се1 5,08 0 45 0,50 0.26 3.20 0 009 0.05 0.51

ВА 210.89 А13/Се1 7,39 0.63 0,95 0.53 4.93 0.023 0.14 0.57

иь 210.60 А3/Се1 8,46 0,77 1,80 0,60 4,09 0.024 0 16 0 50

С-ХЬ 592.2 Х/Ху1 7,28 0 15 32,77 0.40 3.97 0.006 0.39 0.45

Х-ХЬ 592.3 Х/Ху1 6,81 022 30,2 0.44 3 89 0 006 0.37 0.48

Ап^Ь 592.1 Х/Ху1 7,13 0.19 38,36 0.42 4.23 0.006 0.38 0.42

Целловирцдин Г20Х 18.2КК/Се1 6,46 0.44 4.95 0.42 4.95 0.015 0.11 0.44

Целловиридин Г2Х 18.2КК/Се1 8,15 1.28 1,83 0.25 5.98 0.111 0 13 0.72

Т\У-1 TW-l/Cel 6,84 1.42 1,74 0.23 8.47 0 022 0.10 0.63

Обозначения: Се1 - "целлюлазная" схема ферментации, Ху! - "ксиланазная" схема ферментации, ГМ галактоманнан, КГ - ксилоглюкан, ФБ - фильтровальная бумага

Рисунок 3. ДЦС-ЭФ

препаратов

1.2 1 0.8

: 0,6 0,4 02 0

Рисунок 4. Профиль хроматофокусирования препарата иь 210.60

Препараты штамма АЗ. Отбор данного штамма проводился преимущественно по ксиланазной, а также КМЦ-азной активности (табл. 1). Рассмотрим особенности компонентного состава промышленного препарата 11Ь 210.60, полученного на основе данного штамма. ДДС-ЭФ препарата ЦЪ 210.60 существенно отличался от ДДС-ЭФ препаратов БА 210.29 и ВА 210.89. Видно (рис. 3), что белковая полоса, соответствующая мажорному компоненту комплекса - СВН I (65 кДа), сместилась в более низкомолекулярную область, кроме того уменьшились молекулярные массы некоторых других белков. Профиль хроматофокусирования препарата также претерпел значительные изменения (рис. 4). Во-первых, у препарата иЬ 210.60 отсутствует пик Ев II, вместо него появился новый пик, соответствующий ферменту с меньшей молекулярной массой и более кислым значением р1. Во-вторых, уменьшилась молекулярная

масса и значение р1 для Ев I, а соответствующий пик сместился в область более кислых рН, при этом содержание ЕС 1 (а также Ев II и СВН II) в данном препарате возросло по сравнению с препаратами ЭА 210.29 и ВА 210.89. В-третьих, уменьшилась молекулярная масса и значение р1 СВН I. Таким образом, в препарате ЦЬ 210.60, полученном на основе штамма АЗ, наблюдаются схожие изменения, затронувшие три основные целлюлазы комплекса: Ев I, Еб II, СВН I. Данные изменения заключаются в уменьшении молекулярной массы и р1 ферментов (по сравнению с соответствующими целлюлазами препаратов штаммов М1 и А13). Чтобы отличать ферменты с уменьшенной массой и р1, мы назвали их модифицированными, присвоив обозначения то<1 Ев I, тос1. Ев II, то(1. СВН I.

Препараты штамма X. Штамм X был получен из штамма АЗ классическим мутагенезом и отобран как эффективный продуцент гемицеллюлаз (табл. 1). На базе данного штамма был создан ряд лабораторных и промышленных препаратов, типичным представителем, наиболее полно отражающим особенности ферментного комплекса данного штамма, является препарат С-ХЬ 592.2. Из данных ДЦС-ЭФ (рис. 5) видно, что компонентный состав препарата С-ХЬ 592.2 отличается от состава препаратов, полученных на основе штаммов М1, АЗ и А13, более интенсивными полосами белков с массами 21 и 25 кДа. Кроме того, у данного препарата также, как и у препарата 11Ь 210.60, произошло смещение в более низкомолекулярную область белковой

Ша

С

й-

Рисунок 5. ДЦС-ЭФ препаратов

Рисунок 6. Профиль хроматофокусирования препарата C-XL 592.2.

полосы мажорного фермента - СВН I, существенно изменился и профиль хроматофокусирования (рис. 6). В препарате C-XL 592.2 резко увеличилось содержание XYL II (Мг=21 кДа), P-XYL, выросло содержание exo-P-l,3-Glu, EG III, появилась эстераза (EST). EG I, EG II и CBH I в C-XL 592.2, как и у препарата UL 210.60, находятся в модифицированном виде. Также для препарата С-XL 592.2, по сравнению с препаратами UL 210.60, ВА 210.89 и SA 210.29, характерно уменьшенное содержание a-L-Ara, СВН II, mod. EG II, PGU и Man.

10

Препараты Целловиридин Г2Х, Целловиридин Г20Х, TW-l. Препарат Целловиридин Г20Х является серийным отечественным промышленным препаратом, Целловиридин Г2Х -опытно-промышленным препаратом, Т\У-1 - лабораторным препаратом. Целловиридин Г2Х и Г20Х получены на основе штамма 18.2КК Т. гееяег, Т\ДМ - на основе штамма Т'ЧУ-!. Данные ДЦС-ЭФ препаратов (рис. 7) показывают, что они обладают одинаковым набором белковых полос, который, кроме того, повторяет набор полос препаратов на основе штаммов М1 и А1391 (препараты в А 210.29 и ВА 210.89). Анализ профилей хроматофокусирования препаратов позволил заключить, что качественный состав данных препаратов такой же, что и у препаратов ЯА 210.29 и ВА 210.89. Некоторые отличия наблюдаются в количественном содержании компонентов. Так, среди препаратов БА 210.29, ВА 210.89, Целловиридин Г20Х, Целловиридин Г2Х, ТЙМ для препарата Целловиридин Г20Х характерно более низкое содержание а-Ь-Ага, ехо-р-1,3-01и, Ев II, СВН II и ЕС I. В препарате Т\\Ч (рис. 8) крайне высокое содержание НО I, которая выходит в нескольких фракциях, соответствуя, по-видимому, различным изоформам фермента, также стоит отметить несколько более высокое содержание СВН I и Рви. Препарат Целловиридин Г2Х по количественному содержанию компонентов очень похож на препарат ВА 210 89.

Рисунок 7. ДЦС-ЭФ

препаратов.

Рисунок 8. Профиль хроматофокусирования препарата

1.3. Количественная оценка содержания ферментов в препаратах Т. гееьеи

Чтобы представить информацию по сравнению компонентного состава изучаемых препаратов в более удобной форме, была проведена оценка содержания в них индивидуальных ферментов. Оценка содержания проводилась на основании профилей хроматофокусирования (анализировались площади пиков, которые соответствовали белкам с чистотой более 90% по данным ДЦС-ЭФ). Для ферментов, содержание которых в изученных комплексах было низким и которым не соответствовал индивидуальный пик на профиле хроматофокусирования (таких как

Ев Ш, а-Ь-Ага, Рви) количественная оценка была произведена на основании разработанных схем препаративного выделения данных ферментов. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Количественная оценка содержания ферментов в препаратах Т. reesei.

препарат штамм/тип ферментации eg i eg II eg m CBHI свнн XYLI XYLO

SA 210.29 М1/Се1 ++ ++ ± 11 111 11 11 + ±

UL 210.60 А3/Се1 +++* +++* ± 1 1111* 1111 + +

ВА 210.89 А13/Се1 ++ ++ ± ++++ + ±

C-XL 592.2 Х/Ху1 +++* ++* + I 1 1 1 1 * +++ + +++

X-XL #592.3 Х/Ху1 +++* + 11111* +++ + +++

Ant-L #592.1 Х/Ху1 +++* ++* + 1 II 1 1 * +++ + +++

Целловиридин Г2Х 18.2КК/Се1 ++ ■н- ± 11 111 ++++ ± +

Целловиридин Г20Х 18.2КК/Се1 ++ -н- ± -11111 +++ + +

TW-1 TW-1/CeI +++ +++ ± 111 11 11 11 + ±

Таблица 2 (продолжение).

препарат штамм/тип ферментации P-XYL a-L-Ага PGU Man ехо-Р-U-Glu a-Gal XG EST

SA 210.29 М1/Се1 ± + + + + + ++ ±

UL 210.60 А3/Сс1 ± + + + + ± ++ ±

ВА 210.89 А13/Се1 ± + + + + ± ++ +

C-XL 592.2 Х/Ху1 + ± + ± + ± ++ +

X-XL #592.3 Х/Ху1 + ± + ± + ± ++ +

Ant-L #592.1 Х/Ху1 + ± ± + + + 4+ +

Целловиридин Г2Х 18.2КК/Се1 ± 4 + + ± + ++ ±

Целловиридин Г20Х 18.2КК/Се1 ± ± + + ± ± ++ ±

TW-1 TW-1/Cel ± + + + ± ± ++ +

Обозначения: Mill - содержание фермента 30-50%, I м I - содержание фермента 20-30%, +++ -

содержание фермента 10-20%, ++ - содержание фермента 5-10%, + - содержание фермента 0,3-5%, ± - содержание фермента менее 0,3%, либо его наличие в препарате под вопросом, - - фермент отсутствует в препарате; * - фермент находится в модифицированной форме (mod. EG I, mod EG II, mod. CBH I), Cel - "целлюлазная" схема ферментации, Xyl - "ксиланазная" схема ферментации

1.4. Влияние условий ферментации на биосинтез ферментов Т. reesei.

При создании ферментных комплексов с заданным компонентным составом важным является анализ влияния условий ферментации на состав получаемых препаратов. Все препараты Т. reesei, условия получения которых были доступны нам, по особенностям ферментационного процесса могут быть разделены на две группы: препараты, полученные по схеме ферментации, которую мы назвали "целлюлазной" (SA 210.29, ВА 210.89, UL 210.60, препараты серии Целловиридин и TW-1), и препараты, полученные по схеме ферментации, которую мы назвали "ксиланазной" (C-XL 592.2, X-XL 592.3, Ant-L 592.1). Мы выявили существенные отличия между компонентным составом "целлюлазных" препаратов (полученных по "целлюлазной" схеме

12

ферментации) и ксиланазных препаратов (полученных по "ксиланазной" схеме ферментации). Так, для препаратов, полученных по "целлюлазной" схеме ферментации по сравнению с препаратами, полученными по "ксиланазной" схеме ферментации, характерно (табл. 2):

• - более высокое содержание а-Ь-Ага, Мал, СВН И, Рви;

• - более низкое содержание ХУЬ П, ЕОIII, ехо-р-1,3-01и, Р-ХУЬ, ЕЭТ.

Особо выделим различия в содержании ХУЪ II, сх-Ь-Ага, р-ХУЬ. На примере препаратов ВА 210.29 и С-ХЬ 592.2 (табл. 2) нами было показано, что разница в содержании данных ферментов в препаратах, полученных по "целлюлазной" и "ксиланазной" схеме ферментации, может достигать 10 и более раз.

2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ Т. ЯЕЕ$Е1

2.1. Физико-химические и биохимические свойства целлюлаз Т. гееяеи

В ходе исследований были разработаны схемы препаративного разделения ферментных комплексов, полученных на основе различных штаммов Т. гееяе!, и из них выделены целлюлазы: ЕС I, ЕО II, Ев III, СВН I, СВН II, тос1. Ев I, тоё. Ев II, то<1. СВН I. Были определены их молекулярные параметры (Мг, р1) и изучены физико-химические свойства (удельная активность по широкому кругу природных и синтетических субстратов, адсорбционная способность на микрокристаллической целлюлозе, температурные и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях, кинетика исчерпывающего гидролиза микрокристаллической целлюлозы). Полученные результаты приведены в табл. 3. Более детально остановимся на сравнении свойств исходных и модифицированных форм целлюлаз. В ходе изучения пар ферментов Ев I и то<1. Ев I, Ев II и тоё. Ев II, а также СВН I и тос1. СВН I были обнаружены интересные различия в их свойствах:

Во-первых, Мг у модифицированных ферментов была меньше, чем у исходных; во-вторых, модифицированные ферменты характеризовались существенно меньшей активностью по отношению к нерастворимой целлюлозе (авицелу), хотя активности по отношению к растворимым субстратам (КМЦ, ПНФ-Р-Сг), за исключением то<1. Ей II, изменились незначительно; в-третьих, модифицированные ферменты обладали значительно меньшей адсорбционной способностью на нерастворимой целлюлозе (авицеле). Исходя из указанных наблюдений, было сделано предположение, что модифицированные ферменты отличаются от обычных отсутствием ЦСД, который определяет способность фермента к гидролизу высокоупорядоченных кристаллических форм целлюлозы, а 1акже ответственен за адсорбционную способность фермента. Это предположение было подтверждено данными экспериментов по ограниченному протеолизу модифицированных и обычных ферментов

папаином. Так, например, в ходе ограниченного протеолиза СВНI наблюдали уменьшение ее Мг до значения, в точности соответствующего Мг тос1. СВН I (рис. 9).

Таблица 3. Свойства очищенных целлюлаз Т. reesei.

Параметр EG 1 (ВА 210 89) mod. EG I (UA 210 60) EG II (ВА210 89) mod. EG II (UA 210 60) EG III (C-XL 592 2] CBHI (ВА 210.89) mod. СВН I (UA 210 60) свн и (ВА 210.89)

Мг, «Да 57 60 48 40 25 65 57 53

р! 4,6 4,5 5,5 4,5 7,5 4,2 3,7 6,3

ЦСД есть нет есть нет нет есть нет есть

Содержание в препарата, % 8% 10% 4,5% 12% 2% 40% 37% 20%

Кр (авицел), л/г 0,2 0,009 0,1 0,009 0,007 0,14 0,024 0,11

рН - оптимум, (рН»*)1 4,5-5 (4-6,6) 5 (4-6,5) 4,7 (3,7-6,5) 6 (4,3->7,5) 6 (4,6-7) 445 (<3-5,7) 4-4,5 (<3-5,7) 4,5-5 (3,7-6,7)

Т - оптимум (ТиО, "С! 60 (40-72) 60 (45-70) 70-75 (55-85 70-75 (50-85 60 (37-73) 60 (45-66) 60 (45-68) 70-75 (53-82)

Стабильность, рН 51 Зч, 100% Зч, 100% Зч, 100% Зч, 90% Зч, 87% 19ч, 97% 19ч, 97% Зч, 100%

Стабильность, рН 71 3ч, 37% Зч. 65% 40мин, 0% ЗОмин, 0% бОмин, 20% бОмин, 42% бОмин, 19% 40мин, 0%

Устойчивость к термошоку4 60с, 49% 60с, 53% 50с, 26% 20с, 33% 20с, 0% 20с, 0% 20с, 0% 60с, 28%

Устойчивость к мех. стрессу* бОмин, 40% бОмин, 46% бОмин, 75% бОмин, 72% бОмин, 0% бОмин, 100% бОмин, 98% бОмин, 70%

КМЦ, ед/мг 23,7 27,4 15,0 1,5 10,9 0,33 0,16 1,7

р-глюкан, ед/мг 43,7 47,2 26,6 3,0 19,2 0,21 0,14 2,5

КМЦ (Вискозим), ед/мг 6,3 7,3 5,5 0,40 5,8 0,034 0,04 0,53

Авицел, ед/мг 0,22 0,04 0,18 0,03 0,06 0,2 0,08 0,19

Глюкуроноксилан, ед/мг 7,9 10,2 0 0 0,56 0 0 0

Арабиноксилаи, ед/мг 8,3 10,9 0 0 н о 0 0 0

Ксилоглюкаи, ед/мг 45,1 43,2 0 0 8,6 0,37 0,12 0

Ламинарии, ед/мг 0 0 0 0 И.О. 0 0 0

ПГУ, вдГмг 0 0 0 0 0 0 0 0

ПНФ-Э-С,, ед/мг 0,34 0,50 0 0 0 0,01 0,01 0

ПНФ-|Я)-1ас, ед/мг 0,33 0,47 0 0 0 0,09 0,1 0

ПНФ-а-1--Ага, ед/мг 0 0 0 0 0 0 0 0

ОНФ-р-О-Ху!, ед/мг 0 0 0 0 0 0 0 0

ПНФ-р-О-О, ед/мг 0 0 0 0 0 0 0 0

Глубина исчерпывающего гидролиза авицела,' % 37% 13% 36% 19% 11% 80% 50% 60%

2 - Т«« - диапазон температур, в котором фермент сохраняет 50 и более процентов активности

3 - приведена остаточная активность после инкубации при 50°С

4 - приведена остаточная активность после инкубации при 80°С

5 - условия- 50°С, рН 5, перемешивание (300 об/мин) в металических ячейках с цилиндрами

6 - условия реакции 40°С, рН 5, избыток целлобиазы в реакционной смеси, концентрация фермента 0,1 мг/мл, субстрата 5 мг/мл в реакционной смеси, время гидролиза - б суток.

Рисунок 9. ДЦС-ЭФ СВН I и mod. СВН I до и после ограниченного протеолиза.

1 - СВН I до протеолиза

2 - mod. СВН I до протеолиза

3 - СВН I после протеолиза

4 - mod. СВН 1 после протеолиза

2.2. Физико-химические и биохимические свойства гемицеллюлаз Т. геега.

Были разработаны схемы препаративного разделения и выделены следующие очищенные гемицеллюлазы Т. геезег. ХУЬ I, ХУЪ II, Р-ХУЬ, а-Ь-Ага. Как и в случае целлюлаз, у выделенных гемицеллюлаз были изучены биохимические и физико-химические свойства. Результаты

представлены в табл. 4. Также представлены данные для Ей I и тос1. Ев I, которые обладают заметной неспецифической ксиланазной активностью.

Таблица 4. Свойства очищенных гемицеллюлаз Т. reesei.

Параметр EGI mod. EG I Xyll Xylll ß-Xyl a-L-Ara

(ВА210 89) (UA 210 60) (C-XL 592 2) (C-XL 592.2) (C-XL 592 2) (ВА210 89)

М.кДа 57 50 21 21 80 55

р! 4,6 4,5 5,5 9,5 4,5 7,4

цед есть нет нет нет нет н.о.

Содержание в препарате, % 8% 10% 0,5% 20% 2,0% 1%

Кр (авицел), л/г 0,2 0,009 <0,05 <0,05 <0,05 и.о.

рН - оптимум, (рНиО 5,5 (4-6,7) 5 (3,8-6,7) 2-2,5 (<2-4,5) 5-5,5(4-7) 6,5 (2,5-7) 3,5-4(<2,5-5,3)

Т - оптимум (Т60%)> °с 65 (40-68) 65 (47-68) 50 (<25-67) 65 (47-73) 65 (52-73) 60 (45-73)

Стабильность, рН 51 Зч, 100% Зч, 100% Зч, 96% Зч, 100% Зч, 100% Зч, 97%

Стабильность, рН 71 Зч, 26% Зч, 35% 20 мин, 0% Зч, 68% 10 мин, 0% 10 мин, 0%

Устойчивость к термошоку2 60с, 49% 60с, 53% 20с, 0% 20с, 5% 20с, 0% 20с, 0%

КМЦ, ед/мг 24 27 0 0 0 0

о-глюкан, ед/мг 44 47 0 0 0 0

КМЦ (Вмскозим), ед/мг 6,3 7,3 0 0 0 0

Авицел, ед/мг 0,22 0,04 0 0 0 0

Глюкуроноксилак, ед/мг 8 10 8 191 4,6 1,2

Арабиноксилан, ед/мг 8 11 8 170 0,6 2,6

Ксилоглюкан, ед/мг 45 43 0 0 0 0

Ламинарин, ед/мг 0 0 0 0 0 0

ПГУ, ед/мг 0 0 0 0 0 0

ПНФ-р-вг, ед/мг 0,3 0,5 0 0 0 0

ПНФ-р-0-1ас, ед/мг 0,3 0,5 0 0 0 0

ПНФ-а-1_-Ага, ед/мг 0 0 0 0 0,6 14

ОНФ-р-Р-Ху], ед/мг 0 0 0 0 1,5 0

ПНФ-р-О-б, ед/мг 0 0 0 0 0 0

Глубина исч. гидролиза, % глюкуроноксилана 40% 41% 37% 38% 52% 12%

арабиноксилана3 25% 26% 25% 25% 25% 19%

- приведена остаточная активность после инкубации при 50°С 1 - приведена остаточная активность после инкубации при 80°С

- условия реакции: 50°С, рН 5, концентрация субстрата 5 мг/мл, время реакции 3 суток, концентрация ферментов подбиралась таким образом, чтобы достичь глубину гидролиза 1-2% через 10 минут реакции.

Остановимся на наиболее интересных свойствах выделенных гемицеллюлаз. Удельные активности XYL I и обеих форм EG I по арабиноксилану и глкжуроноксилану были близкими (порядка 10 ед/мг белка), удельная активность XYL II по обоим субстратам была почти в 20 раз выше. В связи с этим интересно сравнить, какой вклад вносят индивидуальные ферменты (см. рис. 10, на нем дано произведение удельной активности на содержание фермента в препарате) в суммарную ксиланазную активность препаратов. Видно, что ксиланазная активность препаратов ВА 210.89 и UL 210.60 (равно как и остальных препаратов, полученных по "целлюлазной" схеме ферментации) определяется в основном EG I и mod. EG I, в то время как у препарата C-XL 592.2 (равно как и остальных препаратов, полученных по "ксиланазной" схеме ферментации) доминирующим является вклад XYL И. Мы изучили кинетику исчерпывающего гидролиза двух наиболее распространенных в природе типов ксиланов: арабиноксилана и глюкуроноксилана под действием индивидуальных гемицеллюлаз (рис. 11), их композиций (в соотношении 1:1 по белку), а также исходных препаратов.

Рисунок 10. Вклад ферментов в общую ксиланазную активность ферментных препаратов.

^ иик 1,

Рисунок 11. Кинетические кривые гидролиза арабиноксилана (слева) и глюкуроноксилана (справа) очищенными ферментами. Приведены данные, полученные в первые сутки гидролиза.

Таблица 5. Глубина исчерпывающего гидролиза глюкуроноксилана (ГК) и арабиноксилана (АК) ферментами.

В результате были установлены следующие закономерности (табл. 5): глубина гидролиза глюкуроноксилана (ГК) под действием индивидуальных ферментов выше, чем глубина гидролиза арабиноксилана (АК); добавление а-Ь-Ага не только не приводит к увеличению глубины гидролиза ГК, но, наоборот, уменьшает глубину гидролиза в случае всех ферментов, за исключением ХУЬ II. Таким образом, наблюдается антагонизм в совместном действии Ев I, тоА Ев I, ХУЬ I с одной стороны, и а-Ь-Ага с другой на ГК. Глубина гидролиза АК под действием ферментов значительно возрастает при добавлении а-Ь-Ага или Р-ХУЬ, причем данный эффект наиболее выражен при

Глубина гидролиза, %

ГК АК

ВА 210.89 40 43

иь 210.60 39 40

С-ХЬ 592.2 40 30

ХУЫ 37 28

ХУЫ + а-Ь-Ага 26 40

ХУЫ + Р-ХУЬ 46 37

Х\Ы1 38 28

ХУЬ И + а-Ь-Агя 38 48

ХУ1Л1 + Р-ХУЬ 72 43

ЕС1 42 26

Ев 1 +а-Ь-Ага 37 81

ЕС I + Р-ХУЬ 49 36

шос|. Ев I 41 26

тоа. ЕС I + а-Ь-Ага 38 52

тоЛ. Ей 1 +р-ХУЬ 47 37

Р-ХУЬ 52 19

а-Ь-Ага 12 25

а-Ь-Ага + Р-ХУЬ 49 73

добавлении а-Ь-Ага. Таким образом, наблюдается синергизм в совместном действии на АК эндоксиланаз с одной стороны, а-Ь-Ага и Р-ХУЪ с другой. Глубина гидролиза ГК под действием препаратов примерно равна глубине гидролиза Ев I и mod.BG I для препаратов ВА 210.89 и иЬ 210.60, и ХУЬII для С-ХЬ 592.2.

2.3. Полигалактуроназа и экзо-Р-1,3-глюкозидаза Т. гееже/.

В ходе работы нам удалось выделить два фермента - полигалактуроназу (Рви) и экзо-р-1,3-глюкозидазу (схо-Р-1,3-01и) Т. ree.se/, сведения о которых в литературе крайне немногочисленны. Мы изучили их биохимические и физико-химические свойства и сравнили их с аналогичными для ферментных препаратов.

Ехо-р-1,3-01и (Мг=74 кДа, р1=8,9) обладала высокой активностью по отношению к высокомолекулярным субстратам, причем гидролизу подвергались предпочтительно Р-1,3-связи. Так активность по ламинарину фермента выше, чем по р-глюкану и почти в 100 раз вьппе, чем по КМЦ (табл. 6). Фермент обладал и сравнительно высокой активностью по отношению к низкомолскулярным субстратам, таким как ПНФ-глюкозид, ламинарибиоза, целлобиоза, софороза, гентиобиоза. Анализ изменения молекулярно-массового распределения (ММР) продуктов гидролиза высокомолекулярных субстратов под действием ехо-р-1,3-С1и, проведенный с помощью гель-проникающей хроматографии, показал, что он осуществлялся по экзодеполимеразному механизму. Для фермента была характерна крайне высокая (90%) глубина гидролиза ламинарина, при этом единственным продуктом реакции являлась глюкоза.

Выделенная Рви (Мг=45 кДа, р1=6,0) обладала крайне высокой активностью по отношению к ПГУ и цитрусовому пектину. Фермент не обладал пектин- и пектат- лиазной активностью. Высокая вискозиметрическая активность по отношению к цитрусовому пектину свидетельствовала о эндодеполимеразном механизме изменения ММР продуктов гидролиза высокомолекулярных субстратов под действием Рви.

рН - оптимум ехо-р-1,3-01и составил 5, такой же оптимум активности был и у РОи (рис. 12). Температурные онгимумы активности отличались: 70°С в случае ехо-р-1,3-Яи и 60°С в случае Рви (рис. 13). Оба фермента обладали высокой стабильностью при 50°С, рН 5 (сохраняли более 80% первоначальной активности через 3 ч, см. табл. 6 и рис. 14а и Ъ). При 50°С, рН 7, более стабильным ферментом была ехо-р-1,3-01и. Так после 1 ч инкубации при 50°С, рН 7 ехо-Р-1,3-01и сохраняла 40% своей первоначальной активности, в то время как Рви уже через 10 минут инкубации в аналогичных условиях теряла почти 90% своей первоначальной активности (рис. 14а и Ь)

Данные по устойчивости ферментов к высокотемпературной обработке (устойчивости к термошоку) и кинетике исчерпывающего гидролиза высокомолекулярных субстратов (ламинарина и ПГУ) приведены в табл. 6.

ехо-(5-1,3-Ои PGU

Мг, кДа 74 45

Р1 8,9 6,0

ПГУ, ед/мг 0 200

Пектин, ед/мг 0 360

Ламинарии, ед/мг 30 0

КМЦ, ед/мг 0,4 0

Р-глюкан, ед/мг 16 0

ПНФ-р-О-С, ед/мг 24 0

ПНФ-Р-И-С,, ед/мг 2 0

Ламинарнбиоза', ед/мг 8,9 0

Целлобиоза2, ед/мг 7,3 0

Софороза3, ед/мг 6,8 0

Гентнобиоза4, ед/мг 2,5 0

рН-оптимум, (рНч!%) 5,0 (4,1-6,0) 5,0 (3,5-5,4)

Т-оптнмум, (Тя%), °С 70°С (43-80) 60°С (47-73)

Стабильность5, рН 5 Высокая (Зч, 80%) Высокая (Зч, 85%)

Стабильность5, рН 7 Средняя (1ч, 40%) Низкая (Юмии, 12%)

Устойчивость к термошоку6 Высокая (20с, 96%) Низкая (20с, 0%)

Глубина исчерп. ■ идролиза7 90% (ламинарии) 35% (ПГУ)

1 - дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы, соединенных р-1,3-связью

2 - дисахарид, состоящий го двух остатков глюкозы, соединенных р-1,4-связью

3 - дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы, соединенных [3-1,2-связью

4 - дисахарид, состоящий из двух остатков глюкозы, соединенных р-1,6-связью

3 - приведена остаточная активность после инкубации при 50°С

6 - приведена остаточная активность после инкубации при 80°С

7 - условия реакции- 50°С, рН 5, концентрация субстрата 5 мг/мл, время реакции 3 суток, концентрация ферментов подбиралась таким образом, чтобы достичь глубину гидролиза 1-2% через 10 минут реакции

Рисунок 13. Температурные зависимости активности exo-p-l,3-GIu и PGU.

18

Рисунок 14Ь. Стабильность Рви.

3. ПРИКЛАДНЫЕ ИСПЫТАНИЯ ПРЕПАРАТОВ И ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ Т. КЕЕБЕ! МО РАЗЛИЧНЫМ НАПРАВЛЕНИЯМ ПРИМЕНЕНИЯ

Дальнейшим направлением наших исследований было сравнение эффективности действия препаратов и очищенных ферментов Т. гее$е1 при использовании их для обработки текстильных материалов (биодепигментации, биоотварки и биополировки), в процессе биоотбеливания целюлознобумажной пульпы, а также при их применении в качестве кормовых добавок с целью выявления ключевых ферментов для того или иного применения. Стратегия исследований в данном случае была следующей: первый этап - разработка лабораторных методик оценки эффективности действия ферментов по выбранным направлениям применения, далее -проведение испытаний препаратов с использованием разработанной методики, проведение испытаний индивидуальных ферментов, выявление ключевых ферментов для каждого применения, заключительный этап - оценка вклада индивидуальных ферментов в суммарное действие ферментных комплексов.

3.1. Выявление ключевых ферментов Т. геезе1 для текстильных процессов.

Биополировка. С точки зрения ферментативного катализа данный процесс можно описать как гидролиз поверхностных целлюлозных волокон. На рис. 15 представлена демонстрация биополирующего действия ферментов. Ткань слева (исходная) - необработана ферментами, покрыта многочисленньми волокнами, это ухудшает ее потребительские свойства. Ткань справа обработана препаратом Целловиридин - видно, что дефекты удалены, поверхность стала гладкой.

Рисунок 15. Иллюстрация биополирующего действия ферментов (фотографии поверхности ткани при 60-крагном увеличении).

Нами была разработана методика оценки эффективности биополировки, основанная на измерении интенсивности окраски раствора, образующегося в ходе биополировки окрашенной ткани ферментами. Мы сравнили результаты биополировки под действием препаратов (рис. 16). Высокой эффективностью при биополировке обладали "целлюлазные" препараты, причем содержащие в своем составе немодифицированные целлюлазы (Т№-1, Целловиридин Г2Х и Г20Х, ВА 210.89). Сравнение результатов биополировки под действием индивидуальных ферментов позволило установить нам, что способность к биополировке наиболее выражена у Ев III, далее по эффективности следуют ЕБ П, СВН П и ЕС I (рис. 17). Особо следует подчеркнуть

существенно меньшую биополирующую способность у модифицированных форм Ев I и Ев II по сравнению с немодифицированными ферментами.

Рассмотрим вклад индивидуальных компонентов в способность препаратов к биополировке. Вклад Ей III, несмотря на ее высокую эффективность мал, даже в случае препарата С-ХЬ 592.2. Наибольший вклад в биополирующую способность всех трех препаратов вносит СВНII (рис. 18).

Рисунок 16. Результаты биополировки Рисунок 17. Результаты биополировки

под действием ферментных препаратов поя действием индивидуальных ферментов

(50°С, рН 5, препараты нормированы (50°С, рН 5, ферменты нормированы по белку) по белку)

Рисунок 18. Вклад отдельных ферментов в способность препаратов к биополировке

Биодепигментация джинсовой ткани. Процесс биодепигментации джинсовой ткани под действием ферментов заключается в частичном удалении индиго с ее поверхности, что повышает ее потребительские свойства. Нами была разработана методика оценки эффективности биодепигментации джинсовой ткани, основанная на измерении ее обесцвечивания после ферментативной обработки. Мы сравнили результаты биодепигментации под действием препаратов (рис. 19). Как и в случае биополировки, в процессе биодепигментации более высокой эффективностью обладали "целлюлазные" препараты, содержащие в своем составе немодифицированные целлюлазы (TW-1, Целловиридин Г2Х и Г20Х, ВА 210.89). Сравнение результатов биодепигментации под действием индивидуальных ферментов позволило установить нам, что эффективность максимальна у EG II, также высокой способностью к биодепигментации обладают EG III и СВН II, несколько меньшая депигментирующая способность (т.н. "абразивность") у EG I (рис. 20). Отметим меньшую "абразивность"у модифицированных целлюлаз по сравнению с немодифицированными ферментами.

Рассмотрим вклад индивидуальных ферментов в способность препаратов к биодепигментации. Вклад EG II и EG Ш, несмотря на их высокую эффективность уступает вкладу СВН II. Кроме того, в случае препарата ВА 210.89 весьма ощутимым является вклад СВН I, обусловленный высоким содержанием данного фермента в комплексе) (рис. 21).

Рисунок 19. Результаты Рисунок 20. Результаты Рисунок 21. Вклад отдельных

биодепигментации под действием биодепигментации под действием ферментов в способность

ферментных препаратов (50°С, рН 5, индивидуальных ферментов (50°С, рН 5, препаратов к биодепигментации

препараты нормированы по белку) ферменты нормированы по белку)

Биоотварка суровой хлопчатобумажной ткани. Процесс биоотварки суровой хлопчатобумажной ткани под действием ферментов заключается в увеличении гидрофильности ткани (смачиваемости), что облегчает ее последующую обработку, например, окрашивание.

Нами была разработана методика оценки эффективности биоотварки, основанная на измерении капиллярности ткани после ее ферментативной обработки, а также минимизированная методика, которая базировалась на измерении времени впитывания капли воды, нанесенной на поверхность обработанной ткани. Мы сравнили результаты биоотварки под действием препаратов (рис. 22), наибольшей эффективностью обладали "целлюлазные" препараты, содержащие в своем составе немодифицированные целлюлазы. Среди индивидуальных ферментов (рис. 23) наибольшей способностью к биоотварке обладали Ев II и, особенно, смесь СВН П+Рви, которая вносила основной вклад в суммарное действие препаратов (рис. 24).

Рисунок 22. Результаты биоотварки Рисунок 23. Результаты биоотаарки под Рисунок 24. Вклад отдельных

под действием ферментных препаратов действием индивидуальных ферментов ферментов в способность

(50°С, рН 5, препараты нормированы (50°С, рН 5, ферменты нормированы препарата ВА 210 89

по белку) по белку) к биоотварке

3.2. Выявление ключевых ферментов Т. геезе1, ответственных за биоотбеливание целлюлознобумажной пульпы.

Процесс биоотбеливания целлюлознобумажной пульпы заключается в гидролизе

гемицеллюлозы, входящей в ее состав, что способствует высвобождению хромофоров, а также

21

облегчает ее последующее отбеливание при помощи химических агентов. Нами была разработана методика оценки эффективности биоотбеливания целлюлозы, основанная на спектрофотометрическом определении ароматических производных лигнина на длине волны 237 нм.

Мы сравнили результаты биоотбеливания целлюлозы под действием ферментных препаратов при рН 5 и рН 7,5 (рис. 25). В обоих случаях (особенно при рН 7,5) наибольшей способностью к биоотбеливанию обладали "ксиланазные" препараты. Сравнение результатов биоотбеливания под действием индивидуальных ферментов позволило установить нам, что при рН 5 максимальной биоотбеливающей способностью обладает ХУЬ II, далее по эффективности следуют ХУЬ I, ЕО I и то<1. ЕС I, наименьшая способность (близкая к нулю) у р-ХУЬ (рис. 25). При рН 7,5 биоотбеливающая способность ХУЪ I, Ев I и Р-ХУЬ уменьшается практически до нулевого значения, в то время как у ХУЬII она по-прежнему сохраняется высокой (рис. 25).

Рассмотрим вклад индивидуальных ферментов в способность препаратов к биообеливанию целлюлозы. При рН 5 биоотбеливающая способность "целлюлазных" (ВА 210.89, Ш. 210.60) препаратов обусловлена Ей I или то<1 ЕО I, у "ксиланазных" препаратов (С-ХЬ 592.2) эффект биоогбеливания обусловлен ХУЬ II (рис. 26). При рН 7,5 биоотбеливающая способность "целлюлазных" и "ксиланазных" препаратов обусловлена единственным ферментом - ХУЬ П (здесь данные не представлены).

Рисунок 25. Результаты биоотбеливания целлюлозы ферментными препаратами и индивидуальными ферментами. 50°С, ферменты нормированы по белку.

Рисунок 26. Вклад отдельных ферментов в способность препаратов к биоотбеливанию целлюлозы при рН 5.

3.3. Выявление ключевых ферментов Т. гееяег, ответственных за способность препаратов к увеличению питательной ценности кормов.

Положительное действие целлюлаз и гемицеллюлаз при добавлении их в корма животных и птиц заключается в гидролизе некрахмальных полисахаридов (НКП), таких как ксиланы и (!-глюканы, которые обладают антипитательными свойствами. В ходе работы были разработаны лабораторные методики для оценки способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов ("кормовой" эффективности), мы дали им название т уЛго кормовые тесты. Они основаны на анализе ВС, образующихся в ходе гидролиза кормов ферментами, а также на изучении изменения вязкости экстракта ржи под действием ферментов (рожь дает наиболее вязкие экстракты среди злаков). В качестве объектов действия ферментов выбрали пшеничные отруби, пшеницу, ячмень и рожь - основные компоненты кормовых рационов в России и Европе.

В результате проведения т уНто кормовых тестов мы установили более высокую эффективность "ксиланазных" препаратов и индивидуальных ксиланаз при обработке пшеничных отрубей. При этом основной вклад в "кормовую" эффективносгь "ксиланазных" препаратов вносит ХУЬII, "целлюлазных" - Ев I и то<1. ЕОI (рис. 27). В случае гидролиза ржи и смеси пшеница+ячмень, мы практически не обнаружили разницу в "кормовой" эффективности "ксиланазных" и "целлюлазных" препаратов (несмотря на то, что основным НКП пшеницы и ржи являются ксиланы). Так, вклад целлюлаз и ксиланаз в суммарную "кормовую" эффективность препаратов при действии их на рожь оказался примерно равным (рис. 28). Детальное изучение данного явления показало, что причиной низкой эффективности ксиланаз в данном случае является их ингибирование ингибиторами злаков, имеющих белковую природу. В связи с этим было изучено ингибирование ксиланазной активности ферментных препаратов и очищенных ксиланаз водными экстрактами пшеницы, ржи и ячменя (табл. 7).

Рисунок 27. Вклад отдельных ферментов Рисунок 28. Вклад отдельных ферментов

в "кормовую" эффективность препаратов в "кормовую" эффективность препаратов

на пшеничных отрубях на ржи

Наибольший ингибирующий эффект на ксиланазы Т. геезег оказывал экстракт пшеницы,

экстракт ячменя обладал наименее выраженным ингибирующим эффектом. Среди

23

индивидуальных ферментов наибольшему ингибированию подвергалась XYL II, в то время как EG I и mod. EG I практически не подвергались ингибированию ни на одном из экстрактов. В итоге пришли к выводу, что набор необходимых ключевых ферментов при использовании ферментных препаратов в качестве добавок к кормам будет отличаться в зависимости от состава кормового рациона. Так для кормовых рационов с высоким содержанием пшеничных отрубей и ячменя актуально использование "ксиланазных" препаратов с высоким содержанием XYL II и XYL I, для кормовых рационов с высоким содержанием пшеницы более рационально применение "целлюлазных" препаратов с высоким содержанием EG I или mod. EG I, так как использование XYL I и XYL II в данном случае малоэффективно вследствие их сильного ингибирования.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава внеклеточных ферментных комплексов, продуцируемых штаммами T. reesei. С помощью этого метода исследован компонентный состав ряда лабораторных и промышленных ферментных препаратов на основе мутантных штаммов T. reesei. Установлено наличие модифицированных форм целлюлаз, не содержащих ЦСД (mod. EG I, mod. EG II, mod. CBH I), в препаратах, продуцируемых некоторыми мутантными штаммами T. reesei. Предложена схема препаративного разделения ферментных комплексов, позволившая выделить все основные целлюлазы (EG I, EG И, EG III, CBH I, CBH II) и гемицеллюлазы (XYL I, XYL II, p-XYL, oc-L-Ara), а также ехо-р-1,3-Glu и PGU T. reesei.

2. Изучено влияние условий ферментации на компонентный состав ферментных комплексов Т reesei. Показано, что препараты T. reesei по особенностям ферментационного процесса (состав ферментационной среды, рН и температура ферментации) могут быть разбиты на две 1руппы: "целлюлазные" и "ксиланазные". Установлено существенное различие в содержании отдельных ферментов в "целлюлазных" и "ксиланазных" препаратах.

3. Изучены биохимические и физико-химические свойства всех выделенных ферментов (Mr, pi, температурный и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях, адсорбционая способность, кинетика исчерпывающего гидролиза полимерных субстратов). Обнаружен синергизм при совместном действии на арабиноксилан эндоксиланаз, с одной стороны, a-L-Ara и p-XYL с другой, а также антагонизм при совместном действии на глюкуроноксилан некоторых эндоксиланаз и a-L-Ara.

Таблица 7. Ингибирование ферментов экстрактами злаков.

Остаточная пшеница ссиланазная: Р»ь важность, %

ВД2Ш89 48 53 70

UL 210.60 25 41 55

C-XL 592.2 0 9 27

XYLI 0 22 77

XW.II 0 0 20

BBI 90 96 86

rrodEGI 84 аб 88

4. Разработаны лабораторные методы оценки способности ферментов к биоотварке и биоополировке хлопчатобумажных тканей, а также in vitro "кормовые"тесты, позволяющие сравнивать способность ферментов к увеличению питательной ценности кормов.

5. Выявлены ключевые ферменты, обладающие наибольшей эффективностью действия при ферментативной обработке текстильных изделий (в процессах биодепигментации джинсовой ткани - EG II, EG III, СВН И, биоотварки суровой хлопчатобумажной ткани - EG II, СВН II и PGU, биополировки текстильных материалов - EG III, EG II, EG I и СВН И). Оценен вклад каждого из ферментов в эффективность действия ферментных препаратов.

6. Установлено, что ключевым ферментом "целлюлазных" препаратов Т. reesei, определяющим их способность к биоотбеливанию целлюлозной пульпы при рН 5 является EG I, "ксиланазных" - XYL II. При рН 7,5 биоотбеливающая способность всех препаратов Т. reesei обусловлена действием XYL II.

7. В результате проведения in vitro "кормовых" тестов выявлено, что эффективность ферментных препаратов при использовании их в качестве кормовых добавок определяется двумя факторами. С одной стороны, ферменты, входящие в состав данных препаратов, должны обладать способностью к существенному гидролизу некрахмальных полисахаридов, с другой -быть устойчивыми к действию ингибиторов, содержащихся в кормовых злаках. Даны рекомендации по применению конкретных ферментных препаратов на основе Т. reesei в кормовых рационах, содержащих в качестве основных питательных компонентов пшеницу, пшеничные отруби, ячмень, рожь.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Gusakov A.V., Sinitsyn А.Р., Berlin A.G., Markov A.V., Popova N.N., Sinitsyna O.A., Kurinov A.M. A comparison study of different cellulase preparations in the enzymatic treatment of cotton fabrics. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-98: Fundamentals & Applications", June 13-18,1998, Puschino on the Oka, Russia, p.22.

2. Gusakov A.V. Sinitsyn A.P., Berlin A.G., Popova N.N., Markov A.V., Okunev O.N., Tikhomirov D.F., Emalfarb M. Interaction between indigo and adsorbed protein as a major factor causing backstaining during cellulase treatment of cotton fabrics. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1998, vol.75, p.279-293.

3. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Berlin A.G., Popova N.N., Markov A.V., Skomarovsky A.A., Sinitsyna O.A., Grishutin S.G. Saccharifying and topolytic activities of various cellulase Abstracts of 219"1 ACS National Meeting, Biotechnology Applications in Food and Agriculture, March 26-30, 2000, San Francisco, California, USA.

4. Зоров И.Н., Устинов Б.Б., Бухтояров Ф.Е., Скомаровский А.А., Марков А.В., Синицына О.А., Гришутин С.Г., Синицын А.П. Оценка действия целлюлаз на полимерные растворимые субстраты по изменению молекулярно-массового распределения. Тезисы

стендовых сообщений школы-конференции "Горизонты Физико-Химической Биологии", 28мая - 2 июня 2000, Пущино, с. 119.

5. Bukhtojarov F.E., Markov A.V., Skomarovsky А.А., Sinitsyna O.A., Sinitsyn A.P. The degradation of arabinoxylan by xylanases and oc-L-arabinofuranosidases, isolated from Trichoderma reesei and Penicillium canescens. Abstracts of International Conference "BiocataIysis-2000: Fundamentals & Applications", June 10-15,2000, Moscow, Russia, p.77.

6. Markov A.V., Sinitsyn A.P., Kondratyeva E.G., Grishutin S.G. A comparison study of composition of the multyenzymatic complexes of different Trichoderma reesei mutants by the use of preparative chromatofocusing. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2000-Fundamentals & Applications", June 10-15,2000, Moscow, Russia, p.123.

7. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Berlin A.G., Markov A.V., Ankudimova N.V. Surface hydrophobic amino acid residues in cellulase molecules as a structural factor responsible for their high denim-washing perfomance Enzyme and Microbial Technology, 2000, vol. 27, p. 664-671.

8. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Markov A.V., Sinitsyna O.A., Ankudimova N.V., Berlin A.G. Study of protein adsorption on indigo particles confirms the existence of enzyme-indigo interaction sites in ccllulase molecules. Journal of Biotechnology, 2001, vol. 87, p. 83-90.

9. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Markov A.V., Sinitsyna O.A, Ankudimova N.V. Study of cellulase adsorption on indigo and cellulose. Abstracts of The Second International Symposium on Biotechnology in Textiles. April, 3-6,2002, Athens, Georgia, USA, p. 18.

10. Markov A.V., Gusakov A.V., Grishutin S.G., Semenova M.V., Kondratyeva E.G., Sinitsyn A.P. Viscometric method for assaying pectinase activity. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications", June 22-27,2002, Moscow, Russia, p.l 12.

11. Markov A.V., Grishutin S.G., Salanovich T.N., Kondratyeva E.G., Sinitsyn A.P. Cotton bioscouring by the different enzyme preparations. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2002: Fundamentals & Applications", June 22-27, 2002, Moscow, Russia, p. 112113.----

12. Гусаков A.B., Марков A.B., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 2002, т. 67, вып. 6, с. 815-822.

13. Гришутин С.Г., Дзедзюля Е.И., Марков А.В., Гусаков А.В., Синицын А.П. Поиск ксиланаз устойчивых к действию белковых ингибиторов пшеницы, ржи, ячменя и кукурузы. Материалы II Московского Международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября 2003, Москва, с. 200.

14. Марков А.В., Дзедзюля Е.И., Зоров И.Н., Гусаков А.В., Синицын А.П. Биоотбеливание целлюлозной пульпы современными ферментными препаратами. Материалы II Московского Международного Конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 10-14 ноября 2003, Москва, с. 205-206.

Принято к исполнению 20/11/2003 Исполнено 20/11/2003

Заказ № 447 Тираж'100 экз

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 ■т\г\у.аи1:огеГега1 ги

Qo2.4O

»20240

л

Список сокращений.

Введение.

I. Литературный обзор.

ГЛАВА 1. ПОЛИСАХАРИДЫ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ.

1.1. Микрофибриллярные полисахариды.

1.2. Полисахариды матрикса.

1.2.1. Гемицеллюлозы.

1.2.2. Пектины.

1.3. Р-Глюканы.

ГЛАВА 2. ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ TRICHODERMA REESEI.

2.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов Т. гееsei.

2.2. Получение генетически измененных штаммов Т. reesei.

ГЛАВА 3. СОСТАВ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ, ПРОДУЦИРЕМЫХ Т. REESEI.

3.1. Современные представления о механизме каталитического действия ^ карбогидраз.

3.2. Современные представления о классификации карбогидраз.

3.3. Структурная организация карбогидраз.

3.4. Ферментный комплекс Т. reesei.

3.4.1. Целлюлазы Т. reesei.

3.4.2. Гемицеллюлазы Т. reesei.

ГЛАВА 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КАРБОГИДРАЗ В РАЗЛИЧНЫХ 4fi

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ.

4.1. Использование ферментов для отбеливания целлюл ознобумажной пульпы.

4.2. Применение ферментов в текстильной промышленности.

4.2.1. Биоотварка хлопчатобумажных тканей.

4.2.2. Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий.

4.3. Использование ферментов в качестве кормовых добавок.

И. Экспериментальная часть.

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

5.1. Использованные вещества.

5.1.1. Ферментные препараты.

5.1.2. Субстраты и реактивы.

5.1.3. Хроматографические носители.

5.2. Методы.

5.2.1. Аналитические методы.

5.2.2. Выделение и очистка индивидуальных компонентов Т. ree.se/.

5.2.3. Определение активностей ферментов.

5.2.4. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов.^

5.2.5. Изучение рН- и термостабильности ферментов.

5.2.6. Исчерпывающий гидролиз полимерных субстратов под действием ферментов.

5.2.7. Ограниченный протеолиз ферментов папаином.

5.2.8. Определение адсорбционных характеристик ферментов.

5.2.9. Анализ молекулярно-массового распределения продуктов гидролиза ^ высокомолекулярных субстратов ферментами.

5.2.10. Оценка способности ферментов к биоотварке суровой хлопчатобумажной ^ ткани.

5.2.11. Оценка способности ферментов к биодепигментации окрашенной индиго ^ хлопковой ткани.

5.2.12. Оценка способности ферментов к биополировке окрашенной хлопковой ткани

5.2.13. Оценка способности ферментов к биоотбеливанию целлюлозной пульпы.

5.2.14. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной ^ активности пектиназ.

5.2.15. Оценка "кормовой" ценности ферментов.

III. Результаты и их обсуждение.

ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТНЫХ

КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ Т. ЯЕЕ8Е1.

6.1. Разработка экспресс-метода эффективного разделения ферментных ^ комплексов Т. гееэег на компоненты.

6.2. Сравнительный анализ компонентного состава препаратов мутантных ^ штаммов Т. гее^е/.

6.2.1. Генеалогия мутантов Т. ree.se/.

6.2.2. Сравнение компонентного состава различных ферментных препаратов Т. ree.se/ 1Ъ

6.2.3. Количественная оценка содержания ферментов в препаратах Т. геезе!.

6.2.4. Влияние условий ферментации на биосинтез ферментов Т. ree.se/.

6.3. Оптимизация препаративного метода выделения целлюлаз и гемицеллюлаз ^ Т. геезег.

ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ

СВОЙСТВА ВЫДЕЛЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ.

7.1. Физико-химические и биохимические свойства целлюлаз Т. геезег.

7.1.1. Биохимические характеристики и субстратная специфичность выделенных дд целлюлаз.

7.1.2. рН- и температурные оптимумы активности ферментов, стабильность, | устойчивость к термошоку.

7.1.3. Адсорбционная способность ферментов на МКЦ.

7.1.4. Ограниченный протеолиз ферментов папаином.

7.2. Физико-химические и биохимические свойства гемицеллюлаз Т. геезег.

7.2.1. Биохимические характеристики и субстратная специфичность выделенных j j 2 гемицеллюлаз.

7.2.2. рН- и температурные оптимумы активности ферментов, стабильность, j jg устойчивость к термошоку.

7.2.3. Адсорбционная способность ферментов на МКЦ.

7.2.4. Исчерпывающий гидролиз ксиланов ферментами.

7.3. Полигалактуроназа и экзо-Р-1,3-глюкозидаза Т. reesei.

ГЛАВА 8. ВЫЯВЛЕНИЕ КЛЮЧЕВЫХ "ТЕКСТИЛЬНЫХ" ФЕРМЕНТОВ Т. REESEI

8.1. Изучение способности ферментов к биодепигментации джинсовой ткани.

8.2. Изучение способности ферментов к биоотварке хлопчатобумажной ткани.

8.2.1. Оптимизация метода оценки способности ферментов к биоотварке j 37 хлопчатобумажной ткани.

8.2.2. Сравнение способности ферментных препаратов к биоотварке j 37 хлопчатобумажной ткани.

8.2.3. Разработка микрометода оценки способности ферментов к биоотварке хлопчатобумажной ткани.

8.2.4. Сравнение способности индивидуальных ферментов к биоотварке j хлопчатобумажной ткани и выявление ключевых ферментов.

8.3. Изучение способности ферментов к биополировке хлопчатобумажной ткани

8.3.1. Разработка миниметода оценки способности ферментов к биополировке.

8.3.2. Сравнение способности ферментных препаратов к биополировке.

8.3.3. Сравнение способности индивидуальных ферментов к биополировке и j выявление ключевых ферментов.

ГЛАВА 9. ВЫЯВЛЕНИЕ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ Т. REESEI,

ОТВЕТСТВЕННЫХ ЗА БИООТБЕЛИВАНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗНОЙ ПУЛЬПЫ

9.1. Сравнение способности ферментных препаратов к биоотбеливанию j ^7 целлюлозной пульпы.

9.2. Сравнение способности индивидуальных ферментов к биоотбеливанию ^^ целлюлозной пульпы и выявление ключевых ферментов.

ГЛАВА 10. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПОСОБНОСТИ ФЕРМЕНТОВ К УВЕЛИЧЕНИЮ ПИТАТЕЛЬНОЙ ЦЕННОСТИ КОРМОВ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ. 1'

10.1. Разработка in vitro тестов оценки способности ферментов к увеличению ^ ^ питательной ценности кормов.

10.1.1. Тест на основе анализа образования восстанавливающих Сахаров в ходе j ^ гидролиза природных кормов.

10.1.2. Применение вискозиметрического метода при изучении падения вязкости j ^7 экстракта ржи под действием ферментов.

10.2. In vitro "кормовые" испытания препаратов и индивидуальных ферментов на ^^ различных типах кормов.

10.2.1. Результаты теста с использованием анализа ВС.

10.2.2. Исследование изменения вязкости экстракта ржи под действием ферментных ] 73 препаратов и индивидуальных ферментов.

10.3. Влияние растительных ингибиторов на ксиланазы Т. reesei.

Выводы.

С писок литературы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты a-Gal - а-галактозидаза a-L-Ara - a-L-арабинофуранозидаза

СВН — целлобиогидролаза

EG — эндоглюканаза

EST - эстераза ехо-Р-1,3-Glu - экзо-Р-1,3-глюкозидаза

Man - маннаназа

PGU - полигалактуроназа

XG — ксилоглюканаза

X YL - ксиланаза

P-XYL - р-ксилозидаза

Прочие сокращения а.к. — аминокислота

ВС - восстанавливающие сахара

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГКА — гидрофобный кластерный анализ

ГПХ — гельпроникающая хроматография

ДЦС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

ИЭФ — изоэлектрофокусирование

КМЦ — карбоксиметилцеллюлоза

МКЦ — микрокристаллическая целлюлоза

ММР — молекулярно-массовое распределение

ОНФ-p-D-Xyl - о-нитрофенил-Р-О-ксилопиранозид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГУ — полигалактуроновая кислота (калиевая соль)

ПНФ-P-D-G - л-нитрофенил-Р-О-глюкопиранозид

ПНФ-P-D- G2 - л-нитрофенил-Р-О-целлобиозид

ПНФ-P-D-Lac - л-нитрофенил-Р-О-лактопиранозид

СП - степень полимеризации

ССД - субстратсвязывающий домен

ЦСД — целлюлозосвязывающий домен

История развития фундаментальных знаний о ферментах неразрывно взаимосвязана с разработкой и оптимизацией способов их практического использования. С одной стороны, открытие высокоселективных реакций, катализируемых специфическими ферментами, приводит к появлению новых промышленных процессов. С другой стороны, возрастающие потребности современных отраслей промышленности, а также необходимость внедрения экологически безопасных производственных схем, способствуют целенаправленному поиску новых ферментов. В течение последних 15 лет мировое производство промышленных ферментов выросло более чем в два раза, а объем их продаж превысил 1 млрд. долларов [1]. Среди используемых в современной биотехнологии ферментов целлюлазы и гемицеллюлазы, продуцируемые микроскопическими грибами, отличаются необычайно широким диапазоном применения.

Можно выделить следующие основные области применения целлюлаз и гемицеллюлаз: глубокая биоконверсия возобновляемого растительного сырья, позволяющая в конечном итоге получить топливо, кормовые и пищевые продукты; использование ферментов в пищевой промышленности в таких отраслях как виноделие, пивоварение, производство осветленных соков; использование ферментов в качестве добавок к кормам животных и птиц; биополировка и биоотварка текстильных изделий, приводящие к умягчению их поверхности, а также увеличению их смачиваемости; ферментативная "отварка" (биодепигментация) хлопчатобумажных и льняных изделий, сопровождающаяся изменением их цветности; биоотбеливание целлюлозной массы в целлюлознобумажном производстве, позволяющее уменьшить вредные выбросы хлорных производных разложения лигнина и сократить расход хлора.

Несмотря на широкие возможности и перспективы применения как с экономической, так и с экологической точек зрения, масштабы использования ферментных комплексов, продуцируемых микроскопическими грибами, во многом не соответствуют громадному потенциалу заложенному в них. В значительной степени это объясняется двумя причинами: во-первых, фундаментальные знания о механизмах действия ферментов в сложных мультиферментных системах, продуцируемых микроскопическими грибами недостаточны, это лишает специалистов возможности предсказывать и управлять поведением этих систем при использовании ферментов. Во-вторых, применение целлюлаз и гемицеллюлаз в разных отраслях промышленности часто связано с потребностью к диаметрально отличным типам воздействия на субстрат и предъявляет различные требования к свойствам компонентов, определяющих действие комплекса в целом, поэтому каждое направление применения требует создания ферментных комплексов с определенным компонентным составом. В связи с этим эффективная реализация любого из вышеперечисленных ферментативных процессов с участием целлюлаз и гемицеллюлаз невозможна без выявления компонентов, играющих ключевую роль при практическом использовании ферментных препаратов, детального изучения физико-химических и биохимических свойств данных компонентов, а также оценки их вклада в действие ферментного комплекса в целом.

Среди продуцентов микроскопических грибов, секретирующих целлюлазы и гемицеллюлазы, Тгккос^егта гее$е1 занимает ведущую роль. Это обусловлено высокой секреторной способностью данного продуцента, а также разнообразием продуцируемых ферментов с различной субстратной специфичностью, что делает его универсальным объектом для использования по различным направлениям, а также для выделения и исследования свойств индивидуальных ферментов.

Целью настоящей работы являлось исследование компонентного состава новых ферментных комплексов на основе мутантных штаммов Т. геезе'1, сравнение в лабораторных условиях их эффективности при практическом применении в различных биотехнологических процессах, выявление ферментов, играющих ключевую роль в данных процессах, изучение их физико-химических и биохимических свойств, а также определение их вклада в эффективность действия ферментного комплекса в целом. Среди широкого спектра различных промышленно значимых процессов с участием ферментных комплексов Т. геезег в данной работе для детального изучения были выбраны следующие: биодепипментация, биоотварка и биополировка хлопчатобумажных тканей, биоотбеливание целлюлозной пульпы, использование ферментов в качестве кормовых добавок. Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

Разработать эффективный и экспрессный метод сравнения компонентного состава ферментных комплексов Т. геезег.

Исследовать с помощью данного метода компонентный состав ферментных препаратов на основе мутантных штаммов Т. гее$е1, изучить влияние условий ферментации на компонентный состав получаемых ферментных препаратов. Разработать и оптимизировать способ препаративного выделения и очистки индивидуальных компонентов выбранных ферментных комплексов. Исследовать физико-химические и биохимические свойства выделенных ферментов.

Разработать методики оценки в лабораторных условиях эффективности действия ферментов и препаратов при практическом применении их в процессах биодепигментации, биоотварки и биополировки хлопчатобумажной ткани, биоотбеливания целлюлозной пульпы, а также при использовании ферментов в качестве кормовых добавок.

На основе предложенных методик провести исследование препаратов Т. геевег и их индивидуальных компонентов с целью сравнения эффективности их действия по указанным выше направлениям.

На основе данных о компонентном составе оценить вклад индивидуальных компонентов в эффективность действия ферментного комплекса в целом; определить взаимосвязь между компонентным составом и высокой эффективностью применения тех или иных ферментных препаратов в указанных выше биотехнологических процессах.

выводы

1. Разработан эффективный и экспрессный метод определения компонентного состава внеклеточных ферментных комплексов, продуцируемых штаммами Т. reesei. С помощью этого метода исследован компонентный состав ряда лабораторных и промышленных ферментных препаратов на основе мутантных штаммов Т. reesei. Установлено наличие модифицированных форм целлюлаз, не содержащих ЦСД (mod. EG I, mod. EG II, mod. CBH I), в препаратах, продуцируемых некоторыми мутантными штаммами Т. reesei. Предложена схема препаративного разделения ферментных комплексов, позволившая выделить все основные целлюлазы (EG I, EG II, EG III, CBH I, CBH И) и гемицеллюлазы (XYLI, XYL II, ß-XYL, a-L-Ara), а также exo-ß-1,3-Glu и PGU Т. reesei.

2. Изучено влияние условий ферментации на компонентный состав ферментных комплексов Т. reesei. Показано, что препараты Т. reesei по особенностям ферментационного процесса (состав ферментационной среды, pH и температура ферментации) могут быть разбиты на две группы: "целлюлазные" и "ксиланазные". Установлено существенное различие в содержании отдельных ферментов в "целлюлазных" и "ксиланазных" препаратах.

3. Изучены биохимические и физико-химические свойства всех выделенных ферментов (Mr, pl, температурный и рН-оптимумы действия, стабильность в различных условиях, адсорбционая способность, кинетика исчерпывающего гидролиза полимерных субстратов). Обнаружен синергизм при совместном действии на арабиноксилан эндоксиланаз, с одной стороны, a-L-Ara и ß-XYL с другой, а также антагонизм при совместном действии на глюкуроноксилан некоторых эндоксиланаз и a-L-Ara.

4. Разработаны лабораторные методы оценки способности ферментов к биоотварке и биоополировке хлопчатобумажных тканей, а также in vitro "кормовые" тесты, позволяющие сравнивать способность ферментов к увеличению питательной ценности кормов.

5. Выявлены ключевые ферменты, обладающие наибольшей эффективностью действия при ферментативной обработке текстильных изделий (в процессах биодепигментации джинсовой ткани - EG II, EG III, CBH II, биоотварки суровой хлопчатобумажной ткани - EG II, CBH II и PGU, биополировки текстильных материалов — EG III, EG II, EG I и CBH II). Оценен вклад каждого из ферментов в эффективность действия ферментных препаратов.

6. Установлено, что ключевым ферментом "целлюлазных" препаратов Т. reesei, определяющим их способность к биоотбеливанию целлюлозной пульпы при рН 5 является EG I, "ксиланазных" — XYL II. При рН 7,5 биоотбеливающая способность всех препаратов Т. reesei обусловлена действием XYL II.

7. В результате проведения in vitro "кормовых" тестов выявлено, что эффективность ферментных препаратов при использовании их в качестве кормовых добавок определяется двумя факторами. С одной стороны, ферменты, входящие в состав данных препаратов, должны обладать способностью к существенному гидролизу некрахмальных полисахаридов, с другой - быть устойчивыми к действию ингибиторов, содержащихся в кормовых злаках. Даны рекомендации по применению конкретных ферментных препаратов на основе Т. reesei в кормовых рационах, содержащих в качестве основных питательных компонентов пшеницу, пшеничные отруби, ячмень, рожь.

1. Uhlig Н.: Industrial enzymes and their applications. A Wiley-Interscience Publication. John Willey & Sons, Inc., 1998,454 p.

2. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение в биохимию растений. Москва, изд-во "Мир", 1986, 387 с.

3. Coughlan М.Р., Hazlewood G.P. Hemicellulose and Hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London and Chapel Hill., 1993, v. IV, 120 p.

4. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое B.M.: Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов: Учебное пособие. Москва, изд-во МГУ, 1995,224 с.

5. Целлюлоза и ее производные. Под ред. Байклза Н. и Сегала JI. Москва, изд-во "Мир", 1974,486 с.

6. Роговин З.А. Химия целлюлозы. Москва, 1972, 519с.

7. Stephen A.M. Food polysaccharides and their applications. Marcel Dekker, Inc., 1995,654 p.

8. Scalbert A., Monties В., Lallemand J.Y., Guitted E., Rolando C.: Ether linkage between phenolic acids and lignin fractions from wheat straw. Phytochemistry, 24 (1985) p. 1359-1362

9. Дзедзюля Е.И. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Москва, МГУ, 2000, 117с.

10. Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P.J., Curzon E.H.: Linkage of p-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccharides of barley straw. Carbohydr. Res. 148 (1986) p. 71-85.

11. Синицына O.A. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, МГУ, 2002, 182с.

12. McNeil М., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants. Ann. Rev. Biochem., 1984, v.53, 625 p.

13. Dey P.M., Brinson K. Plant cell walls. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 1984, v. 42,265 p.

14. Rombouts F.M., Thibault J.F. Feruloylated pectic substances from sugar beet pulp. Carbohydr. Res., 1986, v. 154, p. 177-187.

15. Fry S.C. Phenolic components of the primary cell wall. Biochem. J., 1985, v. 203, p. 493-504.

16. Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Иванча Л.Н., Горбач В.И.: Получение и использование антител к биологически активному 1,3; 1,6-Р-0-глюкану — трансламу. Биотехнология, 6 (2000), с. 3-10.

17. Pitson S.M., Seviour R.J., McDougall В.М. Noncellulolytic fungal p-glucanases: Their physiology and regulation. Enzyme Microb. Technol., 15 (1993), p. 178192.

18. Akiyama Т., Shibraya N., Hrmova M., Fincher G.B. Purification and characterization of (l-+3)-p-D-glucan endohydrolase from rice (Oryza sativa) bran. Carbohydr. Res., 297 (1997), p. 365-374.

19. Palace G.P., Phoebe C.H. jr. Quantitative determination of amino acid levels in neutral and glucosamine-containing carbohydrate polymers. Anal. Biochem., 244 (1997), p. 393-403.

20. Грачева И. M., Кривова А. Ю. Технология ферментных препаратов. Москва, изд-во Элевар, 2000, стр. 13-288.

21. Biotechnology, vol. 7а, VCH, 1987, р. 65-216.

22. Кислухина О., Кюдулас И. Биотехнологические основы переработки растительного сырья. Каунас, изд-во Технология, 1997, с. 73-169.

23. Laukevics J. J., Apsite A. F., Viesturs H. E., Tengerdy R. P. Solid-substrate fermentation of wheat straw to fungal protein. Biotechnol. Bioeng., 26 (1984), p. 14651470.

24. Toyama N., Ogawa K. Cellulase production of Trichoderma viride in solid and submerged culture methods. Bioconvers. Cellul. Subst. Energy Chem. Microb. Protein Symp. Proc. (1st) (1978), p. 305-327.

25. Chanal D. S. Solid-state fermentation with Trichoderma reesei for cellulase production. Appl. Environ. Microbiol., 49 (1985), p. 205-212.

26. Deschamps F., Giuliano C., Asther M., Huet M. C., Roussos S. Cellulase production by Trichoderma harzianum in static and mixed solid-state fermentation reactors under non-aseptic conditions. Biotechnol. Bioeng., 27 (1985), p. 1385-1393.

27. Alazard, D., Raimbault M. Comparative study of amylolytic enzyme production by Aspergillus niger in liquid and solid-state cultivation. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 12 (1981), p. 113-117.

28. Deschamps, F., Huet M. C. p-Glucosidase production by Aspergillus phoenicis in solid state fermentation. Biotechnol. Lett., 6 (1984), p. 55-62.

29. Silman R. W. Enzyme formation during solid-substrate fermentation in rotating vessels. Biotecnol. Bioeng., 22 (1980), p. 411-418.

30. Pastore G. M., and Park Y. K. Purification and characterization of (i-galactoidase from Scopulariopsis sp. J. Ferment. Technol., 58 (1980), p.79-85.

31. Cayle T. Treating Lactase Deficiency with an active Lactase. U.S. Patent 3718739 {1973).

32. Macris B. J. Production of extracellular lactase from Fusarium moniliforme. Eur. J. Appl. Microbiol. Bio technol., 13 (1981), p.161-167.

33. Frost, G. M. Commercial production of enzymes. In "Developments in Food Proteins 4". Elsevier Applied Science Publishers, London, 1986, p. 57-134.

34. Pirt S. J. The theory of feed batch culture with reference to the penicillin fermentation. J. Appl. Chem. Biotechnol., 24 (1974), p. 415-422.

35. Dunn I., J., Mor J.-R. Variable volume continuous cultivation. Biotechnol. Bioeng., 17 (1975). p. 1805-1817.

36. Watson T. G., Nelligan I., Lessing L. Cellulase production by Trichoderma reesei (RUT C-30). Biotechnol. Lett., 5 (1984), p. 25-37.

37. McLean D., Podruzny M. F. Further support for feed-batch production of cellulases. Biotechnol. Lett., 7 (1985), p. 683-687.

38. Gottvaldova M., Kucera J., Podrazky V. Enhancement of cellulase production by Trichoderma viride using carbon/nitrogen double feed-batch. Biotechnol. Lett., 41982), p.229-240.

39. Allen A. L. Enzymic hydrolysis of cellulose to fermentable sugars. In "Liquid Fuel Developments". CRC Press, Boca Raton, Florida, (1983), p. 49-64.

40. Hendy N. A., Wilke C. R., Blanch H. W. Enhanced cellulase production in feed-batch culture of Trichoderma reesei RUT-C30. Enzyme Microbiol. Technol., 6 (1984), p.73-77.

41. Andren R.K., Nystrom J. M. Pilot-scale production of cellulase and enzymatic hydrolysis of waste cellulose. AIChE Symp. Ser., 72 (1976), p. 91-95.

42. Sternberg, D. Production of cellulase by Trichoderma. In "Enzymatic Conversion of Cellulosic Materials: Technology and Applications". Biotechnol. Bioeng. Symp. No. 6. Wiley Interscience, New York, 1976, p. 35-53.

43. Warzywoda M., Ferre V. Pourquie J. Development of culture medium for large-scale production of cellulolytic enzymes by Trichoderma reesei. Biotechnol. Bioeng., 251983), p. 3005-3018.

44. Tangnu S. K., Blanch H. W., Wilke C. R. Enhanced production of cellulase, hemicellulase and P-glucosidase by Trichoderma reesei RUT-C30. Biotechnol. Bioeng., 23 (1981), p. 1837-1845.

45. Ryu D., Mandels M. Cellulases: byosynthesis and applications. Enzyme Microb. Technol., 2(1980). p. 91-115.

46. Robinson P. D. Cellulase and xylanase production by Trichoderma reesei RUT-C30. Biotechnol. Lett., 6 (1984), p. 119-128.

47. Beguin P. Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol., 1990, v. 44, p. 219-248.

48. Beguin P., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C. Jr., O'Neill G.P., Warren R.A.J. Cloning of cellulase genes. CRC Critical Reviews in Biotechnology, 1987, v. 6, Issue 2, p. 129-163.

49. Vinzant T.B., Adney W.S., Decker S.R., Baker J.O., Kinter M.T., Sherman N.E., Fox J.W., Himmel M.E. Fingerprinting Trichoderma reesei Hydrolases in a Commercial Cellulase Preparation. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2001, v. 9193, p. 99-107.

50. Nevalainen H., Penttila M. In: "The Mycota II Genetics and Biology", Springer-Verlag, Berlin, 1995, p. 303-319.

51. US Patent No. 5,419,778 (Genencor patent).

52. Niku-Paavola M.-L., Lappalainen A., Enary T.-M., Nummi M. Biochem. J., 1985, v. 231, p. 75-81.

53. Karlsson J., Saloheimo M., Siika-aho M., Tenkanen M., Penttila M., Tjerneld F. Homologous expression and characterization of Cel61A (EGIV) of Trichoderma reesei. Eur. J. Biochem., 2001, v. 268, p. 6498-6507.

54. Poutanen K. An a-L-arabinofuranosidase of Trichoderma reesei. Journal of Biotechnology, 1988, v. 7, p. 271-282.

55. Margolles-Clark E., Ilmen M., Penttila M. Expression patterns of ten hemicellulase genes of the filamentous fungus Trichoderma reesei on various carbon sources. Journal of Biotechnology, 1997, v. 57, p. 167-179.

56. Torronen A., Rouvinen J. Structural comparison of two major endo-1,4-xylanases from Trichoderma reesei. Biochemistry, 34 (1995), p. 847-856.

57. Torronen A., Mach R.L., Messner R., Gonzalez R., Kalkkinen N., Harkki A., Kubicek C.P.The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes. Biotechnology, 10 (1992), p. 1461-1465.

58. Torronen A., Harkki A., Rouvinen J. Three-dimensional structure of endo-1,4-beta-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site. EMBOJ., 13 (1994), p. 2493-2501.

59. Macarron R., van Beeumen J., Henrissat B., de la Mata I., Claeyssens M. Identification of an essential glutamate residue in the active site of endoglucanase III from Trichoderma reesei. FEBS Lett., 316 (1993), p. 137-140.

60. Herrmann M.C., Vrsanska M., Jurikova M., Hirrsch J., Biely P., Kubicek C.P. The p-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional p-D-xylan xylohydrolase. Biochem. J., 1997, v. 321, p.375-381.

61. Saloheimo M., Nakari-Setala T., Tenkanen M., Penttila M.cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast. Eur. J. Biochem., 249 (1997), p. 584-591.

62. Divne C., Stahlberg J., Reinikainen T., Ruohonen L., Pettersson G., Knowles J.K., Teeri T.T., Jones T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science, 265 (1994), p. 524-528.

63. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science, 249 (1990), p. 380-386.

64. Takasshima S., Nakamura A., Hidaka M., Masaki H., Uozumu T. Molecular cloning and expression of the novel fungal beta-glucosidase genes from Humicola grisea and Trichoderma reesei. J. Biochem., 0 (1999).

65. Mach R.L. Submitted (MAY-1994) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.71. http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/

66. Saloheimo M., Nakari-Setala T., Tenkanen M., Penttila M. cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast Eur. J. Biochem., 249 (1997), p. 584-591.

67. Sabine E., Schubert H., Murshudov G., Wilson K.S., Siika-Aho M., Penttila M. The three-dimensional structure of a Trichoderma reesei beta-mannanase from glycoside hydrolase. Acta Crystallogr., D, 2000, v. 56, No. 3, p. 367-380.

68. Sandgren M., Shaw A., Ropp T.H., Bott S.WU,R. Cameron A.D., Stahlberg J., Mitchinson C., Jones T.A. The X-Ray crystal structure of the Trichoderma reesei family 12 endoglucanase Cell2A at 1.9 A resolution. J.Mol.Biol., 2001, v. 308, p.295-302.

69. Margolles-Clark E., Tenkanen M., Luonteri E., Penttila M. Three alpha-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expression in yeast. Submitted (JAN-1996) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases.

70. F.Van Petegem, H.Contreras, R.Contreras, J. Van Beeumen. Trichoderma reesei alpha-1,2-Mannosidase. J.Mol.Biol, 2001, v. 312, p.157-163.

71. Margolles-Clark E, Saloheimo M, Siika-aho M, Penttila M. The alpha-glucuronidase-encoding gene of Trichodermareesei. Gene, 1996; 172(1): 171-2.

72. Margolles-Clark E., Tenkanen M., Soderlund H., Penttila M. Acetyl xylan esterase from Trichoderma reesei contains an active-site serine residue and a cellulose-binding domain. Eur. J. Biochem. 237 (1996), p. 553-560.

73. Hakulinen N., Tenkanen M., Rouvinen J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of the catalytic core of acetyl xylan esterase from Trichoderma reesei. Acta Crystallogr., D 54,1998, p. 430-432.

74. Shoemaker S., Sweickart V., Ladner M., Geldfand D., Kwok S., Myambo K. and Innis M. Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology, 1983, v. 1, p. 691-696.

75. Chen C.M., Oritzali M., Stafford D.W. Nucleotide sequence and deduced primary structure of cellobiohydrolase II of Trichoderma reesei. Bio/Technology, 1987, v. 5, p. 274-278.

76. Teeri T.T., Lehtovaara P., Kauppinen S., Salovuori I., Knowles J. Homologous domains in Trichoderma reesei cellulolytic enzymes: gene sequence and expression of cellobiohydrolase II. Gene, 1987, v. 51, p. 43-52.

77. Penttila M., Lehtovaara P., Nevalainen H., Bhikhabhai R., Knowles J. Homology between cellulase gene of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene. Gene, 1986, v. 45, p. 253-263.

78. Ward M., Wu S., Dauberman J., Weiss G., Larenas E., Bower B., Rey M., Clarkson K., Bott R. Cloning, sequence and preliminary structural analysis of a small, high pi endoglucanase III (EG III) from Trichoderma reesei. In: "Proceeding of the second

79. TRICEL symposium on Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases ", v. 8, Espoo, Finland, 1993, p. 153-158.

80. Suurnakki A., Oksanen T., Linder M., Niku-Paalova M.-L., Tenkanen M., Siika-aho M., Viikari L., Buchert J. Action and effects of cellulase domains on cellulosic fibres. Appl. Environ. Microbiol., 62 (1996), p. 3840-3846.

81. Saloheimo A., Henrissat В., Hoffren A.-M., Teleman O., Penttila M. A novel small endoglucanase gene egl5 from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast. Mol. Microbiol., 1994, v. 13, p. 219-228.

82. Srisodsuk M. Mode of action of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I on crystalline cellulose. VTTPublicatons, Espoo, 1994,107 p.

83. Берлин A.X. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Pénicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, МГУ, 1999, с. 179.

84. Vincken J.-P., Beldman G., Voragen A.G.J. Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? Carbohydrate Research, 1997, v. 298, p. 299-310.

85. Karlsson J., Siika-aho M., Tenkanen M., Tjerneld F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. Journal of Biotechnology, 2002, v. 99, p. 63-78.

86. Goyal A., Ghosh В., Eveleigh D. Characteristics of fungal cellulase. Bioresource Technol., 1991, v. 36, p. 37-50.

87. Chanzy H., Henrissat В., Yuong R., Schulein M. The action of 1,4-p-D-glucan-cellobiohydrolase on Valonia cellulose microcrystals. An electron microscopic study. FEBS Lett., 1983, v. 153, p. 113-118.

88. Henrissat В., Drigves H., Viet C., Schulein M. Synergism of cellulase from Trichoderma reesei in the degradation of cellulose. Bio/Technol., 1985, v. 3, p. 722-726.

89. Claessens M., Tomme P., Brewer C.F., Henre E.J. Stereochemical course of hydrolysis and hydration reactions catalysed by cellobiohydrolases I and II from Trichoderma reesei. FEBS Lett., 1990, v. 263, p. 89-92.

90. Van Tilbeurgh H., Claessens M. Detection and differentiation of cellulase components using low molecular mass fluorogenic substrates. FEBS Lett., 1985, v. 198, p. 283-288.

91. Knowles J. К. C., Lehtovaara P., Penttila M., Saloheimo M. Stereochemical course of the action of the cellobioside hydrolases I and II of Trichoderma reesei. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1988, p. 1401-1402.

92. Claessens M., van Tilbeurgh H., Tomme P., Wood T.M., McCrae S.I. Comparison of the spécificités of the cellobiohydrolases isolated from Pénicillium pinophilium and Trichoderma reesei. Biochem. J., 1989, v. 261, p. 819-825.

93. Bhikhabhai R., Johansson G., Petterson G. Isolation of cellulotic enzymes from Trichoderma reesei QM9414. J. Appl. Biochem., 1984, v. 6, p. 336-345.

94. Chanzy H., Henrissat B. Undirectional degradation of Valonia cellulose microcrystals subjected to cellulase action. FEBS Lett., 1985, v. 184, p. 285-288.

95. Biely P., Vrsansksa M., Claeyssens M. The endo-l,4-P-glucanase I from Trichoderma reesei. Action on p-l,4-oligomers and polymers derived from D-glucose and D-xylose. Eur. J. Biochem., 1991, v. 200, p. 157-163.

96. Claeyssens M., Aerts G. Characterization of cellulolytic activities in commercial Trichoderma reesei preparations: an approach using small, chromogenic substrates. Bioresource Technol., 1992, v. 39, p. 143-146.

97. Niku-Paavola M.-L., Lappalainen A., Enary T.-M., Nummi M. A new appraisal of the endoglucanases of the fungus Trichoderma reesei. Biochem. J., 1985, v. 231, p. 75-81.

98. Macarron R., van Beeumen J., Henrissat B., de la Mata I., Claeyssens M. Identification of an essential glutamate residue in the active site of endoglucanase III from Trichoderma reesei. FEBS Lett., 1993, v. 316, p. 137-140.

99. Fowler T., Grizali M., Brown R.D. Regulation of the cellulase gene of Trichoderma reesei. In: "Proceeding of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases", v. 8, Espoo, Finland, 1993, p. 199-210.

100. Tenkanen M., Puis J., Poutanen K. Two major xylanases of Trichoderma reesei. Enzyme Microb. Technol., 1992, v. 14, p. 566-573.

101. Biely P. Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-P-l,4-xylanase families: differences in catalytic properties. Journal of Biotechnology, 1997, v. 57, p. 151166.

102. KubicekC.P., Zeilinger S., Mach R.L., Strauss J. Regulaion of xylanase gene expression in Trichoderma. In: "Proceeding of the third TRICEL symposium on Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases", Ghent, Belgium, 1997, p. 274-279.

103. Gomes M., Isorna P., Rojo M., Estrada P. Kinetic mechanism of p-xylosidase from Trichoderma reesei QM 9414. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, v. 16, p. 7-15.

104. Hagglund P., Eriksson Т., Collen A., Nerinckx W., Claeyssens M., Stalbrand

105. H. A cellulose-binding module of the Trichoderma reesei (5-mannanase Man5A increases the mannan-hydrolysis of complex substrates. Journal of Biotechnology, 2003, v. 101, p. 37-48.

106. Tenkanen M., Makkonen M., Perttula M., Viikari L., Teleman A. Action of Trichoderma reesei mannanase on galactoglucomannan in pine kraft pulp. Journal of Biotechnology, 1997, v. 57, p. 191-204.

107. Shabalin K., Kulminskaya A., Savel'ev A., Shishlyannikov S., Neustroev K. Enzymatic properties of a-galactosidase from Trichoderma reesei in the hydrolysis of galactooligosaccharides. Enzyme and Microbial Technology, 2002, v. 30, p. 231-239.

108. Качурин А., Протасеня С., Шабалин К., Исаев-Иванов В., Голубев А., Неустроев К. Остатки триптофана в а-галактозидазе из Trichoderma reesei. Биохимия, 1998, т. 63, вып. 10, с. 1391-1399.

109. Torronen A., Harkki A., Rouvinen J. Three-dimensional structure of endo1.4-p-xylanase II from Trichoderma reesei two conformational states in the active site. EMBOJ., 13 (1994), p. 2493-2501.

110. Ooshima H., Kurakake M., Kato I. Enzymatic activity of cellulase adsorbed on cellulose and its change during hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol., 31 (1991), p. 253-266.

111. Kulkarni N., Shendey A., Rao N. Molecular and biotechnological aspects of xylanases. FEMS Microbiol. Rev., 23 (1999), p. 411-456.

112. Tull D., Withers S.G.: A detailed kinetic study of the exo-P-1,4-glycanase from Cellulomonasfimi. Biochemistry, 33 (1994), p. 6363-6370.

113. SinnotM.L.: Catalytic mechanizm of enzymatic glycosyl transfer. Chem. Rev., 90 (1990), p. 1171-1202.

114. Legler G. Glycosyde hydrolases: mechanistic information from studies with reversible and irreversible inhibitors. Adv. Carb. Chem. Biochem., 48 (1990), p. 319-385.

115. Henrissat B., Claeyssens M., Tomme P., Lemessle L., Mornon J.P. Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis. Gene, 81 (1989), p. 83-95.

116. Gilkes N.R., Henrissat B., Kilburn D.G. Domains in microbal P-l,4-glycanase: Sequence conservation, function and enzyme families. Microbiol. Rev., 55 (1991), p. SOS-SIS.

117. Henrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 293 (1993), p. 781-788.

118. Okada H., Mori K., Tada K., Nogawa M., Morikawa Y. Identification of active site carboxylic residues in Trichoderma reesei endoglucanase Cell2A by site-directed mutagenesis. J. Mol. Cat, 10 (2000), p. 249-255.

119. Reese E.T., Levinson H.S. J. Bacteriology, 59 (1950), p. 485-497.

120. Beguin P. Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol. 44 (1990), p. 219-248.

121. Durand R., Rascle C., Fevre M. Molecular characterization of Xyn 3, a member of the endoxylanase multigene family of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix frontalis. Curr. Genet., 30 (1996), p. 531-540.

122. Zhang J.X., Martin J., Flint H.J. Identification of noncatalytic conserved regions in xylanases encoded by the Xynb and Xynd genes of the cellulolytic rumen anaerobe Ruminococcus flavefaciens. Mol. Gen. Genet., 245 (1994), p. 260-264.

123. Matuschek M., Sahm K., Zibat A., Bahl H.: Characterization of genes from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM-1 thet encode two glycosyl hydrolases with conserved S-layer-like domains. Mol. Gen. Genet. 252 (1996), p. 493-496.

124. Van Tillbeurgh H., Tomme P., Claeyssens M. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. FEBS Lett., 201 (1986), p. 223-227.

125. Bray M.R., Johnson P.E., Gilkes N.R., Mcintosh L.P., Kilbern D.G., Warren R.A. Probing the role of tryptophan residues in a cellulose-binding domain by chemical modification. Protein Sci., 5 (1996), p. 2311-2318.

126. Linder M., Nevanen T., Teeri T.T. Design of a pH-dependent cellulose-binding domain. FEBSLett., 447 (1999), p. 13-16.

127. Ong E., Greenwood J.M., Gilkes N.R.: The cellulose binding domains of cellulases: tools for biotechnology. TIBTECH., 7 (1989), p. 239-243.

128. Buchert J., Tenkanen M., Kantelinen A., Viikari L. Application of xylanases in the pulp and paper industry. Bioresourse Techno!., 1994, v. 50, p. 65-72.

129. Viikarri L., Ranua M., Kantelinen A., Linko M., Sundquist J. Bleaching with enzymes. In: "Biotechnology in the pulp and paper industry". Proc. 3rd Int. Conf., p. 6769.

130. Paice M., Gurnagul N., Page D.H., Jurasek L. Mechanism of hemicellulose-direct prebleaching of kraft pulps. Enzyme Microbiol. Technol., 1992, v. 14, p. 272-276.

131. Patel R.N., Grabski A.C., Jeffries T.W. Chromophore release from craft pulp by purified Streptomices roseiscleroticus xylanases. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, v. 39, p. 405-412.

132. Elegir G., Sykes M., Jeffries T.W. Differential and synergistic action of Streptomices endoxylanases in prebleaching of kraft pulps. Enzyme Microbiol. Technol.,1995, v. 17, p. 954-959.

133. Jeffries T.W. Conserved motifs in xylanases for pulp bleaching. IBCs Third Annual Symposium on Commercial enzymes, March 23-24, Wyndham Emerald Plasa, San Diego, CA, 1998, p. 212-218.

134. Buchert J., Ranua M., Kantelinen A., Viikari L. The role of two Trichoderma reesei xylanases in the bleaching of pine kraft pulp. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, v. 37, p. 825-829.

135. Buchert J., Ranua M., Siika-Aho M., Pere J., Viikari L. Trichoderma reesei cellulases in the bleaching of kraft pulp. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, v. 40, p. 941945.

136. Buchert J., Teleman A., Haijunpaa V., Tenkanen M., Viikari L., Vuorinen T. Effect of cooking and bleaching on the structure of xylan in conventional pine kraft pulp. TappiJ., 1995, v. 78, p. 125-130.

137. Godfrey T., West S. Industrial enzymology, second edition. Macmillan Press,1996, p. 69-382.

138. Кричевский Г.Е. Прошлое, настоящее и будущее биотехнологий в отделке текстильных материалов и смежных отраслях. Текстильная химия, 1998, №2 (14), с. 41-57.

139. Кричевский Г.Е., Корчагин М.В., Сенахов А.В. Химическая технология текстильных материалов. Легпромбытиздат., 1985, 640 с.

140. Гусаков А.В., Синицын А.П. О механизме действия ферментов-целлюлаз на текстильные материалы: взгляд энзимологов. Текстильная химия, 1998, №2 (14), с. 68-72.

141. Li Y., Hardin I.R. Enzymatic scouring of cotton: effect on structure and properties. Textile chemists and colorist, 1977, v. 2, No. 8, p. 71-76.

142. Husain P., Lange N.K., Henderson L., Lin J., Condon B. Biopreparation a new industrial enzyme process. In:" Book of papers, AATCC conf, " October 12-15, 1999, p. 170-182.

143. Hartzell M.M., Hsieh Y.-L. Enzymatic scouring to improve cotton fabric wettability. Textile Res. J., 1998, v. 68, №4, p. 233-241.

144. Гришутин С.Г., Гусаков А.В., Синицын А.П., Кричевский Г.Е., Тиматков А.Г., Барышева Н.В. Биоотварка хлопчатобумажных изделий. Текстильная химия. Специальный выпуск РСХТК, 2000, №2 (18), с. 65-70.

145. Li Y., Hardin I.R. Enzymatic scouring of cotton — surfactans, agitation and selection of enzymes. Textile chemists and colorist., 1998, v. 30, No. 10, p. 23-29.

146. Etters J.N. Cotton preparation with alkaline pectinase: an environmental advance. Textile chemists and colorist., 1999, v. 1, No. 3, p. 33-36.

147. Sawada K., Tokino S., Ueda M., Wang X.Y. Bioscouring of cotton with pectinase enzyme. JSDC, 1998, v. 114, p. 333-336.

148. Hsieh Y.-L., Cram L. Proteases as Scouring Agents for Cotton. Textile Res. J., 1999, v. 69, No. 8, p. 590-597.

149. Durden D.K., Etters J.N., Sarkar A.K., Henderson L.A., Hill J.E. Advances in Commercial Biopreparation of Cotton with Alkaline Pectinase. AATCC Review, 2001, v. 1, No. 8, p. 28-31.

150. Takagishi Т., Yamamoto R., Kikuyama K., Arakawa H. Design and Applicaton of Continuous Bio-Scouring Machine. AATCC Review, 2001, v. 1, No. 8, p. 3234.

151. Bhat M.K. Cellulases and related enzymes in biotechnology. Biotechnology Advances, 2000, v. 18, pp. 355-383.

152. Гусаков A.B., Попова H.H., Берлин A.X., Синицын А.П. Сравнение осахаривающей и тополитической активности различных препаратов целлюлаз. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, т. 35, № 2, с. 137-140.

153. Cavaco-Paulo A., Almeida L. Hydrolysis of Cotton Cellulose by Engineered Cellulases from Trichoderma reesei. Textile Research Journal, 1998, v. 68, No. 4, p. 273280.

154. Miettinen-Oinonen A., Heikinheimo L., Buchert J., Morgado J., Almeida L., Ojapalo P., Cavaco-Paulo A. Role of Trichoderma reesei cellulases in finishing of cotton. In:" Book of papers, AATCC conf ", October 12-15,1999, p. 70-76.

155. Heikinheimo L., Cavaco-Paulo A., Nousiainen P., Siika-aho M., Buchert J. Treatment of cotton fabrics with purified Trichoderma reesei cellulases. JSDC, 1998, v. 114, p. 18-22.

156. Liu J., Otto E., Lange N.K., Husain P., Condon B. Bio-Polishing of cotton knit: from multicomponent cellulase complex to mono-component. In: "Book of papers, AATCC conf", 1998, p. 4450-454.

157. Lange N.K. Application of cellulases in the textile industry. In: Proceeding of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases, 1993, v. 8, p. 263-272.

158. Кислухина O.B. Ферменты в производстве пищи и кормов. Москва. ДеЛи принт, 2002, с. 335.

159. Супрунов Д. Обогащение комбикормов ферментным комплексом для цыплят-бройлеров. Комбикорма, 2000, №1, с. 47-48.

160. Bedford M.R. Exogenous enzymes in monogastric nutrition — their current value and future benefits. Animal Feed Science and Technology, 86 (2000), p. 1-13.

161. Annison G., Choct M. Anti-nutritive activities of cereal non-starch polysacharides in broiler diets and strategies minimizing their effect. World's Poultry Science Journal, 1991, v. 47, p. 164-172.

162. Jroch H., Danicke S., Brutan J. The influence of enzyme preparations on the nutritional value of cereals in poultry. A review. Journal of Animal and Feed Science, 1995, v. 4, p. 263-285.

163. Carre В., Lessire M., Nguyen Т.Н., Larbier M. Effect of enzymes on feed efficiency and digestibility of nutrient in broilers. Proceedings of 19 World's Poultry Congress, Amsterdam, 1992, v.3, p. 411-415.

164. Campbell G.L., Bedford M.R. Enzyme applications for monogastric feeds. A review. Canadian Journal of Animal Science, 1992, v. 72, p. 449-466.

165. Bedford M.R. Mechanism of action and potential environmental, benefits from the use of feed enzymes. Animal Feed Science and Technology, 1995, v. 53, p. 145-155.

166. Chesson A. Feed enzymes. Animal Feed Science and Technology, 1993, v. 45, p. 65-79.

167. Girhammar U. and Nair B.M. Certain physical properties of water soluble non-starch polysaccharides from wheat, rye, triticale, barley and oats. Food Hydrocolloids, 1992, v. 6, No. 4, p. 329-343.

168. Vranjes M.V. and Wenk C. Influence of Trichoderma viride Enzyme Complex on Nutrient Utilization and Perfomance of Laying Hens in Diets With and Without Antibiotic Supplementation. Poultry Science, 1996, v. 75, p. 551-555.

169. Coon C.N., Leske K.L., Akavanichan O. and Cheng Т.К. Effect of Oligosaccharide-Free Soybean Meal on True Metabolizable Energy and Fiber Digestion in Adult Roosters. Poultry Science, 1990, v. 69, p. 787-793.

170. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Grishutin S.G., Sinitsyna O.A., Ankudimova N.V. Application of microassays for investigation of cellulase abrasive activity and backstaining. Journal of Biotechnology, 2001, v. 89, p. 233-238.

171. Гусаков A.B., Марков A.B., Гришутин С.Г., Семенова М.В., Кондратьева Е.Г., Синицын А.П. Вискозиметрический метод определения общей эндодеполимеразной активности пектиназ. Биохимия, 2002, т. 67, вып. 6, с. 815-822.

172. Баразненок Вера Алексеевна. Выделение и свойства эндоглюканаз и ксиланаз Chaetomium cellulolyticum. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, МГУ, 1999, с. 147.

173. Debyser W., Delcour J. Inhibitors of Cellulolytic Xylanolytic and p-glucanolytic. Int. Patent WO 98/49278,1998.