Активность и стабильность β-галактозидаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

фил/?-

Пилипенко Ольга Станиславовна

АКТИВНОСТЬ И СТАБИЛЬНОСТЬ р-ГАЛАКТОЗИДАЗ

02.00.15-Каталю

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории кинетики и катализа кафедры физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: Научный консультант:

к.х.н., доцент Атякшева Л.Ф. д.х.н., профессор Полторак О.М.

Официальные оппоненты:

д.х.н., профессор Шеховцова Т.Н. д.х.н., профессор Ямсков И. А.

Ведущая организация: Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН

Защита состоится «21» апреля 2006 г. в 16 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.90 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.3, Химический факультет МГУ, ауд. 337.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «20» марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

д-^OSft/i*^ —

Бобылева М.С.

2,00 g А S700

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы р-Галактозидаза - фермент углеводного обмена растений, микроорганизмов, животных и человека. Одна из функций фермента в организме млекопитающих - гидролиз молочного сахара лактозы на два легко усваиваемых моносахарида - глюкозу и галактозу. Значительная часть населения Земли из-за недостатка этого фермента не способна усваивать молочные продукты, поэтому препараты Р-галактозидазы используют при производстве безлактозных продуктов для детского и диетического питания. В последние годы обсуждается перспектива использования р-галактозидаз для производства обладающих бифидогенными свойствами олигосахаридов, которые также входят в состав лечебно-профилактических продуктов питания. В этом случае используется трансферазная активность фермента. р-Галактозидазы находят применение в медицине при лечении и диагностике некоторых заболеваний, при решении экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды отходами молочной промышленности, а также могут быть использованы в лабораторном синтезе. В связи с этим проблема получения высокоактивных и стабильных катализаторов на основе иммобилизованных Р-галакгозидаз актуальна в настоящее время. Несмотря на то, что нестабильность ферментов - одна из причин, ограничивающих их применение в качестве промышленных катализаторов, исследования стабильности р-галактозидазы носили чисто качественный характер. Сравнительные физико-химические исследования активности и стабильности Р-галакгозидаз из различных источников до сих пор не проводились.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось сравнительное исследование активности и стабильности Р-галактозидаз из различных источников и получение активных и стабильных катализаторов на основе иммобилизованной Р-галактозидазы.

Научная новизна Впервые проведено систематическое исследование р-галактозидаз из четырех различных источников бактериального (Escherihia colî), дрожжевого (Kluyveromyces fragilis), грибного (Pénicillium canescens) и животного происхождения (печень быка). Проанализированы общие закономерности механизма их каталитического действия, рассмотрены кинетические механизмы термоинакгивации и влияние различных факторов на .активность и стабильность ферментов.

Впервые определены активности различных олигомерных форм Р-галактозидаз, исследованы процессы диссоциации олигомеров и показана их роль в стабилизации и дестабилизации фермента.

Впервые предложены критерии стабильности, которые можно использовать и для других олигомерных ферментов: температура исчезновения индукционного периода на кинетических кривых термоинактивации; число промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей ферментом каталитической активности: «критическая» температура смены кинетического режима термоинактивации.

Результаты исследования позволили оптимизировать стабильность и каталитические свойства этих ферментов и предложить способ получения гетерогенного катализатора на основе иммобилизованной Р-галактозидазы из грибов Pénicillium canescens. Для стабилизации адсорбционных слоев р-галакгозидазы использованы полисахариды растительного (амилоза" ' н)

происхождения.

Практическая значимость работы Получен активный и стабильный гетерогенный катализатор на основе р-галактозидазы, иммобилизованной на поверхности широкопористого гидротермального силикагеля в присутствии полисахаридов.

Предложены 1фигерии стабильности, которые могут быть использованы для ферментов олигомерного состава.

Апробация работы Основные результаты работы были представлены на международной конференции «Biocatalysis-2000: Fundamentals and application» (Москва, Россия, 2000); II Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, Россия, 2000); международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001» и «Ломоносов-2005» (Москва, Россия).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 статей и 4 тезисов докладов.

Объем и структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. В литературном обзоре, состоящем из двух глав, представлены имеющиеся в литературе структурные данные и свойства Р-галактозидазы из различных источников, а также рассмотрены различные способы иммобилизации р-галактозидазы и свойства полученных на их основе гетерогенных катализаторов. В экспериментальной части даны методики приготовления рабочих растворов, приведены кинетические параметры исследованных ферментов и методики проведения экспериментов. В главе результаты и обсуждение, состоящей из трех разделов, представлены полученные в работе экспериментальные данные и проведен их анализ. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 42 рисунка и 28 таблиц. Список цитируемой литературы включает 203 наименования.

Объекты исследования В работе исследованы Р-галактозидазы из четырех различных источников: бактериального (Escherihia colt), дрожжевого (Kluyveromyces fragilis), грибного (Pénicillium canescens) происхождения и фермент из печени быка. Их характеристики приведены в таблице 1. Использовали 0.1 M фосфат-цитратные (фермент из Pénicillium canescens) и 0.1М фосфтные буферные системы (ферменты из печени быка, Escherihia coli и Kluyveromyces fragilis).

Таблица 1. Олигомерный состав и свойства исследованных ¡i-галактозидаз

Источник фермента Олигомерный состав * Молек. масса, кДа* Активные формы * Оптимум pH активности км**, мМ к ** лкат > с1

Escherihia coli Тетрамер Гомодимер Мономер 464 232 116 Тетрамер Димер 7.0-7.5 0.093 220

Kluyveromyces fi-agilis Гетеродимер Мономеры Ассоциаты 203 90 и 120 Димер 7.2-7.5 1.0 12.5

Pénicillium canescens Тетрамер Гомодимер Мономер 440-560 220-280 110-140 Тетрамер Димер 4.2-4.5 1.0 35.8

Печень быка Мономер 41 Мономер 7.0-7.5 2.5 0.056

* - данные взяты из литературы.

** - определены д!и синтетического субстрата - орго4мрофенш1-Р-В-галактширанотида при 25ЧС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Механизм реакции гидролиза гликозидной связи субстрата в активном центре ß-галактозидазы в рамках теории цепей перераспределения связей

Механизм каталитического действия фермента рассмотрен с точки зрения представлений о цепях перераспределения связей (ЦПС) с привлечением литературных данных по рентгеноструктурному анализу (РСА) третичной струтктуры и результатов исследования механизма действия ß-галактозидазы из Escherihia coli методом сайт-специфигеского-мутагенеза (рис.1).

Рис.1. Схема реакции гидролиза R-галактопиранозида (R-O-CHGal) I, II, III, IV, V, VI-Различные состояния активного центра фермента I - свободный активный центр. Glu-461 и Glu-537 - протонированная и депротонированная каталитические группы; магний образует координационные связи с каталитически активной Glu-461, субстратом и адсорбционными группами. II и III - ESI - комплекс при гликозшшровании ß-галактозидазы II - начальная ЦПС, III - конечная ЦПС гликозилирования фермента; образование первого продукта реакции (ROH). IV, V -ES2 - комплекс при дегликозилировании ß-галактозидазы: IV - начальная ЦПС, V -конечная ЦПС дегликозилирования, образование второго продукта реакции галактозы (HOCHGal). VI - возвращение активного центра в исходное состояние

Каталигическими группами в активном центре ß-галактозидазы являются карбоксильные группы Glu-537 и Glu-461, причем в нагивном ферменте первая из них депротонирована, а вторая - Glu-461 - протонирована. Glu-537 и Glu-461 участвуют в расщеплении и возникновении гликозидной связи субстрата и гликозил-фермента, соответственно, по механизму кислотно-основного катализа, т.е. служат акцепторами и донорами протонов в акте катализа. Glu-537 в каталитическом процессе функционирует в качестве нуклеофила, который атакует углеродный атом i ликозидной связи С-О с разрывом последней и образованием 1алактозилированною фермента (Gal-E). Glu-461 играет роль донора протона на стадии гликозилирования ферменш для уходящего из активного центра фермента первого продукта реакции (ROH). Карбоксильная группа Glu-461 сильно ионизирована в промежуточном соединении (Gal-E). В реакции гидролиза галактозил-фермента она выступает акцептором протона, уходящего при разрыве О-Н связи молекулы воды, активируя

при этом нуклеофильную атаку атома кислорода молекулы воды на атом углерода гликозидной связи в галактозил-ферменте.

Гидролиз орто- и пара-нитрофенил-р-О-галактопиранозидов Р-галактозидазой в присутствии метанола

Рассмотренному выше механизму ферментативной реакции соответствует трехстадийная кинетическая схема с участием двух промежуточных соединений Е81=Х| и Е^2=Хг и образованием двух продуктов реакции на второй и третьей стадии Эта схема детально проанализирована в литературе, поскольку описывает механизм каталитического действия многих ферментов.

К *2 Е + Я<= ' =эХ,-+Х2->Е + Р2 (I)

I

Р\

Здесь Е - фермент, 8 - субстрат (орто- или пара-нитрофенил-р-О-галактопиранозид), Р, - первый продукт реакции (орто- или пара- нитрофенол) иР2- второй продукт реакции (галактоза).

Помимо тдролиза галактозидной связи Р-галактозидаза может участвовать в реакциях трансгликозилирования, если присутствует нуклеофильный агент, способный конкурировать с молекулами воды и вступающий в реакцию на стадии дегалактозилирования фермента согласно схеме (2):

N -Ш^иЕ+Рг Е + 8<=К" М (2),

+ " о + Л

Р,

где N - добавленный нуклеофил, Рз - третий продукт реакции, получающийся взаимодействием нуклеофила с галактозил-ферментом.

В присутствии нуклеофильного агента выражения для ка1алитической 1нты по 1 принимают вид:

* *

константы по первому продукту реакции к ^ и константы Михаэлиса Км

кш,= 4 ; (3)

к+к+к[Щ '

2 3 4

* к+к[Щ

К = К —5-(4)

м 'к +к + к [Ы]

2 3 4

Нами было исследовано влияние метанола на кинетические параметры ферментативного гидролиза орто-нитрофенил-р-В-галактопирапо-щда (оНФГ) и пара-нитрофенил-(3-П-галактогтиранозида (пНФГ). В случае оНФГ с ростом

концентрации метанола в реакционной смеси наблюдалось значительное увеличение каталитической константы и константы Михаэлиса. При использовании-в качестве субстрата пНФГ присутсвие метанола не влияло на значения кинетических параметров уравнения Михаэлиса-Ментен (рис.2).

Рис.2. Относительное изменение кинетических параметров ферментативного гидролиза орто- и пара- нитрофенил^-й-галактопиранозида ß-галактозидазой из Escherichia coli в присутствии метанола.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что:

1) метанол конкурирует с молекулами воды и влияет на стадию дегалактозилирования ß-галактозидазы согласно схеме (2);

2) при переходе от одного субстрата к другому происходит смена лимитирующих стадий- в реакции гидролиза оНФГ скорость процесса определяет дегалактозилирование фермента, а в реакции гидролиза пНФГ скорость-определяющей является стадия галактозилирования, на которую не влияет присутствие спирта в реакционной среде.

Аналогичные результаты получены для фермента дрожжевого происхождения, выделенного из Kluyveromyces Iactis. Проведенное нами компьютерное сравнение аминокислотных последовательностей ß-галактозидаз из четырех различных источников (в том числе и Kluyveromyces ¡actis) с аминокислотной последовательностью фермента из Escherichia coli, показало, что при степени идентичности первичных структур 30-60% строение активного центра высоко консервативно, в частности сохраняются аминокислотные остатки, являющиеся функциональными в каталитическом домене фермента из Escherichia coli, в число которых входит лигандное окружение катионов магния.

Полученный результат указывает на значительное сходство пространственной структуры активных центров и, соответственно, механизма каталитического действия этих ферментов, до сих пор исследовавшегося только на примере ß-галактозидазы бактериального происхождения.

Ассоциативно-диссоциативные процессы в растворах ß-галактозидаз

Необратимой инактивации олигомерных ферментов, как правило, предшествуют процессы разрушения структуры конформационного замка (многоточечный контакт между белковыми глобулами в олигомере) и обратимая

диссоциация олигомера на составляющие протомеры, поэтому исследование процессов ассоциации и диссоциации в растворах ферментов позволяет выявить некоторые причины их инактивации и дестабилизации.

Олигомерный состав

исследованных в данной работе ß-галактозидаз представлен в таблице 1. В работе более подробно исследована диссоциация тетрамера ß-галактозидазы из Escherihia coli, поскольку только для фермента бактериального происхождения (из исследованных нами ß-галакгозидаз) методом РСА расшифрована третичная структура. На рис. 3 показано строение молекулы фермента (Jacobson R.H., 1994). Образование идентичных контактов AB и CD обусловлено взаимодействием аминокислотных остатков, расположенных в середине последовательности и вблизи С-конца последовательности каждого мономера Идентичные контакты AD и ВС проходят в области активного центра Каждый из четырех активных центров тетрамерной молекулы фермента образован элементами двух различных субъединиц. В формировании активного центра участвуют катионы магния (по два в каждой субъединице).

Исследование межбелковых контактов, образующих структуру конформационного замка в тетрамере ß-галактозидазы из Escherihia coli показало, что контакты AB и CD менее прочные, чем контакты AD и ВС, находящиеся в области активного центра. Естественно предположить, что при диссоциации данного тетрамера в первую очередь разрываются контакты AB и CD с образованием активных димеров. Неактивные субъединицы образуются в результате разрыва контактов AD и ВС. Схематически процесс диссоциации тетрамера фермета из Escherihia coli можно представить следующей схемой:

Рис.3. Строение молекулы ß-галактозидазы из Escherichia coli. А, В, С, D -идентичные субъединицы

Е4 <=> 2Е2 <=> 4Е| (5)

активен активны неактивны

Первая стадия процесса (для ß-галактозидазы из Escherihia coli) преобладает при температурах не выше 40°С. Обратимая диссоциация активных димеров с образованием неактивных мономеров происходит при более высоких температурах.

Другие исследованные нами ß-галактозидазы также существуют в виде олигомеров разного состава (см. табл.1), способных взаимопревращаться в результате процессов ассоциации-диссоциации. В определенных условиях возможно образование неспецифических ассоциатов, состоящих из нескольких молекул фермента. Обратимые процессы ассоциации-диссоциации лежат в основе механизма регуляции ферментативной активности в природе.

Если удельные активности взаимопревращающихся олигомерных форм отличаются, то зависимость удельной активности фермента от его начальной концентрации в растворе позволяет определить активность каждой из олигомерных форм фермента. На рис.4 приведены зависимости удельной активности ß-галактозидаз от разведения при температуре 25°С. Удельная активность фермента, выделенного из Pénicillium canescens, в интервале исследованных концентраций оставалась постоянной. Для фермента из Escherichia coli она возрастала с ростом разведения (интервал концентраций 1.3-1О~10-1.7-1О"8М) как и для фермента из печени быка (интервал концентраций 6.510"7-2.610"5 М). В случае ß-галактозидазы из печени быка, молекула которой представляет собой мономер, изменение удельной активности можно объяснить процессами неспецифической ассоциации а растворах фермента и образованием менее активных димеров. Для

источник с0.м а0, молекул

фермента с*ац

—■— E.coli 1.7*10® 180

—•— K.fragilis 3.6'Ю'7 22

—о— печень быка 2.6*10® 0.036

г Рcanescens 3.4*107 35

20 40 60 80 100 120 140

С/С

Рис.4. Зависимость удельной активности Р-галактозидаз от концентрации фермента в растворе. Т=25"С, рНопт.

фермента дрожжевого происхождения (К¡иууеготусея А-а^Ш^) получена более сложная зависимость: его удельная активность возрастает в интервале концентраций фермента 1.9-10"'°-2.210"®М, достигает максимума, затем убывает Обработка экспериментальных зависимостей удельной активности от концентрации фермента в соответствии с известными подходами (Курганов Б.И., 1978) позволила определить удельные активности различных олигомерных форм р-галактозидаз и рассчитать константы равновесия диссоциации (см.табл.2).

Таблица 2. Параметры равновесных процессов ассоциации-диссоциации в растворах Р-галактозидаз (рассчитаны на мономер массой 116, 100 и 41 кДа для фермента

Источник фермента Escherichia coli Kluyveromyces fragilis Печень

Равновесие в растворе Е, о 2Е, Е <= => 2Е <= => 4Е 4 2 Г Е о2Е 2 1

Удельная активность олигомеров а„, молекул оНФГ/с-ац [Mg2+]=0 [Mg^HO^M а, = 0 а2 = 45.4 а4= 0 а, =0.080 а2 "0.012

а2=400 а4= 180 аг =800 а, = 300

Кдас, М 1.0- КГ® 1.3-10"9 К, = 8.3-10"8 Кг = 2.7-10"9 7-Ю"6

Приведенные результаты показывают, что у всех исследованных нами ß-галактозидаз активны димеры, причем активность димеров фермента из Kluyveromyces fragilis на порядок ниже активности димеров ß-галактозидазы бактериального происхождения и более чем на три порядка превышает активность димеров фермента, выделенного из печени быка.

Поскольку диссоциация активного олигомера на неактивные протомеры -первый шаг на пути потери ферментом каталитической активности, на основании проведенного исследования, высказано предположение, что ß-галактозидаза из Kluyveromyces fragilis будет наименее стабильной из исследованных нами ß-галактозидаз.

Следует отметить активацию димеров и тетрамеров ß-галактозидазы из Escherichia coli в присутствии катионов магния, которые принимают участие в формировании активного центра фермента. Аналогичное влияние катионы магния оказывают на активность ß-галактозидазы из Kluyveromyces lactis, активными формами которой также являются димеры и тетрамеры. По результатам проведенного нами компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей ß-галактозидазы из Escherichia coli и Kluyveromyces lactis в обеих последова!ельностях идентичны все аминокислотные остатки, входящие в лигандное окружение катионов магния в молекуле фермента из Escherichia coli. Таким образом, влияние магния на активность двух ферментов и полученные результаты сравнения аминокислотных последовательностей с привлечением литературных данных по третичной структуре ß-галактозидазы из Escherichia coli позволяют сделать предположение о наличии катионов магния в активном центре фермента из Kluyveromyces lactis.

На активность ферментов из печени быка и грибов Pénicillium canescens присутствие катионов магния влияния не оказывает.

Термоинактивация - процесс потери ферментом каталитической активности под воздействием температуры. В зависимости от температуры и индивидуальных свойств фермента осуществляются различные механизмы инактивации ферментов с четвертичной структурой. Например, в интервале температур 25-42°С (см.рис.5) термоинакгивация р-галактозидазы из К/иууеготусеэ fragilis происходит по следующим кинегаческим механизмам: инактивация по схеме последовательных

I, мин

Рис.5. Кинетические кривые термоинактивации Р-галактозидазы из К1иучеготусе5 fragilis в интервале температур 25-42X! и их спрямление в координатах уравнения первого порядка.

Термоинактивация ß-галактозидазразличного происхождения

t, мин

О 50 100 150 200 250 300

превращений первого порядка (25, 30°С); диссоциативная инактивация (35°С) и необратимая инактивация первого порядка (40 и 42°С).

Наименее информативна необратимая инактивация первого порядка Эффективные кинетические константы, определяемые в этом случае из экспериментальных данных, характеризуют только период полураспада активного белка. Они не позволяют получить более детальную информацию о механизме процесса.

Инактивация по схеме последовательных превращений

В случае реализации данного механизма на кинетических кривых термоинактивации появляется индукционный период (т), в течение которого в контактном участке олигомера происходят скрытые структурные изменения, при этом возникает каталитически активный, но менее стабильный (способный к обратимой диссоциации) олигомер. Если активной формой фермента являются димеры, а субъединицы неактивны, кинетическая схема приобретает вид:

(") к к к ^

Е <= »=>... с:,2 => Е с= ,1 =>2Е-(6)

2 -„ -г 2 1 д

Активные формы Неактивные формы

Кинетический анализ кривых с индукционным периодом позволяет оценить минимальное число стадий, не сопровождающихся потерей ферментом каталитической активности при многоступенчатом разрушении конформационного замка (рис.6). В нашем исследовании кинетические кривые с индукционным периодом получены для всех ферментов. Для дрожжевого фермента из Kluyveromyces fragilis индукционный период проявляется при температурах ниже 40° (рис.5) для бактериального фермента из Escherichia coli - ниже 45°, для фермента из печени быка - ниже 50°, а в случае грибной ß-галактозидаза из Pénicillium canescens - ниже 55°С (рис.7). Минимальное число промежуточных стадий процесса (п), не

60 80 100120140160 t. мин

80 120 t, МИН

Рис.6. Определение минимального Рис.7. Кинетические числа стадий (п), предшествующих индукционным периодом, инактивации Р-галактцзидазы из при термоинактшации

Escherichia coli при

O.B + g " ~ 0.13-0.05<?

кривые с полученные ß-галакто-

зидазы га различных источников.

сопровождающихся потерей ферментом каталитической активности, рассчитанное в исследованных нами условиях для всех ферментов равно двум.

Таким образом, стадии потери ферментом каталитической активности предшествует не менее двух промежуточных стадий, когда активность фермента не уменьшается. Этими стадиями могут быть конформационные изменения в олигомере, либо его диссоциация на активные субъединицы. Число промежуточных стадий, не сопровождающихся потерей активности, может быть важным параметром для оценки стабильности фермента: чем больше величина п, тем стабильнее фермент при хранении. Параметром стабильности фермента может служить также максимальная температура, при которой на кинетических кривых термоинактивации исчезает индукционный период.

Диссоциативная термоинактивация Р-гапактозидаз При диссоциативной инактивации олигомерных ферментов кинетически необратимым изменениям продуктов предшествует обратимая диссоциация олигомера. Простейшая схема диссоциативной термоинактивации димерного фермента, применимая в условиях нашего эксперимента имеет вид:

К к

Е2<——<3—>2ЕД (7)

Здесь Е| - мономер, способный обратимо образовать каталитически активный димер, Ед - денатурированный мономер, не способный образовать комплекс Е2 при данных условиях кинетического эксперимента. кД^Кд« - константа диссоциации фермента; кд - константа скорости денатурации.

Диссоциативную термоинакгивацию можно наблюдать в узком температурном интервале и при определенных концентрациях белка, соизмеримых с Кд„с при данной температуре. При реализации данной схемы на кинетических кривых, построенных в координатах уравнения первого порядка, появляется «точка излома» (рис.8). Критериями диссоциативного механизма является: зависимость положения «точки излома» от исходной концентрации фермента и обратимость процесса при малых степенях инактивации.

Определение параметров «точки излома» позволяет приближенно оценить кинетические параметры схемы (7). Для определения костанты скорости диссоциации к| и константы равновесия диссоциации Кд„с использовали следующие соотношения:

о

Л-к» 2 1

[Б] к _4{£]о(уо~уг)

дис [е ] к

2 -1

v v О Т

(8)

[Е ,] = -

кат

Здесь [£]„ - начальная концентрация димерного белка, v, у0 и v, -значения скорости соответственно при Кт, И) и И («точка излома» на кинетической кривой). По наклону кинетической кривой в полулогарифмических координатах при 1>т

определяли эффективную константу скорости денатурации В. Истинную константу скорости денатурации вычисляли, используя соотношение:

k -B(v°+v

" 2(vo~vr)

(9)

I nV/V0°

In V

• 40°

о 42°

▲ 45°

■ 48°

т 50°

Рис.8. Кинетические кривые термоинактивации ß-галактозидазы из E.coli в интервале температур 40-50"С в полулогарифмических координатах

На рис.8 приведены кинетические кривые термоинактивации фермента из Escherichia coli в интервале температур 40 -50°С. Зависимости, соответствующие диссоциативному механизму, получены при температурах 45, 48 и 50°С. Для фермента из Kluyveromyces fragilis кривая с изломом получена только при температуре 35°С (см.рис.5). На кинетических кривых

термоинактивации р-галакто-зидазы из Pénicillium canescens в координатах уравнения первого порядка излом отсутствует, что может быть связано с большой

разницей в значениях концентрации фермента в растворе и константы диссоциации димера на мономеры. Точки излома исчезают, когда [Ео]»КдиС и [Ео]«КдиС. Полученные значения кинетических параметров диссоциативной

термоинактивации (3-галактозидаз приведены в таблице.

Таблица 3. Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации fi-галактозидаз

Фермент т, °C Кдисс» мкМ ki*io4, с'1 клен*10\ с'

Kluyveromyces fragilis 35 1.9 1.6 1.3

Escherichia coli 45 48 0.2 0.9 6.8 14.2 0.9 1.3

50 3.6 24.0 5.2

Некоторые особенности термоинактивации 0-галактоэидазы из печени быка

При 45°С на кинетической кривой термоинактивации мономерной р-галакгозидазы из печени быка был обнаружен индукционный период, продолжительность которого в условиях нашего эксперимента составила I час, затем происходила инактивация фермента (рис.9). После длительного хранения ферментного препарата индукционный период исчезает, а на кинетической кривой, построенной в полулогарифмических координатах, появляется «точка излома», координаты которой не зависят от начальной концентрации белка. Поэтому в данном случае схема диссоциативной термоинактивации не применима. Причиной появления «излома» может быть присутствие (или возникновение в процессе эксперимента) в препарате фермента, по крайней мере, двух мономерных форм,

мин отличающихся стабильностью.

100 150 200 250 300 Это - активная форма Ei с

эффективной константной

скорости инактивации к|=1.4* 10"V и более стабильная активная форма En с эффективной константной скорости инактивации kir=2.5*10'V'. Полученные экспериментальные данные указывают на скрытые конформационные изменения в активном мономере под влиянием температуры -конформационные переходы типа Ег<-»Еп. Кинетический анализ конформационных

изменений в мономерном ферменте показал, что мономеры Р-галактозидазы из печени быка конформационно подвижны как в виде свободного фермента (Б), так и в виде фермент - субстратного комплекса (ES). Этот факт может играть существенную роль в процессе термоинакгивации фермента, если конформеры при этом отличаются стабильностью.

■ исходный фермент а фермент после длительного хранения

Рис.9. Кинетические кривые термо~ инактивации Р-галактозиоазы из печени быка при 45"С в координатах уравнения первого порядка.

250

Влияние различных факторов на термоинактивацию ft-галактозидаз и параметры стабильности ферментов

Нестабильность ферментов - один из факторов, ограничивающих их практическое использование. В работе изучено влияние некоторых факторов на закономерностй потери каталитической активности ферментов.

Индивидуальные свойства ферментов

Активность и стабильность ферментов и катализаторов на их основе во многом определяются свойствами организмов, из которых эти ферменты выделены. На рис.10 приведены кинетические кривые термоинакгивации р-галакгозидаз при температуре 40°С. Эта температура считается оптимальной при проведении ферментативного гидролиза лактозы. Самый стабильный фермент - р-

галакгозидаза из грибов Pénicillium Рис.10. Кинетические кривые термо-

canescens не теряет своей активности инактивации р-галактозидазы из

„ „ различных источников при

по крайней мере в течение 10 часов. Т-40°С

А печень быка,

P.canescens

V E.coli

о K.fragihs

■ K-lactis

ß-Галактозидаза из печени быка при 40°С также стабильна: фермент сохраняет постоянную активность в течение пяти часов. Бактериальная ß-галактозидаза из Escherichia coli сохраняет постоянную активность в течение полутора часов, затем фермент инактивируется. Дрожжевые ß-галактозидазы менее стабильны. Следует отметить, что при 40°С реализуются три кинетических механизма термоинактивации. Процесс потери каталитической активности дрожжевым ферментом Kluyveromyces fragilis - необратимая инактивация первого порядка (кЭфф=3.710"4с"1). Инактивация бактериального фермента из Escherichia coli происходит по схеме последовательных превращений первого порядка (п=2, кЭфф=3.610"5с'1). Дрожжевой фермент Kluyveromyces lactis теряет активность по механизму диссоциативного распада О^эФФ^-^'Ю"4^ к2эфф=2.510'4с'1). Длительность индукционного периода при заданной температуре можно использовать в качестве критерия стабильности фермента: чем больше эта величина, тем большей стабильностью обладает фермент при разных температурах.

Влияние катионов магния на стабильность ßvaiuuaimudam из Escherichia coli Присутствие катионов магния в реакционной смеси активирует ß-галактозидазу из Escherichia coli, причем активность как димерных, так и тетрамерных форм фермента в присутствии 0.01М Mg2+ возрастает приблизительно

вдвое (см.табл.2).

t, мин

[mal* =0

• [Е^Зб.5 мг/мл

т [Е]0=7.3 мг/мл

[Mgf =10"гМ

о [Е]о=36.5 мг/мл

V [Е]0=7 3 мг/мл

. Влияние катионов магния на термоинактивацию ß-галактозидазы из E.coli при Т=45°С.

ции (кО может быть обусловлено стабилизирующим действием, которое оказывают катионы магния на конформацию полипептидной цепи в области межбелкового контакта в димере галактозидазы из Е.соИ и смещением равновесия димер <-> мономер в сторону образования

Проведенное исследование показало, что присутствие катионов магния оказывает также стабилизирующее действие на р-галакго-зидазу из Е сой.

Соответствующие экспериментальные данные приведены на рис.11 и в таблице 4. Уменьшение эффективной константы скорости диссоциа-

Таблица 4 Эффективные константы скорости инактивации ß-галактозидазы из Escherichia coli в присутствии катионов магнияи в их отсутствие

[Е]0, мг/л ГМк2Чо, М Т,°С k|*10,с' к2*104, с'1

7.3 0 45 4.8 0.2Ö

7.3 0 48 9.8 1.ÖÖ

7.3 0.01 45 0.6 0.15

7.3 0.01 48 3.2 0.20

36.5 0 45 4.8 0.6Ö

36.5 0 48 9.8 1.60

36.5 0.01 45 0.6 0.15

36.5 0.01 48 3.2 0.2Ö

активных и более стабильных димеров.

При более низкой температуре (45°) присутствие катионов магния в растворе оказывает большее влияние на стадию диссоциации: к)эфф в присутствии 0.01 М уменьшается в 8 раз а к2эфф не более чем в 4 раза. При температуре 48° эффективная константа скорости денатурации (к2) в зависимости от концентрации фермента в присутствии катионов магния уменьшается в 5-8 раз, а эффективная константа скорости диссоциации - в 3 раза. Таким образом присутствие катионов магния стабилизирует фермент как на стадии диссоциации, так и на стадии денатурации.

Влияние температуры на

стабильность ß-гапактозидаз

Стабильность ß-галактозидаз, так же как и других ферментов, сильно зависит от температуры: чем выше температура, тем быстрее фермент теряет свою активность. Однако для каждого олигомерного фермента существует свой собственный довольно узкий интервал температур, в котором стабильный и активный фермент начинает довольно быстро терять активность. Приведенная на рис.12 зависимость эффективных констант скоростей инактивации ß-галактозидазы из Escherichia coli от температуры в координатах уравнения

1Л"*103

3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7

Рис.12. Зависимость эффективной константы скорости инактивации ß-галактозидазы из Е coli от температуры в координатах уравнения Аррениуса.

Таблица 5 Энергии активации инактиващи и параметры стабильности ß-галактозидаз

Аррениуса свидетельствует о существовании двух областей температур, различающихся величиной энергии активации. Аналогичные зависимости получены и для других исследованных в данной работе ß-галактозидаз (за исключением мономерного фермента из печени быка). Значения энергии активации процесса инактивации ферментов, определенные

для высоко- и низкотемпературной областей, значительно различаются, (см.табл.5). Энергия активации в низкотемпературной области (Ei = 75-85 кДж/моль)

Источник Фермента Ei, кДж/моль Ei, кДж/моль т 1 крз "С т * 1инд > час (Т=40°С) i ИНД ) "С

Грибы Pénicillium Canescens 85 340 66 >10 57

Печень быка - 390 - 6 50

Бактерии Escherichia coli 80 370 40 1.5 45

Дрожжи Kluyvermyces fragilis 75 280 28 нет 40

*}тдукцианньш период на кинетшеской кривой термаинактивсщии; температура исчезновения индукционного периода

характеризует процесс диссоциации олигомерной структуры фермента, а в высокотемпературной области (Е2= 280-390 кДж/моль) - стадию денатурации. Столь высокие значения энергии активации характерны для кооперативного процесса денатурации глобулярных белков.

Из температурных зависимостей эффективных констант скорости инактивации можно определить «критическую» температуру смены кинетического режима (Ткр). Это - абсцисса точки пересечения двух прямых с разными угловыми коэффициентами (рис.12). В области температур, меньших Ткр инактивация определяется в основном диссоциацией активных форм фермента на неактивные. При температурах, превышающих Ткр, определяющей для потери ферментом каталитической активности становится стадия денатурации.

Параметры стабильности олигомерных ферментов

Проведенное в данной работе исследование термоинактивации р-галактозидаз позволило определить следующие параметры, характеризующие стабильность ферментов:

1. «Критические» температуры смены кинетического режима инактивации. Чем выше эта температура, тем стабильнее фермент.

2. Минимальное число промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей ферментом каталитической активности.

3. Температуры исчезновения индукционного периода на кинетических кривых термоинактивации. Фермент тем стабильнее, чем выше эта температура.

4. Продолжительность индукционного периода при заданной температуре. Более длительные индукционные периоды, в течение которых происходят скрытые изменения в молекуле фермента, указывают на более высокую стабильность.

По совокупности значений этих параметров исследованные нами ферменты можно расположить в следующий ряд в порядке уменьшения их стабильности: фермент грибного происхождения из Pénicillium canescens —» фермент из печени быка —> бактериальная ß-галактозидаза из Escherichia coli —> ß-галактозидаза из Kluyveromyces fragilis. Наибольшей стабильностью обладает ß-галактозидаза из грибов Pénicillium canescens. Сочетанием высокой стабильности и достаточно высокой активности (см.табл.1) обусловлен выбор данной ß-галактозидазы для получения адсорбционных слоев фермента на поверхности силикагеля.

Адсорбционные слои ß-галактозидазы на силикагеле и их стабилизация полисахаридами

Кинетика адсорбции ß-галактозидазы на силикагеле

Простейшая схема иммобилизации фермента, когда образованию прочных адсорбционных или химических связей предшествует обратимая стадия неспецифической адсорбции белковой молекулы, выглядит следующим образом"

к к2

Е + П о ЕО ->2 ЕП (1) к сл пр

-I

В схеме (1) Е - фермент в растворе, £2 - контактная площадка носителя, ЕЙ и Е£2 -

et пр

слабо и прочно связанные ферменты на носителе. Кинетика обратимой стадии описывается уравнением:

— = кЬ(\-в)-к в или — = *Е -[к +кЕ +кЕ а)в + кЕ ав (2)

dt I ' -I ¿1 I О V -1 I о I О > 10 v

Здесь в = степень заполнения носителя ферментом; Ем и Е „„

соответственно количество фермента в адсорбционном слое и при монослойном заполнении; Е и Е0 соответственно текущая и начальная концентрации фермента; о =EBeflSoV> где V - объем раствора.

В результате обработки экспериментальных данных по исследованию кинетических зависимостей сорбции р-галактозидазы из Pénicillium canescens на поверхности силикагеля (в отсутствие полисахаридов) в соответствии с разработанной ранее теорией (Полторак О.М., Пряхин А.Н., 1982) было установлено, что процесс адсорбции осложняется процессами ассоциации адсорбата путем присоединения молекул белка из объема раствора согласно кинетической схеме:

, Таблица 6. Кинетические параметры начальных

| к стадий адсорбции р-галактозидазы

Е + £2 fc => Е£г ——Е—>Ъ%1

(П),

К

Еч-П + ЕР <=, =>Efi,

™ 2 7

Рассчитанные значения кинетических параметров начальной стадии адсорбции Р-галакюзидазы на силикагеле представлены в таблице 6.

Адсорбция и каталитические свойства Р-галактозидазы Pénicillium canescens, иммобилизованной на силикагеле Адсорбцию Р-галактозвдазы проводили из ее растворов в фосфат-цитратном буфере (рН 4.2) при температуре 4°С. Варьировали концентрацию ферменга в растворе и навеску силикагеля (Sy4 23 и 40 м2/г). Предельные величины адсорбции фермента составили 0.4 мг/м2. Для стабилизации адсорбционных слоев фермента на поверхности силикагеля адсорбцию проводили из совместных растворов фермента и полисахаридов крахмала или гепарина. Иммобилизация р-галакгозидазы на поверхности силикшеля в отсутствие полисахаридов приводила к значительной инактивации фермента. Наблюдаемый эффект может быть обусловлен экранированием активного центра при деформации третичной

[EJolO6, M кь М-'с1 k.i-104, с' k2, М-'с1 К-адс'Ю"0, М-1

0.17-1.33 32 0.17 5.5 1.9

Таблица 7. Каталитические свойства р-галактозидазы

Км, мМ амакс» 1 я % МКМОЛЬ/МИН'М! |

Феомент в оаствоое 1.0 16.7 100

силикагеле:

1.2 2.2 13

в присутствии крахмала

4.8 12.4 74

в присутствии гепарина

фермент гепарин — 1'2 4.8 11.8 71

фермент, гепарин - 1 20

5.1 3.5 21

фермент, гепарин =21 5.0 8.6 51

структуры под действием носителя либо изменением четвертичной структуры белка в результате «неспецифических» межбелковых взаимодействий с образованием малоактивных ассоциатов на поверхности носителя согласно схеме (11). Величина активности иммобилизованной |3-галактозидазы составила всего 13% от активности фермента в растворе (табл.7). Получение совместных адсорбционных слоев |3-галактозидазы и полисахаридов крахмала или гепарина в мольном отношении ферментггепарин = 1:2 позволило увеличить этот показатель в пять с половиной раз и сохранить более 70% исходной каталитической активности. Увеличение константы Михаэлиса для совместных адсорбционных слоев фермент-полисахарид может быть обусловлено возникновением диффузионных затруднений.

Термостабильность адсорбционных слоев /3-галактозидазы Проведенное исследование показало, что стабильность фермента, иммобилизованного на поверхности силикагеля несколько выше, чем для фермента в растворе (рис.13). Присутствие полисахаридов в адсорбционных слоях приводит к

А в растворе

• E/S¡02

▼ (E+KpaxMar)/Si02 (E+renapnH)/Si02

Ж 1:20

О 2.1

■ 1.2

0 30 60 90 120 150 180 t, мин

40 80 t, мин

120 160

Рис.13. Кинетические кривые термоинактивацииразличных образцов р-галактозиоазы Pénicillium canescens.

существенному увеличению термостабильности адсорбированной Р-галактозидазы. Согласно полученным результатам (см.табл.8) стабилизирующее действие

Таблица 8 Кинетические параметры процесса термоинактивации Р-галактозидазы

Образец Т,°С k*M.*104, с"1 П т, мин F кДж/моль

Фермент в растворе 50 53 55 57 1.5 2.2 3.8 6.6 2 15-20 340

Адсорбционные слои на силикагеле 53 57 58 1.8 8.2 11.6 2-3 50-30 350

Совместные адсорбционные слои фермента и полисахаридов крахмала 53 57 58 0.8 3.8 5.4 5 75-80 340

Совместные адсорбционные слои фермента и гепарина при мольном отношении фермент:гепарин=1:2 53 57 59 61 0.3 2.8 7.9 16.0 5 5 300 50 350

фермент: гепарин=1:20 57 4.2 5 -

фермент:гепарин=2:1 57 3.9 5 -

полисахаридов приводит к увеличению индукционного периода (т), к увеличению числа промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей каталитической активности (n), а также к уменьшению эффективной константы скорости инактивации. Из всех исследованных образцов наилучшими параметрами активности и стабильности обладал катализатор, полученный совместной адсорбцией фермента и гепарина при мольном отношении фермент:гепарин = 1:2. Присутствие полисахаридов позволяет не только сохранить более 70% активности нативного фермента, но и значительно увеличивает термостабильность иммобилизованной ß-галакгозидазы.

ВЫВОДЫ

Проанализированы общие закономерности механизма каталитического действия р-галакшзидаз; рассмотрены механизмы их термоинактивации и влияние различных факторов на активность и стабильность ß-галактозидаз из различных источников (бактерии Escherihia coli, грибы Pénicillium canescens, дрожжи Kluyveromyces fragilis, печень быка).

1. Предложен кислотно-основной механизм гидролиза гликозидной связи и выделены цепи перераспределения связей (ЦПС) на стадии возникновения и распада промежуточного соединения (галактозил-фермента) и образования конечного продукта реакции с использованием данных РСА о пространственном строении активного центра ß-галактозидазы из Е coli

2. Сравнение аминокислотных последовательностей пяти ß-галактозидаз из различных источников показало, что характерные для активного центра фермента из Escherichia coli фрагменты аминокислотной последовательности сохраняются в первичных структурах четырех других ß-галактозидаз

3. Показано, что в растворах ß-галактозидаз происходят обратимые процессы ассоциации-диссоциации олигомерных молекул. Впервые определены активности различных олигомерных ассоциатов и рассчитаны соответствующие константы равновесия диссоциации.

4. Установлено, что термоинактивация ß-галактозидаз в растворе в зависимости от природы фермента и условий эксперимента происходит по различным кинетическим механизмам. Рассчитаны соответствующие кинетические параметры и определено число промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей каталитической активности. Определены энергии активации на стадиях диссоциации и денатурации фермента.

5. Для ß-галактозидаз впервые определены параметры, характеризующие стабильность ферментов: температуры исчезновения индукционного периода на кинетических кривых термоинакгивации, число промежуточных стадий процесса без потери активности, длительность индукционного периода при заданной температуре, условия смены кинетического режима инактивации.

6. Получены активные и стабильные катализаторы, представляющие собой совместные адсорбционные слои ß-галактозидазы из грибов Pénicillium canescens и полисахаридов (амилоза или гепарин) на поверхности силикагеля. Показано, что присутствие полисахаридов активирует и стабилизирует фермент.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ

1 Атякшева Л.Ф., Пилипенко О.С., Полторак О.М. Механизм термоинактивации ß-галактозидазы Escherihia coli //Вестник Московского Университета. Химия. 2000. Том 41. №6. С. 95-97.

2. Атякшева Л.Ф., Пилипенко О.С., Полторак О.М. Стабилизация адсорбционных слоев ß-галактозидазы гепарином //Журнал Физической Химии. 2001. Том 75. № 12. С. 2256-2259.

3. Атякшева Л.Ф., Полторак О.М., Чухрай Е.С., Пилипенко О.С. Адсорбционные и каталитические свойства ß-галактозидазы //Журнал Физической Химии. 2002. Том 76. №7. С. 1314-1317.

4. Чухрай Е.С., Атякшева Л.Ф., Полторак О.М., Пилипенко О.С. Кинетика адсорбции ß-галакгозидазы на силикагеле // Журнал Физической Химии. 2002. Том 76. № 12. С. 2251-2254.

5. Чухрай Е.С., Полторак О.М., Атякшева Л.Ф., Пилипенко О.С. Анализ конформационных изменений в мономере ß-галактозидазы из печени быка при термоинактивации фермента //Журнал Физической Химии. 2005. гом 79. № 4. С. 759-762.

6. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Атякшева Л.Ф., Пилипенко О.С. Кинетика и механизм реакции гидролиза гликозидной связи в активном центре ß-галактозидазы из Escherichia coli //Журнал Физической Химии. 2005. Том 79. № 5 С. 808-813.

7. Атякшева Л.Ф., Пилипенко О.С., Полторак О.М. Механизм термоинактивации ß-галактозидазы Escherihia coli Материалы IV международной конференции «Biocatalysis-2000: Fundamentals & Applications». С. 142. Москва. 10-15 июня. 2000 г.

8. Атякшева Л.Ф., Пилипенко О.С., Полторак О.М. Стабилизация адсорбционных слоев ß-галактозидазы полисахаридами. Тезисы докладов на II Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы». С. 76. Москва. 30 июня. 2000 г.

9. Пилипенко О.С. Механизм термоинактивации ß-галактозидазы Escherihia coli Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2001». Секция Химия. Том 1. С. 154. Москва. 10-13 апреля. 2001 г. Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова.

10. Берегалов А.Е., Пилипенко О.С. Влияние нуклеофильных агентов на активность ß-галактозидазы. Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». Секция Химия. Том 2. С. 8. Москва. 12-15 апреля. 2005 г. Московский Государственный Универсигет им. М.В. Ломоносова.

Подписано к печати 17 03 06 Тираж 100 экз. Заказ № 36

ООП МГУ

У

¿OCXS А S700

18- 5700

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Источники, структура и механизм действия Р-галактозидаз.

1.1. Классификация р-галактозидаз.

1.2. Р-Галактозидазы растений.

1.3. Р-Галактозидазы млекопитающих и человека.

1.4. Р-Галактозидазы микроорганизмов.

1.4.1. Бактериальные Р-галактозидазы.

1.4.2. Грибные и дрожжевые Р-галактозидазы.

1.4.3. Третичная структура р-галактозидаз.

1.5. Механизм каталитического действия Р-галактозидаз.

1.5.1. Каталитическая активность Р-галактозидаз.

1.5.2. Механизм каталитического действия Р-галактозидаз.

1.5.3. Активаторы и ингибиторы Р-галактозидаз.

Глава II. Биокатализаторы на основе Р-галактозидазы.

2.1. Практическое использование р-галактозидаз.

2.2. Адсорбция и другие физические методы иммобилизации

Р-галактозидаз.

2.3. Химические методы иммобилизаци р-галактозидаз ковалентное связывание).

2.4. Свойства и применение иммобилизованных р-галактозидаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава III. Объекты и методы исследования.

3.1. Характеристика ферментов и использованпых химических реактивов.

3.1.1. Ферменты.

3.1.2. Химические реактивы.

3.1.3. Буферные растворы.

3.2. Определение ферментативной активности р-галактозидазы.

3.3. Методика изучения термоинактивации фермента.

3.3.1. Термоинактивация ß-галактозидазы в растворе.

3.3.2. Термоинактивация ß-галактозидазы в адсорбционных слоях.

3.4. Адсорбционная иммобилизация ß-галактозидазы.

3.4.1. Адсорбционная иммобилизация ß-галактозидазы на силикагеле.

3.4.2. Получение совместных адсорбционных слоев фермента и полисахаридов.

3.5. Количественное определение белка методом Брэдфорда.

3.6. Оценка погрешностей в определении экспериментальных величин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава IV. Механизм реакции гидролиза гликозидной связи субстрата в активном центре ß-галактозидазы из Escherichia coli в рамках теории цепей перераспределения связей.

4.1. Механизм реакции.

4.2. Влияние метанола на гидролиз орто- и пара-нитрофенил-ß-галактопиранозидов ß-галактозидазой из Escherichia coli.

4.3. Структурный анализ аминокислотных последовательностей

-галактозидаз из различных источников.

Глава V. Термоинактивация ß-галактозидаз из различных источников.,.

5.1. Ассоциативно-диссоциативные процессы в растворах

-галактозидаз.

5.1.1. Диссоциация и удельная активность олигомеров ß-галактозидаз.

5.1.2. ß-Галактозидаза животного происхождения из печени быка.

5.1.3. ß-Галактозидаза бактериального происхождения из Escherichia coli.

5.1.4. ß-Галактозидаза дрожжевого происхождения из

Kluyveromyces fragilis.

5.1.5. Удельные активности олигомерных форм ß-галактозидаз.

5.2. Термоинактавация ß-галактозидаз различного происхождения.

5.2.1. Кинетические механизмы термоинактивации.

5.2.2 Диссоциативная термоинактивация ß-галактозидаз.

5.2.3. Индукционный период на кривых термоинактивации

-галактозидаз.

5.3. Влияние различных факторов на стабильность ß-галактозидаз.

5.3.1. Активность и стабильность ß-галактозидаз.

5.3.2. Влияние температуры на стабильность ß-галактозидаз.

5.3.3. Влияние катионов магния на стабильность ß-галактозидазы из Escherichia coli.

5.4. Термоинактивация и параметры стабильности олигомерных ферментов.

5.5. Некоторые особенности термоипактивации ß-галактозидазы животного происхождения из печени быка.

Глава VI. Адсорбционные слои ß-галактозидазы из Pénicillium canescens на силикагеле и их стабилизация полисахаридами.

6.1. Адсорбционная иммобилизация ß-галактозидазы.

6.1.1. Адсорбция ß-галактозидазы Pénicillium canescens на силикагеле.

6.1.2. Каталитические свойства адсорбционных слоев ß-галактозидазы.

6.1.3. Кинетика адсорбции ß-галактозидазы на силикагеле.

6.2. Совместные адсорбционные слои ß-галактозидазы и полисахаридов на поверхности силикагеля.

6.2.1 Каталитические свойства совместных адсорбционных слоев

-галактозидазы и полисахаридов.

6.2.2. Термостабильность адсорбционных слоев ß-галактозидазы.

ВЫВОДЫ.

З-Галактозидаза - фермент, участвующий в углеводном обмене растений, микроорганизмов, животных и человека. Одна из функций р-галактозидазы в организме млекопитающих - гидролиз молочного сахара (лактозы) на два легко усваиваемых моносахарида (глюкозу и галактозу). Поскольку значительная часть населения Земли из-за недостатка р-галактозидазы не способна усваивать молочные продукты, этот фермент широко используется при производстве молочных продуктов с пониженным содержанием лактозы для детского и диетического питания. Ферментные препараты, содержащие (3-галактозидазу, используются в качестве пищевой добавки для людей с лактазной недостаточностью, они применяются для получения глюкозо-галактозного сиропа, который используется в качестве заменителя сахара в хлебопечении и кондитерской промышленности.

Р-Галактозидаза помимо гидролазной проявляет также трансферазную активность и катализирует реакции трансгалактозилирования с образованием олигосахаридов различного состава. В последние годы активно обсуждается перспектива промышленного применения р-галактозидазы для производства лактулозы и других бифидогенных олигосахаридов, входящих в состав лечебно-профилактических продуктов питания.

Р-Галактозидазы находят применение в медицине при лечении и диагностике некоторых заболеваний, при решении экологических проблем, связанных с загрязнением окружающей среды отходами молочной промышленности, они могут быть использованы в лабораторном органическом синтезе.

В настоящее время из различных источников выделены сотни отличающихся строением и свойствами Р-галактозидаз, достаточно хорошо изучена лишь незначительная часть этих ферментов. В связи с перспективами широкого промышленного использования Р-галактозидаз актуальна проблема получения высокоактивных и стабильных катализаторов на основе иммобилизованных Р-галактозидаз. Получение таких катализаторов невозможно без систематического сравнительного исследования активности и стабильности р-галактозидаз из различных источников.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

Проанализированы общие закономерности механизма каталитического действия ß-галактозидаз; рассмотрены механизмы их термоинактивации и влияние различных факторов на активность и стабильность ß-галактозидаз из различных источников (бактерии Escherihia coli, грибы Pénicillium canescens, дрожжи Kluyveromyces fragilis, печень быка).

1. Предложен кислотно-основной механизм гидролиза гликозидной связи и выделены цепи перераспределения связей (ЦПС) па стадии возникновения и распада промежуточного соединения (галактозил-фермента) и образования конечного продукта реакции с использованием данных PC А о пространственном строении активного центра ß-галактозидазы из E.coli.

2. Сравнение аминокислотных последовательностей пяти ß-галакгозидаз из различных источников показало, что характерные для активного центра фермента из Escherichia coli фрагменты аминокислотной последовательности сохраняются в первичных структурах четырех других ß-галактозидаз.

3. Показано, что в растворах ß-галактозидаз происходят обратимые процессы ассоциации-диссоциации олигомерпых молекул. Впервые определены активности различных олигомерпых ассоциатов и рассчитаны соответствующие константы равновесия диссоциации.

4. Установлено, что термоинактивация ß-галакгозидаз в растворе в зависимости от природы фермента и условий эксперимента происходит по различным кинетическим механизмам. Рассчитаны соответствующие кинетические параметры и определено число промежуточных стадий процесса, не сопровождающихся потерей каталитической активности. Определены энергии активации на стадиях диссоциации и денатурации фермента.

5. Для ß-галактозидаз впервые определены параметры, характеризующие стабильность ферментов: температуры исчезновения индукционного периода на кинетических кривых термоинактивации, число промежуточных стадий процесса без потери активности, длительность индукционного периода при заданной температуре, условия смены кинетического режима инакт ивации.

Получены активные и стабильные катализаторы, представляющие собой совместные адсорбционные слои |3-галактозидазы из грибов Pénicillium canescens и полисахаридов (амилоза или гепарин) на поверхности силикагеля. Показано, что присутствие полисахаридов активирует и стабилизирует фермент.

1. Henrissat B.11 Biochem.J. 1991. V.280. P. 309-316. /A classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequense similarities

2. Henrissat B., Bairoch A. //Biochcm. J. 1996 V.316. P.695-696 / Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases.

3. Triantafillidou D., Georgatsos J.G. //J. Protein Chemistry. 2001, v.20, n.7, p.551-662 / Barley beta-galactosidase: strustructure, function, heterogeneity and gene origin

4. Haider J., Bhaduri A. //J.Natr.Biochem. 1997. 8, 7. 378-384 /Glycosidases from tea-leaf (Camellia sinensis) and characterization of P-galactosidase

5. Lee D.H., Kang S.G., Byun J.K. //Mol.Cells,2003,15,1,68-74 /Purification and characterization of a P-galactosidase from peach (Primus persica)

6. Li S.-C., Han J.-W., Chen K.-C., Chen C.-S. //Phytochemistry 2001. V. 57. P. 349-359 /Purification and characterization of isofonns of P-galactosidases in mung beam seedlings

7. Leparou S., Padrines M., Placier G., Colas B. //Biochim. Et Biophys. Acta. 1997. V. 1336. N.3 P. 522-532 /Characterization of a strictly specific acid beta-galactosidase from Achatina achatina

8. Jimenez-Barbero J., Canada F.J., Fernandez P., Martin-Lomas M. //Carbohydrate Research, 1995, 271, 1, 31-42 /Substrate specificity of small-intestinal lactase: study of the steric effects. Hydrogen bonds involved in enzyme-substrate interaction

9. Kobayashi T„ Shinnoh N„ Goto I., Kuroiwa Y. //J.Biol.Chem.260 (1985) 14982-14987 /Hydrolysis of galactosylceramide is catalyzed by two genetically distinct acid beta-galactosidases

10. Alpers D.H. //. Biol. Chem. 244 (1969), 1238-1246 /Separation and isolation of rat and human intestinal beta-galactosidases

11. Asp N.G. //Biochem. J. 121 (1971). 299-308 /Human small-intestinal-galactosidases. Separation and characterization of three forms of an acid-galactosidase.

12. Norden A.G.W., O'Brien J.S. //Arch. Biochem. Biophys. 159 (1973) 383-392 /Ganglioside GMrbeta-gaIactosidase: studies in human liver and brain.

13. Ho M.W., Cheetham P. Robinson D. '/Biochem. J. 136 (1973), 351-359 /Hydrolysis of GMrganglioside by human liver beta-galactosidase isoenzymes.

14. Norden A.G.W., O'Brien J.S. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 56 (1974), 7969-7976 /Binding of human liver bcta-galactosidases to plant lectins insolubilized on agarose.

15. Cheetham P.S.J., Dance N.E. //Biochem. J. 157 (1976), 189-195 /The separation and characterization of the methylumbelliferyl bcta-galactosidase of human liver

16. Frost R.G., Holmes E.W., Norden A.G.W., O'Brien J.S. //Biochem. J., 1978, 175, 181-188 /Characterization of purified human liver acid beta-galactosidases A2 and A3

17. Lo J.-T., Mukerji K., Awasthi Y.C., llanada E., Suzuki K., Srivastaya S.K. //J. Biol. Chem. 254 (1979), 6710-6715 /Purification and properties of sphingolipid beta-galactosidase from human placenta

18. Li Y.-T., Li S.-C. //Adv. Carbohydr. Chem. Biochcm. 40 (1982), 235-286 /Biosynthesis and catabolism of glycosphingolipids

19. Holmes E.W., O'Brien J.S. //Biochemistry, 18 (1979), 6, 952-958 /Purifications and properties of acid beta-galactosidase from feline liver

20. Hiraivva M., Uda Y. //Jpn.J.Exp.Med.,1988,58,3,129-138 /GM1 ganglioside 0-Galactosidase from bovine liver

21. Gatt S. //Biochim. Biophys. Acta. 137 (1967), 192-195 /Enzymatic hydrolysis of sphingolipids. V.Hydrolysis of monosialoganglioside and hexosilceramides by rat brain beta-galactosidase.

22. Fraser N.L., Mahuran O., Freeman S.J., Callahan J.W. //Can. JvBiochem. Cell. Biol. 61 (1983), 313-322 /Improved purification of beta-galactosidase from rabbit brain: two separable fractions share kinetic and structural properties.

23. Hiraivva M., Uda Y. // J. Biochem. 100 (1986), 707-715 /Purification and properties of GM1 ganglioside beta-galactosidase from bovine brain

24. Yamamoto Y., Fujie M. Nishimura K.//.I.Biochem., 1982,92,1,13-21/The interrelation between high- and low-molccular-wcight forms of GM1 P-galactosidase purified from porcine spleen

25. Ostrovvska H., Krukowska K., Kalinowska J., Orlovvska M., Lengievvicz I. //Cell.Mol.Biol.Lett.,2003,8,1,19-24 /Lysosomal high molecular weight multienzyme complex

26. Verheijen F.W., Brossmer R. Galjaard II. //Biochcm. Biophys. Res. Commun., 1982, 108, 868-875 /Purification of acid beta-galactosidase and acid neuraminidase from bovine testis: evidence for an enzyme complex

27. Hiraiwa M., Nishizavva M., Uda Y., Nakajima T., Miyatake T. //Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 163, 1498-1504 /Molecular cloning of a full-length cDNA for human alpha-N-acetylgalactosaminidase (alpha-galactosidase b)

28. Van der Spoel A., Bonten E., D'Azzo A. //J.Biol.Chcm., 275, 14, 10035-10040 /Processing of lysosomal p-galactosidase. The C-terminal precursor fragment is an essential domain of the mature enzyme

29. Callahan J.W., D'agroza R.M., Hubbes M. Shankaran R., Novak A. //Trans. Am. Soc. Neurochem., 1990, 21, 127 /Characteristics of the beta-galactosidase-carboxypeptidase complex and free forms of beta-galactosidase.

30. Norden A.G.W., Tennant L.L., O'Brien J.S. //J. Biol. Chem., 1974, 249, p. 79697976 /GMiGanglioside P-galactosidase A. Purification and studies of the enzyme from human liver

31. Hiraiwa M., Saitoh M., Narutoshi A. Shiraishi T. Odani S., Uda Y., Ono T., O'Brien J.S. //Biochim. Biophys. Acta, 1997, 1341, 189-199 /Protective protein in the bovine lysosomal p-galactosidase complex

32. Taguchi S., Kouyama H., Yago N.//J.Biochem„ 1981, 89, 2, 483-492 /Reversible aggregation and stability of lysosomal P-galactosidase from porcine adrenal cortex

33. Skudlarek M.D., Tulsiani D.R., Orgebin-Crist M.C. //Biochem.J., 1992, 286 (Pt 3): 907-914 /Rat epidymal luminal fluid acid beta-D-galactosidase optimally hydrolyses glycoprotein substrate at neutral pi I

34. Lodish H.F. //J. Biol. Chem., 1988, 263, 2107-2110 /Transport of secretory and membrane glycoproteins from the rough endoplasmic reticulum to the Golgi. A rate-limiting step in protein maturation and secretion35