Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритиемв пептидах и белке бета-галактозидазе изThermoanaerobacter Ethanolicus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.14 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА Химический факультет

На правах рукописи

Дадаян Александр Карэнович

Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в пептидах и белке (3-галактозидазе из ТкегтоапаегоЬас(ег ЕйгапоИсш.

Специальности 02.00.14 - Радиохимия

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук Золотарев Ю.А.

ИМГ РАН

доктор химических наук Борисов Ю.А.

ИНЭОС РАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корреспондент РАН Кочетков С.Н.

ИМБ им В.А. Энгельгардта РАН.

доктор химических наук Фирсова Л.П.

МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится « 24 » сентября 2003 г. в _15_ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.42 при Московском государственном университете им М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра радиохимии, дом 1, строение 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 27 » июня 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Трошина Н.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изотопно-меченые белки, пептиды и аминокислоты являются необходимым инструментом для исследования многих биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности организмов. Меченные тритием соединения представляют особую ценность потому, что замена водорода тритием не приводит к заметному изменению биологических свойств, а водород присутствует практически во всех биологически активных соединениях. Реакции между твердым органическим веществом и активированным тритием интенсивно исследуются учеными многих стран. Для непосредственного введения трития используют, как правило, физические методы активации, такие как термическая активация на нагретой вольфрамовой спирали и микроволновая активация трития. При взаимодействии газообразного водорода с нанесенными катализаторами - металлами платиновой группы, происходит миграция водородных атомов, связанных с поверхностными атомами металла, на носитель. Этот эффект был назван спилловером водорода (СВ). Для синтеза меченных тритием соединений особенно эффективной является реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), основанная на взаимодействии органического соединения и СВ.

При ВТКИО в смеси, образованной твердым органическим соединением, нанесенным на неорганический носитель, и высокодисперсным металлом платиновой группы, под действием СВ с высокой скоростью происходит замещение водорода на тритий при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов. Ранее в Лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных веществ на примере аминокислот были проведены экспериментальные и теоретические исследования механизма реакции ВТКИО. Исследован одноцентровый синхронный механизм замещения при насыщенном углеродном атоме, характеризующийся образованием в переходном состоянии пента-координированного углерода и трехцентровой связи с участием приходящего и уходящего водородных атомов. Исследование взаимодействия твердого органического соединения со СВ при ВТКИО представляет как теоретический так и практический интерес. С помощью этого эффективного и универсального метода получены кратномеченные тритием физиологически активные соединения. В связи с этим, представляется актуальным выяснение основных закономерностей твердофазной реакции пептидов и белков с участием спилловер-трития и исследование влияния пространственной организации полипептидов на реакционную способность их фрагментов при ВТКИО. Квантово-химические расчеты, выполнены под руководством и при участии профессора дхн Ю.А. Борисова (ИНЭОС РАН).

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение реакции ВТКИО в пептидах и белках.

Основные задачи исследования:

- изучение влияния пространственной структуры полипептидов на региоселективность реакции ВТКИО

- исследование влияния условий проведения реакции ВТКИО в белках на сохранение биологической активности и величину молярной радиоактивности

- выяснение возможности применения реакции ВТКИО для получения информации по структурной организации белков

- разработка препаративного метода получения высокомеченных тритием препаратов белка с сохранением биологической активности.

Научная новизна.

Впервые исследовался механизм реакции ВТКИО в пептидах и белках. Показано влияние первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры полипептидов на реакционную способность их фрагментов. Определены оптимальные условия реакции ВТКИО, позволяющие получать высокомеченые белки с полным сохранением ферментативной активности.

Практическая ценность результатов работы.

В результате проведенной работы были получены высокомеченные тритием пептиды и белки, использованные в экспериментах по специфическому связыванию, распределению и биодеградации в тканях.

Показана перспективность использования ВТКИО для получения информации о пространственном взаимодействии полипептидов в белковых комплексах.

Исследовано влияние состава твердой фазы и параметров реакции ВТКИО на включение трития и сохранение ферментативных свойств белков. Разработаны условия реакции ВТКИО, позволившие получить высокомеченый белковый ингибитор ангеотензин-превращающего фермента (10 кДа) с молярной радиоактивностью 300 Ки/ммоль, полностью сохранивший свойства нативного белка.

Реакцией ВТКИО получен меченный тритием инсулин, который был использован для исследования возможности создания пероральной лекарственной формы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на седьмой Всероссийской конференции по металлоорганической химии (Москва, 1999), седьмом международном симпозиуме "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds"

(Дрезден, Германия, 2000), седьмом международном симпозиуме «Amino Acids and Proteins» (Вена, Австрия, август 2001г.), седьмой и восьмой международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001, 2002), в двух докладах на третьем съезде Биохимического общества (С-Петербург, 2002).

В -завершенном виде работа была доложена на заседании ученого совета Института молекулярной генетики РАН 28 апреля 2003 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в отечественной и зарубежной печати, тезисы 7 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 20 таблиц. Библиографический указатель содержит 195 источников литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе исследовалась реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) водорода со спилловер-тритием в пептидах и белках.

1. Исследование твердофазного изотопного обмена в пептидах

Реакцией ВТКИО при 180 °С в одинаковых условиях были получены меченные тритием эндогенный опиоидный пептид [Ьеи5]-энкефалин (LENK, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) и его синтетический аналог даларгин (DALG, Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg), являющийся лекарственным препаратом, используемым в гастроэнтерологии, с молярными радиоактивностями 120 и 138 Ки/ммоль, соответственно. Было показано, что эти меченые пептиды полностью сохраняют свою биологическую активность при проверке их связывания с опиоидными рецепторами мозга крысы. Распределение трития в [3H]DALG и [3H]LENK анализировали с помощью 3Н ЯМР (Таблица 1).

Как видно из приведенных данных, у исследуемых пептидов наблюдается значительное сходство в реакционной способности их фрагментов. В Tyrl остатках легче всего обмен происходит в орто-положении к ОН-группе ароматического кольца. Это положение характеризуется наибольшим сродством к протону (СЗН-140 ккал/моль, С2Н-132 ккал/моль) и для него облегчено взаимодействие с эдектрофильным кислотным каталитическим центром, возникающим при ВТКИО под действием СВ. И для других положений этой аминокислоты в исследованных энкефалинах наблюдается сходная реакционная

з

способность, за исключением СаН. Из данных таблицы 1 следует, что СаН Tyrl в DALG обменивается на тритий при ВТКИО почти на порядок больше, чем в LENK. Такая же повышенная реакционная способность СаН в DALG по сравнению с LENK наблюдается и в Phe4 и Leu5. Значительно различие в реакционной способности для Phe4 этих пептидов, при том, что доля трития, включенного при CßH и в ароматическую часть Phe4, для них близки. В остатке Phe4 пептида DALG в СаН включена самая большая часть метки, и наблюдается почти 70% замещение ]Н на 3Н. Степень замещения в том же положении у LENK составляет лишь около 6%. Так как все эти пептидные структуры сходны, то вероятная причина такого резкого изменения реакционной способности СаН может заключаться в наличии дополнительного заряда, имеющегося на гуанидиновой группировке Arg6 в DALG.

Таблица 1. Распределение изотопной метки (%) в [3Н]энкефалинах, полученных реакцией ВТКИО при температуре 180°С (DALG-138 Ки/ммоль; LENK-120 Ки/ммоль), по данным 3Н ЯМР 640 МГц (хим.сдвиг, ррт) в D,0 при рН 7.0 (Varían UNITY-600).

Амино- Доля трития, % Положение DALG LENK

кислотным DALG LENK метки в ppm доля ppm доля

остаток остатке Т,% Т, %

Tyrl 27.1 28.0 СаН 4.15 4.6 4.20 0,5

CßH2 3.09 1.3 3.08 1.8

С2,6Н2 7.17 1.5 7.20 2.5

С3.5Н2 6.87 19.7 6.91 23.1

Gly2 - 30.5 СаН2 3.85 30.5

G!y3 30.5 31.8 СаН2 3.80 30.5 3.78 31.8

Phe4 20.0 9.1 СаН 4.60 14.3 4.60 1.5

CßH2 3.08;2.95 2.0 3.12;2.96 2.9

С2,6Н2 7.29 1.0 7.29 1.3

СЗ,5Н2 7.40 2.0 7.40 2.4

С4Н 7.35 0.7 7.35 1.0

Leu5 6.3 0.6 СаН 4.30 6.3 4.19 0.6

Arg6 16.1 - СаН 4.29 14.8

CßH2 3.10 1.3

Остатки Gly3 в DALG и LENK проявляют высокую реакционную способность. При выбранных условиях ВТКИО степень замещения водорода на тритий в этих остатках составляла от 65 до 70%. Обнаружено, что интенсивность изотопного обмена в Gly2 у LENK приблизительно такая же, что и в Gly3. В связи с этим представляется интересным раскрыть причины отсутствия реакции изотопного обмена в D-Ala2 DALG. Изотопный обмен в свободной аминокислоте Ala происходит чаще всего в

метальной группе. Возможно, что в ходе процесса сорбции на неорганическом носителе метальная группа 0-А1а2 оказывается в реакции ВТКИО недоступной для каталитических кислотных центров носителя.

Для изучения зависимости реакционной способности аминокислотных остатков от их структуры и подвижности полипептидной цепи, реакцией ВТКИО с газообразным тритием при ]40°С был получен [3Н]конотоксин 01 (0x01, Рисунок 1) с удельной активностью 35 Ки/ммоль. Конотоксины являются эффективными блокаторами ацетил холиновых (АскII) рецепторов. [3Н]С1х01 сохранял свою биологическую активность, что подтвердили данные рецепторного связывания.

1 I 2 3 4 5 6 I 7 8 Э 10 12 13

Glu--Cys--Cys--Asn--Pro--Ala--Cys--Gly--Arg--His--Tyr--Ser--Cys

Рисунок 1. а-Конотоксин G1

Известно, что ВТКИО в свободных аминокислотах происходит с сопоставимой интенсивностью. Поэтому можно было ожидать, что тритий окажется во всех остатках CtxGl. Однако, из таблицы 2 и рисунка 2 можно видеть, что изотопный обмен не происходит во фрагменте Asn4-Pro5-Ala6. Пониженная реакционная способность этих остатков, вероятно, связана с пространственными особенностями структуры CtxGl. Распределение изотопной метки в пептидной цепи, вероятно, определяется реакционной способностью С-Н связей в отдельных аминокислотных остатках и их доступностью для СВ. Доступность С-Н связей в CtxGl оценивали по доле вандерваальсовой поверхности, доступной для взаимодействия с НгО. Этот показатель определяли с помощью программы MOLMOL. Для анализа реакционной способности С-Н связей в CtxGl проводился аЪ initio квантово-химический расчет переходного состояния реакции ВТКИО во фрагментах CtxGl с использованием метода Хартри-Фока.

Отсутствие 3Н в Рго5 и Asn4 может быть связано с низкой пространственной доступностью наиболее реакционных положений этих аминокислот. Было показано, что С5Н для Рго5 а также СаН и СрН для Asn4 в CtxGl обладают низкой доступностью. Однако, метильная группа А1а6 открыта полностью и тем не менее, тритий не включается в эту часть (смотри Таблицу 2). Это означает, что доступность того или другого участка пептида необходимое, но не достаточное условие для ВТКИО.

Согласно 'Н ЯМР, фрагмент Asn4-Cys7 имеет более жесткую конформацию, чем остальная часть молекулы CtxGl и, кроме того, А1а6 имеет конформацию, характерную для альфа-спирали. Для квантово-химических расчетов пути реакции изотопного обмена была зафиксирована геометрия тяжелых атомов главной цепи модельного

фрагмента СН3-С(0)-Ш-СаН(СН3)-С(0)-Ш2 в соответствии с конформацией фрагмента Рго5-А1а6-СуБ7 из С1хв1 (Рисунок 3).

Таблица 2. Распределение изотопной метки в меченном тритием а-конотоксине 61, полученном реакцией ВТКИО с тритием при температуре 140°С, по данным 3Н ЯМР спектра (640 МГц) без подавления спин-спинового взаимодействия в Б20 при рН7.5 и температуре 30°С (спектрометр Уапап ШПТ-600 (США))

Амино- Доля трития в Положение метки Хим. сдвиг, Доля трития в

кислотный остатке, % в остатке ррт положении, %

остаток

вы 3.6 СуН2 2.18 3.6

Су$2 7.0 СаН 4.60 7.0

СуэЗ 9.2 СаН 4.65 9.2

Азп4 0

Рго5 0

А1аб 0

Суэ7 8.0 СаН 4.48 8.0

01у8 2.8 СаН 3.78;4.03 2.8

Агё9 1.8 СуН2 1.25 1.8

Ни 10 50.6 С2Н 7.70 46.6

СаН 4.73 4.0

Тут11 4.1 СЗН, С5Н 6.77 1.4

СрН2 2.88 2.7

8ег12 3.7 СаН 4.34 3.7

СуэП 9.2 СаН 4.63 9.2

При расчете геометрических параметров переходного состояния модельного фрагмента геометрия остальной части реакционного комплекса была полностью оптимизирована. Энергия активации (Еас,), рассчитанная для реакции водородного обмена у Ср атома А1а6 равнялась 33.7 ккал/моль (НР/б-ЗШ*). Для сравнения: рассчитанная Еас, изотопного обмена СрНЗ в свободном аланине составляет 16.6 ккал/моль (№76-31 С*). Снижение Еас1 обмена С(ЗН в свободном аланине объясняется участием карбонильного кислорода в переходном состоянии; в этом случае расстояние между карбонильным О атомом и обменивающимися атомами СрН составляет лишь 2.16 А. В случае с С1хС 1, высокая энергия активации водородного обмена в метальной группе А1а6 связана с жесткой конформацией этого участка пептида, который мешает взаимодействию карбонильного О с Н-бета в переходном состоянии (расстояние между О и Н-бета равно 2.8 А). Таким образом, на примере Охй 1, было впервые показано, что ограниченная подвижность пептидного фрагмента может вызывать значительное снижение скорости реакции изотопного обмена водорода под действием СВ.

8 7 6 5 4 3 2

Рисунок 2. Участки 3Н-ЯМР-спектра (640 МГц) меченного тритием а-конотоксина ф^О, рН 7.5, 30°С). Интенсивность сигналов на участках 7.0-4.2 м.д. и 4.2-1.0 м.д. увеличена в 5 и 25 раз, соответственно. Показано отнесение сигналов (см. также Таблицу 2).

Рисунок 3. Пространственная структура переходного состояния для реакции ВТКИО в А1а6 0x01 (Ш 6-31/0*).

По данным 3Н ЯМР [3H]CtxGl, 57% водорода при С2 HislO было замещено тритием. Из таблицы 2 видно, что имидазол HislO оказывается самым активным в реакции ВТКИО CtxGl. Причина этого, возможно, заключается в участии некоторых атомов - доноров электронов в стабилизации переходного состояния в ВТКИО. Анализ пространственной структуры CtxGl показывает, что только гуанидиновая группа Arg9 может быть таким донором электронной плотности для имидазольного кольца HislO. Чтобы проверить это предположение, был проведен квантово-химический расчет переходного состояния при водородном обмене во фрагменте CtxGl, включающем в себя Arg9 и HislO. Геометрические параметры тяжелых атомов этого фрагмента были взяты из структуры CtxGl и при расчете переходных состояний зафиксированы. (Рисунок 3). Расстояние между обменивающимся атомом Н у His С2 и атомом N в гуанидине Arg9 в переходном состоянии согласно этим расчетам было равно 2.68 Ä и энергия активации этой реакции оказалась очень низкой (7 ккал/моль, HF/6-31G*). Поэтому именно сближение имидазольного кольца HislO и гуанидина Arg9 является причиной включения около половины трития при С2 имидазольного кольца HislO. Таким образом, в полипептидах электронодонорные атомы, способствующие протеканию реакции ВТКИО, могут быть расположены не только в том же аминокислотном фрагменте, где происходит изотопный обмен, но и в пространственно сближенном с ним аминокислотном остатке.

Реакцией ВТКИО был получен меченный тритием пептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс) с молярной радиоактивностью 80 Ки/ммоль. Семакс является фармацевтическим препаратом с ноотропным и нейропротекторным действием. С использованием [3H]Met-Glu-His-Phe-Pro-Giy-Pro было обнаружено специфическое связывание с мембранами нервных клеток и определена его фармакокинетика. Наличие метки во всех фрагментах пептида позволило определить кинетику изменения концентрации всех пептидных фрагментов, образующихся при его биодеградации под действием пептидаз в тканях организма.

Более 50% метки в этом пептиде включается в His3, и большая часть замещения водорода на тритий происходит в имидазольной части молекулы. В отличие от региоселективного обмена при С2 в HislO при ВТКИО в CtxGl, замещение в имидазоле His3 в гептапептиде семакс происходит как в положении 2, так и в положении 4. Аминокислота Gly6 проявляет такую же высокую реакционную способность, как и в DALG и LENK. Включение трития в другие аминокислотные остатки происходит в меньшей степени. Доля 3Н, включенного в Phe4 сравнительно меньше доли, наблюдаемой для Phe4 в DALG и LENK. Это значительное уменьшение реакционной способности может отражать эффект доступности Phe в реакции ВТКИО после сорбции пептида на неорганическом носителе (Таблица 3.).

Таблица 3. Химические сдвиги сигналов в 3Н-ЯМР-спектре меченного тритием семакса, их относительная интегральная интенсивность и отнесение. 'Н и 3Н ЯМР спектры были получены в D2O рН 7.5 при 30°С на спектрометре Varían UNITY-600 (США) при рабочей частоте 600 и 640 МГц для протонов и тритонов, соответственно.

Амино- Доля трития в Положение метки в Хим. сдвиг, Доля трития в

кислотный остатке,% остатке ррт положении, %

остаток

Metí 3.1 СаН 3.6 3.1

G¡u2 5.7 СаН 4.1 1.9

срн 2.2 2.9

СуН 2.3 0.9

His3 55.0 СаН 2.5 2.5

срн 2.9 0.2

С4Н 6.9 18.4

С2Н 7.65 33.9

Phe4 1.4 СаН 4.9 0.2

СЗ,5Н2 7.65 1.2

Gly6 27.8 СаН 4.05 27.8

Pro7 7.0 СаН 4.4 0.4

срн 2.1 2.0

CSH 3.65 4.6

Таблица 4. Химические сдвиги сигналов в 3Н-ЯМР-спектре меченного тритием зервамицина, их относительная интегральная интенсивность и отнесение. 'Н и 3Н ЯМР спектры были получены в СБзОО при 30°С на спектрометре Уапап ЦЫПУ-бОО (США) при рабочей частоте 600 и 640 МГц для протонов и тритонов, соответственно.

Амино- Доля трития в Положение метки в Хим. сдвиг, Доля трития в

кислотный остатке, % остатке ррт положении, %

остаток

Trpl 2.0 С7Н 7.55 0.5

С2Н 7.42 1.5

Пе2 1.9 СаН 3.85 1.9

Gln3 38.8 СРН2 2.40 18.9

срнз 2.15 16.7

СуШ 3.50 3.2

Leu8 0.8 СаН 4.42 0.8

HyplO 10.8 СрН2 2.12 1.9

срнз 2.55 8.9

HypI3 11.8 срнз 2.54 9.3

СуН 4.58 2.5

Pro 15 33.9 срнз 2.23 25.3

C5H2 4.02 8.6

С использованием реакции ВТКИО был получен [3Н]зервамицин ИВ (Ас-Тгр-11е-01п-1уа-Пе-ТЬг-А]Ь-Ьеи-А1Ь-Ьеи-Нур-С1п-А1Ь-Нур-А1Ь-Рго-РЫ, где АЛ это 2-аминоизомасляная кислота) с молярной радиоактивностью 70 Ки/ммоль. Распределение трития в [ Н]зервамицине ПВ показано в Таблице 4. Этот пептид интересен тем, что содержит фрагмент Тгр1-Ьеи8, имеющий конформацию а-спирали (Рисунок 4).

По-видимому, конформационная жесткость этого фрагмента явилась причиной того, что большая часть образующих его аминокислот обнаружила низкую реакционную способность. Высокая степень замещения СрН в Gln3 на тритий может быть связана с благоприятным расположением атома О карбонила боковой цепи Gln3 и N аминогруппы пептидной цепи. Как следует из ab initio квантово-химического расчета (MP2/6-31G*), эти гетероатомы в переходном состоянии реакции ВТКИО сближены с СрН и способствуют протеканию реакции (Рисунок 5).

Рисунок 5. Структура переходного состояния, рассчитанная для реакции изотопного обмена при СрН 01пЗ в зервамицине ПВ (МР2/6-ЗШ*). Расстояние между обменивающимися Н и амидным N равно 2,1 А.

О

Рисунок 4. Зервамицин ИВ.

Для аминокислот Hyp 10, Hyp 13 и Pro 15 в зервамицине IIB наблюдается высокая стереоселективность замещения относительно плоскости пирролидинового кольца этих аминокислот. Замещение происходит преимущественно на "одной стороне" молекулы зервамицина IIB. Такой характер распределения изотопной метки в этом полипептиде, по-видимому, может быть обусловлен ориентацией зервамицина IIB при сорбции на неорганической подложке при ВТКИО.

Альфа-спиральный фрагмент Trpl-Leu8 имеет относительно жесткую конформацию, поэтому для расчета переходного состояния реакции ВТКИО геометрию тяжелых атомов во фрагменте Ue2-Gln3-Iva4 пептидной цепи фиксировали в соответствии с его конформацией. Энергия активации (Еас,), рассчитанная для реакции водородного обмена у Gin Cß атома равнялась 26,2 ккал/моль (MP2/6-31G*), тогда как для СаН и СуН Eact составляла 30,9 и 35,3 ккал/моль (MP2/6-31G*) соответственно. Таким образом, из результатов квантово-химических расчетов переходного состояния реакции обмена водорода следует, что участие карбонильной группы боковой цепи и азота пептидной цепи Gln3 во взаимодействии с CßH Gln3 приводит к значительному увеличению реакционной способности этого положения (Рисунок 5).

В рамках этой работы было проведено теоретическое исследование влияния образования а-спиральных фрагментов в пептидах на реакционную способность образующих их аминокислот. (Таблица 5.)

Таблица 5. Энергия активации (ккал/моль) изотопного обмена водорода между аминокислотами и НзО+, рассчитанная методами Хартри-Фока в базисе 6-31 G* (HF/6-31G*) и теории возмущения Меллера-Плесета второго порядка в базисе

Аминокислота, HF/6-31G* MP2/6-31G*

положение

свободный Ala, а 27,0 20,0

свободный Ala, Р 22,8 16,6

Ala из а-спирали, а 52,6

Ala из а-спирали, (3 35,6 21,4

свободный Ser, а 31,8 16,9

свободный Ser, р 37,7 24,9

Ser из а-спирали, а 49,2

Ser из а-спирали, р 37,0

На примере аминокислот Ala и Ser показано, что участие аминокислот в образовании a-спиральных участков приводит к значительному снижению их реакционной способности в твердофазной реакции обмена водорода с участием спилловер-водорода.

2. Исследование твердофазного изотопного обмена в белках

Для исследования реакции ВТКИО водорода со спилловер тритием в белках использовали термофильную (З-галактозидазу из Termoanaerobacter ethanolicus, являющуюся гомодимером с молекулярной массой

субъединицы 83 кДа и мезофильную Р-глюкозидазу из миндаля (3.2.1.21, Sigma), представляющую собой гетеродимер, состоящий из субъединиц 117 и 66.5 кДа. Изучалась зависимость молярной радиоактивности и ферментативной активности от условий реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена. Выбранные условия позволяют сохранить ферментативную активность Р-глюкозидазы при проведении реакции в течение 10 мин при увеличении температуры от 40 до 120 °С. При температуре выше 120 °С, ферментативная активность резко уменьшается, что свидетельствует о денатурации белка. Молярная радиоактивность плавно возрастает при увеличении температуры (Рисунок 6, а).

Ки/ммоль

20 40 60 80 100 120 140 160 180 Температура, С

5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время реакции, мин

Сохранение ферментативной активности, % Молярная радиоактивность, Ки/ммопь

Сохранение ферментативной активности при 100 С, %

Сохранение ферментативной активности при 120 С, %

(а) (б)

Рисунок 6. Зависимость молярной радиоактивности и сохранения ферментативной активности Щ3Н]глюкозидазы от температуры реакции за 10 мин (а) и сохранения ферментативной активности при 100, 120 "С от времени реакции (б) (5% Рё/ВаЭСЭД.

4

3

о

Увеличение времени реакции при температуре 100-120°С приводит к росту молярной радиоактивности, но величина ферментативной активности при этом уменьшается (Рисунок 6, б). Также было установлено, что в исследованных условиях реакция ВТКИО имеет нулевой порядок по водороду, то есть скорость, с которой возрастает включение трития в белок, не зависит от давления в интервале 50-450 мм рт. ст. Н2.

Была определена зависимость молярной радиоактивности и сохранения ферментативной активности Р-галактозидазы от условий проведения ВТКИО (Таблица 6). Из таблицы 6 видно, что термофильная Р-галактозидаза и мезофильная р-глюкозидаза ведут себя в условиях

ВТКИО сходным образом, хотя по термостабильности они различаются на несколько десятков градусов. Структурные различия между этими белками оказывают влияние на величину молярной радиоактивности меченых белков. При прочих равных условиях трития в Р-галактозидазу включается несколько больше, чем в Р-глюкозидазу.

Таблица 6. Получение меченных тритием белков р-[3Н]галактозидазы и Р-[3Н]глкжозидазы с использованием реакции ВТКИО в присутствии 5% Рс1 на ВаБС^ (10 мин).

т, °с р-Галактозидаза Р-Глюкозидаза

Мол. рад., Ки/ммоль Ферментативная активность, % Мол. рад., Ки/ммоль Ферментативная активность, %

40 54 100 50 100

80 960 100 600 100

100 1090 100 980 100

120 1440 100 1400 100

140 2050 59 1980 45

160 3870 6 - -

Выбранные условия ВТКИО позволяют полностью сохранить ферментативную активность Р-галактозидазы при температурах изотопного обмена от 40 до 120°С, в течение 10 мин. Увеличение времени реакции до 60 минут при 100 и 120° С приводит к росту включения трития при определенном снижении молярной радиоактивности. Можно утверждать, что даже после 10 минут реакции при 160°С может сохраняться небольшая часть ферментативной активности белка. Эти данные показали «мягкость» процесса мечения в ВТКИО. Выбранные условия ВТКИО (120°С, Юмин) позволили получить Р-[3Н]галактозидазу с молярной радиоактивностью 1440 Ки/ммоль и полным сохранением ферментативной активности.

Для изучения влияния пространственного положения пептидного фрагмента в белковой глобуле Р-§а1 на его реакционную способность в реакции ВТКИО провели сравнительное исследование включения трития в пептидный гидролизат белка и в нативный белок в одинаковых условиях. Таким образом, были получены две серии пептидов, для разделения которых была использована обращенно-фазовая ВЭЖХ (Рисунок 7). Для получения индивидуальных пептидных фрагментов, фракции, собранные в градиенте метанола, подвергали рехроматографии с использованием градиента ацетонитрила и УФ-детектированием на двух длинах волн. Полученные фракции анализировали с применением МАЬ01 масс-спектрометрии. Отнесение хроматографических пиков делали по времени

Рисунок 7. ВЭЖХ продуктов гидролиза [3-галактозидазы Glu-протеиназой. Колонка: Phenomenex Primesphere CI 8 (250x3.2 мм, 5 ц)

Градиент: 2% -> 40% ацетонитрила за 80мин, в присутствии 0.1% ТФУК, 0.3 мл/мин.

удерживания, массе пептида и отношению экстинций на двух длинах волн (210 и 280 нм). Затем проводили определение относительной радиоактивности одинаковых пептидов из двух разных серий. Для оценки влияния пространственного строения белка на реакционную способность использовали величину нормированной реакционной способности.

Данные по пространственному строению исследуемой (3-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus получены с использованием метода множественного выравнивания аминокислотных последовательностей близких по строению белков. Рентгеноструктурным анализом ее структура пока не решена, но есть пространственная структура |3-галактозидазы из Escherichia coli. Поэтому для локализации участков исследуемой [3-галактозидазы находящихся внутри мономера и принимающих участие в образовании димера было выполнено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей трех (3-галактозидаз: исследуемой (3-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus, [3-галактозидазы из Escherichia coli с известной пространственной структурой а также (3-галактозидазы из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI. Методика определения пространственной структуры исследуемого белка была разработана в Секторе структуры белка Отдела биоинформатики ИМГ РАН Н.Н. Втюриным. Последовательность третьей р-галактозидазы была взята для

Таблица 7. Результат анализа пептидных фрагментов р-галактозидазы. В первой колонке под первичной структурой пептидов приведены особенности расположения аминокислотных остатков в пространственной структуре белка: а - а-спираль, р -Р-слой, ! - область контакта субъединиц. Доступная поверхность пептидов для молекул воды рассчитана с помощью программы МОЬМОЬ.

№ Пептид Масса пептида, Да Положение в первичной структуре белка Нормированная реакционная способность в ВТКИО Доступная поверхность в субъединице, %

1 KEMQKE 791.9 215-220 152 21.4

2 EIGMLVFEEI оса ß ßßßß 1179.4 338-347 43 13.7

3 D Н D F Y К Е а аааааа 953.0 392-398 51 18.2

4 YLRDSE ! 781.8 417-422 1 15.1

5 YNTTSAFGS а а а а 947.0 501-509 61 13.8

Рисунок В. Расположение фрагментов Р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus (Таблица 7) на белковой глобуле ß-гатактозидазы из Escherichia coli.

увеличения достоверности множественного выравнивания. Гомология (процент идентичности после парного выравнивания) между исследуемой Р-галактозидазой и Р-галактозидазой из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI составляет 42%, что даёт достоточное основание считать, что пространственные структуры этих двух р-галактозидаз имеют одинаковую архитектуру и принадлежат одному семейству пространственных структур (под термином «архитектура» подразумевается число и взаимное расположение элементов вторичной структуры в пространстве). Присутствие Р-галактозидазы из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI не ухудшает результаты множественного выравнивания, а помогает более достоверно локализовать внутренние участки и участки, образующие контакты в димере исследуемой Р-галактозидазы, на основе аналогичных участков в Р-галактозидазе из Escherichia coli с известной пространственной структурой.

Локализацию внутренних и наружных участков в Р-галактозидазе та Escherichia coli проводили с использованием стереоскопического визуализатора пространственных структур белковых молекул, разработанного в Секторе структуры белка Отдела биоинформатики ИМГ РАН а также программы MOLMOL. Результаты анализа приведены в таблице 7.

Из таблицы 7 можно видеть, что участок 215-220 Р-галактозидазы, находящийся на поверхности белковой глобулы и не участвующий в образовании вторичной структуры, имеет наибольшую относительную реакционную способность, тогда как внутренний участок 338-347 в белковой глобуле имеет в 3.5 раза меньшую реакционную способность (Рисунок 8). Из приведенных данных для фрагментов 392-398 и 501-509 Р-галактозидазы следует, что участие пептидных фрагментов в образовании а-спиралей и (i-слоев приводит к снижению реакционной способности по отношению к СВ. Эта закономерность наблюдалась и для а-спирали зервамицина IIB. Также заметным различием в реакционной способности обладает фрагмент 417-422, расположенный в области контакта субъединиц. Его реакционная способность снизилась более чем в 150 раз. Таким образом, образование межмолекулярного контакта резко снижает возможность протекания реакции изотопного обмена с участием СВ.

На основании полученных данных был сделан вывод о том, что на способность участвовать во взаимодействиях со спилловер-тритием влияет как химическая природа пептидного фрагмента, так и его положение в белковой глобуле. Изотопная метка включается преимущественно в пептидные фрагменты, расположенные на поверхности белковой глобулы.

выводы

1. Показано, что в области контакта субъединиц белка при реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) наблюдается резкое снижение включения трития, что может быть использовано для определения участков белковой глобулы, принимающих участие во взаимодействии с другими макромолекулами.

2. Найдены условия проведения реакции ВТКИО водорода на тритий, позволяющие получать меченные тритием пептиды и белки с высокой молярной радиоактивностью и с сохранением биологической активности.

3. Впервые показано влияние пространственного положения пептидных фрагментов белка Р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus на их реакционную способность при ВТКИО. Изотопная метка преимущественно включается в пептидные фрагменты, расположенные на поверхности белковой глобулы.

4. На основе ab initio квантово-химических расчетов показано, что участие доноров электронов (атомов О и N) в стабилизации переходного состояния реакции изотопного обмена является необходимым условием для протекания реакции ВТКИО в пептидах. Эти атомы могут принадлежать как остатку, в котором происходит обмен, так и другим пространственно близким аминокислотным остаткам.

5. Впервые теоретически исследовано влияние образования а-спиральных структур на изотопный обмен с участием спилловер водорода. Предложенный механизм реакции ВТКИО в полипептидах хорошо согласуется с экспериментальными данными.

6. Показано, что реакционная способность аминокислотных остатков полипептидов в реакции ВТКИО зависит как от их структуры и доступности для спилловер-трития, так и от конформационной гибкости пептидной цепи.

7. Показано, что термофильный и мезофильный белок при ВТКИО имеют примерно равную высокую стабильность при повышенной температуре.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Золотарев Ю. А., Борисов Ю. А., Дадаян А. К., Мясоедов Н. Ф. Твердофазный каталитический изотопный обмен аминокислот, пептидов и белков со спилловер-тритием. VII Всероссийская конференция по

металлоорганической химии. Тезисы стендовых докладов, Москва, 1999,2, 65.

2. Ю.А. Золотарев, А.К. Дадаян, Б.В. Васьковский, Н.В. Кост, С.К. Гаранин, В.П. Макаренкова, Н.Ф. Мясоедов. Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена водорода в даларгине. Биоорганическая химия, 2000, 26, (7), 512-515

3. Ю.А. Золотарев, Э.В. Бочаров, А.К. Дадаян, И.Е. Кашеверов, М.Н. Жмак, И.В. Масленников, Ю.А. Борисов, А.С. Арсеньев, Н.Ф. Мясоедов, В.И. Цетлин. Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена водорода в альфа-конотоксине G1 под действием спилловер-трития. Биоорганическая химия, 2000, 26, (8), 587-592

4. Zolotarev YuA , Bocharov EV , Dadayan AK , Borisov YuA , Myasoedov NF New development in the tritium labelling of peptides using solid state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Proceedings of the Seventh International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds", Drezden, Germany, Wiley, New York, J.R. Heys and D.G. Melillo (eds.) 2000, 416-419

5. Zolotarev YuA , Bocharov EV , Dadayan AK, Borisov YuA , Myasoedov NF New development in the tritium labelling of peptides using solid state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Seventh International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds". Symposium handbook and Collection of abstracts, Drezden, Germany, 2000, 37

6. Zolotarev Y.A., Dadayan A.K., Borisov Y.A., Myasoedov NF. New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid-state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Amino Acids, 2001, 21, (1), 74.

7. А. К. Дадаян Применение спилловер трития в исследовании структуры белка на примере [З-галактозидазы из Termocmaerobacter ethanolicus. Тезисы докладов XIII зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-9 февраля 2001, 41.

8. А. К. Дадаян, Ю. А. Золотарёв, Р. Зиганшин Твердофазный изотопный обмен водорода на тритий в пептидах и белках и его использование в исследовании пространственной структуры белков. Тезисы докладов XIII зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 11-15 февраля 2002,88.

9. Золотарев Ю.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Зозуля П.А. Дадаян А.К., Зозуля А.А. [3Н]Инсулин и его пероральное введение в плазму крови с использованием полиакриламидного сорбента. III Съезд Биохимического общества. Тезисы научных докладов. Санкт-Петербург, 2002, 160.

10. Дадаян А.К., Золотарев Ю.А., Зиганшин Р., Дорохова Е.М., Втюрин Н.Н., Козик B.C. Твердофазный изотопный обмен водорода на спилловер-тритий в (3-галактозидазе и его использование в исследовании пространственной структуры белка. III Съезд Биохимического общества. Тезисы научных докладов. Санкт-Петербург, 2002, электронная публикация.

11. Yu. A. Zolotarev, А. К. Dadayan, Е. V. Bocharov, Yu. A. Borisov.B. V. Vaskovsky, Е. М . Dorokhova N. F. Myasoedov New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid-state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Amino Acids, 2003,24, (3), 325-333.

12. Zolotarev Yu.A., Dadayan A.K., Dorokhova E.M., Vtyurin N.N., Kozik V.S., Borisov Yu.A., Myasoedov N.F. Solid State Isotope Exchange of Hydrogen for Spillover Tritium in Proteins. Eighth Internationa] Symposium "The Synthesis and Applications of Isotopes and Isotopically Labelled Compounds". Symposium handbook and Collection of abstracts, Boston, USA, 2003, 52.