Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Penicillium verruculosum тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗА И ЦЕЛЛЮЛОЗОС О ДЕРЖАЩИЕ МАТЕРИАЛЫ (ЦСМ).

1.1. Виды и запасы ЦСМ.

1.2. Состав и структура ЦСМ.

1.3. Предобработка ЦСМ.

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ УПОРЯДОЧЕННЫХ ФОРМ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ.

2.1. Современные представления о классификации ферментов.

2.2. Целлюлолитические ферменты.

2.3. Механизм действия целлюлазного комплекса.

2.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы.

ГЛАВА 3. ПЕРСПЕКТИВНЫЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

КОНВЕРСИИ ЦСМ.

ГЛАВА 4. ШТАММ PENICILLIUM VERRUCULOSUM И КОМПОНЕНТЫ СЕКРЕТИРУЕМОГО ИМ ФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА.

4.1. Характеристика штамма P.verruculosum.

4.2. Ферменты P. verruculosum.

II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ.

5.1. Использованные ферменты.

5.2. Субстраты и реактивы.

5.3. Методы определения Сахаров и концентрации белка.

5.4. Методы выделения и очистки ферментов.

5.5. Методы определения активности ферментов.

5.6. Масс-спектрометрический анализ пептидов и белков.

5.7. Определение рН- и температурного оптимумов действия ферментов.

5.8. Исследование устойчивости ферментов к "термошоку".

5.9. Определение адсорбционных характеристик ферментов.

5.10. Гель-хроматографический анализ продуктов ферментативного гидролиза высокомолекулярных субстратов.

5.11. Оценка способности целлюлаз к биодепигментации джинсовой ткани.

5.12. Оценка способности ферментов к биополировке окрашенной хлопковой ткани.

5.13. Исследование кинетики глубокого гидролиза МКЦ.

5.14. Определение гидролитической способности ферментных препаратов.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 6. КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ КОМПЛЕКСА Р. VERRUCULOSUM.

6.1. Целлюлолитические и сопутствующие активности целлюлазного комплекса

P.verruculosum.

6.2. Фракционирование исходного ферментного препарата с помощью ионобменной хроматографии на Source 15 Q.

6.2.1. Разделение фракции №6 после АОХ на Source 15 Q.

6.2.2. Разделение фракции №7 после АОХ на Source 15 Q.

6.2.3. Разделение несвязавшейся фракции после АОХ на Source 15 Q.

6.3. Идентификация выделенных ферментов методом масс-спектрометрии.

ГЛАВА 7. СВОЙСТВА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ КОМПЛЕКСА P.VERRUCULOSUM.

7.1. Субстратная специфичность.

7.2. рН- и температурные оптимумы действия ферментов, стабильность, устойчивость к термошоку.

7.3. Адсорбционная способность выделенных ферментов.

7.4. Анализ способности ферментов к увеличению питательной ценности кормов животных и птиц.

7.5. Выявление ключевых тополитических ферментов.

7.6. Выявление ключевых гидролитических ферментов.

ГЛАВА 8. СРАВНЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ФЕРМЕНТНЫХ КОМЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ МУТАНТНЫХ ШТАММОВ P. VERRUCULOSUM.

8.1. Результаты анионобменной хроматографии на Mono Q.

8.2. Результаты гидрофобной хроматографии на Source Isopropyl.

ГЛАВА 9. СРАВНЕНИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ СПОСОБНОСТИ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ КОМПЛЕКСОВ P. VERR UCULOSUM И TRICHODERMA SP.

9.1. Сравнение осахаривающей способности целлюлазных препаратов.

9.2. Вклад слабо и сильно адсорбирующихся компонентов целлюлазного комплекса в гидролиз целлюлозы.

9.3. Анализ зависимости выхода Сахаров от активности в реакционной смеси.

9.4. Влияние р-глюкозидазы на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы.

ВЫВОДЫ.

Промышленная технология ферментных препаратов начала развиваться в первой четверти XX века. К сегодняшнему дню ферментные препараты стали мощным средством переработки практически любого вида биологического сырья, формирования и контроля качества продуктов.

В настоящее время основа процесса биоконверсии растительной биомассы состоит в гидролизе целлюлозы до глюкозы с последующим сбраживанием до этанола или получении иных продуктов микробного синтеза. Природная древесина, отходы ее переработки, сельскохозяйственные целлюлозосодержащие отходы представляют потенциальный интерес как дешевый и возобновляемый источник для получения различных продуктов и топлива [1]. Тем не менее, природная древесина и другие целлюлозосодержащие материалы весьма устойчивы к ферментативному воздействию, так как целлюлоза в них имеет кристаллическую структуру, а пространство между целлюлозными волокнами заполнено гемицеллюлозными волокнами, трудно разрушаемой матрицей лигнина, а также пектиновыми оболочками. Следовательно, для эффективного гидролиза с помощью ферментов необходимо провести предварительную обработку, направленную на разрушение кристаллической структуры целлюлозы и удаление лигнина. В настоящее время экономический интерес представляют такие методы предобработки, как паровой взрыв и обработка водно-этанольной смесью в кислой среде (органозольвом). Последний способ наиболее предпочтителен, так как приводит к более полному удалению лигнина из древесины, и образуется более реакционноспособный субстрат для ферментативной конверсии [2].

Стоимость предобработки, а также эффективность гидролитического действия целлюлазных комплексов являются основными факторами, влияющими на экономическую рентабельность процессов биоконверсии лигноцеллюлозной биомассы.

Глубокая деструкция целлюлозы с образованием растворимых Сахаров осуществляется под действием полиферментной системы целлюлаз, включающей в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы. Свойства индивидуальных ферментов, а также их взаимодействие в составе целлюлазного комплекса определяют его эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов.

В настоящее время во многих странах ведется активный поиск новых микроорганизмов - эффективных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз. Проводятся также работы по получению новых штаммов - суперпродуцентов ферментов методами генетической инженерии.

Среди различных организмов - промышленных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз грибы рода Trichoderma получили наибольшее распространение поскольку обладают высокой секреторной способностью.

В отличие от Trichoderma, грибы рода Pénicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляют целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты обладают высокой операционной стабильностью [3]. Поэтому получение высокопродуктивных штаммов Pénicillium является задачей, имеющей большое научное и прикладное значение.

Целью диссертационной работы являлось исследование свойств ферментного комплекса, секретируемого новыми мутантными высокопродуктивными штаммами гриба P. verruculosum, полученными в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Разработать эффективный метод разделения компонентов ферментного комплекса P. verruculosum, на основе чего определить состав комплекса и получить очищенные индивидуальные ферменты.

• Исследовать биохимические и кинетические свойства индивидуальных ферментов.

• Сравнить компонентный состав ферментных комплексов, продуцируемых различными мутантными штаммами P. verruculosum.

• Сравнить гидролитическую способность различных целлюлазных полиферментных систем по отношению к различным типам предобработанной древесины.

• Выявить вклад слабо и прочно адсорбирующихся целлюлаз в эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих субстратов.

• Оценить роль (3-глюкозидазы в процессе гидролиза.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

выводы.

1. В результате хроматографичеекого разделения в составе комплекса внеклеточных ферментов P.verruculosum было выявлено 14 ферментов: 4 эндоглюканазы (EG 25, EG 33, EG 36 и EG 52), 4 целлобиогидролазы (СВН 45, СВН 50, СВН 55 и СВН 66), 2 ксилоглюканазы (XG 25 и XG 70), р-глюкозидаза (b-GL 116), ксиланаза (Xyl 23), а-галактозидаза (a-Gal 60) и глюкоамилаза (GA 66).

2. Методов MALDI-TOF масс-спектрометрии трипсиновых гидролизатов белков установлено, что СВН 55 и СВН 66, являются изоформами целлобиогидролазы I 7-ой семьи гликозид-гидролаз, СВН 50 и СВН 45 являются изоформами целлобиогидролазы II 6-ой семьи гликозид-гидролаз, a-Gal 60 принадлежит 27-й семье гликозид-гидролаз. Методом MALDI-TOF-TOF масс-спектрометрии удалось установить, что EG 33 и EG 36 являются разными ферментами, принадлежащими к 5 семье (эндоглюканазы И), EG 52 - к 7 семье (эндоглюканаза I), XG 25 - к 12 семье, XG 70 - к 74 семье и Xyl 23 - к 11 семье гликозид-гидролаз.

3. В результате испытаний выделенных ферментов установлено, что эндоглюканазы EG 33(11) и EG 52(1) являются наиболее эффективными компонентами ферментного комплекса с точки зрения гидролиза некрахмальных полисахаридов кормов животных и птиц. EG 25(111) и EG 36(11) обладают высокой тополитической активностью и являются самыми эффективными компонентами ферментного комплекса в процессах биодепигментации и биополироки хлопчатобумажных изделий. СВН 50(11) и СВН 66(1) являются ключевыми ферментами для осахаривания целлюлозосодержащих субстратов и способны в индивидуальном виде осуществлять глубокую конверсию кристаллической целлюлозы.

4. Ферментные препараты, полученные на основе новых мутантных штаммов P.verruculosum (В221-151 и В221-6) по сравнению с исходным штаммом В1 содержат более «разнообразный» комплекс ферментов: мутантные штаммы продуцируют новые ферменты - эндоглюканазы EG 33(11), EG 36(11) и ксилоглюканазу XG 25, кроме того у новых мутантных штаммов значительно повысился уровень секреции ксиланазы (Xyl 23) и р-глюкозидазы (P-GL 116).

5. Ферментные препараты на основе P.verruculosum значительно эффективнее гидролизуют различные виды предобработанной древесины, чем ферментные препараты Trichoderma. Более высокая гидролитическая способность целлюлазного комплекса P.verruculosum обусловлена более высоким содержанием целлобиогидролаз и Р-глюкозидазы, а также наличием слабо адсорбирующихся эндоглюканаз. Действие слабо адсорбирующихся компонентов целлюлазного комплекса РжггисиЬзит в значительной мере определяет общую скорость ферментативного процесса гидролиза.

1. Кастельянос О.Ф. Каталитические биохимические и биотехнологические свойства целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum и его компонентов. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ,1995.

2. Тиунова Н.А. Применение целлюлаз. Целлюлазы микроорганизмов. Под ред. Клетовича В.Л. М.,1981, с. 40-73.

3. Грачева И.М., Гаврилова Н.Н., Иванова Л.А. Технология микробных белковых препаратов, аминокислот и жиров. М., 1980, с. 83-90

4. Евилевич А.З., Ахмина Е.И., Раскин М.Н. Безотходное производство в гидролизной промышленности. М., 1982, с.4-40.

5. Шарков В.И., Куйбина И.И., Соловьева Ю.П. и др. Количественный и химический анализ растительного сырья. М., 1976, с. 203.

6. Максимов В.Ф., Вольф И.В., Яковлева О.И. Борьба с загрязнениями окружающей среды в целлюлозно-бумажной промышленности. М., 1976, с.30

7. Nisizawa К. Mode of action ofcellulases. J.Ferment. Technol., 1973, v.51, p 267-304.

8. Рогозин З.А. Химия целлюлозы. M.: Химия, 1972, с.520.

9. Клесов А.А. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. 1988, М., ВИНИТИ Т. 12, с.53.

10. Химия древесины (Йенсен В., ред.), М.: Лесная промышленность, 1982, с.399.

11. Гудвин Т., Мерсер Э. Введение биохимию. М., 1986, с.387.

12. Coughlan М.Р., Hazlewood G.P. Hemicellulose and hemicellulases. Portland Press Research Monograph. London and Chapel Hill., 1993, v.IV, p. 120.

13. Scalbert A., Monties В., Lallemand J.Y., Guitted E., Rolando C.: Ether linkage between phenolic acids and lignin fractoins from wheat straw. Phitochemistry, 24 (1985), p. 13591362.

14. Дзедзюля Е.И. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, МГУ, 2000, с. 117.

15. Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Harris P.J., Curzon E.H.:Linkage of p-kumaroyl and feruloyl groups to cell wall polysaccarides of barley straw. Carbohydr.Res. 148 (1986), p.71-85.

16. Ladish M.R., Lin K.W., Voloch M., Tsao G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass. Enzyme. Mycrob. Technol. 1983, v.5, p.82-102

17. Мецлер Д. Биохимия. M., 1980, т.З, с.152-153

18. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов.МГУ, 1995.

19. Bungay H.R. Energy, the biomass options. N.Y. Wiley and sons, 1981, p. 13-15.

20. Selvan P.V., Ghose Т.К., Ghosk P. Catalytic solvent delignification of agricultural residues:inorganic catalysis. Prosess Biochem., 1983, №3, p.13-15.

21. Ropas M., Marchai R.,Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 1 :Pretreatment procedures. Biosource Technol., 1992, v.42,p.l 97-204.

22. Ropas M., Marchai R.,Porquie J., Wandecasteele P. Large-scale enzymatic hydrolysis of agricultural lignocellulosic biomass. Part 2:Conversion into acetone-butanol. Biosource Technol., 1992, v.42, p.205-217.

23. Schultz T.P., Rughani J.R., Meginnis G.D. Comparison of the pretreatment of sweetgum and white oak by steam-explosion and rapid ateam hydrolysis-continuous (RASH) prosesses. Appl.Biochem.Biotechnol., 1989, v.20, p.9-28.

24. Dale E.B. Lignocellulose conversion and future of fermentation biotechnology. TibTech.,1987, v.5, p.287-292.

25. Синицьш А.П.Физико-химические основы ферментативной конверсии полисахаридов. МГУ, докторская диссертация, 1987.

26. Stakheev I.V.,Sheherva V.V., Babitskaya V.G., Vadetskii B.Yu. The grow of Pénicillium verruculosum BIM G-122 on heterogeneous media depending on the method of the substrate pretreatment. 1986, v.22, №3, p. 363-367.

27. Синицьш А.П., Клесов A.A. Рабинович МЛ. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология. 1988, М., ВИНИТИ Т. 12, с. 150.

28. Emert G.H., Katzen R., Frederickson R.E. Design of the 45 MT/D cellulose to ethanol plant// Proceeddings Pan Pasif. Synfuels Conf. Tokyo. 1982, v.2, p.447-454.

29. Клесов A.A. Инженерная энзимология на промышленном уровне. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М., 1989, т.18, с.106-181.

30. Bungay, H.R. Energy: the biomass options, Wiley and Sons, New York, 1981, p.347

31. Clarke, A J. Biodégradation of cellulose. Enzymology and biotechnology, Technomic Publishing Company Inc., Lancaster, 1997, p.272.

32. Karlsson, J., Siika-aho, M., Tenkanen, M., Tjerneld, F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. J. Biotechnol., 2002, v.99, p.63-68.

33. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 2003, с.201

34. Schulein, M. Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens. J. Biotechnol., 1997, v.57, p.71-81.

35. Schou, C., Rasmussen, G., Kaltoft, M.B., Henrissat, В., Schulein, M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. Eur. J. Biochem., 1993, v.217, p. 947-953.

36. Schou, C., Rasmussen, G., Kaltoft, M.B., Henrissat, В., Schtilein, M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. Eur. J. Biochem., 1993, v.217, p. 947-953.

37. Kanda, Т., Wakabayashi, K., Nisizawa, K. Xylanase activity of endo-cellulase and of carboxymethyl-cellulase type from Irpex lacteus (Polyporus tulipiferae). J. Biochem., 1976, v.79, p.989-995.

38. Vincken, J.-P., Beldman, G., Voragen, A.G.J. Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? Carbohydr. Res., 1997, v.298, p.299-310.

39. Sinnot, M.L. Catalytic mechanisms of glycosyl group transfer. Chem. Rev., 1990, v.90, p.l 171-1202.

40. Christakopoulos, P., Kekos, D., Macris, B.J., Claeyssens, M., Bhat, M.K. Purification and mode of action of a low molecular mass endo-l,4-P-D-glucanase from Fusarium oxysporum. J. Biotechnol., 1995, v.39, p.85-93.

41. Максимов В.И., Чурилова И.В. Исследование гидролазной и трансгликозилазной активности у препарата низкомолекулярной эндогликаназы целлюлазного комплекса Trichoderma koningii. Прикл. биохим. микробиол., 1985, т.21, №4, с.456-460.

42. Wong, Y., Fincher, G.B., McLachlan, G.M. Kinetic properties and substrate specificities of two cellulases from Auxin treated Pea Epicolyls. J. Biol. Chem., 1977, v.252, p. 14021407.

43. Teeri, T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends Biotechnol., 1997, v. 15, p. 160-167.

44. Vrsanska, M., Biely, P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on cellooligosaccharides. Carbohydr. Res., 1992, v.227, p. 19-27.

45. Imai, Т., Boisset, C., Samejima, M., Igarashi, K., Sugiyama, J. Unidirectional processive action of cellobiohydrolase Cel7A on Valonia cellulose microcrystals. FEBS Lett., 1998, v.432, p.l 13-116

46. Knowles, J.K.C., Lehtovaara, P., Murray, M., Sinnott, M.L. Stereochemical course of the action of the cellobioside hydrolases I and II of Trichoderma reesei. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1988, v.21, p.1401-1402.

47. Van Tilbeurgh, H., Tomme, P., Claeyssens, M., Bhikhabhai, R., Pettersson, G. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of the functional domains. FEBS Lett., 1986, v.204, p.223-227.

48. Konstantinidis, A.K., Marsden, I., Sinnott, M.L. Hydrolyses of a- and P-cellobiosyl fluorides by cellobiohydrolases of Trichoderma reesei. Biochem. J., 1993, v.291, p.883-888.

49. Rouvinen, J., Bergfors, Т., Teeri, Т., Knowles, J.K.C., Jones, T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science, 1990, v.249, p.380-386.

50. Wood, T.M., McCrae, S.I. The purification and properties of the CI component of Trichoderma koningii cellulase. Biochem. J., 1972, v.128, p.l 183-1192.

51. Wood, T.M., McCrae, S.I. Purification and properties of a cellobiohydrolase from Penicilliumpinophilum. Carbohydr. Res., 1986, v.148, p.331-344.

52. Wood, T.M., McCrae, S.I. Cellulase from Fusarium solani. Purification and properties of the CI component. Carbohydr. Res., 1977, v.57, p.l 17-133.

53. Nisizawa, K. Mode of action of cellulases. J. Ferment. Technol., 1973, v.51, p.267-304.

54. Ladisch, M.R., Lin, K.W., Voloch, M., Tsao, G.T. Process considerations in the enzymatic hydrolysis of biomass. Enzyme Microb. Technol., 1983, v.5, p.82-102.

55. Tuohy, M.G., Walsh, D.J., Murray, P.G., Claeyssens, M., Cuffe, M.M., Savage, A.V., Coughlan, M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochim. Biophys. Acta, 2002, v. 1596, p.366-380.

56. Umile, C., Kubicek, C.P. A constitutive, plasma-membrane bound P-glucosidase in Trichoderma reesei. FEMS Microbiol. Lett., 1986, v.34, p.291-295.

57. Wilson, R.W., Niederpruem, D.J. Control of P-glucosidases in Schyzophyllum commune. Can. J. Microbiol., 1967, v. 13, p. 1009-1020.

58. Румянцева Г.М., Родионова H.A., Мартинович Л.И. Очистка и характеристика двух типов р-глюкозидаз: целлобиазы и арил-р-Б-глюкозидазы. В сб.: Целлюлазы микроорганизмов (ред. В.Л.Кретович), М., Наука, 1981, с.83-93.

59. Woodward, J. Fungal and other (i-D-glucosidases their properties and applications. Enzyme Microb. Technol., 1982, v.4, p.73-79.

60. Woodward, J., Arnold, S.L. The inhibition of P-glucosidase activity in T. reesei C30 cellulase by derivatives and isomers of glucose. Biotechnol. Bioeng., 1981, v.23, p.1553-1562.

61. Ghose, Т.К., Sachdev, R.K. Kinetics of immobilized P-glucosidase for hydrolysis of cellobiose to glucose. J. Molec. Catal., 1979, v.6, p.99-109.

62. Shewale, J.G., Sadana, J. Purification, characterization and properties of p-glucosidase enzymes from Sclerotium rolfsii. Arch. Biochem. Biophys., 1981, v.207, p.185-196.

63. Chen, H., Hayn, M., Esterbauer, H. Purification and characterization of two extracellular P-glucosidases from Trichoderma reesei. Biochim Biophys. Acta, 1992, v.l 121, p.54-60.

64. Gong, C.-S., Ladisch, M.R., Tsao, G.T. Cellobiase from Trichoderma viride: purification, properties, kinetics and mechanism. Biotechnol. Bioeng., 1977, v. 19, p.959-981.

65. Hash, J.H., King, K.W. Some properties at an aryl-p-glucosidase from culture filtrates of Myrothecium verrucaria. J. Biol. Chem., 1958, v.232, p.395-402.

66. Umezurike, G.M. Kinetic analysis of the mechanism of action of P-glucosidase from Bortyodiplodia theobromae pat. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.397, p. 164-178.

67. McHale, A., Coughlan, M.P. The cellulolytic system of Talaromyces emersonii. Purification and characterization of the extracellular and intracellular p-glucosidases. Biochim. Biophys. Acta, 1981, v.662, p. 152-159.

68. Родионова H.A. Ферментативное расщепление целлюлозы. В сб.: Целлюлазы микроорганизмов (ред. В.Л.Кретович), М., Наука, 1981, с.4-40.

69. Хорлин А.Я. Активные центры карбогидраз. В сб.: Структура и функции активных центров ферментов, М., Наука, 1974, с.39-69.

70. Aerts, G.M., van Opstal, О., de Bruyne, К. p-D-Glucosidase-catalysed transfer of the glycosyl group from aryl-p-D-gluco- and р-D-xylo-pyranosides to phenols. Carbohydr. Res., 1982, v.100, p.221-233.84.

71. Гусаков A.B. Кинетическое описание ферментативного гидролиза целлюлозы (сырье, ферменты, процесс, реакторы). Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук, Москва, МГУ, 1984, с. 192

72. Клесов А.А. Современное состояние проблемы ферментативной переработки целлюлозы в сахара и спирт за рубежом. Прикл. биохим. микробиол., 1985, т.21, №2, с.269-283.

73. Coughlan, М.Р. Enzymatic hydrolysis of cellulose: an overview. Biores. Technol., 1992, v.39, p.107-115.

74. Galbe, M., Zacchi, G. A review of the production of ethanol from softwood. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, v.59, p.618-628.

75. Duff, S .J.B., Murray, W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Biores. Technol., 1996, v.55, p.1-33.

76. Околелова T.M., Румянцев С.Д., Кулаков A.B., Морозов A.M., Иевлев С.А. Корма и биологически активные добавки для птицы, М., Колос, 1999, с.96

77. Chang, М., Chou, Т., Tsao, G.T. Structure, pretreatment and hydrolysis of cellulose. In: Bioenergy (Fiechter, A., ed.), Berlin, Heidelberg, New York, 1981, p. 15-32.

78. Огарков В.И., Киселев О.И., Быков B.A. Биотехнологические направления использования растительного сырья. Битехнолология, 1985, № 3, с.1-15.

79. Reese Е.Т., Sue R.G., Levinson H.S. The biologocal degradation of soluble cellulose derivates and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. J.Biotechnol., 1950, v.59, p.485-497

80. Reese E.T. History of cellulase program at the U.S. Army Development Center.Biotechnol. Bioeng., 1976, v.6, p.9-21.

81. Beardmore D.H. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose:effect of major structural features of cellulose on enzymatic hydrolysis. Biotechnol. Bioeng., 1980, v.22, p. 177-199.

82. Rabinovich M.L. Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms. Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. Pushchino, 1984, p.31 48.

83. Рабинович М.Л., Болобова A.B., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Древесина и разрушающие ее грибы. М., 2001.

84. Henriksson G. et al. Eur. J. Biochem. 1999, №259. p.88 95.

85. Клесов A.A., Рабинович М.Л., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы.Н. Свойства компонентов целлюлазных комплексов из различных источников.Биоорг.химия, 1980, т.6 №6, с.1225-1241.

86. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы.1.Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников.Биоорг.химия, 1980, т.6 №3, с.1225-1241.

87. Gusakov A.V., Sinitsyn A.P., Manenkova J.A.,Protas O.V. Enzymatic sacharification of industrial and agricultural lignocellulosic wastes. Appl.Biochem.biotechnol., 1992, v.34, №5, p.625-637.

88. Клесов A.A., Рабинович М.Л.Ферментативный гидролиз целлюлозы. В кн.: Инженерная энзимология и биоорганический катализ. Итоги науки и техники, сер.биол.химия. М., ВИНИТИ, 1978, т. 12 ,с. 49-91.

89. Клесов А.А., Черноглазое В.М., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы. Биоорг. химия,1982, т.8, №5, с.643-650.

90. Lutzen N.W., Nielsen М.Н., Oxenboel К.М. Cellulase and their application in the conversion of lignocellulose to fermentable sugars. Phil.Trans.R.Soc.Lond., 1983, p.283-291.

91. Синицын А.П., Митькевич O.B. различия в кинетических свойствах прочно и слабо адсорбирующихся на целлюлозе целлюлолитических ферментов. Биотехнология, 1987, т.З, №2, с.227-233.

92. Saddler J.N. Screening of highly cellulolitic firngi and the action of their cellulase enzyme systems. Enzyme Microb. Technol., 1982, v.4, p.414-418.

93. Синицын А.П., Наджеми Б., Клесов А.А. Влияние состава целлюлазного препарата на эффективность ферментативного гидролиза хлопкового линта. Химия древесины, 1982, №2, с.91-96.

94. Морозов A.M., Рабинович M.JL, Клесов А.А. биотехнология непрерывного ферментативного гидролиза целлюлозы. И. Гидродинамическое сопротивление аппарата колоночного типа. Биотехнология, 1986, №5, с.52-59.

95. Клесов А.А., Синицын А.П. Ферментативный гидролиз целлюлозы.1У. Влияние физико-химических и структурных факторов на эффективность ферментативного гидролиза. Биоорг. Химия, 1981, т.7, №12, с.1801-1812.

96. Nystrom J.M., Andren R.K., Allen A.L. Enzymatic hydrolysis of cellulosic waste: the status of process technology and economic accessment. AIChE Symp.Ser., 1978, v.74, № 72, p.82-88.

97. Reese E.T., Mandels M. Stability of the cellulase of Trichoderma reesei under use conditions. Biotechnol.bioeng., 1980, v.22, p.323-335.

98. Hagerdal В., Ferchak J.D., Pye E.K. Sacharification of cellulose by the cellulolitic enzyme system of Thermonospora sp. I. Stability of cellulolytic activities with respect to time, temperature and pH. Biotechnol.Bioeng., 1980, v.22, p. 1515-1526.

99. Гусаков A.B., Синицын А.П., Клесов А.А. ферментативный гидролиз целлюлозы. Инактивация и стабилизация ферментов целлюлазного комплекса. Биохимия, 1982, т.47,№8, с.1322-1331.

100. Синицын А.П., Митькевич О.В., Клесов А.А. инактивация препаратов ферментов целлюлазного комплекса при перемешивании и стабилизация целлюлозой. Прикл.Биохим. Микробиол., 1986, т.2, №6, с.759-765.

101. Neilson M.J., Kelsey R.G., Shafizadeh F. Enhacement of enzymatic hydrolysis by simultaneous attrition of cellulose substrates. Biotechnol.Bioeng., 1982, v.24, p.293-304.

102. Lee S.B., Kim I.H. structural properties of cellulose and cellulase reaction mechanism. Biotechnol.Bioeng., 1983, v.25, p.33-51.

103. Клесов А.А., Черноглазов B.M., Ермолова O.B., Елкин B.B. Влияние лигнина на ферментативный гидролиз лигноцеллюлозных материалов. Биотехнология, 1985, №3, с.106-112.

104. Калуянц К.А., Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. М., 1979, с.118.

105. Яровенко B.JL, Калуянц К.А., Голгер Л.И. Производство ферментных препаратов из грибов и бактерий. М., 1970, с.3-56.

106. Быков В.А., Калуянц К.А. Биокатализаторы в решении вопросов продовольственной программы. Итоги науки и техники, Сер. Технология орг.веществ, 1984, т.8, с.181.

107. Колосков С.П. Оборудование предприятий ферментной промышленности. М., 1969, с.187.

108. Морозова Е.С. Основные достижения и направления селекции продуцентов целлюлаз в СССР и за рубежом. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты. Итоги науки и техники, Сер. Биотехнология, 1988, т. 10, с.6-71.

109. Chung К.С., Kawai К., Yashima S., Eguchi Y. Purification of cellulolitic enzymes by Pénicillium verruculosum. Hakkokogaki-kaishi., 1982, v.60, №5 p.363-367.

110. Берлин А.Х. Исследование тополитических эндоглюканаз и ксиланаз ферментных комплексов Pénicillium verruculosum и Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ,1999.

111. Грачева И.М., Кривова А.Ю. технология ферментных препаратов. Москва, изд.Элвар, 2000, с.13-288.

112. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ, 1998

113. Гутиеррес Родригес Б. Каталитические, биохимические и биотехнологические свойства эндоглюканазы В4 целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ, 1997

114. Сахаров И.Ю., Зоров И.Н., Синицын А.П. Выделение эндоглюканазы Pénicillium verruculosum методом иммуноафинной хроматографии. Биохимия, 1996, т.61, с.1658-1663.

115. Кастельанос О., Синицын А.П., Ермолова О.В. Кинетические свойства индивидуальных компонентов целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Биохимия, 1995, т.60, с. 1609-1617

116. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ,1998

117. Ларин П. Подножный корм. Авторевю ,2005, №5, с.70-71.

118. Yattes J.R. Mass-spectrometry and âge of proteome. J. Mass Spectrom., 1998, 33, p.1-19

119. Rappsilber, J, Moniatte, M., Nielsen, M.L., Podtelejnikov, A.V., Mann, M. Experiences and perspectives of MALDI MS and MS/MS in proteomic research. Int. J. Mass Spectrometry, 2003, v.226, p.223-237.

120. Okada G., Nisizawa K., Enzymatic studies on a cellulase system of Trichoderma viride. Transglycosylation properties of two cellulase components of random type. J.Biochem., 1975, v.78, p.297-306.

121. Srivastava S.K., Ali A., Shanna S. Purification, characterization and cloning of an endo 1,4-p-glucanase from Ruminococus sp. Biotechnology letters, 1991, v. 13, №3,p.157-162.

122. Wood T.M. Fungal cellulases. Chem. Soc.Transac. 1992, v.2, p.80-89.

123. Марков A.B. Свойства ферментных комплексов, продуцируемых мутантными штаммами Trichoderma reesei. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ,2003

124. Niku-Paavola М., Lappalainen A., Enari Т., Nummi М. A new appraisial of the endoglucanases of fungus T.reesei. Biochem.J., 1985, v.231, p.75-81.

125. Tomme P., Van-Til H., at al. Studies of the cellulolytic system of T.reesei QM 9414. Eur.J.Biochem. 1988, v.170, p.575-581.

126. Гришутин С.Г. Свойства ксиланаз, и b-глюканаз и ксилоглюканаз Aspergillus japonicus. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ, 2004.

127. Vincken, J.P., Beldman, G., Voragen, A.G.J. Substrate specificity of endoglucanases: what determines xyloglucanase activity? Carbohydr. Res., 1997, v.298, p.299-310.

128. Biely, P., Vrsanska, M., Claeyssens, M. The endo-1,4-p-glucanase I from Trichoderma reesei. Action on p-l,4-oligomers and polymers derived from D-glucose and D-xylose. Eur. J. Biochem., 1991, v.200, p. 15 7-163.

129. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. НПО Элевар, 2000, с.190-211.

130. Rolz, С., Arriola, J., Villadares, J. Effect of some physical and chemical pretreatments on the composition, enzymatic hydrolysis and digestibility of lignocellulosic sugar cane residue. Process Biochem., 1987, v.2, p. 17-23.

131. Шевелькова A.H. Кинетика и механизм действия ферментов амилазного комплекса. Диссертация на соискание ученой степени канд.хим. наук. МГУ, 1993.

132. Рухля И. Г. Выделение и изучение свойств а-галактозидазы из гриба Р. verruculosum.Дипломная работа, хим. фак., МГУ, 2002.

133. Abuja P.M., Schmuck М., Pilz I., et al. Structural and functional domains of cellobiogydrolase I from Trichoderma reesei, Eur. Biophys. J., 1988, v.58, p.2339-342.

134. Sandgren M., Shaw A., Ropp Т.Н., Bott S.R. cameron A.D., Stahlberg J., Mitchinson C., Jones T.A. the X-ray crystal structure of the Trichoderma reesei family 12 endoglucanase Celll2A at 1.9 A resolution. J.Mol.Biol., 2001, v.308, p.295-302.

135. Sinitsyn A.P., Gusakov A.V., Grishutin S.G., Sinitsyna O.A., AnkudimovaN.V. Application of microassays for investigation of cellulase abrasive activity and backstaining. Journal of Biotechnology, 2001, v. 89, p. 233-238.

136. Legler G. Glycosyde hydrolases: mechanistic information from studies with reversible and irreversible inhibitors. Adv. Carb. Chem. Biochem., 1990, v.48, p. 319-385.

137. Синицын А.П., Наджеми Б., Митькевич О.В., Клесов А.А. Взаимное усиление гидролитического действия прочно и слабо адсорбирующихся целлюлазных препаратов. Прикл. Биох. Микробиол., 1986, т.22, №3, с.333-336.

138. Ghose Т.К., Kostick J. A model for continuous enzymatic saccharification of cellulose with simultaneous removal of glucose syrups. Biotechnol.Bioeng., 1970, v. 12, p.921-927.

139. Mernitz G., Koch A., Henrissat B. and Schulz G. Endoglucanase II (EGII) of Pénicillium janthinellum: cDNA sequence,heterologous expression and promotor analysis J. Curr. Genet. 1996,29 (5), p.490-495

140. Koch A., Weigel C.T. and Schulz G. Cloning, sequencing, and heterologous expression of acellulase-encoding cDNA (cbhl) from Pénicillium janthinellum J. Gene 1993,124 (1), p.57-65

141. Haas H., Friedlin E., Stoffler G. and Redl B. Cloning and structural organization of a xylanase-encoding gene from Pénicillium chrysogenum.J. Gene 1993,126 (2), p.237-242

142. Furniss C.S.M., Williamson G. and Kroon P.A. The substrate specificity and susceptibility to wheat inhibitor proteins of Pénicillium funiculosum xylanases from a commercial enzyme preparation J. J. Sci. Food Agric. 2005, 85 (4), p.574-582

143. Eyzaguirre J. Structure analysis of the endoxylanase A gene from Pénicillium purpurogenum. J. Biol. Res., 2001 34 (3-4), p.217-226

144. Sabatier A., Fish N.M. and Haigh N.P. Enzymes mixture obtained from Pénicillium funiculosum. Patent: US 6534101-A 2 18-MAR-2003

145. Chavez R., Schachter K., Navarro C., Peirano A., Aguirre C., Bull P. and Eyzaguirre J. Differences in expression of two endoxylanase genes (xynA and xynB) from Pénicillium purpurogenum. J. Gene, 2002,293 (1-2), p.161-168

146. Kimura T., Ito J., Kawano A., Makino T., Kondo H., Karita S., Sakka K. and Ohmiya K. Purification, characterization, and molecular cloning of acidophilic xylanase from Pénicillium spAO. J. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000,64 (6), p.1230-1237

147. Diez B., Rodriguez-Saiz M., de la Fuente J.L., Moreno M.A. and Barredo J. The nagA gene of Pénicillium chrysogenum encoding beta-N-acetylglucosaminidase. J. FEMS Microbiol. Lett., 2005,242 (2), p. 257-264

148. Shibuya H., Nagasaki H., Kaneko S., Yoshida S., Park G.G., Kusakabe I. and Kobayashi H. Cloning and high-level expression of alpha-galactosidase cDNA from Pénicillium purpurogenum. J. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64 (11), p.4489-4494

149. Ribon A.O.B., Queiroz M.V., Coelho J.L.C. and de Araujo E.F. Differential expression of polygalacturonase-encoding genes from Pénicillium griseoroseum in different carbon sources. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2002,29 (3), p.145-148

150. Ishida Y., Kakibuchi K., Hirao Y. and Izumori K. Cloning and characterization of a polygalacturonase-encoding gene from Pénicillium janthinellum. J. Ferment. Bioeng., 1997, 84, p.257-260

151. Wagner F., Kusserow H. and Schafer W.Cloning and targeted disruption of two polygalacturonase genes in Pénicillium olsonii. J. FEMS Microbiol. Lett., 2000,186 (2), p.293-299

152. Akimoto H., Kiyota N., Kushima T., Nakamura T. and Ohta K. Molecular cloning and sequence analysis of an endoinulinase gene from Pénicillium sp. strain TN-88.J. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2000, 64 (11), p.2328-2335

153. Nikolaev I.V., Epishin S.M., Zakharova E.S., Kotenko S.V. and Vinetskii Iu.P. Molecular cloning of the gene for secreted beta-galactosidase of the filamentous fungus Penicillium canescens J.Mol Biol. (Mosk.), 1992,26 (4), p.869-875

154. Yoshida,T. and Ichishima,E. Molecular cloning and nucleotide sequence of the genomic DNA for 1,2-alpha-D-mannosidase gene, msdC from Penicillium citrinum. J. Biochim. Biophys. Acta., 1995,1263 (2), p. 159-162

155. Garcia В., Margolles E., Roca H., Mateu D., Raices M., Gonzales M.E., Herrera L. and Delgado J. Cloning and sequencing of a dextranase-encoding cDNA from Penicillium minioluteum. J.FEMS Microbiol. Lett., 1996,143 (2-3), p.175-183

156. Berka R.M., Christgau S., Halkier Т., Shuster J. and Fuglsang C. Penicillium purpurogenum mutanases and nucleic acids encoding same.Patent: US 5853702-A 3 29-DEC-1998

157. Bura, R., Mansfield, S.D., Saddler, J.N., Bothast, R.J. S02-catalysed steam explosion of corn fibre for ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol., 2002, v.98-100, p.59-72.

158. Nelson, N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1944, v.153, p.375-379.

159. Somogyi, M. A new reagent for the determination of sugars. J. Biol. Chem., 1952, v. 195, p. 19-23.

160. Ghose, Т.К. Measurement of cellulase activity. Pure Appl. Chem., 1987, v.59, p.257-268.

161. Doner, L.W., Irwin, P.L. Assay of reducing end groups in oligosaccharide homologues with 2,2'-bicinchoninate. Anal. Biochem., 1992, v.202, p.50-53.

162. Березин И.В., Рабинович M.JI., Синицын А.П. Исследование возможностей кинетического спектрофотометрического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, т.42, №9, с.1631-1636.

163. Snyder, L.R., Kirkland, J.J. Introduction to modern liquid chromatography (2nd ed.), New York, Wiley-Interscience, 1979, 863 p.

164. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, М., Мир, 1991, 543.

165. Рабинович М.Л., Клесов А.А., Березин И.В. Кинетика действия целлюлолитических ферментов Geotrichum candidum. Вискозиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы. Биоорг. химия, 1977, т.З, с.405-414.

166. Smith, В.Е. Protein sequencing protocols, Humana Press, Totowa, 1997, 375

167. NC-IUBMB Enzyme nomenclature 1992. Recommendations of the nomenclature committee of the international Union of Biochemistry and Molecular Biology on nomenclature and classification of enzymes. Academic Press, Orlando, 1992.

168. Henrissat, В., Davies G. Structural and sequence-based classification of hydrolases. Curr.Opin. Struct.Biol., 1997,7, p.637-644.

169. Van Tilbeurgh, H., Tomme, P., Claeyssens, M., Bhikhabhai, R., Pettersson, G. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Separation of the functional domains. FEBS Lett., 1986, v.204, p.223-227.

170. Gilkes, N.R., Henrissat, В., Kilburn, D.G., Miller, R.C., Warren, R.A.J. Domains in microbal (3-1,4-glycanases: sequence conservation, function and enzyme families. Microbiol. Rev., 1991, v.55, p.303-315.

171. Henrissat, B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 1991, v.280, p.309-316.

172. Henrissat, В., Bairoch, A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J., 1993, v.293, p.781-788.

173. Henrissat, В., Bairoch, A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J., 1996, v.316, p.695-696.

174. Рабинович М.Л., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. Биохимия, 2002, т.67, №8, с.1026-1050.

175. Schiilein, М. Protein engineering of cellulases. Biochim. Biophys. Acta, 2000, v.1543, p.239-252.

176. Гусаков A.B. Биокатализаторы на основе грибных целлюлаз:фундаментальные и прикладные аспекты. Диссертация на соискание ученой степени доктора хим. наук. МГУ,2005.