О-Гликозидгидролазы морских бактерий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Бакунина Ирина Юрьевна

О-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ

02.00.10 — биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

2 4 03:

Владивосток — 2011

4855967

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН

Научный консультант: доктор химических наук,

профессор Звягинцева Т.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Шибнев В.А.

доктор химических наук, профессор Лукьянов П.А.

доктор биологических наук, профессор Пивненко Т.Н.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 17 Февраля 2011 г.. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу:

690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан "17" января 2011г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, s

к.б.н. Cc&zLy^' Черников О.В.

/Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Изучение О-гликозидгидролаз (ЕС 3.2.1.-), ферментов, катализирующих гидролитическое расщепление О-гликозидной связи в углеводах и углеводсодержащих биополимерах, является актуальной задачей.

Эти ферменты наиболее востребованы современной биотехнологией и широко используются для нужд пищевой, фармакологической, легкой промышленности и других областей. Они являются ключевыми ферментами углеводного обмена как в высших организмах, так и в микроорганизмах, поэтому знания об их свойствах, структуре и механизме действия необходимы для понимания многих процессов, происходящих в клетке. Кроме того, индивидуальные гликозидгидролазы с установленной субстратной специфичностью являются точными инструментами структурного анализа соответствующих природных полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров.

Большой научный и практический интерес О-гликозидгидролазы представляют при исследовании и модификации антигенной структуры различных биологических объектов. Частным случаем энзиматической модификации антигенов является направленное изменение групповой специфичности эритроцитов крови человека групп А и В в эритроциты группы О, которое нашло применение в биотехнологии создания "универсальной крови" из крови доноров разной групповой принадлежности. Для конверсии эритроцитов необходимы специфические экзо-гликозидазы, способные при нейтральных значениях рН и физиологических температурах эффективно катализировать удаление терминальных а-1,3-связанных иммунодоминантных остатков М-ацетилгалактозамина и галактозы, которые определяют групповую специфичность А- и В-эритроцитов соответственно. На сегодняшний день имеются сведения о двух таких ферментах из клинических бактериальных патогенов. Сообщения о подобных ферментах из морских бактерий в литературе отсутствуют.

Фукоиданы — семейство как гомо- и гетерополисахаридов, основная цепь которых построена из остатков сульфатированной Ьфукозы, связаных преимущественно а-1,3- и/или а-1,4-0-гликозидными связями, так и полисахаридов с высоким содержанием глюкуроновой кислоты и низким содержанием фукозы и сульфатов. Остатки галактозы, маннозы, ксилозы, рамнозы также найдены в различных фукоиданах. Фукоиданы обнаружены только в морских организмах. Высоким содержанием этих полисахаридов отличаются бурые водоросли. Подобные полисахариды также выделены из экстрацеллюлярного матрикса тела кукумарии и обнаружены на поверхности оболочки яйцеклеток у различных видов морских ежей.

Фукоиданы проявляют широкий спектр биологического действия на различные системы организма млекопитающих. Известны их антикоагулянтная, антиангиогенная, антивирусная, антиопухолевая, антиоксидантная и другие виды активностей, т.о. они имеют значительный потенциал как терапевтические агенты. В настоящее время возрастает интерес к фукоиданам, как к основе для создания эффективных медицинских препаратов нового поколения. В связи с этим, важной проблемой является определение тонкой химической структуры этих биополимеров для корреляции с их биологической активностью.

Большие надежды в процессе изучения структуры фукоиданов возлагают на метод селективной деградации этих полисахаридов с помощью ферментов — фукоиданаз. Ферментативное расщепление этих полисахаридов также необходимо для трансформации их с целью получения новых соединений, проявляющих биологические свойства.

Фукоиданазы — гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз О-гликозидных связей основной цепи фукоиданов, остаются наименее изученным семейством О-гликозидгидролаз. С невысоким уровнем активности они обнаружены только у обитателей морской среды. Несмотря на многолетние усилия ряда

ч

исследовательских коллективов, в настоящее время нет коммерческого препарата данного фермента с охарактеризованными свойствами и субстратной специфичностью.

В качестве источников а-галактозидазы, а-Ы-ацетилгалактозаминидазы и фукоиданазы наибольший интерес представляют морские бактерии. Бактерии играют ключевую роль в метаболических процессах морских экосистем. Быстрый ответ микроорганизмов на экологические изменения, их важные функции в экосистемах обеспечиваются разнообразными ферментными системами. Гетеротрофные, аэробные, облигатно морские бактерии привлекают все большее внимание как источники ферментов с оригинальными свойствами и специфичностью, так как они легко культивируются, обладают высокой скоростью размножения и позволяют осуществлять биосинтез веществ в контролируемых условиях. Кроме того, генетический материал уникальных бактерий можно использовать для создания суперпродуцентов рекомбинантных ферментов на основе легко культивируемых известных технологичных штаммов.

Современное развитие генетической инженерии и морской аквакультуры позволяет рассчитывать на создание новых биотехнологических процессов, альтернативных экологически деструктивной крупномасштабной добыче морской биомассы для получения ферментов.

Целью исследования являлось изучение О-гликозидгидролаз из истинно морских гетеротрофных бактерий, имеющих биотехнологический потенциал: а-Ы-ацетилгалактозаминидаз и а-галактозидаз, пригодных для получения "универсальной крови", а также фукоиданаз, участвующих в биодеградации биологически активных полисахаридов бурых водорослей — фукоиданов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать особенности распространения а-М-ацетилгалактозаминидаз и а-галактозидаз среди морских бактерий, собранных в различных акваториях Мирового океана;

- провести поиск а-М-ацетилгалактозаминидаз и а-галактозидаз, удаляющих иммуннодоминантные моносахариды от углеводных составляющих антигенов эритроцитов крови человека при нейтральных значениях рН,

- из перспективных источников выделить а-Ы-ацетилгалактозаминидазу и а-галактозидазу в гомогенном состоянии, охарактеризовать их основные биохимические свойства и субстратную специфичность;

- изучить действие а-М-ацетилгалактозаминидазы и а-галактозидазы на эритроциты крови человека группы А и В, а также действие а-галактозидазы на клетки буккального эпителия и патогенной бактерии СогупеЬас1епит сИрМЬепае-,

- установить первичную структуру, пространственную организацию, механизм действия а-галактозидазы и её принадлежность к определённому семейству гликозидгидролаз;

- провести поиск ингибиторов а-галактозидазы среди морских природных соединений, а также их синтетических производных;

- выполнить иммобилизацию а-галактозидазы в полисахаридсодержащие нанокомпозитные материалы;

- получить высокоочищенный образец фукоидана, охарактеризовать элементы его структуры и обусловленные ими биологические свойства;

- провести поиск фукоиданаз среди бактерий-эпифитов и ассоциантов морских животных Охотского и Японского морей, исследовать особенности их распространения среди у-протеобактерий и бактероидов, используя высокоочищенный субстрат;

- изучить особенности деградации фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides под действием ферментов из морских бактерий, принадлежащих к различным таксонам и культивируемых на различных по составу питательных средах;

- определить области практического применения ферментов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Облигатно морские бактерии, обитающие в Охотском и Японском морях, являются перспективными источниками a-N-ацетилгалактозаминидаз, а-галактозидаз и фукоиданаз.

2. a-N-ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericius КММ 426т удаляет иммунодоминантные а-1,3-связанные остатки N-ацетилгалактозамина от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы крови А.

3. a-Галактозидаза из морской у-протеобактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 удаляет иммунодоминантные а-1,3-связанные остатки галактозы от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы В. Фермент имеет свободную SH-группу, важную для проявления активности; по биохимическим свойствам, субстратной специфичности, первичной и пространственной структуре он относится к 36-ому семейству О-гликозидгидролаз.

4. Иммобилизация a-галактозидазы в гибридные полисахарид-силикатные нанокомпозитные материалы увеличивает уровень ее активности и стабильность.

5. Влияние полигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность тиоловой a-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 зависит от природы заместителей, их числа и положения в структуре соединений: эхинохром А не влияет на активность фермента, ди- и тригалогензамещенные нафтазарины являются необратимыми ингибиторами a-галактозидазы.

6. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens, освобожденный от полифенольных соединений, сохраняет структурные характеристики и биологические свойства исходного полисахарида. Образец полисахарида пригоден для использования в качестве субстрата при поиске фукоиданаз, изучении их свойств и субстратной специфичности.

7. Фукоиданазы с невысоким уровнем активности широко распространены как среди бактерий-эпифитов бурых водорослей, так и среди изолятов морских иглокожих. Лучшими продуцентами являются бактерии родов Alteromonas и Pseudoalteromonas филума Proteobacteria, а также бактерии семейства Flavobacteriaceae типа Bacteroidetes.

8. у-Протеобактерия Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549т, а также бактероиды семейства Flavobacteriaceae, такие как Mesonia algae КММ 3909т, Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 содержат ферменты, участвующие в деградации как нейтральных, так и полианионных полисахаридов бурых водорослей, в том числе — фукоиданазы. Уровень активности фукоиданаз в клетках этих бактерий невысок и варьирует в зависимости от состава питательной среды.

9. Фукоиданазы из штаммов бактерии Pseudoalteromonas citrea, которые являются эпифитами бурых водорослей F. evanescens и Chorda filum, а также ассоциантами голотурии Apostichopus japonicus, катализируют гидролиз доступных а-1,3-0-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens по эндо-типу, образуя в качестве продуктов сульфатированные a-L-фукоолигосахариды.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выполнено крупномасштабное исследование распространенности О-гликозидгидролаз среди бактериальных изолятов различных экотопов Охотского, Японского, Южно-Китайского,

Кораллового морей, литорали Сейшельских о-в, о-в Кука и других акваторий Мирового океана.

Впервые в морских бактериях найдены гликозидгидролазы, модифицирующие эритроциты и гликопротеины крови человека группы А и В: а-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701, a-N-ацетилгалактозаминидаза из Arenibacter latericius КММ 426т, проведено их выделение и очистка; впервые показано, что а-галактозидаза из морской бактерии нарушает углеводные структуры, экспрессированные на поверхности эпителиоцитов человека и бактерий С. diphtheriae.

Установлена полная аминокислотная последовательность a-галактозидазы и принадлежность ее к 36 семейству О-гликозидгидролаз. Впервые методом сравнительного моделирования получены теоретические модели пространственной структуры a-галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701, её каталитического домена и комплекса с конкурентным ингибитором галактозой. На основании результатов этих исследований установлены функционально значимые участки в молекуле фермента и их роль в катализе.

Выполнена иммобилизация a-галактозидазы в гибридных нанокомпозитных материалах, содержащих полисахариды, в результате чего увеличилось время функционирования фермента и его термостабильность.

Среди природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов обнаружены ингибиторы a-галактозидазы; наиболее значительным необратимым ингибирующим действием отличались хлорпроизводные этих соединений.

Из бактерии Pseudoalteromonas citrea выделен фермент, который катализирует гидролиз доступных а-1,3-0-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens и является 1,3-а-1_-фуканазой (ЕС 3.2.1.-).

Результаты исследований защищены патентами и позволят достичь конечной практической цели — применения ферментов морских бактерий и их рекомбинантных форм в медицине, структурной химии углеводов и генной инженерии.

Апробация результатов. Результаты диссертационной работы были представлены в виде постерных сообщений и устных докладов на следующих Региональных, Всероссийских и Международных конференциях и симпозиумах: 45th Arctic Science Conference "Bridges of the science between North America and the Russian Far East" (Vladivostok, Russia, 1994), PICIES Workshop on the Okhotsk Sea and Adjacent Areas (Vladivostok, Russia, 1995), 2-ом Съезде биохимического общества (Москва, Россия, 1997), Proceedings Conference Oceanology International 97 Pacific Rim (World Trade Center, Singapore, 1997), Научной конференции ТИБОХ ДВО РАН "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 1998), IX Pacific Science Inter-Congress (Taipei, Taiwan, 1998), 2-ОМ Международном симпозиуме "Химия и химическое образование" (Владивосток, Россия, 2000), Научной конференции "Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока" (Владивосток, Россия, 2001), 9lh International Symposium on Microbial Ecology (Amsterdam, Holland, 2001), Science Cnference on Marine Biotechnology (Shizuoka, Japan, 2001), 18th European Conference on Biomaterials (Stuttgart, Germany^ 2003), Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 2004), XVIII International Seaweed Symposium (Bergen, Norway, 2004), "2004 International Meeting of the Federation of Korean Microbiological Societies" (Seoul, Korea, 2004), V Всероссийском научном семинаре и молодежной школе "Химия и медицина" (Уфа, Россия, 2005), PICES XIV (Vladivostok, Russia, 2005), 31st FEBS congress (Turkey, 2006), II Региональной научной конференции "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, Россия, 2006), 1st Far-Eastern International Symposium on

Life Sciences (Vladivostok, Russia, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 26 статей в отечественных и международных журналах и 37 тезисов докладов в сборниках трудов Региональных, Всероссийских и Международных конференций и симпозиумов. Штаммы-продуценты, способы получения ферментов защищены тремя патентами РФ.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 596 источников. Работа изложена на 276 страницах, содержит 50 таблиц и 79 рисунков.

Автор искренне благодарен научному руководителю и учителю, д.х.н., проф. Еляковой Л.А., научному консультанту, зав. лабораторией химии ферментов, д.х.н., проф. Звягинцевой Т.Н. за ценные советы, глубокий и критический анализ и помощь в работе. Автор глубочайше признателен всем сотрудникам лаборатории химии ферментов и других лабораторий и подразделений ТИБОХ ДВО РАН, принимавшим участие в работе: к.х.н. Сова В.В., к.х.н. Шевченко Н.М., н.с. Киселёвой М.И., к.б.н. Кусайкину М.И., к.б.н. Бурцевой Ю.В., к.х.н. Ермаковой С.П., д.б.н., член.-кор. РАН Михайлову В.В., д.б.н. Недашковской О.И., д.б.н. Ивановой Е.П., к.б.н. Шевченко Л.С., д.б.н. Пивкину М.В., к.б.н. Рассказову В.А., к.б.н. Балабановой Л.А., к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., к:ф-м.н. Исакову В.В., к.ф-м.н. Глазунову В.П., н.с. Ким Н.Ю., вед. инженеру-электронику Кулешу Ю.Г., д.х.н. Ануфриеву В.Ф., д.х.н. Новикову В.Л., к.х.н. Похило Н.Д., к.х.н. Шестак О.П., к.х.н. Кольцовой Е.А., к.х.н. Чикаловец И.В. Автор также благодарен за плодотворное сотрудничество в работе сотруднику Института химии ДВО РАН д.х.н., член.-кор. РАН Щипунову Ю.А., сотрудникам Института микробиологии и эпидемиологии РАМН, акад. РАМН Беседновой H.H., д.б.н. Запорожец Т.С., д.б.н. Кузнецовой Т.А., к.б.н. Макаренковой И.Д., сотрудникам Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, д.х.н., проф. Усову А.И., к.х.н. Лихошерстову Л.М. и к.х.н. Мартыновой М.Д., сотрудникам Гематологического научного центра РАМН к.б.н. Кульману P.A. (посмертно), д.б.н., проф. Макарову В.А., к.б.н. Дрозд H.H., сотруднику Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, д.х.н., проф. Рабиновичу М.Л.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы, состоящем из двух основных глав, даны общие представления о ферментах, относящихся к группе О-гликозидгидролаз (GH) 1. Описано распространение, свойства, классификация, структура и механизм действия а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз — представителей различных

Используемые сокращения: GH - гликозидгидролаза, GalA - а-галактозидаза, NAGalA - a-N-ацетилгалактозаминидаза, NAGIcB - p-N-ацетилглюкозаминидаза, F2 - фукоидан из бурой водоросли Fucus evanescens, освобожденный от недиализуемых полифенолов, FL - фукоидан из бурой водоросли Laminaria cíchorioides, FucA - a-фукозидаза, GlcB - (3-глюкозидаза, PsGalA - а-галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701, TmGalA - а-галактозидаза из термофильной бактерии Thermotoga marítima, OsGalA - а-галактозидаза из культуры клеток Oryza sativa, pNPHaGal -л-нитрофенил-а-О-галактопиранозид, pNPHNAcaGal - л-нитрофенил-М-ацетил-а-О-галактозаминид, U -стандартная единица активности фермента (мкмоль/мин/мл), а.о. - аминокислотный остаток, АЧТВ -активированное частичное тромбопластиновое время, ГВК-А, ГВК-В и ГВК-Н - групповые вещества крови А, В и Н соответственно, БСА - бычий сывороточный альбумин, н.п. - нуклеотидная последовательность, п.н. - пара нуклеотидов, ОРС - открытая рамка считывания для белка, КД -круговой дихроизм, ТГЭОС - тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликат, Cat-HEC - катионное производное гидроксиэтилцеллюлозы, ЛБГ - галакгоманнан бобов белой акации, Мм - молекулярная масса, Да, Мг - молекулярная масса, а.е.м., СФ - спектры флуоресценции, Ме24 - ионы двухвалентных металлов, НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием, ИС - индекс сравнения, ЭЧ-А, ЭЧ-В, ЭЧ-0 - эритроциты человека группы А, В и О.

семейств СН. Основное внимание уделено ферментам, которые используются в биотехнологии получения универсальной крови из донорских эритроцитов разных групп. Обобщены немногочисленные сведения о фукоиданазах — ферментах, принимающих участие в деградации фукоиданов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Гликозидазы морских бактерий, инактивирующие групповую специфичность эритроцитов крови человека

а-Галактозидаза (Са1А) (ЕС 3.2.1.22) и а-Ы-ацетилгалактозаминидаза (МАСа1А) (ЕС 3.2.1.49) — О-гликозидгидролазы, катализирующие отщепление соответственно остатков галактозы (Р-Са!) и Ы-ацетамидо-2-дезокси-а-0-галактопиранозы (ЫАсОа!), связанных а-гликозидной связью, от невосстанавливающих концов различных олигосахаридов, разветвленных полисахаридов, а также гликозидов и углеводных составляющих различных природных гликоконъюгатов. Ферменты, удаляющие иммунодоминантные а-1,3-связанные остатки Р-йа! и МАсСа! эритроцитов крови групп В (ЭЧ-В), А (ЭЧ-А) и АВ, трансформируя их в эритроциты "универсальной крови" О (ЭЧ-О) при нейтральный значениях рН, физиологической температуре и ионной силе, в условиях, когда красные клетки сохраняют жизнеспособность, представляют большой практический интерес для решения проблем трансфузионной медицины. В литературе приводились сведения об успешном переливании добровольцам "универсальной крови", полученной путем ферментативной обработки при рН 5,5 ЭЧ-В а-галактозидазой из зерен кофе. Так как фермент имеет кислый рН-оптимум действия (3,5-4,0), процедура обработки опытной партии эритроцитов требовала больших количеств дорогостоящего ферментного препарата. Имеются сообщения об Са1А и ЫАОа1А из клинических штаммов анаэробных симбиотрофных и патогенных бактерий ВасЛегоШей КадШв и ЕНзаЬе(Ьк1пд1а тептдозерИса соответственно, эффективно действующих при - рН 7,0, которые полностью конвертировали ЭЧ-В и -А в ЭЧ-О. Сведения о подобных ферментах из морских бактерий отсутствуют.

Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН обладает обширной коллекцией морских бактерий, собранных в различных районах Мирового океана во время экспедиций научно-исследовательского судна "Академик Опарин". Первая часть работы посвящена исследованию Са1А и ЫАСа1А из морских бактерий.

1.1 Распространение а-галактозидаз и а-М-ацетилгалактозаминидаз среди

морских бактерий

Проведен поиск Са1А и МАСа1А среди 2008 и 860 морских бактерий соответственно. В качестве субстратов для тестирования активности ферментов использованы коммерческие хромогенные гликозиды: рЫРНаСа! и рЫРНЫАсаСа! для Са1А и ЫАСа1А соответственно (0,1 М Ыа+-фосфатный буфер, рН 7,0). Выполнен анализ распространения этих ферментов среди морских бактерий, изолированных из различных местообитаний Мирового океана (рис. 1).

Рис. 1. Гистограмма, показывающая соотношение между общим числом исследованных штаммов бактерий, выделенных из различных экотопов Мирового океана, и количеством продуцентов а-галактозидаз и а-Ы-ацетилгалактозаминидаз.

ПАба!Д

В целом, из общего числа изученных штаммов 28% содержали Са1А и 19% — МАСа1А. Среди свободноживущих микроорганизмов штаммы-продуценты Са1А и МАва1А встречались реже, чем среди изолятов животных. Продуценты Са1А и МАСа1А, выделенные из животных, составляли 15 и 12% соответственно, из водорослей — 2 и 1 %.

Наибольшее количество продуцентов Са1А было обнаружено у изолятов Охотского и Японского морей 40%), тогда как продуценты ЫАСа1А встречались среди них довольно редко 14%) (рис. 2).

Рис. 2. Распределение продуцентов а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактоз-аминидаз, по различным районам Мирового океана: Охотскому (I) и Японскому (II) морям, Тихому океану в районе островов Кука (III), Индийскому (IV) и Атлантическому океанам (V): количество изученных штаммов (1), из них активных (2).

В Тихом океане у островов Кука почти половина изолятов являлись продуцентами и GalA, и NAGalA, тогда как в Атлантике у Канарских островов до 38% изолятов синтезировали GalA, а продуцентов NAGalA там не обнаружено. Не обнаружены продуценты ни GalA, ни NAGalA среди 326 изолятов Кораллового моря.

Анализ микробных популяций, выделенных из 50 морских животных и водорослей, показал, что GalA синтезировали бактерии (91%), ассоциированные с красной водорослью Polysiphonia sp., а также бактерии 60%), ассоциированные с губками из Охотского моря. Заслуживают внимания микробные популяции голотурии Stichopus herrenes, собранной в районе островов Кука, почти 44% бактерий-ассоциантов которой синтезировали NAGalA, тогда как продуценты GalA среди них отсутствовали.

Следует отметить, что бактерии распространенного в морской среде филума Proteobacteria, рода Pseudoalteromonas проявили себя лучшими продуцентами GalA, тогда как NAGalA чаще встречались среди немногочисленных изолятов родов Aeromonas, Enterobacter, Pseudomonas.

Бактерии рода Pseudoalteromonas относятся к истинно морским представителям прокариот. Они способны утилизировать разнообразные природные субстраты, включая полисахариды водорослей. У некоторых штаммов, исследованных в представленной работе, была обнаружена способность гидролизовать агар-агар из красных водорослей Ahnfeltia sp., Gelidium amansii и др. Скрининг 404 штаммов-агаролитиков рода Pseudoalteromonas из Коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (КММ) выявил продуценты высокоактивных GalA среди свободноживущих псевдоальтеромонад (10%) и среди ассоциантов гидробионтов (27%), собранных в Охотском и Японском морях.

По результатам широкого скрининга были отобраны продуценты GalA и NAGalA. Клеточные экстракты этих штаммов, а также очищенные препараты ферментов были проверены по действию на ЭЧ и ГВК крови групп А и В в Гематологическом научном центре РАМН и Институте органической химии им. Д.Н. Зелинского РАН. Для дальнейшего изучения выбраны два штамма бактерий под номерами КММ 426 и КММ 701, экстракты которых содержали NAGalA и GalA, инактивирующие серологическую активность эритроцитов А и В при pH 7,3 соответственно.

800 700 600 500 400 300 200 100 О

Я Количество штаммов ьз'А

Количество штаммов MAbälA

У П .В я _.....

1 2 ' 1 2 ' 1 2 1 2 12 I II III IV V

1.2 а-М-ацетилгалакгозаминидаза из бактерии Агеш'Ьас(ег Ыеп'сшэ КММ 426т, устраняющая групповую специфичность А-эритроцитов

В результате таксономического изучения фено-, фило- и генотипических характеристик новый изолят под номером КММ 426, выделенный из грунта ЮжноКитайского моря, был валидизирован как новый род и вид морских бактерий АгетЬаЫег Ыепсшз КММ 426т из семейства Р/аиэйас^ел'зсеа филума Вас(егойе/е5.

В клеточном экстракте бактерии обнаружены следующие гликозидазы (т11/мг белка) 2: р-1\1-ацетилглюкозаминидаза (МАС1сВ) (32,0), 1ШЗа1А (0,44), Са1А (0,14), а-фукозидаза (РисА) (0,81), а-маннозидаза (МапА) (0,14) и р-ксилозидаза (Ху1В) (+). Ферменты, деградирующие полисахариды, выявлены не были.

Процедура очистки ^Са1А включала экстракцию дезинтегрированной биомассы, анионообменную хроматографию и гель-фильтрацию (табл. 1).

Таблица 1

Очистка а-Ы-ацетилгалактозаминидазы из биомассы АгетЬас1ег ШепсшБ КММ 426т

Стадии очистки Фракция Общий белок, мг Общая активность, ти Удельная активность, ш11/мг Степень очистки

Экстракция 1570 677 0,4 0

ОБАЕ-ЗерИагозе СЬбВ II 380 547 1,4 3,5

ЗерЬагоэе СЬбВ Иб 35 189 5,4 14,0

ОЕАЕ-Тоуореаг!-650 М Мб 6 139 23,1 57,5

После хроматографии на ОЕАЕ-БерЬагозе СЫзВ были получены две белковых фракции (I и II), содержащие а-Ы-ацетилгалактозаминидазную активность. Фракция I не сорбировалась на анионообменной смоле в условиях разделения. Фракция II, в свою очередь, была разделена гель-фильтрацией на два пика активности (На и 116, минорный высокомолекулярный и основной ~ 80 кДа соответственно).

МАСа1А11б проявляет максимальную активность в районе значений рН 7,0-8,0. Этот интервал значений рН является наиболее комфортным для проведения реакции конверсии ЭЧ-А в ЭЧ-О. МАСа1А11б сохраняет 100% активности в течение 30-минутного прогревания при 50°С и рН 7,2, длительное время активна при 4°С и в течение недели — при 20 "С в присутствии 0,1% азида натрия, выдерживает замораживание в виде суспензии при высоких концентрациях (NN4)2803.

Рис. 3. Зависимость активности

а-М-ацетилгалактозаминидазы из морской бактерии АгетЬа^ег Шепсш КММ 426т от концентрации №С1 в растворе 0,01 М Ма'-фосфатного буфера, рН 7,2, 20'С.

2 Стандартную активность гликаназ определяли по появлению восстанавливающих Сахаров, образующихся в результате ферментативного гидролиза соответствующих полисахаридов. За единицу активности (I)) принимали количество фермента, при действии которого образуется 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров за 1 мин. Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли по методу Нельсона, используя в качестве стандарта соответствующий моносахарид. Стандартную активность гликозидаз определяли по л-нитрофенолу, выделившемуся в ходе гидролиза соответствующих коммерческих хромогенных гликозидов. Количество л-нитрофенола определяли спектрофотометрически при 400 нм (е=18300 моль"1 см"1) и рассчитывали по формуле: II = Оаоо/(18,3х\/хт), мкмоль/минхмл, где: V- объём аликвоты фермента (мл), т - время реакции (мин). За единицу активности фермента (II) принимали такое его количество, которое катализировало образование 1 мкмоля л-нитрофенола в минуту.

Как многие ферменты морских микроорганизмов, МАСа1АИб галотолерантна, а при концентрации МаС1, равной 0,5 М, ее активность возрастает почти вдвое (рис. 3).

Константа Михаэлиса-Ментен (Кт) ЫАСа1АНб по рМРИМАсава! при рН 7,2 равна 0,60±0,07 тМ. Значение молекулярной массы МСа1АПб по данным БОЭ-электрофореза в денатурирующих условиях составляет 48 кДа, а по результатам гель-фильтрации в физиологических условиях — 94 кДа. Этот факт свидетельствует о наличии четвертичной структуры у фермента, т.е. МАсСа1АИб в растворе образует гомодимер.

Методом ингибиторного анализа исследована роль отдельных аминокислотных остатков в каталитической активности МАСа1АПб (табл. 2).

Таблица 2

Влияние химических реагентов на активность а-М-ацетилгалактозаминидазы

Реагент

л-Хлормеркурибензоат

N-Этилмалеимид

N-Бромсукцинимид

Карбодиимид

Ацетилимидазол

2,2' Дианизидин

Диэтилпирокарбонат

EDTA

2*

Са Мд

2+

Мп

NAD(H) Азид натрия Этанол _

Концентрация реагента M

рН реакции

Остаточная активность. %

1,8 1,8 1.8 1,8 5,0 2,0 2,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 3,0

10

•з

10

-з

10

10"3 ю-3 ю-3 10"3 10

-з

10 ю" 10 10

10

ю"

2%

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

7,2 7,2 7,2 7,2 7,2 7,2

0 60 0 О 30 70 60 100 80

0 130 100 100 100 100

Ингибирование NAGalAII6 л-хлормеркурибензоатом и N-этилмалеимидом предполагает важное значение свободных SH-групп для проявления ферментативной активности этого фермента. Полная потеря активности фермента под действием карбодиимида может свидетельствовать о существенном значении карбоксильных групп остатков Asp и/или Glu, которые входят в активные центры всех известных гликозидаз, где выполняют различные функции. Окисление NAGalAII6 N-бромсукцинимидом при рН 7,2 также приводило к полной потере ее активности. Известно, что в указанных условиях, наряду с остатками Тгр, могут быть задеты и имидазольные группы His, и свободные SH-группы остатков Cys. Установлено, например, что у представителя семейства GH27, рекомбинантной NAGalA из печени цыпленка, остаток Тгр16 участвует в образовании комплекса с субстратом. В активном центре NAGalA семейства GH109 остатков Тгр не отмечено. Важным для проявления активности у этого фермента является His228. Однако при действии диэтилпирокарбоната, растворенного в этаноле, на фермент из морской бактерии, сохранялось около 60% его активности. Растворитель, 2%-ный этанол, не ингибировал NAGalAII6.

EDTA незначительно снижала активность NAGalAII6, ионы Ca2t полностью ее инактивировали, а в присутствии Мд2+ активность фермента возрастала на 30% (табл. 2). Экзогенные Мпг+ и NAD+ не влияли на активность NAGalAII6. Зависимость гидролитической активности от присутствия ионов Me2* — отличительная черта только гликозидгидролаз семейства GH4, среди представителей которого a-N-ацетилгалактозаминидаз пока не обнаружено. a-N-ацетилгалактозаминидазы

семейства вНЮЭ, эффективно конвертирующие ЭЧ-А в ЭЧ-О, являются МАй+ зависимыми ферментами, но не нуждаются в ионах Ме2+ для проявления активности.

Автоматическим методом Эдмана определена Ы-концевая аминокислотная последовательность нативной МАСа1АИб, состоящая из 15 а.о. (ОАКУМССРЭАРКЬОТ). Отмечено ее сходство с Ы-концевой последовательностью ферментов семейства СН109.

Изучено действие ЫАСа1А11б на ЭЧ-А и групповую специфичность ГВК-А. В таблице 3 показаны результаты иммунологического изучения нативных и обработанных ферментом ЭЧ-А.

Таблица 3

Титр агглютинации донорских эритроцитов группы А до и после обработки

g-N-ацетилгалактозаминидазой

Цоликлон-А Титр агглютинации

2 4 8 16 32 64 128 256 512

анти-А + трансформированные ЭЧ-А .........

анти-А + нативные ЭЧ-А + + ++ + + + +

Видно, что все А-антигены трансформированы ферментом в Н-антигены, так как нет агглютинации с анти-А сывороткой. NAGalAllö не вызывала неспецифической агглютинации эритроцитов и их гемолиза. Полная инактивация серологической активности ЭЧ-А может свидетельствовать о том, что NAGalAII6 модифицирует ЭЧ как группы Аг, так и Ai. Это отличает NAGalAII6 от NAGalA из печени цыпленка, бактерий R. torques IX-70265 и С. perfringens, которые конвертируют только ЭЧ-А2. На сегодняшний день полная конверсия ЭЧ-А в ЭЧ-0 была достигнута только под действием рекомбинантного фермента из бактерии Е. meningoseptica.

Препарат NAGalAllö проявлял высокую активность в реакции ингибирования гемагглютинации с групповым веществом крови А (ГВК А+Н), имеющим детерминанты, аналогичные таковым ЭЧ-А. Для установления типа действия NAGalAllö, ГВК А+Н обрабатывали препаратом фермента, продукты ферментолиза разделяли гельфильтрацией. В низкомолекулярной фракции, предварительно подвергнутой кислотному гидролизу, был идентифицирован галактозамин (NAcGal), при практически полном отсутствии других моносахаридов. Это свидетельствовало о том, что NAGalAllö является экзо-гликозидазой.

Таким образом, из морской бактерии A. latericius КММ 426т выделена a-N-ацетилгалактозаминидаза, представляющая большой практический и теоретический интерес. Благодаря способности действовать на ЭЧ-А и ГВК-А в нейтральной области pH она может быть весьма перспективной и как биохимический инструмент, и как фермент для получения универсальных эритроцитов из эритроцитов человека группы А.

1.3 a-Галактозидаза бактерии Pseudoalteromonas sp. KIMM 701, устраняющая групповую специфичность В-эритроцитов 1.3.1 Характеристика штамма

Штамм облигатно морской бактерии, синтезирующий GalA с требуемыми свойствами, был выделен из воды Охотского моря. Исследование фенотипических признаков показало, что бактерия является гетеротрофной, аэробной, галофильной, психротолерантной, грамотрицательной, движущейся посредством единственного полярного жгутика.

По результатам филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК штамма КММ 701 (инвентарный номер GenBank EU661863) новый изолят относится к членам филума Proteobacteria, класса у-Proteobacteria и образует кластер с непигментированными бактериями рода Pseudoalteromonas. Ближайшим

филогенетическим родственником исследуемого штамма оказался штамм Pseudoalteromonas nigrifaciens NCIMB 8614т с гомологией последовательности гена 16S-pPHK 99,1%. Уровень гомологии последовательностей гена 16S-pPHK между КММ 701 и типовыми штаммами родственных видов достигал 98,9% для P. elyakovii КММ 162т и P. espejiana NCIMB 2127т, 98,8% для P. haloplanktis АТСС 14393т, Р. distincte КММ 638' и P. paragorgia КММ 3548т, 98,7% для P. carrageenovora IAM 12662т, 98,6% для P. agarivorans КММ 255т, 98,4% для P. gracilis В9Т и P. issachenkonii КММ 3549т, 98,1% для Р. aliena КММ 3562т и 97,5% для P. antarctica СЕСТ 4664т. Уровень гомологии последовательностей с другими видами бактерий рода Pseudoalteromonas был ниже 97,5%. На основании данных филогенетического анализа можно предположить, что штамм КММ 701 принадлежит новому виду в пределах рода Pseudoalteromonas.

В экстракте сырой биомассы бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 обнаружены только 4 гликозидгидролазы (mll/мг белка): GalA (102,0±22,0) и GalB (5,8±0,5), а также ламинараназа (12,4±1,7) и амилаза (8,04). По уровню активности GalA из Pseudoalteromonas КММ 701 (PsGalA) превосходила в 10-20 раз 3 других гликозидгидролазы.

Активность PsGalA появлялась в клетках бактерии после 5 ч культивирования и достигала максимального значения через 24 ч (рис. 4).

Рис. 4. Изменение биомассы бактерии РвеибоаПеготопаз ер. КММ 701 (1), общего белка (2), а-галактозидазной активности (3) в процессе роста бактерии. Т — 26'С, скорость вращения качалки — 120 об/мин, состав среды (г/л): бактопептон — 5,0, глюкоза — 1,0, К2НРО4 — 0,2, дрожжевой экстракт — 2,0, дистиллированная вода — 500 мл, стерильная морская вода — 500 мл, рН 7,8.

Показано, что для биосинтеза РвСа1А бактерия не требует определенного индуктора и может расти на стандартной среде, содержащей глюкозу.

1.3.2 Выделение и основные свойства а-галактозидазы

В результате последовательности процедур, указанных в таблице 4, получен высокоочищенный препарат РзСа1А.

Таблица 4

_Очистка а-галактозидазы из Pseudoalteromonas эр. КММ 701_

Стадии очистки Общий белок, мг Общая активность, U Удельная активность, U/мг Степень очистки, раз Выход, %

Экстракт 2094,2 230,4 0,11 0 100

40-80% (NH4)2S04 1084,0 177,1 0,16 1,5 77

DEAE Toyopearl 650 M 20,0 115,2 5,76 52,4 50

Sepharose CL-4B 3,0 46,1 15,40 140,0 20

Source 15Q PE 4,6/100 0,12 27,6 231,00 2100,0 12

РвСа1А проявляет максимальную активность в области значений рН 6,7-7,7 (рис. 5), термолабильна, при 37°С полностью теряет активность в течение 10 мин (рис. 6). Однако

при 20°С фермент сохраняет активность более суток. Присутствие бычьего сывороточного альбумина (БСА) защищает РэСа1А от термической денатурации (рис. 7).

0,06

0,04 0,02 О

\

8 9 рН

й* 120

о 100

X

ьи

ф 4П

о

та 20

0

20 25 30 35 40 Т°С

Рис. 5. Зависимость начальной скорости гидролиза РзСа1А от рН, 0,1 М №+-ацетатно-фосфатно-боратный буфер.

Рис. 6. Термостабильность РзСа1А. Прогревание в течение 10 (1) и 30 (2) мин, 0,02 М №*-фосфатный буфер, рН 7,0.

Термолабильность свойственна ферментам морских психротолерантных бактерий, обитающих в водах северных морей, которые летом прогреваются только до 4°С.

1 2 3 4 5 Время, ч

Рис. 7. Зависимость активности РзЗа1А от времени выдерживания ее при 20° (1), 25° (2) и 30°С (3) в присутствии (а) и в отсутствии (б) 0,2% БСА, 0,02 М №+-фосфатный буфер, рН 7,0.

0,5 1,0 1,5 2.0 Концентрация, М

Рис. 8. Зависимость активности Р50а1А от концентраций №С1 (1), мочевины (2) и гуанидинхлорида (3), 0,02 М №*-фосфатный буфер, рН 7,0.

Галотолерантность является также характерной чертой морских бактерий и, вероятно, их ферментов. Мочевина и гуанидинхлорид при низких концентрациях инактивируют фермент (рис. 8, кривые 2 и 3), что позволяет предполагать наличие у РзСа1А четвертичной структуры.

Значение молекулярной массы РзСа1А по результатам гель-фильтрации составляет 170+3 кДа, согласно данным ЗОЭ-электрофореза — 80,5+2,5 кДа. Это означает, что в физиологических условиях фермент имеет олигомерную структуру и состоит, по меньшей мере, из двух одинаковых субъединиц с величиной молекулярной массы, равной приблизительно 80 кДа. Такой результат согласуется с литературными данными, что почти все а-галактозидазы бактерий имеют четвертичную структуру.

1.3.3 Субстратная специфичность а-галактозидазы

РзСа1А отщепляет галактозу от мелибиозы (Са1а1,6С1с), дисахарида Са1а1 .Зва! и трисахарида Са1а1,3(Риса1,2)Са1. Последний олигосахарид является концевым фрагментом структуры В-антигена на ЭЧ-В (табл. 5). Фермент из морской бактерии не действует на раффинозу, что отличает его от мелибиаз из наземных источников. Для оценки эффективности действия микробной а-галактозидазы на ГВК-В было

использовано одинаковое количество стандартных единиц изучаемого фермента и коммерческой а-галактозидазы из зеленых бобов кофе.

Таблица 5

Субстратная специфичность а-галактозидазы

_Субстрат_Действие_

рМРНаСа! +

Са1а1,ЗСа1 +

Са1а1,3(Гиса1,2)Са| +

6а1а1,661с + Са1а1,6С1с|31,2Рги

ГВК-В +

ЭЧ-В +

ЭЧ-А____" _

РБСа1А оказалась существенно более активной на модели эритроцитарного антигена, чем кофейная 6а1А, использовавшаяся ранее в опытах по трансформации донорских эритроцитов для внутривенного введения. Установлено, что для достижения одинаковой инактивации ГВК-В требуется РэСа1А примерно в 4 раза меньше, чем Са1А из зеленых бобов кофе.

1.3.4 Каталитические свойства а-галактозидазы

В таблице 6 представлены кинетические параметры гидролиза р1МРНаСа1, катализируемого РзСа1А.

Таблица 6

Условия Km, mM Vm"': kcat, мин'1 мкмоль/мин mM"1 мин"1

0,1 М 1\|а+-фосфатный буфер, рН 7,3, 20'С, 0,1 М NaCI 0,40±0,035 0,81 ±0,019 36,82 92,05

Величина константы Михаэлиса-Ментен (Кт) РзСа1А типична для бактериальных ферментов, тогда как величина кса, равная 36,82 мин"1, является низкой по сравнению с таковыми для известных Са1А из семейств СН27 и СН36. РзСа1А по эффективности действия на хромогенный гликозид (к^/Кл,) в три раза превосходит Са1А из ВаЛею^ёеэ ЬгадШ (семейство СН110), которая проявляет более низкое сродство (Кт = 0,70 тМ) к р1\1РНаСа1, но эффективно конвертирует ЭЧ-В в ЭЧ-О.

Показано, что галактоза является конкурентным игибитором РвСа1А (К| = 1,32 тМ) (рис. 9 и 10).

1/V, мин/мкмоль

1/v, мин/мкмоль

и

4 -2 0 2 4 6 8 10 1/S,mM

Рис. 9. График Лайнуивера-Берка. Зависимость начальной скорости гидролиза от концентрации р1МРНаСЗа1 в обратных координатах в присутствии 0, 1, 2, 3 тМ галактозы (зависимости 1, 2, 3, 4 соответственно); 0,1 М Ыа+-фосфатный буфер, рН 7,3, 20*С, 0,1 М МаС1.

2 [Gal], mM

Рис. 10. График Диксона. Зависимость обратной скорости гидролиза 0,10, 0,21, 0,42, 0,83 mM pNPHaGal от концентрации Gal (зависимости 1, 2, 3, 4 соответственно). K¡ = 1,32 mM; условия эксперимента аналогичны указанным на рис. 9.

Тип ингибирования установлен с помощью графика Лайнуивера-Берка, из которого видно, что в присутствии возрастающих концентраций D-Gal увеличивается значение Кш фермента при постоянной величине Vmax (рис. 9). Величина константы ингибирования определена по графику Диксона (рис. 10). Согласно литературным данным D-Gal ингибирует активность многих растительных а-галактозидаз семейства GH27 по механизму конкурентного или смешанного ингибирования. Следует отметить, что D-Gal является слабым конкурентным ингибитором для GalA из термофильной бактерии Bacillus stearotherwophilus (Ki = 16,25 mM), и не ингибирует GalA из термофильной археи Sulfolobus solfataricus.

Вопрос о стереохимическом результате ферментативного гидролиза гликозидов является принципиальным при классификации О-гликозидгидролаз. Конфигурацию аномерного центра D-Gal, образующейся при гидролизе pNPHaGal под действием PsGalA, определяли с помощью 1Н ЯМР-спектроскопии. Появление в начале реакции в 1Н ЯМР-спектрах pNPHaGal резонансного сигнала в виде дублета с 5 равным 5,2875,294, который соответствует протонам а-аномерного центра D-Gal, свидетельствует о том, что PsGalA катализирует гидролиз а-О-гликозидной связи с сохранением конфигурации аномерного центра субстрата, как все известные а-галактозидазы клана GH-D. Представители семейства GH110 являются "обращающими" гликозидгидролазами.

1.3.5 Действие а-галактозидазы на антигены клеток человека и бактерий 1.3.5.1 Действие а-галактозидазы на эритроциты человека

Результаты иммунологического изучения нативных эритроцитов и обработанных PsGalA (pH 7,3, 26°С, 24 ч) показаны таблице 7.

Таблица 7

Титры агглютинации нативных и трансформированных под действием

_а-галактозидазы В эритроцитов_

Антисыворотка + В эритроциты _Титр агглютинации_

_2 4 8 16 32 64 128 256 512

Анти-В+трансформированные

Анти-В+нативные Анти-Н+трансформированные

Анти-Н+нативные Анти-М+трансформированные

Анти-М+нативные Анти-М+трансформированные _Анти-М+нативные_

Из таблицы видно, что B-антигены трансформированы в Н-антигены, так как отсутствует агглютинация с анти-В сывороткой. Титр агглютинации с анти-Н сывороткой закономерно увеличен за счет появления новых Н-антигенов вместо B-антигенов. Полученные данные свидетельствуют также об отсутствии в препарате а-фукозидазы. Титр агглютинации с анти-М или анти-N сыворотками не изменяется, что может указывать на отсутствие сиалидаз в изученном образце фермента. PsGalA не вызывала неспецифической агрегации эритроцитов и их гемолиза. При изучении субстратной специфичности фермента на ГВК выяснилось, что на фоне ярко выраженной активности к B-антигенам этот фермент не проявляет активности к А- и Н-антигенам.

Варьируя концентрацию PsGalA, ЭЧ-В и время их обработки ферментом, определили, что 0,24 U/мл фермента конвертируют 1 мл ЭЧ-В в 15-20% гематокрите в течение трехч при 26'С в 0,01 М К+-№+-фосфатном буфере, pH 7,3.

1.3.5.2 Действие а-галактозидазы на эпителиоциты человека

Было исследовано влияние PsGalA на адгезию токсикогенного штамма Corynebacterium diphtheriae к клеткам буккального эпителия. В работе использовали

эпителиоциты донора с группой крови В. Установлено, что Рз6а1А эффективно снижала адгезию патогена (табл. 8).

Таблица 8

Среднее количество бактерий токсикогенного штамма СогупеЬас1епит сИрМЬепае, _прикрепившихся к одной эпителиальной клетке_

Вариант опыта I II III

М±т Р М±т Р М±т Р

PsGalA 6,0±0,3 0,0005 4,7±0,2 0,0005 2,1 ±0,4 0,0005

Контроль 14,7±0,6 14,7±0,6 14,7±0,6

I — фермент инкубировали с микроорганизмами; II — фермент инкубировали с клетками буккального эпителия; III — фермент инкубировали с клетками буккального эпителия и адгезированными микроорганизмами; п=4.

Максимальный эффект достигался в том случае, когда ферментом обрабатывали клетки с уже прикрепившимися микроорганизмами. Это может быть обусловлено действием фермента на углеводные структуры как клеток бактерий, так и эпителиоцитов. Подобный эффект описан для протеолитических ферментов, действие которых приводит к нарушению уже сформированных колоний микроорганизмов, образующих биопленку. Полученные результаты демонстрируют возможность нарушения углеводных структур, экспрессированных на поверхности эпителиоцитов и бактерий, при действии PsGalA.

Известно, что буккальный эпителий, являясь частью мукозальной системы, сохраняет структурные элементы, которые обеспечивают взаимодействие с различными факторами внешней и внутренней среды. На клетках буккального эпителия идентифицированы различные варианты АВН изотипов углеводных цепей, соответствующие АВН антигенам эритроцитов индивидуума. Принимая во внимание способность АВН антигенов участвовать в различных cell-cell и cell-matrix взаимодействиях, результаты, демонстрирующие высокую антиадгезивную активность PsGalA, могут быть обусловлены, в числе прочих возможных факторов, специфичностью фермента, обеспечивающей нарушение углеводных структур, входящих в состав В-антигенов.

Таким образом, выделенная из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 а-галактозидаза представляет большой практический и теоретический интерес. По действию на ГВК-В, ЭЧ-В и другие клетки организма человека и бактерий в нейтральной области значений рН, фермент может быть весьма перспективным не только как биохимический исследовательский инструмент, но и как один из реагентов для получения конвертированных универсальных эритроцитов из эритроцитов группы В.

1.3.6 Характеристика структуры а-галактозидазы 1.3.6.1 Функционально значимые аминокислотные остатки

Роль отдельных аминокислотных остатков в ферментативной активности PsGalA была исследована методом ингибиторного анализа (табл. 9). л-Хлормеркурибензоат натрия ингибировал активность фермента полностью, N-этилмалеимид — на 95%, что говорит о важной роли SH-групп для активности PsGalA. Известно, что соединения с близко расположенными SH-группами (дитиолы) имеют высокое сродство к арсениту натрия и образуют циклические дитиоарсениты. Было показано, что арсенит не влияет на активность фермента. Этот факт позволяет предположить, что в ближайшем окружении SH-группы, важной для активности PsGalA, нет других свободных сульфгидрильных групп.

В присутствии перекиси водорода наблюдалось значительное ингибирование активности PsGalA. Падение активности могло быть связано как с окислением свободных SH-групп Cys, так и остатков Met и Тгр. Окисление N-бромсукцинимидом при различных значениях рН, которое сопровождалось полной потерей активности фермента, также может затрагивать SH-группы, но вероятнее всего в данном случае

модифицируются остаток(и) Тгр, играющие существенную роль в активном центре классических гликозидгидролаз.

Таблица 9

_Влияние химических реагентов на активность а-галактозидазы_

Реагент Концентрация, M рН реакции Остаточная активность, %

л-Хлормеркурибензоат 10* 7,0 0

М-Этилмалеимид 10"3 7,0 5

Арсенит натрия 10'2 7,0 100

Перекись водорода 10"1 7,0 38

ю-3 5,5 0

Ы-Бромсукцинимид 10'3 6,3 0

10"3 7,0 0

ЕРТА 10Г4 10"3 7,0 7,0 100 100

Са2' 10'3 7,0 100

Мд2* 10"3 7,0 100

Азид натрия 3-10"2 7,0 100

Этанол 2-Ю"1 6,0 100

2-Ю"1 7,0 100

На активность фермента не действовали ни EDTA, способная ингибировать активность металлозависимых ферментов, ни азид натрия. Катионы двухвалентных металлов также не требуются ферменту для проявления активности (табл. 9).

1.3.6.2 Определение первичной структуры а-галактозидазы

Последовательность из 15 а.о. (ADTNSFYRLDRVNST) с N-конца полипептидой цепи нативной PsGalA определили с помощью автоматического метода Эдмана. Полную аминокислотную последовательность PsGalA установили с помощью методов молекулярной биологии и генной инженерии. На основании анализа высоко консервативных участков первичной структуры а-галактозидаз семейств GH27 и GH36, размещенных в GenBank (NCBI), были сконструированы вырожденные праймеры для амплификации первого специфического фрагмента гена, кодирующего PsGalA: прямой праймер (5'-RTNGAYGAYGGNTGGTT-3') на участок активного центра I/VDDGWF и обратный праймер (5'-AT(A/C/T)CCCATRTGNCCRAA-3') на участок FGHMGI, где Y, N и R обозначают нуклеотиды С/Т, A/C/G/T и A/G. В течение 44 циклов амплификации геномной ДНК при 55°С был получен единственный фрагмент гена длиной 705 п.н., который клонировали и секвенировали с помощью стандартных процедур. Для получения 5'- и З'-концевых последовательностей, соответствующих открытой рамке считывания для предшественника белка (ОРС), были синтезированы ген-специфические праймеры, ориентированные в противоположные направления.

С помощью четырех из десяти эндонуклеаз рестрикции, которыми обрабатывали ДНК бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 для инверсированной ПЦР, были получены фрагменты ДНК, содержащие ген PsGalA. Фрагмент ПЦР длиной в 1000 п.н. был получен при амплификации лигированных в кольцо рестриктов EcoRI, /4spS9l, Bpu14l, а фрагмент ПЦР длиной в 3000 п.н. был амплифицирован на Psfl-фрагментах ДНК. Все рестрикционные фрагменты ДНК содержали N-концевой участок PsGalA, включая первый метионин. Фланкирующий участок гена длиной в 1200 п.н. со стороны З'-конца, 453 п.н. которого соответствовали С-концевой части первичной структуры белка, был получен с использованием в ПЦР прямого ген-специфеского праймера 3'-CGTGCTGCGGTATCAATGTTC-5'.

В результате выполненных процедур выделен ген PsGalA, соответствующий ОРС для белка, состоящий из 2130 п.н. и кодирующий полипептидную цепь из 710 а.о. Отсутствие потенциального сигнального пептида в выведенной аминокислотной последовательности подтверждает цитоплазматическую локализацию белка. Зрелая

форма белка имеет расчетную молекулярную массу 80,050 «Да и изоэлектрическую точку — pl 5,6, что соответствует экспериментальным данным. Последовательность 15 а.о. с N-конца полипептидной цепи, выведенной из нуклеотидной последовательности гена, совпадает с результатами секвенирования, полученными методом Эдмана. Полная аминокислотная последовательность PsGalA характеризуется высоким содержанием отрицательно заряженных, незаряженных полярных и неполярных аминокислотных остатков, таких как Leu (10,28%), Ser (7,89%), Val (7,04%), Ala (7,04%), Glu (6,90%). Таким образом, установлена полная аминокислотная последовательность а-галактозидазы из морской бактерии, модифицирующей антигены клеток.

1.3.6.3 Характеристика вторичной структуры а-галактозидазы

Содержание элементов вторичной структуры нативной PsGalA (0,01 M Na+-фосфатный буфер, рН 7,3, 0,15 M NaCI, 20'С) определяли экспериментально методом спектроскопии кругового дихроизма (КД). В области спектра КД фермента от 204 до 230 нм наблюдалась широкая отрицательная полоса с минимумом эллиптичности при 219 нм и двумя плечами вблизи 222 и 208 нм, а также положительная полоса с максимумом эллиптичности при 195 нм, что указывало на наличие как a-спиралей, так и p-структуры в полипептидной цепи фермента. На основании результатов анализа спектра КД с помощью пакета компьютерных программ CDPro было установлено, что PsGalA, наиболее вероятно, является а+(3 белком, который содержит 19,1% а-спирали, 29,6% p-структуры и 60,3% неупорядоченной структуры, включая 21,7% р-изгибов (табл. 10).

Таблица 10

Содержание элементов вторичной структуры (%) в молекуле PsGalA_

Метод расчета a-спираль Р-структура р-изгиб Неупорядоченная структура

CONTIN/LL (190-240 нм) 19,1 29,6 21,7 29,6

PSIPRED 21,3 28,6 -*) 50,1

SCRATCH 21,1 24,5 54,4

Примечания: *) — не определяется.

Содержание элементов вторичной структуры PsGalA, рассчитанное с помощью серверов PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/) и SCRATCH (http://www.iab.uci.edu/tools/scratch/) на основании выведенной аминокислотной последовательности (No GenBank DQ530422.1) (табл. 10), хорошо согласуется с экспериментальными данными, полученными для нативной PsGalA из спектров КД.

1.3.6.4 Филогенетический анализ а-галактозидаз

Сравнительный анализ множества аминокислотных последовательностей гомологичных белков из GenBank показал, что PsGalA принадлежит к семейству GH36 и является ближайшим гомологом с а-галактозидазами из морских бактерий семейства Alteromonadales TW-7 (А0ХХ24) идентичность — 92%) и Pseudoalteromonas atlantica (Q15PJ9) (идентичность — 51%), энзиматические свойства которых не охарактеризованы.

Для определения эволюционных отношений между белками из морских бактерий и другими представителями семейств GH27 и GH36 был проведен филогенетический анализ аминокислотных последовательностей ряда а-галактозидаз. Некорневое филогенетическое древо, построенное с помощью сервера Phylogeny.fr на основании множественного выравнивания этих последовательностей представлено на рис. 11. Исследуемые а-галактозидазы разделились на два больших кластера, в которые вошли представители семейства GH27 и GH36 соответственно.

НЧ

I— 08(

■033835 Thermotoga maritime

Q9WXC t Thermus tp. T-2 Q8GEA8 Thermus sp. IB-21

— P28351 Aspergillus nlger P06280 Homo sapiens Q90744 Callus gallus PI7050 Homo sapiens Q6QT41 CeMbrk) mlxtus

Q9HFZ9 Phanerochaete cryzoaporJum

99

99

H 99 r-Q 1—1

Jr,

Q9FXT4 Oryzasatlva Q42656 Coffee arabica Q9SP05 Lycoperslcon esculentum Q6TW99 AJugarepans

— Q9Z4N5 Saccharopolyspora erythrea

— Q9S2C9 Streptomyces coellcolor ■ Q8VV86 Clostridium Josul

_Q92456 Trichoderma reesel

-Q97U94 Suffbfobua rolMericus

61

97

- Q9P8N4 Llchthelmla corymblfera

100 |-Q9UUZ4 Aspergillus nlger

I_Q92457 Trichoderma reesel

-Q88SE5 Lactobacillus plantarum

- Q8XN26 Clostridium pariHngons

— Q84IQ0 Clostridium stercorarium Q9LBD1 Bacillus stearothermoflllus

-Q2XQ11 Bifidobacterium breve

—— Q63IJ0 Pseudomonas pseudomodalel

Q15PJ9 Pseudoalteromonas atiantica A0XX24 Alteromonadalles TW-7 Q19 АХ0 Pseudoalteromonas »p. КИМ 701 -Q2NBZ6 Erythrobacter Utoralls Q7MG03 Vibrio vulnificus Q6D965 Ervlnla carotSvora PI 6551 Escherichia со»

93l-C

гЛ-^Ч'

00 I-4

-ц-

I.

Рис. 11, Филогенетическое древо а-галактозидаз 27 и 36 семейств GH. Филограмма получена с помощью сервера Phvloaenv.fr (http://www.ohvloaenv.frn с использованием программы Phytogeny PhyML 3.0 и статистического теста aLRT для аминокислотных последовательностей а-галактозидаз, выровненных с помощью программы MUSCLE v3.7. Древо построено с помощью программы TreeDyn.

GalA археи Sulfolobus solfataricus (Q97U94), обитающей в грунте геотермальных источников, находится на отдельной ветви в кластере семейства GH36, тогда как а-галактозидазы термофильных баю-ерий Thermus sp. IB-21 (Q8GEA8), Thermus sp. T2

(Q9WXC1) и Thermotoga maritime (033835), изолированных из тех же источников, образовали на филограмме отдельное подсемейство в пределах семейства GH36.

Исследуемая PsGalA (Q19AX0) находится в кластере бактериальных ферментов семейства GH36, на одной ветви с а-гапактозидазами из морских бактерий: Pseudoalteromonas atlantica (Q15PJ9) и инвалидной бактерии семейства Alteromonadales TW-7 (А0ХХ24). Положение а-галактозидаз морских у-протеобактерий рода Pseudoalteromonas на филограмме указывает на ближайшее родство с а-галактозидазами наземных мезофилов семейства Enterobacteriactae (Q2NBZ6). Из топологии полученного дерева следует, что ближайшими родственниками морских ферментов являются а-галактозидазы наземных у-протеобактерий Vibrio vulnificus (Q7MG03), Ervinia carotovora (Q6D965) и Escherichia со// (P16551), некоторое время сохраняющих жизнеспособность в морской водной среде.

1.3.6.5 Компьютерное моделирование пространственной структуры а-галактозидазы и ее комплекса с а-галактозой

Анализ аминокислотной последовательности PsGalA с помощью сервера SWISS-MODEL показал, что в качестве прототипов для построения теоретической модели ее пространственной структуры могут быть использованы гликозидгидролазы клана-D с известной кристаллической структурой: GalA Oryza sativa семейства GH27, код PDB 1uas (OsGalA) и GalA Thermotoga maritima семейства GH36, код PDB 1zy9 (TmGalA) (рис. 12).

Q19AX0 033835

Q19AX0 033835

madtksfyrl drvhstvifd cqsktfally fgkrlsertt etmltqlatr qevkcawee apislspllg

egftgapgle lvndsiamsv gpelqevrqp ssaavefvsv dklr-giew hsitldnhsd vlsahtvltn heifgkt fregrfvlke knftvef-av ekihlgwki--sgrvkgspg rlev--lrtk

q19ax0 033835

140 53

lgdsplsvnf caaptfqlpd svs-kivsfe grwsnefqrq svdlvlgsfv renrkgktsh dvfpgllvhn apekvlvnnw oswgpcrwd afsfkfpeid PNW-----ry tasw-pdvl EBXLQS----dyf----vae

Q19AX0 209 033835 109

enageqhgec ygfhlgwsgn nklraellae grryvqmgel llpgeltlak gqtyqspsiy gsfssegfsa e------gkv ygfl-----s skiahpffa-----vedgel vayleyfdve fddfvplepl wledpntpl

Q19AX0 279 033835 163

lsrnfhrfvk anllsqaqre karpmhymffi egiyfdhd-v dtlkqladkv ap-lgierfv lldgwfkeps llekyaelvg me—nnarvp khtptgwcs^ yhyfldltwe etlkhl—kl aknfpfevfq i^dayekd—

Q19AX0 347 033835 227

wrqcr1rywt vdykiypdgl spvidhvnsl gmefgxhfep emvnpdsfly rahpdhvlgs enneqlsfrn -----igdwl vtrgdfps-v eemakviaen gfipgiwtap fsvsetsdvf nehpdwwke ngepkmayrn

Q19AX0 417 033835 291

q----lvldl trseweyly kaiddilvey ptikyikws

bkkkiya1dl skdevlnwlf dlfssl—rk mgyryfklb

hrdinhagnt dgkpavhqqt lalyrlidri lfagavpger -kknitpiqa frkgietir-

Q19AX0 483 033835 357

C19AX0 553 033835 404

kaahpgleie sgssggarvd ygvlahtdrv htsdsnsald rbeiorgcsf ffpssvmgah vgprdchitg kavgedsfil gggspllpa- vgcvdgm-ri----gfjtap---------f w------geh i—edngapa

rnvsiemraa vsmfghmgie mdprelndhe ynalkaaia--lhkehrefi hsa---dlyr ldsddlsi--

arwalr-nai tryfmh-----drfwlndpd clilreektd ltqkekelys ytcgvldnmi iesddlslvr

Q19AX0 616 033835 468

nfglidaqkt kalfaynsvh etprtaphkl rf-vgldada qytlnlvwpv kfeeyrpssi aavngqtftg dhgkkvlket lellggrp— rvqnimsedl ryeivssgtl sgnvkiwdl nsreyhleke----gksslk

C19AX0 685 033835 532

ealmqfglqm pisfpqtsli felnka krwkredgr nfyfye-----egere

Рис. 12. Выравнивание аминокислотных последовательностей Р5ва1А (11п1Рго( О19АХ0) и ТтСа1А (ип[Рго1 033835). На рисунке отмечены идентичные остатки (*), гомологичные замены (.), каталитические остатки (•), остатки Тгр190 (♦), Аэр220 (■) и Суэ357 (▼), расположенные вблизи активного центра ТтСа1А, и соответствующие им остатки РзСа!А.

Теоретическая модель пространственной структуры РзСа1А получена методом сравнительного моделирования. Для построения фрагмента структуры РэСа1А в качестве прототипа использовали единственную известную кристаллическую структуру ТгтЮа1А семейства вНЗб. Согласно литературным данным, полипептидная цепь ТтСа1А состоит из 552 а.о. Выравнивание полных аминокислотных последовательностей Ттва1А и РзСа1А (рис. 12) выявило фрагмент полипептидной цепи (83-710 а.о.), который является общим для двух ферментов.

Степень идентичности а.о. данного фрагмента РэЗа1А и ТтСа1А составляет 19,1%, а степень гомологии фрагмента с учетом консервативных замен — 40,2%. Как видно из рис. 12, каталитические остатки Аэр327 и Аэр387 ТтСа1А идентичны остаткам Аэр451 и Азр519 РзСа1А. Остатки Тгр 190 и Суэ357 со свободной БН-группой, расположенные в полости активного центра ТтСа1А, идентичны остаткам Тгр308 и Суэ494 у РзСа1А. Остаток Аэр220 ТтСа1А консервативно заменен остатком вЮЗЗв у РзСа1А. Полученные данные указывают на сходство в строении активного центра ферментов.

Модель Зй-структуры фрагмента с 83 по 710 а.о. РзЗа1А построена с помощью программы МОЕ (рис. 13, А).

Рис. 13. А — Модель фрагмента пространственной структуры PsGalA с 83 по 710 а.о., построенная на основе кристаллической структуры TmGalA. Структура PsGalA изображена в виде ленточной диаграммы, цветом показаны элементы вторичной структуры (а-спирали — красным, ß-структура — желтым, ß-изгибы — синим, неупорядоченная структура — голубым цветом). Б — Суперпозиция структур PsGalA (красного цвета) и TmGalA (зеленого цвета). Структуры показаны в виде ленточных диаграмм.

Величина потенциальной энергии модели в вакууме составила -30769,6 кДж/моль. Суперпозиция Са атомов модели этого фрагмента и прототипа показала, что величина среднеквадратичного отклонения составляет 1,24 А. Различия наблюдаются в протяженности а-спиралей и ß-тяжей, а также в области петель на поверхности молекул (рис.13, Б). Полипептидная цепь исследуемого фрагмента PsGalA уложена в три домена, как у прототипа. В N-концевом домене (83-295 а.о.) видны антипараллельные ß-тяжи, упакованные в форме ß-сэндвича, и несколько коротких а-спиралей. Укладка центрального домена (296-576 а.о.) PsGalA в виде ß-цилиндра, окруженного а-спиралями и неупорядоченными петлями, соответствует пространственной структуре ф/а)8-цилиндра ферментов семейств GH27 и GH36, который, как известно, выполняет функцию каталитического домена у всех ферментов клана GH-D. Полипептидная цепь С-концевого домена (577-710 а.о.) образует

А

Е

N

Р-складку из антипараллельных (3-тяжей, меньшего размера, чем (3-сэндвич, т.н. "греческий ключ", ферментов семейства СН27.

Модель пространственной структуры РзСа1А с учетом 1М-концевого участка (1-82 а.о.), отсутствующего в модели фрагмента, построенного с использованием программы МОЕ, получена с помощью программного обеспечения сервера 1-ТАЗЭЕ1Ч (zhanglab.ccmb.med.umich.edu/l-TASSER/) (рис. 14).

"Ч - ,

г"?''Ъуг-' Рис- 14- Модель полной пространственной

^ Р (ч-_1' , у % " структуры РзСа1А, построенная с учетом 1-82

V Г'-' а'0' с П0М°ЩЬЮ сервера МАЭБЕК. Структура

' РэСа1А приведена в виде ленточной

диаграммы, цветом показаны элементы вторичной структуры (а-спирали — красным, Р-структура — желтым, изгибы — синим, неупорядоченная структура — серым цветом).

Согласно данным сервера 1-ТА53ЕР структура участка полипептидной цепи с 1 по 82 а.о. содержит протяженный а-спиральный фрагмент. В настоящее время отсутствуют литературные данные о пространственной упаковке Ы-концевого домена других гликозидгидролаз семейства СН36, кроме ТтОа1А. Следует отметить, что Тт6а1А имеет самую короткую полипептидную цепь среди ферментов семейства СН36 и не образует олигомерной структуры.

Содержание элементов вторичной структуры, рассчитанное на основании теоретических моделей и спектра КД нативной РзСа1А, приведено в таблице 11. Экспериментальные данные о вторичной структуре фермента коррелируют с данными, полученными нами с помощью теоретических моделей.

Таблица 11

Вид белка а-спираль ß-структура Неупорядоченная структура

Модель фрагмента 83-710 (программа МОЕ) Модель полной структуры (сервер МАЗЭЕР) Нативная РвБаЛ (КД спектр, СОЫТИМ/Щ 10,7 22,1 19,1 22,8 25,2 29,6 66,5 52,7 51,3

Пространственную структуру каталитического домена PsGalA, который включает участок полипептидной цепи с 296 по 576 а.о., а также структуру активного центра PsGalA исследовали с использованием в качестве прототипа OsGalA семейства GH27.

Выравнивание аминокислотных последовательностей каталитических доменов а-галактозидаз представлено на рис. 15. Для OsGalA семейства GH27 и PsGalA семейства GH36 в активном центре идентичными остаются остатки Asp130 и Asp451, Asp519 и Asp185, Тгр16 и Trp308, Cys162 и Cys494 соответственно (рис. 15). Остаток Asp51 OsGalA заменен на Glu338 у PsGalA. Это пока единственный случай замены остатка Asp на Glu у а-галактозидаз из семейств GH27 и GH36.

Q19AX0 296

lúas 1

Q19AX0 301

lúas 9

Q19AX0 356

lúas 58

Q19AX0 416

lúas 97

Q19AX0 476

lúas 145

Q19AX0 536

lúas 200

-----QREKA

-FENG-LGRT

PQMGWNS^HFYCGINEQIIRETADAIjVNTGLÍIKLG'ÍQYVNI .DCW-AEYS-RDSQGNF-

-AGSQT---CSNK

NRDINHAGNFDGKPAVHQQTLAL - -NCNDA----GRSVMEEYT---

-GGWM-DPDML

Рис. 15. Выравнивание фрагментов аминокислотных последовательностей (296576 а.о.) PsGalA и (1-275 а.о.) OsGalA (UniProt Q9FXT4), соответствующих каталитическим доменам. На рисунке отмечены каталитические остатки (•), остатки Тгр16 (♦) и Cys162 (▼), расположенные в активном центре OsGalA, и соответствующие им остатки PsGalA.

Исследованием кристаллической структуры комплекса OsGalA с D-галактозой установлено, что остаток Asp185 выступает в качестве сопряженной кислоты/основания, a Asp130 действует как нуклеофил. Из суперпозиции пространственных структур каталитического домена OsGalA (фрагмент 1-275 а.о.) и модели каталитического домена PsGalA (фрагмент 296-576 а.о.), построенной на основе кристаллической структуры каталитического домена OsGalA с помощью программы МОЕ (рис. 16) видно, что указанные выше остатки Asp в пространстве совместились.

Рис. 16. Суперпозиция каталитического домена OsGalA (код PDB 1uas) и модели каталитического домена PsGalA, построенной на основе кристаллической структуры OsGalA. Структура доменов изображена в виде основной цепи, цветом показаны элементы вторичной структуры (а-спирали — красный, (3-структура — желтый, изгибы — синий, неупорядоченная структура — серый). Каталитические остатки показаны в шаростержневой форме: зеленым цветом — остатки Asp130 и Asp185 OsGalA, красным цветом — Asp451 и Asp519 PsGalA. На рисунке указаны расстояния между каталитическими остатками OsGalA (6,46 А) и PsGalA (5,76 А).

Это может свидетельствовать об идентичности их функции в активном центре обоих ферментов. На рис. 16 указаны расстояния между каталитическими остатками

ОэСа1А (6,46 А) и РэСа1А (5,76 А), что соответствует расстоянию между каталитическими карбоксилами для классических гликозидгидролаз, катализирующих гидролиз О-гликозидной связи с сохранением оптической конфигурации аномерного центра субстрата.

Пространственное взаиморасположение каталитических остатков (Авр451 и Аэр519) и других остатков их ближайшего окружения (Тгр308, 61и338 и Сув494) представлено на рис. 17.

Тф308

Âsp519

ТгрЗОв Asp519

Рис. 17. Структура фрагмента активного центра а-галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Аминокислотные остатки показаны в стержневой форме. На рисунке приведены каталитические остатки (Asp451 и Asp519) и функционально важные остатки их ближайшего окружения (ТгрЗОв, Glu338 и Cys494).

Рис. 18. Сайт связывания а-галактозы с а-галактозидазой Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Пунктиром показаны водородные связи, образованные а-галактозой: Glu338.0E1-Gal.04,

Asp451.0D1-Gal.06, Asp519.0D1-Gal.01, Asp519.0D1-Gal.02.

Консервативный Тгр308, расположенный на расстоянии 30 а.о. от маркерного участка 00(С/С)\Л/ дпя гликозидгидролаз семейства СН36 (рис. 12), соответствует Тгр16 у ОзСа1А (рис. 15). Согласно литературным данным, Тгр16 вносит существенный вклад в создание гидрофобного микроклимата в этом районе молекулы, необходимого для протонирования каталитических остатков Аэр. Функциональная важность остатка Тгр для РэОа1А, вытекающая из модели пространственной структуры, согласуется с экспериментальными данными, полученными нами методом ингибиторного анализа (табл. 9).

Методом молекулярного докинга построена теоретическая модель структуры комплекса РзСа1А с молекулой О-ва! (рис. 18). Установлено, что конкурентный ингибитор Р-Са1 взаимодействует с активным центром фермента, образуя 4 водородные связи: Glu338.0E1-Gal.04, Asp451.0D1-Gal.06, Asp519.0D1-Gal.01, Asp519.0D1-Gal.02, три из которых — с каталитическими остатками Аэр451 и Азр519. Величина свободной энергии связывания галактозы с каталитическим доменом фермента составила -11,916 ккал/моль. Теоретическая константа ингибирования фермента галактозой (рК|), рассчитанная с помощью модуля ЫдХ программы МОЕ составила 9,01 мкМ.

Таким образом, в результате выполненного нами анализа моделей пространственных структур показана идентичность каталитических а.о. у ферментов семейств СН27 и СН36. В активном центре РБСа1А роль сопряженной кислоты/основания выполняет Авр451, а нуклеофила — Аэр519. При низкой идентичности аминокислотных последовательностей гликозидгидролазы семейств вН27 и СН36 имеют высокую степень гомологии как пространственных структур в

целом, так их каталитических доменов и активных центров, что позволяет ферментам реализовывать одинаковый механизм катализа. Данное исследование еще раз подтвердило, что а-галактозидазы семейств GH27 и GH36 имеют общее происхождение и механизм действия. Полученную модель пространственной структуры PsGalA можно использовать в дальнейших исследованиях взаимосвязи структуры и функции фермента.

1.3.8 Иммобилизация а-галактозидазы в гибридных нанокомпозитах, содержащих полисахариды

Иммобилизация ферментов давно и успешно используется на практике. Включение в матрицу или закрепление на носителе позволяет многократно использовать ферменты и облегчает отделение продуктов ферментативной реакции, что имеет существенное значение при создании биотехнологических процессов. Иммобилизация значительно увеличивает время функционирования и устойчивость ферментов.

При иммобилизации по методу золь-гель технологии макромолекулы белка включаются в неорганическую матрицу, формирующуюся in situ в результате реакций поликонденсации. При этом они претерпевают минимальные изменения пространственной структруры, что обеспечивает сохранение активности ферментов.

Иммобилизация PsGalA выполнена в гибридных полисахарид-силикатных нанокомпозитных материалах, синтезированных в Институте химии ДВО РАН с использованием нового прекурсора — тетракис(2-гидроксиэтил)ортосиликата (ТГЭОС). К числу достоинств прекурсора относятся растворимость в воде и совместимость с биополимерами. Полисахариды являются катализаторами золь-гель процессов. В их присутствии гелеобразование протекает при любых значениях рН, а также при низких температурах, что важно для термолабильных ферментов. Чтобы минимизировать денатурацию термолабильной PsGalA в процессе включения в силикатную матрицу, иммобилизацию проводили при температуре, близкой к 0°С и рН 7,2.

Активность PsGalA, иммобилизованной в различных по составу гибридных полисахарид-силикатных нанокомпозитных материалах, тестировали на протяжении 16 мес. (табл. 12).

Таблица 12

Активность а-галактозидазы в зависимости от условий её иммобилизации и времени _хранения_

_Время хранения, сутки_

№ ЭЮг, Полисахарид, мас% 0 6 19 30 43 165 417 геля мас% ти/г геля

1 0 Свободная PsGalA * 33,6 21,8 16,5 н.о." 18,7 0 0

2 10 ЛБГ, 0,25 34,6 50,9 76,8 н.о. 54,1 н.о. 28,9

3 10 ЛБГ, 0,75 32,8 56,7 81,8 н.о. 63,5 н.о. н.о.

4 10 ЛБГ, 1,5 9,2 10,9 12,0 н.о. 8,4 н.о. 9,6

5 10 ксантан, 0,25 63,9 н.о. н.о. 21,7 н.о. н.о. н.о.

6 30 ксантан, 0,25 14,1 н.о. н.о. 0,1 н.о. н.о. н.о.

7 10 ламинаран, 0,35 20,0 н.о. н.о. 0 н.о. н.о. н.о.

8 10 Cat-HEC 0 н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.

* — mU/мл, "н.о. — не определяли

Наибольшая активность фермента наблюдалась у образца №5. Ферментативная активность образцов №2 и №3, содержащих полисахарид, являющийся высокоразветвленным галактоманнаном (ЛБГ), сразу после иммобилизации была сопоставима по уровню с активностью фермента в растворе. При увеличении количества силиката и ЛБГ (образцы №3 и №4) активность значительно снижалась. В ряду исследованных полисахаридов только присутствие ламинарана в геле не оказывало стабилизирующего действия на иммобилизованную РзСа!А.

Большое значение для практического применения иммобилизованных ферментов имеет удерживание их в/на носителе. После двух суток выдерживания гелей в буферном растворе при 4°С их подвергали центрифугированию и определяли активность фермента в супернатантах и в гелях. Ферментативная активность практически полностью отсутствовала в растворах, в которых выдерживались биокатализаторы (табл. 13).

Таблица 13

Удерживание а-галактозидазы в силикатном нанокомпозите с различным

содержанием ЛБГ

№ геля ЛБГ, мас% mll/r геля mU в 1 мл супернатанта в 1 г геля

2 0,25 34,6 0,076 3,7

3 0,75 32,8 0,018 12,5

4 1,50 9,2 0,009 12,6

Это указывает на достаточно хорошее закрепление макромолекул фермента в матрице геля. Однако активность фермента в самих гелях №2 и №3 оказалась значительно ниже исходной. Возможно, центрифугирование привело к уплотнению гелей, что стало причиной либо ограничения доступа субстрата к ферменту, либо инактивации иммобилизованного фермента. Любопытно отметить, что с увеличением концентрации ЛБГ в геле (образец №4) механическое воздействие отразилось на активности фермента в значительно меньшей степени (табл. 13).

Включение РзСа1А в силикатную матрицу привело к некоторому уширению интервала рН, но практически не изменило величины рН-оптимума фермента. Возросла термостабильность РзСа1А, каталитические характеристики фермента существенно не изменились.

Таким образом, матрицы, содержащие нейтральный полисахарид ЛБГ, являются оптимальными для иммобилизации Рз6а1А.

1.3.9 Влияние природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на активность а-галактозидазы

Исследовано влияние морских природных полигидрокси-1,4-нафтохинонов (ПГНХ) и их синтетических производных (рис. 19) на гидролитическую активность РэСа1А.

R5 о

Рис. 19. Соединения, использованные в качестве эффекторов PsGalA. Ri, R2, R3, Ft,, R5 - см.

в таблице 14.

Результаты выполненного исследования (табл. 14) позволили разделить эти соединения на три группы: I — (3-метоксипроизводные 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинонов (1 — 6), не влияющие на активность PsGalA в концентрациях 3,2 — 4,6-10^ М в условиях эксперимента; II — соединения (7 — 16), подавляющие активность фермента на 50% при концентрациях С5о ~ 10^-10"5 М; III — полигалогензамещенные нафтазарины (17 — 21), наиболее эффективно ингибирующие фермент (С5о ~ Ю"6 М).

Таблица 14

Влияние природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на активность _а-галактозидазы___

Заместитель Происхождение м. С х Ю\ М

R R R

Отсутствие эффекта ингибирования

1 С2Н5 н н Н он синтетический 218,2 4,6

2 ОН ОН он С2Н5 он природный 266,2 3,8

3 ОСНз С2Н5 С2н5 ОСНз он синтетический 306,3 3,3

4 CI ОСНз ОСНз С2Н5 он синтетический 312,7 3,2

5 CI ОСНз С2Н5 ОСНз он синтетический 312,7 3,2

6 ОСНз ОСНз ОСНз С2Н5 он синтетический 308,3 3,2

Снижение активности фермента на 50%**

7 он ОН н он н природный 222,2 4,5

8 он н CI CI он синтетический 275,0 4,3±1,2

9 он С2Н5 он ОН н природный 250,2 4,0

10 он С2Н5 он С2Н5 он природный 278,3 3,5

11 он С2Н5 С2Н5 ОН он природный 278,3 2,0

12 CI CI С2Н5 н он синтетический 287,1 2,0±1,0

13 он С2Н5 CI CI н синтетический 303,1 1,6

14 он C2H5 н он он природный 250,2 1,3

15 н н н н он коммерческий 190,2 0,41

16 С2Н5 он он он н природный 250,2 0,23

17 CI CI ОСНз C2H5 он синтетический 317,1 0,053

18 CI CI Н н он синтетический 259,1 0,039±0,005

19 CI CI CI СгН5 он синтетический 321,5 0,029±0,005

20 CI CI Вг н он синтетический 337,9 0,015

21 CI CI CI н он синтетический 293,6 0,016±0,005

Примечания: " — номер соединения; **' — в таблице приведен™ концентрации соединений, при которой активность фермента снижалась на 50% при выдерживании фермента в присутствии этого соединения в течение 30 мин.

Все соединения со свободными р-ОН группами либо не иигибируют фермент, как эхинохром А (2), либо проявляют ингибирующее действие при достаточно высоких концентрациях, как соединение 16 (См = 2,3-Ю"5 М). В водных растворах при физиологических значениях рН О-Н связь p-гидроксильных групп этих соединений подвергается гетеролитической диссоциации с образованием моно- или дианионов. Эхинохром А (2) при рН 7,3 существует в виде дианиона. По отсутствию ингибирующего действия эхинохрома А (2) можно предположить, что область активного центра PsGalA при рН 7,3 электростатически отрицательна и ее заряд может препятствовать связыванию этого соединения.

Исследуемые соединения различаются действием на фермент, которое зависит от природы заместителя и его расположения в кольцах. Локализация гидроксильной и этильной групп в положениях 2 и 3 хиноидного кольца влияет на ингибирующее действие соединения (см. данные для изомеров 9 и 16). Вероятно, одна из ОН-групп в положениях 6 и 7 соединения 16 более кислая и поэтому легче, чем в случае соединения 9, вступает в образование межмолекулярной водородной связи с нуклеофильными группами активного центра фермента. Причиной этого различия может быть также стерический фактор и/или возникновение дополнительной водородной связи за счет ОН-группы в 5-м положении бензоидного кольца. Так, при одинаковом характере связывания всей молекулы ингибитора эта гидроксильная группа для соединений 9 и 16 должна будет попадать в разные участки активного центра.

Показано, что ингибирование ПГНХ обратимо. Галогензамещенный нафтазарин 19 необратимо ингибирует, т.е. инактивирует фермент: после гельфильтрации фермента, инактивированного соединением 19, его активность не восстанавливалась.

Эффективными необратимыми ингибиторами оказались соединения 17 — 21 {табл. 14, рис. 19). PsGalA имеет функционально значимую(ые) SH-rpynny(bi) (табл. 9, рис. 17, 18). Механизм влияния нафтохинонов на активность некоторых ферментов, содержащих свободные SH-груплы остатков Суs, обсуждался в литературе. В результате сопряженного присоединения (реакции Михаэля) S-нуклеофила образуется ковалентно связанный коньюгат нафтазарина с ферментом. Возможность протекания реакций такого типа в мягких условиях показана ранее на примере реакции 2,3-дихлорзамещенного нафтазарина 17 и восстановленной формы трипептида глутатиона.

Электронодонорные заместители в хиноидном кольце нафтазарина 15 понижают способность его к сопряженному присоединению нукпеофилов, что видно из сопоставления эффектов соединений 15 и 1, 18 и 12. Соединения 17 — 21, имеющие электроноакцепторные заместители в хиноидном ядре, проявляют себя как эффективные необратимые ингибиторы фермента за счет активации положений 2 и 3 хиноидного кольца к атаке нуклеофилов. Присутствие электронодонорных заместителей Et или Ме в бензоидном кольце этих соединений также вызывает понижение, а присутствие электроноакцепторных заместителей Вг или CI — повышение их инактивирующей способности.

Низкую ингибирующую способность соединения 8, также содержащего два атома хлора в одном кольце нафтазаринового кора, можно объяснить существованием его в экспериментальных условиях в виде моноаниона, являющегося энергетически наиболее выгодной таутомерной формой этой молекулы. Атомы хлора в моноанионе 8 локализованы в бензоидном ядре, где они не могут вступать в реакции нукпеофильного замещения RS-функции по механизму сопряженного присоединения тиола и последующего отщепления молекулы HCl. То же самое относится и к соединению 13. Отсутствие инактивирующего действия у хлорзамещенных нафтазаринов 4 и 5 можно объяснить соседством с атомом хлора сильной электроноакцепторной МеО-группы, нивелирующей активирующее влияние атома хлора для атаки нуклеофила в положения 2 и 3 хиноидного кольца.

Сайт связывания ингибитора 15 в активном центре PsGalA показан на рис. 20 (А).

Рис. 20. А — сайт связывания нафтазарина 15 в активном центре РэСа1А. Красным цветом показана область активного центра фермента, несущая отрицательный электростатический заряд, синим цветом — положительный, серым цветом — нейтральный. Б — локализация соединения 21 в активном центре вблизи свободной сульфгидрильной группы Суз494. Аминокислотные остатки соединения 15 и 21 показаны в стержневой форме. Свободная сульфгидрильная группа окрашена в желтый цвет, атомы хлора — в зеленый цвет.

Б

Как видно из рисунка, соединение 15 локализовано в непосредственной близости от каталитических остатков Asp451, Asp519, в окружении остатков Trp308, Cys494 и Ser496. Внутренняя поверхность активного центра электростатически отрицательна. а-Гидроксильная группа соединения 15 образует водородную связь с карбонилом Asp519, а противоположный карбонил в положении С5 хиноидного кольца — с ОН-группой остатка Ser496. Локализация наиболее эффективного необратимого ингибитора 21 в активном центре PsGalA показана на рис. 20 (Б). Свободная SH-группа остатка Cys494 приближена к СЗ хиноидного кольца трихлорнафтазарина на расстояние 3,15 А, что создает предпосылку к реакции нуклеофильного замещения атома CI. Образование ковалентной связи между Cys494 и соединением 21, вероятно, является причиной необратимого ингибирования фермента под действием данного соединения. Интересно отметить, что наиболее цитотоксичные соединения 19, 20 и 21 для развивающихся эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius, оказались и самыми эффективными необратимыми ингибиторами фермента.

Таким образом, показано, что ингибирующие свойства ПГНХ по отношению к PsGalA зависят от природы заместителей, их числа и положения в структуре соединений. Благодаря высокой чувствительности к характеру и расположению заместителей, фермент можно рассматривать как тест-систему для получения аналитической информации, касающейся обнаружения и оценки высокотоксичных хлорпроизводных нафтазарина, являющихся микропримесями в препаратах синтетического эхинохрома А.

2. Фукоиданазы морских бактерий

Другой группой морских ферментов, исследованных в представленной работе, являются фукоиданазы (ЕС 3.2.1.-), О-гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз а-гликозидной связи между остатками L-фукозы в основной цепи фукоиданов. В настоящее время сведения о фукоиданазах в литературе крайне ограничены. Недавно появились сообщения об аминокислотных последовательностях трех бактериальных фукоиданаз, на основании которых эти ферменты объединены в особое семейство GH107. Это — внутри- и внеклеточные фукоиданазы из Alteromonas sp. SN-1009 (No GenBank AA000508.1 и AA000509.1 соответственно) и внеклеточная фукоиданаза из Mariniflexile fucanivorans SW5 (No GenBank CAI47003.1). Механизм гидролитического действия и пространственные структуры этих ферментов не охарактеризованы, номенклатурный номер ферментам не присвоен.

2.1 Выделение фукоидана из природного комплекса с полифенолами

Для поиска, изучения свойств и субстратной специфичности фукоиданаз необходимы высокоочищенные образцы полисахаридов с установленной структурой. Сотрудниками лаборатории химии ферментов ТИБОХ разработан метод получения фукоидана из различных бурых водорослей. Выход фукоидана при переработке водоросли F. evanescens достигает 15% от сухой массы. Однако образцы этого полисахарида (F0) сохраняют бурую окраску и обладают высокой восстанавливающей способностью.

УФ-спектр поглощения образца фукоидана F0 свидетельствует о присутствии в нем соединений с высокосопряженной ароматической структурой (рис. 21, 1). Согласно литературным данным бурые водоросли могут накапливать до 14% полифенольных соединений от массы сухой водоросли, главным образом, флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензола) и его полимеров — флоротаннинов. Присутствие этих соединений в образцах полисахарида затрудняет тестирование активности фукоиданаз по увеличению восстанавливающей способности Сахаров. Влияние свободных и связанных с полисахаридами полифенолов на активность фукоиданаз также не исследовалось. Поэтому крайне важно для изучения этих ферментов использовать субстрат, не содержащий полифенольных соединений.

f, отн. ед. 14-j—i—-

А

12 10

6 4 2

8

3

0.6

Рис. 21. УФ-спектр поглощения (1), возбуждения (2) и флуоресценции ().801б — 366 нм) (3) фукоидана Р0 из бурой водоросли Р. evanescens (1 мг/мл, 0,1 М Ыа*-фосфатный буфер, рН 8,4).

о

300 400 500 600 Длина волны, нм

Флоротаннины являются флуоресцирующими соединениями. Спектры флуоресценции (СФ) полифенолов, связанных с фукоиданами, прежде не исследовались. Широкий максимум СФ образца F0 (рис. 21 (2, 3)) расположен при 450-460 нм. Значение индекса флуоресценции (I = f4sc/fsoo), характеризующего форму СФ, составляет 1,15. На флуоресценцию связанных флоротаннинов могут влиять различные факторы микроокружения, в том числе природа и состояние ионогенных групп полисахарида. Так, согласно литературным данным, СФ полифенолов, связанных с альгиновой кислотой из бурой водоросли Laminaría pallida и коммерческим альгинатом Manugel GHB, характеризуются максимумом при 440-445 нм и величиной I = 1,96. Известно, что полифенолы, прочно ассоциированные с полисахаридами, особенно альгиновыми кислотами и фукоиданами, могут связывать между собой несколько молекул различных полисахаридов или, как сеть, опутывать их. Природа таких взаимодействий не изучена.

Для освобождения фукоидана от полифенольных соединений в данной работе использовали перекись водорода, которая широко применяется для обесцвечивания природных полисахаридов. Степень очистки образцов полисахарида контролировали флуориметрическим методом, который относительно прост для выполнения, чувствителен, удобен для определения относительного содержания флуоресцирующих примесей в образце и позволяет быстро сделать заключение об эффективности различных стадий очистки полисахарида.

После обработки исходного полисахарида F0 5%-ным водным раствором перекиси водорода при рН 8,5 получили образец полисахарида F, который разделили с помощью DEAE-целлюлозы в линейном градиенте НгО/NaCI (0-2 М) на две фракции F1 и F2. Оба образца полисахарида по данным метода флуоресценции были практически полностью очищены от полифенольных соединений. Молекулярная масса полисахарида F2 составила 40-60 кДа.

Полисахарид F1 (табл. 15), согласно 13С ЯМР-спектру, оказался альгиновой кислотой, состоящей в основном из остатков D-маннуроновой кислоты (МММ), с небольшим включением остатков L-гулуроновой кислоты (GGM-блоков).

Полисахарид F2 (табл. 15) имел 13С ЯМР-спектр, характерный для фукоидана, сульфатированного преимущественно no С2, с невысокой степенью ацетилирования. Фукоидану соответствовали сигналы в области высокого поля с 5 16,9-18,06 м.д., сигналы в области аномерного атома углерода с 5 100,2, 99,95, 98,36, 94,96 м.д. и сигналы в области б 75-83,7 м.д., а также сигналы углерода ацетатных групп в области 5 21-22 м.д. Согласно литературным данным, 13СЯМР-пектр свидетельствовал о наличии в структуре полисахарида F2 фрагментов (1,4)-a-LFucp2S03", (1,3)-a-L-Fucp2,4S03\ (1,3)-a-L-Fucp2S03" (Bilan M.I., et al., 2002).

ИК-спектры полисахаридов F0 и F2 оказались идентичными. Отношение поглощения сульфатных групп и скелетного колебания сахарного кольца при 1263 и 1022 см"1 (0,90 и 0,88) совпадало в пределах ошибки ± 4%.

Таблица 15

Характеристика полученных образцов полисахаридов

р Общий Восст. сп. ..20. Состав нейтральных

Обра- Выход, са cnoco6i -SO,. [afc , моносахаридов,%

зеЧ я ) о/. о/«п /о I "2U

% %") Fuc Rha Gal Glc Xyl

F0 100 46 100,0 14,3 -114,8 69,0 3,3 5,2 11,8 10,7

F 60 49 7,1 16,8 -124,2 74,2 0 9,0 0 * 16,8

F1 8 48 11,0 0 -90,0 0 0 0 0 0

F2 38 40 0,2 31,4 -173,0 94,6 0,3 4,2 0 0,9

способности исходного образца фукоидана F0; *"' — количество сульфатных групп определено турбидиметрическим методом и представлено как % от навески вещества.

В ИК-спектрах этих образцов также наблюдались полосы поглощения при 823 и 827 см"1 соответственно. Математический анализ контура этих полос с разложением на составляющие компоненты показал, что полоса при 823 см"1 в спектре исходного образца F0 состоит из двух компонент, с частотами при 848 и 819 см"1, а компоненты полосы при 827 см"1 в спектре образца полисахарида F2 имеют максимумы при 844 и 820 см"1, которые характерны для сульфатных групп в положении С4 и С2 фукопиранозы соответственно. Отношения площадей этих компонент для двух образцов (0,84 и 0,78 соответственно) отличались лишь на 7%. Превалирование компоненты при 819-820 см"1 свидетельствует о преобладании в исходном и очищенном образцах фукоидана экваториальных сульфатных групп при С2.

Таким образом, в результате проделанной работы получен образец фукоидана F2, свободный от полифенольных соединений и примеси альгиновых кислот, практически не имеющий восстанавливающей способности. Фукоидан F2 имел молекулярную массу 40-60 кДа и структуру полисахаридной цепи, согласно спектральным данным, характерную для фукоидана из бурой водоросли F. evanescens.

2.1.1 Исследование биологической активности фукоидана из F. evanescens, освобожденного от недиализуемых полифенолов

Было выполнено сравнительное исследование биологического действия полисахарида F2, освобожденного от недиализуемых полифенолов, и образца фукоидана, связанного с полифенолами (F0).

На модели развивающихся эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius оба образца фукоидана показали отсутствие токсичности для эмбрионов, а также аномалий их развития в диапазоне испытанных концентраций от 10 до 1000 мкг/мл. Оба образца, добавленные как сразу после оплодотворения, так и на стадии "зигота", практически в 1,5 — 2 раза увеличивали продолжительность жизни эмбрионов относительно контрольного эксперимента.

Нейтрофилы используют в качестве модели in vitro для изучения иммуномодулирующего действия веществ. Действие образцов фукоиданов F0 и F2 на функциональную активность нейтрофилов исследовали по активности их кислородозависимых микробицидных систем в спонтанном тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), а также по их способности к адгезии на пластик (табл. 16). Оба образца полисахарида проявляли одинаковую активность в НСТ-тесте, однако в присутствии фукоидана F2 отмечена более высокая адгезивная активность нейтрофилов по сравнению с исходным образцом F0, что может быть следствием экранирующего эффекта полифенолов для проявления фукоиданом из F. evanescens мембранотропной активности.

Антикоагулянтную активность образцов фукоидана F0 и F2 изучали с использованием стандартных методик (табл. 17).

Таблица 16

Влияние образцов фукоидана на показатели НСТ-теста и адгезивной активности

Концентрация Индекс стимуляции

полисахарида, показателя НСТ-теста адгезивной активности

мкг/мл FO F2 FO F2

10 1,02 1,12 1,21 1,48

50 1,12 1,21 1,33 1,66

100 1,23 1,29 1,49 2,1

Ингибирование тромбина и фактора Ха наблюдали по времени свертывания плазмы крови кроликов в тестах АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время) и "РеаКлот" с увеличением концентрации полисахаридов. Влияние исследуемых препаратов на появление сгустка плазмы оценивали по концентрации, при которой время свертывания плазмы увеличивалось в 2 раза по сравнению с контрольным экспериментом. РО эффективнее ингибировал появление сгустка плазмы, чем Р2 (контрольное время 2АЧТВ — 18,3±0,6 сек; табл. 17).

Таблица 17

_Антикоагулянтная активность фукоиданов

Образец

_Коагулологические определения с плазмой кроликов / человека_

2АЧТВ, мкг/мл_2РеаКлот, мкг/мп_alla. ЕД/мг_аХа, ЕД/мг

F0 0,6±0,05/ 1,8+0,5/ 60+11/ 36,5+4/

F2 13,5±1,3*)/ 11,0±1*)/ 12±5*)/ 20,3±3 *)/

НФГ 0,5±0,03/0,6±0,1 203,1

НМГ_0,43+0,1/0,8+0,03_168_

Примечания: НФГ — нефракционированный гепарин; НМГ — низкомолекулярный гепарин;

*' — достоверность различий с показаниями исходного фукоидана (р<0,05); п = (3-5).

Специфические аИа-активности образцов (стандарт — гепарин) в тесте АЧТВ были в 5 раз выше для образца F0. Полисахарид F0 обладал способностью ингибировать появление сгустка плазмы в тесте "РеаКлот" в большей степени, чем образец F2 (контрольное время 2РеаКлот 30,8±0,7 сек; табл. 17). В тесте РеаКлот специфические аХа активности были также выше для F0 (табл. 17). Видно, что очистка от полифенолов снижает антикоагулянтную и специфические активности фукоидана.

При проведении биоспецифического электрофореза НФГ, исходного фукоидана F0 и образца F2, освобождённого от полифенолов, с классическим антидотом для гепаринов — сульфатом протамина, отмечено образование комплексов для всех образцов. На основании анализа результатов электофореза установлено, что очистка фукоидана из F. evanescens от полифенолов приводит к незначительному снижению его способности ингибировать как тромбин, так и фактор Ха.

Таким образом, при полном отсутствии цитотоксической активности, образцы фукоиданов, освобожденные от полифенолов, сохраняют биологические свойства, характерные для природного комплекса полисахарида с полифенолами. Высокоочищенный образец фукоидана можно использовать в качестве субстрата для поиска и изучения свойств фукоиданаз.

2.2 Распространение фукоиданаз среди бактерий-эпифитов бурых водорослей и

ассоциантов голотурии

Распространение фукоиданаз было исследовано среди 25 штаммов гетеротрофных бактерий, изолированных из бурых водорослей семейства фукусовых парамуширской популяции, и среди 54 штаммов бактерий, выделенных из целомической жидкости и гомогенатов голотурии, обитающей в заливе Петра Великого Японского моря (табл. 18). В качестве субстратов для тестирования

активности ферментов, деградирующих фукоидан, использовали два структурно-различающихся полисахарида: 1,3;1,4-а-1--фукан из F. evanesceris (F2), сульфатированный по положению С2 остатка фукопиранозы, и 1,3-а-1.-фукан из L cichorioides (FL), сульфатированный практически полностью (по положениям С2 и С4).

Большая часть исследованных изолятов (96%) являлась грамотрицательными аэробными палочками, доминирующими среди бактерий, обитающих в морской среде. Фукоиданазная активность отмечена в 14 (56%) из 25 исследованных экстрактов бактерий-эпифитов (табл. 18). Экстракты 10-ти штаммов действовали на оба фукоидана F2 и FL, экстракты четырех — только на полисахарид FL.

Среди 54 бактериальных изолятов голотурии A. japonicus фукоиданазная активность была обнаружена у 37 (68,5%) штаммов. В этой группе бактерий обнаружены два изолята, экстракты которых деградировали фукоидан F2 и не действовали на фукоидан FL (табл. 18).

В итоге на способность к деградации фукоиданов было проверено 79 бактериальных штаммов, из них 51 изолят (64,6%) имел в составе ферментных систем фукоиданазы. Все бактерии-эпифиты группы FlexibacterlCytophaga оказались продуцентами фукоиданаз. Следующими по количеству продуцентов фукоиданаз были эпифиты группы родов AlteromonaslPseudoalteromonas. Среди изолятов голотурии встречались продуценты фукоиданаз, принадлежащие к роду Vibrio, Micrococcus, Pseudomonas/Hatomonas, а также коринеподобных бактерий. Бактерии родов AlteromonaslPseudoalteromonas зарекомендовали себя лучшими продуцентами фукоиданаз. Однако необходимо отметить, что уровень активности фукоиданаз по сравнению с другими гликозидгидролазами, как правило, является низким. В штаммах бактерий родов Vibrio и Micrococcus подобные ферменты обнаружены не были. Высокое содержание бактерий, имеющих фукоидан-деградирующие ферменты, изолированных из бурых водорослей и голотурии, возможно, указывает на важность этих ферментов в метаболизме полисахаридов хозяина с точки зрения потребностей ассоциантов макрогидробионтов. Это может быть одним из звеньев адаптационного механизма морских микроорганизмов, колонизирующих как водоросли, так и животных, к среде обитания, посредством которого они могут использовать фукоиданы в качестве одного из источников углерода, серы и энергии.

Таким образом, показано, что фукоиданазы широко распространены среди облигатно морских аэробных бактерий-эпифитов бурых водорослей и ассоциантов голотурии, матрикс клеточных стенок которых содержит a-L-фуканы.

2.2.1 Особенности состава О-гликозидгидролаз бактерий Pseudoalteromonas citrea

Для дальнейшего исследования из большого числа штаммов морских бактерий КММ, способных деполимеризовать фукоиданы, были выбраны штаммы под номерами КММ 3296, КММ 3297 и КММ 3298 (табл. 18), идентифицированные как Pseudoalteromonas citrea.

На содержание фукоиданаз и других гликозидгидролаз были исследованы типовой штамм и еще 8 штаммов бактерии P. citrea из КММ ТИБОХ, выделенных из различных морских объектов. Все штаммы P. citrea, независимо от местообитания, гидролизовали ламинаран (табл. 19). Известно, что высокоактивные ламинараназы (£-1,3-глюканазы) присутствуют в подавляющем большинстве морских как макро-, так и микроорганизмов. Менее эффективно экстракты изучаемых бактерий деградировали альгиновую кислоту, растворимую агарозу, КМ-целлюлозу. Штаммы P. citrea близки по гликаназному составу, но осуществлять деградацию фукоиданов могли только три из них — КММ 3296, КММ 3298, КММ 3297. Эти штаммы были выделены из бурых водорослей и голотурии, богатых a-L-фуканами, в отличие от остальных девяти, местообитания которых не связаны напрямую с наличием этих полисахаридов.

Таблица 18

Фукоидангидролазная активность^ штаммов морских бактерий, выделенных из бурой водоросли Fucus evanescens и голотурии

Apostichopus japónicas_

Таксономическое положение

Рабочий номер штамма

Фукоидан

F2

FL

Таксономическое положение

Рабочий номер штамма

Фукоидан

F2

FL

Бурая водоросль Fucus evanescens

Голотурия Apostichopus japonicus

Cytophaga sp. 2F7 0 4000 AlteromonaslPseudoalteromonas M-3HL-21/1 220

Cytophaga sp. 2F9B 660 4980 Bacillus sp. M-3HL-1/2 5790

Cytophaga sp. 2F13 1140 12550 Коринеформы M-3HB-14/2 370

Cytophaga sp. 2F16 600 4120 Коринеформы M-3HB-25/2 930

Cytophaga sp. 12F2 0 6220 Коринеформы M-3HB-27/1 2010

Cytophaga sp. 12F9 0 8590 Коринеформы M-3HB-27/2 0

Flexibacter/ Cytophaga 12F8 3920 9650 Коринеформы M-3HL-5/2 1520

Pseudoalteromonas sp. 2F10 710 12090 Cytophaga sp. M-3HB-28/1 170

Pseudoalteromonas sp. 12F1 220 8600 Flavobacterium sp. M-3HB-26 0

Pseudoalteromonas sp. 12F3 370 8680 Hafomonas sp. M-3HL-13/2 990

Pseudoalteromonas sp. 1F5 1490 19650 Halomonas sp. M-3HL-17/3 330

Pseudoalteromonas sp. 20-92"' 5290 3640 Pseudoalteromonas sp. M-3HB-2 1 2230

Pseudoalteromonas sp. 20-101-1 ' 2130 2630 Pseudomonas/Halomonas M-3HB-14/1 1230

Pseudomonas/Halomonas M-3HB-15/2 0

Голотурия Apostichopus japonicus Pseudomonas sp. M-3HL-7/1 3060

Acinetobaoter sp. M-3HL-8/1 0 240 Pseudomonas sp. M-3HL-9 1470

Alteromonas /Pseudoalteromonas M-3HB-8/1 1150 230 Micrococus sp. M-3HB-15/1 720

Alteromonas 1 Pseudoalteromonas M-3HB-8/2 0 1270 Micrococus sp. M-3HB-25/3 0

Alteromonas / Pseudoalteromonas M-3HB-9 420 2940 Vibrio sp. M-3HB-3 450

Alteromonas / Pseudoalteromonas M-3HB-15/3 1540 5300 Vibrio sp. M-3HB-11/2 970

Alteromonas / Pseudoalteromonas M-3HB-17/1 330 1260 Vibrio sp. M-3HL-6/3 О

Alteromonas / Pseudoalteromonas M-3HB-18 1010 3150 Н.И. M-3HL-2 3360

Alteromonas / Pseudoalteromonas M-3HB-19 0 1530 Н.И. M-3HL-7/2 3350

Alteromonas 1 Pseudoalteromonas M-3HL-6/2 3180 1060 Н.И. M-3HB-15/4 660

Alteromonas 1 Pseudoalteromonas M-3HL-14/2 2420 0 Н.И. M-3HB-16/1 0

Alteromonas 1 Pseudoalteromonas M-3HL-14/3 1520 450 Н.И. M-3HB-16/2 440

Alteromonas ! Pseudoalteromonas M-3HL-16/1 0 2000

60 2320 2280 2190 1590 810 0 120 1040 610 910 1480 4960 1310 2350 680 1980 1540 1230 1700 120 3950 340 950 340 630

Примечания: — Количество единиц активности фукоиданазы (U) рассчитывали на 1 г сырой биомассы бактерии. За 1 U принимали количество фермента, при действии которого образуется 1 нмоль восстанавливающих Сахаров (в пересчете на фукозу) за 20 ч, — КММ 3296, *"'— КММ 3298 (штамм выделен из бурой водоросли Chorda filum), ""' — КММ 3297.

Таблица 19

Активность О-гликозидгидролаз штаммов РэеиёоаНеготопаз сИгеа, выделенных из различных местообитаний,

нм/ч/г биомассы

Акватория

Средизем ное море, Франция

Залив Петра Великого, Японское море, Россия

Курильские острова, Охотское море, Россия

Командор

ские острова, Берингово море, Россия

Моллюски Асцидии Голоту Бурые водоросли Губка

рия

Источники выделения Морская Patinopecten yessoensis С. Н. aurantium А. Apostic Fucus Chorda Plocamia

вода grayanus transluci dum hopus japo-nicus evanesc ens filum sp.

—.__Шифр штамма ATCC КММ КММ КММ КММ 188 КММ КММ КММ КММ KMM KMM KMM

Субстрат ~~ ------- 29719Т 157 280 327 216 250 256 3297 3296 3298 504

Фукоидан из Я еуапезсепз 0 0 0 0 0 0 0 0 350 1920 960 0

Фукоидан из 1-. с'юЬопоШеь 0 0 0 -0 0 0 0 0 470 1300 980 0

Альгиновая кислота 1370 680 500 980 1190 3320 0 0 1700 1720 190 0

Амилоза 350 1230 910 1640 400 6270 0 470 3340 3690 3210 0

Ламинаран 5650 2140 1750 4220 2520 9170 3370 4140 6780 32190 5780 1820

Пустулан 1680 0 0 0 560 3950 0 80 0 670 610 0

Агароза растворимая 770 970 810 580 210 3430 10 2 90 1700 950 2120 3700

КМ-целлюлоза 1690 1880 520 1050 230 2620 0 50 1420 1890 2350 0

Ыр-а-О-Галактопиранозид 0 0 0 0 35100 3800 20000 8270 2020 1570 1750 4130

Ыр-р-О-Глюкопиранозид 4 660 0 40 300 1560 150 1200 100 130 10 1560

Ыр-р-О-Галактопиранозид 0 8 0 0 300 300 230 120 390 90 50 300

Ыр-р-О-Ы- 44000 2206 8650 2070 130 4 0 80 2 0 0 80

Ацетилглюкозаминид

Ыр-а-й-Маннопиранозид 3 0 , 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Ир-р-О-Ксилопиранозид 0 0 "о 0 3 0 0 0 0 0 2 0

Мр-а-Фукопиранозид 0 50 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Ыр-Сульфат 0 90 1450 340 0 0 0 0 0 0 0 0

По составу гликозидаз (табл. 19), которые также могут участвовать в деградации фукоидана в силу гетерогенности его моносахаридного состава, бактерии P. citrea разделились на две подгруппы. Отличительной чертой микроорганизмов одной подгруппы было наличие высокоактивной ß-N-ацетилглюкозаминидазы (NAGIcB). В нее вошли четыре штамма: АТСС 29719Т (из морской воды), КММ 157, КММ 280 и КММ 327 (из гребешка Patinopecten yessoensis). Микроорганизмы другой подгруппы отличались наличием высокоактивной GalA. Практически все изученные штаммы, наряду с ламинараназой, содержали ß-глюкозидазу (GlcB). Мощные агаролитики (КММ 188, КММ 216, КММ 250, КММ 256, КММ 504, КММ 3296, КММ 3297, КММ 3298) проявляли невысокую активность по отношению к растворимой агарозе и синтезировали как GalA, так и ß-галактозидазу (GalB).

Таким образом, была изучена способность двенадцати штаммов P. citrea к ферментативной деградации углеводных субстратов, характерных для морской среды. Показано, что штаммы P. citrea КММ 3296 и КММ 3298, выделенные из бурых водорослей F. evanescens и Chorda filum соответственно, а также КММ 3297 — из голотурии A. japonicus содержат перспективные с биотехнологической точки зрения ферменты, катализирующие гидролиз фукоидана.

2.2.2 О-гликозидгидролазы морской бактерии Pseudoalteromonas issachenkonii

В талломах бурой водоросли F. evnescens итурупской популяции обнаружен продуцент фукоиданазы, представленный штаммом морской бактерии, валидизированным как новый вид Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549т. Экстракт биомассы этих бактерий содержал ферменты (mU/мг бета): ламинараназу (1,50), альгинат лиазу (0,55), пустуланазу (0,25) и фукоиданазу (0,15). Кроме того, в клеточном экстракте P. issachenkonii КММ 3549 найдены гликозидазы (U/мг белка): GalB (5,40), GlcB (8,80), ß-ксилозидаза (XylB) и NAGIcB (54,70).

В серии экспериментов по оптимизации состава питательной среды для штамма P. issachenkonii КММ 3549т (табл. 20, 21) было показано, что пептон является значимым для синтеза фукоиданазы, присутствие дрожжевого экстракта и глюкозы не существенно (табл. 20).

Таблица 20

Влияние пептона, дрожжевого экстракта и глюкозы на синтез фукоиданазы штаммом Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549

Фактор варьирования Общий белок, мг/мл Удельная активность, mU/мг белка

Пептон, 5 г/л Дрожжевой экстракт, 2 г/л D-Глкжоза, 1 г/л

+ + - 1,65 0

- + - 0,40 0

+ - + 0,45 1,9

- - + 0 0

- 0,59 1,7

+ + + 1,85 0

Оптимальной для синтеза фукоиданазы является концентрация пептона, равная 2,5 г/л питательной среды. Максимальная удельная активность альгинат лиазы наблюдается при концентрации пептона 1 г/л, NAGIcB — 7,5 г/л питательной среды. Увеличение концентрации пептона до 10 г/л приводит к интенсивному росту бактерий, но не к увеличению активностей гликозидгидролаз (табл. 21).

Добавление в среду моносахаридов 1_-Рис, 0-Ху1, й-РИа и 0-Са1, которые в качестве миноров могут входить в состав фукоиданов, показало, что О-ва! и О-Ху! положительно влияют на выход фукоиданаз. Однако 0-Са1 является положительным фактором также для биосинтеза альгинат лиазы, ламинараназы и NAGIcB, поэтому для дальнейшего исследования была выбрана 0-Ху1. Удельная активность

фукоиданазы становится максимальной при концентрации 0-Ху1 равной 5 г/л. Высокая концентрация 0-Ху1 (10 г/л) в питательной среде ингибирует рост бактерий. Агароза и каррагинан в среде подавляют синтез фукоиданазы бактерией. Фукоидан слабо индуцирует фукоиданазу, но значительно увеличивает синтез ЫАС1сВ. Положительными факторами для продукции фукоиданазы являются ламинаран и альгинат, однако добавление в среду ламинарана и альгината приводит к увеличению удельной активности ламинараназы, что нежелательно, так как это осложняет процедуру очистки фукоиданазы. Важно отметить, что единственным из проверенных ферментов, на синтез которого существенно не влияет присутствие полисахаридов-индукторов, оказалась альгинат лиаза.

Таблица 21

Влияние веществ на общий белок и уровень активности гликозидгидролаз Р. IззасИепкопп КММ 3549т

Фактор варьирования

Концентра ция, г/л

Общий белок, мг/мл

Удельная активность, mU/мг белка

Фукоиданаза Ламинариназа

Альгинат лиаза

NAGlcB

1 0,03 0,0 0,0 12,6 8,6

Пептон 2,5 0,36 1,9 4,4 5,4 7,5

7,5 0,97 1,0 3,8 1,9 10,0

10,0 1,10 1,2 5,2 2,2 7,0

L-Фукоза 0,2 8,6 12,6 13,7 5,4 12,6

D-Галактоза 1 16,3 15,5 14,9 9,6 15,5

D-Рамноза 1 10,0 7,3 12,7 5,0 7,3

1 10,6 14,3 12,6 4,6 14,3

D-Ксилоза 0,5 0,30 4,0 0,7 9,3 5,0

1 0,35 10,6 14,3 12,6 4,6

5 0,17 13,5 5,2 12,9 4,1

Смесь:

D-Галактоза, каждого по 0,35 7,1 1,9 10,9 4,9

D-Рамноза, 0,5

D-Ксилоза

Агароза 0,36 0 0,34 5,0 2,5 0,36

Каррагинан 0,59 0 0 4,0 2,5 0,59

Фукоидан 0,96 0,5 6,6 3,2 10,0 0,96

Ламинаран 0,65 2,0 26,6 4,7 6,0 0,65

Альгинат 0,49 2,0 34,0 6,8 5,0 0,49

Агароза 0,36 0 0,34 5,0 2,5 0,36

Таким образом, варьируя состав питательной среды, можно увеличить выход фукоиданазы. В присутствии D-Xyl (5 г/л) в среде ее активность увеличивается почти на порядок.

2.3 Распространение внутриклеточных фукоиданаз среди морских бактерий семейства Flavobacteriaceae

Проведен поиск фукоиданаз среди бактерий семейства Flavobacteriaceae. В качестве субстратов использовали два фукоидана из бурых водорослей F. evanescens (F2) и L. cichorioides (FL). Для выбора лучшего источника фукоиданазы, экстракты бактерий дополнительно анализировали на присутствие полиманнуронат и полигулуронат лиаз, ламинараназ, агараз, амилаз, карбоксиметилцеллюлаз и ряда гликозидаз. Предпочтительными считали штаммы бактерий с более ограниченным набором ферментов.

Наиболее часто ферменты, действующие на фукоиданы, встречались в изолятах морского ежа S. intermedias. Среди 4 исследованных эпифитов бурых водорослей L. japónica и С. filum невысокая активность по фукоидану FL отмечена только в одном. Неожиданным оказался тот факт, что фукоиданазу синтезировали бактерии-эпифиты зеленой водоросли A. sonderi, не содержащей фукоиданы. Фукоиданаза морской

бактерии М. algae КММ 3909т проявляла специфичность только к полисахариду F2. Один изолят зеленой водоросли U. fenistrata синтезировал фермент, деградирующий фукоидан FL. Следует отметить, в эпифитах этой водоросли практически отсутствовали ферменты, действующие на другие полисахариды бурых водорослей: ламинаран и альгиновые кислоты. Широкой специфичностью обладали фукоиданазы обитателей морской воды и грунта (табл. 22).

Таблица 22

Удельная активность*1 фукоиданаз и других полисахарид деградирующих ферментов _морских бактерий семейства Flavobacteriaceae_

Среда обитания Таксономическое положение KMM Субстрат

PM PG F2 FL L AP

Морская вода t

Zobellia sp. 6204 0 14,0 16,4 20,5 1,4 63,8

Пляжный песок, Коста-Рика

Maribacter sedimenticola 3903T 0 12,6 7,9 16,1 0,6 22,8

Strongylocentrotus intermedius

Bizionia sp. 6055 0 8,9 0 16,3 0 31,5

Maribacter sp. 6036 14,8 23,0 14,7 14,7 0,3 0,1

Maribacter sp. 6211 0 6,9 52,4 15,2 7,2 0

Gramella sp. 6018 0 67,8 0 22,0 18,4 184,0

Gramelta sp. 6053 0 88,1 21,1 13,8 60,3 169,0

Gramella sp. 6054 0 0 56,8 5,5 48,7 156,6

Н.и."' 6038 188,2 254,1 10,3 21,5 5,3 3,5

Н.и.**1 6051 5,2 23,3 3,08 17,8 0,4 0,7

Н.и.**' 6207 0 77,3 0 13,0 43,8 178,1

Н.и."1 6208 1,1 17,9 7,7 23,4 1,8 1,8

Н.и.**' 6209 0 0 0 8,5 30,6 248,0

Н.и.**1 6210 5,4 3,1 32,6 26,9 14,2 32,8

Laminaria japónica

Zobellia laminariae 3676T 0 8,7 0 1,8 67,3 18,1

Acrosiphonia sonderi

Algibacter lectus 3970 37,5 105,5 15,3 18,4 89,5 26,2

Fotmosa sp. 3901 1137,6 907,3 98,3 48,8 50,1 101,9

Mesonia algae 3909T 0 0 55,0 O 0 3,1

Salegentibacter sp. 6039 5,8 28,4 8,6 23,0 29,7 65,8

Zobellia sp. 3964 9,4 25,1 8,7 11,0 3,9 44,4

Ulva fenistrata

Maribacter ulvicola 3951T 6,6 8,0 0 9,4 0 0

Polysiphonia japónica

Winogradskyella eximia 3908 5,0 139,6 0 11,9 11,1 63,2

*' — нмоль/ч мг белка, **' — не идентифицированные штаммы, РМ — полиманнуроновая кислота; Рв — полигулуроновая кислота; Р2 — фукоидан из бурой водоросли Р. еуалевсепз; Р1. — фукоидан из бурой водоросли I. с/с/)ог/ойев; I. — ламинаран; АР — амилопектин.

В виду того, что экстракт биомассы бактерии М. algae КММ 3909т действовал только на сульфатированный 1,3;1,4-сс-1--фукан F2, а М. ulvicola КММ 3951т— на сульфатированный 1,3-а-1--фукан FL, можно предположить о наличии в них фукоиданаз, способных катализировать соответственно а-1,4-0- и а-1,3-О-гликозидные связи между остатками сульфатированной L-Fuc в a-L-фукане.

Результаты скрининга были проанализированы с точки зрения таксономического положения бактерий. Представители рода Агеш'Ьас(ег отличались отсутствием ферментов, деградирующих любые полисахариды (рис. 22), и имели одинаковый профиль действующих гликозидаз (см. стр. 10) в независимости от источника выделения. Преобладающим ферментом АгеЫЬасЛегэр. являлась ЫАИсВ.

§16 Í 12

<=;

о

А Б В Г

1 2 34 5 67 89101112 Род бактерий

Рис. 22. Распространение ферментов, деградирующих фукоидан, среди морских бактерий родов: 1 — Algibacter, 2 — Arenibacter, 3 — Bizionia; 4

— Formosa; 5 — Grame/la; 6 — Maribacter, 7 — Mesonia; 8 — Salegentibacter, 9 — Ulvibacter, 10 — Winogradskyella; 11 — Zobellia; 12 — не идентифицированны. Субстраты: A — фукоидан F2; Б

— фукоидан FL; В — фукоиданы F2 и FL. Г — общее количество штаммов бактерий данного рода.

Бактерии рода 1оЬеШа наряду с ферментами, расщепляющими полисахариды (табл. 22, рис. 22), продуцировали ряд гликозидаз (рис. 23). Два экстракта 1оЬеШа ер. КММ 6204 и КММ 3964 из 8 изученных штаммов, катализировали гидролиз как фукоидана VI, так и фукоидана Р1_ (табл. 22, рис. 22).

Рис. 23. Распространение р-Ы-ацетилглюкозаминидаз (1), а-фукозидаз (2), а-маннозидаз (3), а-галактозидаз (4), р-галактозидаз (5), р-ксилозидаз (6), р-глюкозидаз (7) среди штаммов морских бактерий родов вгатеНа (А), МапЬа^ег (Б) и 1оЬеШа (В). 8 — общее количество штаммов данного рода.

Способность деградировать фукоиданы обнаружена у бактерий родов Gramella и Maribacter. Гликозидазы морских бактерий Gramella sp. были представлены NAGIcB, GalA, GlcB и XylB (рис. 23), тогда как профиль гликозидаз бактерий Maribacter sp не отличался от такового исследованных штаммов бактерий рода Zobellia (рис. 23). Уровень активности ферментов зависел от источника выделения.

В морской бактерии Salegentibacter mishustinae КММ 6049т — ассоцианте морского ежа S. intermedius, искомых ферментов не обнаружено, а штамм бактерии Salegentibacter sp. КММ 6039, изолированный из зеленой водоросли A. sonderi, синтезировал ферменты, деградирующие фукоидан (табл. 22). Экстракт бактерии Winogradskyella eximia КММ 3908, выделенной из красной водоросли Р. japónica, содержал ферменты, действующие на полисахарид FL (табл. 22, рис. 22), а экстракт бактерии Winogradskyella epiphytica КММ 3906т — ассоцианта зеленой водоросли А. sonderi — не проявил активности ни по одному из субстратов. В единственном исследованном штамме бактерии Ulvibacter litoraiis КММ 3976 ферменты, деградирующие фукоидан, обнаружены не были (табл. 22, рис. 22).

В морских бактериях Formosa sp. КММ 3901, М. algae КММ 3909т, Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 активность фукоиданаз была наибольшей (табл. 22), но сравнимой с активностью ферментов морских бактерий рода Pseudoalteromonas. Однако Formosa sp. КММ 3901 также синтезировала высокоактивные альгинат лиазы и полисахаридгидролазы (табл. 22), что может затруднять очистку и исследование фукоиданаз. Достоинством М. algae КММ 3909т,

issacherikonii KMM 3549', уровень фукоиданазной активности т Maribacter sp. KMM 6211 и Gramella sp. KMM 6054,

Maribacter sp. KMM 6211 и Gramella sp. KMM 6054 оставалось почти полное отсутствие других гликозидгидролаз, поэтому они были выбраны для дальнейшего изучения

Подобно Р штаммов М. algae KMM 3909 выращенных на средах, содержащих моносахариды, значительно превышал ее уровень в этих же штаммах, культивированных на среде с добавлением фукоидана F0 (рис. 24) и увеличивался по мере роста бактерий (рис. 25).

Об

Рис. 24. Влияние D-глюкозы (А), D-ксилозы (Б) и фукоидана F0 (В) на уровень активности фукоидан деградирующих ферментов в штаммах морских бактерий семейства Flavobacteriaceae: 1 — М. algae KMM 3909т, 2 — Maribacter sp. KMM 6211, 3 — Gramella sp. KMM 6054.

Рис. 25. Активность фукоидан деградирующих ферментов штаммов морских бактерий М. algae KMM 3909т (1) и Maribacter sp. KMM 6211 (2), выращенных на средах с добавлением соответственно D-глюкозы или D-ксилозы (1 г/л). Оба штамма культивировали в течение 24 ч (а) и 48 ч (б). А — удельная активность фукоиданаз (мкмоль/ч мг белка), Б — концентрация белка в экстрактах (мг/мл).

о 1=

< о

м.

Штаммы

а ® 6

I 2

Штаммы

ID л>

6 Г

>

4

у

<)

;> и ф

Ш

0

Таким образом, в результате проделанной работы было охарактеризовано содержание О-гликозидгидролаз и альгинат лиаз у 51 представителя морских бактерий семейства Flavobacteriaceae. Было показано, что перспективными источниками фукоиданаз являются бактерии М. algae KMM 3909т, Maribacter sp. KMM

6211 и Gramella sp. KMM 6054. Индуктором биосинтеза фукоиданаз является D-Xyl.

этих бактериях

2.4 Исследование свойств и субстратной специфичности фукоиданазы из морской бактерии РзвиёоаНеготопаз сНгеа

Исследования основных свойств фукоиданаз из морской бактерии Рзеис/оаКеготопаз сИгеа были выполнены на ферментных препаратах, полученных частичной очисткой экстрактов бактерий от низкомолекулярных примесей с помощью гель-фильтрации на сефадексе в-25. В качестве субстарата использовали 1,3-а-1_-фукан из I.. сю1югю1с1ез (Б!.). Препараты фукоиданаз всех трех штаммов оказались максимально эффективны по действию на фукоидан при рН 6,5-7,0, и сохраняли активность до 40°-50°С.

Из клеточного экстракта бактерии Р. сИгеа КММ 3296, выращенной на стандартной среде, комбинацией традиционных методов (осаждение сульфатом аммония, анионообменной хроматографии, гельфильтрации и ультафильтрации) выделили препарат фермента, который не содержал Са1А, целлюлазы и альгинат лиазы. Молекулярная масса фукоиданазы по результатам гель-фильтрации составляла 80 кДа. Согласно немногочисленным литературным данным, фукоиданазы — высокомолекулярные ферменты с Мм 80-100 кДа.

Для исследования специфичности фукоиданазы из Р. сИгеа к типу О-гликозидной связи в качестве субстратов использовали фукоиданы из бурых водорослей I. асЬоноШев Б!, и Р. evanescens Б2 (табл. 23). Под действием препаратов

ферментов, полученных частичной очисткой экстрактов бактерий Р. сИгеа КММ 3296, КММ 3297 и КММ 3298 от низкомолекулярных примесей, фукоидан РЬ был практически полностью деполимеризован до олигосахаридов (рис. 26).

Все продукты ферментативного гидролиза фукоидана Р1_ состояли в основном из остатков ЬРис. В 1Н ЯМР-спектрах образовавшихся олигосахаридов наблюдались сигналы с 5 5,42, 4,36, 4,51 и 1,33 м.д., которые характерны для остатков Ь-Рис, сульфатированной по С2 и С4.

Таблица 23

Характеристика фукоиданов и продуктов их деградации под действием

Образец Выход, % Мм, кДа Моносахаридный состав, % Fuc:Gal:Xyl:Rha:Glc:Man Молярное отношение Fuc:S02"4

FL 60-80 90:1,2:2,8:0:0:6:0 1:1,6

F2 100 40-60 95:2,0:2,8:0:0:0,2 1:0,70

Ps-1 70 0,9-0,3 96:4:0:0:0:0 1:0,31

Ps-2 20 2-3 97,2:0,4:2,1:0,3:0:0 1:0,53

В образце фукоидана F2 количество 1,3-связанной Fue в 3,5 раза преобладало над количеством 1,4-связанной, согласно результатам метилирования десульфатированной фракции этого фукоидана (соотношение ацетатов 2,3-ди-О-Ме : 2,4-ди-О-Ме-фуцита = 11 : 39).

490

2.0-

1,5 1 А 2

1.0 - А/\

0,5 / /V'

0.0 4 /Д\

1з

30 40 50 Объем элюентэ, мл

Рис. 26. Профили элюции, полученные после гель-фильтрации на Тоуореаг! 40-Н\А/ (1x100 см, 12 мл/мин) фукоидана Р1- из /.. сюЬопоШез (1) и продуктов его деградации, образовавшихся под действием фукоиданаз бактерий Р. сНгеа КММ 3297 (2), КММ 3298 (3), КММ 3296 (4); 5 —глюкоза.

Продукты ферментативного гидролиза, полученные в результате действия фермента на фукоидан Р2, разделили на две фракции (Рб-1, Рэ-2) (рис. 27). По данным моносахаридного анализа продукты Рэ-1 и Рэ-2 состояли в основном из ЬРис (табл. 23). Фракция Рэ-1, выход которой составил ~70% от суммы продуктов, была изучена более детально (табл. 23).

NaCI, М

Рис. 27. Профили элюции, полученные после разделения фукоидана (1) из Р. еуалезеелв (Р2), а также продуктов его ферментативной деградации Рэ-1 и Рб-2 (2) на ДЭАЭ-целлюлозе (3x15 см, 1,1 мл/мин); 3 — градиент ЫаС1.

200 400 600 800 1000 Объём эпюента.нл

По результатам жидкостной хроматографии фракция Рз-1 оказалась смесью низкомолекулярных олигосахаридов (рис. 28). Сульфатные группы составляли 30% от

массы фракции, что соответствует сульфатированию одного из двух остатков 1_-Рис. Соотношение ацетатов у полисахарида Р2 (2,3-ди-О-Ме- : 2,4-ди-О-Ме-фуцита = 50 : 26) изменилось по сравнению с таковым для исходного полисахарида РО: в исследуемых продуктах стали преобладать олигосахариды, в которых остатки 1_-Рис связаны 1,4-О-гликозидной связью.

Рис. 28. Результаты хроматографирования низкомолекулярных продуктов Ps-1 на жидкостном хроматографе "Jeol" (биогель Р-2, (1x100 см); 0,05 М раствор №+-ацетатного буфера, рН 5,2-5,5, 0,2 М NaCI, 7-9 мл/час). Выход сахара регистрировали реакцией с 0,15% раствором орцина в 70% H2S04 при 95°С. 1 — фукоидан, 2 — фракция низкомолекулярных продуктов Ps-1, 3 —L-фукоза.

Фракция продуктов Ps-2 представляла собой сульфатированные фукоолигосахариды с Мм 2-3 кДа (рис. 29, табл. 23). Величина угла оптического вращения ([а]о20) олигосахаридов Ps-2, равная -11° (1,0 мг/мл, НгО), была значительно ниже, чем у полисахарида F2 (-173°), хотя 13С ЯМР-спектр Ps-2 оставался идентичным спектру фукоидана F2. Моносахаридный состав Ps-2 сравним с моносахаридным составом исходного полисахарида F2, но количество сульфатов уменьшилось.

Рис. 29. Профили элюции, полученные при гель-фильтрации фукоидана из Р. еуапезсепв (1) и продуктов его деградации Р$-2 (2), на колонке Бирегёех 75 НВ (1 хЗО см, 0,01 М №*-фосфатный буфер рН 7,2, 0,15 М №С1, 0,4 мл/мин, петля —0,1 мл), запускаемой системой РР1_С.

Таким образом, сопоставляя результаты выполненного исследования можно с большой долей вероятности предположить, что фукоиданаза из морской бактерии РзеийоаНеготопаз сИгеа является ферментом эндо-типа действия и катализирует гидролиз 1,3-а-О-гликозидных связей в фукоиданах с образованием фукоолигосахаридов. Фуканаза экзо-типа в изучаемых штаммах, вероятно, отсутствуют, так как ЬРис, основной продукт их действия, не обнаружена. Полученные результаты согласуются с литературными данными, касающимися фукоиданаз из у-протеобактерий. Так, известно, что бактерия рода АНеготопаз 3!^-1009 продуцирует фермент, являющийся эндо-1,3-а-1_-фукоиданазой.

Препараты ферментов из морской бактерии Р. сИгеа КММ 3296 можно использовать для получения сульфатированных фукоолигосахаридов из фукоиданов I. сюИопоШез и Р. evanescens.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выполнено систематическое исследование распространения а-галактозидаз и а-М-ацетилгалактозаминидаз среди морских бактерий, которые были

Время выхода, ч

д

490 2.0 1

Объём элюента, мп

изолированы из морской воды, грунта, животных и водорослей, собранных в различных акваториях Мирового океана. Показано, что доминирующими группами микроорганизмов-продуцентов а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз являются грамотрицательные бактерии родов Pseudoalteromonas и Vibrio. Установлено, что оба фермента чаще встречаются среди ассоциантов животных. Продуценты a-галактозидаз в основном найдены в акваториях северо-западной части Тихого Океана, a-N-ацетилгалактозаминидаз — в тропических водах.

2. Впервые из новой морской бактерии рода Arenibacter latericius КММ 426т выделена a-N-ацетилгалактозаминидаза, способная при рН 7,3 устранять групповую специфичность эритроцитов крови человека группы А и проявлять высокую активность в реакции ингибирования гемагглютинации с групповым веществом крови А. Фермент стабилен до 50°С и в физиологических условиях существует в виде гомодимера с молекулярной массой 94 кДа. Экзогенный NAD+ не влияет, а ионы Na+ и Мд2+ увеличивают активность a-N-ацетилгалактозаминидазы. С помощью автоматического метода Эдмана установлена N-концевая аминокислотная последовательность (15 а.о.) a-N-ацетилгалактозаминидазы.

3. Впервые из новой облигатно морской психротолерантной у-протеобактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 выделена термолабильная а-галактозидаза, способная в физиологических условиях (рН 7,3) инактивировать групповую специфичность эритроцитов крови человека группы В и прерывать адгезию патогенной бактерии Соrynebacterium diphtheria к клеткам буккального эпителия. Фермент активен в форме гомодимера с молекулярной массой 170 кДа и катализирует гидролитическое отщепление остатков галактозы с сохранением конфигурации аномерного центра субстрата.

4. Определена N-концевая аминокислотная последовательность (15 а.о.) a-галактозидазы. Методами молекулярной биологии установлена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего этот фермент, и выведена его полная аминокислотная последовательность, построена теоретическая модель пространственной структуры и, активного центра a-галактозидазы, выявлено положение каталитических аминокислотных остатков фермента, а также остатков их ближайшего окружения. a-Галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 отнесена к семейству GH36 клана-D и в кластере бактериальных ферментов образует подсемейство с a-галактозидазами из морских у-протеобактерий.

5. Методом золь-гель технологии a-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 иммобилизована в различные по составу гибридные полисахарид-силикатные нанокомпозитные материалы. Показано, что уровень активности и стабилизация фермента определяется как концентрацией полисахарида в матрице, так и его природой. Предложен оптимальный состав матрицы для иммобилизации a-галактозидазы.

6. Изучено влияние широкого ряда природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность a-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Показано, что ингибирующие свойства этих соединений зависят от природы заместителей, их числа и положения в структуре. Среди природных полигидрокси-1,4-нафтохинонов со свободными р-ОН группами обнаружены обратимые ингибиторы фермента. Ди- и тригалогензамещенные нафтазарины с вицинальным расположением атомов Cl в хиноидном кольце проявляют себя как необратимые высокоэффективные ингибиторы. Фермент можно использовать в качестве тест-системы для обнаружения и оценки количественного содержания высокотоксичных хлорпроизводных нафтазарина, являющихся микропримесями в препаратах синтетического эхинохрома.

7. Разработан способ освобождения фукоидана от полифенольных соединений. Для контроля качества очистки фукоиданов предложен метод флуоресценции.

Показано, что образцы фукоиданов, свободные от полифенолов, сохраняют биологические свойства, характерные для природного комплекса полисахарида с полифенолами. Высокоочищенный образец фукоидана можно использовать в качестве субстрата для поиска и изучения свойств фукоиданаз.

8. Изучено распространение фукоидан-деградирующих ферментов среди морских бактерий-эпифитов водорослей и ассоциантов морских беспозвоночных. Высокая активность фукоиданаз отмечена у представителей бактерий родов Alteromonas/Pseudoalteromonas и семейства Flavobacteriaœae, изолятов бурых водорослей и иглокожих. Показано, что фукоиданазы синтезируются штаммами, выделенными из источников, богатых a-L-фуканами, и могут служить экофизиологической характеристикой данного вида бактерий.

9. Показано, что у-протеобактерия Р. issachenkonü КММ 3549т, выделенная из таллома бурой водоросли F. evanescens итурупской популяции, а также морские бактерии семейства Fiavobacteriaùeae, такие как Mesonia algae КММ 3909т — изоляты зеленой водоросли A. sonden, Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 — ассоцианты морского ежа S. intermedias, наряду с фукоиданазами, содержат ферменты, участвующие в деградации как нейтральных, так и полианионных полисахаридов бурых водорослей. Уровень активности фукоиданаз зависит от состава питательной среды бактерий.

10. Установлено, что фукоиданазы бактерий P. citrea КММ 3296 и КММ 3298, изолятов бурых водорослей F. evanescens и С. Шит соответственно, а также КММ 3297 — изолята A. japonicus, обладают свойством деполимеризовать фукоиданы по эндо-типу до сульфатированных a-L-фукоолигосахаридов. Фермент, выделенный из Р. citrea КММ 3296, катализирует гидролиз доступных 1,3-а-О-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens и является а-1,3-Ьфуканазой (ЕСЗ.2.1.-).

11. a-N-Ацетилгалактозаминидаза и a-галактозидаза морских бактерий, способные к конверсии эритроцитов крови человека, могут найти применение в биотехнологии создания универсальной крови. a-Фукоиданаза может быть применена для получения низкомолекулярных биологически активных сульфатированных фукоолигосахаридов. a-N-Ацетилгалактозаминидаза и a-галактозидаза, а также фукоиданазы могут быть использованы в качестве инструментов для структурных исследований углеводов и углевод содержащих биополимеров, антигенов клеток бактерий и эукариот.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Михайлов В.В., Романенко Л.А., Горшкова Н.М., Парфенова В.В., Елякова Л.А. Распространение хитинразлагающих ферментов у морских и пресноводных микроорганизмов // Биология моря. — 1992. — №3-4. — С. 69—75.

2. Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Михайлов В.В., Недашковская О.И., Горшкова Н.М., Парфенова В.В. Распространение a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских и пресноводных микроорганизмов II Микробиология. — 1994. — Т. 63, №5. — С. 847—853.

3. Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Недашковская О.И., Горшкова Н.М., Михайлов В.В., Елякова Л.А. Поиск продуцентов a-галактозидаз среди морских бактерий рода Alteromonas // Прикл. биохим. микробиол. — 1996. — Т. 32, №6. — С. 624—628.

4. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И, Горшкова Н.М., Михайлов В.В., Елякова Л.А. Распространение морских микроорганизмов, продуцирующих ß-N-ацетилглюкозаминидазы, а-галактозидазы, a-N-ацетилгалактозаминидазы // Биология моря. — 1998. —Т. 24, №6. — С. 351—358.

5. Бакунина И.Ю., Сова В.В., Недашковская О.И., Кульман P.A., Лихошерстов Л.М., Мартынова М.И., Михайлов В.В., Елякова Л.А. a-Галактозидаза морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701 // Биохимия. —1998. — Т. 63, №10. — С.1420—1427.

6. Звягинцева Т.Н., Сова В.В., Бакунина И.Ю., Сундукова Е.В., Ермакова С.П., Елякова Л.А. Морские организмы как источники биологически активных полисахаридов, полисахарид гидролаз с уникальной специфичностью и их ингибиторов // Химия в интересах устойчивого развития. — 1998. — №6. — С. 417—426.

7. Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Михайлов В.В., Елякова Л.А. Ферменты, изменяющие групповую специфичность эритроцитов крови человека. / Научные разработки для практического использования. Владивосток: Дальнаука. — 1999. — Вып. 2. — С. 9—10.

8. Бакунина И.Ю., Шевченко Л.С., Недашковская О.И., Шевченко Н.М., Алексеева С .А., Михайлов В.В., Звягинцева Т.Н. Поиск фукоиданаз среди морских микроорганизмов // Микробиология. — 2000. — Т. 69, №3. — С. 370—376.

9. Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Алексеева С.А., Иванова Е.П., Романенко Л.А., Горшкова Н.М., Исаков В.В., Звягинцева Т.Н., Михайлов В.В. Особенности деградации фукоидана морскими протеобактериями Pseudoalteromonas citre II Микробиология. —2002. — Т. 71, №1. — С. 49—55.

10. Ivanova Е.Р., Bakunina I.Yu., Sawabe Т., Hayashi К., Alexeeva Y.V., Zhukova N.V., Nicolau D.V., Zvyagintseva T.N., Mikhailov V.V. Two species of culturable bacteria associated with degradation of brown algae Fucus evanescens II Microb. Ecol. — 2002. — Vol. 43, N 2. — P. 242—249.

11. Недашковская О.И., Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Светашев В.И., Звягинцева Т.Н., Михайлов В.В. Характеристика морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, деградирующих фукоидан II Мжробюл. журн. — 2002. — Т. 64, №2. — С. 3—10.

12. Бакунина И.Ю., Кульман Р.А., Лихошерстов Л.М., Мартынова М.Д., Недашковская О.И., Михайлов В.В., Елякова Л.А. ct-N-Ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter laterlcius КММ 426Т, устраняющая групповую специфичность А-эритроцитов // Биохимия. — 2002. — Т. 67, №6. — С. 830—837.

13. Alexeeva Y.V., Ivanova Е.Р., Bakunina I.Y., Zvaygintseva T.N., Mikailov V.V. Optimization of glycosidases production by Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549T // Lett. Appl. Microbiol. —2002. — Vol. 35, N 4. — P. 343—346.

14. Ivanova E.P., Bakunina I.Yu., Nedashkovskaya O.I., Gorshkova N.M., Alexeeva Y.V., Zelepuga E.A., Zvaygintseva T.N., Nicolau D.V., Mikhailov V.V. Ecophysiological variabilities in ectohydrolytic enzyme activities of some Pseudoalteromonas species, P. citrea, P. issachenkonii, and P. nigrifaciens II Curr. Microbiol. —2003. —Vol. 45, N 1. —P. 6—10.

15. Shchipunov Y.A., Karpenko T.Yu., Bakunina I.Yu., Burtseva Y.V., Zvyagintseva T.N., A new precursor for the immobilization of enzymes inside sol-gel-derived hybrid silica nanocomposites containing polysaccharides II J. Biochem. Biophys. Methods. — 2004. — Vol. 58, N 1, —P. 25—38.

16. Урванцева A.M., Бакунина И.Ю., Ким Н.Ю., Исаков В.В., Глазунов В.П., Звягинцева Т.Н. Выделение очищенного фукоидана из природного комплекса с полифенолами и его характеристика // Химия растит, сырья. — 2004. — №3. — С. 15—24.

17. Кусайкин М.И., Чижов А.О., Алексеева С.А., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Сова В.В., Звягинцева Т.Н., Еляков Г.Б. Сравнительное исследование специфичности фукоиданаз морских микроорганизмов и беспозвоночных II Доклады РАН. — 2004. — Т. 396, №5. — С. 1—3.

18. Урванцева A.M., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Ким С.Б., Звягинцева Т.Н. Распространение внутриклеточных фукоиданаз среди бактерий семейства Flavobacteriaceae II Прикл. биохим. микробиол. — 2006. — Т. 42, №5. — С. 552—559.

19. Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Звягинцева Т.Н., Щипунов Ю.А. Иммобилизация а-галактозидазы в гибридных нанокопозитах, содержащих полисахариды // Журн. прикл. химии. — 2006. — Т. 79, Вып. 5. — С. 839—844.

20. Kusaykin M.I., Chizhov А.О., Grachev А.А., Alekseeva S.A., Bakunina I.Yu., Nedashkovskaya O.I., Sova V.V., Zvyagintseva T.N. A comparative study of specificity of

fucoidanases from marine microorganisms and invertebrates II J. Appl. Phycology. — 2006.

— Vol. 18, N 3/5. — C. 369—373.

21. Balabanova L.A., Likshatskaya G.N., Bakunina I.Yu., Petruk S.V., Kozhemyako V.B., Rasskazov V.A. Primary structure and homology modeling of the novel a-galactosidase from marine bacterium II FEBS J. — 2006. — Vol. 273, PP687. — P. 262—263.

22. Кузнецова T.A., Беседнова H.H., Урванцева A.M., Бакунина И.Ю., Звягинцева Т.Н., Дрозд Н.Н., Макаров В.А. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов, выделенных из бурых водорослей II Вестник ДВО РАН. — 2006. — №6, —С. 105—110.

23. Лапикова Е.С., Дрозд Н.Н., Толстенков А.С., Макаров В.А., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М., Бакунина И.Ю., Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н. Ингибирование тромбина и фактора Ха фукоиданом из Fucus evanescens и его модифицированными аналогами // Бюл. эксп. биол. мед. — 2008. — Т. 145, №9. — С. 304—310.

24. Kusaykin, M.I., Bakunina, I.Yu., Sova, V.V., Ermakova, S.P., Kuznetsova, T.S., Besednova, N.N., Zaporozhets, T.S., Zvyagintseva, T.N. Structure and biological action of the polysaccharides and products of their transformation II J. Biotechnol. — 2008. — Vol. 3, N7.— P. 904—915.

25. Kiseleva M.I., Bakunina I.Y., Kusaykin M.I., Zvyagintseva T.N. Action of polyanione polysaccharides from the brown seaweeds Fucus evanescens and their modified analogs on reproductive function and development sea urchin embryos Strongylocentrotus intermedius II 1 Far-Eastern International Symposium on Life Sciences. Vladivostok. — 2008- — P. 36.

26. Бакунина И.Ю., Кольцова E.A., Похило Н.Д., Шестак О.П., Якубовская А.Я., Звягинцева Т.Н., Ануфриев В.Ф. Влияние 5-гидрокси- и 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность а-галактозидазы // Хим. природ, соедин, —2009. — №1, —С. 59—63.

27. Balabanova L.A., Bakunina I.Y., Nedashkovskaya О.I., Makarenkova I D., Zaporozhets T.S., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N., Rasskazov V.A. Molecular characterization and therapeutic potential of a marine bacterium Pseudoalteromonas sp. KMM 701 a-galactosidase // Mar. Biotechnol. — 2010.—Vol. 12, N 1, —P. 111—120.

28. Запорожец T.C., Макаренкова И.Д., Бакунина И.Ю., Бурцева Ю.В., Кусайкин М.И., Балабанова Л.А., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Рассказов В.А. Ингибирование адгезии С. diphtheriae к буккальному эпителию человека гликозид гидролазами из морских гидробионтов II Биомедицинская химия. — 2010. —Т. 56, N 3.

— С. 350—358.

29. Патент N 2113479 Российская Федерация, МКИ6 С 12 N 9/40//(С 12 N 9/40, С 12 R 1:01). Штамм бактерий Pseudoalteromonas sp. — продуцент а-галактозидазы / Недашковская О.И, Бакунина И.Ю., Сова В.В., Михайлов В.В., Елякова Л.А., Кульман Р.А. — № 97107819/13; Заявл. 23.04.97; Опубл. 20.06.98, Бюл. № 17. —7 с.

30. Патент N 2141526 Российская Федерация, МКИ6 С 12 N 9/40//(С 12 N 9/40, С 12 R 1:20). Штамм бактерий Flavobacterium sp. — продуцент a-N-ацетилглюкозаминидазы / Недашковская О.И., Бакунина И.Ю., Кульман Р.А., Лихошерстов Л.М., Мартынова М.И., Михайлов В.В., Елякова Л.А. — № 98111673/13; Заявл. 17.06.98; Опубл. 20.11.99., Бюл. № 32. — 10 с.

31. Патент N 2207370 Российская Федерация, МКИ7 С 12 N 1/20, 9/40, 9/36//(С 12 N 9/40, С 12 R 1:38). Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549т — продуцент фукоиданазы и питательная среда для его культивирования / Алексеева Ю.В., Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Звягинцева Т.Н., Михайлов В.В. — № 2002102089/13; Заявл. 01.07.02; Опубл. 27.12.03., Бюл. № 36. — 6 с.

Соискатель

Бакунина И.Ю.

Бакунина Ирина Юрьевна

О-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Подписано в печать «17» декабря 2010 г. Формат 60*84/16. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 2.37 Заказ №213923

Отпечатано в Типографии «КРАСКИ» г. Владивосток, пр-т 100-летия, 43, тел. 36-26-16

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ТЕКСТЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 О-Гликозидгидролазы. Основные понятия. Номенклатура. Классификация

1.2 а-Галактозидазы.

1.3 a-N-ацетилгалактозаминидазы.

1.4 Генетическое регулирование биосинтеза a-галактозидазы у микроорганизмов.

1.5 Классификация, структура и механизм действия a-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз.

1.5.1 a-Галактозидазы и a-N-ацетилгалактозаминидазы семейства GH27.

1.5.1.1 Пространственная структура гликозидаз семейства GH27.

1.5.1.2 Пространственная структура a-галактозидазы семейства GH36.

1.5.1.3 Структура активных центров ферментов семейств GH27 и GH36.

1.5.1.4 Каталитический механизм a-галактозидаз семейств GH27 и GH36.

1.5.2 Гликозидгидролазы семейства GH4.

1.5.2.1 Пространственная структура гликозидаз семейства GH4.

1.5.2.2 Активный центр гликозидгидролаз семейства GH4.

1.5.2.3 Каталитический механизм гликозидгидролаз семейства GH4.

1.5.3 a-Галактозидазы семейства GH57.

1.5.4 a-Галактозидазы семейства GH97.

1.5.4.1 Пространственная структура a-галактозидазы семейства GH97.

1.5.4.2 Структура активного центра и механизм действия a-галактозидазы семейства GH97.

1.5.5 a-N-ацетилгалактозаминидазы семейства GH109.

1.5.5.1 Пространственная структура a-N-ацетилгалактозаминидазы семейства GH

1.5.5.2 Активный центр a-N-ацетилгалактозаминидазы семейства GH109.

1.5.5.3 Каталитический механизм a-N-ацетилгалактозаминидазы семейства GH109.

1.5.6 a-Галактозидазы семейства GH110.

1.6 Практическое применение a-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз

1.6.1 Ферментативное преобразование А- и В-эритроцитов в О-эритроциты.,

1.6.1.1 Группоспецифичекие антигены системы ABO крови человека.

1.6.1.2 Преобразование А- и В-эритроцитов в О-эритроциты под действием классических экзо-гликозидаз.

1.6.1.3 Новое поколение ферментов, конвертирующих эритроциты крови групп А и В в универсальные О-эритроциты.

1.7 Структура, биологическая активность и ферментативная трансформация фукоиданов бурых водорослей.

1.7.1 Распространение и физиологическая роль фукоиданов.

1.7.2 Биологические свойства фукоиданов.

1.7.3 Структура фукоиданов.

1.8 Фукоиданазы.

1.8.1 Распространение фукоиданаз среди морских организмов.

1.8.2 Биохимические свойства фукоиданаз.

1.8.3 Субстратная специфичность фукоидан-деградирующих ферментов.

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 О-Гликозидгидролазы морских бактерий.

2.1.1 Морские микроорганизмы как источники ферментов с уникальными свойствами.

2.1.1.1 Распространение а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских бактерий.

2.1.1.2 Распространение a-галактозидаз среди бактерий рода Pseudoalteromonas.

2.1.2 a-Галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ

2.1.2.1 Характеристика штамма КММ 701.

2.1.2.2 Выделение, очистка и основные свойства a-галактозидазы из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701.

2.1.2.3 Действие a-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 на эритроциты крови человека.

2.1.2.4 Действие a-галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701 на эпителиоциты человека.

2.1.2.5 Каталитические свойства a-галактозидазы.

2.1.2.6 Исследование конфигурации аномерного центра продукта реакции - D-галактозы.

2.1.2.7 Ингибирование a-галактозидазы продуктом реакции — D-галактозой.

2.1.3 Характеристика структуры a-галактозидазы.

2.1.3.1 Функционально значимые аминокислотные остатки.

2.1.3.2 Определение первичной структуры a-галактозидазы.

2.1.3.3 Характеристика вторичной структуры a-галактозидазы.

2.1.3.4 Филогенетический анализ a-галактозидаз.

2.1.3.5 Компьютерное моделирование пространственной структуры a-галактозидазы и ее комплекса с a-D-галактозой.

2.1.3.6 Иммобилизация a-галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701 в гибридных нанокомпозитах, содержащих полисахариды.

2.1.3.7 Влияние природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на активность a-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701.

2.1.4 a-N-ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericiuslAO

2.1.4.1 Выделение и очистка a-N-ацетилгалактозаминидазы.

2.1.4.2 Молекулярная масса a-N-ацетилгалактозаминидазы.

2.1.4.3 Действие a-N-ацетилгалактозаминидазы на эритроциты и групповые вещества крови А.

2.1.4.4 Основные свойства a-N-ацетилгалактозаминидазы.

2.1.4.5 Структурные характеристики a-N-ацетилгалактозаминидазы.

2.2 Фукоиданазы морских бактерий.

2.2.1 Очистка и характеристика фукоидана.

2.2.1.1 Выделение фукоидана из природного комплекса с полифенолами.

2.2.1.2 Биологическая активность фукоидана из Fucus evanescens, освобожденного от недиализуемых полифенолов.

2.2.3 Распространение фукоиданаз среди морских бактерий.

2.2.3.1 Распространение фукоиданаз среди морских бактерий-эпифитов бурых водорослей и ассоциантов голотурии.

2.2.3.2 О-Гликозидгидролазы морских бактерий вида Pseudoalteromonas citrea.

2.2.3.3 Фукоиданазы и другие О-гликозидгидролазы морской бактерии Pseudoalteromonas issachenkonii КММ 3549т.

2.2.3.4 Распространение внутриклеточных фукоиданаз среди морских бактерий семейства Flavobacteriaceae.

2.2.4 Свойства и субстратная специфичность фукоиданаз из морских бактерий Pseiicloalteromonas citrea.

Актуальность исследования. Изучение О-гликозидгидролаз, ферментов, катализирующих гидролитическое расщепление О-гликозидной связи в углеводах и углеводсодержащих биополимерах, является актуальной задачей. Эти ферменты наиболее востребованы современной биотехнологией и широко используются для нужд пищевой, фармакологической, легкой промышленности и других областей деятельности человека. Они являются ключевыми ферментами углеводного обмена, как в высших организмах, так и в микроорганизмах, поэтому знания об их свойствах, структуре и механизме действия необходимы для понимания многих процессов, происходящих в клетке. Кроме того, индивидуальные гликозидгидролазы с установленной субстратной специфичностью являются точными инструментами структурного анализа соответствующих природных полисахаридов и углеводсодержащих биополимеров.

Морская экосистема считается мало исследованным источником природных веществ, в частности полисахаридов, обладающих терапевтическими свойствами, а также ферментов, проявляющих новые виды каталитической активности, перспективные для биотехнологии. Морскими источниками ферментов являются животные, растения и микроорганизмы. Микроорганизмы, особенно бактерии, играют важную роль в метаболических процессах морских экосистем. Они производят биомассу, которая составляет пищу для более высоких трофических уровней, осуществляют биодеградацию органических отходов и техногенных загрязнений экосистемы. Быстрый ответ микроорганизмов на экологические изменения, их важные функции в экосистемах обеспечиваются ферментными системами. Гетеротрофные облигатно морские бактерии привлекают все большее внимание как источники ферментов с редко встречающейся специфичностью, так как они легко культивируются, обладают высокой скоростью размножения и позволяют осуществлять биосинтез веществ в контролируемых условиях. Кроме того, генетический материал уникальных бактерий можно использовать для создания искусственных суперпродуцентов рекомбинантных ферментов на основе легко культивируемых известных технологичных штаммов. Наряду с методами генетической инженерии, современные методы морской аквакультуры становятся альтернативой экологически деструктивной крупномасштабной добыче морской биомассы для производства биологически активных веществ, в том числе ферментов.

Ферменты как биохимические инструменты представляют большой научный интерес при исследовании антигенной структуры различных биологических объектов и её модификации. Частным случаем энзиматической модификации антигенов является направленное изменение групповой специфичности эритроцитов крови человека для создания универсальной крови 0(1) из крови доноров разных групп. Для конверсии эритроцитов используют две специфичных экзо-гликозидазы, способных удалять иммуннодоминантные моносахаридные остатки, которые определяют групповую специфичность эритроцитов крови А(П) и В(Ш). На сегодняшний день изучено лишь несколько таких ферментов из наземных источников, главным образом растений и бактериальных патогенов для человека. Данные о структурах и механизме действия подобных ферментов из морских объектов практически отсутствуют.

Углеводы и гликоконьюгаты осуществляют ряд важных функций в биологических системах, включая оплодотворение, эмбриогенез, развитие нейронов, клеточную пролиферацию и метастазирование, поэтому они имеют значительный потенциал как терапевтические агенты. Особый интерес вызывают фукоиданы -полисахариды клеточных стенок бурых водорослей. Они представляют собой семейство гомо- и гетерополисахаридов, основная цепь которых состоит преимущественно из остатков сульфатированной фукозы, связанных а-1,3- и/или а-1,4-О-гликозидными связями. Эти полисахариды проявляют широкий спектр биологического действия на различные системы организма млекопитающих. Известны их антикоагулянтная, антиангиогенная, антивирусная, антиопухолевая, антиоксидантная и другие активности. Поэтому интерес к фукоиданам, как основе для конструирования эффективных медицинских препаратов нового поколения, в настоящее время возрастает. В связи с этим, важной проблемой является селективный гидролиз этих полисахаридов как с целью установления их химической структуры, так и с целью их трансформации. Такой гидролиз может быть достигнут с помощью специфичных ферментов — фукоиданаз.

Фукоиданазы - гликозидгидролазы, катализирующие гидролиз О-гликозидных связей основной цепи фукоиданов, остаются наименее изученным семейством гликозидгидролаз. Фукоиданазы обнаружены только у обитателей морской среды, и уровень их активности невысок. В качестве источников таких ферментов наибольший интерес представляют морские бактерии, которые участвуют в утилизации биомассы после отмирания макрогидробионтов.

Целью исследования являлось изучение О-гликозидгидролаз из истинно морских гетеротрофных бактерий, имеющих биотехнологический потенциал: a-N-ацетилгалактозаминидаз и a-галактозидаз, пригодных для получения «универсальной крови», а также фукоиданаз, участвующих в биодеградации биологически активных полисахаридов бурых водорослей - фукоиданов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- исследовать особенности распространения a-N-ацетилгалактозаминидаз и a-галактозидаз среди морских бактерий, собранных в различных акваториях Мирового океана;

- провести поиск a-N-ацетилгалактозаминидаз и a-галактозидаз, удаляющих иммуннодоминантные моносахариды от углеводных составляющих антигенов эритроцитов крови человека при нейтральных значениях рН,

- из перспективных источников выделить a-N-ацетилгалактозаминидазу и a-галактозидазу в гомогенном состоянии, охарактеризовать их основные биохимические свойства и субстратную специфичность;

- изучить действие a-N-ацетилгалактозаминидазы и a-галактозидазы на эритроциты крови человека группы А и В, а также действие a-галактозидазы на клетки буккального эпителия и патогенной бактерии Coryne bacterium diphtheriae',

- установить первичную структуру, пространственную организацию, механизм действия a-галактозидазы и её принадлежность к определённому семейству гликозидгидролаз;

- провести поиск ингибиторов a-галактозидазы среди морских природных соединений, а также их синтетических производных;

- выполнить иммобилизацию a-галактозидазы в полисахаридсодержащих нанокомпозитных материалах;

- получить высокоочищенный образец фукоидана, охарактеризовать элементы его структуры и обусловленные ими биологические свойства;

- провести поиск фукоиданаз среди бактерий-эпифитов и ассоциантов морских животных Охотского и Японского морей, исследовать особенности их распространения среди у-протеобактерий и бактероидов, используя высокоочищенный субстрат;

- изучить особенности деградации фукоиданов из бурых водорослей Fucus evanescens и Laminaria cichorioides под действием ферментов из морских бактерий, принадлежащих к различным таксонам и культивируемых на различных по составу питательных средах;

- определить области практического применения ферментов. На защиту выносятся следующие положения:

1. Облигатно морские бактерии, обитающие в Охотском и Японском морях, являются перспективными источниками a-N-ацетилгалактозаминидаз, а-галактозидаз и фукоиданаз.

2. a-N-ацетилгалактозаминидаза из морской бактерии Arenibacter latericius КММ 426т удаляет иммуно доминантные а-1,3-связанные остатки N-ацетилгалактозамина от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы крови А.

3. a-Галактозидаза из морской у-протеобактерии Psendoalteromonas sp. КММ 701 удаляет иммунодоминантные а-1,3-связанные остатки галактозы от невосстанавливающего конца углеводной составляющей антигенных детерминант эритроцитов человека группы В. Фермент имеет свободную SH-группу, важную для проявления активности; по биохимическим свойствам, субстратной специфичности, первичной и пространственной структуре он относится к 36-ому семейству О-гликозидгидролаз.

4. Иммобилизация a-галактозидазы в гибридные полисахарид-силикатные нанокомпозитные материалы увеличивает уровень ее активности и стабильность.

5. Влияние полигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность тиоловой a-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 зависит от природы заместителей, их числа и положения в структуре соединений: эхинохром А не влияет на активность фермента, ди- и тригалогензамещенные нафтазарины являются необратимыми ингибиторами a-галактозидазы.

6. Фукоидан из бурой водоросли F. evanescens, освобожденный от полифенольных соединений, сохраняет структурные характеристики и биологические свойства исходного полисахарида. Образец полисахарида пригоден для использования в качестве субстрата при поиске фукоиданаз, изучении их свойств и субстратной специфичности.

7. Фукоиданазы с невысоким уровнем активности широко распространены как среди бактерий-эпифитов бурых водорослей, так и среди изолятов морских иглокожих. Лучшими продуцентами являются бактерии родов Alteromonas и Psendoalteromonas филума Proteobacteria, а также бактерии семейства Flavobacteriaceae типа Bacteroidetes. т

8. у-Протеобактерия Psendoalteromonas issachenkonii КММ 3549 , а также бактероиды семейства Flavobacteriaceae, такие как Mesonia algae КММ 3909 , Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 содержат ферменты, участвующие в деградации как нейтральных, так и полианионных полисахаридов бурых водорослей, в том числе — фукоиданазы. Уровень активности фукоиданаз в клетках этих бактерий невысок и варьирует в зависимости от состава питательной среды.

9. Фукоиданазы из штаммов бактерии Psendoalteromonas citrea, которые являются эпифитами бурых водорослей F. evanescens и Chorda filum, а также ассоциантами голотурии Apostichopus japónicas, катализируют гидролиз доступных а-1,3-0-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens по эндо-типу, образуя в качестве продуктов сульфатированные a-L-фукоолигосахариды.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые выполнено крупномасштабное исследование распространенности О-гликозидгидролаз среди бактериальных изолятов различных экотопов Охотского, Японского, ЮжноКитайского, Кораллового морей, литорали Сейшельских о-в, о-в Кука и других акваторий Мирового океана.

Впервые в морских бактериях найдены гликозидгидролазы, модифицирующие эритроциты и гликопротеины крови человека группы А и В: a-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701, a-N-ацетилгалактозаминидаза из Arenibacter latericias КММ 426т, проведено их выделение и очистка; впервые показано, что a-галактозидаза из морской бактерии нарушает углеводные структуры, экспрессированные на поверхности эпителиоцитов человека и бактерий С. diphtheriae.

Установлена полная аминокислотная последовательность а-галактозидазы и принадлежность ее к 36-му семейству О-гликозидгидролаз. Впервые методом сравнительного моделирования получены теоретические модели пространственной структуры а-галактозидазы Pseudoalteromonas sp. КММ 701, её каталитического домена и комплекса с конкурентным ингибитором галактозой. На основании результатов этих исследований установлены функционально значимые участки в молекуле фермента и их роль в катализе.

Выполнена иммобилизация а-галактозидазы в гибридные нанокомпозитные материалы, содержащие полисахариды, в результате чего увеличилось время функционирования фермента и его термостабильность.

Среди природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов обнаружены ингибиторы а-галактозидазы; наиболее значительным необратимым ингибирующим действием отличались хлорпроизводные этих соединений.

Из бактерии Pseudoalteromonas citrea выделен фермент, который катализирует гидролиз доступных а-1,3-0-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens и является 1,3-а-Ь-фуканазой (ЕС 3.2.1.-).

Результаты исследований защищены патентами и позволят достичь конечной практической цели - применения ферментов морских бактерий и их рекомбинантных аналогов в медицине, структурной химии углеводов и генной инженерии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выполнено систематическое исследование распространения а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз среди морских бактерий, которые были изолированы из морской воды, грунта, животных и водорослей, собранных в различных акваториях Мирового океана. Показано,. что доминирующими группами микроорганизмов-продуцентов a-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз являются грам отрицательные бактерии родов Pseudoalteromonas и Vibrio. Установлено, что оба фермента чаще встречаются среди ассоциантов животных. Продуценты a-галактозидаз в основном найдены в акваториях северо-западной части Тихого Океана, a-N-ацетилгалактозаминидаз - в тропических водах.

2. Впервые из новой морской бактерии рода Arenibacter latericius КММ 426х выделена a-N-ацетилгалактозаминидаза, способная при рН 7,3 устранять групповую специфичность эритроцитов крови человека группы А и проявлять высокую активность в реакции ингибирования гемагглютинации с групповым веществом крови А. Фермент стабилен до 50°С и в физиологических условиях существует в виде гомодимера с молекулярной массой- 94 кДа. Экзогенный NAD+ не влияет, а ионы Na+

У 4и Mg увеличивают активность a-N-ацетилгалактозаминидазы. С помощью автоматического метода Эдмана установлена N-концевая- аминокислотная последовательность (15 а.о.) a-N-ацетилгалактозаминидазы.

3. Впервые из новой облигатно морской психротолерантной у-протеобактерии . Pseudoalteromonas sp. КММ 701 выделена термолабильная a-галактозидаза, способная в физиологических условиях (рН 7,3) инактивировать групповую специфичность эритроцитов крови человека группы В и прерывать адгезию патогенной бактерии Corynebacterium diphtheria к клеткам буккального эпителия. Фермент активен в форме гомодимера с молекулярной массой 170 кДа и катализирует гидролитическое отщепление остатков галактозы с сохранением конфигурации аномерного центра субстрата.

4. Определена N-концевая аминокислотная последовательность (15 а.о.) a-галактозидазы. Методами молекулярной биологии установлена нуклеотидная последовательность гена, кодирующего этот фермент, и выведена его полная аминокислотная последовательность, построена теоретическая модель пространственной структуры и активного центра a-галактозидазы, выявлено положение каталитических аминокислотных остатков фермента, а также остатков их ближайшего окружения. а-Галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 отнесена к семейству GH36 клана-D и в кластере бактериальных ферментов образует подсемейство с а-галактозидазами из морских у-протеобактерий.

5. Методом золь-гель технологии а-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. КММ 701 иммобилизована в различные по составу гибридные полисахарид-силикатные нанокомпозитные материалы. Показано, что уровень активности и стабилизация фермента определяется как концентрацией полисахарида в матрице, так и его природой. Предложен оптимальный состав матрицы для иммобилизации а-галактозидазы.

6. Изучено влияние широкого ряда природных и синтетических полигидрокси-1,4-нафтохинонов на гидролитическую активность а-галактозидазы из Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Показано, что ингибирующие свойства этих соединений зависят от природы заместителей, их числа и положения в структуре. Среди природных полигидрокси-1,4-нафтохинонов со свободными р-ОН группами обнаружены обратимые ингибиторы фермента. Ди- и тригалогензамещенные нафтазарины с вицинальным расположением атомов Cl в хиноидном кольце проявляют себя как высокоэффективные необратимые ингибиторы. Фермент можно использовать как тест-систему для обнаружения и оценки содержания высокотоксичных хлорпроизводных нафтазарина, являющихся микропримесями в препаратах синтетического эхинохрома.

7. Разработан способ освобождения фукоидана от полифенольных соединений. Для контроля качества очистки фукоиданов предложен метод флуоресценции. Показано, что образцы фукоиданов, свободные от полифенолов, сохраняют биологические свойства, характерные для природного комплекса полисахарида с полифенолами. Высокоочищенный образец фукоидана можно использовать в качестве субстрата для поиска и изучения свойств фукоиданаз.

8. Изучено распространение фукоидан-деградирующих ферментов среди морских бактерий-эпифитов водорослей и ассоциантов морских беспозвоночных. Высокая активность фукоиданаз отмечена у представителей бактерий родов Alteromonas!Pseudoalteromonas и семейства Flavobacteriaceae, изолятов бурых водорослей и иглокожих. Показано, что фукоиданазы синтезируются штаммами, выделенными из источников, богатых a-L-фуканами, и могут служить экофизиологической характеристикой данного вида бактерий. т

9. Показано, что у-протеобактерия P. issachenkonii КММ 3549 , выделенная из таллома бурой водоросли F. evanescens итурупской популяции, а также морские бактерии семейства Flavobacteriaceae, такие как Mesonia algae КММ 3909 - изоляты зеленой водоросли A. sonderi, Maribacter sp. КММ 6211 и Gramella sp. КММ 6054 -ассоцианты морского ежа S. intermedins, наряду с фукоиданазами, содержат ферменты, участвующие в деградации как нейтральных, так и полианионных полисахаридов бурых водорослей. Уровень активности фукоиданаз зависит от состава питательной среды бактерий.

10. Установлено, что фукоиданазы бактерий P. citrea КММ 3296 и КММ 3298, изолятов бурых водорослей F. evanescens и С. filum соответственно, а также КММ 3297 — изолята A. japonicus, обладают свойством деполимеризовать фукоиданы по эндо-типу до сульфатированных a-L-фукоолигосахаридов. Фермент, выделенный из P. citrea КММ 3296, катализирует гидролиз доступных 1,3-а-О-гликозидных связей в фукоиданах из L. cichorioides и F. evanescens и является а-1,3-Ь-фуканазой (ЕСЗ.2.1.-).

11. a-N-Ацетилгалактозаминидаза и a-галактозидаза морских бактерий, способные к конверсии эритроцитов крови человека, могут найти применение в биотехнологии создания «универсальной крови». a-L-Фукоиданаза может быть применена для получения низкомолекулярных биологически активных сульфатированных фукоолигосахаридов. a-N-Ацетилгалактозаминидаза и a-галактозидаза, а также фукоиданазы могут быть использованы в качестве инструментов для структурных исследований углеводов и углевод содержащих биополимеров, антигенов клеток бактерий и эукариот.

2.3 Заключение

В работе представлена обширная информация о распределении ряда О-гликозидгидролаз среди морских бактерий, обитающих в различных акваториях Мирового океана. В истинно морских бактериях найдены, очищены и изучены гликозидазы, которые при нейтральных значениях рН инактивируют серологическую активность эритроцитов и групповых вещества крови человека групп А и В: a-N-ацетилгалактозаминидаза из Arenibacter latericias и a-галактозидаза из Pseudoalteromonas sp. Показано, что a-галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. ингибирует адгезию патогенного штамма Corynebacterium diphtheriae к клеткам буккального эпителия, полученным от донора с группой крови В. В морских бактериях-эпифитах Pseudoalteromonas citrea, Pseudoalteromonas issachenkonii и Mesonia alga обнаружены ферменты, деградирующие фукоиданы бурых водорослей. Основные результаты исследований защищены патентами и открывают перспективу практического использования ферментов морских бактерий.

Наиболее изученным ферментом является a-галактозидаза из морской бактерии Pseudoalteromonas sp. КММ 701. Проведено клонирование гена a-галактозидазы с использованием хромосомной ДНК, установлена ее аминокислотная последовательность и охарактеризована вторичная структура. Методом сравнительного компьютерного моделирования построены теоретические модели полной пространственной структуры a-галактозидазы и её активного центра. На основании результатов ингибиторного анализа и компьютерного моделирования сделаны предположения о функционально важных аминокислотных остатках в молекуле а-галактозидазы и их роли в катализе. Показано, что в рамках классификации CAZy, основанной на сходстве аминокислотных последовательностей, а-галактозидаза из Рs endo alter omonas sp. KMM 701 является членом 36-го семейства GH. Впервые выполнена иммобилизация а-галактозидазы Pseudoalter omonas sp. в гибридные нанокомпозитные материалы, содержащие полисахариды. a-N-ацетилгалактозаминидаза из аэробной морской бактерии Arenibacter latericius - фермент менее изученный. В настоящее время продолжается исследование его структуры и механизма действия. На данный момент остается открытым вопрос о родственных и эволюционных отношениях a-N-ацетилгалактозаминидазы из Arenibacter latericius с подобными ферментами бактерий, представителями различных семейств GH.

Изучение структурно-функциональных свойств, механизма действия и классификации фукоиданаз из отмеченных выше бактерий также находится в развитии. Необходимы экспериментальные подтверждения предположения о том, что ферменты у-протеобактерий и бактероидов могут различаться специфичностью к порядку a-0-гликозидной связи между остатками L-фукозы основной цепи фукоиданов и являться эндо-а-1,3- и эндо-а-1,4-Ь-фуканазами соответственно.

Среди направлений дальнейших исследований важными являются следующие: изучение роли высокоактивной a-галактозидазы в бактерии Pseudoalter omonas sp. KMM 701 и в других морских бактериях, механизма регуляции биосинтеза a-галактозидаз в морских бактериях, принадлежащих к различным таксономическим группам; выяснение особенностей структуры молекул ферментов в целом и их активных центров, определяющих такие свойства, как галотолерантность, термостабильность, а также механизм действия и субстратную специфичность морских О-гликозидгидролаз.

Итогом станет создание суперпродуцентов О-гликозидгидролаз на основе генетического материала морских бактерий и получение рекобинантных форм ферментов, представляющих большой научно-практический интерес. О-гликозидгидролазы морских бактерий найдут применение в медицине, сельском хозяйстве, структурной химии углеводов и углеводсодержащих биополимеров, а также при исследовании и трансформации антигенной структуры различных биологических объектов, в том числе клеток крови.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 3.1 Материалы

Хроматографические материалы: DEAE-Sepharose CL-6B («Pharmacia», Швеция), Toyopearl 40 HW и DEAE-Toyopearl 650 М («Toya Soda», Япония), Sepharose CL-4B и CL-6B, Sephadex G-10; G-15, G-25, G-75 («Pharmacia», Швеция), DEAE-cellulose («Reanal», Венгрия), биогель P2 («BioRed», США, ионообменная смола Ку-2 и гидрофобный сорбент Полихром I («Реахим», СССР), патрон Sep-Pak С18 («Waters Ltd», Великобритания), колонки Superóse 12 HR 10/30 и Superdex 75 HR 10/30 («Amersham Pharmacia Biotech», Германия), анионообменная смола Durrum DA-X8-11 («Durrum», США), ТСХ с Si02 60 F-254 («Merck», Германия), мембраны для ультрафильтрации РМ-10, 30 («Amicon», Голландия), и-хлормеркурибензоат («Chemapol», Чехословакия), диэтилпирокарбонат, карбодиимид, N-метилмалеимид («Sigma», США), тетранитрометан, N-бромсукцинимид, N-ацетилимидазол («Serva», Германия).

Химические реактивы: дигидрофосфат натрия NaH2P04x2H20 («Вектон»), гидроокись натрия («Лаверна»), 10%-ный водный раствор NH3 («Тамбовфармация»), (NH4)2S04, Na2C03, NaCl, НС1, ВаС12, 30%-ая Н202, («Реахим») - отечественного производства. Неорганические соли, этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и азид натрия («Sigma», США), кумасси G-250 («Диа-М», Германия), реактив Фолина Е («AppliChem», Германия), трихлоруксусная кислота («Merck», Германия).

Стандартные соединения: L-фукоза, D-глюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, D-манноза, D-рамноза, меллибиоза («Merck», Германия), раффиноза («Alemana», Германия), декстраны с молекулярными массами 80 кДа, 40 кДа, 20 кДа и 10 кДа («Feral Berlin», (Германия), 5,8-дигидрокси-1,4-нафтохинон (нафтазарин) («Fluka», Швейцария), бычий сывороточный альбумин («Sigma», США).

Гликозиды: pNPH-производные a-D-галактопиранозида, a-D-маннопиранозида, P-D-глюкопиранозида, a-L-фукопиранозида,

P-D-галактопиранозида, М-ацетил-а-Б-галактозаминида, Р-ксилопиранозида, a-D-глюкопиранозида, a-ксилопиранозида («Sigma», США);

4-метил-умбеллиферил-Р-0-ксилопиранозид («Ferak», Германия) и pNPH-N-ацетил-Р-D-глюкозаминид («Chemapol», Чехословакия).

Полисахариды: ксантан и полисахарид Locust bean gum (ЛБГ) («Fluka», Швейцария), катионное производное гидроксиэтилцеллюлозы (cat-HEC) («Hoechst»), пуллулан из Aureobasidiiim piilliilans, декстран, водорастворимый агар («Serva», Германия), амилоза, карбосиметилцеллюлоза («Sigma», США), амилопектин («Реахим», Россия), полигулуроновая кислота («The British Drug Hourses», Великобритания); фукоиданы из бурых водорослей Fucus evanescens, Laminaria cichorioides, L. japónica, а также галактофукан из бурой водоросли Undaria pinnatifida выделены и очищены, как описано ранее [505], пустулан выделен из лишайника Umbillicaria rossica [548], ламинаран выделен из бурой водоросли L. cichorioides [549], полиманнуроновая кислота выделена из бурой водоросли Alaria fistulosa [398], хитозан любезно предоставлен к.х.н. В.И. Горбачем (лаборатория молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН).

Трисахарид Galal,3(Fucal,2)Gal выделен из мочи человека, групповые вещества крови получены из слизистых оболочек желудков свиней и лошадей к.х.н. Л.М. Лихошерстовым (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН) [550, 551]. Дисахарид Gala 1,3 Gal предоставлен проф., д.х.н. А.И. Усовым (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН) (получен из Х-каррагинана).

Нативные эритроциты человека группы крови А, В, AB и О получены на Станции переливания крови Гематологического научного центра РАМН, г. Москва, и от Станции переливания крови, г. Владивосток. Стандартные групповые сыворотки -цоликлон анти-А и анти-В - приобретены у ООО «Медиклон», г. Москва, моноклональные антитела (анти-А, анти-В, анти-Н, анти-М, анти-N) - у фирмы «Гематолог» РАМН, Россия.

Ферменты: а-галактозидаза из зеленых бобов кофе («Sigma», США), ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы («Fermentas», Германия), модифицированная ДНК-полимераза бактериофага Т7 - (секвеназа, версия 2,0, «Amersham»).

Биохимические реактивы: реактивы для капиллярного ДНК секвенатора и автоматического метода Эдмана («Applied Biosystems», США), набор стандартов для определения молекулярных масс белков («Pharmacia, Fine Chemicals AB», США и «Serva», Германия); реактивы для электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), рекомбинантные белки-маркеры («Fermentas», Германия).

РеаКлот - гепарин («Ренам», Россия) антитромбин человека, фактор Ха человека, бычий тромбин («Biopool», «НПО Ренам» и «Технология стандарт», Россия, соответственно, хромогенные субстраты для тромбина S-2238 и для фактора Xa-S

1. 2222 («Dade Behring», Германия), лиофильно высушенная плазма человека (НПО

Ренам»).

3.2 Биологический материал

Водоросли. В качестве объектов исследования использовали бурую водоросль L. cichorioides (б. Троица, Японское море, август 2001 г. и 2003 г.), F. evanescens (побережье о. Парамушир, август 1997 г. и о. Итуруп, июль 1999 и август 2003 гг), Alaria fistulosa и A. marginata (побережье о. Русский и о. Онекотан, август 1999 г.) и высушенный экстракт бурой водоросли Undaria pinnatifida («Haewon Biotech, Inc.», Корея).

Бактерии. Штаммы гетеротрофных бактерий выделены из морской воды, донных осадков, животных и водорослей, собранных во время экспедиционных рейсов НИС «Академик Опарин», на Морской- экспериментальной станции ТИБ ОХ ДВО РАН в зал. Петра Великого Японского моря, и идентифицированы сотрудниками

Лаборатории микробиологии ТИБОХ ДВО РАН. Типовые штаммы получены от Dr. Т. s

Barbeyron (Station Biologique de Roscoff, France) и из Коллекции бактерий Института

Пастера (Франция) (Collection de Bacteries de l'Institute Pasteur, France).

Первичный скрининг по содержанию а-галактозидаз и a-N-ацетилгалактозаминидаз проводили среди морских изолятов, выделенных из морских источников, указанных в таблице 13.

Распространение a-галактозидаз исследовали среди морских бактерий рода Pseudoalteromonas, выделенных из морской воды; водоросли Polysiphonia sp., морской травы Zostera marina; двустворчатых моллюсков Crenomytilns grayaniis, Patinopecten jessoensis, Crassostrea gigas; губок семейства Iotochroideae: Steletta validissima, Haliclona sp., Plocamia fragilis, Chonelasma calix, Dictioceratiola sp., Grantessa sp., Holichondriapanicea, и неидентифицированных видов губок; голотурий Actinopyga mauritiana, Ciicumaria japónica, Holothiiria atra, Holothnria sp., Psolus eximns, Psoitis regalis, Stichopus horrens, Thelenota ananas; морских звезд Asterias amurensis, Ceromaster patagonicus, Crossaster papposus, Culcita novae guineae, Fronia manilis, Henricia sp., Leptasterias fisheri, Lethasterias nanimensis var. chelifera, Nordoa sp., Patina pectinifera, собранных в заливе Петра Великого на Морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН, а также во время экспедиционных рейсов НИС «Академик Опарин» в Охотском море и в тропических районах Тихого океана.

Для поиска фукоиданаз микроорганизмы выделяли из образцов тканей бурых водорослей Fucus evanescens, Chorda filum и голотурии Apostichopus japonicus.

Штаммы морских бактерий семейства Flavobacteriaceae изолировали с поверхности талломов зеленых водорослей Acrosiphonia sonderi и Ulva fenistrata, бурых водорослей Chorda filum и Laminaria japónica, красной водоросли Polysiphonia japónica, гомогенатов морского ежа Strongylocentrotus intermedins и голотурии

Apostichopus japonicus, собранных в бухте Троицы залива Петра Великого Японского т моря в 1999-2002 гг. Типовые штаммы Zobellia galactanivorans Dsij и Zobellia uliginosa CIP 104808т получены от Dr. T. Barbeyron (Station Biologique de Roscoff, France) и из Коллекции бактерий Института Пастера (Collection de Bacteries de lTnstitute Pasteur, France) соответственно.

Клетки эпителия взяты из полости рта человека (группа крови В); токсикогенный штамм № 1129 Corynebacterium diphtheriae, var. gravis выделен от больного дифтерией.

Штаммы Escherichia coli. В работе использовали штаммы XLBlue, Тор 10 производства фирмы «Novagen» для стандартных процедур молекулярного клонирования и размножения рекомбинантных плазмид. Для экспрессии рекомбинантного белка использовали штамм BL21 (DE+).

Бактериальные среды для молекулярной биологии. Для культивирования клеток Е. coli использовали питательную среду LB (на г/л): триптон — 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10. Для получения твёрдой среды добавляли бактоагар в количестве 15 г/л. Для ампициллиновой селекции в питательную среду вносили ампициллин до 100 мкг/мл. Для проведения селекции на lacZ в среду LB вносили 2 %-ный раствор 5-бром-4-хлор-3-индол-Р-Б-галактопиранозида (X-Gal) в диметилформамиде до конечной концентрации 0,004 % и 100 тМ изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 1 тМ.

Компоненты среды для культивирования бактерий: агар («Ferak», Германия); дрожжевой экстракт, глюкоза, агароза («BioRad», США), морской агар

2216, бактопептон, дрожжевой экстракт и морской бульон были получены («Difco», США).

3.3 Приборы и оборудование

В работе использовали ультразвуковой диспергатор УЗНД-2 (СССР), циркуляционный термостат с охлаждением MULTITEMP II («LKB», Швеция), аминокислотный анализатор D-500 («Durum», США) и Pharmacia-LKB 4151 («Alpha Plus», Швеция), углеводные анализаторы Biotronik LC-2000 и IC-5001 («Biotronik», Германия), интегрирующая система C-R2 АХ («Shimadzu», Япония), секвенаторы модели 477А и Procise -модели 492 («Applied Biosystems», США), ДНК-секвенатор версии 2,0 («Amersham», США), спектрофотометры CECIL СЕ 7250 (Англия), GENESYS 5 («Spectronic», Германия), спектрофотометр Bio-EK INSTRUMENTS (США), КД спектрограф («Jasco-500A», Япония), спектрополяриметр («Perckin-Elmer 141», Германия), спектрофлуориметр («Hitachi 850», Япония), ИК-спектрофотометры («Carl Zeiss IR-7» и FTIR Vector 22, «Bruker», Германия), ЯМР-спектрометры «Bruker WM-250» и AVANCE DPX-300 и DRX-500 («Bruker», Германия), рН-метр («InoLab», ФРГ), амплификатор («Eppendorf», Германия), капиллярный ДНК-секвенатор («ABI, PRISM™ 310», США), центрифуги К-24, 5804 К («Eppendorf», ротор F-34-6-38, Германия), 2161 Midispin R («LKB Bromma», Швеция) и («Тур 340», Польша), систему

FPLC («Acta», Франция), жидкостной хроматограф' JLC-6AH («Jeol», Япония), хромато-масс-спектрометр Carlo Erba Fractovap 4200 (капиллярная колонка Ultra-1 «Hewlett-Packard» 25 мх0,2 ммх0,33 мкм), патрон Sep-Pak Cl8 («Waters Ltd», Англия), планшеты для иммуноферментного анализа («Dinatech», ФРГ), световой микроскоп («Motic 101 M», Китай).

3.4 Аналитические процедуры» Стандартную гидролитическую активность гликаназ определяли по появлению восстанавливающих Сахаров, образующихся в результате ферментативного гидролиза соответствующих полисахаридов. За единицу активности (U) принимали количество фермента, при действии которого образуется 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров за 1 мин. Концентрацию восстанавливающих Сахаров определяли по методу Нельсона [552], калиброванному по соответствующему моносахариду как стандарту.

Стандартную гидролитическую активность гликозидаз определяли с помощью соответствующих коммерческих хромогенных гликозидов, по я-нитрофенолу, выделившемуся в ходе ферментативной реакции. Количество и-нитрофенола определяли спектрофотометрически при 400 нм (е = 18300 моль"1 см'1) и рассчитывали по формуле: U = А4оо/(18,3-У--с), мкмоль/(мин-мл), где V - объём аликвоты фермента (мл), т - время реакции (мин). За единицу активности фермента (U) принимали такое его количество в 1 мл раствора, которое катализировало образование 1 мкмоля и-нитрофенола в минуту.

Удельную (специфическую) активность ферментов рассчитывали как отношение стандартных единиц активности на мг белка (U/мг).

Концентрацию белка определяли по стандартным методам Лоури [553] или Брэдфорд [554], используя БСА в качестве стандарта.

3.5 Методы

3.5.1 Выделение, культивирование и хранение штаммов морских бактерий

Для первичного скрининга штаммов образцы морской воды собирали асептическим способом в стерильные стеклянные флаконы, пробы грунта помещали в стерильные пластиковые пакеты, обработанные у-лучами. Животных препарировали асептическим способом. От 3 до 5 г образцов ткани разрушали в' 10-1'5 мл стерильной1 морской воды в стеклянном гомогенизаторе. Микроорганизмы выделяли методом прямого высева образца воды, суспензии грунта в стерильной морской воде (1 г/10 мл) или гомогената тканей животных, который наносили по 0,10,2 мл на чашки Петри с питательной средой А (табл. 50), содержащей морской агар. Гетеротрофные аэробные и факультативно-аэробные микроорганизмы, выделенные из единичных колоний после инкубации в течение 3-7 суток при 28-30°С, очищали методом последовательных пересевов.

Выделение штамма КММ 426. Образцы грунта собирали с глубины 20 м (соленость 32%о, температура 18°С) в Южно-Китайском море, около острова Ky-JIaoPe в декабре 1988 г. Бактериальный штамм КММ 426т выделяли из образцов грунта, как описано выше, с использованием агаризованной среды Б.

Выделение штамма КММ 701. Штамм КММ 701 выделяли из морской воды методом прямого высева на агаризованную среду В, как описано выше.

Выделение штаммов КММ 3296, 3297 и 3298. Штамм КММ 3296 и 3298 выделяли методом отпечатков с поверхности талломов бурых водорослей Chorda filum и Fucus evanescens соответственно (водоросли были собраны у о. Итуруп (Курильские о-ва) во время 20-го рейса НИС «Академик Опарин» в августе 1992 г). Штамм КММ 3297 выделяли в ноябре 1997 г из целомической жидкости голотурии Apostichopus japonicus, обитающей в бухте Троица залива Петра Великого Японского моря. Штаммы были изолированы из отдельных колоний после 7 дней инкубации при 28°С на агаризованной среде Г (табл. 50).

1. Воусе S., Tipton K.F. Enzyme Classification and Nomenclature // Encyclopedia of life sciences. 2001. Nature Publishing Group / www.els.net.

2. Хорлин А.Я. Активные центры карбогидраз // Структура и функции активных центров ферментов / Отв. ред. Ю.М. Торчинский. — М. : Наука, 1974. — С. 39-69.

3. Koshland D.E.J. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions // Biol. Rev. Camb. Phil. Soc. 1953. - Vol. 28, N 4. - P. 416-436.

4. McCarter J., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis // Curr. Opin. Struct. Biol. 1994. - Vol. 4, N 6. - P. 885-892.

5. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases // Structure. 1995. - Vol 3, N 9. - P. 853-859.

6. Sinnott M.L. Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer // Chem. Rev. -1990. Vol. 90, N 7. - P. 1171-1202.

7. Wang Q., Graham R.W., Trimbur D., Warren R.A.J., Withers S.G. Changing enzymatic reaction mechanisms by mutagenesis: conversion of a retaining glucosidase to an inverting enzyme // J. Am. Chem. Soc. 1994. - Vol. 116, N 25. - P. 11594-11595.

8. Henrissat B. A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities //Biochem. J. 1991. - Vol. 280, Pt2. - P. 309-316.

9. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. - Vol. 293, Pt 3. - P. 781788.

10. Cantarel B.L., Coutinho P.M., Rancurel C., Bernard Т., Lombard V., Henrissat B. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): An expert resource for Glycogenomics // Nucleic Acids Res. 2009. - Vol. 37, Database issue. - D233-D238.

11. Henrissat В., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Biochem. J. 1996. - Vol. 316, Pt 2. - P. 695-696.

12. Henrissat В., Davies G. Structural and sequence-based classification of glycoside hydrolases // Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. - Vol. 7, N 5. - P. 637-644.

13. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K.C., Jones T.A. Three-dimensional' structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei II Science. 1990. - Vol. 249, N 4967.-P. 380-386.

14. Zechel D.L., Withers S.G. Glycosidase mechanisms: Anatomy of a finely tuned catalyst//Acc. Chem. Res.-2000.-Vol. 33, N l.-P. 11-18.

15. Vasella A., Davies G.J., Böhm M. Glycosidase mechanisms // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - Vol. 6, N 5. - P. 619-629.

16. Rye C.S., Withers S.G. Glycosidase mechanisms // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. -Vol. 4, N5.-P. 573-580.

17. Vuong T.V., Wilson D.B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity // Biotechnol. Bioeng. 2010. - Vol. 107, N 2. - P. 195-205.

18. Egloff M.P., Uppenberg J., Haalck L., van Tilbeurgh H. Crystal structure of maltose phosphorylase from Lactobacillus brevis: Unexpected evolutionary relationship with glucoamylases // Structure. 2001. - Vol. 9, N 8. - P. 689-697.

19. Dey P.M. Biochemistry of a-galactosidic linkages in the plant kingdom // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1980. - Vol. 37. - P. 283-372.

20. Dey P.M., Pridham J.B. Biochemistry of a-galactosidases // Adv. Enzymol. 1972. -Vol. 36.-P. 91-130.

21. Barham D., Dey P.M., Griffith D., Pridham J.B. Studies on the distribution of a-galactosidase in seeds // Phytochemistry. 1971. - Vol. 10, N 8. - P. 1759-1763.

22. Sugawara S., Nakagawa R., Urashima T., Sato T., Muratubaki T., Sayama K. Transgalactosylation products from melibose by the a-galactosidase of Absidia corymbifera II Agric. Biol. Chem. 1990. - Vol. 54, N 1. - P. 211-213.

23. Bryant R.J., Rao D.R. Purification and characterization of a-galactosidase from peanuts // J. Food Biochem. 2001. - Vol. 25, N 2. - P. 139-156.

24. Dey P.M., Dixon M. Separation and properties of a-galactosidase and P-galactosidase from Cajanus indicus II Biochim. Biophys. Acta. 1974. - Vol. 370, N 1. — P. 269-275.

25. Bhaskar B., Ramachandra G., Virupaksha T.K. a-Galactosidase of germinating-seeds of Cassia-sericea sw // J. Food Biochem. 1990. - Vol. 14, N 1. - P. 45-59.

26. Balasubramaniam K., Mathew D. Purification of a-galactosidase from coconut // Phytochemistry. 1986. - Vol. 25, N 8. -P. 1817-1821.

27. Haibach F., Hata J., Mitra M:, Dhar M., Harmata M., Sun P., Smith D. Purification and characterization of a Coffea canephora a-D-galactosidase isozyme // Biochem. Biophys. Res. Commun.-1991.-Vol. 181, N3.-P. 1564-1571.

28. Chien S.F., Lin-Chu M. The conversion of group B red blood cells into group O by an a-galactosidase from taro (Colocacia esculenta) II Carbohydr. Res. 1991. - Vol. 217. - P. 191-200.

29. Overbeeke N., Fellinger A .J., Toonen M.Y, van Wassenaar D, Verrips C.T. Cloning and nucleotide sequence of the a-galactosidase cDNA from Cyamopsis tetragonoloba (guar) // Plant. Mol. Biol. 1989. - Vol. 13, N 5. - P. 541-550.

30. Thomas B., Webb J.A. Multiple forms of a-galactosidase in mature leaves of Cucurbitapepo II Phytochemistry. 1977. - Vol. 16, N 2. - P. 203-206.

31. Gao Z., Schaffer A.A. A novel alkaline a-galactosidase from melon fruit with a substrate preference for raffinose // Plant Physiol. 1999. - Vol. 119, N 3. - P. 979-987.

32. Guimaraes V.M., de Rezende S.T., Moreira M.A., de Barros E.G., Felix C.R. Characterization of a-galactosidases from germinating soybean seed and their use for hydrolysis of oligosaccharides // Phytochemistry. 2001. - Vol. 58, N 1. - P. 67-73.

33. Kim W.D., Kaneko S., Park G.G., Tanaka H., Kusakabe I., Kobayashi H., Purification and characterization of a-galactosidase from sunflower seeds // Biotechnol. Lett. -2003. Vol. 25, N 4. - P. 353-358.

34. Dey P.M., Wallenfels K. Isolation and characterization of a-galactosidase from Lens esculanta II Eur. J. Biochem. 1974.-Vol. 50, N l.-P. 106-112.

35. Dey P.M., Delcampillo E.M., Lezica R.P. Characterization of a glycoprotein a-galactosidase from lentil seeds (Lens culinaris) II J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258, N 2. - P. 923-929.

36. Feurtado J.A., Banik M., Bewley J.D. The cloning and characterization of a-galactosidase present during and following germination of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) seed // J. Exp. Bot. 2001. - Vol. 52, N 359. - P. 1239-1249.

37. Kim W.D., Kobayashi O., Kaneko S., Sakakibara Y., Park G.G., Kusakabe I., Tanaka H., Kobayashi H. a-Galactosidase from cultured rice (Oryza sativa L: var. Nipponbare) cells//Phytochemistry.-2002.-Vol. 61,N6.-P. 621-630.

38. Agrawal K.M.L., Bahl O.M. a-Galactosidase, (3-galactosidase, p-glucosidase, P-N-acetylglucosaminidase, and a-mannosidase from pinto beans (Phaseolus vulgaris) // Methods Enzymol. 1972. - Vol. 28, Pt B. - P. 720-728.

39. Dhar M., Mitra M., Hata J., Butnariu O., Smith D. Purification and characterization of Phaseolus vulgaris a-D-galactosidase isozymes // Biochem. Mol. Biol. Int. 1994. - Vol. 34, N5.-P. 1055-1062.

40. Chinen I., Nakamura T., Fukuda N. Purification and properties of a-galactosidase from immature stalks of Saccharum officinarum (sugar cane) // J. Biochem. 1981. - Vol. 90, N5.-P. 1453-1461.

41. Falco A.L.P., Durrant L.R., Franco T.T. Purification of a-galactosidase from seeds of Sesbania marginata II Braz. J. Chem. Eng. 2000. - Vol. 17, N 4-7. - P. 819-825.

42. Malhotra O.P, Dey P.M. Purification and physical properties of sweet-almond a-galactosidase // Biochem. J. 1967. - Vol. 103, N 2. - P. 508-513.

43. Malhotra P., Dey P.M. Specificity of sweet-almond a-galactosidase // Biochem. J. -1967.-Vol. 103, N3.-P. 739-743.

44. Williams J., Villarroya H., Petek F. Purification and properties of an a-D-galactoside galactohydrolase from the seeds ofTrifolium repens (white clover) // Biochem. J. -1977.-Vol. 161,N3.-P. 509-515.

45. Bom I., van Wassenaar D., Boot J. Hybrid affinity chromatography of a-galactosidase from Verbascum thapsus L // J. Chromatography A. 1998. - Vol. 808, N 1-2. -P.133-139.

46. Dey P.M., Khaleque A, Pridham J.B. Further observations on the a-galactosidase activity of Viciafaba seeds // Biochem. J. 1971. - Vol. 124, N 2. - P. 27P.

47. Petek F., Villaroya H., Courtois J.E. Purification and properties of the a-galactosidase of the germinating seeds of Vicia sativa II Eur. J. Biochem. 1969. - Vol. 8, N 3.-P. 395-402.

48. Dey P.M. Characteristic features of an a-galactosidase from mung beans (Vigna radiatd) II Eur. J. Biochem. 1984. - Vol. 140, N 2. - P. 385-390.

49. Alani S.R., Smith D.M., Markakis P. a-Galactosidase of Vigna unguiculata II Phytochemistry. 1989. - Vol. 28, N 8. - P. 2047-2051.

50. Kang H.C., Lee S.H. Characteristics of an a-galactosidase associated with grape flesh II Phytochemistry. 2001. - Vol. 58, N 2. - P. 213-219.

51. Hadacova V., Benes K. The differentiation of a- and P-glucosidase and a- and p-galactosidase isoenzymes from Maize and Broad Bean root tips using disc electrophoresis in polyacrylamide gels // Biol. Plant. 1977. - Vol. 19, N 6. - P. 436-442.

52. McCleary B.V., Matheson N.K. Galactomannan structure and P-mannanase and P-mannosidase activity in germinating legume seeds // Phytochemistry. 1975. - Vol. 14, N 5-6.-P. 1187-1194.

53. Plant A.R., Moore K.G. a-D-mannosidase and a-D-galactosidase from protein bodies of Lupinus angustifolius cotyledons // Phytochemistry. 1982. — Vol. 21, N 5. P. — 985-989.

54. Dey P.M. Transgalactosylation activity of sweet almond a-galactosidase: synthesis of saccharides// Phytochemistry. 1979. -Vol. 18, N l.-P. 35-38.

55. Strobel G.A., Hess W.M. Evidence for the presence of the toxin binding protein on the plasma membrane of sugarcane cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1974. - Vol. 71, N 4.-P. 1413-1417.

56. Sastry P.S., Kates M. Lipid components of leaves V. Galactolipids, cerebrosides,and lecithin of runner beans leaves // Biochemistry. 1964. - Vol. 3, N 9. - P. 1271-1280.

57. Beutler E., Kuhl W. Purification and properties of human a-galactosidases // J. Biol. Chem. 1972. - Vol. 247, N 22. - P. 7195-7200.

58. Dean K.J., Sweeley C.C. Studies on human liver a-galactosidases. III. Partial characterization of carbohydrate-binding specificities // J. Biol. Chem. — 1979. Vol. 254, N 20.-P. 10006-10010.

59. Dean K.J., Sweeley C.C. Studies on human liver a-galactosidases. I. Purification of a-galactosidases A and its enzymatic properties with glycolipid and oligosaccharide substrates // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254, N 20. - P. 9994-10000.

60. Kusiak J.W., Quirk J.M., Brady R.O. Purification and properties of the two major isozymes of a-galactosidase from human placenta // J. Biol. Chem. 1978. - Vol. 253, N 1. -P. 184-190.

61. Bajwa S.S., Sastry P.S. Degradation of monogalactosyl diglyceride and digalactosyl diglyceride by sheep pancreatic enzymes // Biochem. J. 1974. - Vol. 144, N 2. - P. 177-187.

62. Chang A.Y. Difference in renal a-galactosidase levels in male and female Chinese hamsters {Cricetulus griseus) // Comp. Biochem. Physiol. B. 1978. - Vol. 61, N 7. - P. 133137.

63. Chapman V.M., West J.D., Adler D.A. Bimodal distribution of a-galactosidase activities in mouse embryos // Basic Life Sci. 1978. - Vol. 12. - P. 227-237.

64. Lusis A.J., Paigen К. Properties of mouse a-galactosidase // Biochem. Biophis. Acta. 1976. - Vol. 437, N 2. - P. 487-497.

65. Gossrau R., Lojda Z. Histochemical detection of a-D-galactosidase with 5-Br-4-Cl-3 -indoxy 1-a-D-galactoside // Acta Histchem. 1989. - Vol. 85, N 2. - P. 213-222.

66. Bierry H. Diastatic cleavage of glucosides and galactosides // Compt. Rend. Soc. Biol. 1913. - Vol. 156. - P. 265. Цитируется no 33.

67. Shepard D., Donovan M., Raghupathy E., Yeung K.K., Owen A.J., Dain J.A. Effect of immobilization on the stability and substrate specificity of a-galactosidase from the invertebrate Turbo cornutus // Carbohydr. Res. 1983. - Vol. 118. -P. 239-245.

68. Grossmann G.A., Terra W.R. a-Galactosidases from the larval midgut of Tenebrio molitor (Coleoptera) and Spodoptera frugiperda (Lepidoptera) // Сотр. Biochem. Physiol. — 2001. В.-Vol. 128,N 1.-P. 109-122.

69. Feldt-Rasmussen U., Rasmussen A.K., Mersebach H., Rosenberg K.M., Hasholt L., Sorensen S.A. Fabry disease: a metabolic disorder with a challenge for endocrinologists? // Horm. Res. 2002. - Vol. 58, N 6. - P. 259-265.

70. Germain D.P., Shabbeer J., Cotigny S., Desnick R. J. Fabry disease: twenty novel a-galactosidase A mutations and genotype-phenotype correlations in classical and variant phenotypes // Mol. Med. 2002. - Vol. 8, N 6. - P. 306-312.

71. Улезло И.В., Запрометова O.M. а-Галактозидазы микроорганизмов // Прикл. биохим. микробиол. 1982. - Т. 18, № 1. - С. 3-15.

72. Zaprometova О.М., Ulezlo I.V. Isolation and purification of a mold a-galactosidase II Biotechnol. Appl. Biochem. 1988. - Vol. 10, N 3. - P. 232-241.

73. Kremnicky L., Biely P. P-Mannanolytic system of Aureobasidium pullulans II Arch. Microbiol. 1997. - Vol. 165, N 6. - P. 350-355.

74. Cavazzoni V., Adami A., Craveri R. a-Galactosidase from the yeast Candida javanica II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1987. - Vol. 26, N 6. - P. 555-559.

75. Church F.C.J., Meyers S.P. a-Galactosidase from Pichia giulliermondii II Mycologia. 1980. - Vol. 72, N 2. - P. 279-287.

76. Lazo P.S., Ochoa A.G., Gascon S. a-Galactosidase from Saccharomyces carlsbergensis. Cellular localization and purification of the external enzyme // Eur. J. Biochem. 1977. - Vol. 77, N 2. - P. 375-382.

77. Baik S.H., Saito K., Yokota A., Asano K., Tomita F. Molecular cloning and highlevel expression in Escherichia coli of fungal a-galactosidase from Absidia corymbifera IFO 8084 // J. Biosci. Bioeng. 2000. - Vol. 90, N 2. - P. 168-173.

78. Неустроев К.А., Крылов A.C., Аброскина О.Н., Фирсов JIM., Насонов В.В., Хорлин А.Я. Выделение и свойства а-галактозидазы из Aspergillus awamori II Биохимия. 1991. - Т. 56, № 3. - С. 447-457.

79. Somiari R.I., Balogh Е. Properties of an extracellular glycosidase of Aspergillus niger suitable for removal of oligo-saccharides from cowpea meal // Enz. Microb. Technol. -1995.- Vol. 17,N4.-P. 311-316.

80. Ademark P., Larsson M., Tjerneld F., Stalbrand H. Multiple a-galactosidases from Aspergillus niger: Purification, characterization and substrate specificity // Enz. Microb. Technol. -2001. Vol. 29, N 6-7. - P. 441-448.

81. Manzanares P., de Graaff L.H., Visser J. Characterization of galactosidases from Aspergillus niger. purification of a novel a-galactosidase activity // Enz. Microb. Technol. -1998. Vol. 22, N 5. - P. 383-390.

82. Scigelova M., Crout D.H.G. Purification of a-galactosidase from Aspergillus niger for application in the synthesis of complex oligosaccharides // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. -2000.-Vol. 8,N4-6.-P. 175-181.

83. Запрометова O.M., Абдыгаппаров A.C., Улезло И.В., Безбородов A.M. Выделение и некоторые свойства а-галактозидазы и ß-N-ацетилглюкозаминидазы микромицета Cephalosporium acremonium 237 II Биохимия. — 1983. Т. 50, N 6. — С. 949954.

84. Kaji A., Yoshihara О. Purification and properties of a-galactosidase produced by Corticium rolfsii II Agric. Biol. Chem. 1972. - Vol. 36, N 8. - P. 1335-1342.

85. Mulimani V.Ii., Ramlingam. Enzymic hyrolysis of rafflnose and stachyose in soymilk by a-galactosidase from Gibberella fujikuroi II Biochem. Mol. Biol. Intl. 1995. -Vol. 36, N4. -P. 897-905.

86. Kotwal S.M., Gote M.M., Khan M.I., Khire J.M. Production, purification and characterization of constitutive intracellular a-galactosidase from« the thermophilic fungus Humicola sp. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 23, N 1. - P. 661-667.

87. Wong H., Hu C., Yeh PI., Su W., Lu H., Lin C. Production, purification and characterization of a-galactosidase from Monascus pilosus II Appl. Environ. Microbiol. -1986. Vol. 52, N 5. - P. 1147-1152.

88. Galas E., Miszkiewicz H. Purification and some properties of a-galactosidase from Mortierella vinacea IBT-3 // Acta Microbiol. Pol. 1996. - Vol. 45, N 2. - P. 143-154.

89. Luonteri E., Alatalo E., Siika-Aho M., Penttila M., Tenkanen M., a-Galactosidases of Penicillium simplicissimum: production, purification and characterization of the gene encoding AGLIII Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. - Vol. 28, Pt 2. - P. 179-188.

90. Luonteri E., Tenkanen M., Viikari L. Substrate specificities of Penicillium simplicissimum a-galactosidases // Enz. Microb. Technol. 1998. - Vol. 22, N 3. - P. 192198.

91. Varbanets L.D., Malanchuka V.M., Buglova T.T., Kuhlmann R.A. Penicillium sp. 23 a-galactosidase: purification and substrate specificity // Carbohydr. Polym. — 2001. Vol. 44, N4.-P. 357-363.

92. Brumer H., Sims P.F.G., Sinnott M.L. Lignocellulose- degradation by Phanerochaete chrysosporium: purification and characterization of the main a-galactosidase // Biochem. J. 1999. - Vol. 339, Pt 1. - P. 43-53.

93. Ohtakara A., Mitsutomi M., Uchida Y. Purification and enzymatic properties of a-galactosidase from Pycnoporus cinnabarinus II Agr. Bio. Chem. 1984. - Vol. 48, N 5. - P. 1319-1327.

94. McKay A.M. Production of extracelluar P-glucosidase and a-galactosidase during fungal growth on polygalacturonate// J. Food Sci. 1991.-Vol. 56, N6.-P. 1749-1750.

95. Zeilinger S., Kristufek D., Arisan-Atac I., Hodits R., Kubicek C.P. Conditions of formation, purification and characterization of an a-galactosidase of Trichoderma reesei RUT C-30 //Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59, N 5. - P. 1347-1353.

96. Savel'ev A.N., Ibatullin F.M., Eneyskaya E.V., Kachurin A.M., Neustroev K.N. Enzymatic properties of a-galactosidase from Trichoderma reesei II Carbohydr. Res. — 1996. -Vol. 296.-P. 261-273.

97. Simerska P., Monti D., Cechova I., Pelantova H., Mackova M., Bezouska K., Riva S., Ksen V. Induction and characterization of an unusual a-D-galactosidase from Talaromyces flavusII J. Biotechnol.-2007.-Vol. 128,N l.-P. 61-71.

98. Puchart V., Vrsanska M., Bhat M.K., Biely P. Purifcation and characterization of a-galactosidase from a thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus II Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1524, N 1. - P. 27-37.

99. Rezessy-Szabo J.M., Nguyen Q.D., Bujna E., Takacs K., Kovacs M., Hoschke A. Thermomyces lanuginosus CBS 395.62/b strain as rich source of a-galactosidase enzyme // Food Technol. Biotechnol.-2003.-Vol. 41, N l.-P. 55-59.

100. Hogness D.S., Battley E.H. The a-galactosidase of Aerobacter aerogenes, its characteristics and induce synthesis // Fed. Proc. 1957. - Vol. 16, N 2. - P. 197-198.

101. Wong T.Y. Melibiose is hydrolyzed exocellularly by an inducible exo-a-galactosidase in Azotobacter vinelandii II Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 56, N 7. — P. 2271-2273.

102. Delente J., Johnson J.H., Kuo M.J., O'Connor R.J., Weeks L.E. Production of a new thermostable neutral a-galactosidase from a strain of Bacillus stearothermophilus II Biotechnol. Bioeng. 1974. - Vol. 16,N 9. -P. 1227-1243.

103. Talbot G., Sygusch J. Purification and characterization of thermostable f3-mannanase and a-galactosidase from Bacillus stearothermophilns II Appl. Environ. Microbiol. 1990.-Vol. 56, N 11. - P. 3505-3510.

104. Dion M., Nisole A., Spangenberg P., Andrer C., Glottin-Fleury A., Mattes R., Tellier C., Rabiller C. Modulation of the regioselectivity of a Bacillus a-galactosidase by directed evolution //Glycoconj. J. -2001. Vol. 18, N3.-P. 215-223.

105. Fridjonsson O., Watzlawick H., Gehweiler A., Mattes R. Thermostable a-galactosidase from Bacillus stearothermophilns NUB3621: cloning, sequencing and characterization // FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 176, N 1. -P. 147-153.

106. Gote M., Umalkar H., Khan I., Khire J. Thermostable a-galactosidase from Bacillus stearothermophilns (NCIM 5146) and its application in the removal of flatulence causing factors from soymilk // Process Biochem. 2004. - Vol. 39, N 11. - P. 1723-1729.

107. Gherardini F., Babcock M., Salyers A.A. Purification and characterization of two a-galactosidases associated with catabolism of guar gum and other a-galactosides by Bacteroides ovatus II J. Bacteriol. 1985. - Vol. 161, N 2. - P. 500-506.

108. Berg J.O., Lindqvist L., Nord C.E. Purification of glycoside hydrolases from Bacteroides fragilis II Appl. Environ. Microbiol. 1980. - Vol. 40, N 1. - P. 40-47.

109. Okuyama M., Kitamura M., Flondoh H., Kang M.-S., Mori H., Kimura A., Tanaka I., Yao M. Catalytic mechanism of retaining a-galactosidase belonging to glycoside hydrolase family 97II J. Mol. Biol. 2009. - Vol. 392, N 5. - P. 1232-1241.

110. Leder S., Hartmeier W., Marx S.P. a-Galactosidase of Bifidobacterium adolescentis DSM 20083 II Curr. Microbiol. 1999. - Vol. 38, N 2. - P. 101-106.

111. Xiao M., Tanaka K., Qian X.M., Yamamoto K., Kumagai H. High yield production and characterization of a-galactosidase from Bifidobacterium breve grown on raffinose // Biotechnol. Lett. 2000. - Vol. 22, N 9. - P. 747-751.

112. Coombs J., Brenchley J.E. Characterization of two new glycosyl hydrolases from the lactic acid bacterium Carnobacterium piscícola strain BA // Appl. Environ. Microbiol. — 2001. Vol. 67, N 11. - P. 5094-5099.

113. Durance T., Skura B. Purification and characterization of a Clostridium perfringens a-galactosidase // J. Food Sci. 1985. - Vol. 50, N 2. - P. 518-522.

114. Kimura S.T., Sakka K., Ohmiya K. Cloning, sequencing, and expression of the gene encoding the Clostridium stercorarium a-galactosidase Aga36A in Escherichia coli II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2003. - Vol. 67, N 10. - P. 2160-2166.

115. Li Y.T., Li S.C., Shetlar M.R. a-Galactosidase from Diplococcus pneumoniae II Arch. Biochem. Biophys. 1963. - Vol. 103, N 3. - P. 436-442.

116. Sheinin R., Crocker B.F. The induced concurrent formation of a-galactosidase and ß-galactosidase in E. coli B1 // Can. J. Biochem. Physiol. 1961. - Vol. 39, N 1. - P. 63-71.

117. Schmid K., Schmitt R. Raffinose metabolism in Escherichia coli K 12. Purification and properties of a new a-galactosidase specified by a transmissible plasmid // Eur. J. Biochem. 1976. - Vol. 67, N 1. - P. 95-104.

118. Garro M.S., de Valdez G.F., Oliver G., de Giori G.S. Purification of a-galactosidase from Lactobacillus fermentum U J. Biotechnol. 1996. - Vol. 45, N 2. - P. 103109.

119. Garro M.S., de Valdez G.F., Oliver G., de Giori G.S. Influence of carbohydrates on the a-galactosidase activity of Lactobacillus fermenti II Curr. Microbiol. 1996. - Vol. 33, N5.-P. 302-305.

120. Schuler R. Kinetic properties of a-galactosidase from Lactobacillus fermenti II Enz. Microbial Technol. 1985. - Vol. 7, N 5. - P. 207-211.

121. Mital B.K., Shallenberger R.S., Steinkraus K.H. a-Galactosidase activity of Lactobacilli II Appl. Microbiol. 1973. - Vol. 26, N 5. - P. 783-788.

122. Akiba T., Horikoshi K. Localization of a-galactosidase in an alkalophilic strain of Micrococcus II Agric. Biol. Chem. 1978. - Vol. 42, N 11. - P. 2091-2094.

123. Hashimoto H., Goto M., Katayama C., Kitahata S. Purification and some properties of a-galactosidase from Pseudomonas fluorescens H-601 // Agric. Biol. Chem. — 1991. Vol. 55, N 11. - P. 2831-2838.

124. Blucher A., Karlsson E.N., Hoist O. Substrate-dependent production and some properties of a thermostable a-galactosidase from Rhodothermns marinus II Biotechnol. Lett. -2000. Vol. 22, N 8. - P. 663-669.

125. Post D.A., Luebke V.E. Purification, cloning, and properties of a-galactosidase from Saccharopolyspora erythraea and its use as a reporter system // Appl. Microbiol. Biotechnol.-2005. Vol. 67,N 1.-P. 91-96.

126. Bailey R.W. The intracellular alpha-galactosidase of a rumen strain Streptococcus bovis. Part-IV. Characteristics of a-galactosidase and estimation of raffinose by the enzyme preparation // Biochem. J. 1963: - Vol. 86, Pt: 3. - P: 509-514.

127. King M.R., Yernool D.A., Eveleigh D.E., Chassy B.M. Thermostable a-galactosidase from Thermotoga neapolitana: cloning, sequencing and expression // FEMS Microbiol; Lett. 1998. - Vol. 163, N l.-P. 37-42.

128. King M.R., White B.A., Blaschek H.P., Chassy B.M., Mackie, Cann I.K.O. Purification and characterization of a thermostable a-galactosidase from Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum II J. Agric. Food Chem. 2002. - Vol. 50, N 20.-P. 5676-5682.

129. Fridjonsson O., Watzlawick H., Gehweiler A., Rohrhirsch T., Mattes R. Cloning of the gene encoding a novel thermostable a-galactosidase from Thermus brockianus ITI360 // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, N 9. - P. 3955-3963.

130. Brouns S.J.J., Smits N., Wu H., Snijders A.P.L., Wright P.C., de Vos W.M., van der Oost J. Identification of a novel a-galactosidase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus II J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188, N 7. - P. 2392-2399.

131. Pat. US 5958751. Int. CI. CN12 15/09. Alpha-galactosidase / Murphy D., Reid J.; Assignees: Diversa Corporation, San Diego, CA 08/613220; Priority date: Mar. 08. 1996; Filed: Sep. 28. 1999.-6 p.

132. Clausen H., Hakomori S.-i. ABH and related histo-blood group antigens; immunochemical differences in carrier isotypes and their distribution // Vox Sang. 1989. -Vol. 56, N 1. — P. 1-20.

133. Wu A.M., Wu J.H., Chen Y.Y., Tsai M.S., Неф A. Forssman pentasaccharide and polyvalent Gaipi—>4GlcNAc as major ligands with affinity for Caragana arborescens agglutinin // FEBS Lett. 1999. - Vol. 463, N 3. - P. 223-230.

134. Nakajima H., Kurosaka A., Fujisawa A., Kawasaki Т., Matsuyana M., Nagayo Т., Yamashina I. Isolation and characterization of a glycoprotein from a human rectal adenocarcinoma // J. Biochem. (Tokyo). 1983. - Vol. 93, N 2. - P. 651-659.

135. Wu A.M. Carbohydrate structural units in glycosphingolipids as receptors for Gal and GalNAc reactive lectins // Neurochem. Res. 2002. - Vol. 27, N 7-8. - P. 593-600.

136. Yamamoto F., Clausen FI., White Т., Marken J., Hakomori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system // Nature. 1990. - Vol. 345, N 6272. - P. 229233.

137. Haslam D.B., Baenziger J.U. Expression cloning of Forssman glycolipid synthetase: A novel member of the histo-blood group ABO gene family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - Vol. 93, N 20. - P. 10697-10702.

138. Hagen F.K., Van Wuyckhuyse В., Tabak L.A. Purification, cloning, and expression of a bovine UDP-CalNAc-polypeptide-N-acetyl-galactosaminyltransferase // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268, N 25. - P. 18960-18965.

139. White Т., Bennett E.P., Takio K., Sorensen Т., Bonding* N., Clausen H. Purification and cDNA cloning of a human UDP-N-acetyl-a-D-galactosamin:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270, N41. - P.' 24156-24165.

140. Callahan- J.W., Lassila EX., Den Tandt W., Philippart M. a-N-Acetylgalactosaminidase: isolation, properties and distribution of the human enzyme // Biochem. Med. 1973. - Vol. 7. N 3. - P. 424-431.

141. Sweeley C.C., Ledonne N.C., Robbins P.W. Post-translational processing reactions involved in the biosynthesis of lysosomal a-N-acetylgalactosaminidase in cultured human fibroblasts //Arch. Biochem. Biophys. 1983. - Vol. 223, N 1. -P. 158-165.

142. Den Tandt W.R., Scharp S. Micromethod for the fluorimetric determination of plasma N-acetyl-a-galactosaminidase and study of some of its characteristics // Enzyme and Protein. 1996. - Vol. 49, N 5-6. - P. 273-280.

143. Salvayre R., Maret A., Negre A., Douste-Blazy L. Properties of multiple molecular forms of a-galactosidase and a-N-acetylgalactosaminidase from normal and Fabry leukocytes // Eur. J. Biochem. 1979. - Vol. 100, N 2. - P. 377-383.

144. Howe C., Kabat E.A. Immunochemical studies on blood groups. XIII. The Action of enzyme from snail (Busycon) liver on blood group A and 0(H) substances (Hog) // J. Am. Chem. Soc. 1953. - Vol. 75, N 22. - P. 5542-5547.

145. Weissmann B., Hinrichsen D.F. Mammalian a-acetylgalactosaminidase. Occurrence, partial purification, and action on linkages in submaxillary mucins // Biochemistry. 1969. - Vol. 8, N 5. - P. 2034-2043.

146. Sung S.S.J., Sweely C.C. Purification and partial characterization of porcine liver a-N-acetylgalactosaminidase // J. Biol. Chem. 1980. - Vol. 255, N 14. - P. 6589-6594.

147. Weissmann B., Friederici D. Occurrence of a mammalian a-N-acetyl-D-galactosaminidase // Biochim. Biophis. Acta. 1966. - Vol. 117, N 2. - P. 498-499.

148. Isreal M., Bach G., Miyatake T., Naiki M., Suzuki K. Forssmann Hapten N-Acetil-a-D-galactosaminidase in rat brain and kidney // J. Neurochem. 1974. - Vol. 23, N 4. -P. 803-809.

149. Hata J., Dhar M., Mitra M., Harmata M., Haibach P., Sun P., Smith D. Purification and characterization of N-acetyl-a-D-galactosaminidase from Gallus domesticus II Biochem. Int. 1992. - Vol. 28, N 1. - P. 77-86.

150. Nakagawa H., Asakawa M., Enomoto N. Purification and characterization of a-N-acetylgalactosaminidase from skipjack liver // J. Biochem. 1987. - Vol. 101, N 4. - P. 855862.

151. Tuppy H., Staudenbauer W.L. The action on soluble blood group A substances of an a-N-acetylgalactosaminidase from Helixpomatia II Biochemistry. 1966. - Vol. 5, N 5. -P. 1742-1747.

152. Muramatsu T. N-Acetylhexosaminidases from a gastropod, Turbo cornutus II J. Biochem. (Tokyo). 1968. - Vol. 64, N 4. - P. 521-531.

153. Rashid H., Matsuzawa T., Satoh Y., Shiraishi T., Ando M., Sadik G., Uda Y. Purification and characterization of a-N-Acetylgalactosaminidases I and II from starfish Asterina amurensis II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010. - Vol. 74, N 2. - P. 256-251.

154. Sadik G, Rashid H, Itoh-Nashida T., Ishii K., Satoh Y., Shiraishi T., Uda Y. Chemical and imunological characterization of the two a-N-Acetylgalactosaminidases from squid liver // Biol. Pharm. Bull. 2009 - Vol. 32, N 8. - P 1469-1472.

155. Uda Y., Li S.C., Li Y.T. a-N-Acetylgalactosaminidase from the limpet Patella vulgate IIJ. Biol. Chem. 1977. - Vol. 252, N 15. - P. 5194-5200.

156. Chi en S.F. Purification and characterization of a-N-acetylgalactosaminidase from shrimp hepatopancreas // J. Chin. Biochem. Soc. 1986. - Vol. 15, N 1. - P. 86-96.

157. Watkins M. Enzymes of Trichomonas foetus. The action of cell-free extracts on blood-group substances and low-molecular-weight glycosides // Biochem. J. — 1959. — Vol. 71, N2.-P. 261-274.

158. Harrap G. J., Watkins M. Characterization of the enzyme from Trichomonas foetus that destroys the serological specificity of blood-group A substance // Biochem. J. 1964. -Vol. 93, N3.-P. 9p-10p.

159. Williams A.G., Withers S.E., Coleman G.S. Glycoside hydrolase of rumen bacteria and protozoa II Curr. Microbiol. 1984. - Vol. 10, N 5. - P. 287-294.

160. Hatheway C.L. Toxigenic Clostridia // Clin. Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 3, N 1. -P. 66-98.

161. Levy G.N., Aminoff D. Purification and properties of a-N-acetylgalactosaminidase from Clostridium perfringens II J. Biol. Chem. 1980. - Vol. 255, N 24.-P. 11737-11742.

162. Hoskins L.C., Boulding E.T., Larson G. Purification and characterization of blood group A-degrading isoforms of a-N-acetylgalactosaminidase from Ruminococcus torques strain IX-70 // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, N 12. - P. 7932-7939.

163. McDonald M.J., Bahl O.P. a-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger II Methods Enzymol. 1972. -Vol. 28. -P. 734-738.

164. Kadowaki S., Ueda T., Yamamoto K., Kumagai H., Tochikura T. Isolation and characterization of a blood group A substance-degrading a-N-acetylgalactosaminidase from an Acremonium sp. // Agric. Biol. Chem. 1989. - Vol. 53, N 1. - P. 111-120.

165. Mohamad S.B., Nagasawa H., Uto Y., Hori H. Tumor cell alpha-7V-acetylgalactosaminidase activity and- its involvement in GcMAF-related macrophage activation//Comp. Biochem. Physiol. Part A.-2002.-Vol. 132, N 1.-P. 1-8.

166. Yamamoto N., Urade M. Pathogenic significance of a-N-acetylgalactosaminidase activity found in the hemagglutinin of influenza virus // Microbes Infection. 2005. - Vol. 7, N4.-P. 674-681.

167. Russell R.R.B., Aduse-Opoku B.J., Sutcliffe I.C., Tao L., Ferretti J.J. A binding protein dependent transport system in Streptococcus mutans responsible for multiple sugar metabolisms // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267, N 7. - P. 4631-4637.

168. Saier M.H.J., Ghauvaux S., Cook G.M., Deutscher J., Paulsen I.T., Reizer J., Ye J.J. Catabolite repression and inducer control in Gram-positive bacteria // Microbiology. -1996. Vol. 142, Pt 2. - P. 217-230.

169. Rosenow C., Maniar M., Trias J. Regulation of the a-galactosidase activity in Streptococcus pneumoniae: characterization of the raffinose utilization system // Genome Res. -1999.-Vol. 9, N12.-P. 1189-1197.

170. Pardee A. An inducible mechanism for accumulation of melibiose in E. coli II J. Bacteriol. 1957. - Vol. 73, N 3. - P. 376-385.

171. Orskov I., Orskov F. Plasmid determined H2S character in E. coli and its relation to plasmid-carried raffinose fermentation and tetracycline resistance characters // J. Gen. Microbiol. 1973. - Vol. 77, N 2. - P. 487-499. ,

172. Prestidge L.S., Pardee A.B. A second permease for methyl-thio-P-D-galactoside in E. coliU Biochim. Biophys. Acta. 1965. - Vol. 100, N3.-P. 591-593.

173. Muiznieks I., Rostoks N., Schmitt R. Efficient control of raf gene expression by CAP and two Raf repressors that bend DNA in opposite directions // Biol. Chem. 1999. -Vol. 380, N 1.-P. 19-29.

174. Stassi D.L., Dunn J.J., Lacks S.A. Nucleotide sequence of DNA controlling expression of genes for maltosaccharide utilization in Streptococcus pneumoniae II Gene. -1982. Vol. 20, N 3. - P. 359-366.

175. Vadeboncoeur C., Pelletier M. The phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system of oral streptococci and its role in the control of sugar metabolism IIFEMS Microbiol. Rev. 1997. - Vol. 19, N 3. - P. 187-207.

176. Cvitkovitch D.C., Boyd D.A., Plamilton I.R. Regulation of sugar transport via the multiple sugar metabolism operon of Streptococcus mutans by the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system // J. Bacteriol. 1995. - Vol. Ill, N 19. - P. 5704-5706.

177. Fridjonsson O., Watzlawick H., Mattes R. The structure of the a-galactosidase gene loci in Thermus brockianus ITI 360 and Thermus thermophilic TH125 // Extremophiles. -2000.-Vol. 4, N 1. P. 23-33.

178. Silvestroni A., Connes C., Sesma F., de Giori G.S., Piard J.C. Characterization of the melA locus for a-galactosidase in Lactobacillus plantarum II Appl. Environ. Microbiol. -2002. Vol. 68, N 11. - P. 5464-5471.

179. Boucher I., Vadeboncoeur C., Moineau S. Characterization of genes involved in the metabolism of alpha-galactosides by Lactococcus raffinolactis // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69, N 7. - P. 4049-4056.

180. Hama H., Wilson T.H. Primary structure and characteristics of the melibiose carrier at Klebsiella pneumoniae II J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267, N 26. - P. 1837118376.

181. Sumner-Smith M., Bozzato R. P., Skipper N., Davies R.W., Hopper J.E. Analysis of the inducible MEL1 gene of Saccharomyces carlsbergensis and its secreted product, a-galactosidase (melibiase) // Gene. 1985. - Vol. 36, N 3. - P. 333-340.

182. Post-Beittenmiller M.A., Hamilton R.W., Hopper J.E. Regulation of basal and induced levels of the MEL1 transcript in Saccharomyces cerevisiae II Mol. Cell. Biol. —1984. -Vol. 4, N7.-P. 1238-1245.

183. Dey P.M., Patel S., Brownleader M.D. Induction of a-galactosidase in Penicillium ochrochloron by guar (Cyamopsis tetragonobola) gum // Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. -Vol. 17, Pt3.-P. 361-371.

184. Zaprometova O.M., Ulezlo I.V., Lakhtin V.M. Structure and properties of Cephalosporium acremonium a-galactosidase. I I Glycoconj. J. 1990. - Vol. 7, N 4. — P. 287300.

185. Rigden D.J. Iterative database searches demonstrate that glycoside hydrolase families 27, 31, 36 and 66 share a common evolutionary origin with family 13 // FEBS Lett. — 2002.-Vol. 523, N1-3.-P. 17-22.

186. Наумов Д.Г. Филогенетический анализ а-галактозидаз семейства GH27 // Молекулярная биология. 2004. - Т. 38, № 3. - С. 463-476.

187. Naumoff D.G. GH97 is a new family of glycoside hydrolases, which is related to the a-galactosidase superfamily // BMC Genomics. 2005. - Vol. 6 - P.112-124.

188. Garman S.C., Hannick L., Zhu A., Garboczi D.N. The 1,9 A Structure of a-N-acetylgalactosaminidase: molecular basis of glycosidase deficiency diseases // Structure. -2002.-Vol. 10, N3.-P. 425-434.

189. Clark N.E., Garman S.C. The 1,9 A Structure of human a-N-acetylgalactosaminidase: the molecular basis of Schindler and Kanzaki diseases // J. Mol. Biol. 2009. - Vol. 393, N 2. - P. 435-447.

190. Fujimoto Z., Kaneko S., Momma M., Kobayashi H., Mizuno H. Crystal structure of rice a-galactosidase complexed with D-galactose // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, N 22. -P. 20313-20318.

191. Garman S.C., Garboczi D.N. The molecular defect leading to Fabry disease: structure of human a-galactosidase // J. Mol. Biol. 2004. - Vol. 337, N 2. - P. 319-335.

192. Fujimoto Z., Kaneko S., Kim W.-D., Park G.-G., Momma M., Kobayashi H. The tetramer structure of the glycoside hydrolase family 27 a-galactosidase I from Umbelopsis vinacea II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2009. - Vol. 73, N 10. - P. 2360-2364.

193. Burstein C., Kepes A. The a-galactosidase from Escherichia coli K12 // Biochim. Biophys. Acta. 1971. - Vol. 230, N 1. - P. 52-63.

194. Raasch C., Streit W., Schanzer J., Bibel M., Gosslar U., Liebl W. Thermotoga maritima AglA, an extremely thermostable NAD(+)-, Mn2+-, and thiol-dependent a-glucosidase // Extremophiles. 2000. - Vol. 4, N 4. - P. 189-200.

195. Thompson J., Ruvinov S.B., Freedberg D.I., Flail B.G. Cellobiose-6-phosphate hydrolase (CelF) of Escherichia coli: Characterization and assignment to the unusual family 4 of glycosylhydrolases // J. Bacterid. 1999. - Vol. 181, N 23. - P. 7339-7345.

196. Bouma C.L., Reizer J., Reizer A., Robrish S.A., Thompson J. 6-Phospho-a-D-glucosidase from Fiisobacterium mortiferum: cloning, expression, and assignment to family 4 of the glycosylhydrolases // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179, N 13. - P. 4129-4137.

197. Bibel M., Brettl C., Gosslar U., Kriegshauser G., Liebl W. Isolation and analysis of genes for amylolytic enzymes of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima II FEMS Microbiol. Lett. 1998. - Vol. 158, N 1. - P. 9-15.

198. Thompson J., Hess S., Pikis A. Genes malh and pagl of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 encode NAD+- and Mn2+-dependent phospho-a-glucosidase(s) // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, N 5. - P. 1553-1561.

199. Lodge J.A., Maier T., Liebl W., Hoffmann V., Strater N. Crystral structure of Thermotoga maritima a-glucosidase AglA defines a new clan of NAD+-dependent glycosidases // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, N21.- P. 19151-19158.

200. Varrot A., Yamamoto H., Sekiguchi J., Thompson J., Davies G.J. Crystallization and preliminary X-ray analysis of the 6-phospho-a-glucosidase from Bacillus subtilis II Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1999i - Vol. 55, Pt 6. - P. 1212-1214.

201. Yip V.L.Y., Withers S.G. Mechanistic analysis of the unusual redox-elimination sequence employed by Thermotoga maritima BglT: a 6-phospho-P-glucosidase from glycoside hydrolase family 4 // Biochemistry. 2006. - Vol. 45, N2.-P: 571-580.

202. Yip V.L.Y., Thompson J., Withers S.G. Mechanism of GlvA from Bacillus subtilis: a detailed kinetic analysis of a 6-phospho-a-glucosidase from glycoside hydrolase family 4II Biochemistry. 2007. - Vol. 46, N 34. - P. 9840-9852.

203. He X., Thorson J.S., Liu H.W. Probing the coenzyme and substrate binding events of CDP-D-glucose 4,6-dehydratase: Mechanistic implications // Biochemistry. 1996. - Vol. 35, N 15.-P. 4721-4731.

204. Gatzeva-Topalova P.Z., May A.P., Sousa M.C. Structure and mechanism of ArnA: Conformational change implies ordered dehydrogenase mechanism in key enzyme for polymyxin resistance // Structure. 2005. - Vol. 13, N 6. - P. 929-942.

205. Fiala G., Stetter K.O. Pyrococcus furiosus sp. nov. represents a novel genus of marine heterotrophic archaebacteria growing optimally at 100°C // Arch. Microbiol. 1986. -Vol. 145, N 1.-P. 56-61.

206. Kengen S.W.M., Luesink E.J., Stams A.J.M., Zehnder A.J. Purification and characterization of an extremely thermostable (3-glucosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus 11 Eur. J. Biochem. 1993. - Vol. 213, N 1. - P. 305-312.

207. Gueguen Y., Voorhorst W.G.B., van der Oost J., de Vos W.M. Molecular and biochemical characterization of an endo-P-l,3-glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus II J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, N 50. - P. 31258-31264.

208. Imamura H., Fushinobu S., Yamamoto M., Kumasaka T., Jeon B.S., Wakagi T., Matsuzawa H. Crystal structures of 4-a-glucanotransferase from Thermococcus litoralis and its complex with an inhibitor II J. Biol. Chem. -2003. Vol. 278, N 21. -P. 19378-19386.

209. Davies G.J., Gloster T.M., Henrissat B. Recent structural insights into the expanding world of carbohydrate-active enzymes // Curr. Opin. Struct. Biol. — 2005. — Vol. 15,N6.-P. 637-645.

210. Comstock L.E., Coyne M.J. Bacteroides thetaiotaomicron: a dynamic, niche-adapted human symbiont // Bioessays. 2003. - Vol. 25, N 10. - P. 926-929.

211. Xu J., Bjursell M.K., Himrod J., Deng S., Carmichael L.K., Chiang H.C., Hooper L.V., Gordon J.I. A genomic view of the human -Bacteroides thetaiotaomicron symbiosis // Science. 2003. - Vol. 299, N 5615. - P. 2074-2076.

212. Zocco M.A., Ainora M.E., Gasbarrini G., Gasbarrini A. Bacteroides thetaiotoamicron in the gut: molecular aspects of their interaction // Dig. Liver Dis. 2007. -Vol. 39, N8. -P. 707-712.

213. D'Elia J.N., Salyers A.A. Contribution of a neopullulanase, a pullulanase, and an a-glucosidase to growth of Bacteroides thetaiotaomicron on starch // J. Bacterid. — 1996. — Vol. 178, N24.-P. 7173-7179.

214. Reeves A.R., Wang G.-R., Salyers A.A. Characterization of four outer membrane proteins that play a role in utilization of starch by Bacteroides thetaiotaomicron II J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179, N 3. - P. 643-649.

215. Cho K.H., Cho D., Wang G.-R., Salyers A.A. New regulatory gene that contributes to control of Bacteroides thetaiotaomicron starch utilization genes // J. Bacteriol. -2001.-Vol. 183, N24.-P. 7198-7205.

216. Juers D.H., Heightman T.D., Vasella A., McCarter J.D., Mackenzie L., Withers S.G., Matthews B.W. A structural view of the action of Escherichia coli (lacZ) p-galactosidase II Biochemistry. 2001. - Vol. 40, N 49. - P. 14781-14794.

217. Selwood T., Sinnott M.L. A solvent-isotope-effect study of proton transfer during catalysis by Escherichia coli (lacZ) P-galactosidase // Biochem. J. 1990. - Vol. 268, N 2. — P. 317-323.

218. Sinnott M.L., Withers S.G. The necessity of magnesium cation for acid assistance of aglycone departure in catalysis by Escherichia coli (lacZ) P-galactosidase // Biochem. J. -1978. Vol. 175, N 2. - P. 539-546.

219. Waldroup P.W., Keen C.A., Yan F., Zhang K. The effect of levels of a-galactosidase enzyme on performance of broilers fed diets based on corn and soybean meal // J. Appl. Poult. Res. -2006. Vol. 15, N 1. - P. 48-57.

220. Waldroup P.W., Fritts C.A., Keen C.A., Yan F. The effect of a-galactosidase enzyme with and without Avizyme 1502 on performance of broilers fed diets based on corn and soybean meal // Int. J. Poult. Sci. 2005. - Vol. 4, N 12. - P. 920-937.

221. Ghazi S., Rooke J.A., Galbraith H. Improvement of the nutritive value of soybean meal by protease and a-galactosidase treatment in broiler cockerels and broiler chicks // Br. Poult. Sci. -2003. Vol. 44, N 3. - P. 410-418.

222. Ganter C., Bock A., Buckel P., Mattes R. Production of thermostable, recombinant a-galactosidase suitable for raffinose elimination from sugar-beet syrup // J. Biotechnol. -1988.- Vol. 8, N 4. -P. 301-310.

223. Cruz R., Park Y.K. Production of fungal a-galactosidase and its application to the hydrolysis of galacto-oligosccharides in soybean milk // J. Food. Sci. 1982. — Vol. 47, N 6. -P. 1973-1975.

224. Tayal A., Pai V.B., Khan S.A. Rheology and microstructural changes during enzymatic degradation of a guarborax hydrogel // Macromolecules. — 1999. — Vol. 32, N 17. -P. 5567-5574.

225. Soin B., Vial S.M., Friend P.J. Xenotransplantation // Br. J. Surgery. 2000. -Vol. 87,N2.-P. 138-148.

226. Ezzelarab M., Cooper D.K.C. Reducing Gal expression on the pig organ a retrospective review // Xenotransplantation. - 2005. - Vol. 12, N 3. - P. 278-285.

227. Naundorf A., Ajisaka K. Purification of a-N-acetyl-galactosaminidase from Aspergillus niger and its use in the synthesis of GalNAc-a-(l—>0)-serine // Enz. Microbial. Technol. 1999. - Vol. 25, N 6. - P. 483-488.

228. Olsson M.L., Hill C.A., de laVega H., Liu Q.P., Stroud M.R., Valdinocci J., Moon S., Clausen H., Kruskall M.S. Universal red blood cells-enzymatic conversion of blood groupA andB antigens // Transfus. Clin. Biol.-2004.-Vol. 11,N l.-P. 33-39.

229. Landsteiner K. Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und agglutinierenden Wirkungen des Blutserums und der Lymphe // Zbl. Bakt. 1900. - Vol. 27. - P. 357-362. L(ht. no 282.

230. Watkins W.M. The ABO blood group system: historical background // Transfus. Med. -2001. Vol. 11, N 4. - P. 243-265.

231. Honig C.L., Bove J.R. Transfusion-associated fatalities: review of bureau of biologies reports 1976-1978 // Transfusion. 1980. - Vol. 20, N 6. - P. 653-661.

232. Sazama K. Reports of 355 transfusion-associated deaths: 1976 through 1985 // Transfusion. 1990. - Vol. 30, N 7. - P. 583-590.

233. Ravn V., Dabelsteen E. Tissue distribution of histo-blood group antigens // APMIS.-2000.-Vol. 108,N l.-P. 1-28.

234. Hakomori S. Antigen structure and genetic basis of histo-blood groups A, B and O: their changes associated with human cancer // Biochem. Biophis. Acta. 1999. - Vol. 1473,N l.-P. 247-266.

235. Yamamoto F., Clausen H., White T., Marken J., Hakomori S. Molecular genetic basis of the histo-blood group ABO system // Nature. 1990. - Vol. 345, N 6272. - P. 229233.

236. Schachter H., Michaels M.A., Tilley C.A., Crookston M.C., Crookston J.H. Qualitative differences in the N-acetyl-D-galactosaminyltransferases produced by human Ai and A2 genes // Proc. Natl. Acad. Sci. 1973. - Vol. 70, N 1. - P. 220-224.

237. Chester M.A., Olsson M.L. The ABO blood group gene a locus of considerable genetic diversity//Transfus. Med. Rev. -2001. -Vol. 15, N4.-P. 177-200.

238. Olsson M.L., Clausen H. Modifying the red cell surface: towards an- ABOuniversal blood supply//Br. J. Haematol. -2007. Vol. 140, N 1. - P. 3-12.

239. Garratty G. Modulating the red cell membrane to produce universal/stealth donor red cells suitable for transfusion // Vox Sang. 2008. - Vol. 94, N 2. - P. 87-95.

240. Goldstein J., Siviglia G., Hurst R., Lenny L., Reich L. Group B erythrocytes enzymatically converted to group O survive normally in A, B, and O individuals // Science. -1982.-Vol. 215, N4529.-P. 168-170.

241. Morgan W.T.J. The human ABO blood group substances // Experientia. 1947. -Vol. 3, N 7. -P. 257-267.

242. Morgan W.T., Watkins W.M. Unravelling the biochemical basis of blood group ABO and Lewis antigenic specificity // Glycoconj. J. 2000. - Vol. 17, N 7-9. - P. 501-530.

243. Zarnitz M.L., Kabat E.A. Immunochemical studies on blood groups. XXV. The action of coffee beans a-galactosidase on blood group B and BPi substances // J. Am. Chem. Soc. 1960. - Vol. 82, N 15. - P. 3953-3957.

244. Yatziv S., Flowers H.M. Action of a-galactosidase on glycoprotein from human B-erythrocytes II Biochem. Biophys. Res. Comm. 1971. - Vol. 45, N 2. - P. 514-518.

245. Harpaz N., Flowers H.M., Sharon N. Studies on B-antigenic sites of human erythrocytes by use of coffee bean a-galactosidase // Arch. Biochem. Biophys. 1975. - Vol. 170.-P. 676-683.

246. Goldstein J. Conversion of ABO blood groups // Transfus. Med. Rev. — 1989. -Vol. 3, N 3. -P. 206-212.

247. Harpaz N., Flowers H.M., Sharon N. Purification of coffee bean a-galactosidase by affinity chromatography // Biochem. Biophys. Acta. 1974. - Vol. 341, N 1. -P. 213-221.

248. Hobbs L., Mitra M., Phillips R., Smith D. The activity of blood type B specific exoglycosidase from Glycine max II Clin. Chim. Acta. 1996. - Vol. 247, N1-2. - P. 7-21.

249. Davis M.O., Hata D.J., Johnson S.A., Walker J.C., Sminh D.S. Cloning, expression and characterization of a blood group B active recombinant a-D-galactosidasefrom soybean (Glycine max) // Biochem. Mol. Biol. Intern. 1996. - Vol. 39, N. 3. - P. 471485.

250. Chien S.-F., Chen S.-H., Chien M.-Y. Cloning, expression, and characterization of rice a-galactosidase // Plant. Mol. Biol. Rep. 2008. - Vol. 26, N 3. - P. 213-224.

251. Oishi K., Aida K. Blood group substance-degrading enzymes obtained from Streptomyces sp. Part II. Purification and characteristics of a-galactosidase from Streptomyces 9917S // Agric. Biol. Chem. 1972. - Vol. 36, N 4. - P. 578-587.

252. Pat. US 4427777. Int. CI. C12N 05/00. Enzymatic conversion of red cells for transfusion / Goldstein J.; Assignees: New York Blood Center INC. 292558; Priority date: 14.08.1980; Filed: Jan. 24. 1984. - 8 p.

253. Hsieh H.Y., Mitra M., Wells D.C., Smith D. Purification and characterization of a-N-acetylgalactosaminidase from Clostridium perfringens IIIUBMB Life. 2000. - Vol. 50, N 2.-P. 91-97.

254. Calcutt M.J., Hsieh H.Y., Chapman L.F., Smith D.S. Identification, molecular cloning and expression of an a-N-acetylgalactosaminidase gene from Clostridium perfringens I IFEMS Microbiol. Lett. 2002. - Vol. 214, N 1. - P. 77-80.

255. Hsieh H.Y., Smith D. Clostridium perfringens a-Nacetylgalactosaminidase blood group A2-degrading activity // Biotechnol. Appl. Biochem. 2003. - Vol. 37, Pt 2. - P. 157163.

256. Goldstein J. Preparation of transfusable red cells by enzymatic conversion // Prog. Clin. Biol. Res. 1984. - Vol. 165. - P. 139-157.

257. Zhu A., Monahan C., Wang Z.K., Goldstein J. Expression, purification, and characterization of recombinant a-N-acetylgalactosaminidase produced in the yeast Pichia pastoris II Protein Expr. Purif. 1996. - Vol. 8, N 4. - P. 456-462.

258. Hoskins L.C., Boulding E.T. Changes in immunologic properties of group A RBCs during treatment with an A-degrading exo-a-Nacetylgalactosaminidase // Transfusion. -2001.-Vol. 41, N 7.-P. 908-916.

259. Izumi K., Yamamoto K., Tochikura T., HirabayashiY. Serological study using a-N-acetylgalactosaminidase from Acremonium sp. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - Vol. 1116, N 1. -P. 72-74.

260. Ashida H., Tamaki H., Fujimoto T., Yamamoto K., Kumagai H. Molecular cloning of cDNA encoding a-N-acetylgalactosaminidase from Acremonium sp. and its expression in yeast // Archiv. Biochem. Bioph. 2000. - Vol. 384, N 2. - P. 305-310.

261. Percival E. Sulfated polysaccharides containing neutral sugars // Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides / Ed. R.H. McDowell London : Academic Press.-1967.-P. 157-164.

262. Painter T.J. Algal polysaccharides // The Polysaccharides / Ed. G.O. Aspinal -London : Academic Press. 1983. - Vol. 2. - P. 195-285.

263. Kloareg В., Quatrano R.S. Structure of cell walls of marine algae and ecophysiological functions of the matrix polysaccharides // Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev. -1988.-Vol. 26.-P. 259-315.

264. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fiicans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fiicans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiology. 2003. - Vol. 13, N 6. - P. 29R-40R.

265. Усов А.И., Билан М.И. Фукоиданы сульфатированные полисахариды бурых водорослей // Успехи химии. - 2009. - Т. 78, № 8. - С. 846-862.

266. Облучинская Е.Д., Воскобойников Г.М., Галынкин В.А. Содержание альгиновой кислоты и фукоидана в фукусовых водорослях Баренцева моря // Прикл. биохим. микробиол. 2002. - Т. 38, № 2. - С. 213-216.

267. Ribeiro А.С., Vieira R.P. Mourao P.A.S., Mulloy В. A sulfated a-L-fucan from-sea cucumber // Carbohydr. Res. 1994. - Vol. 255. - P. 225-240.

268. Alves A.C., Mulloy В., Diniz J.A., Mourao P.A.S. Sulfated polysaccharides from the egg jelly layer are species-specific inducers of acrosomal reaction in sperms of sea urchins // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, N 11. - P. 6965-6971.

269. Alves A.-P., Mulloy В., Moy G.W., Vacquier V.D., Mourao P.A.S. Females of the sea urchin Strongylocen.trotus purpuratus differ in the structures of their egg jelly sulfated fucans // Glycobiology. 1998. - Vol. 8, N 9. - P. 939-946.

270. De Angelis P.L., Glabe C.G. Polysaccharide structural features that are critical for the binding of sulfated fucans to bindin, the adhesive protein from sea urchin sperm // J. Biol. Chem. 1987. - Vol. 262, N 29. - P. 13946-13952.

271. Ellouali M., Boisson-Vidal С., Durand P., Jozefonvicz J. Antitumor activity of low molecular weight fucans extracted from brown seaweed Ascophyllum nodosum // Anticancer Res. 1993. - Vol. 13, N 6A. - P. 2011 -2019.

272. Yámamoto I., Takahashi M., Suzuki Т., Seino H., Mori H. Antitumor effect of seaweeds. IV. Enhancement of antitumor activity by sulfation of a crude fucoidan fraction fromSargassum Jgellmanianum //Jpn. J. Exp. Med. 1984.-Vol. 54, N4.-P. 143-151.

273. Запорожец T.C., Беседнова H.H., Лоенко Ю.Н. Антибактериальная и иммуномодулирующая активность фукоидана // Антибиот. химиотер. 1995. - Т. 40, № 1.-С. 9-13.

274. Hirmo S., Utt М., Ringner M.,Wadstrom Т. Inhibition of heparan sulfate and other glycosaminoglycans binding to Helicobacter pylori by various polysulfated carbohydrates // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 10, N 3-4. - P. 301-306.

275. Lee J.-B., Hayashi K., Hashimoto M., Nakano Т., Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu) // Chem. Pharm. Bull. 2004. -Vol. 52,N9.-P. 1091-1094.

276. Adhikari U., Mateu C.G., Chattopadhyay K., Pujol C.A. Damonte E.B., Ray B. Structure and antiviral activity of sulfated fucans from Stoechospermum marginatum II Phytochemistry. 2006. - Vol. 67, N 22. - P. 2474-2482.

277. Mourao P.A.S. Use of sulfated fucans as anticoagulant and antithrombotic agents: future perspectives // Curr. Pharm. Des. 2004. - Vol. 10, N 9. - P. 967-981.

278. Matsui M.S., Muizzuddin N., Arad S., Marenus K. Sulfated polysaccharides from red microalgae have anti-inflammatory properties in vitro and in vivo II Appl. Biochem. Biotechnol.-2003. -Vol. 104, N 1.-P. 13-22.

279. Семенов А.И., Мазуров A.B., Преображенская M.E. Сульфатированные полисахариды как ингибиторы рецепторной активности Р-селектинов и Р-селектин-зависимой инфламматации // Вопр. мед. химии. 1999. - Т. 2, №2. - С. 135-143.

280. Zen К., Liu Y., Cairo D., Parkos C.A. CD 1 lb/CD 18-dependent interactions of neutrophils with intestinal epithelium are mediated by fiicosylated proteoglycans // J. Immunol. -2002. Vol. 169, N 9. - P. 5270-5278.

281. Zhang X.W., Liu Q., Thorlacius H. Inhibition of selectin function and leukocyte rolling protects against dextran sodium sulfate-induced murine colitis // Scand. J. Gastroenterol. -2001. Vol. 36, N 3. - P. 270-275.

282. Millet J., Jouault S.C., Mauray S., Theveniaux J., Sternberg C., Vidal C.B., Fischer A.M. Antithrombotic and anticoagulant activities of a low molecular weight fucoidan by the subcutaneous route // Thromb. Haemost. 1999. - Vol. 81, N 3. - P. 391-395.

283. Nishino Т., Yamauchi Т., Horie M., Nagumo Т., Suzuki H. Effects of a fucoidan on the activation of plasminogen by u-PA and t-PA // Thromb. Res. 2000. - Vol. 99, N 6. -P. 623-634.

284. Soeda S., Ohmagari Y., Shimeno H., Nagamatsu A. Preparation of aminated fucoidan and its evaluation as an antithrombotic and antilipemic agent // Biol. Pharm. Bull. -1994. Vol. 17, N 6. - P. 784-788.

285. Boisson-Vidal C., Chaubet F., Chevolot L., Sinquin C., Theveniaux J., Millet J., Sternberg C., Mulloy В., Fischer A.M. Relationship between antithrombotic activities of fucans and their structure // Drug Dev. Res. 2000. - Vol. 51; N 4. - P. 216-224.

286. Grauffel V., Kloareg В., Mabeau S., Durand P., Jozefonvicz J. New natural polysaccharides with potent antithrombic activity: fucans from brown algae // Biomaterials. -1989. Vol. 10, N 6. - P. 363-368.

287. Nishino Т., Aizu Y., Nagumo T. The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity // Thromb. Res. 1991. - Vol. 64, N 6. - P. 723-731.

288. Springer G.F.,Wurzel H.A., McNeal G.M.J., Ansell N.J., Doughty M.F. Isolation of anticoagulant fractions from crude fucoidin // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - Vol. 94, N2.-P. 404-409.

289. Shibata H., Kimura-Takagi I., Nagaoka M., Hashimoto S., Aiyama R., Iha M., Ueyama S., Yokokura T. Properties of fucoidan from Cladosiphon okamnranus tokida in gastric mucosal protection // BioFactors. 2000. - Vol. 11, N 4. - P. 235-245.

290. Запорожец T.C., Иванушко JI.А., Звягинцева Т.Н., Молчанова В.Н., Беседнова Н.Н., Эпиггейн Л.М. Цитокинкоррегирующая активность биополимеров морских гидробионтов // Медицинская иммунология. 2004. - Т. 6, № 1-2, - С. 89-91.

291. Blondín С., Fischer Е., Boisson-Vidal С., Kazatchkine M.D., Jozefonvicz J. Inhibition of complement activation by natural sulfated polysaccharides (fucans) from brown seaweed // Mol. Immunol. 1994. - Vol. 31, N 4. - P. 247-253.

292. Макаренкова И.Д., Компанеец Г.Г., Запорожец Т.С. Ингибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эукариотических клетках // Журн. микробиол. 2006. -№ 3. - С. 121-125.

293. Hahnenberger R., Jakobson A.M. Antiangiogenic effect of sulphated glycosaminoglycans and polysaccharides in the chick embryo chorioallantoic membrane // Glycoconj. J. 1991. - Vol. 8, N 4. - P. 350-353.

294. Koyanagi S., Tanigawa N., Nakagawa H., Soeda S., Shimeno H. Oversulfation of fucoidan enhances its antiangiogenic and antitumor activities // Biochem. Pharmacol. — 2003. -Vol. 65, N2.-P. 173-179.

295. Folkman J. Tumor angiogenesis // Adv. Cancer Res. 1974. - Vol. 19. - P. 331358.

296. Кузнецова T.A., Шевченко H.M., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей перспективы их применения в медицине // Антибиотики и химиотерапия. 2004. - Т. 49, № 5. - С. 2430.

297. Zhuang C., Itoh H., Nishino Т., Itoh H. Antitumor active fucoidan from brown seaweed Umitoranoo (Sargassum thunbergii) II Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - Vol. 59, N4.-P. 563-568.

298. Maruyama H., Tamauchi H., Hashimoto M., Nakano T. Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from sporophyll of Undaria pinnatifida II In Vivo. 2003. - Vol. 17, N 3. - P. 245-249.

299. Haroun-Bouhedja F., Ellouali M., Sinquin C., Boisson-Vidal С. Relationship between sulfate groups and biological activities of fucans // Thromb. Res. 2000. - Vol. 100, N5.-P. 453-459.

300. Vischer P., Buddecke E. Different action of heparin and fucoidan on arterial smooth muscle cell proliferation and thrombospondin and fibronectin metabolism // Eur. J. Cell. Biol. 1991. - Vol. 56, N 2. - P. 407-414.

301. Honya M., Mori H., Anzai M., Araki Y., Nisizawa K. Monthly changes in the content of fucans, their constituent sugars and sulphate in cultured Laminaria japónica II Hydrobiologia.- 1999.-Vol. 398/399.-P. 411-416.

302. Усов А.И., Смирнова Г.П., Билан М.И., Шашков А.С. Полисахариды водорослей. 53. Бурая водоросль Laminaria saccharina (L.) Lam. как источник фукоидана // Биоорган, химия. 1998. - Т. 24, № 5. - С. 437-445.

303. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L. // Carbohydr. Res. 2004. - Vol. 339, N 3. - P. 511-517.

304. Fitton J.H. Fucoidans: Healthful saccharides from the sea // GlycoSci. Nutr. -2005.-Vol 6, N 1. P. 1-6.

305. Bilan M.I., Grachev A.A., Ustuzhanina N.E., Shashkov S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens II Carbohydr. Res. — 2002. Vol. 337, N 8. - P. 719-730.

306. Chevolot L., Mulloy В., Ratiscol J., Foucault A., Colliect-Jouault S. A disaccharide repeat unit is the major structure in fucoidans from two species of brown algae // Carbohydr. Res. 2001. - Vol. 330, N 4. - P. 529-530.

307. Chizov A.O., Dell A., Morris PI.R., Plaslam S.M., McDowell R.C., Shashkov A.S., Nifant'ev N.E., Khatuntseva E.A., Usov A.I. A study of fucoidan from brown seaweed Chorda filum // Carbohydr. Res. 1999. - Vol. 320, N 1-2. - P. 108-119.

308. Nagaoka M., Shibata H., Kimura-Tagaki I., Hashimoto S., Kimura K., Makino Т., Aiyamo R., Ueyama S., Yokokura T. Structural study of fucoidan from Cladosiphon okamuranus (Tokida) // Glycoconj. J. 1999. - Vol. 16, N 1. - P. 19-26.

309. Patankar M.S., Oehninger S., Barnett Т., Williams R.L., Clark G.F. A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities // J. Biol. Chem. 1993. -Vol. 268, N 29. - P. 21770-21776.

310. Sakai Т., Kawai Т., Kato I. Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterial strain and its fucoidanase // Mar. Biotechnol. 2004. - Vol. 6, N 4. - P. 335346.

311. Ponce N.M.A., Pujol C.A., Damonte E.B., Flores M.L., Stortz C.A. Fucoidans from the brown seaweed Adenocytis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies // Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338, N 2. - P. 153-165.

312. Шевченко H.M., Анастюк С.Д., Герасименко Н.И., Дмитринок П.С., Звягинцева Т.Н. Полисахаридный и липидный соства бурых водорослей Laminaria gurjanovae /УБиоорган. химия. — 2007. — Т. 33, № 1. С. 96-107.

313. Descamps V., Colin S., Lahaye M., Jam M., Richard C., Potin P., Barbeyron Т., Yvin J.-C., Kloareg B. Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae // Mar. Biotechnol. 2006. - Vol. 8, N 1. - P. 27-39.

314. Venkateswaran P.S., Millman I., Blumberg B.S. Interaction of fucoidan- from Pelvetia fastigiata with surface antigen of hepatitis В and woodchuck hepatitis viruses // Planta Med. 1989. - Vol. 55, N 3. - P. 265-270.

315. Main A.J., Percival E. Carbohydrates of the brown seaweed Himanthalia lorea and Bifurcaría bifurcata: Part II. Structural studies of the «fiicans»// Carbohydr. Res. — 1973. -Vol. 26, N 1. P. 147-161.

316. Giordano A., Andreotti G., Tramice A., Trincone A. Marine glycosyl hydrolases in the hydrolysis and synthesis of oligosaccharides // Biotechnol. J. 2006. - Vol. 1, N 5. - P. 511-530.

317. Thanassi N.M., Nakada H.I. Enzymic degradation of fucoidan by enzymes from the hepatopancreas of abalone, Haliotus species // Arch. Biochem. Biophys. 1967. Vol. 118, N l.-P. 172-177.

318. Фудзикава Т., Коябу P., Вада M. Ферменты гепатопанкреаса Abalone, деградирующие фукоидан. Неочищенный фермент и фракция, не адсорбирующаяся на СМ-целлюлозу // (перевода яп. яз.) Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1979. - Vol. 53, N 1. -P. 87-95.

319. Kitamura K., Matsuo M., Yasui T. Enzymatic degradation of fucoidan by fiicoidanase from the hepatopancreas of Patinopecten yessoensis II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. - Vol. 56, N 3. - P. 490-494.

320. Aleksander C.G., Cutler R.L., Yellowless D. Studies on the composition and enzyme content of the crystalline style of Telescopium telescopium (L.) (Gastropoda) // Сотр. Biochem. Physiol. 1979. - Vol. 64B, N 1. - P. 83-89:

321. Gonzalez J.M., Weiner R.M. Phylogenetic characterization of marine bacterium strain 2-40, a degraded of complex polysaccharide // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. -Vol. 50, Pt2. - P. 831-834.

322. Sakai Т., Kimura H., Kato I. A marine strain of Flavobacteriaceae utilizes brown seaweed fucoidan // Mar. Biotechnol. 2002. - Vol. 4, N 4. - P. 399-405.

323. Sakai Т., Ishizuka K., Kato I. Isolation and characterization of a fucoidan-degrading marine bacterium // Mar. Biotechnol. 2003. - Vol. 5, N 5. - P. 409-416.

324. Furukawa S., Fujikawa Т., Koga D., Ide A. Purification and some properties of exo-type fucoidanases from Vibrio sp. N-5 // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. — Vol. 56, N 11.-P. 1829-1834.

325. Бурцева Ю.В., Кусайкин М.И., Сова B.B., Шевченко Н.М., Скобун С.А., Звягинцева Т.Н. Распространение фукоиданаз и некоторых гликозидаз среди морских безпозвоночных // Биология моря. 2000. - Т. 26, № 6. - С. 429-432.

326. Pat. US 6720419. Int. CI. C08B 37/00P. Sulfated focan oligosaccharide / Sakai Т., Amarume H., Kawai Т., Kojima K., Shimanaka K., Ikai K., Kato I.; Assignee: Takara Bio INC. JP 2001-325960, Priority date: Oct. 24. 2001; Filed: Apr. 13. 2004. - 8 p.

327. Sakai T.} Ishizuka К., Shimanaka К., Ikai К., Kato I. Structures of oligosaccharides derived from Cladosiphon okamuramis fucoidan by digestion with marine bacterial enzymes 11 Mar. Biotechnol. 2003. - Vol. 5, N 6. - P. 536-544.

328. Barbeyron Т., L'Haridon S., Michel G., Gzjzek M. Description of Mariniflexile fucanivorans sp. Nov., a marine Flavobacteriaceae that degrades sulphated fiicans from brown algae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - Vol. 58, Pt. 9. - P. 2107-2113.

329. Sakai Т., Kimura H., Kato I. Purification of sulfated fucoglucuronomannan lyase from bacterial strain of Fucobacter marina and study of appropriate conditions for its enzyme digestion//Mar. Biotechnol. -2003. -Vol: 5, N4. -P. 380-387.

330. Алексеева C.A., Бакунина И.Ю., Недашковская О.И., Исаков В.В., Михайлов И.И., Звягинцева Т.Н. Внутриклеточные альгинолитические ферменты морской бактерии Pseudoalteromonas citrea KMM. 3297 // Биохимия. 2004. - Т. 64, Вып. 3. - С. 328-337.

331. Elyakov G.B., Kuznetsova Т.А., Stonik V.A., Mikhailov V.V. New trends of marine biotechnology development // Pure Appl. Chem: 1994. - Vol: 66, N 4.-P. 811-818.

332. Михайлов B.B., Терентьев JI.JI., Терентьева H.A. Морские микроорганизмы и их ферменты / Отв. ред. В.Ф. Гальченко; РАН. Дальневост. отд-ние. Тихоокеан. ин-т биоорган, химии. Владивосток : Дальнаука. - 2004. — 230 с.

333. Arrigo K.R. Marine microorganisms and global nutrient cycles // Nature. 2005. -Vol. 437, N 7057.-P. 349-355.

334. Мишустина И.Е., Щеглова И.К., Мицкевич И.Н. Морская микробиология / Отв. ред. М.В. Ильченко; Далневост. гос. ун-т. -Владивосток : Изд-во ДВГУ. 1985. —184 с.

335. Chorst R.J. Microbial enzymes in equatic environment // Microbial enzymes in equatic environment / Ed. R.J. Chrost. New York : Springer. - 1991. - P. 47-78.

336. Иванова Е.П., Бакунина И.Ю., Горшкова Н.М., Романенко JI.A., Михайлов В.В., Елякова Л.А., Парфенова В.В. Распространение хитин-деградирующих ферментов среди морских и пресноводных микроорганизмов // Биология моря. 1992. - № 3-4. - С. 69-75.

337. Sugano Y., Nadae Н., Inagaki К. Yamamoto Т., Terada Т., Yamazaki Y. Production and characteristics of some new P-agarases from a marine bacterium Vibrio sp. strain JT0107 // J. Ferment. Bioeng. 1995. - Vol. 79, N 6. - P. 549-554.

338. Сова B.B., Елякова JLA., Иванова Е.П., Федосов Ю.В., Михайлов В.В. Индуцированная Р-1,3-глюканаза из морской бактерии Alteromonas sp. // Биохимия. -1994. Т. 59, Вып. 9. - С. 1369-1377.

339. Stonier R.Y., Pallerony N.J., Doudoroff М. The aerobic pseudomonads: a taxonomic study // J. Gen. Microbiol. 1966. - Vol. 49, N 2. - P. 159-271.

340. Baumann L., Baumann P., Mandel M., Allen R. D. Taxonomy of aerobic marine eubacteria //J. Bacterid. 1972. - Vol. 110, N 1. - P. 402-429.

341. Михайлов В.В., Кочкин А.В., Иванова Е.П. Сравнительное изучение микроорганизмов мидии и среды её обитания // Микробиология. 1988. - Т. 57, Вып. 1. -С. 158-159.

342. Иванова Е.П., Фролова Г.М., Михайлов В.В., Горшкова Н.М. Направленный скрининг щелочных фосфатаз бактериального происхождения // Прикл. биохим. микробиол- 1992. Т. 28, Вып. 3. - С. 726-730.

343. Austin В. Taxonomy of marine microorganisms // Marine microbiology. -Cambridge : Cambridge Univ. Press. 1988. - 223 p.

344. Akagawa-Matsushita M., Matsuo M., Koga Y., Yamasato K. Alteromonas atlantica sp. nov. and Alteromonas carageenovora sp. nov., bacteria that decompose algal polysaccharides // Int. J. Syst. Bacterid. 1992. - Vol. 42, N 4. - P. 621-627.

345. Бухарин O.B., Лобанова E.C., Немцева H.B., Черкасов С.В. Ассоциативный симбиоз. Екатеринбург : УрО РАН. - 2007. - 264 с.

346. Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов // Журн. микробиол. 2007. - № 4. - Р. 93-100.

347. Тец В.В., Кнорринг Г.Ю., Артеменко Н.К., Заславская Н.В., Артеменко К.Л. Влияние экзогенных протеолитических ферментов на бактерии // Антибиот. химиотер. 2004. - Т. 49, № 12. - С. 9-13.

348. Mattos-Guaraldi A.L., Formiga L.C., Pereira G.A. Cell surface components and adhesion in Corynebacterium diphtheriae II Microb. Infect. 2000. - Vol. 2, N 12. - P. 15071512.

349. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М. : Наука. - 1977. - 303 с.

350. Качурин А.М., Неустроев К.Н., Голубев A.M., Ибатуллин Ф.М. Химическая активация а-галактозидазы из Trichoderma reesei И Биохимия. — 1993. Т. 58, Вып. 4. — С. 550-561.

351. Kachurin A.M., Golubev A.M., Geisow M.M., Veselkina O.S., Isaeva-Ivanova L.S., Neustroev K.N. Role of methionine in the active site of a-galactosidase from Trichoderma reesei /I Biochem. J. 1995. - Vol. 308, Pt 3. - P. 955-964.

352. Jones D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices // J. Mol. Biol. 1999. - Vol. 292, N 2. - P. 195-202.

353. McGuffin L.J., Bryson К., Jones D.T. The PSIPRED protein structure prediction server // Bioinformatics. 2000. - Vol. 16, N 4. - P. 404-405.

354. Bryson K., McGuffin L.J., Marsden R.L., Ward J.J., Sodhi J.S., Jones D.T. Protein structure prediction servers at University College Londo // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33. - W36-W38. http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/

355. Cheng J., Randall A.Z., Sweredoski M.J., Baldi P. SCRATCH: a protein structure and structural feature prediction server // Nucleic Acids Res. 2005. -Vol. 33. - W72-W76. http://www.igb.uci.edu/tools/scratch/

356. Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-Pdb Viewer: an environment for comparative protein modeling // Electrophoresis. 1997. - Vol. 18, N 15. -P. 2714-2723.

357. Schwede Т., Jurgen K., Guex N., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: an automated protein homology modeling server // Nucleic Acids Res. 2003. - Vol. 31, N 13. - P. 33813385.

358. Arnold K. Bordoli L., Kopp J., Schwede T. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modeling // Bioinformatics. 2006. -Vol. 22, N2.-P. 195-201.

359. Molecular Operating Environment (МОЕ) version 2005.02; Chemical Computing Group, Montreal, Quebec, Canada, http://www.chemcomp.com/

360. Zhang Y. Template-based modeling and free modeling by I-TASSER in CASP7 // Proteins. 2007. - Vol. 69, N S8. - P. 108-117.

361. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction // BMC Bioinformatics. 2008. - Vol. 9, N 40 - P. 342-348.

362. Wu S., Skolnick J., Zhang Y. Ab initio modeling of small proteins by iterative TASSER simulations // BMC Biology. 2007. - Vol. 5. - P. 17.

363. Maranville E., Zhu A. Assessment of amino-acid substitutions at tryptophan 16 in a-galactosidase // Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267, N 5. - P. 1495-1501.

364. Hoffman A.S. Biologically functionally matherials // Biomaterials science / Eds. B.D. Ratner, A.S. Hoffman, F J. Schoen, J.E. Lemons. London : Acad. Press. - 1996. - P. 124-130.

365. Синицин А.П., Райнина Б.И., Лозинский В.И., Спасов С. Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М. : МГУ. - 1994. - 288 с.

366. Kuo J.-Y., Goldstein J. a-Galactosidase immobilized on a soluble polymer // Enzyme Microb. Technol. 1983. - Vol. 5, N 4. - P. 285-290.

367. Mitsutomi M., Uchida Y., Ohtakara A. Immobilization of thermostable a-galactosidase from Pycnoporns cinnabarinus on chitin and some properties of the immobilized enzyme // J. Ferment. Technol. 1985. - Vol. 63, N 4. - P. 325-329.

368. Hernaiz M.J., Crout D.H.G. Immobilization/stabilization on Eupergit C of the p-galactosidase from B-circulans and an a-galactosidase from Aspergillus oryzae II Enzyme Microb. Technol. 2000. - Vol. 27, N 1-2. - P. 26-32.

369. Prashanth S.J., Mulimani V.FI. Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae a-galactosidase immobilized in calcium alginate // Process Biochem. — 2005. — Vol. 40, N3-4.-P. 1199-1205.

370. Thippeswamy S., Mulimani V.H. Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a-galactosidase from Gibberella fujikuroi II Process Biochem. -2002. Vol. 38, N 5. - P. 635-640.

371. Dave B.C., Dunn B., Valentine J.S., Zink J.I. Sol-gel encapsulation methods for biosensors II Anal. Chem. 1994. - Vol. 66, N 22. - P. A1120-A1127.

372. Gill I., Ballesteros A. Bioencapsulation within synthetic polymers (Part 1): sol-gel encapsulated biologicals II Trends Biotechnol. 2000: - Vol. 18, N 7. - P. 282-296.

373. Shchipunov Yu.A., Karpenko T.Yu. Hybrid silica-polysaccharide materials prepared by the sol-gel processing // 2-nd Intern. Rhodia Conf. «Physical chemistry of polymeric systems». Bristol: Bristol Univ. - 2002. - P. 72.

374. Shchipunov Yu.A. Sol-gel-derived biomaterials of silica and carrageenans // J. Colloid Interf. Sci.-2003.-Vol. 268,N 1.-P. 68-76.

375. Shchipunov Yu.A., Karpenko T.Yu. Hybrid polysaccharide-silica nanocomposites prepared by the sol-gel technique II Langmuir. 2004. - Vol. 20, N 10. - P. 3882-3887.

376. Livage J., Coradin T. Roux C. Encapsulation of biomolecules in silica gels // J. Phys. Condens. Mat. -2001. - Vol. 13, N 33. - P. R673-R691.

377. Lu Z.-L., Lindner E., Mayer H.A. Applications of sol-gel-processed interphase catalysts // Chem. Rev. 2002. - Vol. 102, N 10. - P. 3543-3577.

378. Eggers D.K., Valentine J.S. Crowding and hydration effects on protein conformation: A study with sol-gel encapsulated proteins // J. Mol. Biol. 2001. - Vol. 314, N 4.-P. 911-922.

379. Eggers D.K., Valentine J.S. Molecular confinement influences protein structure and enhances thermal protein stability // Protein Sci. 2001. - Vol. 10, N 2. - P. 250-261.

380. Ellis R.J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated // Trends Biochem. Sci. -2001.- Vol. 26, N 10. P. 597-604.

381. Bodalo A., Gomez E, Gomez J.L., Bastida J., Maximo M.F., Diaz F. A comparision of different methods of P-galactosidase immobilisation // Process Biochem. -1991. Vol. 26, N 6. - P. 349-353.

382. Thomson R.H. Naturally Occurring Quinones / 2-nd ed. London, New York : Acad. Press. - 1971. - 734 p.

383. Стехова С.И., Шенцова Е.Б., Кольцова Е.А., Кулеш Н.И. Антимикробная активность полигидроксинафтохинонов из морских ежей // Антибиотики1 и химиотерапия. 1988.-Т. 33, № 11.-С. 831-833.

384. Похило Н.Д., Киселева М.И., Маханьков В .В., Ануфриев«: В:Ф: Цитотоксическая активность полупродуктов и побочных продуктов синтеза эхинохрома //Химия природ, соедин. -2008. -№ 3. -С. 228-231.

385. Лебедев А.В., Иванова М.В., Красновид Н.И., Кольцова Е.А. Кислотные свойства и взаимодействие с супероксид анион-радикалом эхинохрома А и его структурных аналогов // Вопросы мед. химии. 1999. - Т. 45, № 2. - С. 123-130.

386. Bender R.P., Ham A J., Osheroff N. Topoisomerase II-drug interaction domains: Identification of substituents on etoposide that interact with the enzyme // Biochemistry. -2007.-Vol. 46,N 10.-P. 2856-2864.

387. Valente C., Moreira R., Guedes R.C., Iley J., Jaffar M., Douglas K.T. The 1,4-naphthoquinone scaffold in the design of cysteine:protease inhibitors // Bioorgan. Med. Ghem: -2007.-Vol: 15, N 15.-P. 5340-5350.

388. Ivanova E.P:, Nedashkovskaya. O.I., Chum J:, Lysenko A.M., Frolova G.M., Svetashev V.I., Vysotskii M.V., Mikhailov V.V.,,Hug A., Colwell R.R. // Int. J: Syst. Evoli Microbiol.-,2001.-Vol. 51, Pt 6.-P. 1987-1995.

389. Zhu A., Monahan C., Wang Z.K. Trp-16 is essential for the activity of a-galactosidase and a-N-acetylgalactosaminidase // Bioch. Bioph. Acta. 1996. - Vol. 1297, N l.-P. 99-104.

390. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobun A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water-solublepolysaccharides from brown seaweed // Carbohydr. Res. 1999. - Vol. 322, N 1-2. - P. 3239.

391. Ragan M.A., Jensen A. Quantitative studies on brown algal phenols. II. Sesonal variation in polyphenol content of Ascophyllum Nodosum (L.) Le Jol. and Fucus vesiculosus (L.) //J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1978. - Vol. 34, N 3. - P. 245-258.

392. Ragan M.A., Glombitza K.W. Phlorotannins, brown alga polyphenols. In: Progress in phycological research / Eds. F.E. Round, D.J. Chapman. Bristol : Biopress. -1986. Vol. 4.-P. 129-141.

393. Pavia H., Cervin G., Lindgren A., Aberg P. Effects of UV-B radiation and simulated herbivory on phlorotannins in the brown alga Ascophyllum nodosum II Mar. Ecol. Prog. Ser.-1997.-Vol. 157.-P. 139-146.

394. Pavia H., Brock E. Extrinsic factors influencing phlorotannin» production in brown alga Ascophyllum nodosum II Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000. - Vol. 193. - P. 285-294.

395. Jormalaenen V., Honkanen T., Koivikko R., Eranen J. Inductiction of phlorotannin prodaction in a brown alga: defens or resource dynamic? // Oikos. 2003. - Vol. 103, N 3. -P. 640-650.

396. Toth G.B., Pavia H. Lack of phlorotannin induction in the kelp Laminaria hyperborea in response to grazing by two gastropod herbivores // Mar. Biol. 2002. - Vol. 140, N2.-P. 403-409.

397. Schoenwaelder M.E.A., Clayton M.N. The presence of phenolic compounds in isolated cell walls of brown algae // Phycologia. 1999. - Vol. 38, N 3. - P. 161-166.

398. Moen E., Larsen B., Ostgaard K. Aerobic microbial degradation of alginate in Laminaria hyperborea stipes contaning different levels of polyphenols // J. Appl. Phycol. — 1997.-Vol. 9, N 1. -P. 45-54.

399. Nakamura T., Nagayama K., Uchida K., Tanaka R. Antioxidant activity of phlorotannins isolated from the brown alga Eisenia bicyclis I I Fisher. Sci. 1996. - Vol. 62, N 5.-P. 923-926.

400. Nagayama K., Iwamura Y., Shibata T., Hirayama I., Nakamura T. Bactericidal activity of phlorotannins from the brown alga Ecklonia kurome II J. Antimicrob. Chemother. -2002.-Vol. 50, N6.-P. 889-893.

401. Tretyn A., Groling F., Magdowski G., Wagner G. Selective binding of Ca2+, Zn2+,2+ 4"

402. Cu and K by the physoedes of the green alga Mougeotia scalaris II Folia Histochem. Cytobiol. 1996. - Vol. 34, N 2. - P. 103-108.

403. Rogers D.J., Loveless R.W. Electron-microscopy of human erythrocytes agglutinated by lectin from codium-fragile SSP tomentosoides and pseudohaemagglutinin from Ascophyllum nodosum II J. Appl. Phycol. 1991. - Vol. 3, N 1. - P. 83-86.

404. Barwell C.J., Bllunden G., Manandhar P.D. Isolation and characterization of brown algal polyphenols as inhibitors of amylase, lipase and trypsin // J. Appl. Phycol. — 1989. -Vol. 1,N4.-P. 319-323.

405. Moen E., Larsen B., Ostgaard K. Biological degradation of Ascophyllum nodosum //J. Appl. Phycol. 1997. - Vol. 9, N4. - P. 347-357.

406. Shibata T., Fujimoto K., Nagayama K., Yamaguchi K., Nakamura T. Inhibitory activity of brown algal phlorotannins against hyaluronidase // Int. J. Food Sci. Technol. — 2002. Vol. 37, N 6. - P. 703-709.

407. Shibata T., Yamaguchi K., Nagayama K., Kawaguchi S., Nakamura T. Inhibitory activity of brown algal phlorotannins against glycosidases from the viscera of the turban shell Turbo cornutus II Eur. J. Phycol. 2002. - Vol. 37, N 4. - P. 493-500.

408. Ragan M.A., Jensen A. Quantitative studies on brown algal phenols. I. Estimation of absolute polyphenol content of Ascophyllum Nodosum (L.) Le Jol. and Fucus vesiculosus (L.) // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1977. - Vol. 30, N 2. - P. 209-221.

409. Haug A., Larsen B. Phenolic compounds in brown algae I. The presence of reducing compounds in Ascophyllum Nodosum (L.) Le Jol I I Acta Chem. Scand. 1958. -Vol. 12, N4.-P. 650-657.

410. Chen J., Le Boeuf E. J., Dai S., Gu B. Fluorescence spectroscopic studies of natural organic matter fractions // Chemosphere. 2003. - Vol. 50, N 5. - P. 639-647.

411. Колмакова O.A., Пен P.3., Шапиро И.Л., Бывшев А.В., Тарабанько В.Е. Низкотемпературная окислительная делигнификация древесины. 11. Химические свойства пероксидной целлюлозы // Химия растит, сырья. — 2003. — № 1. — С. 39-43.

412. Grasdalen Н., Larsen В., Smisrod О. 13C-n.m.r. studies of monomeric composition and sequence in alginate // Carbohydr. Res. 1981. - Vol. 89, N 2. - P. 179-191.

413. Бузников Г.А., Подмарев B.K. Морские ежи Strongylocenrotns drobachinensis, S. nudiis, S. intermedins // Объекты биологии развития / отв. ред. Т.А. Детлаф. М. : Наука.-1975.-гл.10.-С. 188-216.

414. Hagstrom В.Е., Lonning S. The sea urchin egg as a testing object in toxicology // Acta Pharmacol. Toxicol. 1973. - Vol. 32 (Suppl). - P. 1-49.

415. Kobayashy N. Marine ecotoxicological testing with echinoderms. In: Ecotoxicological testing for the marine environment / Eds. Persoon G., Jaspers E., Claus. C. Bredene, Bergium : State Univ. Ghent and Inst. Mar. Sci. Res. 1984. - Vol. 1. - P. 341-405.

416. Khurrum М., Hernandez A., Eskalaei М., Badali О., Coyle-Thompson С., Oppenheimer S.B. Carbohydrate involvement in cellular interactions in sea urchin gastrulation // Acta Histochem. 2004. - Vol. 106, N 2. - P. 97-106.

417. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. — Новосибирск : Наука. 1983.-288 с.

418. Segal J.B., Streiff М.В., Hofmann L.V., Thornton К., Bass E.B. Management of venous thromboembolism: A systematic review for a practice guideline // Ann. Intern. Med. -2007.-Vol 146, N3.-P. 211-222.

419. Warren J. Microbial hydrolysis of polysaccharides // Annu. Rev. Microbiol. -1996.-Vol. 50.-P. 183-212.

420. Laycock R.A. The detrital food chain basedon seaweeds. 1. Bacteria associated with the surface of Laminaria fronds // Mar. Biol. 1974. - Vol. 25, N 3. - P. 223-231.

421. Kong M.X., Chan K. A study of the bacterial flora isolated from marine algae // Bot. Mar. 1979. - Vol. 22, N 2. - P. 83-97.

422. Недашковская О.И., Иванова Е.П., Бакунина1 И.Ю., Светашев В .И., Звягинцева Т.Н., Михайлов В.В. Характеристика морских бактерий Pseudoalteromonas citrea, деградирующих фукоидан // М1кробюл. журн. 2002. - Т. 64, № 2. - С. 3-10.

423. A.c. № 1227199 СССР МКИ4 A 61 К 35/78. Способ получения пустулана / Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Сундукова Е.В., Кривощекова О.Е., Мищенко Н.П; // заявл. 16.12.83.; опубл. 30.04.86, № 3741257/28-14. Бюл. № 16.-2 с.

424. Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И., Елякова JI.A. Структура ламинаринов некоторых бурых водорослей // Биоорган, химия. — 1994. Т. 20, № 12. - С. 1349-1358.

425. Лихошерстов Л.М., Деревицкая В.А., Федорова В.И. Модифицированный метод выделения группового вещества крови (А+Н) из слизистой оболочки желудка свиньи II Биохимия. 1969: - Т. 34, № 1. - С. 45-50.

426. Деревицкая В.А., Лихошерстов Л.М., Арбатский Н.П;, Кочетков Н.К. Исследование структуры группового вещества крови В из слизистой желудка лошади // Изв. АН СССР, Сер. хим. 1972. 12. - С. 2782-2786.

427. Nelson Т.Е. A photometric adaptation' of the Somogyi method for the determination of glucose II J. Biol. Chem. 1944.-Vol. 153, N 1. -P. 375-381.

428. Claus D., Berkeley R.C.W. Genus Bacillus Cohn 1872, 174AL // Bergey's manual of systematic bacteriology / EdsP.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J;G. Holt., Baltimore : Williams and Wilkins. 1986: - Vol: 2: -PI T105-1139:

429. Reichenbach H. The order Gytophagales Leadbetter 1974, 99 AL // Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. J.T. Staley, M.P. Bryant, N. Pfennig, J.C. Holt. Baltimore: Williams & Wilkins. 1989. - Vol. 3. - P; 2011-2073.

430. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Eds. N.R. Krieg, J.G. Holt. Baltimore : Williams & Wilkins. 1984. - Vol: 1. - 964 p.

431. Collins M.D., Cumming C.S. Genus Corynebacterium Lehmann and Neumann 1896, 350al I I Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Ed. P.H.A. Sneath, N.S. Mair, M.E. Sharpe, J.G. Holt. Baltimore : Williams & Wilkins, 1986. - Vol. 2. - P. 1266-1283.

432. Oliver J.D., Smith J. Intestinal microflora of deep-sea animals: a taxonomic study // Deep Sea Res. 1982. - Vol. 29, N 10. - P. 785-794.

433. Marmur J., Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its therminal denaturation temperature // J. Mol. Biol. 1962. - Vol. 5, N 1. - P. 109-118.

434. Svetashev V.I., Vysotskii M.V., Ivanova E.P., Mikhailov V.V. Cellular fatty acid of Alteromonas species // System. Appl. Microbiol. 1995. - Vol. 18, N 1. -P. 37-43.

435. Dubois M., Gillers K.A., Hamilton J., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. - Vol. 28, N 3. - P. 350-356.

436. Кольцова E.A., Чумак Г.Н., Максимов О.Б. Хиноидные пигменты иглокожих. III. Минорные пигменты морского ежа Strongylocentrotiis nadiis Н Химия природ, соедин. 1977. - № 2. - С. 202-207.

437. Глазунов В.П., Чижова AJL, Шувалова М.И., Ануфриев В.Ф. Химия производных нафтазарина. Сообщение 7. Установление строения замещенных 2,6(7)-дигидроксинафтазаринов методами УФ- и ИК-спектроскопии // Изв. АН, Сер. хим.-2001.-№ 1.-С. 85-91.

438. Кольцова Е.А., Дис. Исследование химического строения и физиологической функции хиноидных пигментов морских ежей, канд. хим. наук, Тихоокенский институт биоорганической химии, Владивосток. — 1983. — 240 с.

439. Mehrotra R.C., Narian R.P. Reactions of tetramethoxy- and triethoxysilanes with glycols // Ind. J. Chem. 1967. - Vol. 5, N 12. - P. 444-448.

440. Lenny L.L., Hurst R., Goldstein J., Galbraith R.A. Maltiunit transformations to group О and A subjects of red cells enzymatically converted from group В to group О // Blood. 1994. - Vol. 84, N 10. - P. A469-A469.

441. Lenny L.L., Hurst R., Goldstein J., Benjamin L.J., Jones R.L. Single unit transfusions of RBC enzymatically coverted from group В to group О to group A and group О normal volunteers//Blood.- 1991.-Vol. 77,N6.-P. 1383-1388.

442. Kabat E.A. Blood group substances. Their chemistry and immunochemistry. New York : Academic Press, 1956. - 330 p.

443. Брилис В.И., Брилене T.A., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. 1986. - №4. — С. 210212.

444. Laemmli V.K. Cleavage of structural proteins during of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227, N 5259. - P. 680-685.

445. Запрометова С.М., Улезло И.В., Лихошерстов Л.М., Мартынова М.Д. Субстратная специфичность а-галактозидазы // Бихимия. 1990. - Т. 55, Вып. 12. - С. 2281-2285.

446. Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymatic and non-enzymatic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. J. 1961. — Vol. 78,N2.-P. 312-319.

447. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism // Biochemistry. 1981. - Vol. 20, N 1. - P. 33-37.

448. Venyaminov S.Yu., Vassilenko K.S. Determination of protein tertiary structure class from circular dichroism spectra // Anal. Biochem. 1994. - Vol. 222, N 1. - P. 176-184.

449. ExPASy (Expert Protein Analysis System) Proteomics Server. http://cn.expasy.org/tools/protparam.html

450. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual / 2-nd ed. Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989. -253 p.

451. National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

452. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual / 3-rd ed. -Cold Spring Harbor, New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001.

453. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32, N 5. - P. 1792-1797.

454. Chevenet F., Brun C., Banuls A.L., Jacq В., R. Christen. TreeDyn: towards dynamic graphics and annotations for analyses of trees // BMC Bioinformatics. 2006. - Vol. 7.-P. 439.

455. Yeats С. InterPro: the integrative protein signature database // Nucl. Acid. Res. 2009. - Vol. 37. -P. D211-D215.

456. Van Der Spoel D., Lindahl E., Hess В., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen H.J.C. GROMACS: Fast, flexible, and free // J. Comput. Chem. 2005. - Vol. 26, N 16. - P. 1701-1718. http://www.gromacs.org/.

457. Kelley L.A., MacCallum R.M., Sternberg M.J.E. Enhanced genome annotation using structural profiles in the program 3D-PSSM.// J. Mol. Biol. 2000. - Vol. 299, N 2. - P. 499-520. http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~3dpssm/

458. Kelley L.A., Sternberg M.J.E. Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server // Nature protocols. 2009. - Vol. 4, N 3. - P. 363-371. http://www.sbg.bio.ia.ac.uk/phyre/

459. Bates S.M., Weitz J.I. Coagulation assays // Circulation. 2005. - Vol. 112, N 4. -P. 53-60.

460. Monien B.H., Henry B.L., Raghuraman A., Hindle M., Desai U.R. Novel chemo-enzymatic oligoiners of cinnainic acids as direct and indirect inhibitors of coagulation proteinases // Bioorg. Med. Chem. 2006. - Vol. 14, N 23. - P. 7988-7998.

461. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология М. : ВНИРО. - 1995. — 219 с.

462. УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

463. ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН1. На правах рукописи05201150552 Бакунина Ирина Юрьевна

464. О-ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ0200.10 биоорганическая химия Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук

465. Научный консультант: доктор химических наук,профессор Звягинцева Т.Н.1. Владивосток-2011 г.