Исследование кристаллической структуры и механизма действия α-галактозидазы из Trichoderma reesei и β-галактозидазы из Penicillium sp. методом дифракции синхротронного рентгеновского излучения тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ им. Б .П. КОНСТАНТИНОВА

На правах рукописи УДК 548.73, 577.322.63

Голубев Александр Михайлович

ИССЛЕДОВАНИЕ КРИСТАЛЛИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ И МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ а-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ИЗ TRICHODERMA REESEIИ (З-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ИЗ PENICILLIUMS?. МЕТОДОМ ДИФРАКЦИИ СИНХРОТРОННОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

01.04.07 - физика конденсированного состояния

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

К В I « '

XJïi % • .

f% i" ? Vj " i, s ■

Гатчина - 2006

< *

- • т i

Работа выполнена в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН.

Научный руководитель:

доктор физ.-мат. наук, профессор Плахтий Владимир Петрович.

Официальные оппоненты:

доктор физ.-мат. наук, профессор Бирштейн Татьяна Максимовна,

доктор физ.-мат. наук, ст.науч.сотр. Штельмах Константин Федорович.

Ведущая организация:

Объединенный институт ядерных исследований, г.Дубна.

Защита диссертации состоится _

в_часов на заседании диссертационного совета

Д-002.115.01 при Петербургском институте ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН.

Адрес; 188300, Ленинградская область, г. Гатчина, Орлова роща.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова.

Автореферат разослан_

Ученый секретарь диссертационного совета

/И.А. Митропольский/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований

Развитие биотехнологии является приоритетной задачей не только для повышения эффективности технологии, но, в первую очередь, для решения экологических проблем. В отличие от химического производства, сопровождаемого вредными и опасными выбросами, биотехнологические процессы используют, как правило, биологические катализаторы химических реакций - ферменты.

В современной биотехнологической промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз, гликозидгидролазы, катализирующие расщепление гликозидных связей, являются одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Достаточно упомянуть, что ни одно современное целлюлозно-бумажное производство не обходится без применения гликозидгидролаз.

Помимо этого, гликозидгидролазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих соединений, используемых в фармацевтике и медицине. Такое их применение основано на способности при определенных условиях обращать реакции гидролиза и катализировать реакцию трансгликозилирования - образование новых гликозидных связей. Энзиматический гидролиз и синтез имеют значительные преимущества перед традиционными методами органической химии, так как позволяют получать необходимые соединения практически в одну стадию.

Совокупность знаний о конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствии с научными или производственными задачами. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств, а также знаний пространственной трехмерной структуры их активного центра. Часто информация о структуре белка и его комплекса с ингибиторами является необходимым условием для создания новых биологических препаратов и лекарств. Такой подход - от знания структуры белка к созданию новых меди

щ [йао«Ац*>енарйЯ1й)д БИБЛИОТЕКА С.-Петербург ОЭ 2006лкт^/

названный рациональным конструированием лекарств (rational drug design),- в последнее десятилетие послужил мощным стимулом для развития структурной биофизики.

Практически единственным современным методом изучения трехмерной пространственной структуры ферментов и их активных центров остается рентгеноструктурный анализ. В последнее время использование мощных источников рентгеновского излучения -синхротронов - стимулировало и ускорило развитие новых методов рентгеноструктурного анализа биологических макромолекул.

Основные цели и задачи исследования

Современная классификация всех гликозидгидролаз по 94 семействам, выполненная Хенриссатом [1] на основании гомологии их последовательностей и стереохимии катализируемой реакции, оказалась весьма продуктивной. Дело в том, что ферменты из одного семейства, даже с разными каталитическими свойствами, оказались структурно гомологичными, имеющими идентичный тип укладки полипептидной цепи, что было показано на примере нескольких гликозидгидролаз, для которых известна трехмерная структура. Тем не менее, таблица Хенриссата все еще содержит много "белых пятен" в отношении структуры и детального каталитического механизма действия ферментов из отдельных семейств.

Настоящая работа посвящена решению трехмерных структур а-галактозидазы из Trichoderma reesei (27 семейство) и Р-галактозидазы из Pénicillium sp. (35 семейство), а также их комплексов с ингибиторами. Цель такого исследования - выяснить механизм работы этих ферментов на молекулярном уровне с перспективой последующей модификации их свойств методами белковой инженерии.

Интересный феномен окислительной активации, обнаруженный в а-галактозидазе из Trichoderma reesei, когда каталитическая активность фермента возрастала в 12 раз при химическом окислении [2], также мог быть объяснен только на основании решения трехмерной структуры. Очевидно, что единственным методом, отвечающим на поставленные вопросы, является

рентгеноструктурный анализ. Отсюда вытекают конкретные задачи данного исследования:

■ Получить кристаллы а-галактозидазы из Trichoderma reesei и ее комплекс с ингибиторами и решить трехмерную пространственную структуру фермента.

■ На основании полученной структуры объяснить механизм действия фермента, выявить строение активного центра и каталитические аминокислотные остатки.

■ Прояснить механизм окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei.

■ Получить кристаллы Р-галактозидазы из Pénicillium sp. и решить трехмерную пространственную структуру фермента.

• На основании полученной структуры объяснить механизм действия фермента, объяснить субстратную специфичность и другие каталитические свойства.

■ Сравнить структуры а- и Р-галактозидаз для выяснения аномерной специфичности этих двух ферментов.

■ Изучить углеводную компоненту рассматриваемых ферментов.

Методика решения поставленных задач

Для решения пространственной структуры были получены кристаллы а-галактозидазы из Trichoderma reesei и Р-галактозидазы из Pénicillium sp., а также кристаллы комплексов этих ферментов с природным ингибитором - D-галактозой.

Выращенные кристаллы белков и их тяжелоатомные производные были использованы в дифракционном эксперименте для последующего решения трехмерных структур. Фазовая проблема была решена с использованием изоморфного замещения.

Наборы рентгеновских данных высокого разрешения были получены на линии белковой кристаллографии Бразильского национального центра синхротронного излучения (LNLS), Кампинас, Сан-Паулу, Бразилия [3].

Научная новизна полученных результатов

Получены данные о пространственной структуре двух новых ферментов, а также структуры их комплексов с природными ингибиторами. Все полученные трехмерные структуры депонированы в Белковый Банк Данных.

Впервые решены трехмерные пространственные структуры представителей 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз -а-галактозидазы из T.reesei и Р-галактозидазы из Pénicillium sp.

На основании полученных рентгеноструктурных данных выяснен молекулярный механизм катализа двух ферментов.

Объяснена причина интересного феномена - окислительной активации а-галактозидазы из T.reesei.

В процессе решения структур двух описываемых ферментов успешно модифицирован и применен метод быстрой криодериватизации для решения фазовой проблемы, впервые предложенный Дотером [4].

Обе описываемые структуры решены с применением синхротронного рентгеновского излучения при использовании эффекта аномального рассеяния.

Впервые структура белка - а-галактозидазы из T.reesei - была решена комбинацией метода быстрой криодериватизации и метода SIRAS, использующего всего одну катионную (Cs1+) тяжелоатомную производную.

Впервые методом быстрой криодериватизации была решена фазовая проблема для структуры белка с массой более 120 ООО Да -Р-галактозидазы из Pénicillium sp.

Качество рентгеноструктурных данных позволило изучить структуру углеводной компоненты двух гликопротеинов.

На основании рентгеноструктурных данных выяснены причины аномерной селективности двух ферментов.

Анализ структурно-функциональных особенностей двух гликозидгидролаз позволяет приступить к получению ферментов с заданными каталитическими свойствами методами белковой инженерии.

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание особенностей структуры и механизма действия гликозидгидролаз.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Впервые показано, что метод быстрой криодериватизации может быть использован с применением катионов (Cs+) в качестве аномальных рассеивателей для решения фазовой проблемы в белковой кристаллографии.

2. Структура а-галактозидазы из Trichoderma reesei состоит из N-концевого домена типа (р/а)8-баррель и С-концевого домена типа Р-сэндвич.

3. Аминокислотные остатки а-галактозидазы Asp 132 и Asp 226 участвуют в катализе, причем первый в качестве нуклеофила, а второй - донора протонов, или кислотно-основного катализатора.

4. Эффект окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei обусловлен перераспределением зарядов внутри активного центра фермента в результате окисления Met 258 в метионинсульфоксид.

5. а-Галактозидаза из Trichoderma reesei является гликопротеином и содержит 4 N-связанных гликана маннозного типа, структура которых определена с атомным разрешением на основании полученных в работе дифракционных данных .

6. Структура (3-галактозидазы из Pénicillium sp. состоит из центрального домена типа (p/a)g баррель и четырех периферических доменов, содержащих Р-структуры.

7. Аминокислотные остатки ¡З-галактозидазы Glu 299 и Glu 200 участвуют в катализе, причем первый в качестве нуклеофила, а второй - донора протонов или кислотно-основного катализатора.

8. Р-Галактозидаза из Pénicillium sp. является гликопротеином и содержит 7 N-связанных гликанов маннозного типа, структура которых определена на основании полученных в работе дифракционных данных высокого разрешения.

9. Полученные в результате проведенного исследования данные о структуре и механизме действия двух ферментов создают основу для изменения свойств этих ферментов методами белковой инженерии.

Апробация работы

Материалы работы были представлены на следующих международных семинарах и конференциях:

■ V Congresso Ibero-Americano de Biofísica, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 12 а 15 de outubro de 2003.

■ XVI Reuniäo da SBCr, Campus da USP/Säo Carlos, 16 а 19 de mar?o 2003.

■ VI Semenário Brasileiro de Tecnología Enzimática, ENZITEC 2004, Rio de Janeiro, 5 а 7 de abril de 2004.

■ Ist Latin American Protein Society Meeting, Angra dos Reis, RJ, November 8-12, 2004.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа объемом 119 страниц состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы и включает 23 рисунка, 8 таблиц и 98 ссылок на цитируемую литературу.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследований и научная новизна, сформулированы цель и задачи диссертационной работы, перечислены конференции, на которых были апробированы основные результаты работы, выражены благодарности.

Первая глава посвящена обзору научной литературы по объектам исследования - гликозидгидролазам. К гликозидгидролазам относят ферменты, проявляющие каталитическую активность в отношении гликозидной связи -ковалентной химической связи углеводного остатка с другой химической группой. В настоящее время несколько тысяч известных последовательностей гликозидгидролаз и родственных ферментов (трансгликозидазы, трансферазы и т.д.) сгруппированы в 94 семейства [1]. Основным признаком семейства в данной классификации стала гомология не менее 100 аминокислотных остатков в выровненных белковых последовательностях. Вторым

8

важным признаком стал одинаковый стереохимический результат каталитического гидролиза гликозидной связи: с обращением или сохранением конфигурации аномерного углеродного атома субстрата в месте разрыва гликозидной связи. По этим признакам изучаемые ферменты - а-галактозидаза из T.reesei и Р-галактозидаза из Pénicillium sp. относятся, соответственно, к 27-му и 35-му семействам гликозидгидролаз. В главе кратко упомянуто применение изучаемых ферментов в промышленности и медицине, их физико-химические характеристики.

Вторая глава включает краткий обзор методов рентгеноструктурного анализа макромолекул. Описаны методы кристаллизации белка и способы оптимизации роста кристаллов. Рассмотрена история применения синхротронного рентгеновского излучения в кристаллографии. Высокоинтенсивное синхротронное излучение повысило требования, предъявляемые к детектирующим устройствам. Проблему удалось решить, используя детекторы на основе запоминающих экранов (Image Plate), которые были разработаны в конце 80-х годов [5]. Детекторы на основе запоминающих экранов работают как интегрирующие детекторы.

Способность такого флюорофора «запоминать» обусловлена присутствием соли редкоземельного элемента Еи2+, наличием природных точечных дефектов в структуре микрокристаллов (Eu/Ba)(F/Br) и явлением фотоиндуцированной люминесценции. Другой тип современных детекторов работает на основе приборов с разрядовой связью (charge-coupled device, ccd). При попадании рентгеновского кванта на тонкий сцинтилляционный экран происходит переизлучение в видимой области, которое регистрируется и запоминается фотоэлектронной матрицей, а затем отправляется непосредственно в память компьютера [6].

Одной из проблем кристаллографии макромолекул является слабая отражающая способность кристаллов и их разрушение при рентгеновском облучении. При использовании синхротронного излучения, радиационное разрушение заметно ухудшает качество дифракционной картины. Решение проблемы было найдено в использовании криогенных методов сбора дифракционных данных. Основным методом решения фазовой проблемы в белковой кристаллографии является изоморфное замещение, где главной

задачей является получение тяжелоатомных производных белковых кристаллов.

При введении атомов тяжелых металлов в кристалл белка параметры элементарной ячейки изменяются. Чем сильнее изменения, тем большие ошибки возникают при определении положений и заселенностей тяжелых атомов. Метод быстрой криодериватизации с галогенидами и с использованием эффекта аномального рассеяния, предложенный Дотером [4], позволяет значительно упростить и ускорить процедуру получения тяжелоатомной производной белка. В заключение главы приведены краткие характеристики компьютерных программ, применяемых в работе.

В третьей главе подробно описаны все экспериментальные методы, применяемые для решения трехмерных структур а-галактозидазы из T. reesei и р-галактозидазы из Pénicillium sp., от очистки белков до построения кристаллографических моделей. Обе структуры были решены с применение метода быстрой криодериватизации. Структура а-галактозидазы из T.reesei была решена с использованием всего одной тяжелоатомной производной (Cs+) и эффекта аномального рассеяния (метод SIRAS). Положения трех атомов Cs были найдены с помощью программы SnB в SAS моде [7] и, независимо, с помощью программы RSPS [8] по аномальному разностному синтезу Паттерсона (Рис. 1)

Первоначально рассчитанные фазы использовали для поиска дополнительных положений атомов цезия через построение аномального разностного синтеза Фурье. Процесс повторяли для поиска всех возможных положений связывания цезия. В результате были локализованы 11 атомов цезия с заселенностями от 0,8 до 0,1, которые позволили рассчитать экспериментальные фазы методом максимального правдоподобия с коэффициентом достоверности m = 0,286 (данные программы SHARP [9]).

Исходная кристаллографическая модель а-галактозидазы была построена с применением программы ARP/WARP [10]. Поскольку связность карты электронной плотности, статистические параметры и коэффициент достоверности были близки для обоих энантиоморфов, то построение модели выполнялось с использованием карт электронной плотности для двух возможных

вариантов. После 500 циклов встраивания полиаланиновых и полиглициновых полипептидных цепей алгоритм, используемый в

> № о 1 ' С7 Л 6 •У

€ 1 о Ь _ £ о ' £ & < ■ (у

0 0 - о ? О'М 1 •

\У О о <9 1 0 1 я о

! % » о о > а к « п ° 0 < <2>

Рисунок 1. Харкеровское сечение карты аномального синтеза Патгерсона для цезиевой производной кристалла а-галактозидазы из Т.гееяег. Контуры Патгерсоновской карты построены с шагом 1а

программе АЛРЛ^АКР, сошелся для правильного энантиоморфа. Первоначально построенная модель а-галактозидазы включала около 90 % всех аминокислотных остатков с локализованными боковыми группами.

Рисунок 2. Общий вид и активный центр а-галактозидазы из Т. reesei. а-спирали и Р-структуры представлены ленточной диаграммой. Ингибитор - D-галактоза, связанная в активном центре, каталитические аминокислотные остатки (Asp 132 и Asp 226), два остатка, участвующие в гидрофобном взаимодействии (Тгр 19 и Тгр 205),и N-связанные гликаны показаны в виде стержней

Решение структуры р-галактозидазы выполнялось сходными методами. Йодная и цезиевая производные были получены методом быстрой криодериватизации. Позиции 6 атомов йода с высокой заселенностью в йодной производной были определены при помощи программы SnB в SAS моде. Гибридная кристаллографическая

модель р-галактозидазы была построена с применением фаз, рассчитанных для йодной производной и структурных амплитуд набора данных нативного белка при помощи программ ARP/WARP [10]hREFMAC[11].

Модель состояла из 971 аминокислотного остатка в составе одной полиглициновой полипептидной цепи и из нескольких тысяч молекул воды. Используя гибридную модель, удалось методом аномального разностного синтеза Фурье локализовать все тяжелые атомы с заселенностями от 0,8 до ОД в цезиевой и уранильной производных. Уточненные фазы были рассчитаны программой SHARP [9] с использованием всех 4 наборов данных и положений 76 тяжелых атомов. Для 155 000 независимых рефлексов фазы были рассчитаны с общим коэффициентом достоверности 0,61 в диапазоне разрешения 27 Â -2,4 Â.

Четвертая глава включает подробное описание кристаллографических моделей а-галактозидазы из T.reesei и Р-галактозидазы из Pénicillium sp. и объяснение на их основе механизмов действия ферментов. Уточненная до разрешения 1,54 Â модель а-галактозидазы включала 417 аминокислотных остатков, 17 углеводных остатков в составе четырех N-связанных гликанов и 621 молекулы кристаллизационной воды. Белок состоит из двух основных доменов (Рис.2). N-концевой.или каталитический,домен (аминокислотные остатки 1-319) принадлежит к типу (р/а)8-баррель и состоит из восьми параллельных Р-цепей, проходящих примерно параллельно центральной оси, и из восьми протяженных а-спиралей. Малый С-концевой домен (остатки 320-417) состоит из восьми антипараллельных Р-цепей, сгруппированных в две плоскости.

Все природные и синтетические субстраты а-галактозидазы могут быть условно разделены на «медленные» и «быстрые». Например, и-нитрофенил a-D-галактопиранозид (ПНФаГ) является быстрым субстратом [Кц - 50 мкМ, к^ = 5,1 хЮ'2 мкМ/(минхмг)], а природный субстрат - раффиноза - медленным [Хм = 11 мМ, ^югг= 1,2x10"2 мкЩминхмг)]. Для объяснения структурных предпосылок таких различий модели 1,6-а-0-галактопиранозил галактопиранозида и ПНФаГ были помещены в каталитический центр фермента. При этом галактопиранозидные остатки моделей

были совмещены с экспериментально определенным положением D-галактозы. В случае ПНФаГ, нитрофенильное кольцо оказалось расположенным напротив индольной группы триптофана Тгр 205 на расстоянии около 4 А. Разумно предположить, что подобная ориентация вызовет суммарный сдвиг молекулы ПНФаГ внутри активного центра а-галактозидазы, по сравнению с молекулой (3-D-галактозы, таким образом, что расстояние между аномерным углеродным атомом субстрата и атомом О82 в остатке Asp 132 уменьшится. Это, в свою очередь, облегчит нуклеофильную атаку, а константа скорости гидролиза увеличится, что хорошо согласуется с имеющимися кинетическими данными.

Подобный подход помогает объяснить, почему активность (ккат) а-галактозидазы в гидролизе ПНФаГ увеличивается в 12 раз после обработки фермента мягкими окислителями (Н2О2, KMn04, NaI04 и ДР-)-

Методом ЯМР-спектроскопии было показано, что окислительная активация а-галактозидазы обусловлена окислением остатка L-метионина в метионинсульфоксид [2]. Окисления фермента не наблюдается в присутствии галактозы, что указывает на локализацию метионинсульфоксида вблизи активного центра (стерическая защита). Единственный остаток метионина, обнаруженный вблизи активного центра фермента, - это Met 258, атом серы которого расположен на расстоянии 4,7 А от ближайшей гидроксильной группы галактозы (ОНЗ). Это расстояние слишком велико для эффективного взаимодействия с молекулой ингибитора или субстрата, но ситуация меняется, если метионин Met 258 заменен на метионинсульфоксид Sme 258 (Рис. 3).

Модель позволяет выявить возможность электростатического взаимодействия между полярным метионинсульфоксидом и боковой группой Asp 54 - остатка, образующего сильную водородную связь с ОН4 гапактозного кольца (расстояние 2,6 А). В случае окисленного фермента распределение электронной плотности атома О52 в Asp 54 изменится, она сместится по направлению к полярной SO-группе метионинсульфоксида, таким образом освобождая группу ОН4 галактопиранозида в субстрате, и, следовательно, суммарное химическое сродство фермента к галактопиранозному кольцу уменьшится. В результате такого перераспределения

Asp2261 ТФ205 "PNPG

Sme258

Аэр132

Аэр54

Рисунок 3. Окислительная активация вызвана сильным взаимодействием между полярной БО - группой

метионинсульфоксида и О82 в Авр54, что сопровождается ослаблением связи О52 Авр54 - 04 галактопиранозид

электронной плотности упомянутое выше гидрофобное взаимодействие фенильного остатка в ПНФаГ и индольной группы Тгр 205 в ферменте, несомненно, должно вносить больший вклад в суммарное взаимодействие фермент-Субстрат, по сравнению с неокисленным ферментом. Как результат, расстояние между аномерным углеродом субстрата и карбоксильной группой нуклеофила Asp 132 уменьшится, что увеличит вероятность нуклеофильной атаки и, следовательно, приведет к увеличению константы скорости гидролиза и увеличению константы Михаэлиса (уменьшению химического сродства). Это объясняет наблюдаемый феномен окислительной активации.

Кристаллографическая модель (3-галактозидазы из Pénicillium sp. была уточнена программой REFMAC [11] до разрешения 1,90 Â. Молекула белка с молекулярной массой 120 кДа состоит из 5 различимых доменов (Рис. 4). Первый домен, состоящий из 355 остатков и включающий каталитический центр, принадлежит к типу (Р/а)8 - структуры. Второй домен, включающий аминокислотные

Рисунок 4. Общий вид молекулы Р-галактозидазы. а-спирали и р-структуры представлены ленточной диаграммой. Ингибитор - Р-Б-галактоза, связанная в активном центре, и К-гликаны представлены в виде стержней

остатки Туг 396 -Туг 576, состоит из 16 антипараллельных ß-цепей и одной а-спирали на С-конце. Третий домен (Тгр 577 -Туг 665) намного меньше, чем второй, и состоит из а-спирали на N-конце, за которой следует 8 антипараллельных ß-цепей, расположенных в виде ß-сэндвича. Из третьего домена выходит короткая полипептидная цепочка (Thr 666 - Pro 687), проходящая через домен 5 и формирующая ß-структуру перед четвертым доменом, состоящим из остатков Glu 688-Leu 861 и организованным в виде правозакрученного валика из ß-цепей, образующих структуру типа ß-сэндвич.

Положение молекулы D-галактозы в активном центре фермента было найдено при помощи разностного Фурье синтеза с использованием электронной плотности нативного фермента и комплекса ß-галактозидаза - галактоза. Разностная электронная плотность позволила встроить единственную молекулу ß-D-галактозы в районе каталитического домена в конформации кресла.

В случае ß-галактозидазы из Pénicillium sp. по положению ингибитора внутри активного центра можно полагать, что нуклеофилом является Glu 299, а кислотно-основным катализатором - Glu 200. Два этих остатка расположены на 4-м и 6-м ß-слое TIM-барреля, и среднее расстояние между их карбоксильными группами составляет 4,9 Â, что характерно для гликозидгидролаз, сохраняющих аномерную конфигурацию субстрата.

Знание пространственной структуры двух ферментов, а также структур их комплексов с природными ингибиторами позволило объяснить ферментативную реакцию, в основе которой лежит механизм двойного нуклеофильного замещения, а также определить каталитические аминокислотные остатки и устройство активных центров а-галактозидазы из Trichoderma reesei и ß-галактозидазы из Pénicillium sp.

В заключении сформулированы основные результаты и выводы, приведен список опубликованных по теме работ:

1. Golubev A.M. & Neustroev K.N. (1993) Crystallization of

a-galactosidase from Trichoderma reesei. J.Mol.Biol. 231,933 - 934.

2. Качурин A.M., Неустроев К.Н., Голубев A.M., Ибатуллин Ф.М. (1993) Химическая активация а-галактозидазы из Trichoderma reesei. Биохимия, 58, 550 - 561.

3. Kachurin A.M., Golubev A.M., Geisow M.M., Veselkina O.S., Isaeva-Ivanova L.S. & Neustroev K.N. (1995) Role of methionine in the active site of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Biochem. J. 308, 955 - 964.

4. Eneyskaya E.V., Golubev A.M., Kachurin A.M., Savel'ev A.N. & I Neustroev K.N. (1997) Transglycosylation activity of a-D-galactosidase from Trichoderma reesei. An investigation of the active

site. Carbohydr. Res. 305,83 - 91. '

5. Savel'ev A.N, Eneyskaya E.V., Isaeva-Ivanova L.S., Shabalin K.A., Golubev A.M. & Neustroev K.N. (1997) The carbohydrate moiety of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Glycoconj. J. 14, 897905.

6. Качурин A.M, Протасеня C.B, Шабалин K.A., Исаев-Иванов B.B., Голубев A.M., Неустроев K.H. (1998) Остатки триптофана в а-галактозидазе из Trichoderma reesei. Биохимия, 63, 1391 - 1399.

7. Neustroev K.N., de Sousa E.A., Golubev A.M., Brandao Neto J.R., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A. & Polikarpov I. (2000) Purification, crystallization and preliminary diffraction study of p-galactosidase from Penicillium sp. Acta Cryst. D56, 1508 -

1509.

8. Golubev A.M., Nagem R.A.P. Brandao Neto J.R., Neustroev K.N., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Shabalin K.A., Savel'ev A.N. & Polikarpov I. (2004) Crystal structure of a-galactosidase from f Trichoderma reesei and its complex with galactose: Implications to catalytic mechanism. J.MolBiol. 339, 413 - 422.

9. Rojas A.L., Nagem R.A.P., Neustroev K.N., Arand M., Adamska M., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A. Garratt R.C. Golubev A.M. & Polikarpov I. (2004) Crystal structures of P-galactosidase from Penicillium sp. and its complex with galactose. J.Mol.Biol. 345, 923 -934.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

[1] Henrissat В. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280, 309 - 316.

[2] Качурин A.M, Неустроев K.H.., Голубев A.M., Ибатуллин Ф.М. (1993) Химическая активация а-галактозидазы из Trichoderma reesei. Биохимия, 58, 550-561.

[3] Dauter Z. & Dauter M. (2001) Entering a new phase: using solvent halide ions in protein structure determination. Structure, 9,21 - 26.

[4] Polikarpov I., Oliva G., Castellano E.E., Garratt R., Arruda P., Leite A. & Craievich A. (1997) The protein crystallography beamline at LNLS, the Brazilian National Synchrotron Light Source. Nucl. lnstrum. Methods A, 405, 159-164.

[5] Amemiya Y., Matsushita Т., Nakagawa A., Satow Y., Miyahara J.& Chikawa J-I. (1988) Design and performance of an imaging plates system for X-ray diffraction study. Nuc. lnstrum. Meth. Phys. Res.A, 266,645-653.

[6] Gruner S.M. (1994) X-ray detectors for macromolecular crystallography. Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 765 - 769.

[7] Weeks C.M. & Miller R. (1999) The design and implementation of SnB v.2.0. J. Appl. Crystallog. 32,120 - 124.

[8] Knight S.D. (2000) RSPS version 4.0: a semiinteractive vector-search program for solving heavy atom derivatives. Acta Crystallog. D56, 42-47.

[9] de La Fortelle E. & Bricogne G. (1997) Maximum likelihood heavy-atom parameter refinement for the multiple isomorphous replacement and multiwavelength anomalous diffraction methods. Methods Enzymol. 276, 472 - 494.

[10] Perrakis A., Morris R.J.H. & Lamzin V.S. (1999) Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nature Struct. Biol. 6, 458 - 463.

[11] Murshudov G.N., Vagin A.A. & Dodson E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallog. D53,240 - 255.

t

I

(

»

Отпечатано в типографии ПИЯФ РАН

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 169, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 19.04.2006 г.

лообА 3S03

#-950*

f ■ «

«

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ГЛИКОЗИДГИДРОЛАЗЫ

1.1 Современная классификация гликозидгидролаз.

1.2 Каталитические механизмы действия гликозидгидролаз.

1.3 Гликозидгидролазы 27 семейства, а-галактозидазы.

1.4 Р-Галактозидазы.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА

МАКРОМОЛЕКУЛ

2.1 Кристаллизация белка.

2.2 Синхротронное рентгеновское излучение.

2.3 Приборы и методы сбора данных в кристаллографии макромолекул.

2.4 Методы решения фазовой проблемы для макромолекул.

2.5 Недостатки метода изоморфного замещения: метод быстрой криодериватизации.

2.6 Краткий обзор компьютерных программ, применяемых в работе.

ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1 Очистка и кристаллизация а-галактозидазы из мицелярного гриба Тпскос1егта гее8е1.

3.2 Окислительная активация а-галактозидазы.

3.3 Очистка и кристаллизация Р-галактозидазы из гриба Pénicillium sp. w 3.4 Получение тяжелоатомных производных кристаллов белков и сбор дифракционных данных.

3.5 Решение фазовой проблемы и построение кристаллографической модели а-галактозидазы и ее комплекса с D-галактозой.

3.6 Решение структуры Р-галактозидазы и ее комплекса с D-галактозой. ф

ГЛАВА 4. КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ И МЕХАНИЗМ

ДЕЙСТВИЯ ИЗУЧАЕМЫХ ФЕРМЕНТОВ

4.1 Качество модели и описание структуры а-галактозидазы из T.reesei.

4.2 Сравнение структур а-галактозидазы и других гликозидгидролаз.

4.3 Связывание ингибитора и строение активного центра а-галактозидазы.

4.4 Каталитический механизм действия а-галактозидазы из T.reesei.

4.5 Описание структуры Р-галактозидазы из Pénicillium sp.

4.6 Сравнение структур Р-галактозидаз из Pénicillium sp.,

E.colin T.thermophilus.

4.7 Активный центр Р-галактозидазы.

Актуальность проблемы Развитие биотехнологии сегодня является приоритетной задачей не только для повышения эффективности технологии, но, не в последнюю очередь, для решения экологических проблем. В отличие от химического производства, сопровождаемого вредными и опасными выбросами, биотехнологические процессы используют, как правило, биологические катализаторы химических реакций - ферменты. Это направление предполагает применение, как природных ферментов, так и их аналогов, свойства которых могут быть изменены в нужном направлении при помощи методов белковой инженерии.

В современной биотехнологической промышленности используются различные ферменты, в том числе гидролазы, обеспечивающие реакции расщепления различных субстратов до мономеров. Среди гидролаз, гликозидгидролазы (гликозидазы, К.Ф. 3.2.1.), катализирующие расщепление гликозидных связей, относятся к одной из самых широко применяемых и изучаемых групп ферментов. Достаточно упомянуть, что ни одно современное целлюлозно-бумажное производство не обходится без применения гликозидгидролаз. Помимо этого, гликозидазы оказались чрезвычайно эффективным инструментом энзиматического синтеза многих соединений, используемых в фармацевтике и медицине. Такое их применение основан«} на способности, при определенных условиях, обращать реакции гидролиза и катализировать реакцию трансгликозилирования - образования новых гликозидных связей. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз (действующих на концевые углеводные остатки олиго- и полисахаридов), выделенных из широкого круга организмов и успешно примененных в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ.

Энзиматический гидролиз и синтез имеют значительные преимущества перед традиционными методами органической химии, так. как позволяют получать необходимые соединения практически в одну стадию. Кроме того, при использовании реакций ферментативного синтеза удается получать строго определенные стереоизомеры с высоким выходом продуктов. Совокупность знаний о конкретном ферменте позволяет целенаправленно изменять его структуру и свойства в соответствие с научными или производственными задачами. Эффективное применение гликозидаз требует тщательного изучения их свойств, а также знаний пространственной трехмерной структуры их активного центра. Часто, информация о структуре белка и его комплекса с ингибиторами является необходимым условием для создания новых биологических препаратов и лекарств. Такой подход, от знания структуры белка - к созданию новых медицинских препаратов, названный рациональным конструированием лекарств (rational drug design), в последнее десятилетие послужил мощным стимулом для развития структурной биофизики.

Основным методом изучения трехмерной пространственной структуры ферментов и их активных центров является рентгеноструктурный анализ. Банк данных известных на сегодня белковых структур (Protein Data Bank) содержит около 12000 файлов с координатами атомов трехмерных структур белков и их комплексов с лигандами. Из них около 80% всех белковых структур получены методом дифракции рентгеновского излучения и только около 20% - методом ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Рентгеноструктурный анализ белка включает ряд необходимых стадий.

Первым этапом определения структуры является получение чистого препарата, выращивание кристаллов исследуемого белка и получение дифракционной картины рентгеновского рассеяния на кристаллах. Второй этап представляет собой поиск распределения электронной плотности в кристалле по дифракционной картине с применением разнообразных компьютерных математических методов. Конечный этап - это построение и уточнение кристаллографической атомной модели исследуемой структуры.

Интенсивность каждого отдельного дифракционного рефлекса пропорциональна квадрату модуля структурного фактора. Поэтому, измерив интенсивности рефлексов, можно получить значения модулей структурных факторов, но не фаз, необходимых для расчета электронной плотности. Принципиальная невозможность определения фаз из эксперимента является центральной проблемой в рентгеноструктурном анализе, как белков, так и малых молекул с неизвестной пространственной структурой. Основными методами решения фазовой проблемы для макромолекул в настоящее время являются:

• Метод множественного изоморфного замещения (Perutz, 1956;Blow& Crick, 1959)

• Метод молекулярного замещения (Rossmann, 1972)

• Метод мультиволновой аномальной дифракции (Hendrickson, 1991) Все три метода активно используются по отдельности или в комбинации одного с другим. Заметим, что метод молекулярного замещения требует наличия 3-х мерной структуры, гомологичного белка или, по-другому, поисковой модели структурно гомологичной исследуемому белку, причем, среднее расстояние между соответствующими атомами двух белков не должно быть большим. Метод мультиволновой аномальной дифракции требует съемки с изменением длины волны падающего рентгеновского излучения и введения в кристалл аномально рассеивающих атомов, что не всегда выполнимо.

Метод изоморфного замещения является в настоящее время основным для решения неизвестных белковых структур. Процесс расшифровки включает сбор дифракционных данных не только от кристалла нативной молекулы, но также от одного или нескольких кристаллов ее тяжелоатомных изоморфных производных. Кристаллы производных должны принадлежать той же пространственной группе, что и кристалл исходной белковой молекулы, а параметры элементарной ячейки не должны сильно различаться.

В случае успеха, положения тяжелых атомов в полученных кристаллах могут 8 быть определены, и фазовая проблема может быть решена из сравнения интенсивностей рефлексов от нативного кристалла и одной или нескольких тяжелоатомных производных. Часто, даже после получения белковых кристаллов, введение в кристалл тяжелых атомов является сложной проблемой из-за нарушения изоморфизма кристалла нативного белка и кристалла его тяжелоатомной производной. По сути, большинство используемых тяжелых атомов (Pt, Hg, U, Au и др.) при низкой концентрации и длительной экспозиции присоединяются к тем или иным реакционным группам белка и, таким образом, модифицируют исследуемую молекулу (Blundell & Jonson, 1976).

Метод быстрой криодериватизации (fast cryosoaking), предложенный

Дотером (Dauter et al., 2000), использует явление замещения молекул кристаллизационной воды на галоген (I, Вг) при непродолжительной экспозиции белкового кристалла в маточной жидкости с концентрированной солью галогена и криопротектором, препятствующим кристаллизации воды например, глицерином). В таких условиях, кристалл насыщается тяжелыми атомами галогенов, но реакция присоединения в белке пройти не успевает, а наличие криопротектора позволяет немедленно заморозить кристалл в токе холодного азота и использовать для сбора данных. При этом, если использовать рентгеновское излучение с длиной волны близкой к границе поглощения тяжелого атома, когда возможна регистрация аномального сигнала, то использование современных компьютерных методов позволяет локализовать до 50 (!) позиций связывания тяжелых атомов в макромолекуле. 9

Метод не свободен от недостатков, однако, значительно упрощает и ускоряет получение тяжелоатомных производных. В представленной работе модифицированный метод быстрой криодериватизации являлся основным средством, благодаря которому были решены две неизвестные структуры гликозидгидролаз из низших грибов T.reesei и Penicilium sp.

Цели и задачи исследования

Современная классификация всех гликозидгидролаз в 94 семейства, выполненная Хенриссатом (Henrissat, 1991) на основании гомологии их последовательностей и стереохимии катализируемой реакции оказалась весьма продуктивной. Дело в том, что ферменты из одного семейства, даже с разными каталитическими свойствами, оказались структурно гомологичными, то есть имеющими идентичный тип укладки полипептидной цепи, что было показано на примере нескольких близкородственных гликозидгидролаз, для которых известна трехмерная структура. Тем не менее, таблица Хенриссата все еще содержит много "белых пятен" в отношении структуры и детального каталитического механизма действия ферментов из отдельных семейств. Перед началом данной работы, отсутствовали данные о трехмерных структурах представителей 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз. Настоящая работа посвящена решению трехмерных структур а-галактозидазы из Trichoderma reesei (GHF 27) и (3галактозидазы из Pénicillium sp. (GHF 35), а также их комплексов с ингибиторами. Цель такого исследования - выяснение механизма работы

10 этих ферментов на молекулярном уровне с перспективой последующей модификации их свойств методами белковой инженерии. Интересный феномен окислительной активации, обнаруженный в а-галактозидазе из T.reesei, когда каталитическая активность фермента возрастала в 12 раз при химическом окислении, также мог быть объяснен только на основании решения трехмерной структуры.

Очевидно, что единственным методом, отвечающим на поставленные вопросы, является рентгеноструктурный анализ. Отсюда вытекают конкретные задачи данного исследования:

• Получить кристаллы а-галактозидазы из T. reesei и Р-галактозидазы из Pénicillium sp., а также комплексы ферментов с ингибиторами.

• Решить трехмерные пространственные структуры и на основании полученных данных выявить строение активных центров и объяснить механизм действия ферментов.

• Прояснить механизм окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei.

• Сравнить структуры а- и Р-галактозидаз для выяснения аномерной специфичности этих ферментов.

• Изучить углеводную компоненту рассматриваемых ферментов.

• Получить информацию для последующей модификации ферментов методами сайт-направленного мутагенеза для белковой инженерии.

Научная новизна полученных результатов

• Впервые решены трехмерные пространственные структуры представителей 27-го и 35-го семейств гликозидгидролаз-а-галактозидазы из T.reesei и (3-галактозидазы из Pénicillium sp., а также структуры комплексов двух изучаемых ферментов с ингибиторами.

• Все полученные трехмерные структуры депонированы в Белковый Банк Данных (Protein Data Bank).

• На основании построенных кристаллографических моделей объяснен молекулярный механизм катализа двух ферментов.

• Определены причины интересного феномена - окислительной активации а-галактозидазы из T.reesei.

• В процессе решения структур двух описываемых ферментов успешно применен модифицированный метод быстрой криодериватизации с использованием эффекта аномального рассеяния для решения фазовой проблемы, впервые предложенный Дотером (Dauter et al., 2000)

• Впервые структура белка - а-галактозидазы из T.reesei - была решена комбинацией метода быстрой криодериватизации и метода SIRAS, используюшего всего одной катионную (Cs1+) тяжелоатомную производную.

• Впервые методом быстрой криодериватизации была решена фазовая проблема для структуры белка с массой более 120000 Да-(3-галактозидазы из Pénicillium sp.

• Качество рентгеноструктурных данных' позволило изучить структуру углеводной компоненты двух исследуемых гликопротеинов.

• На основании рентгеноструктурных данных показаны причины аномерной селективности двух гликозидаз.

Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структуры и механизма действия гликозидгидролаз.

Апробация работы

Материалы работы были представлены, на следующих международных семинарах и конференциях:

1. V Congresso Ibero-Americano de Biofísica, Rio de Janeiro, RJ, Brasil, 12 a 15 de outubro de 2003.

2. XVI Reuniao da SBCr, Campus da USP/Sao Carlos, 16 a 19 de mar?o 2003

3. VI Semenário Brasileiro de Tecnología Enzimática, ENZITEC 2004, Rio de Janeiro, 5 a 7 de abril de 2004.

4. 1st Latin American Protein Society Meeting, Angra dos Reis, RJ, November 812,2004.

По теме диссертации опубликовано 9 статей в рецензируемых научных журналах.

Основные положения, выносимые на защиту

Основные положения, выносимые на защиту, приведены в разделе «Заключение».

Благодарности

Я хочу выразить признательность и огромную благодарность своему научному руководителю, профессору Владимиру Петровичу Плахтию, одному из инициаторов рентгеноструктурных' исследований протеинов в ПИЯФ РАН, за постоянную поддержку и помощь в подготовке данной работы.

Я выражаю благодарность всем сотрудникам лабораторий энзимологии и биофизики макромолекул Отделения молекулярной и радиационной биофизики, а также сотрудникам лаборатории физики кристаллов Отделения нейтронных исследований ПИЯФ РАН за многолетнее плодотворное сотрудничество, дружескую поддержку и помощь в работе.

Отдельно хочу выразить особую благодарность моему трагически погибшему коллеге Кириллу Николаевичу Неустроеву и отметить его участие в работе.

Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам профессору Игорю Владимировичу Поликарпову за сотрудничество и организацию работ в Бразильском центре синхротронного излучения, доктору Рональдо Наженю и сеньоре Адриане Рохас, (Институт физики Сан-Карлос, Университет Сан-Паулу, Бразилия), а также профессору Майклу Аранду (Институт токсикологии, Вюрцбургский Университет, Германия) за плодотворное сотрудничество по теме данной работы.

Работа выполнена при финансовой поддержке

• Программы фундаментальных исследований «Физико-химическая биология» Президиума РАН,

• Российского фонда фундаментальных исследований - РФФИ (проекты 0304-48756 и 03-04-49741),

• Национального совета по научному и технологическому развитию (Бразилия) - CNPq (Conselho Nacional de Desenvolmento Científico e Tecnologico), гранты 302125/02-7 и 300220/96-0,

• Фонда поддержки исследованиям в штате Сан-Паулу (Бразилия) -FAPESP (Funda?ao de Amparo á Pesquisa do Estado de Sao Paulo), гранты 99/03387-4, 02/14208-8 и 01/07014-0.

выводы:

1. Впервые показано, что метод быстрой криодериватизации может быть использован с применением катионов (Cs+) в качестве аномальных рассеивателей для решения фазовой проблемы в белковой кристаллографии.

Структура а-галактозидазы из Trichoderma reesei состоит из N-концевого домена типа (р/а)8-баррель и С-концевого домена типа Р-сэндвич.

Аминокислотные остатки а-галактозидазы Asp 132 и Asp 226 участвуют в катализе, причем первый в качестве нуклеофила, а второй — донора протонов, или кислотно-основного катализатора.

Эффект окислительной активации а-галактозидазы из Trichoderma reesei обусловлен перераспределением зарядов внутри активного центра фермента в результате окисления Met 258 в метионинсульфоксид. а-Галактозидаза из Trichoderma reesei является гликопротеином и содержит 4 N-связанных гликана маннозного типа, структура которых определена с атомным разрешением на основании полученных в работе дифракционных данных.

Структура Р-галактозидазы из Pénicillium sp. состоит из центрального домена типа (Р/а)8 баррель и четырех периферических доменов, содержащих Р-структуры.

7. Аминокислотные остатки Р-галактозидазы Glu 299 и Glu 200 участвуют в катализе, причем первый в качестве нуклеофила, а второй - донора протонов или кислотно-основного катализатора.

8. Р-Галактозидаза из Pénicillium sp. является гликопротеином и содержит 7 N-связанных гликанов маннозного типа, структура которых определена на основании полученных в работе дифракционных данных высокого разрешения.

9. Полученное в результате проведенного исследования знание о структурах и механизмах действия двух ферментов создает основу для изменения свойств изучаемых ферментов методами белковой инженерии.

По материалам работы были опубликованы 9 статей в рецензируемых # научных журналах:

1. Golubev, A.M. & Neustroev, K.N. (1993) Crystallization of a-galactosidase from Trichoderma reesei. J.Mol.Biol. 231, 933-934.

2. Качурин, A.M., Неустроев, K.H., Голубев, A.M., Ибатуллин, Ф.М. (1993) Химическая активация а-галактозидазы из Trichoderma reesei. Биохимия,58, 550 — 561.

Kachurin, A.M., Golubev, A.M., Geisow, M.M., Veselkina, O.S., Isaeva-Ivanova, L.S. & Neustroev, K.N. (1995) Role of methionine in the active site of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Biochem. J. 308, 955964.

Eneyskaya, E.V., Golubev, A.M., Kachurin, A.M., Savel'ev, A.N. & Neustroev, K.N. (1997). Transglycosylation activity of a-D-galactosidase from Trichoderma reesei. An investigation of the active site. Carbohydr. Res. 305, 83-91.

Savel'ev, A.N., Eneyskaya, E.V., Isaeva-Ivanova, L.S., Shabalin, K.A., Golubev, A.M. & Neustroev, K.N. (1997) The carbohydrate moiety of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Glycoconj. J. 14, 897-905.

Качурин, A.M, Протасеня, C.B, Шабалин, K.A., Исаев-Иванов, B.B., Голубев, A.M., Неустроев, K.H. (1998). Остатки триптофана в а-галактозидазе из Trichoderma reesei. Биохимия,63, 1391-1399.

Neustroev, K.N., de Sousa, E.A., Golubev, A.M., Brandao Neto, J.R., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A. & Polikarpov, I. (2000). Purification, crystallization and preliminary diffraction study of beta-galactosidase from Pénicillium sp. Acta Cryst. D, 56, 1508-1509.

8. Golubev, A.M., Nagern, R.A.P. Brandäo Neto, J.R., Neustroev, K.N., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A., Shabalin, K.A., Savel'ev, A.N. & Polikarpov, I. (2004) Crystal structure of a-galactosidase from Trichoderma reesei and its complex with galactose: Implications to catalytic mechanism. J.Mol.Biol. 339, 413-422.

9. Rojas, A.L., Nagern, R.A.P., Neustroev, K.N., Arand, M., Adamska, M., Eneyskaya, E.V., Kulminskaya, A.A. Garratt, R.C., Golubev, A.M., & Polikarpov, I. (2004) Crystal structures of ß-galactosidase from Pénicillium sp. and its complex with galactose J.Mol.Biol. 345, 923-934.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенного исследования были решены трехмерные структуры а-галактозидазы из Trichoderma reesei (GHF 27) и Р-галактозидазы из Pénicillium sp. (GHF 35), а также их комплексов с ингибиторами. Четыре трехмерные структуры высокого разрешения, полученные в результате работы, депонированы в Белковый Банк Данных (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/) и могут быть востребованы под следующими номерами:

1SZN - а-галактозидаза из Trichoderma reesei;

1ТОО - а-галактозидаза из Trichoderma reesei, комплекс с D-галактозой; 1TG7 - Р-галактозидаза из Pénicillium sp.;

1ХС6 - Р-галактозидаза из Pénicillium sp., комплекс с D-галактозой.

На основании выполненного исследования могут быть сделаны следующие

1. Abrahams, J.P. & Leslie, A.G.W. (1996) Methods used in the structure determination of bovine mitochondrial Fl ATPase. Acta Crystallog. D, 52, 30-42.

2. Amemiya, Y., Matsushita, T., Nakagawa, A., Satow, Y., Miyahara, J. & Chikawa, J-I. (1988) Design and performance of an imaging platesystem for X-ray diffraction study. Nuc. Instrum. Meth. Phys. Res. A, 266, 645 653.

3. Bagnis, C., Chabannon, C. & Mannoni, P. (1999) Beta-galactosidase marker genes to tag and track human hematopoietic cells. Cancer Gene Ther. 6, 3 — 13.

4. Baker, P.J., Farrants, G.W., Stillman, T.J., Britton, K.L., Helliwell, J.R. & Rice, D.W.(1990) Isomorphous replacement with optimized anomalous scattering applied to protein crystallography. Acta Cryst. A, 46, 721 725.

5. Blow, D.M. & Crick, F.H.C. (1959) The Treatment of Errors in the Isomorphous Replacement Method. Acta Cryst. 12, 1195 1202.

6. Blundell, T.L. & Jonson, L.N. (1976) Protein crystallography, Academicpress, New York, London, San Francisco.103

7. Blundell, T.L. (2005) Advances in the uses of synchrotron X-ray and proton beams in structural biology. Progress Biophys. Mol. Biol. 89, 121 — 123.

8. Bourne, Y. & Henrissat, B. (2001) Glycoside hydrolases and glycosyltransferases: families and functional modules. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 593-600.

9. Brady, R.O., Gal, A.E., Bradley, R.M., Martensson, E., Warshaw, A.L. & Laster, L. (1967) Enzymatic defect in Fabry's disease. Ceramide trihexosidase deficiency. N. Engl. J. Med. 276, 1163 1167.

10. Briinger , A.T.(1992) Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of crystal structures. Nature, 1992, 355, 472-475.

11. Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (2000) CAZy — Carbohydrate-Active enZYmes (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/).r

12. Dauter, Z., Dauter M. & Rajashankar, K.R. (2000) Novel approach to phasing proteins: derivatization by short cryo-soaking with halides. Acta Crystallogr D, 56, 232 237.

13. Dauter, Z. & Dauter, M. (2001) Entering a new phase: using solvent halide ions in protein structure determination. Structure, 9, 21 26.

14. Desnick, R.J., Ioannou, Y.A., & Eng, C.M. (2001) a-Galactosidase A deficiency: Fabry disease. In The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Eighth Edition, C.S. Scriver eds., New York, McGraw-Hill, pp. 3733 3774.

15. Enzyme Nomenclature. Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes. (1992) San Diego: Academic Press;, pp 862 880.

16. Elgavish, S. & Shaanan, B. (1998) Structures of the Erythrina corallodendron lectin and of its complexes with mono- and disaccharides. J.Mol.Biol 277, 917 932.

17. Eng, C.M., Guffon, N., Wilcox, W.R., Germain, D.P., Lee, P., Waldek, S., Caplan, L., Linthorst, G.E., & Desnick, R.J. (2001) Safety and efficacy of recombinant human a-galactosidase. A replacement therapy in Fabry's disease. N. Engl J. Med. 345, 9-16.

18. Fabry, J. (1898) Ein Beitrag Zur Kenntnis der Purpura haemorrhagica nodularis (Purpura papulosa hemorrhagica Habrae) Arch. Dermatol Syph. 43, 187.

19. Feher, G & Kam, Z. (1985) Nucleation and growth of protein crystals: general principles and assays. Methods Enzymol. 114, 77 112.

20. Fujimoto, Z., Kaneko, S., Momma, M., Kobayashi, H. & Mizuno, H. (2003) Crystal structure of rice a-galactosidase complexed with D-galactose. J. Biol Chem. 278, 20313-20318.

21. Garman, S.C., Hannick, L., Zhu, A. & Garboczi, D.N. (2002) The 1.9 A structure of a-N-acetylgalactosaminidase: molecular basis of glycosidase deficiency diseases. Structure, 10, 425 -434.

22. Goldstein, J., Lenny, L., Davies, D., & Voak, D. (1989) Further evidence for the presence of A antigen on group B erythrocytes exthrough the use of specific exoglycosidases. Vox Sang. 57,142 146.

23. Gruner, S.M. (1994) X-ray detectors for macromolecular crystallography. Curr. Opin. Struct. Biol 4, 765 769.

24. Haas, D.J. & Rossman, M.G. (1970) Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75°C . Acta. Cryst. B, 26, 998 1004.

25. Harker, D. (1956.) The determination of the phases of the structure factors of non-centrosymmetric crystals by the method of double isomorphous replacement Acta. Cryst. 9, 1 -9.

26. Hashimoto, H., Katayama, G., Goto, M., Okinaga, T. & Kitahata, S. (1991) Purification and some properties of a-galactosidase from Pseudomonasfluorescens H-601, Agric. Biol. Chem. 55, 2831 -2838.

27. Helliwell, J.R. (1992) Chapter 5: SR instrumentation. In Macromolecular

28. Crystallography with Synchrotron Radiation., Cambridge University Press, Cambridge, pp. 136 243.

29. Hendrickson, W. A. (2000) Synchrotron crystallography. TIBS, 25, 637 643.

30. Henrissat, B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280, 309 — 316.

31. Holm, L. & Sander, C. (1996) Mapping the protein universe. Science, 273, 595-602.

32. Hope, H., (1990) Crystallography of biological macromolecules at ultra-low temperature. Ann. Rev. Biphys. Chem. 19, 107- 126.

33. Jacobson, R.H., Kuroki, R., Weaver, L.H., Zhang, X.-J. & Matthews, B.W. (1995) Enzymatic degradation of insoluble carbohydrates, Saddler & J.N., Penner M.H. Eds., ACS Symposium Series, Vol. 618, American Chemical Society, Washington, pp. 38 45.

34. Jacobson, R. H., Zhang, X-J. , DuBose, R. F. & Matthews, B. W. (1994) Three-dimensional structure of P-galactosidase from E. coli. Nature, 369, 761 -766.

35. Jancaric, J., & Sung-Hou, K. (1991) Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J.Appl. Cryst. 24, 409 -411.

36. Kachurin, A.M., Golubev, A.M., Geisow, M.M., Veselkina, O.S., Isaeva-Ivanova, L.S. & Neustroev, K.N. (1995). Role of methionine in the active site of a-galactosidase from Trichoderma reesei. Biochem. J. 308, 955 — 964.

37. Karle, J. & Hauptman, H. (1956) A theory of phase determination for the four types of non-centrosymmetric space groups 1P222, 2P22, 3P12, 3P22 Acta Cryst. 9, 635-651.

38. Knight, S.D. (2000) RSPS version 4.0: a semiinteractive vector-search program for solving heavy atom derivatives. Acta Crystallog. D, 56, 42-47.

39. Kolatkar, A.R., Leung, A.K., Isecke, R., Brossmer, R., Drickamer, K. & Weis, W.I. (1998) Mechanism of N-acetylgalactosamine binding to a C-type animal lectin carbohydrate-recognition domain. J. Biol. Chem. 273, 19502- 19508.

40. Koshland, D.E. (1953) Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Revs. Cambridge. Phil. Soc. 28, 416-436.

41. Kraulis, P.J. (1991) MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein structures. J. Appl. Crystallog. 24, 946 950.

42. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680 685.

43. Laskowslci, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. & Thornton, J.M.1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality ofprotein structures. J. Appl. Crystallog. 283, 291 -302.1.l

44. Lenny, L.L., Hurst, R., Zhu, A., Goldstein, J., & Galbraith, R.A. ; q (1995) Multiple-unit and second transfusions of red cells enzymaticallyconverted from group B to group O: report on the end phase 1 trials. Transfusion, 35, 899 902.

45. Leparoux, S., Padrines, M., Placier, G. & Colas, B. (1997) Characterization ^ of a strictly specific acid P-galactosidase from Achatina achatina. BBA,1336, 522-532.

46. Ly, H.D. & Withers, S.G. (1999) Mutagenesis of glycosidases. Annu. Rev. Biochem. 68,487 522.

47. Margolles-Clark, E., Tenkanen, M., Luonteri, E. & Penttila, M. (1996) Three a-galactosidase genes of Trichoderma reesei cloned by expression in yeast. Eur. J. Biochem. 240,104 -111.

48. McCarter, J. D. &Withers, S. G. (1994) Mechanisms of enzymatic glycosidase hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4, 885 892.

49. McPherson, A. (1998) Crystallization of Biological Macromolecules, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

50. McRee, D.E. (1999) XtalView/Xfit—a versatile program for manipulating atomic coordinates and electron density. J. Struct. Biol. 125, 156- 165.

51. Miller, R. Gallo, S.M., Khalak, H.G. & Weeks, C.M. (1994) SnB¡Crystal structure determination via Shake-and-Bake. J.Appl.Cryst. 27, 613 621.

52. Mizuguchi, K., Deane, C.M., Blundell, T.L. & Overington, J.P. ^ (1998) HOMSTRAD: a database of protein structure alignments forhomologous families. Protein Science, 7, 2469 2471.t'

53. Murray, J. & Garman, E. (2002) Investigation of possible free-radical cavengers and metrics for radiation damage in protein cryocrystallography. J. Synchrotron. Radiat. 9, 347 54.

54. Murshudov, G.N., Vagin, A.A. & Dodson, E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallog. D, 53, 240 255.

55. Nagern, R.A.P., Dauter, Z. & Polikarpov, I. (2001) Protein crystal structure solution by fast incorporation of negatively and positively anomalous scatterers. Acta Crystallogr. D, 57, 996 1002.

56. Navaza, J. (1994) AMoRe: an automated package for molecular replacement. Acta Crystallog. A, 50, 157 163.- ^ 67. Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997) Processing of X-ray diffraction datacollected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307 326.

57. Perrakis, A., Morris, R.J.H. & Lamzin, V.S. (1999) Automated proteinf'model building combined with iterative structure refinement" Nature Struct. Biol. 6 458-463.0 71. Perutz, M.E. (1956) Isomorphous Replacement and Phase Determination in

58. Noncentrosymmetric Space Groups. Acta Cryst. 9, 867 873.114

59. Phillips, J.C. ,Wlodawer, A., Yevitz, M.M. & Hodgson, K.O. (1976) Applications of synchrotron radiation to protein crystallography: preliminary results. Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 73, 128 132.

60. Pivarnik, L.F., Senecal, A.G., & Rand, A.G. (1995) Hydrolytic and transgalactosylic activities of commercial (3-galactosidase (lactase) in food processing. Adv Food Nutr Res. 38, 1 -102.

61. Polikarpov, I., Oliva, G., Castellano, E.E., Garratt, R., Arruda, P., Leite, A. & Craievich, A. (1997) The protein crystallography beamline at LNLS, the Brazilian National Synchrotron Light Source. Nucl Instrum. Methods A, 405, 159-164.

62. Qin, G., Takenaka, T., Telsch, K., Kelley, L., Howard, T., Levade, T., Deans, R., Howard, B.H., Malech, H.L., Brady, R.O. & Medin, J.A. (2001) Preselective gene therapy for Fabry disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3428-3433.

63. Read, R.J. (1986) Improved Fourier coefficients for maps using phases from partial structures with errors. Acta Cryst. A, 42, 140-149.

64. Reid, J.S.G. (1995) Galactomannan. Biochemistry of storage carbohydrates in green plants., P.M. Dey & R.A. eds., Dixon. London. Academic Press.

65. Ren, Z., Bourgeois, D., Helliwell, J.R., Moffat, K., Srajer, V. & Stoddard, B.L. (1999) Laue crystallography: coming age. J. Synchrotron Rad. 6, 891 — 917.

66. Rosenbaum, G., Holmes, K.C. & Witzet, J. (1971) Synchrotron radiation as a source for X-ray diffraction. Nature, 230, 434 437.

67. Rossmann, M.G. (1972) The Molecular Replacement Method., Gordon & Breach eds.; New York, London, Paris.

68. Rye, C.S. & Withers, S.G. (2000) Glycosidase mechanisms. Curr. Opin. Chem Biol 4, 573 580.

69. Schiffmann, R., Kopp, J.B., Austin, H.A.,III, Sabnis, S., Moore, D.F., Weibel, T., Balow, J.E. & Brady, R.O. (2001) Enzyme replacement therapy in Fabry disease: a randomized controlled trial. JAMA, 285, 2743 2749.

70. Shindyalov, I.N. & Bourne, P.E. (1998) Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path. Protein Eng. 11,739-747.

71. Sinnott, M.L. (1990) Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer.• Chem. Rev. 90, 1171 1202.

72. Stirk, HJ., Woolfson, D.N., Hutchinson, E.G. & Thornton, J.M. (1992) Depicting topology and handedness in jelly roll structures. FEBS Letters, 308, 1-3.

73. Strohmeier, M., Hrmova, M., Fischer, M., Harvey, A.J., Fincher, G.B. & Pleiss, J. (2004) Molecular modeling of family GH16 glycoside hydrolases:s