1→3-β-D-Глюканазы моллюсков Японского и Южно-Китайского морей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Захарепко Александр Михайлович

•3-(!-0-Глюканазы моллюсков Японского и Южно-Китанского морей

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 6 ИЮН 2011

Владивосток-2011

4850557

Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН, г. Владивосток

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Звягинцева Т.Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Косте цкий Э.Я.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Мензорова Н.И.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова, г. Санкт-Петербург

Защита состоится 23 июня 2011г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Учреждении Российской академии наук Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232) 314-050. e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г.Владивосток, пр-т 100-лет Владивостоку, 159, ДВГИ ДВО РАН). Текст автореферата размещен на сайте совета http://www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан " 20 " мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Интерес к l-O-ß-D-глюканазам связан с их важной ролью в жизнедеятельности микро- и макроорганизмов. Функции, выполняемые этими ферментами, чрезвычайно разнообразны. 1->3-р-0-Глюканазы микроорганизмов принимают участие в утилизации углеводсодержащих биополимеров, ферменты также играют важную роль в пищеварении беспозвоночных, репродуктивных процессах и защитных реакциях различных организмов. Морские беспозвоночные, представленные большим количеством видов, отличающихся друг от друга способом питания и образом жизни, являются богатыми и сравнительно доступными источниками l-»3-ß-D-rrnOKana3.

Субстратами для этих ферментов служат l->3-ß-D-raioKanbi и смешанные 1->3;1->4 и 1-*3;1—>б-р-0-глюканы, которые чрезвычайно широко распространены в природе. Эти полисахариды известны как иммуномодуляторы, радиопротекторы, антифунгапьные и антиопухолевые соединения. Перспективным является использование 1—»З-Р-О-глюканаз для ферментативной трансформации глюканов из различных природных источников с целью их стандартизации и увеличения биологической активности. Поэтому актуальным остается изучение как полисахаридов, так и ферментов, катализирующих их трансформацию.

Цель и задачи исследования. Цель исследования - установить структурно-функциональные связи для некоторых l->3-ß-D-raiOKaHa3 морских моллюсков, обитающих в различных экорегионах. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить уровень О-гликозидгидролаз в пищеварительных органах морских беспозвоночных, обитающих в прибрежных водах Социалистической Республики Вьетнам.

2. Выбрать объекты для выделения индивидуальных 1—>3-ß-D-niiOKaHa3.

3. Разработать методы очистки 1—»3-ß-D-raiOKaHa3 из двух видов моллюсков: Рсгпа viridis и Tapes literata.

4. Исследовать свойства, специфичность и тип действия новых 1->3-Р-0-глгокапаз.

5. Методами молекулярной биологии установить аминокислотную последовательность 1—»3-ß-D-raK>Kana3 из двух видов моллюсков: Р. viridis и Т. literata.

6. Провести сравнительный анализ свойств и структуры новых ферментов с известными.

7. Определить способность О-гликозидгидролаз из морских объектов дегликозилировать гликозиды изофлавоноидов.

8. Охарактеризовать водорастворимые полисахариды зеленых водорослей рода Caulerpa.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В пищеварительных органах морских беспозвоночных Южно-Китайского моря содержатся активные О-гликозидгидролазы: 1->3^-0-глюканазы, фукоиданазы, гликозидазы.

2. 1—»З^-О-Глюканазы из кристаллических стебельков морских моллюсков Р. viridis и Т. literata классифицированы как глюкан эндо-1->3^-0-глюкозидазы (КФ 3.2.1.39) и, согласно гомологии аминокислотной последовательности, отнесены к 16-ому структурному семейству О-гликозидгидролаз.

3. Выделенные 1—»З-р-О-глюканазы обладают высокой трансгликозилирующей способностью и могут использоваться для получения новых гликоконъюгатов.

4. Показано, что температурная стабильность ферментов хорошо коррелирует с числом дисульфидных мостиков.

5. ß-D-Глюкозидаза из морского брюхоногого моллюска Littorina sitkana способна катализировать гидролиз гликозидов изофлавоноидов.

6. Новые 1—>3-ß-D-rmoKaHbi, выделенные из зеленой водоросли Caulerpa ¡entillifera отличаются от известных ламинаранов более высокой молекулярной массой.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проведена оценка состава и уровня активности О-гликозидгидролаз в пищеварительных органах морских беспозвоночных, обитающих в прибрежных водах Социалистической Республики Вьетнам. Впервые из двух видов вьетнамских промысловых моллюсков Р. viridis и Т. ¡itérala выделены гомогенные 1->3-Р-0-глюканазы. Определены свойства, специфичность, тип действия ферментов. Анализ продуктов реакций гидролиза и трансгликозилирования, катализируемых эндо-1-»3-Р-0-глюканазами, проведен методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии. На основании гомологии аминокислотной последовательности эндо-1—»З-р-О-глюканазы отнесены к 16 семейству 0-гликозидгидролаз. Показана возможность практического применения 3hflo-l->3-ß-D-глюканаз для синтеза новых углеводсодержащих соединений, а ß-D-глюкозидазы из L. sitkana для энзиматического дегликозилирования гликозидов изофлавоноидов с целью повышения их антиопухолевой активности. Впервые охарактеризован состав водорастворимых полисахаридов зеленых водорослей рода Caulerpa.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на:

Третьей международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008) и 1 st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences (Vladivostok, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы. Список литературы включает 170 публикаций. Диссертация изложена на 110 стр. и содержит 17 таблиц и 34 рисунка.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектом исследования являются О-гликозидгидролазы - ферменты углеводного обмена, очень широко распространенные в природе. О-гликозидгидролазам присвоен 171 КФ номер, установлены 36545 первичных структуры и 2286 третичных. Эти ферменты являются удобной моделью для исследований, на их примере решались и решаются многие проблемы энзимологии.

1 Поиск источников l->3-ß-D-rnioKaiia3 среди морских беспозвоночных ЮжноКитайского моря

Проведен поиск О-гликозидгидролаз (]->3-ß-D-nnoKaHa3, фукоиданаз, гликозидаз) среди 14 наиболее распространенных видов морских беспозвоночных Южно-Китайского моря. 1->3^-0-Глюканазы присутствали во всех исследованных видах, фукоиданазы и гликозидазы обнаружены в пищеварительных органах морских ежей, моллюсков, червей и голотурий. Максимальная активность 1—>3-р-0-глюканазы обнаружена в кристаллических стебельках мидии Р. viridis и двустворчатого моллюска Т. literata. Эти моллюски были выбраны как основные объекты исследования.

2 1—>3-ß-D-r\iioKaiia ia промысловой мидии Южно-Кнтанского моря Perna viridis

Анализ содержания ферментов в экстракте кристаллического стебелька мидии Р. viridis показал, что l->3-ß-D-nnoKaHa3a является наиболее активным ферментом. Активность других глюканаз, катализирующих гидролиз амилопектина, КМ-целлюлозы и пустулана была незначительной (6,4%; 4%; 0,2%, соответственно) в сравнении с активностью по ламинарану (100%). Гликозидазы в экстракте отсутствовали.

Схема очистки 1—>3-Р-0-глюканазы оказалась достаточно простой и включала стадии катионнообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и гельфильтрации на сефадексе й-75 (таблица 1).

Высокая концентрация 1—»З-р-О-глюканазы и практическое отсутствие других ферментов в исходном экстракте позволили при небольшой степени очистки (в 6,4 раз) получить фермент, гомогенный по данным БОБ-электрофореза, имеющий молекулярную массу 33 кДа (рисунок 1). Выход фермента составил 10,6%.

Таблица 1 - Очистка 1 ->3-

З-Р-глюканазы из кристаллического стебелька Р. viridis

Стадия очистки Общий белок, мг/мл Общая активность, ед.акт. Удельная активность, ед.акт./мг белка Степень очистки (раз) Выход, %

Экстракция 89,1 22,6 0,25 1 100

Ионообменная хроматография на КМ-целлюлозе 11,7 11,6 1,0 4 51,2

Гельфильтрация на сефадексе G-75 1.5 2,4 1,6 6,4 10,6

1—>3-Р-0-Глюканаза проявляла максимальную активность в широком диапазоне pH: от 4 до 6,5 и при температуре 45 "С. Время полуинактивации фермента (понижения активности на 50%) при 45 "С составляло 180 мин, при 50 °С оно уменьшалось до 20 мин.

Кт для гидролиза ламинарана была рассчитана по методу Лайнуивера-Берка и составляла 0,3 мг/мл, что является характерной величиной для 1—»3-ß-D-глюканаз из различных источников. Так для 1—»3-ß-D-глюканазы из морского гриба Trichoderma aureviride Кш составляет 0,3 мг/мл, для 1—»3-ß-D-глюканаз морских моллюсков Л0, Л1У и ЛУ - 0,7; 0,25 и 0,6 мг/мл, соответственно.

Изучение специфичности 1—>3^-Б-глюканазы из Р. viridis показало (таблица 2), что она расщепляла ß-1—>3-связи в смешанных 1—>3;1^6-ß-D-глюканах: с высокой скоростью гидролизовала ламинаран и транслам, слабо - дрожжевой глюкан, не гидролизовала высокомолекулярные и плохо растворимые глюканы, такие как пахиман и аубазидан. Высокоочищенные глюканы с другим типом связи (пустулан, амилопектин и КМ-целлюлоза) гидролизу не подвергались. Различная скорость гидролиза хорошо растворимых глюканов ламинарана и транслама, по-видимому, связана с особенностями структуры этих глюканов. В молекуле транслама, полученного ферментативной трансформацией природного ламинарана, ß-1—Несвязанные остатки глюкозы присутствуют как в виде включений в основную цепь глюкана, так и в виде разветвлений, и сосредоточены на невосстанавливающем конце молекулы.

Рисунок 1 - SDS-электрофорез в полиакриламидном геле: (1)-очищенная 1->3-Р-Р-глк>каназа из кристаллического стебелька Р. viridis, (2)-маркеры

Таблица 2 - Специфичность 1—>3-Р-Р-глюканазы из кристаллического стебелька Р. viridis

Субстрат Тип связи, соотношение Молекулярная масса, кДа. Растворимость Активность, %

Ламинаран ß-1—>3; 1-»6 90:10 5-6 Раств. 100

Периодатно-окисленный ламинаран ß-l->3 5-6 Раств. 100

Транслам ß-1—»3; I-»6 75:25 8-10 Раств. 32,1

Дрожжевой глюкан ß-l-»3; l->6 90:10 >200 Слабо раств. 1,6

Пахиман ß-l->3; l->6 98:2 50-120 Слабо раств. 0

Аубазидан ß-l->3; l-»6 50:50 500-550 Слабо раств. 0

Пустулан ß-1 30 Раств. 0

Амилопектин a-l-»4; a-1—>6 2000 Раств. 0

КМ-целлюлоза ß-1-^4 >2000 Раств. 0

В молекулах ламинарана разветвления в виде ß-1-Несвязанных остатков глюкозы относительно равномерно распределены по всей цепи 1—»З-Р-Ц-глгокана. Можно предположить, что 1—»З-р-О-глюканаза предпочтительно атакует Р-1н>3-связи, расположенные вблизи невосстанавливающего конца субстрата, поэтому наличие в трансламе разветвлений в этой части молекулы замедляет скорость его расщепления по сравнению с ламинараном.

Модификация восстанавливающего и невосстанавливающего концов в молекуле ламинарана (периодатно-окисленный ламинаран) не изменяла скорости его гидролиза 1 —»З-Р-О-глюканазой из Р. viridis (таблица 2) по сравнению с исходным ламинараном. Это типичная картина для ферментов эндо-типа действия, которые расщепляют внутренние

связи в молекуле глюкана. Как известно, экзо-1—>3-ß-D-nnoKana-зы, последовательно отщепляющие глюкозу (реже дисахарид) с невосстанавливающего конца глюкана, не гидролизуют периода-тно-окисленный ламинаран.

Анализ продуктов гидролиза ламинарана 1->3-р-0-глюканазой из Р. viridis проводили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (рисунок 2). При степени гидролиза субстрата около 20% в продуктах реакции были обнаружены глюкоза и глюкоолигосахариды различной степени полимеризации. В спектрах наблюдали пики с m/z [M+Naf: Glc, (203,3), Glc2 (365,2), GIc3 (527,2), Glc4

-Uli

Рисунок 2 - MALDI-TOF масс-спектр продуктов гидролиза ламинарана 1—>3-Р-0-глюканазой из кристаллического стебелька Р. viridis

а

Г

Y К !\

(689,2), G1c5 (851,3), Glc6 (1013,5), Glc, (1175,7), Glc« (1338,0), Glc, (1501,0), GlcHI ( 1662,3), Glcu (1825,5), Glc,2(1987.6), Glc13 (2150,6), Glc,„ (2312,4).

Степень расщепления ламинараиа при исчерпывающем гидролизе 1—>3-ß-D-глюканазой из Р. viridis достигала 74%. Согласно данным ВЭЖХ, основными продуктами при данной глубине гидролиза являлись глюкоза, ди-, три- и тетрасахариды (рисунок 3). Состав продуктов подтверждает, что 1—>3-ß-D-nnoKana3a катализирует гидролиз внутренних связей в молекуле глюкана, т.е. является ферментом эндо-типа действия.

Для подтверждения специфичности выделенного фермента к гидролизу ß-1—>3-связей было проведено сравнение спектров ПМР ламинарана и продуктов его ферментативного гидролиза. Показано, что в спектрах ламинарана (рисунок 4А) присутствует дублет аномерного протона Н1 4,98 м.д. (./=7,9 Гц), относящийся к ß-1-^З-связанным остаткам глюкозы, и группа сигналов в области 4,44 - 4,35 м.д., которая соответствует аномерным протонам ß-1—>6-связанных остатков глюкозы. В спектре продуктов ферментативного гидролиза ламинарана (рисунок 4Б) наблюдается увеличение интенсивности сигналов восстанавливающих остатков глюкозы а (5,32 м.д.) и ß (4,76 м.д.), слабо выраженных в спектре нативного ламинарана, что свидетельствует о расщеплении молекулы полисахарида.

Кроме того, после ферментативного гидролиза в спектре увеличивается количество сигналов в области 5,01-4,95 м.д., соответствующих аномерным протонам ß-1—»3-связанных остатков глюкозы, входящих в состав образующихся олигосахаридов. Сигналы аиомерных протонов ß-l->6-cвязaнныx остатков глюкозы 4,44 - 4,35 м.д. не претерпевают изменений после проведения ферментативного гидролиза ламинарана.

Как известно, гидролиз гликозидных связей под действием глюканаз проходит с обращением или сохранением конфигурации связи. Для установления типа действия фермента, кинетика реакции гидролиза ламинарана была исследована методом ЬС ЯМР спектроскопии (рисунок 5). На рисунке приведен спектр исходного ламинарана в области от 50 до 110 м.д. На спектре, соответствующем 15 мин реакции, появляются новые сигналы в области 97,2 м.д., которые соответствуют С-1 с ß-конфигурацией гликозидной связи. При продолжении реакции сигнал 97,2 м.д., соответствующий ß конфигурации, растет и появляется новый сигнал в области 93,7 м.д., что соответствует сигналу С-1 с а-конфигурацией связи. Сигнал, соответствующий С-1 остатка глюкозы с а-конфигурацией гликозидной связи, появляется позже, как следствие мутаротации связи, следовательно, фермент гидролизует связь с сохранением её конфигурации.

Рисунок 3 - ВЭЖХ продуктов исчерпывающего гидролиза ламинарана 1 —>3-[VD-rinoKaii;noii из

кристаллического стебелька Р. viridis. G -глюкоза, Gz - биоза, Gj - триоза, G. - гетраоза

Рисунок 4 - 'Н ЯМР спектры ламинарана (А) и продуктов гидролиза ламинарана 1—>3-ß-D-глюканазой из кристаллического стебелька Р. viridis (Б)

L . У к 1 ijü 1 !

'7 'Ъ 1S min J •i № ii 1 1 1 }2 1 Г ' Ä ' ... .. .. J ' Л ' 1 г г •V 1 * i? Й »V T'T' "3

" I 30 min | 1 " •.// ' ' ' SS <-r vi™,' | Я У V Ui X? * 1 <.'(? # .K

' § 4S min j iOS W >} 1 ¿1 >0 I j .! tW i L t liÄj Uü 1 ?»? :» .5?

Рисунок 5 - "С ЯМР спектры ламинарана (0 мин) и продуктов гидролиза ламинарана 1—>3-ß-D-глюканазой из кристаллического стебелька Р. viridis, записанные через 15, 30 и 45 мин после

начала реакции

Известно, что эндо-1^3-р-0-глюканазы из кристаллических стебельков морских моллюсков, являясь типичными гидролазами, обладают повышенной, по сравнению с наземными ферментами, способностью к реакциям трансгликозилирования, т.е. к

реакциям переноса гликоновой части субстрата не только на воду (реакция гидролиза), но и на различные гидрокснлсодержащие вещества (реакция трансгликозилирования).

Методом ВЭЖХ нами было установлено, что 1—>3-ß-D-nnOKana3a из Р. viridis также эффективно катализирует процесс трансгликозилирования, протекающий с образованием и-нитрофенил-пиокоолигозидов (рисунок 6). Анализ состава продуктов на различных стадиях реакции показал картину, характерную для действия эндо-ферментов: наблюдается первоначальное образование более крупных и-нитрофенил-глюкоолигозидов и последующее превращение их в более короткие олигомеры в процессе вторичного гидролиза.

Исследование реакции

трансгликозилирования было проведено более детально с использованием ESI и MALDI-масс-спектрометрии. Неоспоримым преимуществом этого метода является возможность одновременно регистрировать продукты гидролиза и трансгликозилирования.

Для того, чтобы получить количественные данные о продуктах реакции гидролиза из данных масс-спектрометрии, нами была изучена кинетика реакции гидролиза двумя методами одновременно: методом гельфильтрации и масс-спектрометрии. Продукты реакции были

проанализированы методом

гельфильтрации на автоматическом анализаторе (колонка с биогелем Р-2). Эта же реакционная смесь была проанализирована с помощью ESI-масс-спектрометрии (рисунок 7). Были вычислены площади пиков

хроматограммы после гельфильтрации, соответствующие отдельным продуктам реакции, и эти данные сопоставлены с ESI-масс-спектром. На основании полученных результатов были вычислены поправочные коэффициенты для отдельных олигосахаридов, которые позволили количественно оценивать их время,мин содержание в ESI-масс-спектрах.

Кинетика накопления низкомолекулярных продуктов реакции, с учетом поправочных коэффициентов согласно данным ESI-масс спектров, приведена на рисунке 8.

Видно, что основными продуктами гидролиза являются моно- и дисахариды, что типично для глюканаз морских беспозвоночных. Интересно отметить, что после исчерпывающего гидролиза количество тетрасахаридов было больше, чем трисахаридов, а количество глюкозы изменялось линейно с момента начала гидролиза. Согласно графику, в процессе реакции нет задержки в накоплении глюкозы. Отсутствие лаг-периода означает, что глюкоза - продукт первичной атаки.

Рисунок 6 - ВЭЖХ продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой 1—»3-ß-D-

глюканазой из кристаллического стебелька Р. viridis. NpGi -л-нитрофенил-р-О-глкжоплранозид, NpG„ - л-нитрофенил-глюкоолигозиды. (А) 10 мин, (Б) 30 мин, (В) 24 час. Пик и-нитрофенола выходит на 30 мин

х10"3м

Рисунок 7 - EST-Масс-спектр продуктов гидролиза ламинарана, 15 мин (А) и гельфильтрация продуктов гидролиза ламинарана, на колонке с биогелем Р-2,15 мин (Б)

Через 24 часа реакции концентрация глюкозы составляла -4x10"3 моль/мл, что соответствовало примерно 70% гидролиза ламинарана. Количество олигосахаридов со степенью полимеризации >3 постепенно уменьшалось после 40 мин реакции. Это свидетельствует о том, что фермент медленно деполимеризовап олигосахариды со степенью полимеризации 4 и 5. Низкая скорость их гидролиза, возможно, связана с тем, что в структуре олигосахаридов могут содержаться ß-1-^б-гликозидные связи, присутствующие в исходном ламинаране. Кроме того, скорость гидролиза олигосахаридов под действием эндо-ферментов падает с уменьшением степени полимеризации субстрата.

1 ->3-Р-0-Глюканаза из Р. viridis подобно другим глюканазам

морских моллюсков

ингибировалась халистанол сульфатом 050 =1,26х10"4 М) стерином выделенном из тропической губки. Интересно отметить, что 1—>3-ß-D-nnoKaHa3a из Р. viridis более устойчива к действию этого природного метаболита: для понижения ее активности на 50% необходима концентрация халистанол сульфата на два порядка выше, чем для других 1—>3-р-0-глюканаз морских моллюсков, обитающих в Японском море..

Исследование первичной структуры фермента проводили методами генной инженерии. кДНК сиквенс эндо-1-»3^-0-глюканазы из мидии Р. viridis был проведен быстрой амплификацией кДНК концов (RACE методом) и внесен в генетическую базу

[Glc+Na]

[Glc2+Na]

[Glc«+Naf : [GICj+Na] : [Glc6+Naf

"I 5 10 20 30 40min 24h Рисунок 8 - Кинетика гидролиза ламинарана 1—»3-ß-D-глюканазой из кристаллического стебелька Р. viridis

данных (GcnBank) под номером FJ623758. кДНК состоит из 1380 нуклеиновых оснований с открытой рамкой считывания; 1332 нуклеиновых основания кодируют 443 аминокислотных остатка. Зрелый белок начинается со 118 аминокислотного остатка и состоит из 328 аминокислотных остатков. N-Концевая аминокислотная последовательность белка (AVVFRDDFHSFNKGS) полностью совпадает с N-концевой последовательностью фермента, определенной по методу Эдмана. Анализ аминокислотной последовательности эндо-1—>3-Р-0-глюканазы из мидии Р. viridis, проведенный с помощью программы SMART tool (http://smart/cmbl-licidclbcrg.dc), позволил отнести белок к 16 семейству О-гликозидгидролаз CAZy.

Результаты поиска в базе данных BLAST2 показали высокую гомологию аминокислотной последовательности эндо-1—>3-Р-0-глюканазы из мидии Р. viridis с эндо-1—»З-Р-О-глюканазами гребешков М. yessoensis (GeneBank номер AY848857) и Ch. albidus (GeneBank номер DQ093347) (53% идентичности, 68% и 66% гомологии, соответственно), и с эндо-1—»З-Р-Э-глюканазой из двустворчатого моллюска Р. sachaünensis (GeneBank номер ААР74223) - 43% идентичности и 58% сходства. Несколько меньшая гомология (30% идентичности и 40% сходства) была получена при сравнении с аминокислотной последовательностью бактериальной 1—^-ß-D-глкжаназы.

ш i ......

»тквйфтЬв нфщкадафч i - .

ч ..l.'A i- -a w: -mi|i

'■Bilili

рт^фг^-фл-

HSßswtj

Рисунок 9 - Множественное выравнивание аминокислотной последовательности эндо-1—>3-ß-D-глюканаз беспозвоночных и бактерий. P fur - Pyrococcus furiosas (GeneBank AAC25554), Bxyl - Bursaphelenchus xylophilus (BAE02683), R mar - Rhodothermus marinas (AAC69707), C_alb - Chiamys albidus (DQ093347), M_yes - Mizuchopeclen yessoensis (AY848857), P_vir - Perna viridis (FJ623758), P sach - Pseudocardium sachalinensis (AAP74223), H arm - Helicoverpa armígera

(ABU98621)

Множественное выравнивание последовательностей 1—>3-ß-D-nnoKaHa3 беспозвоночных и бактерий (рисунок 9) показало, что фермент содержит высококонсервативный участок Glyl50-Glul56 (исходя из нумерации аминокислотной последовательности 1—>3-ß-D-nnoKaHa3bi мидии Р. viridis), включающий в себя две каталитических аминокислоты GlulSl и Glul56. Участок для связывания субстрата представлен фрагментом молекулы фермента, ограниченным Trpl31-Leul37.

Методом химической модификации ранее было показано, что аминокислотный остаток гистидина важен для каталитической активности эндо-1—>3-ß-D-rai0KaHa3 моллюсков. Анализ данных множественного выравнивания позволил предположить, что эту роль могут выполнять два гистидиновых аминокислотных остатка His 180 и His209, находящиеся в консервативном участке эндо-1—>3-ß-D-nnoKaHa3 16 структурного семейства CAZy.

Интересно, что эндо-1 —>3-ß-D-niK>KaHa3a мидии Р. viridis, как и другие эндо-1—>3-ß-D-глюканазы моллюсков, имеют около 40% структурного сходства с 1—>3-ß-D-raiOKaH-

связывающими белками беспозвоночных и грамм-отрицательных бактерий, запускающими иммунный ответ на заражение микроорганизмами. Согласно действующей классификации эти белки принадлежат к 16 структурному семейству CAZy, также, как и эндо-1->3-р-0-глюканазы (http://www.cazy.org/fam/GH16.html).

Таким образом, из кристаллического стебелька промыслового вида вьетнамской мидии Р. viridis в гомогенном состоянии выделена и охарактеризована l-»3-ß-D-глюканаза, которая гидролизует р-1-»3-связи в глюканах с сохранением конфигурации гидролизуемой связи и обладает способностью катализировать реакцию трансгликозилирования. Фермент классифицирован как глюкан эндо-1-»3-р-Б-глюкозидаза (КФ 3.2.1.39) и отнесен к 16 структурному семейству CAZy. Фермент может быть использован для установления структуры 1->3-р-0-глюканов и энзиматического синтеза новых углеводсодержащих соединений.

3 Эндо-1—>3-ß-D-r.TiOK-amm моллюска Южно-Китайского моря Tapes literata

Двустворчатый моллюск Т. literata является промысловым видом, обитающим у берегов Социалистической Республики Вьетнам. Анализ состава О-гликозидгидролаз в экстракте кристаллического стебелька моллюска показал, что 1—»З-р-О-глюканаза, как и у Р. viridis, является преобладающим ферментом. Активность других глюканаз, катализирующих гидролиз амилопектина, КМ-целлюлозы и пустулана, была незначительной.

Очистка фермента включала в себя стадии экстракции, центрифугирования, ионообменную хроматографию на СМ-МасгоРгер, ультрафильтрацию, гельфильтрацию на биогеле Р-30 и сефадексе G-50 (таблица 3).

Таблица 3 - Очистка 1 —>3-Р-Р-глюканазы из кристаллического стебелька Т. literata

Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ед.акт. Удельная активность, ед.акг./мг белка Степень очистки (раз) Выход, %

Экстракция 91,3 15,5 0,2 1 100

Ионообменная хроматография на СМ-МасгоРгер 20,7 13,35 0,6 3,7 85,4

Гелъфильтрация на биогеле Р-30 8,4 9,2 1,1 6,5 59,5

Гельфильтрация на сефадексе G-50 5,8 8,1 1,4 8,2 52,3

Высокая концентрация 1—>3-р-0-глюканазы в исходном экстракте позволила при небольшой степени очистки (в 8,2 раза) получить фермент, гомогенный по данным SDS-электрофореза. Выделенный фермент имел молекулярную массу около 36 кДа (рисунок 10). Выход фермента составил 52%, что значительно выше, чем у 1 ->3^-0-глюканазы из Р. viridis. 1—»З-Р-Э-Глюканаза проявляла максимальную активность в широком диапазоне pH: от 4,5 до 7,5. Исследование термостабильности показало, что время полуинактивации выделенного фермента составило 30 мин при 50 °С. NaCl в концентрации до 1,5 М на активность фермента не влиял. Специфичность 1—»З-р-О-глюканазы из Т. literata к ß-1-*3-связи в смешанных 1-»3;1-»6-р-0-глюканах подтверждена на серии субстратов. Показано, что фермент эффективно гидролизовал ламинаран, очень слабо гидролизовал высокомолекулярные и плохо растворимые глюканы - пахиман, дрожжевой глюкан и аубазидан.

Глюканы с другим типом связи (пустулан, амилопектин и КМ-целлюлоза) гидролизу не подвергались (таблица 4).

Тот факт, что 1—>3-|3-0-глюканаза из Т. literata с одинаковой скоростью гидролизовала природный и периодатно-окисленный ламинаран, подтверждает эндо-тип действия фермента.

Влияние различных групп-специфических реагентов и ионов металлов на активность l->3-p-D-глюканазы позволяет предположить важную роль остатков триптофана. Было обнаружено ингибирующее действие N-бромсукцинимида, специфически окисляющего остатки триптофана. Вероятно также участие в катализе карбоксильных групп: в присутствии нуклеофила (бутиламина) активность 1-*3-|}-0-глюканазы падала на 34%. На 12% уменьшалась ферментативная активность при действии как высоко специфичного реагента на остатки гистидина - диэтилпирокарбоната, так и менее специфичного- ацетилимидазола. Остальные реагенты: N-этилмалеимид, этилендиамин-тетрауксусная кислота и ионы двухвалентных металлов (Mg2+, Со2+, Sn2+, Cu2+, Mn2t) значительного влияния на активность не оказывали. Константа Михаэлиса (К„,) для гидролиза ламинарана была рассчитана по методу Лайнуивера-Берка и составляла 0,25 мг/мл, что является величиной, характерной для 1—»З-Р-О-глюканаз из различных источников: морских грибов, моллюсков и др.

Таблица 4 - Специфичность 1—»З-3-Р-глюканазы из Т. literata

Субстрат Тип связи, Молекулярная масса, кДа. Растворимость Активность, %

соотношение

Ламинаран ß-l->3;ß-l->6 90:10 5-6 Раств. 100

Периодатно-окисленный ламинаран ß-1^3 5-6 Раств. 100

Дрожжевой глкжан ß-1—»3; ß-1 —»6 90:10 >200 Слабо раств. 2

Пахиман ß-l->3; ß-l->6 98:2 50-120 Слабо раств. 1

Аубазидан ß-1—^3; ß-1—^6 50:50 500-550 Слабо раств. 0,5

Пустулан ß-l->6 30 Раств. 0

Амилопектин a-l->4; a-l->6 2000 Раств. 0

КМ-целлюлоза ß-1-^4 >2000 Раств. 0

Анализ продуктов гидролиза ламинарана 1—>3-Р-0-глюканазой из Т. literata проводили методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии. В продуктах реакции были обнаружены глюкоза и глюкоолигосахариды различной степени полимеризации. В спектрах наблюдали основные пики с m/z [M+Na]+: Glci (203,3), GIc2 (365,2), GIcî (527,2), G1c4 (689,2), Glcs (851,3), Glc6 (1013,3), Glc, (1175,4), Glcs (1337,4), Glc, (1499,4), Glc10 (1661,5), Glcii (1823,5), G le |2 (1987,6), Glc,3 (2149,7), Glcu (2311,8), Glc,5 (2473,9), Glc,6 (2636,0), Glc17 (2798,2).

Методом 13C ЯМР-спектроскопии был изучен тип действия фермента. Показано, что гидролиз ß-1—>3 связей в молекуле ламинарана проходит с сохранением конфигурации

А Б В

Рисунок 10 - SDS-электрофорез белковых препаратов из кристаллического стебелька Т. literata

на разных стадиях отчистки: (А)-экстракт, (Б)- после CM-MacroPrep, (В)-после гельфильтрации на сефадексе G-50. 1 - препарат белка; 2- стандарты

расщепляемой связи, что характерно для ферментов, обладающих трансгликозилирующей способностью.

Методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии была исследована способность 1 —>3-(3-D-глюканазы из Т. literata катализировать реакцию трансгликозилирования. В качестве донора был использован ламинаран, акцепторами служили глицерин, метил-P-D-глюкопиранозид, метил-|3-0-ксилопиранозид, метанол. Наиболее предпочтительным акцептором, как и для других 1—»З-Р-Б-глюканаз морских моллюсков, оказался глицерин. При использовании его в качестве акцептора в продуктах реакции были обнаружены олигоглицегиды со степенью полимеризации от 2 до 15 (рисунок 11).

' 4 1 Li j л. A Л A j J J J 0_F1\2: +MS .....iilît

J 'i 4 i il i 4 4 т ;li Б iiil; Li .1.1 0_G1M: »MS I i Î t î * Í 4

а i ▲ - j I i il В ííiíj Jï M; 0_H1\1- +MS f » 4 * ; l„ ,1, Í ,i, ,f , t.....

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 т/г

А - I мин; Б - 15 мин; В - 30 мин; ▲ - продукты гидролиза; • - продукты трансгликозилирования

Рисунок 11 - MALDI-TOF-масс-спектр продуктов трансгликозилирования, полученных в результате действия I—>3-[3-0-глюканазы из кристаллического стебелька Т. literata на ламинаран в присутствии акцептора - глицерина

4. Сравнение некоторых свойств эндо-1—»3-ß-D-nnoKaiia3 морских беспозвоночных

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей 1—>3-[}-0-глюканаз кристаллических стебельков морских двустворчатых моллюсков Р. viridis. Ch. albidus, P. sachalinensis, M. yessoensis, T. literata показал их высокую гомологию (от 58 до 68%). Множественным выравниванием последовательностей 1—>3-р-0-глюканаз установлено, что эти ферменты содержат несколько высококонсервативных участков: каталитический центр (GEIDME), в котором расположены два каталитических остатка Glu и важный для активности ферментов остаток гистидина; субстрат-связывающий центр (WPA1WM), содержащий 2 остатка триптофана; и гомологичную последовательность, расположенную в С-концевой области молекул. Методом химической модификации эти данные были подтверждены: окисление остатка триптофана вызывало полную потерю ферментативной активности; модификации дикарбоновых кислот и гистидина приводили к заметной потере активности.

Все эти ферменты имели близкие значения молекулярных масс (от 32 до 37 кДа) и изоэлектрических точек, но отличались значениями температурного и pH оптимумов, температурной стабильностью, кинетическими и каталитическими характеристиками (таблица 5).

Таблица 5 - Характеристики эндо-1—»З-р-О-глкжаназ морских двустворчатых моллюсков

Источник фермента Масса, кДа Pi Функционально значимые аминокислоты Оптимальные условия Реакция гидролиза Реакция трансгликозилирования

pH Т. ("С) NaCl (M) Гидролизуемая связь Km, M г/мл Исчерпывающий гнлролш, % GIc, % Синтезируемая связь Np-Gle, %/ за 1 час Km, Выход вмп •, %

L0, Ch. albidits 37 7,5 Glu/As р Тгр, His 4,4 20 0,1-0,3 ß-l->3 0,7 60 30 Р-1->3 р-1->4 М->6 13 2 20

UV, P. sachalinetísis 38 7,6 Glu/Asp Тгр, His 5,8 45 0,01-0,3 ß-l->3 0,2 70 40 Р-1->3 11 1 4

LV, А/. yessoensis 36 н.О. Glu/Asp Trp, His 4,5 45 0,2 - 0,5 ß-l->3 0,6 60 30 р-1->3 12 и.о. 0

P. viridis 33 н.о. Glu/Asp Trp, His 4,5-6,0 45 и.о. p-l—>3 0,3 70 и.о. Р-1->3 Н.О. н.о. 0

T. literata 37,0 6,3 Glu/Asp Trp, His 4,5-7,0 40 0-1,5 ß-l->3 0,25 68 н.о. Р-1->3 Н.О. и.о. 0

В МП* - высоко молекулярные продукты

Наибольшей термостабильностью обладает эндо-1—»З-Р-О-глюканаза из Р. viridis -период ее полужизни при 45 "С составляет 180 мин. Эндо-1->3-р-0-глюканаза из СЛ. albidus имеет самую низкую термостабильность: период полужизни этого фермента при 37 "С составляет всего 10 мин.

Показано, что термостабильность ферментов во многих случаях определяется степенью их конформационной подвижности: чем выше конформационная подвижность белковой молекулы, тем, как правило, меньше ее термостабильность. С другой стороны, существует определенная корреляция между конформационной подвижностью и аминокислотным составом ферментов.

В таблице 6 приведены данные об относительном содержании аминокислотных остатков (а.о.) в эндо-1—>3-р-0-глюканазах моллюсков, расположенных в порядке уменьшения их термостабильности. Анализ относительного содержания а.о. в эндо-1-»3-ß-D-глюканазах моллюсков показал, что чем ниже термостабильность фермента, тем меньше в нем гидрофобных а.о. и ниже соотношение Arg/(Arg+Lys). Также эти ферменты отличаются количеством остатков цистеина: ферменты из гребешков Ch. albidus и М. yessoensis имеют по два остатка цистеина, из Т. literata - три, из Р. sacha! mens is - четыре, из Р. viridis - семь. Просматривается следующая закономерность - чем больше остатков цистеина в молекуле эндо-1-*3-Р-0-глюканазы (и, вероятно, дисульфидных связей), тем более термостабилен фермент.

Таблица 6 - Аминокислотный состав эндо-1—*3-Р-Р-глюканаз

Относительное содержание а.о., %

А.о. Р. viridis Р. sachalinensis Т. literata Л-/. yessoensis Ch. albidus

Ala (А) 6,71 5,52 4,35 5,56 4,94

Arg (R) 5,49 6,13 5,28 4,01 4,63

Asn (N) 5,49 6,44 9,01 7,41 7,72

Asp (D) 6,40 8,90 7,76 7,10 6,48

Cys (С) 2,13 1,23 0,93 0,62 0,62

Glu (Е) 4,88 3,68 2,80 3,70 3,09

Gin (Q) 3,66 3,37 2,80 2,16 2,16

Gly (G) 12,5 8,90 10,56 11,11 11,42

His (Н) 3,35 3,37 3,73 4,94 4,32

lie (1) 3,05 5,83 4,97 5,25 4,63

Leu (L) 4,88 4,91 3,11 4,01 4,01

Lys (К) 3,96 3,07 3,42 3,70 4,32

Met (М) 1,83 3,37 4,35 2,78 2,78

Phc (F) 3,96 4,91 4,66 4,63 4,94

Pro (Р) 5,18 5,52 6,52 5,56 5,25

Ser (S) 5,18 4,29 6,52 6,48 6,79

Thr (Т) 4,88 5,52 3,73 5,56 6,17

Trp (W) 4,88 4,29 4,97 5,86 5,86

Tyr (Y) 5,49 4,29 4,35 4,63 4,32

Val (V) 6,10 6,44 6,21 4,94 5,56

% заряженные" 24,08 25,15 22,99 23,45 22,84

% кислые" 11,28 12,58 10,56 10,8 9,57

% основные' 12,80 12,57 12,43 12,65 13,27

% гидрофобные" 36,59 35,88 39,14 34,58 33,96

% ароматические' 15,25 14,7 15,53 16,05 16,35

Arg/Arg+Lys 0,58 0,67 0,61 0,52 0,52

"DEHKR, "DE, CKRH, "LMIVWPAF,' YFW

Ранее было показано, что эндо-1-»3-р-0-глюканазы из Ch. albidus и Р. sachalinensis не имеют свободных сульфгидрильных групп и, следовательно, содержат одну и две дисульфидные связи, соответственно. Анализ аминокислотных последовательностей эндо-1—>3-Р-0-глюканаз показал (рисунок 12), что два остатка цистеина (Cys77 и Cys85 согласно нумерации а.о. эндо-1—»З-Р-О-глюканазы из Т. literata) являются консервативными для всех эндо-1—»З-Р-Э-глюканаз моллюсков, а также для эндо-1—>3-Р-

D-глюканаз га других источников: Т. molitor, S. purpuratus, H. armígera и H. discus. Вероятно, у всех этих ферментов они образуют дисульфидную связь.

Заметны различия и в отношении 1—»З-р-О-глюканаз к NaCl. Так l-»3-ß-D-глюканазы J10 и J1V из морских гребешков Ch. albidiis из М. vessoensis, соответственно, имеют выраженные солевые оптимумы, в то время как JIIV и 1->3-Р-0-глюканаза из Т. literata практически нечувствительны к изменениям содержания NaCl в реакционной среде. Этот феномен, к сожалению, пока не удалось связать со структурными особенностями ферментов.

1—>3-р-0-Глюканазы моллюсков имели близкую специфичность в реакции гидролиза. Они расщепляли Р-1->3-связи в смешанных 1 —»3; 1 —>6-р-0-глюканах: с высокой скоростью катализировали гидролиз ламинарана и трапслама, слабо -дрожжевого глюкан, практически не гидролизовапи высокомолекулярные и плохо растворимые глюканы - пахиман и аубазидан. Гидролизу не подвергались глюканы с другим типом связи: пустулан, амилопектин и КМ-целлюлоза. Все ферменты осуществили гидролиз по эндо-типу действия с сохранением конфигурации расщепляемой связи, и основными продуктами гидролиза ламинарана являлись глюкоза и олигосахариды. Степень полимеризации основного продукта различалась (например, n=3 у J1IV, п=4 у глюканазы из Р. viridis), что вероятно связано с различной величиной активных центров ферментов. Отличительной особенностью всех глюканаз явилось высокое содержание глюкозы, которая появлялась с первых минут реакции. Исключение составляла глюканаза ЛО, у которой глюкоза появлялась с задержкой во времени, т.е. с лаг-периодом.

Все эти ферменты обладали способностью к реакции трансгликозилирования, которую катализировали с различной эффективностью в сравнении с реакцией гидролиза (наибольшей способностью к реакции трансгликозилирования обладала глюканаза ЛО морского гребешка СИ. albidus, наименьшей - глюканаза моллюска Т. literata). Для исследования реакции трансгликозилирования использовали различные доноры и акцепторы. Лучшим донором в реакции трансгликозилирования так же, как и лучшим субстратом при гидролизе оказался ламинаран из L. cicliorioides: содержание ß-l-»6-связей в нем оптимально. Лучшим акцептором оказался глицерин. Глюканаза ЛО синтезировала не только ß-1—>3-связи, но и ß-1—>4- и ß-1-^б-связи. Интересной особенностью этого фермента оказалась его способность синтезировать при определенных условиях 1—>3;1->6-р-0-глюкан более разветвленный, чем ламинаран и с молекулярной массой выше, чем у ламинарана используемого в этой реакции в качестве субстрата (ВМП, таблица 5).

Подводя итог, можно сказать, что 1—>3-Р-0-глюканазы двустворчатых моллюсков, обитающих в различных экорсгионах (Охотском, Японском, Южно-Китайском морях), являются ферментами эндо-типа действия. Все эти ферменты способны катализировать с одинаковой эффективностью две реакции: гидролиза и трансгликозилирования. Эта способность резко отличает их от подобных ферментов, выделенных из наземных источников. Последние являются узкоспецифичными и катализируют либо только реакцию гидролиза, либо трансгликозилирования. Отличия в молекулярных свойствах ферментов из морских моллюсков, по всей видимости, связано с условиями обитания источника ферментов. Проведенный анализ позволил выявить общие черты и различия между известными 1—>3-Р-0-глюканазами двустворчатых моллюсков и сравнить их с ферментами из наземных источников.

jos - - ldmqkSnhest - lgS

íds--fgldxgehemt-ag8 1ds - -fdleksqhent-las jng - afdpagwy evs- my? íng - afn png®jyevs - myj

JngggldtnnJbnyevs - муз

itt - - wd psdyqi evs - aws |tt--wnpnnyqigvs-awb jtts - - fnxgsyk1 ecs - avi ínshqlnpkhfflhheit-cw¡ !ng-gnladr®3felg-cn|

-GALI •GTW

■gavm ■ - -ag

•GNTvfgl ---LDWI

•gviwq03

ÍS-LDTS

T.molitor (ACS36221) S.purpuratus (AAC47235) H.armígera (ABU98621) P.sachalinensis (AAP74223) T.literata L.sitkana (ACN22491) M.yessoensis (AY848857) С.albidus (DQ093347) P.viridis (ACM6S926^ H.discus (BAH84971) C.antarcticus (ACD93221) B.xylophilus (BAE02683)

■ns - kynsytsí»!- lyxkpt: laí: - - exc'troflssgqi.dinggspad

¡tnn-hsn-syvrdSklftkptlttu- klgegslssgtldlwgsspan

-rtn'sfthskrlfirpslmsd- -qrgeqflssghlnveggapad (vpd-ar.mi ftsnghlfikptr.t tdhpnyndgnij^sat.mdг,: alyg-|vpd pkviftrnshlpikpmltiddprfs- -ni.nsdvmdmkakyg nd-ksmvytní®k¿fbkptktvdd?rwdenflhsgvmdvaqiwg-@fqvftrв - psnbfvrngtíly ikptftrdsahfndgs l yygtmdvns i.wh js::gfqv^?e-l\sn4.fvrdgslyrk?tftrl\shhfrdgnlyygtmdlyh:.wn-J^;gHQ\^;E-P3NbYARcS.Ur"íbK?TLT7DDPKYDDNRLYHGQViKVTDfCGG sfqkhtpe-aanty i kngvlylkptftad- - kfgddffqhgvldvkqqwc -gLOqpDKRGANARÜHDgKLVlS -

112

88

92

92 88

93 92 92

94 91 65 61

T.molitor S.purpuratus H.armigera P.sachalinensis T.literata L.sitkana M.yessoensis C.albidus P.viridis H.discus C.antarcticus В.xylophilus

T.molitor S.purpuratus H.armigera P.sachalinensis T.literata L.sitkana M.yessoensis C.albidus P.viridis H.discus C.antarcticus

B.xylophilus

T.molitor S.purpuratus H.armigera P.sachalinensis T.literata L.sitkana M.yessoensis

C.albidus P.viridis H.discus C.antarcticus B.xylophilus

227 194 206 202

199

200 205 205 205 204

159

160

lvnasgani|skl|ss

ikdadglsaSvdqügs

ramt-fngvhigtheágsj tvardgsghnhgvnevg-hl qaidgnnhnhgvnevgñgm

vrasg-----hsvnevss jl

tkailg-gqnsgvnyvas tkavlw-gqnsgvnyvas lsymkcg-snlegvqe\/as vhls eangatqgvdrvls

---------qrpqqilg

-vadaiaagnvnkeílg

wgpawninmy--mmthvessnpagfda

wgpfwplngy--pkthat---------

ygpypamngw--erahwirrntagyns

wdqmpviids-vrrtgdld---gdwsh

tígpdagqnkf - ylthgdvs---gdwsh

wgtsagdnhygqtthakqa---adwsn

wgpaynhnaf-akthaskrkyggddwh wgpdfnnnrf-qkthgskrksggadwh ipdagqnrf - ykthgeldkgsgdwad ygaspsqhrq--qgdsktsktgttwad

¡fgaapdnkgd---vgtgerdfpxdfsa

gqhaq---ygtn-yvapndltt

F jjwSNN-<

GNSEILPP GN---GAQIPPI

rYRLl rYRLI TWRI.I TY5U TYSLI TYKLE

TYSVl tfgli vykl'.

В скобках указаны номера последовательностей в базе данных ОспВапк. Черным

цветом выделены идентичные а.о., серым цветом — гомологичные. Отмечены активный центр (АЦ) и участок связывания субстрата (УСС), Т - каталитические аминокислотные остатки.

Рисунок 12 - Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей эндо-1—e-p-D-пноканаз беспозвоночных

о wgjw yqmt25tend i sfsi

-kfyv

r-yqlegjtpdylr fs1 idgjiqvfv íihvsv 'hdffilatfv •adlsiityv 'agSivtyv

jirvtv 'aggjlrmdí ¡spdsmqwll ¡sqseikmfi

dallgtfappd---ggfwewgdld - - ssgfakpwr'i'sksf

deltlmvdpat- • -g-fwdl.gefendapgtdnpwaynpnkl dlelgrvtpgn - - - ggfw er'gg fns - npn t knpwr yg - s

nrhtmnipqs----rxvfgsledlv- - --dpipgavep

grícmmnipis- - qsfwqkggfgg.....mntwgsgt-

nqqilrvtpp----sggfsei.ghts-----n- twagnd-

nvemmrintps • - -qsfwgwggfdg-----nniwasgg-

nveimrittps - - osgwgwgafsg - -.....nni wasí !g

gküilyvstpg---msywgwggfgg- - --snpwaggg-rd

nqpvmawttps- qgywsyshqsg-----tnvwsqgg-

d.qvyhtes lqrnfwdg vgnqn----------------

diqymvfditp--------------------------

TD---TÁAFKlbgÜKJWAL-----------356

-----EAAMQVNWVRl/YXE PGQTTYXLRDR 319

VblDGQDASXjQVbeVRIWAL----------------------339

-----DVAMECDWVEMTQY----------------------326

-----AVAMEÜÜSVDMQQC----------- 322

-----KVAMEIDSIEMRYL-----------322

-----EVALVIDRIEMIPH-----------324

-----EVAMVVDHIEMI PH-----------324

-----RftAMVl.tgVEfíVQA-----------327

-----DVAMK^KSVKMIQY----------------------32 9

-------TFEVESVKKNTWN----------249

-------QMLVr^XKVTQ------------236

DV-TNPí

gl-tytp;

gv-snpnp[ nvj -tydq< nw-ryns nw-dygy1 -eydvpj -dydv) -aynhp1 hntphai

sntsptas tdfs4 kgrdi |sndsptas kdfws dfnr gsptaatgfrtngrwl ¡f snsptelqdfwn arf( sptepkdfwdhrs; ¡sntsphaaqdwwngrs!

ipmr - - s fwearhsffieh' ihspmr- -sfwearhsj ¡dgsprqeaefyexks! ¡knns ptammdfwkskqí pfdísesdgwakn-ihdagavtaplpg-

5 Специфичность О-гликозндгндролаз из морского брюхоиогого моллюска Японского моря ЬШоппа 5Йкапа

Известно, что гдюкозидазы обладают широкой специфичностью, что позволяет с успехом использовать их для дегликозилирования различных природных гликозидов. Мы исследовали специфичность О-гликозидгидролаз из ¡¡¡капа по отношению к изофлавоноидам из клеточной культуры высшего растения МааИа атигети.

Для изофлавоноидов характерно наличие углеводных заместителей при С-7 и С-4'. Большинство изофлавоноидов существует в природе исключительно в виде Р-глюкозидов, в то время как для фармакологических исследований чаще используются агликоны изофлавоноидов.

Получение агликонов возможно как кислотным, так и ферментативным гидролизом гликозидов изофлавоноидов. Однако, ферментативный гидролиз имеет неоспоримые преимущества по сравнению с кислотным. Все ферментативные реакции протекают при физиологических значениях температуры и рН, а выход основного продукта приближается к 100%.

Для получения агликонов изофлавоноидов нами были использованы ферментативный комплекс Р-В-гидролаз, индивидуальные р-Б-глюкозидаза (в-П) и 1—>3-р-О-глюканаза (0-1) из морского моллюска Ь. ¡¡¡капа.

Эффективность гидролиза глюкозидов заметно зависит от структуры агликона и углеводной компоненты (таблица 7). Например, степень гидролиза генистина (3) была меньше, чем даидзина (1). Модификация углеводной компоненты введением малонильной группы в положение С6 остатка глюкозы, заметно уменьшала степень ферментативного гидролиза модифицированных генистина и ононина.

Таблица 7 - Гидролиз гликозидов изофлавоноидов под воздействием ферментных комплексов и

Окончание таблицы 7_

1 2 3 4 5

ононин (5) 0 ^^Чэсн, 90,6 100 100

6 "-0-малонилононин (6) ^^ чзсн, 38,8 100 10,5

(бай, 11аД)-6"-0-малонил-З-О-Р-Р-глюкопиранозил маакиаин (7) н«1Т т> 0— 100 100 100

Для дальнейших экспериментов были выбраны индивидуальные препараты ферментов 0-1 (ЕС 3.2.1.39) и О-Н (ЕС 3.2.1.21). Оба фермента катализировали расщепление гликозидов изофлавоноидов с образованием агликонов (таблица 7). Структура агликона практически не влияла на эффективность действия обоих ферментов. Ферменты также катализировали расщепление гликозидной связи в случае замещения гидроксильной группы при С6 остатка глюкозы малонатом (соединения 4, 6 и 7), однако оба фермента гидролизовали модифицированные соединения менее эффективно, чем гликозиды с немодифицированной глюкозой (соединения 3 и 5).

Таким образом, показано, что Р-О-глюкозидаза и 1—>3-Р-0-глюканаза из Ь. зИкапа способны катализировать гидролиз гликозидов и малонилгликозидов изофлавоноидов и могут быть использованы для получения агликонов изофлавоноидов, которые в большинстве случаев обладают высокой биологической активностью.

6 Водорастворимые полисахариды зеленых водорослей рода Саи1егра

Исследование специфичности 1->3-р-0-глюканаз предполагает подробный анализ способности фермента гидролизовать не только достаточно редко встречающиеся 1—»3-Д-В-глюканы, но и широко распространенные полисахариды или углеводсодержащие полимеры со смешанным типом связи (1—>3;1-»6- или 1->3;1—>4-р-0-глюканы или глюкоолигозиды).

Нами были выделены 3 новых 1->3-Р-0-глюкана из зеленой водоросли Саикгра 1епШП/ега. Методом гельфильтрации была определена их молекулярная масса, которая составила 20, 60 и 70 кДа (таблица 8). В |3С ЯМР спектре наблюдались сигналы, характерные для р-1—>3- связанных глюканов: С1 (104,08 м.д.); С2 (74,90 м.д.); СЗ (86,10 м.д.); С4 (69,85 м.д.); С5 (77,30 м.д.); С6 (62,47 м,д.). Эти глюканы представляют большой интерес как новые субстраты для исследования свойств глюканаз. Традиционно используемый 1-»3;1-»6-р-0-глюкан - ламинаран имеет молекулярную массу до 6 кДа, в то время, как глюканы из С. 1епИШ/ега имеют значительно большие молекулярные массы. В настоящее время 1—»З-Р-Б-глюкаиы с большой молекулярной массой (до 500 кДа) выделены, в основном, из грибов. Основной их недостаток - плохая растворимость в воде. Хорошая растворимость и отсутствие Р-1->б-связей увеличивают ценность полученных субстратов.

Из другого вида зеленой водоросли С. 1егШ1апоШе$ были выделены два типа 1-»4-а-Р-глюканов: сульфатированный и не содержащий сульфатные группы, а также сульфатированный 1 —>4-а-В-галактан. Следует отметить, что полисахаридов, содержащих (3-1—>3-связанные остатки глюкозы, в этом виде водоросли обнаружено не было. Методами ИК- и ЯМР-спектроскопии была установлена структура галактана, который является 1—>3;1-»6-р-В-гапактаном, сульфатированным по С2 остатка галактозы.

Таблица 8 - Основные полисахариды водорослей С. ¡ешИИ/ега и С. ¡егПЛапоШе!

Вид водоросли Выход, % ♦ Полисахарид Мм, кДа Моносахаридный состав, мольные доли

Ис ва! Мап Ху1

СаиЫгра 1сп!ПИ/сга 2,7 1-*3-Р-0-глюкан 20-60 1 0,2 0,2 0,1

4,1 1-*3-Р-0-глюкан 20-40 1 0,1 0,07 0

3,5 1 —»З-р-О-глюкан 70 1 0,3 0,2 0,2

СаиЫгра 1,0 1 —>4-а-В-галактан н.о. 0,3 1 0,4 0,2

0,8 1—>4-а-В-глюкан н.о. 1 0,5 0,2 0,3

2,3 1->4-а-0-глюкан н.о. 1 0,2 0 0

н.о. - не определяли

* - % от сухого веса обезжиренной водоросли

7 Заключение

Выделенные 1-*3-р-0-глюканазы представляют большой научный и прикладной интерес. Установление их аминокислотной последовательности и изучение каталитических свойств позволили выявить общие черты и различия между известными 1->3-р-0-глюканазами двустворчатых моллюсков и сравнить их с ферментами из наземных источников.

Субстратами этих ферментов являются 1-»3-Р-0-глюканы и смешанные 1—>3;1—>6-Р-О-глюканы, которые известны как иммуномодуляторы, радиопротекторы, антигрибковые, противоопухолевые соединения. Очевидно, что запасы р-1—>3-связанной глюкозы в природе достаточно велики и сопоставимы с запасами ее в виде целлюлозы. Всесторонне изученные глюканазы открывают перспективы практического использования этих ферментов с целью стандартизации полисахаридов и увеличения их биологической активности.

ВЫВОДЫ

1. Проведен поиск О-гликозидгидролаз: 1—»З-р-О-глюканаз, фукоиданаз, гликозидаз среди морских беспозвоночных Южно-Китайского моря. Показано, что 1—>3-ß-D-глюканазы присутствуют во всех исследованных видах, фукоиданазы и гликозидазы обнаружены в пищеварительных органах морских ежей, моллюсков, червей и голотурий. Кристаллические стебельки вьетнамских промысловых моллюсков Perm viridis и Tapes literata выбраны как источники для выделения и изучения новых l-»3-ß-D-глюканаз.

2. Изучены каталитические свойства новой 1—>3-Р-0-глюканазы из кристаллических стебельков двустворчатого моллюска Р. viridis, установлена аминокислотная последовательность. Фермент классифицирован как глюкан эндо-1—>3-Р-0-глюкозидаза (КФ 3.2.1.39) и отнесен к 16-ому структурному семейству О-гликозидгидролаз.

3. Показано, что 1-»3-Р-0-глюканаза из Р. viridis катализирует реакцию трансгликозилирования. Регистрация продуктов реакции методом масс-спектрометрии позволила использовать в качестве акцепторов глицерин, метил-Р-О-глюкопиранозид, метил-Р-О-ксилопиранозид и метанол. Установлено, что лучшим акцептором является глицерин.

4. Из кристаллических стебельков двустворчатого моллюска Т. literata впервые в гомогенном состоянии выделена 1->3-Р-0-глюканаза, изучены свойства фермента. Показано, что он обладает высокой трансгликозилирующей способностью. Фермент классифицирован как глюкан эндо-1-»3^-0-глюкозидаза (КФ 3.2.1.39). Анализ аминокислотной последовательности позволил отнести эндо-1->3-р-0-глюканазу к 16-ому структурному семейству О-гликозидгидролаз.

5. Проведен сравнительный анализ взаимосвязи структуры и каталитических свойств новых ферментов и известных эндо-1-»З-р-О-глюканаз морского происхождения. Установлено, что термостабильность ферментов возрастает с увеличением количества дисульфидных связей.

6. Обнаружена способность О-гликозидгидролаз морского брюхоногого моллюска Японского моря Littorina sitkana катализировать гидролиз гликозидов изофлавоноидов. Показано, что структура агликона практически не влияет на скорость гидролиза. Наличие малонильного заместителя в углеводной компоненте существенно уменьшает скорость и степень гидролиза гликозидов изофлавоноидов.

7. Расширена коллекция субстратов для 1—>3-Р-П-глюканаз. Из водоросли Caitlerpa lentUlifera выделены новые 1—>3-р-0-глюканы, отличающиеся от известных ламинаранов более высокой молекулярной массой (от 20 до 60 кДа).

Публикации по теме диссертации

1. Захареико A.M., Кусайкин М.И., Ли Б.М., Хуен Ф.В., Хоанг Н.Х., Сова В.В., Звягинцева Т.Н. Каталитические и молекулярные свойства эндо-1,3-Р-В-глкжаназы из вьетнамской мидии Perna viridis // Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки: Тез. докл. Третьей междунар. научн.-практ. конф., Владивосток, 8-10 сент. 2008 г. Владивосток: ТИНРО-Центр, 2008. С. 313.

2. Захаренко A.M. Разработка и создание нового поколения лекарственных средств и/или биологически активных добавок на основе веществ с установленной химической структурой // 1st Far-Eastem intern, symp. on Life Sciences, молодеж. секция «Актуальные проблемы химии и биоологии», Владивосток, 2-7 сент. 2008: материалы. Владивосток, 2008. 4.2. С. 31-35.

3. Захаренко A.M., Кусайкин М.И., Буи Минь Ли, Фам Ван Хуэн, Хьюнь Хоанг Кхань, Сова В.В., Звягинцева Т.Н. Каталитические свойства эндо-1,3-Р-0-глюканазы из вьетнамской мидии Per па viridis И Биоорган, химия. 2009. Т. 35, № 1. С. 62-69.

4. Шевченко Н.М., Бурцева Ю.В., Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Сергеева О.С., Захаренко A.M., Исаков В.В. Nguyen Thi Linh, Nguen Xuan Hoa, Bui Minh Ly, Pham Van Huyen. Полисахариды и стерины зеленых водорослей Caulerpa lentillifera и С. serlularioidesИХимия природ, соедин. 2009. №1. С. 5-8.

5. Zakharenko A.M., Kusaykin M.I., Kovalchuk S.N., Anastyuk S.D., Bui Minh Ly, Sova V.V., Rasskazov V.A., Zvyagintseva T.N. Biochemical and molecular characterization of an endo-l,3-P-D-glucanase from the crystalline styles of the mussel Perna viridis // Carbohydr. Res. 2011. V. 346, №2. P. 243-252.

6. Кусайкин М.И., Захаренко A.M., Ермакова С.П., Веселова M.B., Григорук Е.В., Федореев С.А., Звягинцева Т.Н. Дегликозилирование гликозидов изофлавоноидов из клеточной культуры Maackia amurensis под действием p-D-глюкозидазы из гепатопанкреаса Littorina sitkana // Химия природ, соедин. 2011. №2. С. 182-185.

Соискатель

Захаренко Александр Михайлович

»З-р-Б-Глюканазы моллюсков Японского и Южно-Китайского

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 18.05.2011 Формат 60x84/16 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 405

Отпечатано в Типографии ДВГТУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Классификация гликозидгидролаз.

1.1.1 Номенклатура ферментов (КФ), её недостатки и достоинства; новые системы классификации ферментов.

1.1.2 Классификация ферментов по аминокислотной последовательности

1.1.3 Классификации, основанные на механизмах действия гликозидгидролаз

1.2 1—»З-Р-Б-Глюканазы. Номенклатура. Классификация.

1.2.1 1—>3-р-0-Глюканазы бактерий.

1.2.2 1—»З-Р-О-Глюканазы грибов.

1.2.3 1—»3-ß-D-Глгоканазы растений.

1.2.4 1-»3-р-0-Глюканазы животных.

1.3 Особенности молекулярных и каталитических свойств 1 -»З-р-Б-глюканаз морских беспозвоночных.

1.4 1—>3;1—»б-р-Б-Глюканы - субстраты 1—»З-р-В-глюканаз (распространение, структура, свойства).

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1 Поиск источников 1—»З-р-Б-глюканаз среди морских беспозвоночных ЮжноКитайского моря.

2.1.1 1—>3-Р-В-Глюканаза промыслового моллюска Южно-Китайского моря Регпа viridis.

2.1.2 1—»З-р-Б-Глюканаза моллюска Южно-Китайского моря Tapes literata

2.2 Сравнение некоторых свойств эндо-1—»З-Р-Б-глюканаз морских беспозвоночных.

2.3 Специфичность О-гликозидгидролаз морского брюхоногого моллюска Японского моря ЬШогіпа Біїкапа.

2.4 Водорастворимые полисахариды зеленых водорослей рода Саиіегра.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Биологическое сырье и реактивы.

3.2 Определение восстанавливающих Сахаров.

3.3 Определение нейтральных Сахаров.

3.4 Определение гидролитической активности 1->3-Р-В-гюканаз.

3.5 Определение гликозидазной активности.

3.6 Электрофорез белков.

3.7 Определение оптимума рН.

3.8 Определение рН-стабильности.

3.9 Определение температурного оптимума.

3.10 Определение термостабильности.

3.11 Определение константы Михаэлиса (Кга).

3.12 Действие ингибиторов.

3.13 Ингибирование р-Б-глюкозидазы О-П формононетином.

3.14 Получение продуктов ферментативного гидролиза глюкозидов изофлавоноидов.

3.15 Условия реакции трансгликозилирования.

3.16 Аналитическая ВЭЖХ.

3.17 Анализ продуктов ферментативного гидролиза и трансгликозилирования методом ВЭЖХ.

3.18 ЯМР-спектроскопия.

3.19 Масс-спектрометрия.

3.20 ИК-спектроскопия.

3.21 Выделение и очистка 1—>3-Р-0-глюканазы вьетнамской. мидии Per па viridis.

3.22 Выделение и очистка 1 —>3-Р-0-гюканазы вьетнамского моллюска Tapes literata.

3.23 Экстракция полисахаридов.

3.24 Характеристика продуктов гидролиза ламинарана.

ВЫВОДЫ.

Ферменты или энзимы (от лат. ГегтепШт, греч. ^Зрл], еу£ицоу-дрожжи, закваска) - обычно белковые молекулы или молекулы РНК (рибосомы) или их комплексы, ускоряющие (катализирующие) химические реакции в живых системах.

На сегодняшний день согласно традиционной номенклатуре (КФ) существует 5258 КФ номеров ферментов. Для 1325633 ферментов установлена первичная структура и только для 13147 из них - третичная структура. Объектом нашего исследования являются О-гликозидгидролазы. О-гликозидгидролазы — это ферменты углеводного обмена, очень широко распространенные в природе. О-гликозидгидролазам присвоен 171 КФ номер, установлено 36545 первичных структур и 2286 третичных. Эти ферменты являются удобной моделью для исследований, на их примере решались и решаются многие проблемы энзимологии.

1->3-(3-0-Глюкапазь: встречаются у представителей всех царств живой природы от архебактерий до эукариот. Функции, выполняемые этими ферментами, чрезвычайно разнообразны. В частности, 1—»З-Р-О-глюканазы бактерий принимают участие в деградации полисахаридов, которые используются бактериями в качестве источника энергии. У грибов эти ферменты осуществляют лизис собственного клеточного матрикса в процессе развития клеток. В растениях они участвуют в клеточной дифференциации, в системе защиты растений от патогенных грибов, в деградации 1 —>3-р-0-глюканового слоя оболочки семян при их прорастании. Важную роль 1—»З-Р-Э-глюканазы играют в пищеварении морских беспозвоночных. Предполагают участие этого фермента в процессе оплодотворения и раннего развития эмбрионов морских ежей.

Богатым источником высокоактивных 1—»З-Р-О-глюканаз являются морские организмы; в основном, беспозвоночные и микроорганизмы. Тем не менее, 1-»3-Р-0-глюканазы из морских источников - одна из самых малоизученных групп О-гликозидгидролаз. 1->3-Р-0-Глюканазы из морских источников в большинстве своем отличаются от аналогичных ферментов, синтезируемых наземными организмами, по своим кинетическим характеристикам и повышенной способностью к реакциям трансгликозилирования.

1—»З-р-О-Глюканазы представляют большой научный и прикладной интерес. Субстратами для этих ферментов являются 1—>3-(3-0-глюканы и смешанные 1—>3;1->4- и 1-^3;1-»6-Р-0-глюканы. Эти полисахариды известны как иммуномодуляторы, радиопротекторы, антигрибковые, противоопухолевые соединения. Источниками этих глюканов являются водоросли, дрожжи, грибы, бактерии, лишайники и высшие растения. Очевидно, что запасы Р-1 —»3-связанной глюкозы в природе достаточно велики и сопоставимы с запасами ее в виде целлюлозы. Практическое использование 1—>3-|3-0-глюканаз связано с перспективами ферментативной трансформации 1—>3- или смешанных 1—>3;1—>4- и 1—>3;1—»б-Р-О-глюканов из различных природных источников с целью их стандартизации и увеличения биологической активности. Следовательно, изучение этих полисахаридов, так же, как и ферментов, катализирующих их трансформацию, является перспективным и актуальным.

Цель исследования - установить структурно-функциональные связи для некоторых 1—»З-р-Э-глюканаз морских моллюсков, обитающих в различных экорегионах.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Проведен поиск О-гликозидгидролаз: 1-»3-р-0-глюканаз, фукоиданаз, гликозидаз среди морских беспозвоночных Южно-Китайского моря. Показано, что I—>3-Р-0-глюканазы присутствуют во всех исследованных видах, фукоиданазы и гликозидазы обнаружены в пищеварительных органах морских ежей, моллюсков, червей и голотурий. Кристаллические стебельки вьетнамских промысловых моллюсков Perna viridis и Tapes literata выбраны как источники для выделения и изучения новых 1->3-р-0-глюканаз.

2. Изучены каталитические свойства новой 1—»З-р-О-глюканазы из кристаллических стебельков двустворчатого моллюска Р. viridis, установлена аминокислотная последовательность. Фермент классифицирован как глюкан эндо-1—»З-Р-О-глюкозидаза (КФ 3.2.1.39) и отнесен к 16-ому структурному семейству О-гликозидгидролаз.

3. Показано, что 1—»З-Р-О-глюканаза из Р. viridis катализирует реакцию трансгликозилирования. Регистрация продуктов реакции методом масс-спектрометрии позволила использовать в качестве акцепторов глицерин, метил-p-D-глюкопиранозид, метил-р-О-ксилопиранозид и метанол. Установлено, что лучшим акцептором является глицерин.

4. Из кристаллических стебельков двустворчатого моллюска Т. literata в гомогенном виде выделена новая 1—>3-Р-0-глюканаза, изучены свойства фермента. Показано, что он обладает высокой трансгликозилирующей способностью. Фермент классифицирован как глюкан эндо-1—»З-Р-О-глюкозидаза (КФ 3.2.1.39). Анализ аминокислотной последовательности позволил отнести эндо-1—»З-Р-О-глюканазу к 16-ому структурному семейству О-гликозидгидролаз.

5. Проведен сравнительный анализ взаимосвязи структуры и каталитических свойств новых ферментов и известных эндо-1-»3-Р-0-глюканаз морского происхождения. Установлено, что термостабильность ферментов возрастает с увеличением количества дисульфидных связей.

6. Обнаружена способность О-гликозидгидролаз морского брюхоногого моллюска Японского моря Littorina sit/сапа катализировать гидролиз гликозидов изофлавоноидов. Показано, что структура агликона практически не влияет на скорость гидролиза. Наличие малоиильиого заместителя в углеводной компоненте существенно уменьшает скорость и степень гидролиза гликозидов изофлавоноидов 7. Расширена коллекция субстратов для 1—»З-Р-О-глюканаз. Из водоросли Сагйегра 1епИ1И/ега выделены новые 1—»З-р-О-глюканы, отличающиеся от известных ламинаранов более высокой молекулярной массой (от 20 до 60 кДа).

1. Gourley D.G., Shrive A.K., Polikarpov I., Krell T., Coggins J.R., Hawkins A.R. The two types of 3-dehydroquinase have distinct structures but catalyze the same overall reaction. //Nature Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 521-525.

2. Coutinho P.M., Deleury E., Davies G.J., Henrissat B. An evolving hierarchical family classification for glycosyltransferases. // J. Mol. Biol. 2003. V. 328. 307-317.

3. Bartlett G.J., Borkakoti N., Thornton J.M. Catalysing new reactions during evolution: economy of residues and mechanism // J. Mol. Biol. 2003. V. 331, № 4. P. 829-860.

4. Babbitt P.C., Gerlt J.A. Understanding enzyme superfamilies. Chemistry As the fundamental determinant in the evolution of new catalytic activities // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, № 49. P. 30591-30594.

5. Todd A.E., Orengo C.A., Thornton J.M. Evolution of function in protein superfamilies, from a structural perspective // J. Mol. Biol. 2001. V. 307, № 4. P. 1113-1143.

6. Gariev I.A., Varfolomeev S.D. Hierarchical classification of hydrolases catalytic sites // Bioinformatics. 2006. V. 22, № 20. P. 2574-2576.

7. O'Boyle N.M., Holliday G.L., Almonacid D.E., Mitchell J.B. Using reaction mechanism to measure enzyme similarity // J. Mol. Biol. 2007. V. 368, № 5. P. 14841499.

8. Henrissat B., Callebaut I., Fabrega S., Lehn P., Mornon J.P., Davies G. Conserved catalytic machinery and the prediction of a common fold for several families of glycosyl hydrolases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92, № 15. P. 70907094.

9. McCarter J.D., Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis // Curr. Opin. Struct. Biol. 1994. V. 4, № 6. P. 885-892.

10. Koshland D. // Biol. rev. 1953. V. 28. P. 416.

11. Vocadlo D.J., Withers S.G. Detailed comparative analysis of the catalytic mechanisms of beta-N-acetylglucosaminidases from families 3 and 20 of glycoside hydrolases // Biochemistry. 2005. V. 44, № 38. P. 12809-12818.

12. Mark B.L., Vocadlo D.J., Knapp S., Triggs-Raine B.L., Withers S.G., James M.N. Crystallographic evidence for substrate-assisted catalysis in a bacterial beta-hexosaminidase // J. Biol. Chem. 2001. V. 276, № 13. P. 10330-10337.

13. Watson J.N., Dookhun V., Borgford T.J., Bennet A.J. Mutagenesis of the conserved active-site tyrosine changes a retaining sialidase into an inverting sialidase // Biochemistry. 2003. V. 42, № 43. P. 12682-12690.

14. Klebl F., Tanner W. Molecular cloning of a cell wall exo-beta-l,3-glucanase from Saccharomyces cerevisiae // J. Bacteriol. 1989. V. 171, № 11. P. 6259-6264.

15. Riou C., Salmon J.M., Vallier M.J., Gunata Z., Barre P. Purification, characterization, and substrate specificity of a novel highly glucose-tolerant betaglucosidase from Aspergillus oryzae // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64, № 10. P. 3607-3614.

16. Comitini F., Di Pietro N., Zacchi L., Mannazzu I., Ciani M. Kluyveromyces phaffii killer toxin active against wine spoilage yeasts: purification and characterization // Microbiology. 2004. V. 150, Pt 8. P. 2535-2541.

17. Izgu F., Altinbay D. Isolation and characterization of the K5-type yeast killer protein and its homology with an exo-beta-l,3-glucanase // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2004. V. 68, №3. P. 685-693.

18. Kritzman G., Chet I., Henis Y. Localization of beta-(l,3)-glucanase in the mycelium of Sclerotium rolfsii // J. Bacteriol. 1978. V. 134, № 2. P. 470-475.

19. Cortat M., Matile P., Wiemken A. Isolation of glucanase-containing vesicles from budding yeast // Arch. Mikrobiol. 1972. V. 82, № 3. P. 189-205.

20. Santos T., Sanchez M., Villanueva J.R., Nombela C. Regulation of the beta-1,3-glucanase system in Penicillium italicum: glucose repression of the various enzymes //J. Bacteriol. 1978. V. 133, № 2. P. 465-471.

21. Molina M., Cenamor R., Sanchez M., Nombela C. Purification and some properties of Candida albicans exo-l,3-beta-glucanase // J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135, Pt 2. P. 309-314.

22. Brown R., Embil J.M. p-Glucanases // Handbook of Microbiology. Boca Ration: CRC Press. 1987. V. VIII. P. 301-315.

23. Kasahara S., Nakajima T., Miyamoto C., Wada K., Furuichi Y., Ichishima E. Characterization and mode of action of exo-l,3-beta-D-glucanase from Aspergillus saitoi II J. Bacterid. 1992. V. 108. P. 184-190.

24. Bodenmann J., Heiniger U., Hohl H.R. Extracellular enzymes of the Phytophtora infestans: endo-cellulase, ß-glucosidases, and 1,3-ß-glucanases // Canad. J. Microbiol. 1985. V. 31. P. 75-82.

25. Richelt B.Y., Fleet G.H. Isolation, properties, function, and regulation of endo-(l-3)-beta-glucanases in Schizosaccharomyces pompe II J. Bacteriol. 1981. V. 147. P. 1085-1094.

26. Fontaine T., Ilartland R.P., Beauvais A., Diaquin M., Latge J.P. Purification and characterization of an endo-l,3-beta-glucanase from Aspergillus fumigatus // Eur J Biochem. 1997. V. 243, № 1-2. P. 315-321.

27. Fontaine T., Hartland R.P., Diaquin M., Simenel C., Latge J.P. Differential patterns of activity displayed by two exo-beta-l,3-glucanases associated with the Aspergillus fumigatus ccll wall //J. Bacteriol. 1997. V. 179, № 10. P. 3154-3163.

28. Stubbs H.J., Brasch D.J., Emerson G.W., Sullivan P.A. Hydrolase and transferase activities of the beta-l,3-exoglucanase of Candida albicans // Eur. J. Biochem. 1999. V. 263, № 3. P. 889-895.

29. Castresana C., de Carvalho F., Gheysen G., Habets M., Inze D., Van Montagu M. Tissue-specific and pathogen-induced regulation of a Nicotiana plumbaginifolia beta-1,3-glucanase gene //Plant Cell. 1990. V. 2, № 12. P. 1131-1143.

30. Genta F.A., Terra W.R., Ferreira C. Action pattern, specificity, lytic activities, and physiological role of five digestive beta-glucanases isolated from Periplaneta americana // Insect Biochem. Mol.Biol. 2003. V. 33, № 11. P. 1085-1097.

31. Ebel J. Oligoglucoside elicitor-mediated activation of plant defense // Bioessays. 1998. V. 20, №7. P. 569-576.

32. Umemoto N., Kakitani M., Iwamatsu A., Yoshikawa M., Yamaoka N., Ishida I. The structure and function of a soybean beta-glucan-elicitor-binding protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94, № 3. P. 1029-1034.

33. Mithofer A., Fliegmann J., Neuhaus-Url G., Schwarz H., Ebel J. The hepta-beta-glucoside elicitor-binding proteins from legumes represent a putative receptor family // Biol. Chem. 2000. V. 381, № 8. P. 705-713.

34. Sangwan I., O'Brian M.R. Identification of a soybean protein that interacts with GAGA element dinucleotide repeat DNA // Plant Physiol. 2002. V. 129, № 4. P. 1788-1794.

35. Fliegmann J., Montel E., Djulic A., Cottaz S., Driguez H., Ebel J. Catalytic properties of the bifunctional soybean beta-glucan-binding protein, a member of family 81 glycoside hydrolases // FEBS Lett. 2005. V. 579, № 29. P. 6647-6652.

36. Chesters C.G., Bull A.T. The enzymic degradation of laminarin. 1. The distribution of laminarinase among micro-organisms // Biochem. J. 1963. V. 86. P. 28-31.

37. Piavaux A. Distribution and localization of the digestive laminarinases in animals // Biochemical Systematics and Ecology. 1977. V. 5, № 3. P. 231-239

38. Pauchet Y., Freitak D., Heidel-Fischer H.M., Heckel D.G., Vogel H. Immunity or digestion: glucanase activity in a glucan-binding protein family from Lepidoptera // J. Biol. Chem. 2009. V. 284, № 4. P. 2214-2224.

39. Kumagai Y., Ojima T. Enzymatic properties and the primary structure of a beta-1,3-glucanase from the digestive fluid of the Pacific abalone Haliotis discus hannai // Сотр. Biochem. Physiol. 2009. V. 154 В, № 1. P. 113-120.

40. Захаренко A.M., Кусайкин М.И., Ли Б.М., Хуэн Ф.В., Кхань Х.Х., Сова В.В., Звягинцева Т.Н. Каталитические свойства эндо-1,3-Ь-0-глюканазы из вьетнамской мидии Perna viridis // Биоорган, химия. 2009. Т. 35, № 1 .С. 62-69.

41. Genta F.A., Bragatto 1., Terra W.R., Ferreira C. Purification, characterization and sequencing of the major beta-l,3-glucanase from the midgut of Tenebrio molitor larvae // Insect Biochem. Mol. Biol. 2009. V. 39, 12. P. 861-874.

42. Sova V.V., Elyakova L.A. Some aspects of the specificity and action pattern of -1,3-glucan glucanohydrolase from Spisula sachalinensis // Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 258, № 1. P. 219-227.

43. Favorov V.V., Vozhova E.I., Denisenko V.A., Elyakova L.A. A study of the reaction catalysed by alginate lyase VI from the sea mollusc, Littorina sp // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 569, № 2. P. 259-266.

44. Giordano A., Andreotti G., Mollo E., Trincone A. Transglycosylation reactions performed by glycoside hydrolases from the marine anaspidean mollusc Aplysia fasciata // J. Mol. Cat. B-Enzym. 2004. V. 30, № 2. P. 51-59.

45. Kumagai Y., Inoue A., Tanaka H., Ojima T. Preparation of P-l,3-glucanase from scallop mid-gut gland drips and its use for production of novel heterooligosaccharides // Fisheries Science. V. 74, № 5. P. 1127-1136.

46. Kumagai Y., Ojima T. Isolation and characterization of two types of beta-1,3-glucanases from the common sea hare Aplysia kurodai // Сотр. Biochem. Physiol. 2010. V. 155 B, № 2. P. 138-144.

47. Звягинцева Т.Н., Елякова JI.A., Исаков B.B. Ферментативное превращение ламинаранов в 1—>3;1—>6-(3-0-глюканы, обладающие иммуностимули-рующим действием // Биоорган, химия. 1995. Т. 22, № 3. С. 218-225.

48. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Механизм действия и специфичность эндо-1—>3-P-D-глюканаз морских моллюсков // Биоорган, химия. 1994. Т. 20, № 5. С. 453474.

49. Bachman E.S., McClay D.R. Molecular cloning of the first metazoan beta-1,3 glucanase from eggs of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93, № 13. P. 6808-6813.

50. Roux M.M., Pain A., Klimpel K.R., Dhar A.K. The lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein gene is upregulated in white spot virus-infected shrimp (Penaeus stylirostris) // J. Virol. 2002. V. 76, № 14. P. 7140-7149.

51. Libertini E., Li Y., McQueen-Mason S.J. Phylogenetic analysis of the plant endo-beta-1,4-glucanase gene family // J. Mol. Evol. 2004. V. 58, 5. P. 506-515.

52. Lee W.J., Lee J.D., Kravchenko V.V., Ulevitch R.J., Brey P.T. Purification and molecular cloning of an inducible gram-negative bacteria-binding protein from the silkworm, Bombyx raori // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93, № 15. P. 78887893.

53. Ma C., Kanost M.R. A betal,3-glucan recognition protein from an insect, Manduca sexta, agglutinates microorganisms and activates the phenoloxidase cascade // J. Biol. Chem. 2000. V. 275, № 11. P. 7505-7514.

54. Fabrick J.A., Baker J.E., Kanost M.R. cDNA cloning, purification, properties, and function of a beta-l,3-glucan recognition protein from a pyralid moth, Plodia interpunctella // Insect Biochem. Mol. Biol. 2003. V. 33, № 6. P. 579-594.

55. Henrissat В., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. V. 293, Pt 3. P. 781788.

56. Широкова П.И., Елякова JI.A. Экзо-Р-1,3-глюканаза из улитки Eulota maakii // Биоорган, химия. 1977. Т. 3. С. 1656-1662.

57. Sova V.V., Elyakova L.A., Vaskovsky V.E. The distribution of laminarinases in marine invertebrates // Сотр. Biochem. Physiol. 1970. V. 32 B. P. 459-464.

58. Privalova N.M., Elyakova L.A. Purification and some properties of endo-pi,-glucanase from marine bivalve Chlamys albidus // Сотр. Biochem. Physiol. 1978. V. 60 B. P. 225-228.

59. Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Ермакова С.П., Елякова Л.А. Получение п-нитрофенил-ламинариолигозидов реакцией трансгликозилирования, катализируемой эндо-1,3-р-0-глюканазой из морского моллюска // Биоорган, химия. 1998. Т. 24, № 3. С. 219-223.

60. Turkiewicz M., Galas E., Zielinska M. Purification and partial characterization of an endo-(l-3)-|3-D-glucanase from Euphasia superba Dana (Antarctic krill) // Polar Biol. 1985. V. 4. P. 203-211.

61. Takeuchi K. Purification and characterization of exo-beta-1,3-glucanase from a hatching supernatant of Strongylocentrotus intermedius // Canad. J. Biochem. Cell Biol. 1983. V. 61, № 1. P. 54-62.

62. Talbot C.F., Vacquier V.D. The purification and characterization of an exo-beta-1,3-glucanohydrolase from sea urchin eggs // J. Biol. Chem. 1982. V. 257, № 2. P. 742746.

63. Green J.D., Glas P.S., Cheng S.D., Lynn J.W. Fertilization envelope assembly in sea urchin eggs inseminated in chloride-deficient sea water: II. Biochemical effects // Mol. Reprod. Dev. 1990. V. 25, №2. P. 177-185.

64. Muchmore A.V., Epel D., Weaver A.M., Schimke R.T. Purification and properties of an exo-beta-D-l,3-glucanase from sea urchin eggs // Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 178, №3. P. 551-560.

65. Cline K., Albersheim P. Host-Pathogen Interactions: XVI. Purification and characterization of a beta-glucosyl hydrolase/transferase present in the walls of soybean cells // Plant Physiol. 1981. V. 68, № 1. P. 207-220.

66. Cline K., Albersheim P. Host-Pathogen Interactions : XVII. Hydrolysis of biologically active fungal glucans by enzymes isolated from soybean cells // Plant Physiol. 1981. V. 68, № 1. P. 221-228.

67. Lienart Y., Comtat J., Barnoud F. A wall-bound exo-l,3-D-glucanase from Acacia cultured cells // Biochem. Biophys. Acta. 1986. V. 883. P. 353-360.

68. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Кинетические особенности действия эндо-1-3-0-D-глюканаз из различных источников // Биоорган, химия. 1981. Т. 7. С. 680685.

69. Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Елякова Л.А. Структура и иммунотропное действие 1—>3; 1—>6-Р-В-глюканов. Владивосток: Дальнаука. 2002. 160 с.

70. Eylakova L.A., Shilova T.G. Characterization of the type of action of beta-1,3-glucanases from marine invertebrates // Сотр. Biochem. Physiol. 1979. V. 64 B, № 3. P. 245-248.

71. Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Привалова Н.М. Сравнительная характеристика и изучение сорбционных свойств активных центров эндо-р-1,3-глюканаз из морских беспозвоночных//Биоорган, химия. 1978. Т. 4. № 11. С. 1553-1559.

72. Duffus J.H., Levi С., Manners D.J. Yeast cell-wall glucans // Adv. Microb. Physiol. 1982. V. 23. P. 151-181.

73. Нага C., Kiho Т., Ukai S. A branched (l-3)-P-Dglucan from a sodium carbonate extract of Dictyophora indusiata Fisch. // Cardohydr. Res. 1983. V. 117. P. 201-213.

74. Johnson J., Kirkwood S., Misaki A., al. e. Structure of a new glucan // Chem. Ind. 1963. V. 9. P. 820-822.

75. Shida M., Ushioda Y., Nakajima Т., Matsuda K. Structure of the alkali-insoluble skeletal glucan of Lentinus edodes // J. Biochem. 1981. V. 90, № 4. P. 1093-1100.

76. Sietsma J.H., Wessels J.G. Chemical analysis of the hyphal wall of Schizophyllum commune // Biochim. Biophys. Acta. 1977. V. 496, № 1. P. 225-239.

77. Елинов Н.П. Некоторые микробные полисахариды и их применение // Успехи микробиологии. 1982. Т. 7. С. 158-177.

78. Dubourdieu D., Ribereau-Gayon P., Fournet В. Structure of the extracellular P-D-glucan from Botrytis cinerea // Carbohydr. Res. 1981. V. 93. P. 294-299.

79. Harada Т., Masada M., Fujimori K., Maeda J. Production of a firm resilient gel-forming polysaccharide by a mutant of Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3 // Agric. Biol. Chem. 1966. V. 30. P. 196-198.

80. Iwamuro Y., Murata M., Kanamaru K., al. e. Structural analisis of an extracellular polysaccharide of Porodisculus pendulus // Agric. Biol. Chem. 1981. V. 45. P. 525526.

81. Ohno N., Suzuki I., Yadomae T. Structure and antitumor activity of a beta-l,3-ghican isolated from the culture filtrate of Sclerotinia sclerotiorum IFO 9395 // Chem. Pharm. Bull (Tokyo). 1986. V. 34, № 3. P. 1362-1365.

82. Ueno Y., Hachisuka Y., Esaki H. Structural analysis of extracellular polysaccharide of Sclerotinia libertiana // Agric. Biol. Chem. 1980. V. 44. P. 353-359.

83. Warsi S.A., Whelan W.J. Structure of pachyman, the polysaccharide component of Poria cocos Wolf// Chem. Ind. 1957. V. 48. P. 1573.

84. Kato K., Mutoh K., Egashira T., al. e. Chemical heterogeneity of (3-D-glucan in sclerotia of Grifora umbellate (fr.) // Plat Chem. 1978. V. 42. P. 1073-1074.

85. Miyazaki T., Oikawa N. Studies on fungal polysaccharides. XII. Water-soluble polysaccharide of Grifora umbellate (Fr.) Pilat. // Chem. Pharm. Bull. 1973. V. 21. P. 2545-2548.

86. Ohno N., Adachi Y., Suzuki I., Sato K., Oikawa S., Yadomae T. Characterization of the antitumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa // Chem. Pharm. Bull. 1986. V. 34, №4. P. 1709-1715.

87. Singh P.P., Whistler R.L., Tokuzen R., Nakahara W. Scleroglucan, an antitumor polysaccharide from Sclerotium glucanicum // Carbohydr. Res. 1974. V. 37, № l.P. 245-247.

88. Wang M.C., Bartnicki-Garcia S. Mycolaminarans: storage (l-3)-beta-D-glucans from the cytoplasm of the fungus Phytophthora palmivora // Carbohydr. Res. 1974. V. 37. P. 331-338.

89. Manners D.J., Ryley J.F., Stark J.R. Studies on the metabolism of the protozoa. The molecular structure of the reserve polysaccharide from Astasia ocellata // Biochem. J. 1966. V. 101, №2. P. 323-327.

90. Painter T.J. Structural evolution of glycans in algae // Pure Appl. Chem. 1983. V. 55. P. 677-694.

91. SalkowskiE. (1984), Berlin. Vol. 27.

92. Zechmeister L., Toth G. // Biochem. Z. 1934. V. 270. P. 309.

93. Schimideberg J.E.O. // Gesellschaft deutcher Naturforschung and Lrzte, Leipzing, Tageblatt der Versammlung. 1885. V. 58. P. 427-428

94. Riggi S.J., Di Luzio N.R. Identification of a reticuloendothelial stimulating agent in zymosan // Amer. J. Physiol. 1961. V. 200. P. 297-300.

95. Reagents for immunology // Nature. 1990. V. 346. P. 591-592

96. Wang Z.M., Cheung Y.C., Leung P.IL, Wu J.Y. Ultrasonic treatment for improved solution properties of a high-molecular weight exopolysaccharide produced by a medicinal fungus // Bioresour. Technol. V. 101, № 14. P. 5517-5522.

97. Leathers T.D., Nunnally M.S., Cote G.L. Optimization of Process Conditions for Enzymatic Modification of Alternan using Dextranase from Chaetomium erraticum // Carbohydr. Polym. 2010. V. 81. P. 732-736.

98. Xu X., Wang X., Cai F., Zhang L. Renaturation of triple helical polysaccharide lentinan in water-diluted dimethylsulfoxide solution // Carbohydr. Res. V. 345, № 3. P. 419-424.

99. Sang H.M., Fotedar R. Effects of dietary beta-l,3-glucan on the growth, survival, physiological and immune response of marron, Cherax tenuimanus (smith, 1912) // Fish Shellfish Immunol. 2010. V. 28, № 5-6. P. 957-960.

100. Bromuro C., Romano M., Chiani P., Berti F., Tontini M., Proietti D., Mori E., Torosantucci A., Costantino P., Rappuoli R., Cassone A. Beta-glucan-CRM197 conjugates as candidates antifungal vaccines // Vaccine. V. 28, № 14. P. 2615-2623.

101. Chattopadhyay N., Ghosh T., Sinha S., Chattopadhyay K., Karmakar P., Ray B. Polysaccharides from Turbinaria conoides: Structural features and antioxidant capacity // Food Chemistry. 2010. V. 118. P. 823-829.

102. Mcntosh M., Stone В .A., Stanisich V.A. Curdalan and other bacterial (l-3)-beta-D-glucans // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. № 68. P. 163-173.

103. Бурцева Ю.В., Веригина H.C., Сова B.B., Пивкин М.В., Звягинцева Т.Н. О-гликозилгидролазы морских мицелиальных грибов. р-1,3-Глюканазы морского гриба Trichoderma aureviride II Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39, № 5. С. 542-548.

104. Sinnott M.L. Catalytic mechanisms of enzymic glycosyl transfer. // Chem. Rev. 1990. V. 90. P. 1171-1202.

105. Tang L., Kebarle P. Dependence of ion intensity in electrospray mass spectrometry on the concentration of the analytes in the electrosprayed solution // Anal. Chem. 1993. V. 65, № 24. P. 3654-3668.

106. Bonnin E., Vigouroux J., Thibault J.F. Kinetic-Parameters of Hydrolysis and Transglycosylation Catalyzed by an Exo-Beta-(l,4)-Galactanase // Enzyme and Microbial. Technology. 1997. V. 20, № 7. P. 516-522.

107. Elyakova L.A., Zvyagintseva T.N. A study of the laminarins of some Far-Eastern, brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1974. V. 34, № 2. P. 241-248.

108. Сова В.В., Левина Э.В., Андриященко П.В., Федоров С.Н., Елякова Л.А. Действие полиоксистероидов из морских звезд и офиур на активность бета-1,3-глюканаз // Химия природ, соедин. 1994. Т. 5. С. 647-650.

109. Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Стоник В.А., Елякова Л.А. Сульфатироваиные стероиды губок семейства Halichondriidae природные ингибиторы эндо-1,3-(3-0-глюканаз // Химия природ, соедин. 1986. № 1. С. 7178.

110. Бакунина И.Ю., Сова В.В., Елякова Л.А., Макарьева Т.Н., Стоник В.А., Пермяков Е.А., Емельяненко В.И. Влияние сульфатов полиоксистероидов на экзо- и эндоглюканазы // Биохимия. 1991. Т. 56, № 8. С. 1397-1405.

111. Sritunyalucksana К., Soderhall К. The proPO and clotting system in crustaceans // Aquaculture. 2000. V. 191. P. 53-69.

112. Gueguen Y., Voorhorst W.G., van der Oost J., de Vos W.M. Molecular and biochemical characterization of an endo-beta-1,3- glucanase of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // J. Biol. Chem. 1997. V. 272, № 50. P. 31258-31264.

113. Matz M., Shagin D., Bogdanova E., Britanova O., Lukyanov S., Diatchenko L., Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR//Nucleic Acids Res. 1999. V. 27, № 6. P. 1558-1560.

114. Keitel Т., Simon O., Borriss R., Heinemann U. Molecular and active-site structure of a Bacillus 1,3-1,4-beta-glucanase // Proc. Natl. Acad Sci USA. 1993. V. 90, № 11. P. 5287-5291.

115. Juncosa M., Pons J., Dot Т., Querol E., Planas A. Identification of active site carboxylic residues in Bacillus licheniformis 1,3-1,4-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase by site-directed mutagenesis // J. Biol. Chem. 1994. V. 269, № 20. P. 14530-14535.

116. Рабинович M.JI., Мельник M.C., Болобова A.B. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов // Биохимия. 2002. Т. 8. С. 1026-1050.

117. Лакизова И.Ю., Елякова Л.А., Емельяненко В.И., Пермяков Е.А., Бурштейн Э.А. Сравнительное изучение бета-1,3- глюканаз морских моллюсков по флуоресценции триптофана // Биофизика. 1988. Т. 33, № 1. С. 31-35.

118. Светашева Т.Г., Сова В.В., Шевченко Н.М., Елякова Л.А. Исследование функциональных групп, существенных для каталитической активности бета-1,3-глюканазы из Chlamys albidus, методом химической модификации // Биохимия. 1984. Т. 49, № 11. С. 1762-1768.

119. Елякова Л.А., Светашева Т.Г., Лакизова И.Ю. Значение гистидина для активности бета-1,3-глюканазы IV из Spisula sachalinensis II Биоорган, химия. 1977. Т. 3,№3.C. 415-420.

120. Елякова Л.А., Сова В.В., Светашева Т.Г., Лакизова И.Ю. О возможной роли триптофана в ферментативной активности бета-1,3-глюканазы из Spisula sachalinensis II Биоорган, химия. 1976. Т. 2, № 1. С. 90-97.

121. Сова В.В., Елякова Л. А. Влияние реагентов, взаимодействующих с карбоксильными группами, на бета-1,3-глюканазу из Spisula sachalinensis II Биоорган, химия. 1978. Т. 4, № 11. С. 1547-1552.

122. Сова В.В., Мястовская Т.Г., Светашева Т.Г., Филитова М.Б., Елякова Л.А. Сравнение энзиматических и структурных характеристик бета-1,3-глюканаз из морских моллюсков. //Химия природ, соедин. 1987. Т. 4. С. 577-582.

123. Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н. Кинетические особенности действия 1,3-бета-глюканаз из различных источников // Биоорган, химия. 1981. Т. 7, № 5. С. 680685.

124. Delmonte P., Rader J.I. Analysis of isoflavones in foods and dietary supplements // J. AOAC Int. 2006. V. 89, № 4. P. 1138-1146.

125. Day A.J., DuPont M.S., Ridley S., Rhodes M., Rhodes M.J., Morgan M.R., Williamson G. Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid glycosides by human small intestine and liver beta-glucosidase activity // FEBS Lett. 1998. V. 436, № 1. P. 71-75.

126. Keung W.-M. Daidzin: A potent, selective inhibitor of human mitochondrial aldehyde dehydrogenase // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. V. 90, № 4. P. 1247-1251.

127. Bilan M.I., Vinogradova E.V., Shashkov A.S., Usov A.I. Structure of a highly pyruvylated galactan sulfate from the Pacific green alga Codium yezoense (Bryopsidales, Chlorophyta) // Carbohydr. Res. 2007. V. 342, № 3-4. P. 586-596.

128. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Popivnich I.B., Isakov V.V., Scobun A.S., Sundukova E.V., Elyakova L.A. A new procedure for the separation of water -soluble polysaccharides from brown seaweeds // Carbohydr. Res. 1999. V. 322. P. 32-39.

129. Nelson T.E., Scarletti J.V., Smith F., Kirkwood S. // Can. J. Chem. 1962. V. 245. P. 1671-1678.

130. Nelson T.E. A photometric adaptation of the Somogy method for the determination of glucose // J. Biol. Chem. 1944. V. 153. P. 375-381.

131. Dubois M., Gilles K.A., Plamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. // Anal. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

132. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

133. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227, № 5259. P. 680-685.

134. Colburn N.H., Wendel E.J., Abruzzo G. Dissociation of mitogenesis and late-stage promotion of tumor cell phenotype by phorbol esters: mitogen-resistant variants are sensitive to promotion // Proc. Natl. Acad Sci USA. 1981. V. 78, № 11. P. 69126916.

135. McFeeters R.F. A manual method for reducing sugar determinations with 2,2'-bicinchoninate reagent // Analytical Biochemistry. 1980. V. 103, № 2. P. 302-306.