Изучение специфичности и механизма действия эндо-13- β-D-глюканаз из морских моллюсков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

изучение специфичности и механизма действия эндо-1-»з-р-о-глкжаназ из морских моллюсков

02.0010 — биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Авторе ф Ь р а т

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

На правах рукописи

ЗВЯГИНЦЕВА Татьяна Николаевна

Владивосток — 1994

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганическоп химии Дальневосточного отделения РАН.

Научный консультант: доктор химических наук,

профессор Елякова Л.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Рабинович М.Л.

доктор химических наук Соловьева Т.ф.

доктор биологических наук, профессор Дзадзиева М.Ф.

Ведущее предприятие Санкт-Петербургский Институт

ядерной физики РАН

Защита состоится " 5" " июля 1094 г. в " " часов на заседании .Специализированного Совета Д.003.99.01 по защите диссертаций и Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100-летия Владивостока, 159, ТИБОХ.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке

ДВО РАН

(г. Владивосток, пр. проспект 100-летия Владивостока, 159, ДВГИ) Автореферат разослан мая 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ■кандидат химических наук

общая характеристика работы.

- Актуальность проблемы. В последние 10-15 лет значительно увеличилось число публикаций, связанных с изучением 1-»3- н 1—>3;1-»6-Р-0-глюканон и ферментов, катализирующих их преобразование. 1->3;1-»6-р-0-Глюкоолпго- и полисахариды являются полифункцпоналышми соединениями. Спектр выполняемых ими функций колеблется от резервных и структурных до функций клеточного "узнавания".

Наибольший интерес вызывают иммуномодулирующие свойства этих глюканов. Они запускают множество реакций защиты хозяина, например, штиопухолевую активность у животных, наработку защитных PR-белков и :воеобразных антибиотиков — фитоалексинов у растений. Поэтому участие 1—>3,1—>6-р-0-глюканов в иммунитете как животных, так и растений изучается 1аиболее интенсивно. Это связано прежде всего с перспективами создания сак нетоксичных иммуностимуляторов, так и экологически чистых средств 1ащнты растений, действие которых основано на стимуляции природных 1еханизмов защиты. Так, 1->3;1->6-р-0-глюканы применяются в качестве [репаратов антиопухолевого и иммуностимулирующего действия в клиниках [понии (лентинан и шизофиллан из грибов) и США (частпчковый глюка и из рожжен) .

В преобразованиях 1 —>3; 1 —>6-р-В-глюкапов принимают участие l->3-|3-D-<иоканазы — ламинариназы. Изучение механизмов ферментативного ката-иза относится к центральным проблемам молекулярной биологии, гликозпль-ый же транспорт, в свою очередь, является важнейшей биохимической реак-ией. В частности, ферментативная деградация полисахаридов — один из |ундаментальных молекулярно-биологических процессов (например, рагщеп-зние крахмала, целлюлозы, ламинаранов). Катализирующие деградацию по-исахаридов карбогидразы наиболее широко применяются в нро-

ышленности. Среди карбогидраз 1->3-р-0-глюканазы занимают, как сейчас юлне обосновано можно утверждать, особое место, отличаясь разпооб-азием каталитического действия на субстраты, что объективно обусловлено ногообразием структур и физико-химических свойств их субстратов — -*3; 1-»6-Р-0-глюканов. Поэтому, изучение механизма действия l->3-(i-D-юканаз актуально как с теоретической, так и с практической точек зрения, г о связано с созданием новых веществ, в т.ч. лекарств, новых технологий, а кже с новыми решениями проблем познания основ функционирования ;рмеитов.

Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение механизма действия и специфичности трех эндо-1->3-р-0-глюкаиаз из морских моллюсков (ЛШ, ЛГУ из 5р1зи1а $асЬаНпспз13 и Ло из СЫатуэ а1Ыёиз), а также синтез с помощью ферментов изученной специфичности биологически активных 1—>3; 1—>6-Р-0-глкжанов из неактивных исходных полисахаридов.

Поскольку изучение распределения продуктов ферментативных реакций является в настоящее время основным, а часто и единственным источником информации об особенностях структуры и механизма действия карбогндраз, в задачи настоящего исследования входили разработка методов выделения, качественного и количественного анализа глюкоолиго- и полисахаридов и различных гликозидов, а также поиск п установление структуры ламшшра-нов из различных видов бурых водорослей и природных ингибиторов ламинариназ.

Научная ценность. Впервые для 1—>3-р-И-гАЮканаз эндо-тигщ действия проведено систематическое экспериментальное исследование совместного протекания реакций гидролиза и трансглпкозилированпя. Информация, полученная в результате этого исследования, практически отсутствует для эндо-глкжаназ, хотя она представляет как научный, так и практический интерес, и необходима для выяснения сложных аспектов взаимодействия карбогндраз с полисахаридами.

При взаимодействии 1—>3-р-0-глюкапаз из морских моллюсков с субстратами скорость процесса трансгликозилпрования в 20 тысяч раз превышает скорость гидролиза в случае лучших акцепторов, что отличает изучаемые ферменты от других групп карбогндраз. |

Исследована специфичность ферментов по отношению к структуре субстрата — донора гликозильных остатков. Установлено, что процесс гидролиза, катализируемый Ло и Л1У, малочувствителен к изменениям в структуре доноров, в то время как эффективность процесса трансгликозилпрования с увеличением доли 1—>6-связанной глюкозы в 1— >3; 1—>6-р-0-глюкаиах уменьшается более, чем на порядок.

Получена информация об особенностях структуры акцепторов, которые имеют критическое значение для их специфического взаимодействия с эидо-1—»З-Р-О-глюканазами и, соответственно, о структурах акцепторных участков активных центров ферментов. Показано, что акцепторный участок комплементарен остатку глюкозы и имеет гидрофобную область вблизи восстанавливающего конца молекулы.

Исследуемые эндо-1-»3-р-П-глюканазы специфичны к гидролизу р-1->3-глюкозидной связи. В процессе трансгликозилпрования Л1У катализирует синтез только Р-1->3-глюкозидной связи, в то время как Ло отличается гораздо

меньшей специфичностью и способна, помимо ß-1—>3-глюкозпдпой связи, катализировать синтез ß-l->4- и ß-1->6-глюкозидных связей. Благодаря атому, именно под действием Ло образуется из исходного ламшгарана новый 1—>3; 1—>6-ß-D-ivuoKaH большей молекулярной массы с высоким содержанием 1-»6-связей, названный трансламом.

Изучение специфичности п механизма действия эндо-1—>3-р-0-глюкапаз Ло, AIV и Л III из близкородственных источников позволило сделать вы иод, что среди них ЛГУ является высокоспецифпчным ферментом как в реакциях гидролиза, так и трансгликози'лнрованпя. Поэтому для структурных исследований углеводов можно рекомендовать только Л1У.

Среди исследованных ламинаранов обнаружены ламннараны необычного строения, источниками которых являются как дальневосточные, так и тропические виды водорослей.

В губках семейства Halichondriidac обнаружены природные ингибиторы 3HAO-l-»3-ß-D-niiOKaHa3 — халнетанол и сокотрастерин сульфаты. Выпилены другие потенциальные источники ингибиторов.

Практическая ценность работы.

1. Впервые из биологически неактивного ламшгарана был осуществлен ферментативный синтез нового 1->3;1->6-р-0-глюкана — транслама, обладающего эффективным иммуномодулирующпм, антибактериальным и радпопро-текторным действием. В литературе отсутствуют сообщения, свидетельствующие о ферментативном синтезе биологически активного полисахарида из неактивного неходкого под действием карбогидраз эндо-тнпа действия.

2. В настоящее время практически закончена стадия доклинических испытаний транслама как препарата для лечения острой лучевой болезни. Ог зарубежных аналогов транслам отличается прекрасной-растворимостью, отсутствием токсичности, пир огенности и нежелательных эффектов, связанных с нерастворимостью этих глюканов. В России препараты, подобные трансламу, отсутствуют.

3. Предложен технологически значимый метод получения транслама, в основе которого лежит его сорбция на гидрофобном сорбенте.

4. Предложены ферментативные методы получения различных рядов ß-D-глюкоолигосахаридов, а также Np- и метплглпкозидов. Выход целевых продуктов составляет от 5 до 40%..

5. Разработаны методы выделения ß-D-глюканов из водорослей, олиго- и полисахаридов из продуктов ферментативной трансформации 1—>3;1—>6-ß-D-глюканов. Один из предложенных нами методов выделения полисахаридов с помощью гидрофобного сорбента представляет собой одностадийный процесс, позволяющий проводить извлечение углеводов из очень разбавленных по

основному веществу растворов и экстрактов. Метод является технологичным и может быть применен на предприятиях, ведущих переработку бурых водорослей, для выделения из отваров водорослей таких ценных полисахаридов, как ламинаран и фу^оидан.

6. Найдены источники 1—>3; 1—>(3-р-0-глюканов различной структуры. Результаты изучения распространения ламинаранов в бурых водорослях представляют интерес для ресурсоведения.

Апробация работы и публикации. Основное содержание работы изложено в 20 статьях в центральных и международных изданиях. По результатам работы получено 8 авторских свидетельств.

Материалы диссертации докладывались на Международном симпоузиме стран СЭВ "Химия углеводов и их производных" (Москва, 1983 г.), на Всесоюзном симпоузиме "Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты" (Москва, 1984 г.), на XII и XIV Менделевских съездах (Баку, 1981 г., Ташкент, 1989 г.), на Специальном симпоузиме и 16-й Конференции ФЕБО (Греция, 1982 г., Москва, 1984 г.), на III, IV и V Всесоюзных биохимических съездах (Рига, 1974 г., Ленинград, 1980 г., Киев, 1986 г.), на III Международной конференции по химии и биотехнологии биологически активных природных продуктов (София, 1985 г.), на Дунайском симпоузиме по хроматографии (Ялта, 1985 г.), на XIII Международном конгрессе по биохимии (Амстердам, 1985), на XIII Международном симпоузиме по углеводам (Нью-Йорк, 1986 г.), на Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987 г.), на VI Всесоюзном симпоузиме "Инженерная энзимологня" (Вильнюс, 198Í! г.), на VII Симпоузиме ФРГ-СССР по химии пептидов и белком (Дилижаи, 1989), на IV Всесоюзной конференции "Химия, фармакология и механизмы действия противолучевых средств" (Москва, 1990 г.), на IV Советско-шведском симпоузиме по углеводам (Лунд, 1990 г.).

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, литературного обзора, содержащего сведения о механизмах действия карбогндраз, структурах и биологической функции 1—>3;1->6-р-0-глюканов, четырех глав с изложением собственных результатов, экспериментальной части и выводов. Диссертация содержит стр., 36 таблиц, 24 рис., 12 схем и список

цитированной литературы, включающий 409 ссылок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I. 1->3;1->6-р-Б-ГЛЮКАНЫ

Изучение механизма действия, а также такого свойства зндо-1->3-(5-0-глюканаз, как специфичность, требует максимально разнообразного набора

субстратов, ингибиторов, а также акцепторов. Наличие удобных методой качественного и количественного анализа продуктов ферментативных реакции — глюкозы, глюкоолиго-, полисахаридов и гликозидов также необходимо для этих исследований. Поэтому часть работы посвящена исследованиям распространения и установления структуры субстратов — ß-D-глюканоп из различных водорослей и грибов, ингибиторов изучаемых в данной работе эпдо-1->3-ß-D-глюканаз ЛШ, AIV из S.sachalincnsis и Ло из C.albidus, а также разработке новых методов выделения и анализа 1->3;1->6-р-0-глгакоолнго- и полисахаридов.

1.1. Структурные характеристики глюканов из бурых водорослей и грибов

Было проведено изучение распространения в бурых водорослях Охотского и Японского морей, тропической зоны Индийского океана :: некоторых грибах 1-»3;1—>6-ß-D-DU0KaH0B, а также исследовалась' их тонкая структура. Водоросли заготавливались в рейсах НИС "Академик Опарин" и на морской экспериментальной станции ТИБОХ (Приморский край, Хасанский район). Для поиска и установления структуры ламниараиов нами широко использовались 1-»3-р-В-глкжаназы.

Наиболее широко представлены в исследованиях бурые водоросли Охотского и Японского морей (15 видов, из которых 6 принадлежат к семейству ламинариевых). Нейтральные полисахариды практически полностью отсутствовали или содержались в небольших количествах (от 0,015 до 1%) в Laminaria angustata, L. yessoensis, ¡..japónica, Cosía:ia costata, Alaria fistulosa, Coccnphora langsdorfii, Pelvetia wrightii, Punctaria latifolia, Dcsmarestia viridis, Sphacrotrichin sp., Chordaiia magcllanica и Chorda filurn." Значительные различия в содержании ламинарана отмечаются даже в пределах одного семейства — ламинариевых, причем не только между видами водорослей, но зависят и от года сбора. Так, в L.cichorioides колебания от года к году составляли от 4 до 12%, в ¡..japónica — от следовых количеств до 1% (табл.1).

Все исследованные нейтральные полисахариды бурых водорослей оказались низкомолекулярными 1->3;1—yG-ß-D-глюканамп {по данным |3С-ЯМР-спектроскопии, гель-фильтрации и энзпматического гидролиза экзо- (ЛИ из Eulota maakii) и эндо-1-»3-р-0-глюканазами (AIV)}.

Значительные различия были отмечены для изучаемых лампнарапов в содержании ß-1-^б-связанных остатков глюкозы (табл.2-4). Так, под действием эндо-1~»3-р-0-глюканазы AIV на конечной стадии гидролиза из лампнарапов образовывались глюкоза, лампнарнбиоза и различные количества смешанных 1->3;1-»6-р-0-глюкотрц- и тетраоз. Количество этих соединений отражает содержание в ламинаранах ß-1-^б-связанных остатков D-глюкозы. Эти дан-

Таблица 1. Содержание ламннаранов в бурых водорослях, характеристика

различных образцов после первой стадии очистки

Источник Тип Выход (% от Моносахариды,

ламинарана экстракции сухого веса) состав (содержание, <?;)

Laminaria холодная 5,0 Glc (79); Gal (4); Xyl (7)

cichorioides горячая 5,0 Glc (92)

Laminaria холодная 1,0 и.о.'

qurjanovae горячая 2,5 Glc (75); Gal (5); Xyl (5)

Fucus холодная 1,0 Glc (60); Gal (9); L-Fuc (8);

cvanescens Man (9); Xyl (7)

горячая 1,5 Glc (41); L-Fuc (28)

Turbinaria sp. холодная 1,5 Glc (90)

(Сейшелц) горячая 0,2 Glc (92)

Turbinaria sp. холодная 0,015 H.O.

(Мальдивы) горячая 0,15 Glc (44); Gal (10); L-Hic (18);

Man (5)

Sargassum sp. холодная 1,6 Glc (92)

(Сейшелы) горячая 1,0 Glc (72); Gal (5); Xyl (3); Mail (-1)

' — не определяли.

ные, полученные с помощью ондофермента, хорошо согласуются с данными 13С-ЯМР-спектроскопин и метилирования. При анализе 13С-ЯМР-снектров количество р-1->3- и 1->6-глюкозпдных связей в ламинаранах определяли из значений интегральных интенсивностей сигналов с химическими сдвигами 61,4 и 69,4 м.д., 70,3 и 68,8 м.д., а также 103 и 85 м.д. Из расчетов следует, что в ламинаране из Кеусглсясепя содержится до 35% П-1->6-связси, тогда как и ламинаране из 1..диуапоуае они практически отсутствуют (табл.3,4).

По данным метилирования практически все ламниараны содержали небольшое количество внутрицепочечиых 1—>6-связанных остатков О-глюко.чы (табл.2), однако деградация по Смиту исследуемых ламннаранов не вызывала фрагментации их молекул. Следовательно, Р-1—>6-связанные остатки глюкозы находятся, главным образом, в ответвлениях от основной цени 1->3-|М> глюкана.

Даже в случае ламннарана из Р.сгапе^сел.;, содержащего около 9% внутрицепочечиых 1—>6-р-0-глюкозидных связей (табл.2), разрушение этих остатков в условиях деградации по Смиту не приводило к распаду его молекул. Очевидно, примерно половина разветвлений в этом глюкане существует в виде остатков генциобиозы, остальные — в виде остатков глюкозы (табл.2,4).

Присутствие различных 1->6-связаппых остатков В-глюкозы в ламинара-нах из L.c¡'chorioides и К еуапсвсепя следует также из гетерогенности сигналов С-5 этих остатков в 13С-ЯМР- спектрах: 75,2 и 75,2, 75,6 м.д., соответственно. В ламинаране из L.cichorioides основным по интенсивности является сигнал С-5 с химическим сдвигом 75,2 м.д. и минорным — сигнал С-5 с хим.сдвигом 75,(5

Таблица 2. Ацетаты метилгекситолов, полученные при метилировании ламинаранов с последующим гидролизом,

восстановлением и ацетилированием

Содержание ацетатов метилгекситолов

Ацетаты метилгекситолов I. с1с!юг101йсз 1.диг]'апоуас И. еуапсвсепя Транслам

(тип связи) хэ- гэ- ГЭ ГЭ, ВМФ' ХЭ

% 1 п. % | т о/ /о 1 т % | т % | т % | т

1-О-Ас; 2,3,4,5,6-пента-О-Ме 2,0 0,25 2,0 0,25 2,3 1,35 2,0 0,26 3,5 0,26 — 0

(манннт)

1,5-ди-О-Ас; 2,3,4,6-тетра- 13,5 1,69 13,0 1,62 7,7 4,53 10,0 1,3 19,0 1,43 13,0 1,14

О-Ме (н/в конец)

1,3,5-три-О-Ас; 2,4,6-три-О-Ме 74,0 9,25 75,0 9,37 88,0 51,8 78,0 10,1 55,5 4,13 67,6 5,93

(1,3-Р-0-ас)

1,5,6-три-О-Ас; 2,3,4-три-О-Ме 2,5 0,3 2,0 0,25 0,3 0,18 2,3 0,3 8,7 0,65 8,0 0,7

(1,6-р-0-С1с)

1,3,5,6-тетра-0-Ас;2,4-дн-0-Ме 8,0 1,0 8,0 1,0 1,7 1,0 7,? 1,0 13,3 1,0 11,4 1,0

(1,3,6-р-Р-С1с)

п 18 20 17 43 17 62

Мп, кДа 2,9 3,2-1 2,75 . 7,0 2,75 10,4

Манннтсодержащпе 33 40 33 87 61

молекулы, % -

' — ХЭ, ГЭ — ламинараны, полученные экстракцией при 25 и 50=С, соответственно;

ВМФ — высокомолекулярная фракция; " — мольная доля.

Таблица 3. Хим.сдвиги С-атомов (ф м.д.) в 13С-ЯМР-спектрах ламинаранов, Р-Р-глюкоолиго- и полисахаридов.

Соединение Элемент структуры С1 С2 СЗ С4 С5 С6 П

тип содержание, %

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11

Ламннаран из /^иси.1; сгалсА'сепх, 1^3 60-65 103,0 73,8 85,1 68,8 76,6 61,4 <2(1

ХЭ 1^3,6 103,3 74,1 85,6 70,3 75,2

1->6 35-40 103,3 74,1 76,2 70,3 75,6 69,4

манннт 63,8

продолжение табл.3

1 1 2 1 з 1 4 1 5 | 6 | 7 1 8 1 9 1 10

Ламинаран из Ьат^папа 1->3 85-90 103,0 73,8 85,1 68,8 76,6 61,4 <20

с1с1юг101с1сз, ХЭ 1->3,6 маннит 10-15 103,3 74,1 85,6 70,3 75,2 69,4 63,8

Ламинаран из I. дицапоуае, ГЭ 1->3 1->3,6 маннит 97-100 <3 103,0 73,8 85,1 68,8 70,3 76,6 75,2 61,4 63,8 <20

Ламинаран из ¿. дицапоуае, 1->3 85-90 103,0 73,8 85,1 68,8 76,6 61,4

ГЭ, ВМФ 1-»3,6 маннит 10-15 103,3 74,1 85,6 70,3 75,2 69,4 63,8

Ламинаран из I. дицапоуас, ХЭ 1->3 1->3,6 маннит 97-100 <3 103,0 73,8 85,1 68,8 85,6 70,3 76,6 61,4 63,8 <20

Ламинаран из Багдазяит ер. 1-»3 103,4 74,3 85,2 69,3 85,6 76,7 61,9

1->6 103,7 74,3 76,8 70,7 76,3 69,9

маннит 72,3 70,7 70,7 70,7 70,7 72,3

1->1,6<-

Пустулан из ЧтЫШсапа го$51са 1->6 104,2 74,2 76,8 70,7 76,3 70,0

Транслам С 1-»3 75 103,4 74,4 85,6 69,4 76,8 62,0

1->3,6 103,7 74,4 85,9 70,8 86,1 75,7 70,1

1^6 25 103,9 74,4 76,8 70,8 76,0 70,1

Транслам С 75 103,7 74,4 85,7 69,4 76,8 61,9

1->3,6 103,9 74,4 86,2 70,8 75,7 70,1

87,4

1-»6 25 103,7 74,4 76,8 70,8 76,0 70,1

продолжение табл.3

11 1 2 1 3 1 4 | 5 1 6 1 ? 1 8 1 9 | 10

Транслам И 1->3 65 103,6 74,2 85,7 69,3 76,7 61,9

1-»3,6 103,9 74,2' 86,1 70,7 75,8 69,9

87,3

1-»б 35 103,9 74,2 76,7 70,7 76,1 69,9

маннит 64,3

Транслам-С1с1—>6С1сЫН2 1->3 103,7 74,4 85,6 69,4 76,8 62,0

1-»3,6 103,9 74,7 86,1 70,9 75,7 70,9

87,5

1->6 104,2 74,9 76,8 70,0 76,0 70,0

?->6)С1сЫН2 а 90,3 55,5 70,9 70,9 72,8 68,9?

Р 93,9 58,05 73,2 70,9 76,8 68,9?

Ыр-Р-О-ламинарибиозид ->3)С1сИр 100,2 73,1 85,9 68,7 76,6 61,5

С1ср(1-> 103,1 74,2 76,3 70,3 76,6 61,3

Метил-2-0-метилцеллобнозид —>4)2МеС1са0Ме 97,1 80,9 71,9 80,9 71,9 61,3

С1сЗ(1—> 103,3 73,4 76,5 70,3 76,5 61,3

-О-Ме 55,4 58,5

Ламинаритриоза —>ЗС1с а 92,6 71,7 82,9 68,8 71,9 61,4

Р 96,4 74,5 84,9 68,8 76,2 61,4

—>ЗС1с1—> 103,2 73,9 85,2 68,8 76,2 61,4

ас1-> 103,5 74,1 76,2 70,0 76,7 61,4

62-Р-0-Глюкозилламинарибиоза —>ЗС1с а 92,5 71,6 84,0 68,9 72,3 61,3

Р 86,2 73,8 85,2 69,4 76,2 61,3

->6С1с1-> 103,1 73,8 76,2 70,2 75,3 69,9

103,3 73,8 76,2 70,2 76,2 61,3

С1с1-> 104,0 74,5 77,0 71,0 77,0 62,0

63-р-В-Глюкознлламинарнтриоза —>ЗС1с а 92,7 71,7 83,2 68,9 72,0 61,5

Р 96,4 74,5 85,5 68,9 76,3 61,5

—>ЗС1с 1 --> 103,2 73,9 85,9 68,9 76,3 61,5

->6С1с1—> 103,5 74,1 76,3 70,4 75,5 69!5

ас!-> 103,5 74,0 76,3 70,4 76,7 61,5

Таблица 4. Структурные характеристики ламинаранов

Источник Mw, Мп Содержание 1,6-связей, % Распределение Фрагмент

ламинарана, кДа (метили- метили- действие 13С-ЯМР 1,6-связей вдоль структуры

тип экстракции" рование) рование ЛГУ, ЛИ цепи глюкана (ЛИ)

L. cichorioides ХЭ 5,0 2,75 10,5 12 10-12 сосредоточены у С1с1|

ГЭ 6,0 3,24 ' 10,0 9 8-10 невосстанавливаю 6

щего конца с1с1-1->зс1с1-]->зас...

L. gurjanovae" ХЭ 4,0 н.о. н.о. 4,5 <3

ГЭ 4,5 2,75 2,0 2 <3 -ИЗС1с1->]зас1-»

ГЭ, ВМФ 5-50 7,0 10,0 10 8-10 н.о.

Punctaria latifolia ХЭ 4,5 н.о. н.о. 10 н.о. равномерное

Facas ХЭ 4,0 2,75 22,0 30 35-40 равномерное ас1->бС1с14,

evanesccns ГЭ 5,0 . н.о. н.о. 27 30-35 н.о. 6

...ас1-[-»зс1с1-]->зс1с...

Sargassum sp. ХЭ 5,0 н.о. н.о. 25 15 н.о. ...С1с1—>ЗС1с1—>1СН2

(Сейшелы) ГЭ 5,0 н.о. н.о. 20 и.о. н.о. (СНОН)4

...С1с1->ЗС1с1->6СН?

" — ХЭ и ГЭ — экстракция водорослей при 25 и 50"С, соответственно;

" — чувствительность метода не позволяет получить достоверные данные по распределению р-1-»6-связанных

остатков О-глюкозы по цепи молекулы; "' — ВМФ — высокомолекулярная фракция.

м.д., тогда как в ,3С-ЯМР-спектрах для F.evanescons эти сигналы имеют приблизительно одинаковую интенсивность, что хорошо соответствует данным метилирования (табл.2,3). В соответствии с полученными структурами ламина-ранов (табл.2-4) эти сигналы можно соотнести с С-5 1,3,6-связанных остатков (75,2 м.д.), и 1-»6-связанных остатков (75,6 м.д.).

По данным метилирования, определения маннпта модифицированным методом Нэша, |3С-ЯМР-спектроскопии различные образцы ламинаранов содержали от 40 до 80% молекул, восстанавливающие концы которых гликози-лирует маннит (табл.2,3). Перспективным для определения манннта является метод электрораспылительной масс-спектрометрни, с помощью которого можно обнаруживать и количественно регистрировать маннит и маннитсодержа-щие олигосахариды в продуктах кислотного или ферментативного гидролиза ламинаранов в виде квазимолекулярных ионов (рис.1).

I, %

/К

[GlcyfNa]

[MeGlc + Na]

|GIcM

[GIc + Na]

Vr

+ Na)

|MoG.c2+Na|+ |G|C3+^1 + N + [Clc4 + Naf

T-V r

|MoGlc3+Na)

;Glc M+N,i|

[MuGJc+Ndl"

200 210 220 360 370 380 390

520 530 540

П Г I 7

690 700 710 m/z

Рис. 1. Масс-спектры продуктов трансформации ламинарана под действием Л1У в присутствии метанола (40%).

С1с2, Исз, С1с4 — ламинариби-, -три- и -тетраоза, соответственно. Ме и М — остатки метанола и маннита, соответственно.

В 13С-ЯМР-спектре ламинарана из вагдаззит яр. наряду с сигналами, относящимися к 1,3-, 1,6- и 1,3,6-замещенным остаткам глюкозы, присутствуют сигналы с хим. сдвигами 72,7 и 72,3 м.д. (таОл.31, которые можно отнести к остатку маннита, гликознлированному по С1 и Сб (табл.3,4).

С помощью экзо-ламинариназы ЛИ было изучено распределение (3-несвязанных остатков Б-глюкозы по цепи ламинаранов. Специфичность этого фермента такова, что он последовательно гидролизует Р-1—>3-связн с невосста-навливающего конца молекулы субстрата, обходя 1-»6-связанные остатки глюкозы, и образует в качестве продуктов реакции глюкозу, а из разветвлений дисахарид — генциобиозу. Отношение количества генциобиозы к глюкозе в

процессе гидролиза 1—>3;1—>6-р-0-глюкаиов окзоферментом должно отражать распределение 1->6-связей по цепи глюкана. Если ото отношение постоянно, то распределение 1->6-разветвленнн по цепи должно быть равномерным; если оно уменьшается в процессе реакции, то основная часть разветвлений сосредоточена на невосстанавливающем конце молекулы; если увеличивается — то на восстанавливающем. В процессе гидролиза исследуемых ламинаранов ЛП образовался более богатый набор Сахаров: глюкоза, гепциобиоза и небом.пик.' количества три- и тетрасахаридов. Характер накопления этих олигисахчрпдов показывает, что в ламинаране из ¿.С1сЛог/о1'с(с5 небольшая часть фрагментов, содержащих Р-1-»6-связанные остатки глюкозы сосредоточена вблизи невос-станавливающего конца молекул, в остальных ламинаранах они распределены равномерно по цепи 1-»3-р-0-глюкана (рис.2, табл.4).

ас„ /С1с

■I

.и и

1л\

\'8

Рис. 2. Распределение несвязанных остатков по цепи ламинарана (Д) и транслама (о).

Образование под действием

ЛП гентиобиозы (---),

1->3;1->6-р-Б-глюкотриоз (—) и -тетраоз (--)

30

480

90

150 210 'ПО

время, мин

Рис. 3. Гель-фнльтрацпя на сефадексе С-75 ламинаранов ИЗ ' С.С1С1ЮГ101С1С5 (и),

Ь.дицапоуас (□) и ВМФ из Ь.диг]'апоуас (О).

20 25 № фракции

В результате проведенного изучения были отмечены следующие особенности в поведении различных ламинаранов. Фракционирование ламинарана из ¡..дицапоуае позволило обнаружить в нем небольшие количества (до 1020%) разветвленной, гетерогенной по молекулярным массам, подобной по

структуре ламинарану из ¿.с;сЛопо)'с/с5, фракции 1->3;1->6-р-0-глюкана (пил. 2-4, ГЭ, ВМФ, рис.3). Среднечисленные (М„) и средневесовые (М№) молекулярные массы ламинаранов получены различными методами: концевым анализом и гель-проникающей хроматографией, соответственно. При этом значения Ми оказались приблизительно в 2 раза бо\ыие Мп (табл.2-4).

Нами проводятся также исследования топкой структуры некоторых грибных 1—>3;1-»6-р-0-глюканов (из внлта, поражающего хлопок, из Аиг1си1аг1а аиг^сЫае^'иёае, Р1с1)1а [егтаМЫиь').

Весь комплекс методов для установления структуры полисахаридов был применен нами при сравнительном изучении структуры двух глюканов (1.1 и 3.4), выделенных из разных по генам вирулентности рас возбудителя фито-фтороза РЬ^орЫЬога ¡пуезЬтв у картофеля, предоставленных д.б.н. Васюко-вой Н.И. (Институт биохимии им.А.Н.Баха, г.Москва). Метилированием, деградацией по Смиту, '3С-ЯМР-спектроскопиеп, гель-фнльтрацпей было показано, что это — 1—>3; 1—»б-Р-О-глюканы (1->3:1—>6 = 9:1) с приблизительно одинаковой молекулярной массой (М.м.) 4 —17, М.м.3 4 ~12). Применение экзо- и эпдо-1—>3-р-0-глюканаз позволило обнаружить разницу в числе разветвлений по 1—>6-связям (12% у глюкана 1.4 и 10% у глюкапа 3.4) и, самое интересно'.-, в распределении этих разветвлений по цепи 1—>3-р-0-глюканов. Облает:, пенос-станавливающего конца глюкана 3.4 более сильно, чем у глюкана 1.4 обогащена фрагментами, содержащими 1—>6-развегвлеипя. Глюкан 3.4 содержит также большее количество 1—>6-связанных остатков глюкозы, входящих в состав фрагментов, из которых при действии ЛИ образуются три- и тетрасахариды.

Таким образом, применение ферментов позволяет получить интересные данные о структуре полисахаридов, а также ускорить процесс ее изучения. Работы, касающиеся изучения распределения различных включений по цепи полисахаридов, достаточно редки, хотя в настоящее время все больше фактов свидетельствует, что именно в этом зашифрована информация, лежащая в основе биологической активности олпго- и полисахаридов.

Богатый набор ламинаранов и грибных р-О-глюканов, различающихся по структуре и физико-химическим свойствам, позволил нам провести исследование специфичности и механизма действия эндо-1->3-р-0-глюкапаз из морских моллюсков.

1.2. Методы выделения олпго-и полисахаридов.

В процессе исследования был разработан ряд достаточно простых методов получения 1->3;1->6-Р-В-глюкоолпго- и полисахаридов. Так, для их разделения был использован гидрофобный сорбент — политетрафторэтилен (ПТФЭ), необычным свойством которого оказалась способность избирательно сорбировать 1—>3;1->6-р-0-глюкоолиго- п полисахариды. Соли, глюкоза и ла-

минариолпгосахарпды полностью элюировались водон, разветвленные 1->3;1—>6-р-0-глкжоолиго- и полисахариды задерживались на сорбенте. Дальнейшей элюцией сорбированных веществ градиентом вода —этанол можно добиться частичного разделения 1—>3; 1—>6-р-0-глкжоолиго- и полисахаридов по степени разветвленностн II по молекулярным массам (табл.5). Из табл.5 видно, что сила сорбции увеличивается с ростом Мм и количества несвязанных остатков глюкозы. Очень удобно, что сорбция вещества из раствора не зависит от его концентрации. В процессе хроматографии происходит концентрирование сорбировавшихся веществ.

Таблица 5. Данные анализа фракций, полученных разделением па ПТФЭ

_ смеси глюкоолиго- и полисахаридов_

Фракция | Элюент | ncp | Интервал П | М.м.ср, кДа | 1 _>з: 1—>6

1 Вода 2 1 - 6 0,4 95 : 5

2 2,5% водный этанол 4 5 3 - 7 0,75 85 : 15

3 7,5% водный этанол 8 6 - 10 1,3 85 : 15

_^_15% водный этанол 15_>10_215_75 ; 25

Обозначения: Пср и М.м.ср определены из соотношения количества восстанавливающих и общих Сахаров; интервал П определен БХ или гель-фильтрацией на биогеле Р-2; соотношение количества 1->3-Ai 1->6-глюкозпд-ных связей определено из данных 13С-ЯМР-спектроскопип.

Представляющие интерес как источники разнообразных ламннарапив промысловые водоросли, например, L.japonica и рода Fucus, содержат не более 1-2% ламинарана от сухого веса, по, учитывая масштабы производства пищевых продуктов и альгиновой кислоты из этих водорослей, в отходы попадают огромные количества ламинарана. Поэтому для получения ламинарана из дальневосточных бурых водорослей нами разработан новый способ с использованием ПТФЭ. Разделение как низко-, так и высокомолекулярных веществ экстрактов водорослей происходит за счет их различной гпдрофоб-ности. Заряженные соединения (альгиновая кислота, фукоидап, соли и т.п.) не сорбируются ПТФЭ; ламинараны сорбируются, но, будучи слабо гидрофобными соединениями, элюируются растворами с низким содержанием этанола. Белки, часть пигментов, липиды, обладая более высоким индексом гидрофобное™, элюируются 40-96% этанолом. Полученный препарат ламинарана не содержит практически минеральные примеси и фукоидан (табл.6).

Высокая инертность ПТФЭ позволяет проводить хроматографическоо разделение как в кислой, так и в щелочной средах. Это является, безусловно, ценным свойством, например, при выделении ламинарана из водорослей рода Fucus. Препарат ламинарана, получаемый из F.cvancsccns известными методами, имеет красно-бурую окраску. Для отделения пигментов полученные эхет-

ракты предварительно подщелачивали, а затем проводили хроматографию па ПТФЭ в градиенте вода —спирт. При этом пигменты отмывались водой, а ламинаран был получен в виде порошка белого цвета.

Табмгца 6. Анализ образцов ламинарана, полученных из 1.с1с1юг11пс!с.< еппр-

товым осаждением после обработки экстрактов цетавлоном (1) и хроматографией на ПТФЭ (2), и пустулана, полученных вымораживанием (3) и обработкой перекисью водорода (-Ц_

! с Н N эо4 зола ацетаты [а]п Мм, к Да

1 40,16 6,05 нет 0,5 4,0 нет и.о. 5

2 =3, -' 0 "22 нет пет 0,5 нет -41 5

3 41,75 6,05 нет нет 3,46 4,59 -12 35

4 42,3 пет пет С1,66 нет -12 30

В процессе работ1.! бы\ также ¡¡рел »о; "_>ц способ по\учеч''ч пуст;.-, па, к^Горы:: представке. соиой 1->6-^-11>-:Лк>кан, примерно на 10/и зтерт; пци-р^ьашшй уксусной кислотой. По известим методам он полупится в : иде коричневых хлопьев. С целью получения неокрашенного и дезапети.ч^хаванного 1—>б-р-В-глюкана продукт экстракции лишайника итЬиПстш

вымора^чНЪчНИЯ ^¿раоатывалл Ю'и-пии перекисью водороде^ а з-и-.а,

ч-сл» оо^с""еч*:в"ння р.'створэ. пустул «г »'«-ажАЧл:: т йога спит.':: И •.">-льзу того, что нпш действии перекиси водорода произошло но том.ко удаление пигмента, но и значительное дезацетнлпрованпе пустулана, говорят дшнии элементного анализа (табл.6), ИК-спекароскошш, а также 13С-ЯМР-спек': ри-

полученный предложенным способом, представляет собой порошок бе.ого

Предложенные нами методы выделения ламинарана н пустулана просты и позволяют полагать высокоочпшепные полисахариды в препаративных количествах. Применение гидрофобной хроматографии может стать основой д\я технологической схемы получения фракций 1—>3; 1—»б-р-О-глюкоолигисах 1рн-дов и р-О-глюканов из различных источников.

1.3. Применение электрораспылительнон или ЭРИАД масс-спектрометрпи для анализа мопо-, олнгосахаридов и их производных.

Применение масс-спектрометрип для анализа смесей углеводов, незначительно различающихся по молекулярным массам, теоретически выг/яднт очень привлекательно. Однако применение ее для качественного и количественного анализа смесей углеводов связано с рядом чисто технических трудностей.

Нами обнаружена и продемонстрирована возможность применения электрораспылительной или ЭРИАД (экстракция растворенных попов при атмосферном давлении) масс-спектрометрпи для анализа смесей углеводов.

Масс-спектры моно- и дисахарида — глюкозы и сахарозы, полученные методом ЭРИАД на опытном образце масс-спектрометра ХЖ-МХ 3303, построенном в НТО РАН, приведены на рисунках 4а и 46, соответственно. Указанные соединения вводились в масс-спектрометр в виде водно-метанолы.ых растворов и регистрировались в виде квазимолекулярных ионов [M + Na] '1 и [М + К] + . Суть исследования заключалась в выборе условий максимального выхода квазимолекулярных ионов моно- и олнгосахарпдов в присутствии щелочных металлов.

I, %

100

50

|M + Na]

I

180

I

I0Ü

|М + К)

200

220

m/z

[M + Na]

[М + К|

360

зво

m/z

Рис. 4. Масс-спектры ЭРИАД растворов глюкозы (А) и сахарозы (Б, 10-4М)

Для достижения максимальной чувствительности метода било изучено формирование квазимолекулярных ионов ламннарнбиозы (ЛГ2) в зависимости от вида (Li, Na, К, Rb) и концентрации (10"6-10"3М) солей щелочных металлов Типичный масс-спектр ламинарибиозы с добавкой этих солей в эквимоллр-ных количествах приведен на рисунке 5. Видно, что максимальную интенсивность имеют пики [M + Na]+ и [М + К] + . В связи с тем, что Na + являеия обычным катионом буферных растворов, увеличивает m/z квазнмолекуляр-ного иона сахара меньше, чем К + , и не имеет изотопов, для дальнейших исследований был выбран Na + .

Концентрационная зависимость изучалась па примере метилгенцпобни-зида в присутствии NaCl (10"4М). Оказалось, что для уверенной записи спектра (отношение сигнал:шум>3:1). необходима концентрация сахара >10 мкг/мл в объеме пробы >5 мкл (150-200 пикомолей сахара). При повышении концентрации сахара с 10-5 до 2x10"^ интенсивность пика с m/z 379 ((M + Na|T) возрастает в 50 раз (табл.7). Метод, в принципе, позволяет проводить оценку

А

концентраций олигосахаридов в смеси относительно вводимого реперного вещества известной концентрации.

Г!Ь '

50

40

60

'м + ма1 [М + К| +

[М-Ш]+

[М+КЬ)

80

360 300 /,00 420

т/г

Рис. 5. Масс-спектр ЭРИАД растворов ламинарнбпозы (1в присутствии КтаС1, КС1 (1(ИМ) и и2304, ИЬ2С03 (5х10'5м). (После разрыва по оси абсцисс интенсивность пиков увеличена в 10 раз).

.Таблица 7. Зависимость интенсивности пика квазнмолекулярного иона метпл-генциобиозида (I) от его концентрации.

Интенсивность пика, мм Концентрация метилгенцнобнознда, М

Ю-5 | 5х10-5 2x10-4 17х 10"1

Максимальная 10 20 530 460

Средняя' 8 13 • 400 175

Минимальная 5 7 280 100

средняя интенсивность рассчитана по 4-5 значениям I без учета максимального и минимального.

ЯЬ

Зависимость интенсивности пиков квазнмолекулярных ионов сахарок от их природы и степени полимеризации изучалась для смесей следующего состава: глюкоза, маннит (М ), ламинарнбпоза (ЛГ2), метилцеллобнозид (МеЦБ), метилгентиобиозид (МеГБ), ламинаритриозд (ЛГ3) и ламинарипентаоза (ЛГг). Относительные интенсивности квазнмолекулярных ионов при равных молярных концентрациях Сахаров п Ди = 300В уменьшались в ряду: МеЦБ = МеГБ = ЛГ2 > ЛГ3 > М > ЛГ5 > С1с. В целом, интенсивность падает с ростом молекулярного веса Сахаров, но пик мономера аномально мал. Возможно, для связывания с важна гликозидная связь.

ii. изучение специфичности и механизма действия эндо-1->з-р-о-глкжаназ из морских моллюсков

11,1. Особенности реакций гидролиза, катализируемых эндо-1->3-р-0-глюканазамн мирских моллюсков

Проведено сравнение механизмов гидролитического действия трех андо-1->3-р-В-глкжаназ из кристаллических стебельков морских'моллюсков, которые к настоящему времени являются наиболее изученными среди этой'группы ферментов: двух-из 5.50сЛа7/лел5/5 (ЛШ, Л1У) и Ло из С.ЫЫйиз.

Известно, что большинство 1->3-Р-0-глюканаз (выделенных, в основном, из грибов и микроорганизмов), подобно амилазам, целлюлазам, функционируют в организмах, образуя ферментные комплексы, полный состав которых включает эндо-, экзоферменты и глюкозпдазы.

Интересным моментом является то, что источники изучаемых 1—>3-|1-0-глюканаз —кристаллические стебельки морских моллюсков— не содержат экзоламинарнназы. Отсутствие экзоламинарнназ было показано работами нашей Лаборатории для 15 видов двустворчатых моллюсков. Такое отсутствие компенсируется особенностями действия эндо-1—>3-,(3-В-глюканаз кристаллических стебельков: в продуктах гидролиза ими ламииарана содержится много глюкозы (до 40, 50 и 60% для Ло, ЛГУ и ЛШ, соответственно).

Влияние глюкозы на процесс гидролиза субстратов и образование илн-госахаридов наиболее подробно было изучено для Л1У и Ло. Оказалось, что глюкоза не ингибирует процесс деградации субстрата изучаемыми ферментами. Расщепление окрашенного лнхепана или карбоксиметплпахнмапа в среде, содержащей до 30% глюкозы,протекало с такой же скоростью, что и в ее отсутствие. Однако, при этом было продемонстрировано (работы пашей Лаборатории) образование достаточно прочных комплексов 2-4 молекул глюкозы с ЛГУ и Ло с Кй= 10-5-10-6М. Величины Кт (К^ фермент-субстратного комплекса) составляют 5x10"5М для Л1У н 15х10"5 М для Ло. Следовательно, субстрат и глюкоза связываются Л1У и Ло одинаково хорошо, не конкурируя при этом друг с другом. Отсутствие ннгпбнрованпя глюкозой, характерной для эндо-1-»3-Р-0-глюканаз из морских моллюсков, резко отличает их от известных целлюлаз и амилаз.

Для ЛГУ и Ло были обнаружены интересные различия в кинетике образования глюкозы и восстанавливающих Сахаров из ламииарана (п-20) и ламн-нариолигосахаридов (П~13) (рис.6). Отношение количества образующихся ¡и этих субстратов под действием Л1У олигосахарндов к глюкозе с течением времени (линейный участок кривой) остается постоянным и приблизительно равно 2,5 (рис.6). Этот факт является отражением действия ЛГУ по механизму

т.н. множественной атаки, когда за время существования одного ферм.-чт-субстратного комплекса происходит разрыв нескольких связей в субстрате. Напротив, для Ло была получена снгмоидпая кривая накопления глюкозы ни ламинарана, т.е. кривая имеет отчетливо выраженный лаг-период до степени полимеризации продуктов, равной 7-10. Наличие линейного участка (риг 6Б, II) на кривой накопления глюкозы из ламинарана указывает на то, что олп-госахариды с П<10 должны гидролнзоваться под действием Ло без лаг-перпо-да. Это было показано с использованием в качестве субстрата олигосахарндов с П~13. Очевидно, Ло является более типичным эндоферментом, чем Л1У.

Рис. б. Накопление восстанавливающих Сахаров (□) и глюкозы (о) под действием ЛГУ (А) и Ло (Б) из ламинарана.

Были предприняты попытки изучить влияние р-1—>4- и р-1—»6-снязанпых остатков глюкозы на процесс трансформации р-О-глюканов под действием эндо-1->3-Р-В-глюканаз из морских моллюсков. Нужно отметить особое отношение ЛШ к смешанным 1—>3;1—>4-Р-0-глюканам: скорость гидролиза их под действием ЛШ приближается к скорости гидролиза ламинарана (длч Л1У и Л(> она в 10 раз меньше), глубже (в 2-4 раза) и степень гидролиза в присутствии ЛШ этих субстратов в сравнении с Л1У и Ло. В этом плане интересен факт отсутствия ннгибирования целлобиозой образования глюкозы из ламинарана под действием ЛШ. Для Л1У, напротив, пнгпбированпе целлобиозой наблюдается, и этой реакции равна 1,5х10'2М; Кс) комплекса целлобиозы с ЛГУ, определенная ранее в нашей Лаборатории флюоресцентным методом, равна 10"2М и хорошо совпадает с К; определенной нами в каталитическом процессе. По всей видимости, целлобиоза связывается в районе АЦ Л1У, а с ЛШ — нет.

Отношение к олигосахарндам, имеющим в своем составе (!-1— ^-связанную глюкозу, примерно одинаково для всех исследуемых ферментов Гак, при ингибировании генцпобнозой (0-С1с-р-1—>6-0-0с) процесса образования глюкозы из ламинарана величины К, равны 2х10"2М и для ЛШ, и для Л1У. КП1

лампнарибиозы и ламинаритриозы для Л1У, ЛШ, Ло приблизительно одинаковы II находятся в пределах величин от 2х10"4 до 6х10_4М. Смешанный тетра-сахарид (С1с1—>6С1с1—>ЗИс1->ЗС1с) ингнбпрует реакцию гидролиза лампнара-на как Ло, так. и ЛГУ с К, 1,5х10"3М. Если сделать допущение, что 1<ш и К, приблизительно равны К^ фермент-субстратных пли фермент- ппгпбпторпых комплексов, то видно, что введение р-1-»6-связанной глюкозы в ламинарп-триозу уменьшает на порядок связывание олнгосахаридов ферментами. Под действием изучамых ферментов из ламинаранов возникают смешанные 1-»3;1-»6-р-0-глюкотри- и тетраозы следующей структуры: С1с1->6С1с1->ЗС1с и С1с1->6С1с1->ЗС1с1->ЗС1с (табл.3). Следовательно, присутствие р-1->6-свя-занной глюкозы делает затрудненным гидролиз р-1->3-глюкозидных связей, прилежащих к восстанавливающему концу генцпобиозного фрагмента.

Методом картирования активного центра выяснено, что эндоламинарппа-зы Ло, ЛШ и ЛГУ отличаются величинами активных центров. Изучение действия ферментов на ламинариолигосахариды, ламинараны и смешанные 1->3;1->4-Р-0-глюканы показало, что по количеству участков связывания в активных центрах ферменты можно расположить в ряд: Ло>Л1У>ЛШ. Составлены энергетические карты активных центров ЛГУ, Ло II ЛШ (рис.7). Величины энергий связывания (А,) отдельными участками, или подцентрамп, активных центров мономерных остатков субстрата для Ло и ЛГУ были оценены как с помощью стандартных процедур метода, предложенного Хпромп, так и Тома.

А., кДж/моль

Ло

3'2

ЛУ1

ЛШ

л

номер участки связывания

-4

-24 кДж/моль -20 кДж/мол[.

Рис. 7. Энергии сорбции (А;) участков активных центров Ло, ЛУ1 и ЛШ.

Для ЛШ получены данные по гидролизу ламинариби- и трнозы, из которых были по методу Хироми рассчитаны суммы энергий связывания (А2+А3) двух подцентров, соседних с каталитическими группами (участки 2 и 3, рис.7)( и подцентра 4 гликоновой части активного центра. Далее была проведена оценка возможности расчета энергий сорбции подцентров аглико-новой части активных центров эндоламинарпназ, используя распределение

3 2

низкомолекулярных продуктов, возникающих из ламинарана. Так, из схемы ! видно, что частоты (Р) разрывов связей, приводящих к образованию либо глюкозы (Рс1с), либо ламннарибиозь: 113 полимерного субстрата должны

быть связаны с величинами энергий сорбции участков 1 и 2 агликоновой части активных центров ферментов следующим соотношением: -ЯТ ]п(Рп | /РпА) = ДС„,+ 1 - ДС„.|, т.е.

А|(кДж/моль) = -11Т 1п(Рс:с2 /РЙ|С) = -5.6 1д(РС|с2 /Рс-|С)

п.и-1 -О-О-ОО-О-О-ОО

„I <кккккю

□ □ □ ола □ □ □ АЦ

6 5 4 3 2 I

Схема 1, Продуктивные комплексы (¡ + 1 и ¡), образованные субстратом с п>т (т — число подцентров в АЦ эндоламинариназы) и приводящие к возникновению С1с2 и в!с. О —, остаток С1с.

Из анализа хроматограмм продуктов ферментативных реакций (углеводный анализатор .1ео1-Л_С-6АН, биогель Р-2) следует, что для Ло соотношение ( молей глюкозы и ламинарибнозы, получаемых из ламинарана, пли Рск-Уск-= 0,45, для ЛГУ Рс1с2/РС1с = 0'4 11 Аля ЛШ Рс!с2/РС1е = 0'3' отсюда А, равно 2,0, 2,24 и 2,9 кДж/моль для Ло, ЛГУ и ЛШ, соответственно. Таким образом, па основе имеющихся кинетических экспериментов для ЛШ можно, подобно Ло и ЛГУ, построить энергетическую карту активного центра (рис.7).

Присутствие мощных барьерных участков (т.е. участков, энергетически невыгодных для связывания субстрата) в агликоновой части активных центров обеспечивает повышенное образование глюкозы и сродство таких ферментов к восстанавливающему концу. Для Л1У дополнительное количество глюкозы образуется также из-за способности этого фермента к осуществлению гидролиза гликозидных связен за счет действия его по механизму множественной атаки (рис.6 ). Преимущественное же накопление продуктов конечного гидролиза ламинарана под действием Л1У — фракций три-, а под. действием Ло — тетрасахаридов, обнаруженное нами, можно объяснить различной энергетикой гликоновых частей их АЦ (рнс.7).

Таким образом, сравнение трех эндо-;—»-З-р-О-глюкапаз из морских моллюсков показывает, что каталитическое действие их в процессе гидролиза имеет как общие черты, так и существенные различия, что обусловлено энергетикой АЦ и различиями в кратности атак.

11.2. Трансгликозилпрованне, осуществляемое эндо-1->3-(№-глюканазамп из морских моллюсков.

Н.2.1. Акцепторная специфичность эндо-1—>3-р-0-глюканаз из морских моллюсков

Отличительной чертой эндо:1->3-р-0-глюканаз из морских моллюсков оказалась повышенная способность по сравнению с другими карбогидразамп (лизоцимами, а-амилазами, целлюлазами) катализировать реакцию трансгли-козилирования, т.е. осуществлять перенос гликознльных остатков субстрата не только на гидроксильную группу воды (реакция гидролиза), но и на гидрок-силы ряда веществ, способных быть акцепторами в реакции трансгликознли-рования (схема 2).

Ч к2ч Н2>Рг

Е + 5 ~—^ [ЕБ] -> Гликозил Е ^

Ра.ч.

Схема 2. Трансформация субстрата иод действием фермента

В табл. 8 и 9 приведены вещества, которые были испытаны в качестве акцепторов гликозильных остатков субстрата. Полученные данные указывают, что одним из лучших акцепторов среди моносахаридных остатков является глюкоза. Модификации глюкозы по С-5 (ксилоза) или С-2 (Ы-ацетилглю-козамин) не влияют на эффективность реакции трансгликозилированпя, тогда как при модификации по С-4 (галактозид, 4-О-Ме-глюкозид) реакция транс-гликозилирования не протекает. Повышение гидрофобности заместителей при С-2 (2-О-Ме-глюкозид) или С-5 (хиновознд — б-дезокси-О-глюкозид) улучшает акцепторные свойства моносахаридов в реакции трансгликозилированпя.

Эндо- 1-»3-р-0-глкжаназы из морских моллюсков Л1У и Ло способны гли-козилировать спирты: метанол, глицерин. Гликозилирование метанола протекает намного менее эффективно, чем глюкозы, и только в 3-5 раз интенсивнее, чем воды. В результате образуются как а-, так и р-метилглюкозпды, т.е. ферменты не обладают в данном случае специфичностью.

Под действием исследуемых ферментов происходит вторичный гидролиз с отщеплением из продуктов трансгликозилированпя агликона акцептора. Так, п-нитрофенол из Ыр-р-О-глкжозида выделяется достаточно интенсивно. Отщепление его происходит с лаг-периодом, что характерно для вторичного процесса.

Интересно отметить, что под действием одного из ферментов (Ло из С.а1-Ыски) в зависимости от структуры гликоновой или агликоновой части акцептора могут синтезироваться не только р-1->3-глюкозидная связь, но также и

Таблица 8. Акцепторная способность" ыетплгликозндов в реакциях

трансгликознлирования, катализируемых ЛШ, Л1У и Ло.

Метилгликозиды | Л1Н 1 AIV |

GlCpCt + + + + ■ +

Glcpp + + + + + +

2MeGlcpct + + + + + + + + +

QuipCt + + + + + + + + +

GlcNAcpa + + + + + +

6MeGlcNAcpa + + + + + -H

Xylpa + + + + + -r

XylpP + + + + + +

2MeXylpp + + + + + +

3MeGIcpa — — —

Galpa — - —

Fucpa - — —

Manpa — . —

Lyxpa — — —

4MeXylpa — - —

Rhapa — — —

RhapP — — —

ArajCt + — —

Ara„a — —

' — оценка с помощью ТСХ (предел чувствительности метода — 3-5%);

включение метки: до 50% — + + + ; до 20-30% — + + ; до 5-10% — +.

Таблица 9. Кинетические параметр;,i реакций трансгликознлирования и

гидролиза, катализируемых Л1У и Ло

Акцептор | М.м. акцептора к„. мМ К|, мМ (AIV) axlO3 ')

AIV | Ло AIV Ло

i-tGlc2> 180 10

MeGlcP3) 194 30 2 4

MeGlc(Pl->4)2MeGlca3) 370 7 - 3

MeQuia3) 182 3 3,2 20

p-NO,Ph-p-D-Glc4) 301 5 5 23 22

глицерин2) 92 0.05

метанол5! 31 0,003 0,005

Ч - (а = кт/к,.= ([Рт]/[Р1.])х({Н20]/[А)), где кт и к,., Рт и Р,. - скорости и продукты реакции трансгликознлирования, [ЬЬО] и [А] — концентрации воды и акцептора, соответственно. 21 — значения получены ранее; продукты гидролиза и трансгликознлирования определяли: 3) — ВЭЖХ с регистрацией рефрактометром; — после отделения Кр-глюкозида на биогеле Р-2 методом Нельсона и при Х = 300 нм, соответственно; 5) — ЭРИАД МС или ГЖХ.

другие типы глюкозидных связен. Так, замещение гидрокспла при С-2 привело к синтезу метйл-2-О-метилцеллобиозида (табл.3).

Таким образом, для успешного протекания реакции трансгликознлирования необходимо, чтобы соответствующий акцептор содержал остаток моносахарида, способный гликозилироваться (ксилозу, глюкозу, хиновозу или Ы-аце-

тилглкжозамин). Следовательно, акцепторный участок ферментов комплеьчш-тарен остатку глюкозы п со стороны восстанавливающего конца глюкозы и нем скорее всего имеется гидрофобная область, поскольку повышение гндро-фобности при С1, С2 и С5 глюкознэго цикла благоприятно сказывается на акцепторной способности веществ.

II.2.2. Энзиматический синтез новых 1—>3; 1->6-р-0-глюканов из ламинаранов. Механизм образования транслама

В качестве акцепторов в реакциях трансглпкозилироваппя, естественно, могут выступать продукты, образующиеся в процессе гидролиза лампнарана (глюкоза и глюкоолигосахариды), а также исходный ламинаран. С целью найти высокомолекулярные вещества в продуктах действия эндо-1->3-|',-[> глюканаз ЛП/ из 5.5асс/ш/шсл515 и Ло из C.aIbidus на ламинаран из Ь.снЬи-Г101с1сз было изучено их молекулярновесовое распределение. В результате в продуктах трансформации лампнарана иод действием Ло в условиях высокой концентрации субстрата была обнаружена и выделена фракция более высокомолекулярных, чем исходный ламинаран, р-В-глюканов, названная транс-ламом (фракция V, табл.10). Аналогичная фракция была получена с помощью гидрофобной хроматографии продуктов реакции на ПТФЭ. Исследование биологической активности транслама показало, что он обладает нммуно.чоду-лирующими свойствами в отличие от исходного лампнарана. Выход продукта в оптимальных условиях составляет 20-25% от исходного лампнарана (табл.10). Фракция IV (табл.10) иншбнровала развитие инфекции, вызываемой вирусом табачной мозаики на растениях табака,и была названа "антивиром".

Таблица 10. Молекулярно-весовое распределение продуктов ферментативной

трансформации различных ламинаранов (% от исходного субстрата, ^1-50)

и характеристика фракций"

Источник лампнарана Интервал Mw (kDa) фракций

<2 (I) 2-4 (II) I 4-6 (III) 6-8 (IV) 8-12 (V)

Laminaria cichorioides Выход, % 20 5 30 25 20

1,3:1,6 90:10 85:15 80:20 80:20 75:25

п 50-70

Laminaria gurjanovae Выход, % 1,3:1,6 п 30 95:5 10 95:5 40 90:10 10 80:20 10 75:25 50-70

Fucas cvanesccns Выход, % 1,3:1,6 п 10 30 70:30 60 60:40

' — соотношение 1-»3- и 1->6-р-0-глюкозидных связей определяли из |;1С-ЯМР-спектров; п (степень полимеризации фракций) — концевым анализом (из соотношения количеств общих и восстанавливающих Сахаров).

Молекулярная масса трапслама, определенная гель-фильтрацией |М„,|, оказалась около 8 кДа (П~50) против 5 кДа у исходного ламинарана (рис.8). В молекуле транслама отсутствует машшт (табл.3). Содержание (1-1—>6-скязей » новом глюкане 25%, тогда как в ламинаране — 10% (табл.2,3).

Присутствие в молекулах транслама различных типов Р-1—>6-связанных остатков О-глюкозы следует из наличия в 13С-ЯМР-спектрах транслама двух сигналов — 75,7 и 76,0 м.д. примерно одинаковой интенсивности, принадлежащих С-5 атомам р-1—>3,6- и р-1—>6-связанных остатков О-глюкозы (табл 3), как это было уже показано в главе I.

А480 о

Рис. 8. Гель-фильтрация на сефадексе С-50 ламинарана из 1*.с1с1юг101с!сз (-х-), транслама (-о-), и продуктов их деградации по Смиту (-.:-) и (-Л-), соответственно

>

№ фракции

Количество р-1->3,6- и Р-1->6-свя::.шных остатков О-глюкозы в молекуле транслама было определено с помощью метилирования (табл.2) и составил'.) 12 и &%, что хорошо соответствует данным |3С-ЯМР-спектрометрип.

Деградация по Смиту синтезированного (З-О-глюкана приводит к распаду его молекул на более мелкие фрагменты (рис.8). Такая фрагментация может происходить, если в цепь 1->3-р-0-глюкана включены р-1—>6-связи. Таким образом, в молекуле транслама помимо 1—>3- и !->3,6-связанных остатков О-глюкозы присутствуют р-1—>6-связанные внутрицепочечпые остатки глюкозы в количестве, сопоставимом с 1—>3,6-связанпымн (табл.2,3).

Распределение фрагментов, содержащих 1—>6-связанные остатки глюкозы в трансламе, было изучено с помощью экзо-1—>3-Р-0-глюканазы ЛИ. Следует отметить, что из транслама под действием ЛИ возникает приблизительно в 2 раза большее количество три- и тетрасахарпдов, чем из ламинарана (рис.2). Основная часть фрагментов, дающих да-, три- и тетрасахариды в трапсламе сосредоточена вблизи невосстанавлнвающего конца молекулы (рис.2). Больше всего в трансламе фрагментов, дающих при действии ЛН триозу. Возможно,

10 15 20 25 30 35

она образуется из тех участков цепи, где |1-1->6-глюкозидная связь включена в линейную цепь молекулы.

Т.о., транслам от исходного ламинарана отличает 1) более высокая молекулярная масса, 2) отсутствие мапнита на восстанавливающем конце молекулы, 3) высокое содержание 1->6-связсп, 4) наличие внутрицепочечных 1- >6-связанных остатков глюкозы, 5) концентрированно 1—>6-связанных остатков у невосстанавливающего конца молекулы глюкана.

Образование такого глюкана при трансформации ламинарана нельзя объяснить, если представить, что в процессе трансглпкозилированпя происходит только перенос гликоновой части субстрата под действием Ло в положение 3 остатков глюкозы, находящихся в разветвлениях в ламинаране, либо в продуктах его гидролиза, р-1—>6-Связанная О-глюкоза таким образом может быть включена в цепь 1->3-р-0-глюкапа, но оба глкжозных' остатка генцпобп-озного фрагмента окажутся замещенными в положении С-3 и не должны подвергаться деградации по Смиту. По всей видимости, под действием Ло происходит перераспределение и синтез р-1—>6-глюкозидиых связей. Возможность синтеза Р-1—>6-глюкозпдных связей под действием Ло следует из анализа ,3С-ЯМР-спектров всех продуктов, образующихся при получении транслама в сравнении с исходным ламннарапом (табл.10): суммарное содержание 1->6-связанных остатков Э-глюкозы в продуктах реакции выше в 1,5-2,5 раза, чем в исходном ламинаране. В отдельном эксперименте было показано, что под действием Ло при исчерпывающем гидролизе субстрата в условиях высокой концентрации ламинарана образуется в 1,5-2 раза большее количество 1—>3; 1 —>6-р-0-глюкоолигосахарндов, чем при низкой (табл.11). Лучшим подтверждением синтеза 1->6-связен, катализируемого Ло, является факт образования 1—>3; 1-*6-р-0-глюкана со структурой, аналогичной трансламу, из неразветвленного ламинарана из I.дицапоуис (р-Б-глюкан в, табл.3,10).

При действии Ло на силыюразветвленпый ламннаран из Ксгалсбссчь в условиях образования транслама возникновения более высокомолекулярного глюкана не происходит (табл.10). Практически не наблюдается здесь так?кг и увеличения содержания 1—>6-глюкозпдных связей (табл.3,10). Деградация по Смиту не вызвала фрагментации молекул продукта трансформации ламинарана из F.evaлe5ceпs. Однако, в 13С-ЯМР-спсктре этого продукта, названного трансламом-Р, имеется новый сигнал С-3 углеродного атома с химическим сдвигом 87,3 м.д., сопоставимый по интенсивности с обычным сигналом при 85,7 м.д. (табл.3). По всей видимости, и в этом случае под действием Ло также происходит синтез нового 1->3;1->6-р-П>-глюкана, но не через образование дополнительных 1->6-связей, а благодаря перераспределению уже имеющихся.

Особенностью поведения молекул ламинарана из ¿.с/сЛог/о/с/са1 в растворе является несовпадение значений молекулярных масс, определенных мсти-

Таблица 11. Содержание (%) глюкозы и глюколигосахаридов в продуктах трап-сформации Ло и ЛГ/ ламинаранов из ¿шлшал'а ас1юг1о1'с1ся и

Ь.дит]апоуас при различных концентрациях субст рата"

Ло Л! V

Продукты Ь. с1сЬогю:с1е8 (¡иг) тоуае 1_. сцлфиЮУае

1 Омг/мл | 1 мг/мл 1 Омг/мл 1 мг/мл 1 Омг/мл \ мг/м '1

С1с 25,2 33,5 20,0 25,4 38,7 27,8

С1сч . 13,4 20,2 ' 12,5 20,0 12,8 23,0

С1с3" . 12,3 10,5 6,2 3,2 1,9 •1,6

ас4" 15,7 14,2 4,3 3,5 2,2 3,8

С1с5 13,8 9,4 3,8 2,8 2,2 1.:'

С1с6.9 19,6 12,2 6,8 3,0 1,8 1,

С1с3.д 61,4 46,0 21,0 12,5 8,1 12,0

С1с1-9 100 100 ■ 53,0 58,0 63,9 63,0

46,4 42,0 36,1 37,0

' — анализ проводили на углеводном анализаторе ^ОЬ^4С-6АН •• _ установлена структура С1с3 ,, Ос,], как смешанных 1—>3; 1—>6-[1-0-глюкотри- и -тетраоз.

дом гель-фильтрации (М„) и концевым анализом (Мп): М„>МП в 1,0-2 рл и Напротив, М№ и Мп транслама хорошо совпадал:; друг с другом (табл.4,10,12).

Глюкап | п 1 Мп, кОа | М„„ к!)а

Ламинаран из Ьашшапа с1с1юг!01(1сз 17-20 3-5 5-8

Транслам 50-70 8-12 - 8-12

— приведены интервалы молекулярных масс, полученных при исследован ни нескольких образцов ламинарана и транслама

В твердофазных ПП/МУ ,3С-ЯМР-спектрах (|3С-ЯМР-спектрах, снячых при перекрестной поляризации и под магическим углом) транслам имеет дна сопоставимых по интенсивности сигнала С-3: 85,0 м.д. и 89,8 м.д., первый из которых соотносят с наличием в 1->3;1->6-(!-0-глюканах трехспнральных структур, второй — односпнральиых, лампнаран в аналогичных условиях имеет один сигнал (85,0). Возможно, необычное поведение транслама при голь-фильтрации (Ми, = Мп), большая гетерогенность сигнала С-3 в |3С-ЯМР-спектрах транслама в растворе (табл.3) и в твердой фазе говорят о том, что ламппар.ш и транслам находятся в различных конформацпопиых состояниях.

В отличие от Ло, в продуктах ферментативной трансформации лампиара-на действием эндо-1->3-(№-глюканазы Л1\' (!-0-глюкана, подобного транс,хаму, не было обнаружено. В противоположность Ло, Л1У катализирует образование большего количества глюкозы при высокой концентрации ламннарана, чем при низкой (табл.11). По всей видимости, для Л1У степень множественности с увеличением концентрации субстрата увеличивается (табл.11).

Таким образом, впервые был осуществлен ферментативный синтез биологически активного глюкаиа из неактивного ламипарана. Можно предполагать, что биологическая активность транслама скорее всего связана с наличием в его молекулах внутрицепочечпых р-1—>6-глюкозндных связен и с концентрацией р-1->6-связанных остатков глюкозы вблизи невос-

станавливающего конца молекул транслама.

II.2.3. Совместное протекание реакций гидролиза и трансгликозилированпя иод действием эпдо-1->3-р-0-глюканаз из морских моллюсков.

Несмотря на то, что реакция трансгликозилированпя, катализируемая карбогидразами эндо-типа действия открыта достаточно давно (в 1964 г.), данные по изучению совместного протекания реакций гидролиза и трансглпкозп-лирования под действием этих ферментов практически отсутствуют.

Основные трудности, связанные с исследованием закономерностей совместного протекания реакции гидролиза и трансгликозилированпя, обусловлены отсутствием удобных методов или сочетания методов, позволяющих одновременно разделять и регистрировать продукты гидролиза и трансглнкозплн-рования. Поэтому большое внимание при изучении комплекса катализируемых эндо-1—>3-р4Э-глюканазамп реакции было уделено нами поиску и применению новых методов, таких как ЭРИАД-масс- спектрометрия и ВЭЖХ, или удачных сочетаний известных методов для разделения и анализа углеводол, а также различных гликозидов.

11.2.3.1. Кинетические характеристики совместного протекания реакций гидролиза и трансглнкозилировання, катализируемых Ло и ЛИ'

Детали совместного протекания реакций гидролиза и трансглнкозилпро-ваия, катализируемых двумя эндоферментамн Ло и Л1У с применением в качестве акцептора п-нитрофенил-р-О-глюкозида (Ыр-), изучали с использованием биогеля Р-2 д\я разделения продуктов реакций гидролиза и трансгликозилированпя и регистрацией их методом Нельсона и поглощением при 300 им, соответственно, после отделения Ыр-глюкозида. Были определены удельные веса реакций гидролиза и трансгликозилированпя, катализируемых этими ферментами. Оказалось, что величина а=кт/к,. составляет 2х104 для обоих ферментов, т.е., для них трансгликозилпрованне в 20000 раз предпочтительнее гидролиза (табл.9). Показано, что удельный вес реакции трансглнкозилировання уменьшается с уменьшением степени полимеризации субстрата для Л1У, тогда как для Ло существует определенное постоянство в соотношении этих двух реакций при любой глубине деструкции субстрата (рис.9). рН-Оптимумы

р /р т г

5 -

Рис. 9. Зависимость Р,/Р, Д1я Ло (о) и Л1У (Д) от глубины деструкции (Р)

субстрата.

30 1 40 50 60

>и.

для реакций Гидролиза и трансгликознлирозания хорошо совпадают у обоих ферментов (рис.10). Однако для Ло отмечалось увеличение числа оборотов фермента в присутствии акцептора, тогда как для Л1У число оборотов практически не менялось (рис.10). Может быть дано несколько объяснении такому различию. Например, можно предполагать, что для ЛГУ стадией, определяющей скорость, является образование фермент-субстратного комплекса, тогда как для Ло — присоединение молекулы акцептора.

Р, 10 цМ

Рис. 10. Влияние рН на накопление продуктов реакций гидролиза (х,!.:) и трансгликозилирования (Д), катализируемых Л1У (А) и Ло (Б). Субстрат — ламинаран; акцептор — Ыр-глюкозид. хД — гидролиз в отсутствие и присутствии Ыр-глюкознда, соответственно; о — суммарное количество продуктов в присутствии ^-глюкозида.

Дальнейшее изучение совместного протекания реакций гидролиза и трансгликозилировашш под действием Л1У было проведено посредством ВЭЖХ с использованием рефрактометра, что позволило регистрировать все вещества, входящие в состав реакционной смеси. Этот подход позволил определить качественный и количественный состав низкомолекулярных фракций продуктов гидролиза и трансгликозилировашш. Для этой работы были выбраны три акцептора: метил-р-О-глюкоппранозид, вещество, наиболее близкое естественному акцептору — глюкозе, метпл-а-О-хиновозид, один из лучших акцепторов (табл.8,9) и дисахарид — 2-О-метилцеллобиознд.

В результате были получены константы связывания (1/Кс|) метплгликози-дов для реакции трансглПкозилирования, катализируемой Л1У, константы ин-гнбирования ими реакции гидролиза (К,), а также о£ = к.,./к,. (табл.9). Видно, что выбранные вещества являются на 3-4 порядка более эффективными акцопторами гликозильных остатков, чем вода. Сродство метил-а-О-хиновознда к акцепторному участку на порядок выше, чем метил-р-Ц-глюкозида, что соответствует увеличению энергии связывания (ДС) на 1,4 ккал/моль.

Сильно различается действие исследованных в качестве акцепторов веществ на образование ннзкомолекулярных продуктов гидролиза, протекающего совместно с трансгликозилированием. Дисахарид в области исследованных концентраций не влияет на такой процесс. Метилхнновозпд и метилглкжоаид ингибируют образование ннзкомолекулярных продуктов реакции гпдролнз.1 и, хотя достигаемая этими веществами степень торможения примерно одинакова (около 70%), механизмы ингибирования совершенно различны. Метплхиново-зид на начальных стадиях реакции трансформации ламинарана под действием ЛГУ практически полностью подавляет образование глюкозы и ламппарнбпо-зы. Ингибирующее действие метилглюкозпда выражается в равномерном уменьшении скорости накопления всех регистрируемых ннзкомолекулярных продуктов гидролиза по сравнению с исходной реакцией (рис.11).

Интересно сопоставить величины К^ и К;, отражающие влияние акцепторов на разные процессы (трансгликозилированпе и гидролиз, соответственно), катализируемые Л1У. Так, величина К^ метил-р-О-глюкозида на порядок больше, чем величина К; (табл.9). Вероятнее всего, метил-р-Б-глюкозид связывается не только акцепторным участком активного центра фермента с Кс! комплекса фермент-лиганд равной Зх10"2М. На ферменте есть еще один участок связывания этого моносахарида с большим сродством к нему (К; = 2х10"3М). Эти данные находятся в соответствии с вышеупомянутыми (стр.18) результатами по связыванию глюкозы ЛГУ, из которых следует, что глюкоза также имеет несколько участков связывания на ферменте. К(| и К, метнл-а-О-хпновозпда практически, сопоставимы. По всей видимости этот моносахарид связывается с одним участком активного центра, имеющим к нему большое сродство.

Отсюда, возможно, и возникает такое различие в составе образующихся продуктов ферментативного превращения при использовании этих метилглпкози-дов в качестве акцепторов.

CI С V Cl II С1 VII

III

IV

III IV

VI

Г-! 'I I 5 15 5 15

А Б

VI

IV

25

5 15

В

25

5 15

Г

Рис. И. ВЭЖХ продуктов трансформации ламинарана в присутствии глюка-назы ЛГУ, образующихся в условиях гидролиза (А, время реакции <10 мин) II при использовании в качестве акцептора метнл-а-О-хпново.шда (Б и В, время реакции 1 и 15 часов, соответственно) и метил-р-О-глюкозпда (Г, время реакции 97 мин).

I-IV — продукты гидролиза (глюкоза, дп-, три- и тетрасахарнды, соответственно); V — метил-а-О-хнновознд; VII — метпл-р-О-глюкозид; VI, VIII — продукты трансгликозплирования; С — соли, входящий в состав буферных смесей.

Для изучения закономерностей совместного протекания реакций гидролиза и трансглнкознлированпя очень перспективным является использование метода электрораспылительной масс-спектрометрнн, в одной и той же пробе позволяющего одновременно регистрировать продукты, возникающие в процессе превращения субстрата, прп условии, что они различаются молекулярными массами. В первом приближении зтот вид масс-спектрометрпи можно рассматривать как углеводный анализатор, позволяющий разделять и регистрировать олигосахариды, отличающиеся Я о молекулярным массам даже на 1 а.е. Так, с его помощью были зарегистрированы продукты ферментативного переноса на метанол (рис. 1), метнлгенцпо- и целлобнозид и т.д. Получены кинетические параметры (табл.9) этих процессов. Перенос на метанол был параллельно подтвержден ГЖХ ацетатов продуктов ферментативной реакции. Если вернуться к схеме 2, то нетрудно при анализе масс-спектра продуктов трансформации ламинарана (имеющего на восстанавливающем конце природную метку — маннит (М)), проведенной в присутствии метанола (Ме) (рис.1), соотнести все образовавшиеся олигосахариды с теми стадиями, в результате которых они получаются. Так, маннптсодержащие олигосахариды соит-

ьетствуют Ра ч (продукту, возникающему из аглпконовой части субстрата), метилгликозиды — Рг, ламинарполнгосахарпды — Рг

Экспрессность метода, небольшие количества веществ для анализа, простота подготовки пробы, высокая разрешающая способность, универсальность регистрации веществ, возможность получения количественной информации делает его привлекательным для применения при изучении структуры углеводов и механизма действия карбогидраз.

Нужно отметить, что подобное изучение закономерностей протекания реакции гидролиза и трансглпкозплпроваппя для карбогидраз эндо-тппа действия проведено впервые. В итоге было показано, что эндо-1—>3-[3-В-глюкаиа-зы морских моллюсков обладают в сравнении с известными эндоферментамп повышенной способностью к реакции трансгликозилпровапия, различаясь между собой значительно в механизмах катализа этой реакции.

11.2.3.2. Влияние структуры субстрата — донора гликозильных остатков, па процессы гидролиза и трансгликозплирования

Интересным казалось сопоставить способности различных ламинарппаз катализировать реакции гидролиза и трансгликозплирования в зависимости от структуры 1—>3; 1—>6-ß-D-nu0KaH0i> — доноров гликозильных остатков. Для этого были выбраны ламннараны из L. cichorioidcs (1), L. gurjunovac (2), И. evanesccns (3) и транслам (4), отличающиеся между собой содержанием и качеством 1->6-связанных остатков глюкозы (табл.2-4).

Эндоферменты AIV, Ло практически не реагировали на различия в структурах этих 1->3;1->6-р-0-глюканов (рис.12). Только 1—>3;1—>6-Р-0-глюкан из Sclerotium rolfsii, имеющий около 50% 1—>6-связанных остатков глюкозы, не подвержен действию исследуемых ферментов (рис. 12).

Рис. 12. Влияние структуры субстрата на образование продуктов гидролиза (--) и трансгликозплирования ( —) под действием Ло (о) и AIV (х).

Ламннараны из: L.gurjano-vac (I, 3%), L.cichorioidcs (II, 10%) и F.cvancsccns (IV, 35%), транслам (III, 25%), S.rolfsii (V, 50%)

10 20 30 JO

содержание ß— 1 —>6 -связи, %

В противоположность этому, способность 1—>3;1—>6-р-0-глюканов вступать в реакцию трансглнкознлпрованпя, оцененная как по максимальному количеству продуктов (Рг), образующихся в процессе этой реакции (табл. 13), так и по скорости образования отдельных продуктов (табл.13), резко уменьшается в ряду — ламинаран из Ь.с1с1шп'01с1сз, ламинаран из ¿.диципиуас, транслам, ламинаран из Р.егапсБСспя-. для Л1У РТ|:РТ2:РТ4:РГ3 = 12:5:3:1 (1 мг субстрата) и Рт1:Р.г2:РТ4.'Ртз = -1,5:4,5:3:1 (10 мг субстрата) и для Ло Р.[.1:Ргз = 5:1 (1 мг субстрата) и РТ1:РТ2:РТ4:РТ3 = 3:2:2:1 (10 мг субстрата) (рис.12, табл.13). Следовательно, при практически равной способности катализировать гидролиз этих субстратов, возможность эндоламинарипаз использовать их в качестве доноров гликозильных остатков в реакции трансглнкознлпрованпя сильно разнится и падает больше, чем на порядок для ламинарана из р.суанасгп* в случае ЛГУ (табл.13, рис.12). Учитывая сильную разветвленность этого ламинарана, а также наличие в нем разветвлений в виде генцнобиозы, можно предположить, что олигосахаридные фрагменты не любой структуры могут вступать под действием Л1У (Ло) в реакцию тр.шсглпкозплированпя.

Скорости накопления под действием Л1У продуктов трансгликозилирования при использовании субстратов (доноров) в концентрации 1 мг меньше.', чем при 10 мг/мл. Для ламинарана из I. С1с1юг101с1сз эта разница составляет 1,5-2 раза, для транслама — 5-10 раз, тогда как для ламинарана из I. дт;гиш-\'ас — 20-25 раз. Это говорит о том, что сродство Л1У к субстратам в реакции трансгликозилирования падает в данном ряду и, как это ни странно, учшывая неразветвленность структуры, самое небольшое сродство — по отношению к ламинарану из ¿. диг]апо\'ае. Из этих данных можно примерно оценить д\я Л1У величины Кт различных субстратов в реакции фаисглпкизилпронашы Кт для ламинарана из ¿.с/сЛошийс.! <1 мг/мл, Аля транслама — 1мг<К]п<10 мг/мл, для ламинарана из Ь.дицапох'ас — КП1>10 мг/мл. Т.о., величины К|М для Л1У в реакции трансгликозилирования д\я различных субстра тов разчпчаюкя больше, чем на порядок, в то время, как в реакции гидролиза, катализируемой ЛГУ, Кт для этих же субстратов примерно одинаковы (0,3-0,7 мг/мл).

Ло в меньшей степени реагирует па изменения в структуре субстрата, несмотря на то, что активный центр его несколько больше. Под действием Ло продуктов трансгликозилирования в одинаковых условиях образуется из всех субстратов в 1,5-2 раза больше, чем под действием Л1У, т.е. Ло успешнее катализирует реакцию трансгликозилирования при практически равной с ,\1 V способности к гидролизу (рис. 12). В случае Ло при трансформации субстратов отмечается накопление глюкоин- и трпо.з, расхода этих продуктов трапст\п-козилпрования практически не наблюдается. В образовании Ыр-Ос, отмечается большой лаг-период практически для всех субстратов, исключая ламппа-рап'из Ь.диц'аноще. Дл-' Л1У заметный лаг-нерпо», наблюдается 1! образовании

Таблица 13. Влияние структуры и концентрации ;,он< ров глигозилы лх ос" ттков на реакцию трансгликозилирования, катализируемую ЛГУ и Ло (в качест) э ахцеь 'ор;, — ;-1р- локоз. 2 М1 'мл)

Np-Glc? Np Glc;, Np-Glc, Сумма про-

Донор, концентрация мг/мл V liai о пл. PTmax V накопл 1 PTir ах V накопл. Рттах дуктов, %

AIV Ло /.V Ло ЛГУ Ло | AIV Ло ЛIV Ло AIV Ло ЛГУ Ло

Ламинаран из Laminaria 1 1,7 н.о. 1 ,5 ч.о 1 н.о 10,5 н.о. 0,5 н.о. 2,0 н.о. 30 30

cichorioides 10 5 2,5 20 27 1,5 Г 7 10,5 1 2' 1,2 6 28 43,5

Ламинаран из L. gurjanovac 1 0,2G и.о. 8,5 и.о. 0,12 и.о. 4,2 и.о. - н.о. 0,1 - 13 н.о.

10 4,Л 2 У 2 21 3 0,3 9,5 7,5 1,2 0,6 5 2,8 26,5 32

Ламинаран из Fucus cvancsccns 1 0,2 0,0G 2,0 5,5 0,2 0,01 0,5 - - - - - 2,5 6,5

Транслам 1 0,27 и.о. 3,6 н.о 0,24 и.о. 3 и.о. 0,05 н.о. 0,5 н.о. 7,1 и.о.

10 3,5 0,6 13 22 1,5 0,2 3 7,5 0,2 0,7' 1,0 5 17 34,5

Обозначения: Ыр-С1сп — продукт трансгликозилирования; V накопл. — скорость накопления продукта; Рттах — максимальный выход продукта. — имеется лаг-период в накоплении продукта (V определяли после лаг-периода).

Ыр-С1с2 из Антивира (фракция IV, табл.10), причем увеличение лаг-периода происходит с уменьшением концентрации акцептора. Пороговой концентрации акцептора, при которой практически не происходит реакции трансглпко-зилирования, для наших ферментов пока но обнаружено.

Был сделан качественный анализ продуктов реакций трансгликонплпро-вания, катализируемых Ло и ЛГУ (рис. 13). Под действием ЛГУ образуется набор Г^р-ламинариолигозидов: 1Чр-ламинарпбн-, три- и тетраозиды, из транслама Ыр-ас4 образуется примерно в 5 раз меньше, чем из ламипарана {Ь.С1сЬог101(1е5) (табл.13).

1д т

1,5

1,0

0,5

Ло

ЛГУ

Рпс. 13. Зависимость времени удерживания (Т) Ыр-глюкези-дов, полученных действием глюканаз на ламинаран (10 мг/мл) в присутствии Кр-С1с (2 мг/мл), от степени их полимеризации (п). (ВЭЖХ, X = 300 им)

Под действием Ло образуется набор дисахарпдов, меченных ,\'р' Кр-ламинарибиозид>Ыр-целлобиознд>Мр-гентнобпознд (т1—>з = 5,5 мин, Т|_(1з = 6,5 мин, Т]_>4 = 6,9 мин), Кр-ламинаритри- и тетраозиды не образуются, а образуются, по всей видимости, Ыр-1->3;1->4-, и 1Чр-1—>3; 1—»6-глюкотрн- и тетраозиды следующей структуры: С1с1->ЗС1с1—>ЗС1с1—>4С1с-Кр и С1с1- >3 С1с1—>ЗС1с1—>6С1с-Нр (рис.13), что вполне соответствует способности Ло синтезировать Р-1->4- и р-1->6-глюкозидиые связи.

11.2.4. Применение эндо: 1->3-р-В-г.\юканаз для получения олиго-, полисахаридов и различных глюкозидов

Нами были предприняты попытки разработать практически значимые схемы для получения с помощью ферментов наряду с трансла.чом и других соединений.

а) Была исследована возможность использования эндо-1—»З-р-О-глюка-назы Ло в синтезе соединений, подобных липопслисахарндам грамотрнцате-льных бактерий. В качестве донора в реакции трансгликозплпровапия был

использован ламинаран из Ь.Ыс1югЫс1сз, в качестве акцептора — глюкозаыпп. Реакционную смесь гель-фильтрацпей на Тоуореаг1 ШЛМО разделили на три фракции: высоко- (1), средне- (2) и ннзкомолекулярную (3). Вещества фракций 1 и 2 обработали Ы-Океисукципимидным эфиром (К)-З-окснмпристпповой кислоты в условиях ацилирования аминогруппы глюкозамина. Со<уи1и-ппя гликолипидной природы были отделены от ламинарполпгосахарпдов хромато-графней на гидрофобном сорбенте Бер-Рак С-16.

. Состав полученных гликолиппдных фракций 1 и 2 исследовали различными методами. По данным элементного анализа, ГЖХ, ПМР- и ИК-спектро-скопии во фракциях 1 и 2 содержится в среднем 20 и 14 остатков глюкозы на остаток глюкозамина и 3-окспмиристпновой кислоты, соответственно.

Помимо этого, для отделения соединений типа (С1с)пС1с^Н2 от непро-реагировавшего ламинарана и высших олигосахаридов был применен П'ГФЭ, где нейтральные углеводы сорбировались. Состав полученной таким образом фракции (С1с)пС1с-1МН2 был изучен с помощью 13С-ЯМР-спектроскопии (табл. 3). В 13С-ЯМР-спектре этого соединения имеются сигналы, соответствующие глюкозамину, но на С-2 глюкозамина аффект гликозилирования не сказался. Возможно, гликозилирование глюкозамина под действием Ло идет не в положение С-3, а в положение С-6. Выход фракции от исходного ламинарана составил 5%.

Установление точного строения полученных соединений требует дальнейших исследований. Однако приведенные результаты показывают, что с помощью сочетания методов ферментативного п органического синтеза получены соединения гликолипидной природы. В принципе, от этих веществ можно ожидать дуализма в их действии на живые системы, прежде всего на систему коагуляции гемолимфы крабов.

б) Из продуктов трансформации ламинарана под действием Л1У в присутствии Ыр-Ис были выделены гель-фильтрацией на бногеле Р-2, а также хроматографией на силикагеле Ыр-лампнариби- и -трнозиды. Выход Кр-С1с2 от исходного ламинарана в последнем случае составил 12%. Величины химических сдвигов атомов углерода в 13С-Я1х1Р-спектре полученного таким образом Ыр-С1с2 приведены в табл.3.

в) Продукты конечного гидролиза ламинарана из Х.с/сУюгш/г/ел1 при высокой его концентрации под действием Л1\г представляют собой смесь глюкозы (30%), ламинарибиозы (30%), а также ламинари- и 1->3;1->6-р-0-глюкотрп-(30%) и тетраоз (10%). Для получения смеси олигосахаридов был предложен метод освобождения их от глюкозы с помощью глюкозооксидазы.

г) Показана возможность выделения на сплнкагеле мстилолшо щ. имеющих на восстанавливающем конце различные моносахаридные о< татки (1—>3- либо 1—>4-связанные) (табл.8,9).

Предложенные варианты получения олиго- и полисахаридов лпис только с помощью ферментов, либо в сочетании с органическим синтезом позволяют получать достаточно уникальные вещества с высоким выходом. Они могут применяться как для научных исследований, так и для различных практических целей, например, в медицине.

III. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРАНСЛАМА

Изучение биологической активности транслама (иммуномодулнрующпх, радиопротекторных и антибактериальных свойств) проводится в различных исследовательских центрах: 1. Институте эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток), 2. Институте биофизики Минздрава России (г. Москва), 3. Онкологическом научном центре (г. Москва), 4. Центре радиационной медицины (г. Киев), 5. Санкт-Петербургской военно-медицииской Академии, 6. Институте иммунологии РАМН (г. Москва), 7. ТИБОХ ДВО РАН (г. Владивосток).

Известно, что радиационное облучение является причиной развития в организмах всех признаков вторичного иммунодефицита, связанных с угнетением кроветворения, и часто также с инфицированием ослабленного организма. В настоящее время транслам предлагается нами в качестве, средства раннего лечения радиационного поражеипя.

Выживаемость — интегральный показатель действия препарата, его эффективности. Наилучший результат влияния транслама на выживаемость мышей при экспериментальном коли-сепспсе составил -90% при отсутствии выживших животных в контроле, ламннараном — 25%..

При лечении облученных радпорезистентных мышей-гибридов, где получить положительный терапевтический эффект труднее, было достигнуто 80% выживаемости (90% — на обычных мышах).

В опытах на собаках использование транслама в течение суток после облучения их летальными дозами обеспечивает выживаемость до 60% животных. Оптимальная доза для трапелама в этом случае около 10 мг/кг.

Лечебная эффективность транслама в опытах на обезьянах, облученных ■у-квантами в дозе, близкой к минимальной абсолютно смертельной,

составила 40-50% на фоне 20% животных, выживших в контрольной группе.

Иммуномодулирующее действие препаратов проявляется в увеличении числа и активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Под

действием транслама как in vivo, так п in vitro, происходило увеличение всех показателей фагоцитоза в тестах, основанных на поглощении Staphylococcus aureus, Yersinia pseudotuberculosis, E.coli, монодисперсного латекса: фагоцитарного показателя (число макрофагов, вовлеченных в фагоцитарный процесс) к 2-4 раза, фагоцитарного числа (количество частиц, поглощенных одним макрофагом) в 4-8 раз, завершенность фагоцитоза (уничтожение поглощенных микроорганизмов) достигала 80-100%.

Дополнительно к этому было исследовано влияние транслама па некоторые факторы неспецифнческой резистентности гуморального типа. Так, было обнаружено, что при введении .транслама в 9-10 раз повышался уровень al-кислого гликопротеина у мышей. Влияния транслама in vitro на альтернативный путь системы комплемента отмечено не было.

Так как транслам — до некоторой степени аналог лентпнана, являющегося активатором Т-системы иммунитета, го прежде всего действие транслама испытывали на стимулируемые лентинаном звенья иммунного ответа.

Было показано, что транслам стимулирует пролиферативный ответ мышиных спленоцитов: максимальное значение индекса стимуляции (IS) около 2 при 0,5 мкг/мл. Для лентинана в этом же опыте IS = 2 при 0,01 мкг/мл. К сожалению, это единственный опыт, проведенный в сравнении с лентинаном. Действие транслама проявляется в синергизме пролифератпвного ответа при совместном введении его и Con-A: IS=1,5 по отношению к действию только Соп-А.

Транслам, аналогично лентинану, дозозавнеимо стимулирует генерацию цитотоксических лимфоцитов (действие па 5,С.ч-меченые мишени) и киллеров (мишень — опухолевые клетки YAC-1) в исследованиях как in vivo, так и in vitro. Максимальное значение цитотокспчностп in vivo достигает 90-95% ¡при концентрации транслама 10 мг/кг), in vitro — 80% (при концентрации 0J мкг/ мл).

При введении траислама наблюдается снижение показателей реакции гп-перчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана примерно и 2 раза (доза максимального эффекта — 10 мг/кг), значительное снижение интенсивности анафилактического шока, отсутствие влияния на реакцию трансплантат против хозяина.

Было изучено влияние транслама па уровень лимфокннов и других веществ, продуцируемых нммунокомпетентнымп клетками. Так, титры антител к ЭБ при введении транслама одновременно с иммунизацией пли за сутки до нее возрастают в 15-20 раз, титры у-интерферона — до 8 раз. Два пика активности, подобно действию на пролиферацию, наблюдается при воздействии транслама на продукцию IL-2, которую препарат стимулирует в максп-

мальных значениях при концентрациях 1 и 100 мкг/кг в 2 и 3 раза, соответственно.

Поскольку транслам обладал значительным пострадиационным лечебным эффектом, было подробно изучено влияние его на кроветворение. Введение транслама мышам после облучения вызывало более быстрое и полное восстановление гуморального ответа на ЭБ по сравнению с контрольными облученными мышами. Так, число IgG-AOK восстанавливалось до 65-70%, a IgM-AOK до 80-100% против' 20 и 25%, соответственно, у контрольных, облученных мышей. Наблюдалось стимулирование эндо- и экзоколониеобразоваппя в селезенке облученных мышей примерно в 5 и 1,6 раза, соответственно, при введении препарата в течение суток после облучения, а также происходило повышение уровня миграции (в 4 раза) и фиксации (в 16 раз) полнпотентных стволовых кроветворных клеток.

В согласии с этими данными находятся данные, полученные на мышах, облученных в зоне Чернобыля. Инъекции транслама приводили к повышению в периферической крови мышей как здоровых, так и облученных, количества Т-хелперов и препятствовали повышению доли клеток с супрессорпой активностью, что приводило к значительному повышению соотношения Т-хелнеры/ Т-супрессоры у мышей, облученных в Чернобыле, инъецированных трансла-мом, по сравнению с контрольными животными (т.е. облученными, но не леченными трансламом). Такой препарат может быть полезен при лечении последствий облучения и раковых заболеваний, когда уменьшается отношение Т-хелперы/Т-супрессоры, которое рассматривается сейчас как функция темпа роста опухоли.

Коррегирующие свойства транслама проявились также в восстановлении при его добавлении экспрессии E-рецептора на лимфоцитах периферической крови человека, обработанных имитирующим иммунодефицит азатиапрниом.

Было исследовано in vivo влияние транслама на кроветворение бсстнмус-ных мышей и мышей с анемией по следующим показателям: среднее число колониеобразующих единиц, клеточность костного мозга, рост и дифферепци-ровка гранулоцитарномакрофагальных клеток-предшественниц. В результате обнаружено, что введение транслама (2 мг/кг) увеличивало все эти показатели по сравнению с контролем в 2-3 раза, что приблизило их к норме.

Таким образом, иммунокоррегирующпе свойства транслама были отмечены в самых различных экспериментальных системах. Результаты биологических испытаний свидетельствуют,, что транслам — 1->3;1->6-р-0-глюкан, полученный ферментативным синтезом из биологически неактивного ламипарана, можно характеризовать как хорошо растворимый, нетоксичный, неппроген-ный препарат, обладающий иммуномодулирующнми свойствами, который

может быть использован для коррекции нарушений иммунной системы, вызванных облучением, инфицированием и опухолями. Транслам относится к редким препаратам, обладающим лечебным действием при острой лучевой болезни. Он может быть также чрезвычайно полезен при радиотерапии опухолей. Действие его реализуется как через активацию системы мононуклеар-ных фагоцитов (клеточных и гуморальных факторов неспецифпческон резистентности организма), так и через коррекцию нарушений в Т-спстеме иммунитета.

ВЫВОДЫ ■

I. Проведено систематическое изучение процессов гидролиза и траисглико-зилирования, катализируемых эндо-1—>3-р-В-глкжаназами морских моллюсков: Ло из СЫатуБ а1Ы(1из, ЛШ и ЛГУ из 5р/5иУа 5ас/1а/тгп5/5, а также закономерностей их совместного протекания.

1. Гидролазное действие Ло, ЛШ и Л1У характеризуется высоким по сравнению с известными карбогндразами эндо-типа действия содержанием глюкозы в продуктах реакции. Причиной этого является наличие во втором положении агликоновой части их активных центров энергетически невыгодных для связывания субстрата участков. Дополнительное количество глюкозы для ЛГУ может образовываться также вследствие действия этого фермента но механизму множественной атаки.

2. Показано, что присутствие р-1->6-связанных остатков снижает сродство всех изучаемых ферментов к таким субстратам и защищает от гидролиза прилежащие к восстанавливающему концу генциобиозного фрагмент а р-1->3-глюкозидные связи. Подобный эффект на действие Ло и ЛГУ оказывает также и р-1-И-связь в субстрате. Только под действием эндоламннарппазы ЛШ скорости гидролиза ламннарана и смешанных 1->3;1—>4-р-В-глюканов сопоставимы, что может быть объяснено отсутствием ингибпрования ЛШ целлобпозоп, в отличие от Ло и Л1У.

3. С помощью различных метилглпкозпдов исследована акцеп торная специфичность ондо-1-»3-р-В-глюканаз. Показано, что только гомоморфные глюкозе моносахариды могут служить в качестве акцепторов в реакциях трапс-гликозилирования. Следовательно, акцепторный участок активных центров этих ферментов комплементарен остатку глюкозы, в нем имеется также гидрофобная область со стороны восстанавливающего конца моносахарндного остатка. Показана возможность переноса глнкозильных остатков на метанол. При этом образуются как Р-, так и а-метилглюкозиды.

4. Показано, что эндо-1—>3-Р-0-глюханазы из морских моллюсков обладают повышенной по сравнению с известными карбогидразпмп зндо-тппа действия способностью катализировать реакции трансглнкозплированпя: в случае лучших акцепторов трансглпкозилпрованпе предпочтительнее гидролиза более, чем в 2x10'' раз. При использовании метанола в качестве акцептора скорость трансгликозилировання выше, чем гидролиза в 3-5 раз.

5. При одинаково высокой способности к катализу реакций трансгликозилировання механизмы совместного протекания процессов гидролиза и трансгликозилировання под действием Ло и ЛГУ разнятся в деталях. Так, число оборотов в присутствии акцепторов увеличивается для Ло в 1,5-2 раза и не изменяется для ЛГУ. Это может быть связано с различными скорость-лими-тирующими стадиями в процессе деградации субстрата. Для Ло способность к трансгликозилировашпо не зависит от степени полимеризации субстрата, а для ЛГУ падает с ее уменьшением.

6. ЛГУ катализирует как гидролиз, так и синтез только р-1—>3-глюкозпд-ной связи, является высокоспецифичным ферментом и может быть рекомендован для структурных исследований углеводов. Установлено, что Ло, катализируя гидролиз Р-1—>3-глюкозндной связи, в процессе трансгликозилировання способна катализировать, дополнительно к р-1->3-, синтез Р-1—>4- н [¡-1->6-глюкозидных связей.

7. Показано, что увеличение доли Р-1—>6-глюкозидных связен (с 3 до 35%) в субстратах значительно уменьшает способность ферментов катализировать реакцию трансгликозилировання, причем, у ЛГУ в большей степени, чем у Ло. Скорость гидролиза ими этих субстратов практически не меняется.

8. Впервые ферментативным синтезом из биологически неактивного полисахарида — ламннарана — получен биологически активный 1—>3;1—>6-р-0-глюкап — транслам. Изучены его структура н механизмы иммуностимулирующего, антибактериального и радиопротекторного действия. От исходного ламннарана транслам отличает большая молекулярная масса, высокое содержание р-1->6-связанных остатков глюкозы. Эти р-1—>6-связанные остатки присутствуют как в цепи, так и в разветвлениях и сконцентрированы у непосста-навливающего конца молекулы. Возникновение транслама происходит только под действием Ло, по всей видимости, благодаря способности катализировать образование Р-1—»6-глюкозндных связей.

И. Д\я изучения специфичности п механизма действия эпдо-1—>3-(>-1>гл1и-каназ проведены поиск и изучение структуры 1—>3;1->6-р-0-глюканов из грибов и дальневосточных и тропических водорослей, а также ингибиторов ферментов.

1. Основная масса исследованных буопх водорослей содержала 1— P-D-глюканы, подобные по структуре ллминарану из Laminaria cichoriuiclcs, i М.м. около 4-6 кДа и 10% р-1-»6-связанных остатков глюкозы в виде единичных ответвлений от основной цепи 1—>3-р-0-глюкана. Обнаружено незначительное количество внугрицепочечпых 1—>б-связаппых остатков глюкозы. Ог 30 до 85% восстанавливающих концов молекул ламинаранов блокированы мап-нитом. Распределение 1—>6-связаиных остатков глюкозы по цепи молекул ламинаранов, изученное с помощью окзо-1—>3-р-0-глюкаиазы из Eulula waakn, оказалось практически равномерным.

2. Помимо этого, обнаружены источники ламинаранов необычного строения. Ламинаран из Laminaria gurjanovac представляет собой 1—>3-р-0-глюкан. Ламинаран из Fucus evancsccns, напротив, содержит до 35% 1—>6-связанних остатков глюкозы, примерно половина которых находится в молекуле в виде ответвлений из остатков генциобпозы. Ламинаран из Sargassum sp. (Сейшельские о-ва) содержит маннит, гликозплироваиный по С1 п С6 цепями 1->3,1-> б-Р-О-глюкана.

3. Впервые найдены источники ингибиторов эндо-1->3-Р-0-глюкапа:>. Показано, что ннгибирующая активность в губках семейства HuUchuiulriidac при надлежит сулъфатированным стероидам. Изучен .механизм их ингнбпрующею действия.

III. Предложены новые ферментативные методы получения и выделения p-D-глюкоолиго- и полисахаридов и различных глпкозпдов, в том числе технологически значимый метод, в основе которого лежит гидрофобная хроматография. Показано, что сила сорбции p-D-глюкоолиго- пли полисахаридов па гидрофобном сорбенте возрастает с увеличением молекулярной массы и содержания р-1->6-связей в них.

IV. Отработаны новые методы для качественного и количественного анализа смесей P-D-глюкоолигосахарндов и глпкозпдов, в том числе ВЭ/КХ и элекч ре-распылительная (или ЭРИАД) масс-споктрометрия. Впервые показана возможность регистрации углеводов с помощью электрораспылительной масс-сиект-рометрии в виде квазимолекулярных ионов со щелочными металлами, изучены закономерности их образования.

Основные материала диссертации изложены в следующих публикациях: 1. Elyakova L.A., Zvyagintseva T.N. A study of the laminarins oí some far-eastern brown seaweeds.//Carbohydr.Res. 1974. Vol. 34. P. 241-248.

2. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Зависимость кинетических параметре:'. |)-1—>3-глюканазы из Spisula sachalincnsis от pH.//Биооргап.химия. Н)/.>. Т.1. С. 1470-1473.

3. Звягинцева Т.Н., Денисенко Н.М., Елякова A.A. Анализ продуктов фер-мептолиза ламннарина с помощью автоматического жидкостного анализатора. //Химия природ», соедин. 1977. №5. С. 697-699.

4. Елякова A.A., Звягинцева Т.Н., Привалова Н.М. Сравнительная харак:е-рнстпка II изучение сорбцнонных свойств активных центров эпдо- [!-!,3-глю-каназ из морских беспозвопочных.//Бтюргап. химия. 1978. Т. 4. С . оЗ-lSv.l.

5. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.Л. Кинетические особен:!',c-i п дештния эндо-1—>3-[]-0-глюканаз из различных источников.//Биооргап.химия. 1'):: 1. *!'. 7. С. 680-685.

6. Звягинцева Т.Н., Сова В.В., Перера 1-1., Елякова A.A. Ингибиторы а мил. и актиний Карибского моря. Ингибитор амилаз белковой природы из Sluirhm Iis hcücmtluis.//Химия природн.соеднн. 1982. N-'З. С. 343-350.

7. A.c. №929646. Способ получения смеси лампнарпбиозы и лампнаритри-озы./ Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Назарова H.H. — Опубл. ПИ №19. 1982.

8. A.c. №1053912. Способ получения ламннарина нз морских водорослей,/ Звягинцева Т.Н., Елякова A.A., Сова 13.» - Опубл. БИ №42. 1983.

9. A.c. 1013474 (СССР) Способ получения арилламннарполигозпдов./ Назарова Н.И., Звягинцева Т.Н., Елякова A.A. - Опубл. БИ 15. 1983.

10. Звягинцева Т.Н., Назарова Н.И., Елякова A.A. Исследование трапегмпа'-зилирующей способности эндо-ß- 1,3-глюканаз. II. Кинетические особенности реакций гидролиза и трансглпкозилпроваиня, катализируемых эндо-|1-1,3-глю-каназамн нз морских моллюсков.//Биооргап.химия. 1984. Т. 10. С. 1342-13-16

11. A.c. №1189880. Ингибиторы карбогпдраз./ Звягинцева Т.Н., Макарьена Т.Н., Назарова Н.И., Стопнк В.А., Елякова A.A. - Опубл. БИ №41. 1985.

12. Shevchenko N.M., Zvyagintseva T.N., Elyakuva L.A. Mode of action ol endo-(l—>3)-ß-D-glucanases from marine inollusks on the laminarin from l.umiiuuiu cichorioides: the structure and the inhibitory effect of the resulting (1—>3,1->6)-|l-D-glucooligosaccharides.//Carbohydr.Res. 1986. Vol. 148. P. 57-62.

13. Александров М.Л., Безукладников И.В., Грачев М.Л., Елякова А А., Зн>,-гинцева Т.Н., Кондратьев В.М., Куспер Ю.С., Миргородская O.A., Фридлянскпи Г.В. Применение масс-спектрометрни ЭРИАД для исследования реакционных смесей, содержавших олш-о^.ахарпды.//Биооргап.химия 1986 i'. 12. С. 1689-1692.

14. Звягинцева Т.Н., Макарьева Т.Н., Стопнк В.А., Елякова A.A. Сульф.н'п-рованные стероиды губок семейства HiiUchoiidriidao — природные ингибиторы эндо-1—>3-р-0-глюкапаз.//Химия прпродн. соедин. 1986. №1. С. 71-/8

15. A.c. №1227199. Способ получения пустулаиа./ Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Суидукова Е.В., Мищенко Н.П. н др. - Опубл. БИ №16. 1986.

16. A.c. №1329153. Способ выделения разветвленных 1—>3,1—>6-|1-0-глюко-олиго- и полисахаридов./Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Исаков Р, 15., Шевченко Н.М. - Опубл. БИ №29. 1987.

17. Васюкова Н.И., Озерецковская O.A., Леонтьева Г.В., Чалепко Г',11., Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Широкова H.H. Различия в структуре (1-глюкапов двух рас возбудителя фитофтороза.//Бпсорган. химия. 1987. Т. 13. С.825-832.

18. A.c. №1415775. Способ получения глюкана, обладающего иммуномоду-лирующей активностью./Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Беседпова H.H., Игпа-тенко Л.А. и др. Опубл. БИ №41. 1988.

19. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л., Леонтьева Г.В., Чаленко Г.И., Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Рудакова В.Я. Модуляция иммунного ответа к ß-глюканам в клубнях картофеля.//Физиология раст. 1989. Т. 36. С. 794-802.

20. Безукладников П.В., Елякова Л.А., Звягинцева Т.Н., Миргородская О.Л. Изучение реакций, катализируемых карбогпдразамн, с помощью масс-спект-рометрии ЭРИАД.//Химия природн.соедпн. 1989. №1. С. 54-59.

21. Звягинцева Т.Н., Евтушенко Е.В., Елякова Л.А. Исследование трапеглп-козилирующей способности эндо-1->3-|3-0-глюкаиаз. III. Акцепторная специфичность эндо-1—>3-р-0-глкжаназ из морских моллюсков в реакциях трансгликозилирования по отношению к различным метнлглюкозпдам.//Бпооргап. химия. 1989. Т. 15. С. 1206-1214.

22. Sova V.V., Bakunina I.Y., Zvyagintseva T.N., et al. Natura! inhibitors ol carbohydrases.//J.Toxicology. 1990. Vol.9. P. 82.

23. Игнатенко Л.А., Звягинцева Т.Н., Беседпова H.H., Крашснскип C.Ii., Елякова Л.А. Стимуляция регенерации гемопоэза мышей под действием трансла-ма.//Радиобиология. 1990. Т. 30. С. 555-556.

24. A.c. №1642725. Способ получения ламннарииа./ Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А., Сундукова Е.В. - Опубл. БИ №14. 1991.

25. Zvyagintseva T.N., Elyakova L.A. Krasochin V.B. The search of effectors ol ß-D-glucanases among marine invertebrates.//Comp.Biochem.Physiol. 1992. Vol. 102B. P. 187-191.

26. Чертков К.С., Чотий В.Г., Стеймацкая З.А., Нестерова Т.А., Елякова /i.A., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М., Беседпова H.H., Игнатенко Л.А. Способ лечения острой лучевой болезни.// Заявка на патент МКИ /) 6/ К 35/80. 1993.

27. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.А. Специфичность и механизм действия эндо-1—>3-ß-D-nuoKaHa3 из морских моллюсков.//Бноорган.химия. 1994. Т.20. №5. а, ЧЗЗ-ЦЩ.

28. Звягинцева Т.Н., Елякова Л.Л., Исаков В.В. ферментативный синтез h i ламннаранов 1—>3;1—>6-р-0-глюканов, обладающих нммупомодулпрующеп »к-тивностыо.//Биоорган.химия. 1994. Т. 20. №6.

29. Звягинцева Т.Н., Широкова Н.И., Елякова Л.А. Структура ламннаранов из некоторых бурых водорослей.//Биоорган.химия. 1394. Т-20. №6.

Звягинцева Татьяна Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ И МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ЭНДО-1—>3-Р-0-ГЛЮКАНАЗ ИЗ МОРСКИХ МОЛЛЮСКОВ

Автореферат

Подписано к печати Х3.0Ь. 94 г. Формат 60x84x11). Печать офсетная. Усл.п.л. 1,16. Уч.-изд.л. 0,82. Тираж 100 экз. Заказ

Отпечатано в офсетно-ротапршггном цехе РНО ДВО РАН 690600, Владивосток, Светланская, 50