Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в полипептидах и белке β-галактозидазе из Thermoanaerobacter Ethanolicus

Дадаян, Александр Карэнович

Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в полипептидах и белке β-галактозидазе из Thermoanaerobacter Ethanolicus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.14 ВАК РФ

Дадаян, Александр Карэнович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2003 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.14 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в полипептидах и белке β-галактозидазе из Thermoanaerobacter Ethanolicus»

Автореферат диссертации на тему "Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в полипептидах и белке β-галактозидазе из Thermoanaerobacter Ethanolicus"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА Химический факультет

На правах рукописи

Дадаян Александр Карэнович

Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в пептидах и белке (3-галактозидазе из ТкегтоапаегоЬааег ЕЛапоИст.

Специальности 02.00.14 - Радиохимия

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук Золотарев Ю.А.

ИМГРАН

доктор химических наук Борисов Ю.А. ИНЭОСРАН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корреспондент РАН Кочетков С.Н.

ИМБ им В.А. Энгельгардта РАН.

доктор химических наук

Фирсова Л.П.

МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится « 24 » сентября 2003 г. в _15_ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.42 при Московском государственном университете им М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра радиохимии, дом 1, строение 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « 27 » июня 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук

Трошина Н.Н.

"777

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изотопно-меченые белки, пептиды и аминокислоты являются необходимым инструментом для исследования многих биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности организмов. Меченные тритием соединения представляют особую ценность потому, что замена водорода тритием не приводит к заметному изменению биологических свойств, а водород присутствует практически во всех биологически активных соединениях. Реакции между твердым органическим веществом и активированным тритием интенсивно исследуются учеными многих стран. Для непосредственного введения трития используют, как правило, физические методы активации, такие как термическая активация на нагретой вольфрамовой спирали и микроволновая активация трития. При взаимодействии газообразного водорода с нанесенными катализаторами - металлами платиновой группы, происходит миграция водородных атомов, связанных с поверхностными атомами металла, на носитель. Этот эффект был назван спилловером водорода (СВ). Для синтеза меченных тритием соединений особенно эффективной является реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), основанная на взаимодействии органического соединения и СВ.

При ВТКИО в смеси, образованной твердым органическим соединением, нанесенным на неорганический носитель, и высокодисперсным металлом платиновой группы, под действием СВ с высокой скоростью происходит замещение водорода на тритий при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов. Ранее в Лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных веществ на примере аминокислот были проведены экспериментальные и теоретические исследования механизма реакции ВТКИО. Исследован одноцентровый синхронный механизм замещения при насыщенном углеродном атоме, характеризующийся образованием в переходном состоянии пента-координированного углерода и трехцентровой связи с участием приходящего и уходящего водородных атомов. Исследование взаимодействия твердого органического соединения со СВ при ВТКИО представляет как теоретический так и практический интерес. С помощью этого эффективного и универсального метода получены кратномеченные тритием физиологически активные соединения. В связи с этим, представляется актуальным выяснение основных закономерностей твердофазной реакции пептидов и белков с участием спилловер-трития и исследование влияния пространственной организации полипептидов на реакционную способность их фрагментов при ВТКИО. Квантово-химические расчеты, выполнены под руководством и при участии профессора дхн Ю.А. Борисова (ИНЭОС РАН). ________—-—>

Г »»--с. НАаИОНАЛЬНАЯ | 1 I библиотека |

Цели и задачи исследования.

Цель настоящей работы - изучение реакции ВТКИО в пептидах и белках.

Основные задачи исследования:

- изучение влияния пространственной структуры полипептидов на региоселективность реакции ВТКИО

- исследование влияния условий проведения реакции ВТКИО в белках на сохранение биологической активности и величину молярной радиоактивности

- выяснение возможности применения реакции ВТКИО для получения информации по структурной организации белков

- разработка препаративного метода получения высокомеченных тритием препаратов белка с сохранением биологической активности.

Научная новизна.

Впервые исследовался механизм реакции ВТКИО в пептидах и белках. Показано влияние первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры полипептидов на реакционную способность их фрагментов. Определены оптимальные условия реакции ВТКИО, позволяющие получать высокомеченые белки с полным сохранением ферментативной активности.

Практическая ценность результатов работы.

В результате проведенной работы были получены высокомеченные тритием пептиды и белки, использованные в экспериментах по специфическому связыванию, распределению и биодеградации в тканях.

Показана перспективность использования ВТКИО для получения информации о пространственном взаимодействии полипептидов в белковых комплексах.

Исследовано влияние состава твердой фазы и параметров реакции ВТКИО на включение трития и сохранение ферментативных свойств белков. Разработаны условия реакции ВТКИО, позволившие получить высокомеченый белковый ингибитор ангеотензин-превращающего фермента (10 кДа) с молярной радиоактивностью 300 Ки/ммоль, полностью сохранивший свойства нативного белка.

Реакцией ВТКИО получен меченный тритием инсулин, который был использован для исследования возможности создания пероральной лекарственной формы.

Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на седьмой Всероссийской конференции по металлоорганической химии (Москва, 1999), седьмом международном симпозиуме "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds"

(Дрезден, Германия, 2000), седьмом международном симпозиуме «Amino Acids and Proteins» (Вена, Австрия, август 2001г.), седьмой и восьмой международных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001, 2002), в двух докладах на третьем съезде Биохимического общества (С-Петербург, 2002).

В завершенном виде работа была доложена на заседании ученого совета Института молекулярной генетики РАН 28 апреля 2003 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в отечественной и зарубежной печати, тезисы 7 докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 20 таблиц. Библиографический указатель содержит 195 источников литературы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В работе исследовалась реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) водорода со спилловер-тритием в пептидах и белках.

1. Исследование твердофазного изотопного обмена в пептидах

Реакцией ВТКИО при 180 °С в одинаковых условиях были получены

меченные тритием эндогенный опиоидный пептид [Ьеи5]-энкефалин

(LENK, Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu) и его синтетический аналог даларгин (DALG, Tyr-£>-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg), являющийся лекарственным препаратом, используемым в гастроэнтерологии, с молярными радиоактивностями 120 и 138 Ки/ммоль, соответственно. Было показано, что эти меченые пептиды полностью сохраняют свою биологическую активность при проверке их связывания с опиоидными рецепторами мозга крысы. Распределение трития в [3H]DALG и [3H]LENK анализировали с помощью 3Н ЯМР (Таблица 1).

Как видно из приведенных данных, у исследуемых пептидов наблюдается значительное сходство в реакционной способности их фрагментов. В Tyrl остатках легче всего обмен происходит в орто-положении к ОН-группе ароматического кольца. Это положение характеризуется наибольшим сродством к протону (СЗН-140 ккал/моль, С2Н-132 ккал/моль) и для него облегчено взаимодействие с электрофильным кислотным каталитическим центром, возникающим при ВТКИО под действием СВ. И для других положений этой аминокислоты в исследованных энкефалинах наблюдается сходная реакционная

способность, за исключением СаН. Из данных таблицы 1 следует, что СаН Tyrl в DALG обменивается на тритий при ВТКИО почти на порядок больше, чем в LENK. Такая же повышенная реакционная способность СаН в DALG по сравнению с LENK наблюдается и в Phe4 и Leu5. Значительно различие в реакционной способности для Phe4 этих пептидов, при том, что доля трития, включенного при CßH и в ароматическую часть Phe4, для них близки. В остатке Phe4 пептида DALG в СаН включена самая большая часть метки, и наблюдается почти 70% замещение 'Н на 3Н. Степень замещения в том же положении у LENK составляет лишь около 6%. Так как все эти пептидные структуры сходны, то вероятная причина такого резкого изменения реакционной способности СаН может заключаться в наличии дополнительного заряда, имеющегося на гуанидиновой группировке Arg6 в DALG.

Таблица 1. Распределение изотопной метки (%) в [3Н]энкефалинах, полученных реакцией ВТКИО при температуре 180°С (DALG-138 Ки/ммоль; LENK-120 Ки/ммоль), по данным 3Н ЯМР 640 МГц (хим.сдвиг, ppm) в D20 при рН 7.0 (Varían UNITY-600).

Амино- Доля трития, % Положение DALG LENK

кислотами DALG LENK метки в ppm доля ppm доля

остаток остатке Т,% Т,%

Tyrl 27.1 28.0 СаН 4.15 4.6 4.20 0,5

CßH2 3.09 1.3 3.08 1.8

С2,6Н2 7.17 1.5 7.20 2.5

С3.5Н2 6.87 19.7 6.91 23.1

Gly2 - 30.5 СаН2 3.85 30.5

Gly3 30.5 31.8 СаН2 3.80 30.5 3.78 31.8

Phe4 20.0 9.1 СаН 4.60 14.3 4.60 1.5

CßH2 3.08;2.95 2.0 3.12;2.96 2.9

С2,6Н2 7.29 1.0 7.29 1.3

СЗ,5Н2 7.40 2.0 7.40 2.4

С4Н 7.35 0.7 7.35 1.0

Leu5 6.3 0.6 СаН 4.30 6.3 4.19 0.6

Arg6 16.1 - СаН 4.29 14.8

CßH2 3.10 1.3

Остатки Gly3 в DALG и LENK проявляют высокую реакционную способность. При выбранных условиях ВТКИО степень замещения водорода на тритий в этих остатках составляла от 65 до 70%. Обнаружено, что интенсивность изотопного обмена в Gly2 у LENK приблизительно такая же, что и в Gly3. В связи с этим представляется интересным раскрыть причины отсутствия реакции изотопного обмена в D-Ala2 DALG. Изотопный обмен в свободной аминокислоте Ala происходит чаще всего в

метальной группе. Возможно, что в ходе процесса сорбции на неорганическом носителе метальная группа Б-А1а2 оказывается в реакции ВТКИО недоступной для каталитических кислотных центров носителя.

Для изучения зависимости реакционной способности аминокислотных остатков от их структуры и подвижности полипептидной цепи, реакцией ВТКИО с газообразным тритием при 140°С был получен [3Н]конотоксин (0x01, Рисунок 1) с удельной активностью 35 Ки/ммоль. Конотоксины являются эффективными блокаторами ацетил холиновых (АскЯ) рецепторов. [3Н]Охб1 сохранял свою биологическую активность, что подтвердили данные рецепторного связывания.

1 _ I 2

з. 8 . ' 11 _ 12

Glu--Cys--Cys--Asn--Pro-Ala--Cys-Gly--Arg--His--Tyr--Ser-Cys Рисунок 1. а-Конотоксин G1

Известно, что ВТКИО в свободных аминокислотах происходит с сопоставимой интенсивностью. Поэтому можно было ожидать, что тритий окажется во всех остатках CtxGl. Однако, из таблицы 2 и рисунка 2 можно видеть, что изотопный обмен не происходит во фрагменте Asn4-Pro5-Ala6. Пониженная реакционная способность этих остатков, вероятно, связана с пространственными особенностями структуры CtxGl. Распределение изотопной метки в пептидной цепи, вероятно, определяется реакционной способностью С-Н связей в отдельных аминокислотных остатках и их доступностью для СВ. Доступность С-Н связей в CtxGl оценивали по доле вандерваальсовой поверхности, доступной для взаимодействия с Н20. Этот показатель определяли с помощью программы M0LM0L. Для анализа реакционной способности С-Н связей в CtxGl проводился ab initio квантово-химический расчет переходного состояния реакции ВТКИО во фрагментах CtxGl с использованием метода Хартри-Фока.

Отсутствие 3Н в Рго5 и Asn4 может быть связано с низкой пространственной доступностью наиболее реакционных положений этих аминокислот. Было показано, что С5Н для Рго5 а также СаН и СРН для Asn4 в CtxGl обладают низкой доступностью. Однако, метильная группа А1а6 открыта полностью и тем не менее, тритий не включается в эту часть (смотри Таблицу 2). Это означает, что доступность того или другого участка пептида необходимое, но не достаточное условие для ВТКИО.

Согласно 'Н ЯМР, фрагмент Asn4-Cys7 имеет более жесткую конформацию, чем остальная часть молекулы CtxGl и, кроме того, А1а6 имеет конформацию, характерную для альфа-спирали. Для квантово-химических расчетов пути реакции изотопного обмена была зафиксирована геометрия тяжелых атомов главной цепи модельного

фрагмента СН3-С(0)-Ш-СаН(СН3)-С(0)-МН2 в соответствии с конформацией фрагмента Рго5-А1а6-СуБ7 из ОхС1 (Рисунок 3).

Таблица 2. Распределение изотопной метки в меченном тритием а-конотоксине 01, полученном реакцией ВТКИО с тритием при температуре 140°С, по данным 3Н ЯМР спектра (640 МГц) без подавления спин-спинового взаимодействия в 020 при рН 7.5 и температуре 30°С (спектрометр Уапап Ш1ТУ-600 (США))

Амино- Доля трития в Положение метки Хим. сдвиг, Доля трития в

кислотный остатке, % в остатке ррт положении,%

остаток

01и1 3.6 СуН2 2.18 3.6

Су$2 7.0 СаН 4.60 7.0

СувЗ 9.2 СаН 4.65 9.2

Абп4 0

Рго5 0

А1а6 0

Суэ7 8.0 СаН 4.48 8.0

01у8 2.8 СаН 3.78;4.03 2.8

Агё9 1.8 СуН2 1.25 1.8

ШвЮ 50.6 С2Н 7.70 46.6

СаН 4.73 4.0

Туг11 4.1 СЗН, С5Н 6.77 1.4

СрН2 2.88 2.7

вег12 3.7 СаН 4.34 3.7

СуэП 9.2 СаН 4.63 9.2

При расчете геометрических параметров переходного состояния модельного фрагмента геометрия остальной части реакционного комплекса была полностью оптимизирована. Энергия активации (Еас1), рассчитанная для реакции водородного обмена у Ср атома А1а6 равнялась 33.7 ккал/моль (ШУб-ЗШ*). Для сравнения: рассчитанная Еас, изотопного обмена СРНЗ в свободном аланине составляет 16.6 ккал/моль (ШУ6-ЗШ*). Снижение Еас, обмена СрН в свободном аланине объясняется участием карбонильного кислорода в переходном состоянии; в этом случае расстояние между карбонильным О атомом и обменивающимися атомами СрН составляет лишь 2.16 А. В случае с Йхв 1, высокая энергия активации водородного обмена в метальной группе А1а6 связана с жесткой конформацией этого участка пептида, который мешает взаимодействию карбонильного О с Н-бета в переходном состоянии (расстояние между О и Н-бета равно 2.8 А). Таким образом, на примере 0x01, было впервые показано, что ограниченная подвижность пептидного фрагмента может вызывать значительное снижение скорости реакции изотопного обмена водорода под действием СВ.

а-конотоксина 01 фгО, рН 7.5, 30°С). Интенсивность сигналов на участках 7.0-4.2 м.д. и 4.2-1.0 м.д. увеличена в 5 и 25 раз, соответственно. Показано отнесение сигналов (см. также Таблицу 2).

Рисунок 3. Пространственная структура переходного состояния для реакции ВТКИО в А1а6 ахМ (ОТ 6-31/0*).

По данным 3Н ЯМР [3H]CtxGl, 57% водорода при С2 HislO было замещено тритием. Из таблицы 2 видно, что имидазол HislO оказывается самым активным в реакции ВТКИО CtxGl. Причина этого, возможно, заключается в участии некоторых атомов - доноров электронов в стабилизации переходного состояния в ВТКИО. Анализ пространственной структуры CtxGl показывает, что только гуанидиновая группа Arg9 может быть таким донором электронной плотности для имидазольного кольца HislO. Чтобы проверить это предположение, был проведен квантово-химический расчет переходного состояния при водородном обмене во фрагменте CtxGl, включающем в себя Arg9 и HislO. Геометрические параметры тяжелых атомов этого фрагмента были взяты из структуры CtxGl и при расчете переходных состояний зафиксированы. (Рисунок 3). Расстояние между обменивающимся атомом Н у His С2 и атомом N в гуанидине Arg9 в переходном состоянии согласно этим расчетам было равно 2.68 А и энергия активации этой реакции оказалась очень низкой (7 ккал/моль, HF/6-31G*). Поэтому именно сближение имидазольного кольца HislO и гуанидина Arg9 является причиной включения около половины трития при С2 имидазольного кольца HislO. Таким образом, в полипептидах электронодонорные атомы, способствующие протеканию реакции ВТКИО, могут быть расположены не только в том же аминокислотном фрагменте, где происходит изотопный обмен, но и в пространственно сближенном с ним аминокислотном остатке.

Реакцией ВТКИО был получен меченный тритием пептид Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс) с молярной радиоактивностью 80 Ки/ммоль. Семакс является фармацевтическим препаратом с ноотропным и нейропротекторным действием. С использованием [3H]Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro было обнаружено специфическое связывание с мембранами нервных клеток и определена его фармакокинетика. Наличие метки во всех фрагментах пептида позволило определить кинетику изменения концентрации всех пептидных фрагментов, образующихся при его биодеградации под действием пептидаз в тканях организма.

Более 50% метки в этом пептиде включается в His3, и большая часть замещения водорода на тритий происходит в имидазольной части молекулы. В отличие от региоселективного обмена при С2 в HislO при ВТКИО в CtxGl, замещение в имидазоле His3 в гептапептиде семакс происходит как в положении 2, так и в положении 4. Аминокислота Gly6 проявляет такую же высокую реакционную способность, как и в DALG и LENK. Включение трития в другие аминокислотные остатки происходит в меньшей степени. Доля 3Н, включенного в Phe4 сравнительно меньше доли, наблюдаемой для Phe4 в DALG и LENK. Это значительное уменьшение реакционной способности может отражать эффект доступности Phe в реакции ВТКИО после сорбции пептида на неорганическом носителе (Таблица 3.).

Таблица 3. Химические сдвиги сигналов в 3Н-ЯМР-спектре меченного тритием семакса, их относительная интегральная интенсивность и отнесение. 'Н и 3Н ЯМР спектры были получены в DjO рН 7.5 при 30°С на спектрометре Varían UNITY-600 (США) при рабочей частоте 600 и 640 МГц для протонов и тритонов, соответственно.

Амино- Доля трития в Положение метки в Хим. сдвиг, Доля трития в

кислотный остатке, % остатке ррш положении, %

остаток

Metí 3.1 СаН 3.6 3.1

Giu2 5.7 СаН 4.1 1.9

срн 2.2 2.9

СуН 2.3 0.9

His3 55.0 СаН 2.5 2.5

срн 2.9 0.2

С4Н 6.9 18.4

С2Н 7.65 33.9

Phe4 1.4 СаН 4.9 0.2

С3.5Н2 7.65 1.2

Gly6 27.8 СаН 4.05 27.8

Pro7 7.0 СаН 4.4 0.4

срн 2.1 2.0

C5H 3.65 4.6

Таблица 4. Химические сдвиги сигналов в 3Н-ЯМР-спектре меченного тритием зервамицина, их относительная интегральная интенсивность и отнесение. 'Н и3Н ЯМР спектры были получены в СПзОЭ при 30°С на спектрометре Уапап Ш1ТУ-600 (США) при рабочей частоте 600 и 640 МГц для протонов и тритонов, соответственно.

Амино- Доля трития в Положение метки в Хим. сдвиг, Доля трития в

кислотный остатке, % остатке рргп положении, %

остаток

Trpl 2.0 C7H 7.55 0.5

С2Н 7.42 1.5

Ие2 1.9 СаН 3.85 1.9

Gln3 38.8 СрН2 2.40 18.9

срнз 2.15 16.7

ОуН2 3.50 3.2

Leu8 0.8 СаН 4.42 0.8

HyplO 10.8 СрН2 2.12 1.9

срнз 2.55 8.9

Нур13 11.8 срнз 2.54 9.3

СуН 4.58 2.5

Pro 15 33.9 срнз 2.23 25.3

С5Н2 4.02 8.6

С использованием реакции ВТКИО был получен [3Н]зервамицин ПВ (Ас-Тгр-11е-01п-1уа-Пе-ТЬг-А1Ь-Ьеи-А1Ь-Ьеи-Нур-С1п-А1Ь-Нур-А1Ь-Рго-РЫ, где АЛ это 2-аминоизомасляная кислота) с молярной радиоактивностью 70 Ки/ммоль. Распределение трития в [ Н]зервамицине ПВ показано в Таблице 4. Этот пептид интересен тем, что содержит фрагмент Тгр1-Ьеи8, имеющий конформацию а-спирали (Рисунок 4).

Рисунок 4. Зервамицин IIB.

По-видимому, конформационная жесткость этого фрагмента явилась причиной того, что большая часть образующих его аминокислот обнаружила низкую реакционную способность. Высокая степень замещения CßH в Gln3 на тритий может быть связана с благоприятным расположением атома О карбонила боковой цепи Gln3 и N аминогруппы пептидной цепи. Как следует из ab initio квантово-химического расчета (МР2/6-3IG*), эти гетероатомы в переходном состоянии реакции ВТКИО сближены с CßH и способствуют протеканию реакции (Рисунок 5).

Рисунок 5. Структура переходного состояния, рассчитанная для реакции изотопного обмена при СрН ИпЗ в зервамицине ПВ (МР2/6-ЗШ*). Расстояние между обменивающимися Н и амидным N равно 2,1 А.

Для аминокислот Hyp 10, Hyp 13 и Pro 15 в зервамицине IIB наблюдается высокая стереоселективность замещения относительно плоскости пирролидинового кольца этих аминокислот. Замещение происходит преимущественно на "одной стороне" молекулы зервамицина IIB. Такой характер распределения изотопной метки в этом полипептиде, по-видимому, может быть обусловлен ориентацией зервамицина IIB при сорбции на неорганической подложке при ВТКИО.

Альфа-спиральный фрагмент Trpl-Leu8 имеет относительно жесткую конформацию, поэтому для расчета переходного состояния реакции ВТКИО геометрию тяжелых атомов во фрагменте Ile2-Gln3-Iva4 пептидной цепи фиксировали в соответствии с его конформацией. Энергия активации (Еас,), рассчитанная для реакции водородного обмена у Gin Cß атома равнялась 26,2 ккал/моль (MP2/6-31G*), тогда как для СаН и СуН Eact составляла 30,9 и 35,3 ккал/моль (MP2/6-31G*) соответственно. Таким образом, из результатов квантово-химических расчетов переходного состояния реакции обмена водорода следует, что участие карбонильной группы боковой цепи и азота пептидной цепи Gln3 во взаимодействии с CßH Gln3 приводит к значительному увеличению реакционной способности этого положения (Рисунок 5).

В рамках этой работы было проведено теоретическое исследование влияния образования а-спиральных фрагментов в пептидах на реакционную способность образующих их аминокислот. (Таблица 5.)

Таблица 5. Энергия активации (ккал/моль) изотопного обмена водорода между аминокислотами и НзО+, рассчитанная методами Хартри-Фока в базисе б-31 G* (HF/6-31G*) и теории возмущения Меллера-Плесета второго порядка в базисе 6-31 G*

На примере аминокислот Ala и Ser показано, что участие аминокислот в образовании a-спиральных участков приводит к » значительному снижению их реакционной способности в твердофазной

реакции обмена водорода с участием спилловер-водорода.

V 2. Исследование твердофазного изотопного обмена в белках

Для исследования реакции ВТКИО водорода со спилловер тритием в белках использовали термофильную Р-галактозидазу из Termoanaerobacter ethanolicus, являющуюся гомодимером с молекулярной массой

(MP2/6-31G*).

Аминокислота, HF/6-31G* MP2/6-31G*

положение

свободный Ala, а 27,0 20,0

свободный Ala, р 22,8 16,6

Ala из а-спирали, а 52,6

Ala из а-спирали, р 35,6 21,4

свободный Ser, а 31,8 16,9

свободный Ser, р 37,7 24,9

Ser из а-спирали, а 49,2

Ser из а-спирали, Р 37,0

субъединицы 83 кДа и мезофильную Р-глюкозидазу из миндаля (3.2.1.21, Sigma), представляющую собой гетеродимер, состоящий из субъединиц 117 и 66.5 кДа. Изучалась зависимость молярной радиоактивности и ферментативной активности от условий реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена. Выбранные условия позволяют сохранить ферментативную активность р-глюкозидазы при проведении реакции в течение 10 мин при увеличении температуры от 40 до 120 °С. При температуре выше 120 "С, ферментативная активность резко уменьшается, что свидетельствует о денатурации белка. Молярная радиоактивность плавно возрастает при увеличении температуры (Рисунок 6, а).

20 40 60 80 100 120 140 160 180 Температура, С

5 10 15 20 25 30 35 40 45 Время реакции, мин

Сохранение ферментативной активности, % Молярная радиоактивность, Ки/ммоль

Сохранение ферментативной активности при 100 С, %

Сохранение ферментативной активности при 120 С, %

(а) (б)

Рисунок 6. Зависимость молярной радиоактивности и сохранения ферментативной активности р-[3Н]глюкозидазы от температуры реакции за 10 мин (а) и сохранения ферментативной активности при 100, 120 "С от времени реакции (б) (5% Рё/ВаЯО.,).

Увеличение времени реакции при температуре 100-120°С приводит к росту молярной радиоактивности, но величина ферментативной активности при этом уменьшается (Рисунок 6, б). Также было установлено, что в исследованных условиях реакция ВТКИО имеет нулевой порядок по водороду, то есть скорость, с которой возрастает включение трития в белок, не зависит от давления в интервале 50-450 мм рт. ст. Н2.

Была определена зависимость молярной радиоактивности и сохранения ферментативной активности р-галактозидазы от условий проведения ВТКИО (Таблица 6). Из таблицы 6 видно, что термофильная Р-галактозидаза и мезофильная р-глюкозидаза ведут себя в условиях

ВТКИО сходным образом, хотя по термостабильности они различаются на несколько десятков градусов. Структурные различия между этими белками оказывают влияние на величину молярной радиоактивности меченых белков. При прочих равных условиях трития в р-галактозидазу включается несколько больше, чем в Р-глюкозидазу.

Таблица 6. Получение меченных тритием белков р-[3Н]галаюозидазы и р-[3Н]глюкозидазы с использованием реакции ВТКИО в присутствии 5% 1М на ВаБО^ (10 мин).

т,°с {5-Галактозидаза Р-Глюкозидаза

Мол. рад., Ки/ммоль Ферментативная активность, % Мол. рад., Ки/ммоль Ферментативная активность, %

40 54 100 50 100

80 960 100 600 100

100 1090 100 980 100

120 1440 100 1400 100

140 2050 59 1980 45

160 3870 6 - -

Выбранные условия ВТКИО позволяют полностью сохранить ферментативную активность р-галактозидазы при температурах изотопного обмена от 40 до 120°С, в течение 10 мин. Увеличение времени реакции до 60 минут при 100 и 120° С приводит к росту включения трития при определенном снижении молярной радиоактивности. Можно утверждать, что даже после 10 минут реакции при 160°С может сохраняться небольшая часть ферментативной активности белка. Эти данные показали «мягкость» процесса мечения в ВТКИО. Выбранные условия ВТКИО (120°С, Юмин) позволили получить р-[3Н]галактозидазу с молярной радиоактивностью 1440 Ки/ммоль и полным сохранением ферментативной активности.

Для изучения влияния пространственного положения пептидного фрагмента в белковой глобуле Р-§а1 на его реакционную способность в реакции ВТКИО провели сравнительное исследование включения трития в пептидный гидролизат белка и в нативный белок в одинаковых условиях. Таким образом, были получены две серии пептидов, для разделения которых была использована обращенно-фазовая ВЭЖХ (Рисунок 7). Для получения индивидуальных пептидных фрагментов, фракции, собранные в градиенте метанола, подвергали рехроматографии с использованием градиента ацетонитрила и УФ-детектированием на двух длинах волн. Полученные фракции анализировали с применением МА1Л31 масс-спектрометрии. Отнесение хроматографических пиков делали по времени

| <

Рисунок 7. ВЭЖХ продуктов гидролиза р-галактозидазы Glu-протеиназой. Колонка: Phenomenex Primesphere С18 (250x3.2 мм, 5 ц)

Градиент: 2% -> 40% ацетонитрила за 80мин, в присутствии 0.1 % ТФУК, 0.3 мл/мин.

удерживания, массе пептида и отношению экстинций на двух длинах волн I

(210 и 280 нм). Затем проводили определение относительной i

радиоактивности одинаковых пептидов из двух разных серий. Для оценки 1

влияния пространственного строения белка на реакционную способность использовали величину нормированной реакционной способности.

Данные по пространственному строению исследуемой р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus получены с использованием метода множественного выравнивания аминокислотных последовательностей близких по строению белков. Рентгеноструктурным анализом ее структура пока не решена, но есть пространственная структура Р-галактозидазы из Escherichia coli. Поэтому для локализации участков исследуемой Р-галактозидазы находящихся внутри мономера и принимающих участие в образовании димера было выполнено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей трех Р-галактозидаз: исследуемой р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus, Р-галактозидазы из Escherichia coli с известной пространственной структурой а также р-галактозидазы из (,

Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI. Методика определения пространственной структуры исследуемого белка была разработана в Секторе структуры белка Отдела биоинформатики ИМГ РАН Н.Н. Втюриным. Последовательность третьей р-галактозидазы была взята для

Таблица 7. Результат анализа пептидных фрагментов Р-галактозидазы. В первой колонке под первичной структурой пептидов приведены особенности расположения аминокислотных остатков в пространственной структуре белка: а - а-спираль, р -¡3-слой,! - область контакта субъединиц. Доступная поверхность пептидов для молекул воды рассчитана с помощью программы МОЬМОЬ.

№ Пептид Масса пептида, Да Положение в первичной структуре белка Нормированная реакционная способность в ВТКИО Доступная поверхность в субъединице, %

1 KEMQKE 791.9 215-220 152 21.4

2 EIGMLVFEEI act Р Р ß ß ß 1179.4 338-347 43 13.7

3 DHDFYKE а а а а а а а 953.0 392-398 51 18.2

4 YLRDSE ! 781.8 417-422 1 15.1

5 YNTTSAFGS аааа 947.0 501-509 61 13.8

Рисунок 8. Расположение фрагментов ß-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus (Таблица 7) на белковой глобуле ß-галактозидазы из Escherichia coli.

увеличения достоверности множественного выравнивания. Гомология (процент идентичности после парного выравнивания) между исследуемой Р-галактозидазой и Р-галактозидазой из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI составляет 42%, что даёт достаточное основание считать, что пространственные структуры этих двух Р-галактозидаз имеют одинаковую архитектуру и принадлежат одному семейству пространственных структур (под термином «архитектура» подразумевается число и взаимное расположение элементов вторичной структуры в пространстве). Присутствие р-галактозидазы из Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EMI не ухудшает результаты множественного выравнивания, а помогает более достоверно локализовать внутренние участки и участки, образующие контакты в димере исследуемой Р-галактозидазы, на основе аналогичных участков в Р-галактозидазе из Escherichia coli с известной пространственной структурой.

Локализацию внутренних и наружных участков в Р-галактозидазе из Escherichia coli проводили с использованием стереоскопического визуализатора пространственных структур белковых молекул, разработанного в Секторе структуры белка Отдела биоинформатики ИМГ РАН а также программы MOLMOL. Результаты анализа приведены в таблице 7.

Из таблицы 7 можно видеть, что участок 215-220 Р-галактозидазы, находящийся на поверхности белковой глобулы и не участвующий в образовании вторичной структуры, имеет наибольшую относительную реакционную способность, тогда как внутренний участок 338-347 в белковой глобуле имеет в 3.5 раза меньшую реакционную способность (Рисунок 8). Из приведенных данных для фрагментов 392-398 и 501-509 Р-галактозидазы следует, что участие пептидных фрагментов в образовании а-спиралей и р-слоев приводит к снижению реакционной способности по отношению к СВ. Эта закономерность наблюдалась и для а-спирали зервамицина IIB. Также заметным различием в реакционной способности обладает фрагмент 417-422, расположенный в области контакта субъединиц. Его реакционная способность снизилась более чем в 150 раз. Таким образом, образование межмолекулярного контакта резко снижает возможность протекания реакции изотопного обмена с участием СВ.

На основании полученных данных был сделан вывод о том, что на способность участвовать во взаимодействиях со спилловер-тритием влияет как химическая природа пептидного фрагмента, так и его положение в белковой глобуле. Изотопная метка включается преимущественно в пептидные фрагменты, расположенные на поверхности белковой глобулы.

выводы

1. Показано, что в области контакта субъединиц белка при реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) наблюдается резкое снижение включения трития, что может быть использовано для определения участков белковой глобулы, принимающих участие во взаимодействии с другими макромолекулами.

2. Найдены условия проведения реакции ВТКИО водорода на тритий, позволяющие получать меченные тритием пептиды и белки с высокой молярной радиоактивностью и с сохранением биологической активности.

3. Впервые показано влияние пространственного положения пептидных фрагментов белка Р-галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus на их реакционную способность при ВТКИО. Изотопная метка преимущественно включается в пептидные фрагменты, расположенные на поверхности белковой глобулы.

4. На основе ab initio квантово-химических расчетов показано, что участие доноров электронов (атомов О и N) в стабилизации переходного состояния реакции изотопного обмена является необходимым условием для протекания реакции ВТКИО в пептидах. Эти атомы могут принадлежать как остатку, в котором происходит обмен, так и другим пространственно близким аминокислотным остаткам.

5. Впервые теоретически исследовано влияние образования а-спиральных структур на изотопный обмен с участием спилловер водорода. Предложенный механизм реакции ВТКИО в полипептидах хорошо согласуется с экспериментальными данными.

6. Показано, что реакционная способность аминокислотных остатков полипептидов в реакции ВТКИО зависит как от их структуры и доступности для спилловер-трития, так и от конформационной гибкости пептидной цепи.

7. Показано, что термофильный и мезофильный белок при ВТКИО имеют примерно равную высокую стабильность при повышенной температуре.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Золотарев Ю. А., Борисов Ю. А., Дадаян А. К., Мясоедов Н. Ф. Твердофазный каталитический изотопный обмен аминокислот, пептидов и белков со спилловер-тритием. VII Всероссийская конференция по

металлоорганической химии. Тезисы стендовых докладов, Москва, 1999,2, 65.

2. Ю.А. Золотарев, А.К. Дадаян, Б.В. Васьковский. Н.В. Кост, С.К. Гаранин, В.П. Макаренкова, Н.Ф. Мясоедов. Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена водорода в даларгине. Биоорганическая химия, 2000,26, (7), 512-515

3. Ю.А. Золотарев, Э.В. Бочаров, А.К. Дадаян, И.Е. Кашеверов, М.Н. Жмак, И.В. Масленников, Ю.А. Борисов, А.С. Арсеньев, Н.Ф. Мясоедов, В.И. Цетлин. Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена водорода в альфа-конотоксине G1 под действием спилловер-трития. Биоорганическая химия, 2000,26, (8), 587-592

4. Zolotarev YuA, Bocharov EV , Dadayan AK , Borisov YuA , Myasoedov NF New development in the tritium labelling of peptides using solid state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Proceedings of the Seventh International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds", Drezden, Germany, Wiley, New York, J.R. Heys and D.G. Melillo (eds.) 2000, 416-419

5. Zolotarev YuA, Bocharov EV , Dadayan AK, Borisov YuA , Myasoedov NF New development in the tritium labelling of peptides using solid state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Seventh International Symposium "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds". Symposium handbook and Collection of abstracts, Drezden, Germany, 2000, 37

6. Zolotarev Y.A., Dadayan A.K., Borisov Y.A., Myasoedov NF. New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid-state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Amino Acids, 2001, 21,(1), 74.

7. А. К. Дадаян Применение спилловер трития в исследовании структуры белка на примере Р-галактозидазы из Termoanaerobacter ethanolicus. Тезисы докладов XIII зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-9 февраля 2001,41.

8. А. К. Дадаян, Ю. А. Золотарёв, Р. Зиганшин Твердофазный изотопный обмен водорода на тритий в пептидах и белках и его использование в исследовании пространственной структуры белков. Тезисы докладов XIII зимней международной молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 11-15 февраля 2002, 88.

9. Золотарев Ю.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Зозуля П.А. Дадаян А.К., Зозуля А.А. [3Н]Инсулин и его пероральное введение в плазму крови с использованием полиакриламидного сорбента. III Съезд Биохимического общества. Тезисы научных докладов. Санкт-Петербург, 2002,160.

10. Дадаян А.К., Золотарев Ю.А., Зиганшин Р., Дорохова Е.М., Втюрин Н.Н., Козик B.C. Твердофазный изотопный обмен водорода на спилловер-тритий в (3-галактозидазе и его использование в исследовании пространственной структуры белка. III Съезд Биохимического общества. Тезисы научных докладов. Санкт-Петербург, 2002, электронная публикация.

11. Yu. A. Zolotarev, А. К. Dadayan, Е. V. Bocharov, Yu. A. Borisov,B. V. Vaskovsky, Е. М . Dorokhova N. F. Myasoedov New development in the tritium labelling of peptides and proteins using solid-state catalytic isotopic exchange with spillover-tritium. Amino Acids, 2003,24, (3), 325-333.

12. Zolotarev Yu.A., Dadayan A.K., Dorokhova E.M., Vtyurin N.N., Kozik V.S., Borisov Yu.A., Myasoedov N.F. Solid State Isotope Exchange of Hydrogen for Spillover Tritium in Proteins. Eighth International Symposium "The Synthesis and Applications of Isotopes and Isotopically Labelled Compounds". Symposium handbook and Collection of abstracts, Boston, USA, 2003, 52.

Принято к исполнению 24/06/2003 Исполнено 27/06/2003

Заказ №316 Тираж: 100 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

^^/ А

"777

№ 117 7 7

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Дадаян, Александр Карэнович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Природа спилловер-водорода

Атомарная природа спилловер-водорода

Нз частицы

Ионные пары

Нойоны

2.2. Термическая активация трития. Тритиевая планиграфия

2.3. Активация трития ВЧ разрядом

2.4. Реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена

2.5. Исследование региоселективности изотопного обмена водородных атомов твердого органического соединения

2.6. Исследование механизма твердофазных реакций с использованием квантово-химического моделирования

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и приборы

3.2. Методы исследования

3.2.1. ВТКИО водорода на тритий 67 ВТКИО в пептидах 67 ВТКИО в белках

3.2.2. Очистка р -гал актозидазы

Приготовление клеточных экстрактов

Фракционирование сульфатом аммония

Гель-фильтрация

Анион-обменная хроматография

3.2.3. Определение ферментативной активности (3-галактозидазы и

Р -глюкозид азы

3.2.4. Определение концентрации белка

3.2.5. Подготовка белка к протеолизу

3.2.6. Гидролиз белка глутамилэндопептидазой из Bacillus intermedius

3.2.7. ВЭЖХ продуктов гидролиза (3-галактозидазы.

3.2.8. Определение радиоактивности растворов

3.2.9. ЯМР-спектроскопия

3.2.10. Методика ab initio расчетов.

3.2.11. Определение доступности С-Н связей в а-конотоксине G1 73 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Исследование твердофазного изотопного обмена в пептидах

4.2. Исследование твердофазного изотопного обмена в белках 89 ВЫВОДЫ 98 БЛАГОДАРНОСТИ 99 ПРИЛОЖЕНИЕ А 100 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ б/в безводный

ВТКИО высокотемпературный твердофазный каталитический изотопный обмен

ВЧ высокочастотный

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

РСА рентгено-структурный анализ

РНК рибонуклеиновая кислота

СВ (СТ) спилловер-водород (спилловер-тритий)

ТФУК трифторуксусная кислота

ТПД температурно-программированная десорбция

ЭПР электронный парамагнитный резонанс

ЯМР ядерный магнитный резонанс ab initio неэмпирический метод расчета

Aib 2-аминоизомасляная кислота

Ар ампициллин

P-gal (3-галактозидаза

P-glu Р-глюкозидаза

CtxGl а-конотоксин G

DALG даларгин (Tyr-D- Ala-Gly-Phe-Leu-Arg)

Eact энергия активации

FT-NIR ближняя ИК-Фурье-спектроскопия

Н* активированный водород

Iva изовалин

LB среда Лурия-Бертрани

LM межмолекулярный комплекс

LENK [Ьеи5]-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)

МР2 метод теории возмущения Меллера-Плессета 2-го порядка

РЫ фенилаланинол pNP п-нитрофенол pNPGal п-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид pNPGlu п-нитрофенил-Р-Б-глюкопиранозид q эффективный заряд на атоме

RHF ограниченный метод Хартри-Фока

TS переходное состояние реакции

Для обозначения аминокислот использовали стандартные одно- и трёхбуквенные сокращения.

Введение диссертация по химии, на тему "Твердофазный изотопный обмен со спилловер-тритием в полипептидах и белке β-галактозидазе из Thermoanaerobacter Ethanolicus"

Изотопно-меченые белки, пептиды и аминокислоты являются необходимым I инструментом для исследования многих биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности организмов. Меченные тритием соединения представляют особую ценность потому, что замена водорода тритием не приводит к заметному изменению биологических свойств, а водород присутствует практически во всех биологически активных соединениях. Реакции между твердым органическим веществом и активированным тритием интенсивно исследуются учеными многих стран. Для непосредственного введения трития используют, как правило, физические методы активации, такие как термическая активация на нагретой вольфрамовой спирали и микроволновая активация трития. При взаимодействии газообразного водорода с нанесенными катализаторами - металлами платиновой группы, происходит миграция водородных атомов, связанных с поверхностными атомами металла, на носитель. Этот эффект был назван спилловером водорода (СВ). Для синтеза меченных тритием соединений особенно эффективной является реакция высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), основанная на взаимодействии органического соединения и СВ. При ВТКИО в смеси, образованной твердым органическим соединением, нанесенным на неорганический носитель, и высокодисперсным металлом платиновой группы, под действием СВ с высокой скоростью происходит замещение водорода на тритий при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов. Ранее в лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных веществ на примере аминокислот были проведены экспериментальные и теоретические исследования механизма реакции BTIG10. Исследован одноцентровый синхронный механизм замещения при насыщенном углеродном атоме, характеризующийся образованием в переходном состоянии пента-координированного углерода и трехцентровой связи с участием приходящего и уходящего водородных атомов. Исследование взаимодействия твердого органического соединения с СВ при ВТКИО представляет как теоретический, так и практический интерес. С помощью этого эффективного и универсального метода получены кратно меченные тритием физиологически активные соединения. В связи с этим представляется актуальным выяснение основных закономерностей твердофазной реакции пептидов и белков с участием спилловер-трития и исследование влияния пространственной организации полипептидов на реакхщонную способность их фрагментов при ВТКИО, Квантово-химические расчеты выполнены под руководством и при участии профессора Д.Х.Н. Ю.А. Борисова (ИНЭОС РАН).1. ОБ1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Цели и задачи исследования.Цель настоящей работы - изучение реакции ВТКИО в пептидах и белках.Основные задачи всследования: изучение влияния пространственной структуры полипептидов на региоселективность реакции ВТКИО - исследование влияния условий проведения реакции ВТКИО в белках на сохранение биологической активности и величину молярной радиоактивности - выяснение возможности применения реакции ВТКИО для получения информации о структурной организации белков - разработка препаративного метода получения высокомеченных тритием препаратов белка с сохранением биологической активности.Научная новизна.Впервые исследовался механизм реакции ВТКИО в пептидах и белках. Показано влияние первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур полипептидов на реакционную способность их фрагментов. Определены оптимальные условия реакции BTbGIO, позволяющие получать высокомеченые белки с полным сохранением ферментативной активности.Практическая ценность результатов работы.В результате проведенной работы были получены высокомеченные тритием пептиды и белки, использованные в экспериментах по специфическому связыванию, распределению и биодеградации в тканях.Показана перспективность использования ВТКИО для получения информации о пространственном взаимодействии полипептидов в белковых комплексах.Исследовано влияние состава твердой фазы и параметров реакции ВТКИО на включение трития и сохранение ферментативных свойств белков. Разработаны условия реакции ВТКИО, позволивпше получить высокомеченый белковый ингибитор ангеотензин-превращающего фермента (10 кДа) с молярной радиоактивностью 300 Ки/ммоль, полностью сохранивший свойства нативиого белка.Реакцией ВТКИО получен меченный тритием инсулин, который был использован для исследования возможности создания пероральной лекарственной формы инсулина.Апробация работы. Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на седьмой Всероссийской конференции по металлоорганической химии (Москва, 1999), седьмом международном симпозиуме "Synthesis and Application of Isotopically Labelled Compounds" (Дрезден, Германия, 2000), седьмом международном симпозиуме «Amino Acids and Proteins» (Вена, Австрия, август 2001 г.), седьмой и восьмой меяздународных молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2001, 2002), в двух докладах на третьем съезде Биохимического общества (С-Петербург, 2002).В завершенном виде работа была доложена на заседании ученого совета Института молекулярной генетики РАН 28 апреля 2003 года.Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в отечественной и зарубежной печати, тезисы 7 докладов.

Заключение диссертации по теме "Радиохимия"

выводы

3. Впервые показано влияние пространственного положения пептидных фрагментов белка Р -галактозидазы из Thermoanaerobacter ethanolicus на их реакционную способность при ВТКИО. Изотопная метка преимущественно включается в пептидные фрагменты, расположенные на поверхности белковой глобулы.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность своим научным руководителям Юрию Александровичу Золотареву и Юрию Андреевичу Борисову за постоянное внимание и руководство в работе и написании статей, Елену Михайловну Дорохову и Валерия Станиславовича Козика за огромную помощь в проведении экспериментов и редактировании текста диссертации. Автор также благодарен Николаю Федоровичу Мясоедову за создание условий для работы.

Автор благодарит А. А. Недоспасова за критические замечания и помощь в редактировании данной работы.

Автор также признателен Л. С. Блоховой, Р. Зиганшину, Н. Втюрину и Э. Бочарову за существенную помощь в работе.

Автор выражает искреннюю благодарность Г. А. Великодворской, И. Волкову, Н. А. Луниной, И. Демидюку, О. Долотову и С. Шраму за полезные советы и большую помощь в экспериментальной работе.

Автор особенно благодарен членам своей семьи за моральную и материальную поддержку, без которой эта работа не была бы доведена до конца.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Дадаян, Александр Карэнович, Москва

1. М. Boudart, М.А. Vannice, J.E. Benson -Adlineation, Portholes and Spillover. // Z. Phys. Chem. NF, 1969,64,171-177.

2. S.J. Khoohiar Particle to Particle Migration of Hydrogen Atoms on Platinum-Alumina Catalysts from Particle to Neighboring Particles. // J. Phys. Chem., 1964,68,411.

3. P.A. Sermon, D.C. Bond Hydrogen Spillover. // Catal. Rev., 1973,8,211-239.

4. D.A. Dowden in: C. Kemball, D.A. Dowden (Eds.) Catalysis, vol. VIII. Spec. Period. Rep. The Chemical Society. London. 1980,136.

5. W.C. Conner, G.M. Pajonk, S.J. Teichner Spillover of Sorbed Species. // Adv. Catal., 1986, 34,1-79.

6. W.C. Conner in: Z. Paal, P.G. Menon (Eds.). Hydrogen Effects in Catalysis. Marcel Dekker. New York, 1988,311.

7. B. Delmon The control of reaction selectivity and stability of catalysts by spillover processes // Heterogeneous Chem. Rev., 1994,1,219-230.

8. L.-T. Weng, B. Delmon Phase cooperation and remote control effects in selective oxidation catalysts. // Appl. Catal., 1992, A 81,141-213.

9. Z. Knor, C. Edelmann, J. Rudny, J. Stachurski Nitrogen spill-over effect in the palladium-tungsten system. // Appl. Surf. Sci., 1986,25,107-117.

10. B. Sen, J.L. Falconer, T.-F. Mao, M. Yu, R.L. Flesner Spillover of CO and H2 onto A1203 Surfaces. II J. Catal., 1990,126,465-476.

11. B. Chen, J.L. Falconer Spillover Rate from Pd to A1203. // J. Catal., 1992,134,2,737741.

12. F. Solymosi, L. Volgyesi, J. Sarkany The Effect of the Support on the Formation and Stability of Surface Isocianate on Platinum. // J. Catal., 1978, 54,3,336-344.

13. G. Webb, J.I. MacNab The Hydroisomerization of n-Butanes. 2. The Reaction of 1-Butene over Mercniy-Poisoned Rhodium-Silica Catalysts. // J. Catal., 1972,26,2,226-232.

14. A. J. Robell, E.V. Ballou, M. Boudart Surface Diffusion of Hydrogen on Carbon. // J. Phys. Chem., 1964,68,2748-2753.

15. M.A. Vannice, W.C. Neikam On the Chemical Nature of Hydrogen Spillover. // J. Catal., 1971,20,2,260-263.

16. W.C. Conner Spectroscopic insight into spillover// Stud. Surf. Sci. Catal., 1993, 77,6168.

17. W.C. Conner, J.L. Falconer Spillover in Heterogeneous Catalysis // Chem. Rev., 1995,95, 759-788.

18. G.M. Pajonk Attempt at the characterization of spillover adsorbed species during catalysis // Stud. Surf. Sci. Catal., 1993,77,85-93.

19. D.H. Lenz, W.C. Conner, J.P. Fraissard Hydrogen spillover on silica. 3. Detection of spillover by proton NMR // J. Catal., 1989,117,281-289.

20. T.-C. Sheng, I.D Gay Proton Magnetic Resonance of Hydrogen Adsorbed on Supported Platinum Catalysts. // J. Catal. 1981,71,1, 119-126.

21. T.M. Apple, C. Dybowski TPD-NMR study of hydrogen irreversibly adsorbed on Rh/Ti02 // Surf. Sci., 1982,121,2,243-248.

22. Rouabah, R. Benslama, J. Fraissard 1H NMR study of hydrogen chemisorbed on supported platinum: application to the determination of the metal dispersion // Chem. Phys. Lett., 1991,179, 3,218-222.

23. D. Rouabah, J. Fraissard H-l and Xe-129 nuclear-magnetic-resonance studies of hydrogen chemisorption on supported platinum application to the metal dispersion and spillover // Solid State Nuclear Magnetic Resonance, 1994,3,153-162.

24. О J. Barabino, С. Dybowski Nuclear magnetic resonance of hydrogen sorbed by powdered palladium metal and alumina- supported palladium. // Solid State Nuclear Magnetic Resonance 1992,1, 5-12.

25. Т.Н. Chang, C.P. Cheng, C.T. Yeh A solid-state nuclear magnetic resonance study of deuterium adsorbed on rhodium/silica: exchange between mobile and weakly adsorbed deuterium. // J. Phys. Chem. 1991,95,5239-5244.

26. M.A. Chesters, A. Dolan, D. Lennon, D.J. Williamson, K.J. Parker // J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1990,86,3491.

27. X. Wu, B.C. Gerstein, T.S. King Characterization of Silica-Supported Ruthenium Catalysts by Hydrogen Chemisorption and Nuclear Magnetic Resonance of Adsorbed Hydrogen. // J. Catal., 1989,118,238-254.

28. T.W. Root, T.M. Duncan Characterization of hydrogen on silica-supported rhodium with 1H NMR spectroscopy // Chem. Phys. Lett., 1987,137,1,57-62.

29. W.C. Neikam, M.A. Vannice Hydrogen Spillover in the Pt Black/Ce-Y Zeolite/Perylene System. // J. Catal., 1972,27,207-214.

30. E. Baumgarten, C. Lentes-Wagner, R. Wagner H-D exchange and hydrogen spillover in the Pd/Si02 system - kinetics and detection of hydrogen-atoms // J. Mol. Catal., 1989, 50, 153-165.

31. E. Baumgarten, C. Lentes-Wagner, R. Wagner Hydrogen spillover through gas-phase transport of hydrogen-atoms// J. Catal., 1989,117,533-541.

32. J.L. Hall, R.I. Schumacher Electron Spin Resonance of Hydrogen Atoms in CaF2 // Phys. Rev., 1962,127,1892-1912.

33. S.G. Sligar, H. Blum Hyperfine Structure of the Hydrogen Atom in CaF2 as a Function of Temperature // Phys. Rev., 1971, В 3,3587-3592.

34. J.M. Spaeth Influence of Zero-Point Vibration on the Superhyperfine Interactions of Hydrogen and Deuterium Centres in KC1. // Phys. Status Solidi, 1969,34, 1,171-182.

35. M.S. Spencer, R. Burch, S.E. Golunski Hydrogen spillover through gas-phase transport of hydrogen-atoms - comment // J. Catal., 1990,126,311-313.

36. E. Baumgarten, G. Meyer Hydrogenation of Hexene-1 by Gas Phase Spillover Hydrogen. Influence of Substances Added in the Reaction Chamber, Without Contact to the Catalyst // Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 2000, 70,1,35-41.

37. E. Baumgarten, L. Maschke Hydrogen spillover through the gas phase - Reaction with graphite and activated carbon. // Applied Catalysis A: General, 2000,202,2,171-177.

38. E. Baumgarten, G. Meyer Hydrogen Spillover Through the Gas Phase. Some Kinetic Aspects. // Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 2000,71,2,325-333.

39. E. Baumgarten, I. Niemeyer On the Role of Surfaces in Hydrogenation Reactions with Gas Phase Spillover Hydrogen. // Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 70 (2000), 2, 371377.

40. E. Baumgarten, R. Krupp Gas Phase Hydrogen Spillover and Oxygen Content. // Reaction Kinetics and Catalysis Letters, 2000,70,1,27-33.

41. W.A. Pliskin, R.P. Eischens — Infrared Spectra of Hydrogen and Deuterium Chemisorbed on Platinum. // Z. Phys. Chem. NF, 1960,24,11-23.

42. G.C. Bond A short history of hydrogen spillover. // Stud. Surf. Sci. Catal., 1983,17, 1-16.

43. J.E. Benson, H.W. Kohn, M. Boudart On the Reduction of Tungsten Trioxide Accelerated by Platinum and Water. // J. Catal., 1966,5,2, 307-313.

44. М.А. Vannice, M. Boudart, J.J. Fripiat Mobility of Hydrogen in Hydrogen Tungsten Bronze. // J. Catal., 1970,17,3,359-365.

45. P. A. Sermon, G.C. Bond Studies of Hydrogen Spillover. Part 1. - Study of the Rate, Extent and Products of Hydrogen Spillover from Platinum to the Trioxides of Tungsten and Molibdenum. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1,1976,72, 3, 730-744.

46. P.A. Sermon, G.C. Bond Studies of Hydrogen Spillover. Part 4. - Factors Affecting Hydrogen Spillover and its Reversal. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, 1980, 76,4, 889890.

47. P.G. Dickens, R.H. Jarman, R.C.T. Slade, C.J. Wright On the attachment of hydrogen in НхМоОз //J. Chem. Phys., 1982, 77, 1, 575-577.

48. B. Gerand, M. Figlarz Reduction of hexagonal WO3 by hydrogen spillover: formation of new hydrogen hexagonal tungsten bronzes HXW03. // Stud. Surf. Sci. Catal., 1983,17,275284.

49. N. Sotoni, K. Eda, M. Kunitomo // J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1990, 86,1583.

50. M.J. Sienko, H. Oesteneicher Infrared and electron spin resonance study of hydrogen tungsten bronze. // J. Am. Chem. Soc., 1968,90,6568-6570.

51. R. Kramer, M. Andre Adsorption of Atomic Hydrogen on Alumina by Hydrogen Spillover. // J. Catal., 1979, 58,2,287-295.

52. E. Serwicka, R.N. Schindler, R. Schumacher An ESR Study of Tto2 Treated with Atomic Hydrogen // Ber. Bunsen-ges. Phys. Chem., 1981, 85,192-195.

53. P.G. Dickens, RJ. Hurditch X-ray and Neutron Diffraction Studies of a Tetragonal Hydrogen Bronze HxW03. //Nature, 1967,215,1266-1267.

54. K. Gadgil, R.D. Gonzalez The Adsorption of Hydrogen Atoms on Support Oxides Active in Promoting Hydrogen Atom Spillover. // J. Catal., 1975,40,2,190-196.

55. E.M, Serwicka ESR of Polycrystalline V2O5 Treated with H Atoms at Room Temperature. // Z. Phys. Chem. NF, 1990,167,87-92.

56. M. Che, B. Canosa, A.R. Gonzalez-Elipe Use of Hydrogen Atoms for the Low-temperature Reduction of Oxides. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1,1982,78,4,1043-1050.

57. E.M. Serwicka ESR of Polycrystalline Titania Reduced at Room Temperature with H Atoms. // Z. Phys. Chem. NF, 1990,166,249-252.

58. S.J. Teichner Recent studies in hydrogen and oxygen spillover and their impact on catalysis. // Appl. Catal., 1990,62,1-10.

59. G.E.E. Gardes, G.M. Pajonk, SJ. Teichner Catalytic Demonstration of Hydrogen Spillover from Nickel-Alumina Catalyst to Alumina. //J. Catal., 1974,33,1,145-148.

60. D. Bianchi, M. Lacroix, G.M. Pajonk, S.J. Teichner Catalytic and Infrared Demonstrations of the Effect of Hydrogen Spillover on a Gel of Silica. // J. Catal., 1979, 59, 3,467-467.

61. M. Lacroix, G.M. Pajonk, S.J. Teichner in: T. Seiyama, K. Tanabe (Eds.), Proc. 7th Int. Congr. on Catalysis. Kodansha, Japan. Elsevier. Amsterdam, 1981,279.

62. J.P. Nogier, J.L. Bonaroct, J.P. Fraissaro Silica activation by hydrogen plasma. // Stud. Surf. Sci. Catal., 1983,17,233-240.

63. W.F. Maier Reactionsmechanismen in der Heterogenen Katalyse; C-H-Bindungsaktivierung als Fallstudie. // Angew. Chem. 1989,101,135-146.

64. A.B. McEwen, F.A. Etzkorn, W.F. Maier Significance of Isotopic Distributions in Catalytic Reactions of Hydrocarbons with Dideuterium. // Chimia, 1987,41,293-297.

65. K.I. Lundsirom, M.S. Shivaraman, C.M. Svensson A hydrogen-sensitive Pd-gate MOS transistor// J. Appl. Phys., 1975,46,9, 3876-3881.

66. K.L Lundstrom, T. DiStefano Hydrogen induced interfacial polarization at Pd—Si02 interfaces // Surf. Sci., 1976,59,1,23-32.

67. A. Ortiz, S. Lopez, J.C. Alonso, S. Muhl Hydrogen-sensitive Ni/Si02/a-Si:H Schottky diodes // Thin Solid Films 1992,207,279-282.

68. H.-Y. Nie, Y. Nannichi Pd-on-GaAs Schottky Contact: Its Barrier Height and Response to Hydrogen // Jpn. J. Appl. Phys., 1991,30,906-913.

69. B-Y. Tsaur, J.P. Mattia, C.K. Chen Hydrogen annealing of PtSi-Si Schottky barrier contacts // Appl. Phys. Lett., 1990,57,11,1111-1113.

70. D. Bianchi, M. Lacroix, G.M. Pajonk, S.J. Teichner Spilled-Over Hydrogen Transport from Platmum-on-Alumina Catalyst to Methoxylated Silica Aerogel. // J. Catal., 1981, 68,2, 411-418.

71. J.U. Hirschfelder Energy of the Triatomic Hydrogen Molecule and Ion. // J. Chem. Phys., 1938,6,12, 795-805.

72. B. Delmon, M.T. Pouchot №442.- La cinetique des reactions het^rogenes. La hermination et l'avancement de 1'interface r6actionnel dans la reduction des oxydes de nickel et de cuivre pub^rulentes. // Bull. Soc. Chim. Fr., 1966,8,2677-2682.

73. K. Aimoto, K. Fujimoto, K. Maeda Hydroizomerization of n-pentane over hybrid catalysts containing supported hydrogenation catalyst/ // Stud. Surf. Sci. Catal., 1993,77, 165-169.

74. E. Kikuchi, T. Matsuda The effect of spillover hydrogen on coke formation catalyzed by HY zeolite and pillared montmorillonite // Stud. Surf. Sci. Catal., 1993,77,53-60.

75. K. Ebitani, J. Tsuji, H. Hattori, H. Kita Dynamic modification of surface acid properties with hydrogen molecule for zirconium-oxide promoted by platinum and sulfate-ions // J. Catal., 1992, 135,609-617.

76. Т. Tanaka, K. Ehilani, H. Hattori, S. Yoshida A new concept of hydrogen storage - a (Pt/S04)-0-2-Zr02 material // Stud. Surf. Sci. Catal., 1993,77,285-288.

77. A.M. Stumbo, P. Grange, B. Delmon Effect of spillover hydrogen on amorphous hydrocracking catalysts // Stud. Surf. Sci. Catal., 1996,101,97-106.

78. К. Fujimoto, К. Tomishige, A. Okabe Effect of hydrogen on n-butane isomerization over Pt/S042--Zr02 and Pt/Si02+S042--Zr02 //Applied Catalysis A: General, 2000,194-195, 383-393.

79. T. Kusakari, K. Tomishige, K. Fujimoto Hydrogen spillover effect on cumene cracking and n-pentane hydroisomerization over Pt/Si02 + H-Beta. Applied Catalysis A: General, 2002,224,1-2,219-228.

80. Yanyong Liu, Gaku Koyano, Makoto Misono Hydroisomerization of n-hexane and n-heptane over platinum-promoted Cs{2.5}H{0.5}PW{12}0{40} (Cs2.5) studied in comparison with several other solid acids. Topics in Catalysis, 2000,11/12,1/4,239-246

81. R.B. Levy, M. Boudart The Kinetics and Mechanism of Spillover. // J. Catal., 1974, 32, 304-314.

82. R. Cavanagh, J.T. Yates Hydrogen Spillover on Alumina - A Study by Infrared Spectroscopy // J. Catal., 1981,68,22-26.

83. J.F. Cevallos Candau, W.C. Conner The Spillover of Hydrogen onto Silica. IV. The Use of Scanning FTIR to Follow Spillover from a Point Source. // J. Catal., 1987,106,2, 378385.

84. R.A. Dalla Betta, M. Boudart Hydroxyl Exchange on H-CaY and Pt/H-Cay Zeolites with Deuterium. // J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1,1976,72, 8,1723-1732.

85. U. Roland, R. Salzer, S. Stolle Investigation of hydrogen and deuterium spillover on Y -zeolites by FT-IR microscopy - rate-determining steps // Stud. Surf. Sci. Catal., 1994,84, 1231-1238.

86. E. Baumgarten, R. Wagner, C. Lentes-Wagner Reactivity of spillover hydrogen -reactivity of unsaturated compounds // J. Catal., 1987, 104,307-311.

87. U. Roland, H. Winkler, K.H. Steinberg in: K.-H Steinberg (Ed.). Proc. 2nd Int. Conf. on Spillover. Leipzig. Germany, University of Leipzig, 1989,63.

88. U. Roland, Н. Winkler, Н. Bauch, К.-Н. Steinberg Studies of the influence of a magnetic-field on the diffusion of spilt-over deuterium on Y-zeolites // J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1991,87,3921-3924.

89. E. Keren, A. Soffer Simultaneous Electronic and Ionic Surface Conduction of Catalyst Support: A General Mechanism for Spillover. // J. Catal., 1977,50,43-55.

90. J.M. Herrmann, P. Pichat Evidence by electrical conductivity measurements for hydrogen spill over on Pt, Rh and Ni/TiC>2 catalysts. Consequences for bifunctional photocatalysis. // Stud. Surf. Sci. Catal., 1983,17,77-88.

91. J.M. Herrmann, P. Pichat Metal-Support Interactions: An in Situ Electrical Conductivity Study of Pt/Ti02 Catalysts. // J. Catal., 1982,78,2,425-435.

92. J. Disdier, J.M. Hemnann, P. Pichat//J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1,1983, 79,651.

93. H. Jiehan, H. Zupei, S. Yongze, W. Hongli Evidence for hydrogen back-spillover in Pt-Ti02 system. // Stud. Surf. Sci. Catal., 1983,17,53-62.

94. Th. Braunschweig, U. Roland, H. Winkler Electrical-conductivity study of hydrogen spillover on Ti02 // Stud. Surf. Sci. Catal., 1993,77, 183-188.

95. R. Huck, U. Bottger, D. Kohl, G. Heiland Spillover effects in the detection of H2 and CH4 by sputtered Sn02 films with Pd and PdO deposits // Sensors Actuators, 1989,17,355-359.

96. D. Kohl The role of noble metals in the chemistry of solid-state gas sensors // Sensors Actuators, 1990, В 1,158-165.

97. N. E. Lobashina, N. N. Sawin, I. A. Myasnikov Mechanism of hydrogen spillover on supported metal-catalysts. 1. Novel investigation method // Kinet. Catal., 1983,24,634-638.

98. A.Y. Graifer, A.P. Koshcheev, I.A. Myasnikov Light-stimulated spillover of hydrogen on Pt/ZnO catalyst // Kinet. Catal., 1988,29,1243-1247.

99. J.C. Conesa, J. Soria, J.M. Rojo, J. Sanz, G. Munuera Spillover and Electronic Effects for H2 Weakly Adsorbed on Metal/Semiconductor Catalysts: Comparison of ESR and NMR Data for the Rh/Ti02 and Rh/SrTi03 Systems. // Z. Phys. Chem. NF, 1987,152,83-92.

100. G. Munuera, A. R. Gonzalez-Elipe, A. Munoz, A. Fernandez, J. Soria, J. Conesa, J. Sanz -Mechanism of hydrogen gas-sensing at low temperatures using Rh/TiCh systems // Sensors Actuators, 1989, 18,337-348.

101. A.G. Shastri, J. Schwank Adsorption-induced conductance changes of thin Pt films and PtPd/Ti02 gas sensors. // Appl. Surf. Sci., 1987,29,3,341-360.

102. U. Roland, R. Salzer, Th. Braunschweig, F. Roessner, H. Winkler Investigations on hydrogen spillover. 1. Electrical-conductivity studies on titanium-dioxide // J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1995,91, 1091-1095.

103. A. Jacob Detection of atomic oxygen and atomic hydrogen beams by semiconductors // J. Appl. Phys., 1975,46,12, 5116-5121.

104. A.Y. Graifer, A.P. Koshcheev, I.A. Myasnikov Photostimulated hydrogen spillover in semiconductor palladium membrane system // Kinet. Catal., 1990,31,1315-1318.

105. S. Khoobiar, J.L. Carter, P.J. Lucchesi The electronic properties of aluminum oxide and the chemisorption of water, hydrogen, and oxygen. // J. Phys. Chem. 1968,72,1682-1688.

106. M.E. Franke, U. Simon, F. Roessner, U. Roland Influence of spilt-over hydrogen on the electrical properties of H-ZSM-5. // Applied Catalysis A: General, 2000,202,2,179-182.

107. F. Boccuzzi, G. Ghiotti, A. Chiorino Optical Properties of Microcrystalline Zinc Oxide. Influence of Defects Produced by Interaction with CO. // J. Chem. Soc. Faraday. Trans. I, 1983,79,12,1779-1789.

108. F. Boccuzzi, G. Ghiotti, A. Chiorino Metal-Semiconductor interaction: effect of H2 chemisorption on the IR transparency of the Cu/ZnO system. // Surf. Sci., 1987,183, L285-L289.

109. E. Guglielminotti, F. Boccuzzi, G. Ghiotti, A. Chiorino Infrared evidence of metal-semiconductor interaction in a Ru/ZnO system. // Surf. Sci., 1987, 189-190,331-338.

110. U. Roland, R. Salzer, E. Henssge in N -T Yu. X Y Li Proc XTVth Int Conf on Raman Spectroscopy Hong Kong. John Wiley and Sons Chichester, 1994,772.

111. U. Roland, E. Henssge, L. Summchen, R. Salzer Fluorescence effects in Raman-spectroscopy of titanium-dioxide - influence of tempering and adsorption // Z. Phys. Chem., 1995,191,197-208.

112. W.C. Conner (Ed.), Proc. 1st Int. Conf. Spillover. Lyons. France, 1983, Volume of Discussion. University of Claude Bernard. Lyon-Villeurbanne, 1984, 71.

113. U. Roland, T.Braunschweig, F. Roessner On the nature of spilt-over hydrogen // J. Mol. Catal. A: Chem. 1997,127,61-84.

114. F. Roessner, U. Roland Hydrogen spillover in bifunctional catalysis // J. Mol. Catal. A: Chem. 1996, 112,3,401-412.

115. J.H.Sinfelt, P.J.Luchesi Kinetic Evidence for the Migration of Reactive Intermediates in Surface Catalysis. // J. Amer. Chem. Soc., 1963,85,3365-3367.

116. Х.М.Миначев, А.Н.Депок, Р.В.Дмитриев, П.И.Слюняев Обмен дейтерия с водородом поверхности цеолитных катализаторов. // Изв. АН СССР, сер. хим., 1978, 12,2678-2682.

117. В.В.Лунин, Х.Н.Асхабова, Б.В.Романовский Новый способ осуществления каталитических реакций. // Докл. АН СССР, 1980,250,4, 896-898.

118. Т. Fleisch, R. Aberman On the Reduction of Ag2S Film by Hydrogen Spillover under Ultra High Vacuum Condition // J. Catal., 1977,50,268-278.

119. R. Klein, M.D. Scheer The reaction of hydrogen atoms with solid olefins at - 195°. // J. Phys. Chem., 1958,62,1011-1014.

120. А.В.Шишков, Э.С.Филатов, Е.Ф.Симонов, М.С.Унукович, В.И.Гольданский, Ан.Н.Несмеянов Получение меченных тритием биологически-активных соединений. //Докл. АН СССР, 1976,228,5,1237-1239.

121. Е.Ф.Симонов, М.С.Унукович, Э.С.Филатов, А.В.Шишков Исследование реакций атомарного трития с аминокислотами. I. Аланин. Продукты реакций и внутримолекулярное распределение трития. // Химия выс. энергий, 1978,12,1,8-10.

122. J.Kay, R.Malsan, F.S.Rowland Recoil Tritium Reactions at an Asymmetric Carbon: L(+)-Alanine. // J. Amer. Chem. Soc., 1959,81,5050-5053.

123. Э.С.Филатов, Е.Ф.Симонов, А.В.Шишков, В.П.Могильников Получение а-аланина-3Н воздействием атомарного трития, нагретого до 2000 К, на твердую мишень аланина при 77 К. // Радиохимия, 1979,21,6,909-913.

124. М.А.Орлова, Ан.Н.Несмеянов Реакции атомарного трития с фенил аланином и тирозином. // Радиохимия, 1978,20,5,787-791.

125. М.А.Орлова, Е.Ф.Симонов, Э.С.Филатов Исследование реакций атомарного трития с аминокислотами. Ш. Низкотемпературные реакции атомов трития с фенил ал анином и тирозином. // Химия выс. энергий, 1979,13,5,468-473.

126. А.В.Волынская, А.Ю.Скрипкин, А.В.Шишков, В.И.Гольданский. Исследование структуры адсорбционных слоев поверхностно-активных веществ методом тритиевой метки // Докл. АН СССР, 1982,266, 871.

127. В.И.Гольданский, Ю.М.Румянцев, А.В.Шишков, Л.А.Баратова, Л.П.Белякова. -Исследование пространственной структуры белков при помощи тритиевой метки. П.

128. Внутримолекулярное распределение трития в N-концевой части миоглобина и третичная структура белка И Молекуляр. биология, 1982,16,3,528-534.

129. B.K.Lee, F.M.Richards The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. // J. Mol. Biol., 1971,55,3,379-400.

130. S.A.Islam, D.L.Weaver Variation of folded polypeptide surface area with probe size. // Proteins, 1991,10,4,300-314.

131. Богачева E.H., Шишков А.А., Шишков A.B., Баратова JI.A. Понятие "доступная поверхность" в рамках метода тритиевой планиграфии. Эксперимент и расчет. // Молекуляр. Биология, 1994,28, 5,1035-1043.

132. Гедрович А.В., Баратова Л.А., Богачева Е.Н., Медведкин В.Н., Шишков А.В. -Количественное определение доступной поверхности глобулярных белков методом тритиевой планиграфии. // Молекуляр. Биология, 1993,27,2,309-315.

133. Miller S., Janin J., Lesk M., Chothia С. Interior and surface of monomelic proteins. // J. Mol. Biol, 1987,196,3,641-656.

134. Volynskaya A.V., Kasumov E.A., Bogacheva E.N., Shishkov A.V., Goldanskii V.I. -Determination of the accessible surface of globular proteins by means of tritium planigraphy. // Eur. J. Biophys, 1994, V. 23,139-143.

135. Н.Г.Котлова, М.А.Кулиш, А.Ф.Миронов. Выделение меченной тритием субъединицы и цитохромоксидазы. // Биоорг. химия, 1988, 14, 12,1695-1697.

136. И.А.Филатов, М.А.Кулиш, А.Ф.Миронов, Е.В.Кожевникова, Л.А.Нейман. -Исследование взаимодействия цитохрома с с цитохромоксидазой методом тритиевой планиграфии. // Биоорг. химия, 1987, 13,5,623-627.

137. Е.Н.Богачева, Н.Д.Жуков, А.В.Шишков. Доступная поверхность и внутримолекулярная подвижность белков: исследование методом тритиевой планиграфии. // Молекуляр. биология, 1993,27,5,1044-1050.

138. Belayev N.D., Budker V.G., Dubrovskaya V.A., Kim A.A., Kiseleva E.V., Sidorov V.N. -Localization of proteins forming the outer surface of isolated metaphase chromosomes // FEBS Letts., 1992, V. 297,43-45.

139. Agafonov D.E., Kolb VA., Spirin A.S. Proteins on ribosome surface: Measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V. 94, 12892-12897.

140. L.A.Baratova, N.I.Grebenshchikov, A.V.Shishkov, I.A.Kashirin, Yu.L.Radavsky, LJarvekulg, M.Saarma. The topography of the surface of potato virus X: tritium planigraphy and immunological analysis // J. Gen. Virol.,1992,73,2,229-235.

141. Ксенофонтов AJL, Федорова Н.В., Бадун Г.А., Тимофеева Т.А., Григорьев В.Б., Баратова Л.А., Жирное О.П. Локализация матриксного белка Ml вируса гриппа в вирионе. //Молекуляр. Биология, 1999,33, 5, 881-886.

142. Богачева Е.Н., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова Л.А. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью тритиевой планиграфии. П. Порядок укладки определяет структуру. // Молекуляр. биология, 1996,30,4, 885-892.

143. Ивлев А.Б., Гедрович А.В., Шишков А.В. Тритиевая планиграфия биологических систем: принципы метода и математическая модель. // Молекуляр. биология, 1992,26, 5,1047-1053.

144. Б.Г.Дзантиев, О.С.Шимчук, А.В.Шшпков Спектральные характеристики ВЧ разряда в водороде и инертных газах в области вакуумного ультрофиолета. // Ж. прикл. спектр., 1976,24,2,340-342.

145. А.В.Шишков, Л.А.Нейман, В.С.Смоляков Получение меченых органических соединений действием атомарного трития. // Усп. химии, 1984,53,7,1125-1151.

146. W.C.Hembree, R.L.E.Ehrenkaufer, SXiebeiman, A.P.Wolf A general method of tritium labeling utilizing microwave discharge activation of tritium gas. Methodology and application to biological compounds // J. Biol. Chem, 1973,248, 15, 5532-5540.

147. Э.С.Филатов, Е.Ф.Симонов, В.П.Мошльников Исследование реакций атомарного трития с аминокислотами. П. Получение а-аланина-3Н. II Химия выс. энергий, 1979, 13,4,373-376.

148. R.L.E.Ehrenkaufer, A.P.Wolf, W.C.Hembree // US Pat. 4162142,1979.

149. А.В.Шишков, Ю.М.Румянцев, В.И.Гольданский Образование меченых биологически активных соединений при реакциях ускоренных атомов и ионов трития. // Докл. АН СССР, 1978,239,4,988-991.

150. Э.С.Филатов, М.А.Орлова, Е.Ф.Симонов Реакции атомов трития с фенилаланином и тирозином в интервале температур 77-400 К. // Весгн. МГУ. Химия, 1980,21,49-52.

151. М.А.Орлова, Е.Ф.Симонов, Э.С.Филатов Реакция атомов трития с тирозином при Т<77 К. // Радиохимия, 1981,23,4,614-618.

152. А.М.Дубинская, Н.Н.Юсубов Зависимость константы скорости реакции

153. Н + HR->H2 + R от температуры. // Изв. АН СССР. Сер. хим., 1975,9,2095-2097.

154. Л.А.Баратова, Ю.М.Румянцев, Е.Ф.Симонов, М.С.Унукович, В.А.Цыряпкин, А.В.Шишков Реакции атомарного трития с аминокислотами. Рацемизация L-аланина. // Химия выс. энергий, 1981, 15,4,370-373.

155. А.В.Шишков, Л.А.Баратова Тритиевая планиграфия биологических систем // Усп. химии, 1994, 63,9,825-841.

156. Н.Ф.Мясоедов, Н.С.Марченков, К.С.Михайлов Твердофазное каталитическое восстановительное дегалоидирование (ТКВД) / в сб.: Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами. Прага, 1977,275-283.

157. U.B. Demirci, F. Garin Kinetic study of n-heptane conversion on sulfated zirconia-supported platinum catalyst: the metal-proton adduct is the active site. // Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2002,188,1-2,233-243.

158. T. Nozoe, K. Tanimoto, T. Takemitsu, T. Kitamura, T. Harada, T. Osawa, O. Takayasu -Non-solvent hydrogenation of solid alkenes and alkynes with supported palladium catalysts. // Solid State Ionics, 2001,141-142,695-700.

159. D.C. Dittmer// Chem. Ind. 1997, 779.

160. K. Tanaka, F. Toda Solvent-Free Organic Synthesis. // Chem. Rev. 2000,100, 3,10251074.

161. Т. Kitamura, Т. Harada Solvent-free reactions of solid substances using solid catalysts: estimation of physical states of substrate-product mixtures by the BET method and the SEM observation. // Green Chemistry, 2000,3,5,252-256.

162. F. Iannone, O. Ursini Solid state catalytic tritiation: Isotopic exchange and tritium addition in high specific activity synthesis. // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 2002,251,3, 363-368.

163. Ю.А.Золотарев, В.С.Козик, Д. А.Зайцев, Е.М. Дорохова, Н.Ф.Мясоедов -Высокотемпературный твердофазный каталитический изотопный обмен новый подход в синтезе кратномеченных изотопами водорода аминокислот. // Докл. АН СССР, 1989, 308,5,1146.

164. Yu.A.Zolotarev, V.Yu.Tatur, D.A.Zaitsev, N.F.Myasoedov Method for prepering biologically active compounds labelled with hydrogen isotope. / US Pat. 5026909 (1988).

165. Yu.A.Zolotarev, V.Yu.Tatur, D.A.Zaitsev, N.F.Myasoedov Preparating biologically active compounds labelled with a hydrogen isotope. / Pat. UK 2229718.

166. Yu.A.Zoiotarev, V.S.Kozic, D.A.Zaitsev, E.M.Dorokhova, N.F.Myasoedov High-Temperature Solid-State Catalytic isotopic Exchange with Deuterium and Tritium. // J. Radioanal. Nucl. Chem. Art., 1992, 162,1, 3.

167. S.G.Rosenberg, Yu.A.Zolotarev. Application of tritium high resolution NMR srectroscopy to analysis of tritium-labelled amino acids and peptides. // Amino Acids, 1992, (3), 95-104.

168. Ю.А. Золотарев, B.C. Козик, Д.А. Зайцев, Е.М.Дорохова, Н.Ф.Мясоедов. -Высокотемпературный твердофазный каталитический изотопный обмен новый подход в синтезе кратномеченных изотопами водорода аминокислот. // Доклады АН, 1989,308, N5, 1146-1150.

169. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozic, D.A. Zaitsev, E.M.Dorochova, N.F. Myasoedov. Tritium incorporation in alpha-amino acids by isotope exchange using high-temperature solid-state catalysis. // J. Labelled Сотр., 1991,29, (5), 507-517.

170. О.А. Klimova, Yu.A. Zolotarev, V.Yu. Chebotarev. The preparation of the soft-tritium labelled proteins and its application for the collagenolytic activity investigation. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993,195 (2), 758-761.

171. Ю.А. Золотарев, E.B. Ласкателев, B.C. Козик, E.M. Дорохова, С.Г. Розенберг, Ю.А. Борисов, Н.Ф. Мясоедов Исследование твердофазного изотопного обмена водорода в L-аланине. // Известия РАН, сер. хим., 1997, (4), 757-762.

172. Ю.А. Борисов, Ю. А. Золотарев, Е. В. Ласкателев, Н. Ф. Мясоедов Квантово-химический расчет модели спилловера водорода на графитовой подложке. // Известия РАН, сер. хим., 1997, (3), 407-409.

173. S. Yamabe, Y. Osamura, Т. Minato An МО study on the structure and the stability of the CH5+(CH4)n cluster (n = 0,1,2, and 3). // J. Amer. Chem. Soc., 1980, 102,2268-2273.

174. А.Б. Ярославцев. Протонная проводимость неорганических гидратов. // Успехи химии, 1994,63,5,449-455.

175. Способ получения меченных тритием альфа-аминокислот. Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф. Авторское свид. СССР N 841255,28.11.1979 Бюлл. изобр. 1981 28.11.1979

176. Л. С. Кошелева Влияние термической и кислотной обработки на структуру цеолита NHjNa-Y по данным ИК-спектроскопии. // Известия РАН, сер. хим., 1995,2,236-240.

177. Е. М. Evleth, Е. Kassab, L. R. Sierra Calculation of the Exchange Mechanism of D2 and CD4 with a Zeolite Model. // J. Phys. Chem., 1994,98,5,1421-1426.

178. Борисов ЮА, Золотарев ЮА, Ласкателев ЕВ, Мясоедов НФ Новые представления о механизме обмена водорода органических молекул с протонами сильнокислых центров. // Известия РАН, сер. хим., 1996,7,1852-1854.

179. Zolotarev YA, Borisov YA, Myasoedov NF. Experimental and ab Initio Studies on Solid-State Hydrogen Isotope Exchange with Spillover Tritium. // J. Phys. Chemistry A, 1999,103,25,4861-4864.

180. D.E. Woon, Т.Н. Dunning Gaussian basis sets for use in correlated molecular calculations. Ш. The atoms aluminum through argon. // J. Chem. Phys., 1993,98,2, 13581371.

181. Золотарев ЮА, Борисов ЮА Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена в оксипролине под действием спилловер-трития. // Известия РАН, сер. хим., 1999,6,1051-1055.

182. Peterson G.L. Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry,

183. Rosebrough, Farr and Randall. // Anal. Biochem., 1979,100,2,201-220.

184. Roothaan C.C.J. New Developments in Molecular Orbital Theory // Rev. Mod. Phys., 1951,23,69-75.

185. Peng C., Schlegel H.B. // Isr. J. Chem., 1993,33,449-453.

186. Frisch M.J., Foresman J.B., Frisch A. // Gaussian 92, Gaussian. Inc., Pittsburgh. (PA). 1993.

188. Dupius M., Spangler D., Wendolowski J.J.//Nat. Resour. Comut. Chem. Software Cat. 1. Prog. QG01 (GAMESS). 1980.

189. Koradi R, Billeter M, Wuthrich К MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures // J Mol Graphics, 1996,14,51-57.

190. Guddat L.W., Martin J.A., Shan L., Edmundson A.B., Gray W.R. Three-dimensional structure of the alpha-conotoxin GI at 1.2 A resolution. // Biochemistry, 1996,35,1132911335.

191. Maslennikov I.V., Sobol A.G., Gladky K.V., Lugovskoy A.A., Ostrovsky A.G., Tsetlin V.I., Ivanov V.T., Arseniev A.S. Two distinct structures of alpha-conotoxin GI in aqueous solution. // Eur. J. Biochem., 1998,254,238-247.