Выделение и характеристика бета-1,3:1,6-глюканаз из гребешка приморского и их действие на некоторые высокомолекулярные субстраты тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

1 О о 3' 9'?

ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РАН

На правах рукописи

СУНДУИОВА ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА 0-1,3 И-б-ГЛХЮШАЗ ИЗ ГРЕБИИКА ПРИМОРСКОГО И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА НЕКОТОРЫЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СУБСТРАТЫ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток - 1992

Работа выполнена в Лаборатории химии ферментов Тихоокеанское института биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН:

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Елякова Л.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук Бакиновский Л.В. кандидат химических наук Белогорцева Н.И.

Ведущее предприятие: Институт биомедицинской технологии, г. Москва

Защита состоится " е2/Г" марта 1992 г. в ИУ^час, на заседании Специализированного Совета Д 003.99.01 по защите диссертаций в Тихоокеанском институте оиоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект Столетия Владивостока, 159, ТИБОХ.

( диссертацией моию ознакомиться в библиотеке ДВО РАН (г.Владивосток, проспект Столетия Владивостока, 159, ДОГИ)

вторефорат разослан " " февраля 1992 г.

Ученый секретарь Социализированного совета, /

кандидат химических ыаук 'Г.И.Прокопенко

ангсетщ -3

¡.л г Актуальность проблемы. Пристальное внимание в последнее I.И- я уделяется ферментам, которые катализируют гидролиз полиса-юстртац»»^ дов' «держащих ЬЗ-р- и 1-*6-р-сяязашп;е остатки Ц-глюкозн, "" НЗ-р-Г>-глюканов и смешагашх 1-»3;1-»4- и 1-»3;1-»6-р-0-гл»уканов. Особое место среди них занимают 1->3-р.-В-глюканаза, или ламянцда-назн, актуальность имения которых, а такко их многочислошых природных субстратов связан? с выявленным непосродствешшм участием этих ведает- в системах иммунитета как животных, тлк и растений. Изучение механизма действия глюканаз, на нэп рзгляд, ьш-жет открыть ну-и направленного Ферментативного преобразования неактивных 1-»3- и 1 >3; 1 -»б-р-и-глюкоолиго- и полисахаридов п биологически активные. Менее изучена 1-»6-р-0-глЕканази, или пусту-ланази, хотя о пи также могут пршшмать участие и трансформации выоеуказягашх смешанных глкканов и 1-»6-р-1)-глюканов, я; лпщи-хся основными составляющими клеточ дх стенок дроке я и грибов.

Цель работы. Настоящая работа является часть» исследовании, проводимых в Лаборатории химш! ферлоцтов ТКБОХ ДВО РАН по изучению глюканаз морских беспозвоночных. Основной целью исследования являлось изучение р-1.3- и р-1,6-глтоканаз из промыслового моллюска ТаИпоресгеп уеэвоепз1з и действия их не только на водорастворимые, но и на водонерастворишэ высокомолекулярные субстраты.

Научная новизна.. В высокоочищеннсм состоянии получены р-1,3- и р-1,6-глюканази из нового источника. Установлен тип их действия на специфически субстраты и изучены физико-химические свойства. На основании сравнительного анализа кшгетгаш гидролиза эндоламинариназоя водорастворимых и яодонерзстворга.шх 1-»3- и 1 -»3; 1 -»ь-р-В-глкканов установлено, что ¿¡ажннм фактором, определяющим механизм гидролиза, является но'толь.со первичная,, но и пространственная структура субстрата.

Практическая значимость работы. В процессе исследования разработав способы получения р-1,3- и р-1,6-глюканаз и их субстратов: ламинарана (. 1 -»З-р-Ц-глюкана, пуотулана (Ь6-р-1)-глисана). а тагам смешанного 1-»3;1-»6-р~П-глюкаиа из аубазндяна. На оснсвэ-нии предложенных методов выделегаи возмозяо получение коммерческих препаратов этих форментов и их субстратов. Способ получения ламинариназы (р-1,3-глюканази) внедрен в производство.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научны:« работ; получено авторски:: свидетельства. Результат:) работ представлялась на IV Всесоюзном ст.:;зиуме но кщ:(гпе;;.чол

- 4 - ......

энзимологии (Киев, 1933), на Мекуцгнародном симпозиуме "Структура, оиосинтоз и функции молекулярных элементов иммушюй сиоте- • мы" (Пущино, 19й'0.no XIV Менделеевском съезда (Ташкент, 1989), на Ьсег-чосшом симпозиуме "Хшия белков" (Тбилиси, 1990). '.'—V'. '.'..

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 1Z0 страницах машинописного токста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов; включает 2J? таблиц, Í схем, LB рисунка и список цитированной литоратури, состояний из З/ЗО iiain/.t юваний.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТ» 1. Получение субстратов глкжаназ и изуче1ше их основных свойств.

Известно, что морские бурно водоросли - источник 1-»3-p-D-глюкана ламинарана - содержат в своем составе киюго гл ирофобных соединений: лилида (до 3% от сухого веса), белки, полифенолы (до 16Х от сухого воса), которые служат защитными веществами, а трк-ко кислые полисахариды (альгияовая кислота и фукоидал, до 70802). Нами разработан упрощенный способ выделения ламинарана, который позволяет разделять как низко-, так и высокомолекулярные соединения на основе их различной гидрофобности. При ртом препарат индивидуального ламинарана получают в концентрированном виде, что позюляет применить лиофильную сушку сразу после хрома-Torpa^.ipjEamiH и опустить обычно применяемое высавдение полисахарида егшртом. Как видно из таблицы 1, припарат ламинарана, по-jií jeimuít по 1гродложешому методу, не содержит сульфат-ионы (т.е. полностью отсутствует фукоидан).

Таблица 1. Сравнение ламинарана из Laminaria clctiortoletea, полученного разными метод шли.

Способ получения

Зола, %

Сульфата, %

Содержание ламинарана,

Ü2 _извостномх_М19 ду___________3-4_________________85________

lio предложенному методу, 0,7-0,8 нет 90-S2

'ЛИ0фиЛЬН0_ВЫСУШ9ШШЙ____________________________________________

По предложенному методу, 5.7 нот b¿-85

ьисавдегпшй спиртом с

добавлением flaCj_:_____

Таким образом, разработанный метод выделпния ламинарана позволил:.(1) упростить процесс за счет сокращения числа трудов тел»:

операций, (2) получить более чистый и концентрированный препарат, (3) сократить расход реактивов и рабочее время, (4) получать ламинаран из очень разбавленных растворов (исслодовыг; растворы до 0,05% по ламинарану). Более того, метод оказался универсальным и с некоторыми модификациями был использован нами для выделения различных 1 -»3'; 1 -»б-р-О-глюканоо.

Субстрат для i.e-p-D-глюканаз - пустулан - получают известными методами с выходом 5-7% от сухого веса лишайника, окрашенным за счет наличия пигментов i: содержгадгм ацетильные группы. lio разработанной нами методике из лишайника Umbtlicaria rosaica (Dombr.) Golubk. мок ¡o получить пустулан с выходом до VI% от сухого веса лишайника. Для получения неокрашенного и дезацетилиро-ванного пустулапа применили обработку водного экстракта лишайника перекисью водорода в слабо щелочной среде. Сравнение образцов пустулана, полученных по методу Heckendorf и Snlmlzu и предложенному нами, показало, что во втором случае получается более чистый продукт (табл.2) с низким содержанием золы и практически не содержащий ацетильных групп. Данные ИК-спектроскогши подтверждают это: интенсивность полос поглощения при 1730 и 1252 см-1, характерных для ацетильных групп, значительно меньше в ШС-спект-ре пустулрна, полученного по разработанному нами методу. 1^с-ЯМР Спектр пустуллана содержал сигналы только от 1-»6-р-1)-связашшх остатков глюкозы (табл.З).

Таблица 2. Данные элементного анализа пустуланов из Umblltcaria roaolca, полученных разными методами

Способ получения | С, Ж 1 Н. %,\ N, % | | S, % | зола, % |С00СН3

Известный метод 41 .75 6,05 нэт нет 3,46 4,59

Предловешшй метод 42 ,3 6,5 не г нет . 0,66 нет

Пахчмач - высокомолекулярный ЬЗ-р-С-глхжан - был выделен нами из препарата восточной медицины Никитуо. Он давал один узкий пик при гелъфи.чьтрации на колонках с сефадексом G-100 зГ в 0,05 N NaOH И сефакрило..! CL-4B в 0,2 М NaOH, соответствующий М.м. ~50 кД. 13С-ЯМР-Спектр пахимона в ДМСО содержал сигналы только ЬЗ-р-Б-связанных остатков глюксзы (табл.З).

Из любезно предоставленного профессором Елиновым H.H. (..'lo-нингшдскпЛ химико-фармацевтический институт) препарата аубази-дана, комплекса внеклеточных полисахаридов, продуцируемых дкчор-

Таблица 3. Хим.сдвиги атомов углерода е

глкжанов

13

С-ЯМР спектрах

Глвкан Тип связи С1 С2 СЗ С4 С5 С6

Ламшшран 1-»3-6- 103,1 73,8 85,3 68,9 76,3 61,5

________________il6zih__i03ii__ï3j0___V6j3___70а7___75^3___69,5

Пахнманл_ЩЮ____Ь3=§=__102л8__72^___86^1___68±4___76х3___60х9

Исходный крв1юрат1-»3-в- 102,5 72,6 85,8 68,3 76,4 61,1 аубазиданэ, ДМСО 1->6-р 102,9 73,6 70,1 70,1

1->6-а- 67,6

65.0

Фракция 1 из 1-3-р- 102,7 73,6 85,9 препарата ауОа- Ь6-р- 102.9 74,7 задана, ДМС0-(16 1-4-а- 100,9 71,9 72,5

68,4 79,7 69,6

76,3 61,0 70,1 71,5 60,5

0,5 M NaOH

ЬЗ-6- 104,2 72,5 87.6 87,1

.iî§=§r„_i04 x5__léil___11 tl___П il.

79,6 79,4 71.0

77,7 62,2 77,4 70,3

Фракция 2 из оубазидана,

Ь4-а-

71,5 60,5

100,9 72,5 74,5 101,2 72,7 74,3

____ilfhq-___99х8_________70х2

1.3-р- 103,9 73.8 87,3 86,9

______________Их?___76,0___70z0

1-.6-Р- 103,1 75,5 76,6 70,1 73,5 68,6

Ah

69,6

68.2 62',3

Фракция 3, 0,5 M NaOH

Пустулан

77,1

фним грибом Avreobaaidtum pulluhma D-Hy Arnaud (1910) штамм 8 (коллжция ЛХФИ i с помощью гидрофобной хроматографии нам удалось выделить три фракции, две из которых (1 и 3) представляют собой смешащие 1-»3;1-*6-р-Б-глюкани, а фракция 2 - Ы ; !-»6-а-Ь-глюкэн (данные 1ЭС ЯМР-спектроскопии, табл.3).

Отделение пуллулана позволило получить препарат, обладающий значительной биологической активностью, что было показано изуче-ем его иммуномодулирующих свойств как на модельных системах, так и в практике, на зверодармах НПО "Дальпунншна" .для профилактики и лечения алеутской болезни (вирусный иммунодефицит) норок.

При гельфильтрации на колонке с сефакрилом CL-4B в 0,4 M Nr.0II (рис.1А> фракция 1 вела себя подобно исходному препарату и ее кажущаяся М.м. равнялась ~5,5-10^. Содержание этой фракции в препарате колеблется от 50 до 75% в зависимости от исходной партии аубазидана. Фракции 2 и 3 оказались полидисцерсными. '1ргм;м!я 3 выходила двумя пиками: первый соответствовал М.м. lip, а второй, более дисперсный, охватывал интервал М.м. ot.6,6!0'î до 2,4-WJ; з этом же интервале лежал разброс М.м. для фракции ...

объем элюции, мл

1.IC. 1. Гельфильтрация на колонке о сефарозой CL-4B (1,ЬхУ9 ом) исходного аубозидана ( —) и выделенных из него фржцня 1 (о), 2 <■) и 3 {») до (А) и после (Б) гидролиза ЛИ. Элюонт: 0,4 М NaOH.

Низьомолеку'лярные пики после действий экзоламинариназы из ¡>j.lota maakll на глюканы фракций 1 и 3 (рис.1Б) анализировали на углеводном анализаторе "Blotronlk". При степени конверсии субстрата 21 и 24%, соответственно, соотношение гентиос;г :>и к глюкозе было 3,26:1 и 2,01:1, соответствешю, т.е. глюкан 1 является значительно болео разветвленным, чем глюкан 3, структура которого похсха на многие уже охарактеризованные глюканы грибов.

Согласно 13C-ñi.lP спектрам, снятии при перекрестной поляризации и под магическим углом, ламинаран и глюкан фракции 1 находятся, в основном, в виде трехеггаралъных целей: их СЗ атоми резонировали ¡три 35-36 1.1.д. (форма III по классификации Salto).

Известно, что конфирмационное состояние линейных 1»3-р-Ь- и разветвленных 1 -»3; 1 *6-ß-D-i'JimauoB можно оценивать, наблюдая за изменениями их оптического врщенил и спектров в видимой области комплексов с красителем конго красшй в зависимости от концентрами щелочи.

Хорошо растворимый п воде низкомолекулярный ламинаран имеет [а.]^5 -31,6° (с 0,1; Н20) и образует слабый комплекс в нейтральных растворах с конго 1срасным (дЯта1<= +10 нм), который при дово- ■ лъно низкой концентрации щелочи (~0,05 М) практически распадается (рис.2А).

Ьодонерйотворимие высокомолекулярные пзхиман и разветвленные глюканы 1 и 3 образуют прочные комплексы с конго красным в щелочной среде (рие.2Л), указывая на »информационную упорядоченность этих полисахаридов. Способные к' гелеобрэзованип разветвленные

0,1 0,1 0,0 |ЙаОн](И 0,1 0,3 0,0 0,7 0,9 [Ñ»oh], II

Рис. 2. Слияние концентрации NaOH на сдвиг максимума полосы поглощения комплекса конго красшК - глюкан (А) и на yro/i Оптического вращения (Б) растворов ламинарана (о), пяхимана (*), фракций 1 (■) и 3 (с) из аубазидана.

глюканы 1 и 3 образуют комплексы с конго красным уже в нейтральной среде, тогда как линейный пахиман в этих условиях не способен к комплексообразованию. В 0,05 М NaOH он хорошо растворим и формирует комплекс с конго красным (рис.2А).

Разрушение комплексов конго красного с пахиманом и глюканом 3 отмечается при 0,2-0,25 М NaOH, совпадая с известными данными для линейного ПЗ-р-Б-глюкана курдлана и разветвленных 1-*3;U6-p-D-глюканов T-5-N из Dlctyoplwra Inatualata, грифолана 1ÍMÍ-5N из Grifóla fromlom, N-5P из Auricular la aurlculcie Jvúae, C1-6P из Cordycepa cicaúae. В этой же области концентрации NaOII происходит-резкое падение угла оптического вращения растворов лахкманя, а для глюкана 3 даже раньше - между 0,1 и 0,2 М NaOH (рис.2Б). Наблюдаемые различия в области конформациошюго перехода вля глюкана 3 можно объяснить, видимо, тем, что конго красный индуцирует упорядочешюсть в его цепи. Вероятно, это же относится и к отмеченному выше слабому комплексе образованию конго красного с ламинараном в нейтральной среде. Исходя из рассмотренных данных, можно заключить, что изучаемые нами линейные и разветвленные 1 -»З-р-О-глюкаш имеют различные пространственные структуры в нейтральных растворах.

2. Выделение глюканаз, изучение ifx физико-химических свойств и действия на низкомолекулярные природные субстраты.

Работами, проведенными ранее в Лаборатории химии ферментов ТИБОХ, показано, что идеальным источником р-i,3-глюкеназ являют-

ся кристаллические стебельки двустяорчэтых моллюсков. К ценным особенностям кристаллических стебельков следует отнести низкое содержание балластных белков и практическое отсутствие прэтеи-паз. Так как при переработке промысловых моллюсков кристаллические стебельки попадают в отхода, они могут служить дешевым и доступным источником для выделения карбогидраз.

В качестве возможного источника промышленного получения ламинаринази наше внимание привлек кристаллический стебелек двустворчатого моллюска РаИпорее,.еп цеззоепШз, промысел которого ведется на о.Сахалин и который введен в марикультуру на о.Попова

Предложенный ранее для выделения эндо- р-1,3-глюканазы из морского моллюска СМатуз аХЫбиз метод, основашшй на гельфиль-трации гомогената кристаллического стебелька, не лишен недостатков: процесс гельфильтрации длителен, а пропускная способность колонки ограничена. Для устранения эти недостатков мы использовали при выделении лэминариназы из гребешка приморского ионообменную хроматографии, причем проводгаую в объеме, а не в колоночном варианте, что позволяет быстро, в одну стадию, обрабатывать большую партию гомогената кристаллических стебельков, получая с высоким выходом (-84$) очищяышй в 13 раз препарат ламинариназы, свободный от а-амилазной и целлюлазной актишостой. Этот метод был внедрен в производство на НПО "Биохимреактив" (г. Олайне. Латвия) в 1983 г. (Акт о внедрении о? 30.09.1983 г.)

Ь дальнейшем метод бил усовершенствован для одновременного выделения двух интересующих нас глюкаиаз: ламинаринази и пусту-ланазы. В ходе одностадийной ионообменной хроматограф™ на колонке достигается практически полное их разделение. При этом происходит 45-кратная очистка р-1,3-глюканазы (выход по активности —50%) и 20-кратная очистка р-1 ,б-глю.;аназы (выход -20%). Препарат ламинариназы не содержит других карбогидразных активностей, а в препарате пустуланазы имеется примесь ламинариназы (-15%) и амилазы (-13%).

Поскольку для изучения специфичности действия и снята» стандартных физико-химических характеристик ферментов необхолтмо иметь их в гомогенном состоянии, для очистки глюканаз была предложена и использоввна последовательность' операций, представленная на схеме 1. Результаты очистки сведены в таблицу 4.

Полученные препараты ферментов, обозначенные ЛУ (ламинари-назз) и ПУ (пустулапаза), были гомогенными по данным БИа-элент-

Г0М0ГЕНАТ, ЭКСТРАКЦИЯ

КМ-СЕФАДЕКС С-50, В ОБЪЕМЕ | лашшарйназа ± X "пустулапаза

ШШЛ-СЕФАГОЗА

СЕФАДЕКС С-75

КМ-ЦЕДЛЮЛОЗА СИ-52

Схема 1. Последовательность операций по выделению и очистке глюканаз из кристаллических стебельков гребешка приморского

Таблица 4. Выделение и очистка р-1,3- и р-1,6-глюканаз из гребешка приморского.

Стадия

р-1,3-глюканоза (ЛУ) . р-1,6-глюквназа (ПУ.)

очистки удельная активность стопень очистки (раз) выход. % активы. удельная активность степень очистки (раз) выход, % ак-тивн .

Экстракция 0.095 1 100 О^ООТ 1 100

Ионообменная хро- 1,07 матогряфия (1СМ-се-фадокс С-50| в объеме 11 84 0,11 ;4 80

Гидрофобная хро- 4,2 матография (фенил-сефароза) и гель-фильтрация (сефа-декс 5-75) 44 25 2,7 • 386 27,5

Ионообменная хроматография (КМ-целлюлоза Ск- 6,0 -52) 65 14 5,0 ТОО 15

» - удолтная активность выражена в микромолях ьквивалента глюкозы, выделяемых в минуту на мг белка при 253С.

рофореза и их М.м. составляли 36 и 43 чДа, соответственно.

Анализ продуктов расщепления специфических, з т.ч. химичео-ки модифицированных, субстратов этими глюканазами (рис.3), превалирующее накопление в ходе гидролиза восстанавливающих Сахаров но сравнению с глюкозой (рис.4), сохранение р-конфигу{ации продуктов позволяет считать исследуемые глюканазы эндо-фермен-тами.

Рис. 3. Анализ продуктов гидролиза ламинарана (А,Н) и перчодат-ноокислешюго ламина-рана (В,Г) глюканаюй ЛУ и пустулана (Д,Е) глюканазой ПУ на угле-ролном анализаторе Jeol 6АН.

Степень конверсии субстратов: 0,3:5 (Л,В); 20% (Д); -70% (Б,Г,Е).

Конечные продуктами фермеш'ативного гидролиза ламинарана и пустулана выделенными глюкгшазами ЛУ и ¡IV являются олигомеры со СП 2-6 и глюкоза (рис.3). При этом отличительной особенностью действия ламинаринази М на нативный и пернодчтно окисленный ла-минзраны является наличие с ранних стадий среди продуктов гидролиза заметных количеств глюкозы (рис.ЗА-Г). Исследование кинетики накопления глюкоза и восстанавливающих Сахаров в ходе гидролиза ламинарана ЛУ обнаружило интересное свойство этого фермента: е интервале с'реднечисленшх СП от 18 до 5 наблюдается уменьшение скорости накопления глюкозы по сравнению с таковой для исходного субстрата (рис.45). Одним из возмо:::нчх объяснений может являться,то, что расщопленио исходного субстрата и его слигоме-ров со СПЯ8 происходит по механизму множественной атаки, т.е. после гидролиза внутренней гликозидной сзяси полисахарида (происходящего по закону случая) фермент остается в комплексе с од-'ним из его фрагментов и совершает несколько послед"нательных атак на этот фрагмент с образованием низксмолэкулярных п;^дук-тов. Возможность осуществления гидролиза ламинарана по этому механизму показана ранее для фермента ЛТУ из Бр1зи1а Dacha.ll-пепэ1й. Для олигомесов со СЖ18 оптимальным является, по-видимому, многсцслгочечкый механизм, согласно которому при гзаимо-действии фермента с молекулой субстрата происходит разрыв одной

(Б) Рис. 4. (А) Накопление

глюкоза (1) и восстанавливающих сахароп (2) в -в зоде гидролиза ламиня-рана ЛУ (о) и пустулапа 11У (о); (Б) Отношение глюкозы к восотанавлива -щиы сахарам при различных степенях конверсии ^.сусстратов.

Цифры над отрелками озна-время. мин степень конверсии40101 СП

внутренней связи.

При гидролизе ЛУ 3Н-ыеченного по восстанаши'заодему концу 1-»3-р-Л-глюкана, полученног'о из ламинарана, на долю С1с* приходится ~40Я от фракции со СП 1 -5 при степени конверсии субстрата ~1Ж. Поскольку используемый субстрат содержит радиоактивную метку только на восстанавливающем конце (согласно методу получения), на ранних стадиях гидролиза мольные фракции меченых продуктов будут эквивалентны относительным частотам расщепления связей. На рисунке 5 представлены значения относителышх частот расщепления связей для ЛУ в сравнении с литературными данными для ЛО и Л1У.

Тйким образом,- все вышеприведенные данные по действию эндо-ламннариназы ЛУ на нативный и модифицированные ламинараны указы-

26

5 5 7

1 18 16 Л1У:~0±0-(^0-0-0-0

ЛО:

ЛУ:

0

37

14 18

-о^о-о-о1©

20

0 - остаюк глюкозы;

Q - остаток глюкозы на восстанавливающем конце, несущий метку:

5 7

<= Ю 10 1 1 -0-0-0-0

снтон

или

снтон -¿н

¿¡11'ОИ

(Г - ТрИТШ!)

Рис. 5. Относительные частоты расщеплении связей при действии ЛО, Л1У и ЛУ на 3Н-меченшй по восстапавливамцему кон\у 1.З-р-И-глюкан.

вают на большое сходство изучаемой нами глюканазы с эндоламина-риназой ЛIV из Яр1зи1а зааНа11пепз1з, которая, как считается, осуществляет гидролиз ламинарана по механизму мнокогшенной атаки.

При действии ПУ на пустулан накаплиБа.лдимся прс,*уктом является тетрамер (рис.ЗД.Е), «то было описано также для эндопусту-ланазы из СШатуз а1Ыскш.

Обо выделенные нами глюканазы обладают 'тюсоолосу! п переносить глиноиовуи часть субстрата не только на воду, но и на пит-рофенильше р-и-глюкозиды (рис.б), т.е. осуществляют реакции трансгликозилировяния. Это свойство значительно сильнее выражено для ЛУ, чем для ПУ. Если для ЛУ продукты переноеп регистрируются при концентрациях донора и акцептора 1 иг/мл (рис.бА), то при действии ПУ на пустуляк >з присутствии п-нитрофенил-р-В-глюкопи-ранозида (концентрации обоих улеводов 2 мг/мл) продукты переноса регистрируются в следовых количествах. Однгжо, увеличение концентрации донора и акцептора до 10 мг/мл при катализе ПУ вызывает появление значительных количеств различных продуктов, несущих п-нитрофенильшй радикал (рлс.бБ).

. Хроматогрчфня продуктов' РОМКЦШ! ТриНСГЛИКО-

зилироьглш.ч в присутстыш нитрофс-нилглюкоэнда и (А) л?.1старана и ЛУ и (Б) пустул^.на и ПУ. Концентрация и донора и акцептора 1 мг/мл (А) и 10 мг/мл (<3).

регистрация продуктов -при 280 им;

* - п-нитрофенильннй радикал.

Оптимальным для действия эндоглюканая ЛУ и ПУ является рН ~4,5 13 0,05 М сугц1Ш--|Тнсм или ацетатном буфере при 25°и (рис.'М, и С1Ш стабнйыш при рН 5-7 2 тоаднио, по крайней мере, двух часов |1рн этой температуре. Мексимальиая активность ЛУ и ПУ появлялась при темпяратуре 45°С (рлс.ВЛ), шшэ коюрой наблюдается резкое хидонио активности фэрмоитов, связанное, вероятно, о тепловой денатурацией ферментон. Различия между ЛУ и ПУ наблюдаются

(А) Рис. 6

Рис. 7. Влияние рН (А), температуры (Б) и присутствия N801 (В) , но активность ЛУ (о) и ПУ (о). По оси ординат отложена остаточная активность (Ж). Время инкубации 10 шш; концентрация ламинарана 1 Ш'/мл, пустулана 2 мг/ыл.

в термоустойчивости. Если при 25°С обе глюканазы сохраняют практически исходную активность в течение месяца, тс при 37°С ЛУ ин-активируется полностью через 2 часа инкубации, а ПУ - стабильна в течение, по крайней мере, б суток.

Интересно также различие в действии МаС1 на проявление активности этих глюканаз. В то время как на гидролиз пустулана ПУ присутствие НаС1 .до концентрации ^0,3 М не оказывает никакого влияния, скорость гидролиза ламинарана ЛУ при добавлении 0,25 И НаС1 увеличивается почти в 3 раза (рис.7В). В этом ЛУ похожа на эндслам1шариназу Л0 из СМапуз а1ЫОиэ.

Ча активность ЛУ не оказывали влияния реагенты, взаимодействующие с сульфгидрильными грушами, остатками тирозина и лизина. Методом Эллмана показано отсутствие свободных ЕН-групп е молекуле фермента. Отсутствие свободных БН-групп было ранее уста-но влено для эндоглюканаз из РеШси1аг1а зазак1, КМгориз аг-гЫгиэ, СМитуз а1Ыс1иэ и БрьаиШ засЬа11пепа1з. Падение активности .ЛУ при модификации остатков гистидшш и карбоксильных групп дикарбоновых аминокислот наблюдалось только при значительном избытке специфических реагентов. Ранее для глюканаз Л1У и ЛО бчло показано, что существенное падение активности ферментов наблюдается при модификации 6 остатков гастидина; субстрат защищал ферменты от действия реагента.

Полностью подавлял активность ЛУ Л-бромсукцинимид (БОН) в концентрации Ю-4 М при рН 4,0, что указывало на существенную, роль остатков триптофана. Ранее при исследовании г>ндо-р-1,3-глю-

канлз JIIV и ЛО методом дифференциальной спектроскопии было показано, что окисление БСИ одного остатка триптофана, участвующего в фермент-субстратном связывании, приводит к полной потере способности Л1У и ЛО катализировать гидролиз ламинарана.

3. Иммобилизация ЛУ на модифицированном аминосилохроме.

В качестве носителя для адсорбционной иммобилизации ЛУ использовали гидрофобный сорбент на основе аминосилохрома:

Гаминопропил- -т_со_(сн . _tJH.co.

I силшсагель 5 г,м

Связывашю фермента составило 100« при емкости 100 мг белка на 1 г носителя. Специфическая активность по ламчпарану иммобилизованной ЛУ равнялась 45% от уровня нативной." При пропускании раствора ламинарана через колонку с иммобилизованной ЛУ основными продуктами гидролиза как и в случае натипгой ЛУ оказались ла-минариолигосахариды со СП 2-6 и глюкоза. Иммобилизованная лами-нариназа сохранила также способность к трансгликогчшгрованию. Заметного падения активности при работе на колонке с иммобчлизо-ванной ЛУ в течение 2 педель при 20°С но было отмечено.

4. Изучение действия глхжаназ на высокомолекулярно субстраты.

Нами было показано, что эндоламинариназа ЛУ гидролизует высокомолекулярный нерастворимый в соде субстрат - пахпман, предварительно обработанный 0,05 и раствором NaOH, со скоростью, составляющей 60% от таковой относительно ламинарана.

Для изуче1шя влияния вторичной структуры субстрата на скорость ферментативного гидролиза и адсорбционную способность провели сравнение этих параметров при действии ЛУ на нативннй, суспендированный в буфере, и на предварительно обработанный 0,05 М NaOH пяхиман. Выяснилось, что адсорбционная способность Л1«' по отношению к предобработанному щелочью пахшану в два раза выше (рис.8Л). Стационарная скорость гидролизп ЛУ натнвного пахимана оала на порядок меньше, <г;м для предоораоотанного щелочь» (pie. 8Б). Процент сорбщш ЛУ на последнем достигал максимального значения г (рис.8А).' Значение К^ для ЛУ было 0,06 л/г, что, по аналогии с эндоглюканззами целлюлозных комплексов, позволяет отнести ее в расряд олзбосорбирунциг.ся фогмен'.'ов. Таким обрати, упорядоченность структуры субстрата играет важную роль в механизма ферментативной деградации пахимана ЛУ. При обработке иахпма-

РИС. 8. Изотерми адсорбции (А) и стационарные скорости гидролиза (Б) натиьного (I) и продобрг.ботанного пелочью (II) пахимана.

Ось абсцлсс: концентрация пахимана, иг/ил (А) и время, мш; (Б). Ось ординат: сорбция фермента (А) и поглощение при А^^ (Б).

на щелочью происходит разупорядочтааниэ его пространственной структуры и тем самым увеличивается эффективная площадь поверхности, доступной для связывания с ферментом и реакционная способность пагимана, т.е. доступность его связей для гидролиза.

Известные на сегодня"работы, связанные с изучением действия р-1,3-глюканаз на нерастворимые субстраты, описывают распределение н состав только водорастворимых продуктов ферментативной деградации полимеров, не касаясь совсем водонэрастворимой части деполияерисованного субстрата. Для получения полной картини рас- ' пределения продуктов ферментативного гидролиза пахимана эндола-минаринасой ЛУ мы прилегали метод гель-проникающей хроматографш на колонке с сафадоксом С-100 зГ и 0,05 М ИаОН в качестве элюен-та. Диапазон разделения полисахаридов в этих условиях лежал в пределах от 1 до 45 кДа. На ранних! стадиях гкдро.чиза отмечалось небольшое уширение основного пика исходного пахимана, который выходил со свободным объемом колонки, и слабое накопление низкомолекулярных продуктов (рис.9А). Какого-либо заметного накопления промежуточных продуктов не наблюдалось деке на более поздних стадиях гидролиза. Однако наличие их в гидролизате было подтверждено после концентрирования фракций, находящихся между высокомолекулярным и низкомолекулярным пиками; сп равнялась -35. Исчерпывающий гидролиз, достигаемый добавлением свеяих порций фермента к реакционной смеси, давал преимущественно один низкомолекулярный пик при хроматографии (рис.ЭА); степень конверсии субстрата достигала при этом 65-70%. Анализ низкомолекулярного пика на колонке с биогелем Р-2 выявил, что он содержит сумму олигосахаридов, причем основными продуктами при всех степенях конверсии пахимана являются глюкоза и лшлшарибиозв (рис.9Б).

Преимущественное накопление низкомолекулярных продуктов отмечалось и ранее при исследования действия эндогликаназ на нерастворимые гомополисахариды: эндоламинариназы Л1У из 8р1зи1а за-

Рис. 9. Гельфильтрация: (А) пахимаиа (—) и продуктов гидролиза его ЛУ при 15 (о), 27 (о) и 72% (») степени конверпш! на колонке с сефадексом G-109si (1,1x95 см) и (Б) ннзкомолеку-лярных продуктов при 27 и 72% степени конверсии на Зиогеле Р-2 (Jeol 6АН).

сhaltrwnaia на пяхиман, эндогт.оллюлазы из Vrichodennci reeaet на микрокристаллическую и аморфную целлюлозу и эндомани.-мазы иь Bacillus aut>tilla на машин. «Такт этот объяснялся том, что структура нерастворимых гомоггсыисахеридов создает условие для гидролиза их экдодеполимэрчзами по механизму множественной атаки.

Фракции 1 и 3 из аубазидана не подвергались гидролизу ЛУ и Ш7 как по раздельности, так и при их совместном действии. Это можно объяснить высокой разветвленностью глюкана, не позволяющей ферментам образовывать фермент-субстратные комплексы. Недоступность высокоразветвленных 1-»3;1-»б-0-Б-глхжанов действию зндоглю-канаг показана для склероглюка!Ш из Sclerotinia rolfall.

Радиолиз фракции 1 из аубазидана в сухом состоянии действием ^-излучения в дозах 2,3 и 4,6 МРад вызвал, как и спадалось, ее деполимеризацию (рис.10), но не сделал его доступным гидролизу эндоглюканазами. Экзоламкнэриназя ЛИ гидролизоЕала облучен-иье препараты (рис.10).

5. Поиск лгитичаскйх форментов.

Морские беспозвоночные, представленные больпим числом типов и видов, находятся на различных этапах, эволюции, является богатом источшшом карбогидраз. Присутствие а:« в их пищевом рационе наряду с водорослями морских микроорганизмов предполагает наличие и литпческих ферментоз, обнаружение которых основано на

- 18 -"♦.о

Л

J_I Г->_i> У1 /1 \i

70 to 110 130 180

I Г"з—i—i 1S1 /

TO >0 110 130

190

объем элюции, мл

Рис. 10. Гельфильтрация на колонке с сефарозой CL-4B (1,6x99 см)

Фракции 1 из аубазидана до (-) и после радиолиза (а) и

облученного препарата после действия ЛИ (о).

Доза облучения: 2,3 (А) и 4,6 (Б) МРад. Элюент: 0,2 W NaCl.

способности преимущественно или со сравнимой скоростью гидроли-зовать как высокомолекулярные, так и низкомолекулкрше субстраты.

Нами было исследовано распределение ряда гликаназ среди широко распространенных-и доступных видов залива Посьета Японского моря и Индийского океана. В качестве субстратов использовали 0,1% растворы ламинарана, пахимана, карбоксиметилпахимана, аубазидана, лихенина (смешанный 1-»3; 1-«4-р-В-глюкан), пустулана, 1*3;1-»4-р-Р-ксилана, 1-»3;1-»4-р-Б~маннана (родэксман).

В течение рейса ШС "Ирофоссор Богоров" были исследованы представители 80 видов морских беспозвоночных Индийского океана, принадлежащих к типу Mollusca (10 видов класса Mudlbranchla, 53 - Gastropoda, 1 - Polyplacophora и 16 - Bivalvla) Представители Nudlbranchla проявили слабую активность по отношению к использованным субстратам. Среди исследованных представителей класса Gastropoda наиболее активными оказались Patella concolor, Trochus nl lot l сиз и Bulla atppulla. Как и ожидалось, высокую активность проявили экстракты кристаллических стебельков двустворок, а именно, Atrtna vexlllum, Trtdakna squamosa, виды родов Spondylus и Р'ппа. Экстракты Atrtrxi vexillm и Trldalina squamosa могут служить источниками литических ферментов, т.к. гидролизуют со сравнимыми скоростями ламинарзн, пахиман и КМ-пахиман.

Тестирование гликаназ 60 обитателей залива Посьета выявило слабые активности или даже полное их отсутствие у изученных видов типов Vermes (3 ьида), Echlnodermata (12 видов) и Chordata

(3 вида). Высокие активности отмечет! для представителей типов Arthropcda (9 видов) и особенно Mollusca (2 вида loricate, 8 видов Gastropoda и 23 вида Blvalvla). Среди них выделялись виды родов Iachnochtton, Batlllarla, Crencmytllus и Area, которые обладали значительны!™ способностями катализировать гидролиз лами-нарана, пахимана и дрожжевого глюкэна.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема выделения в гомогенном состоянии лашша-риназн и пустуланазы из нового источника - кристаллических стебельков промыслового моллюска Patinopocten уезэоепз1з. Установлено, что они являются ферментами эндо-типа действия. Возможно, что эндоламинариназа ЛУ гидролизует ламшюран по механизму множественной атаки. Исследованы некоторые физико-химические свойства выделенных эндоглюканаз.

2. Установлено, что при гидролизе водонерастворимого высокомолекулярного 1-»3-р-Б-глюкана - пахимана - эндоламшшриназой ЛУ происходит сорбция последней на субстрате, а основными продуктами при всех степенях« превращения субстрата являюгея глюкоза и лймтщрибиоза. Это предполагает, что гидролиз пахимана эндолами-нариназой ЛУ осуществляется преимущественно по механизму ;лложе-ственной атаки. На способность эндольмштриназы ЛУ гидролизовать пахиман влияет пространственная структура субстрата.

3. Установлено, что для проявления каталитической активности ондоламинарипазы ЛУ существенную роль играют остатки триптофана, а также, вероятно, вамш остатки дккарбоновых аминокислот и гис-•гидина. Она не является SH-ферментом; остатки тирозина и лиз!ша но входят в активный центр.

4. Разработан метод одновременного выделения , ламикаринэзы И пустуланазы, позволяющий в одну стадию достигать 45-кратной очистки ламинариназы с выходом по активности ~50% и 20-кратной очистки пустуланазы с пнходом по активности -20'. Предложен промышленный способ выделения эндоламннартшзы ЛУ, внедренный на НПО "Биохпмреактнв" (г. Олайно, Латвия). Показано, что иммобилизация ЛУ на модифицированном аминосилохромо не вызывает изменения ее каталитических и трансглпкознлиругсцих свойств. Это открывает возможности практического применения фермента.

5. Предло:а;н новый способ получения ламинарана из морских но-доросла, испольгук'цнй гидрофобную урэматографию и позьъл.чгаий

- 20 - •

выделить чистый продукт в концентрированном виде непосредственно из экстрактов, в том числе из очень разбавленных.

6. Предложен новый способ выделения пустулана из лишайника Umoillcarla roaaica fDombr.) Golubk-, использующий обработку водного экстракта этого лишайника перекисью водорода в слабо щелочной сродэ для получения неокрашенного и дезацотилировпшюго густулана.

7. Показано, что препарат "аубазвдсн" представляет собой смесь, по крайней мере, трех полисахаридов: двух 1-»3;1-»6-ß-D-глюканов и пуллулана. Удаление пуллулана из препарата усиливает биологическую активность аубазидана. Изучение пространствегаюй структуры выделенных 1-»3;1-»б-р-D-глюканов с помочью комплексооб-разопэшм с конго красным, 13С ЯМР-спектросколии в щелочном растворе и в твердом состоянии показало, что они находятся преиму-ществешю в виде трехспиральннх цепей.

8. Показано, что сильно разветвленный 1-»3;1-»6-(Э-1)-глюкан, выделенный из аубазидана, не подвергается гидролизу эндоглюканазь-ми. При действии экзо-р-1,3-глюканаз происходит накопление глюкозы и гентиобиозы.

9. Проведен поиск литических глюканаз среди морских беспозвоночных Индийского и Тихого океанов. Исследовано около 140 видов животных. Выявлены перспективные источшки различных карбогид-раз.

Основные натериал>; диссертащш изложены:

1. Сундукова Е.В., Шевченко Н.М., Лртюков A.A., Елякова Л.А. Изучение свойств и картины действия иммобилизованной эндо-р-1,3-глюканазы из Patinopecten уеавоепа1з.//1Ч Всесоюсн.симп. по инженерной энзимологии. 1983. Киев. С. 83.

2. Сундукова Е.В., Гончарова Е.А., Елякова Л.А. Ферменты, расщепляющие углеводсодержащие биополимеры, и полисахариды из отходов промышленной переработки морского сырья.//Всесоюзн.конф. "Экономика освоения океана". Тез. докл. 1985. Владивосток. С. 86-88.

3. Елякова Л.А., Рудакова В.П., Сундукова Е.В., Исаков В.В. Трансферазная активность эндо-р-1,6- глюканаз из кристаллических стебельков двустворчатых морских моллюсков.//Химия природы, сое-ДОШ. 1986. № 4. С. 469-471.

4. Звягинцева Т.Н., 1иирокова Н.И., Сундукова Е.В., Еллетвз

Л.А., Крылова Н.В., Игнатенко Л.А., Сергиенко А.Л., Беседнова

H.H. р-1,3;4,6-Глюканы и продукты их ферментативной трансформации в качестве иммуномодулк^уодих агентов.//Междунеродн. симп. "Структура, биосинтез и функции молекулярных элементов иммунной системы". Тез.докл. 1987. Пущино. С. 47.

5. Сундукова Е.В., Елякова Л.А. Распространение некоторых глюканаз сроди морских беспозвоночных.//Биология моря. 1989. M 4. С. 78-80.

6. Бакунина И.Ю., Колесникова Г.П., Сундукова Е.В., Звягинцева Т.Н. , Широкова Н.И., Елякова Л.А. Взаимодействие ß-1,3;1,6-глшанов с конго красным как показатель наличия вторичной структуры, в связи с биологической активностью.//XIV Менделеевский съезд. Тез.докл. 1989. Ташкент. С. 405.

7. Сундукова Е.В., Елякова Л.А. Выделение, очистка и некоторые свойства эндо-ß-l,3- и эндо-ß-l,6-глюканаз из гребешка приморского. //Всесоюзн. симп. "Химия белков". Тез.докл. 1990. Тбили си. С. 154. V

8. Сундукова К.В., Светашева 'Г.Г., Сова В.В., Елякова Л.А Действие различных реагентов на активность эндо-ß-l,3- и ьндо-ji

I,6-глюканаз из гребешка приморского.//Всесоюзн.симп. "Хими,, белков". Тез.докл. 1990. Тбилиси. С. 155.

9. Беседнова H.H., Крылова Н.В., Сундукова В.В., Елякови Л.а. Сравнительное исследований иммуномодулируюцей активности пубази' дана и его активного компонента.//Всесоюзн.совещ. "Иммуномодули торы природного происхождения". Тез.докл. 1990. Владивосток. С. 42.

Результаты работы защищены авторскими свидетельствами:

10. A.c. 1097674. Способ получения ß-1,3- и ß~1,6-глмсшшз./ Е.В.Сундукова, Л.А.Елякова. - Опубл. в БИ № 22. 1984.

11. A.c. 1172263. Способ получения вндо-р-1,3-глюканаяц (ла-минариназы)./Л.А.Елякова, Е.В,Сундукова, В.Х.Кирсис, И.К.Шпрун-ка. - Опубл. в БИ » 29. 1935.

4 12. A.c. 1227199. Способ получения пуотуланр./Т.Н.Звягшадьа, Е.В. Сундукова, Н.П. Мищенко, О.Е.КривощокоЕа, Л.А.Елнкона. Опубл. в БИ * 16. 1986.

13. A.c. ■'642725. Способ получения лашшарина./Т.Н.Звкглчц.э ва, Е.В.Сундукова, Л.А.Еллкова. - Опубл. в БИ » 14. 1991 .

л-,

Соискатель ■ Суидук'.-па Ь'.Ь,

С 1'-'-