Синтез и исследование меченых тритием аминокислот, пептидов и белков с использованием твердофазных реакций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ЗОЛОТАРЕВ Юрий Александрович

Синтез и исследование меченных тритием аминокислот,

пептидов и белков с использованием твердофазных реакций.

(02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных соединений и физиологически активных веществ;)

ш ^ .....

1 дофрЬа химических нам в форме научного доклада,

Моск(

ДИССЕРТАЦИЯ .....

на соискание ученой степени доф/фа хкми^еских наук

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики Российской Академии Наук

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Федосеев В.М. дою-ор химических наук, профессор Шишков А.В. доктор химических наук, Уткин Ю Н.

5М-9

Ведущая организация: Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук.

Защита состоится "25' НО$,Ър£ 1998 г. на заседании Диссертационного Совета Д.002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117871, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ г"'-' Автореферат разослан "£/" к

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.002.35. ' при ИБХ РАН, доктор химических н£..<

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Белки, пептиды и аминокислоты являются основой жизнедеятельности всех организмов. В основе функционирования многих важнейших процессов, происходящих в живой клетке, лежат белок-белковые взаимодействия и комплексообразование белков с низкомолекулярными лигандами пептидной и аминокислотной природы. Успех в исследовании этих процессов во многом определяется наличием соответствующих меченых препаратов. Особую ценность представляют биологически активные меченные тритием соединения. Это связано с тем, что водород присутствует во всех органических соединениях, а замещение его на изотопные атомы не приводит к изменению химической природы. Тритий выгодно отличается от многих других радиоактивных элементов своими ядерными свойствами. Он является мягким р-изяучателем с энергией 18 КэВ и удобным для использования периодом полураспада, составляющим 11,2 года. Развитие современных методов детектирования трития делает использование меченных тритием соединений еще более эффективным. Особую ценность для исследования связывания пептидных регуляторов клеточных процессов представляют кратномеченные тритием препараты. Использование этих соединений делает возможным повысить чувствительность методов, основанных на их использовании.

8 качестве препаративных методов для получения кратномеченных тритием аминокислот, пептидов и белков получили применение лишь немногие методы. Такие меченые аминокислоты и пептиды получают, в основном, гидрированием ненасыщенных соединений или дегалоидированием гапогенсодержащих соединений-предшественников в растворе газообразным :;этием в присутствии катализаторов платиновой группы. Основным способом получения меченных тритием белков является их химическая модификация с «пользованием низкомолекулярных меченных тритием соединений. При этом алчченый препарат уже не полностью химически соответствует исходному белку, поэтому возможно различное поведение меченых и нативных макромолекул при •Фо^графии и комплексообразовании. В случае пептидов наиболее ^|?!1ными оказываются препараты, содержащие метку по тирозиновому остатку, рые получают дегалоидированием соответствующего ди-иодтирозинового

производного. Это накладывает ограничения на доступность меченых тритием пептидов, не содержащих тирозинового остатка, и на предельную величину молярной радиоактивности меченого препарата. Использование соединений-предшественников, имеющих кратные связи на месте хиральных углеродных атомов меченой аминокислоты, делает необходимым проведение разделения меченых рацематов на оптические изомеры. Реакции каталитического гидрогенолиза в растворе позволяют вводить в большинство аминокислот не более 2-3 атомов трития. Известные методы не позволяли значительно повысить молярную радиоактивность препаратов аминокислот и пептидов, а равномерно меченные тритием соединения были недоступны.

В Лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных соединений реакция твердофазного каталитического восстановительного дегалоидирования была впервые использована для получения меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот4. Твердофазные реакции аминокислот, пептидов, белков и их производных с активированным водородом были выбраны в качестве объекта данного исследования. Как было показано в наших исследованиях, твердофазные реакции гидрирования и изотопного обмена биоорганических соединений происходят с участием активированного на катализаторе спилловер-водорода (CB)f Несмотря «а то, что процессы, основанные на использовании СВ известны уже более 30 лет, нет общепринятого мнения о природе этих активированных частиц и механизме реакций с их участием. Поэтому представляется актуальным проведение исследования реакционной способности биоорганических соединений, выяснение основных закономерностей и механизма твердофазных реакций с участием спилловер-трития.

В связи с выше изложенным, представляется актуальным исследование твердофазных реакций гидрирования и изотопного обмена. Кроме того, данные, полученные в ходе выполнения этих исследований, позволили достичь увеличения молярной радиоактивности меченых соединений и создания универсальных методов синтеза биологически активных соединений. Данная работа является частью плановой тематики Лаборатории изотопно-замещенных

* N.F. Myasoedov, et al, in Org. Сотр. Labeled by Radioisitopes, Prague, CKAE1977, p. 275

* P A. Sermon, Catalysis Reviews. 1973, 8, 211

физиологически активных соединений ИМГ Российской АН {Тема 1.4 плана НИР Института) и выполнялась в соответствии с постановлениями ГКНТ, Президиума АН, в рамках фундаментальных научных исследований по программам "Геном человека" и "Биоген". Исследование поддержано грантами Российского Фонда фундаментальных исследований и Международным научным фондом.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось:

исследование основных закономерностей твердофазных каталитических реакций гидрирования и изотопного обмена водорода в биоорганических соединениях.

определение реакционной способности водородных атомов в твердых биоорганических соединениях по отношению к активированному на катализаторе спилловер-водороду.

выяснение механизма реакции изотопного обмена водорода в твердом биоорганическом соединении со спилловер-тритием с использованием ab initio квантово-химического расчета этой реакции.

разработка препаративных методов получения изотопно-меченных аминокислот, пептидов и белков с использованием реакций твердофазного каталитического гидрирования и изоТЬпного обмена газообразным тритием.

исследование характеристик изотопно-меченных соединений, полученных с использованием твердофазных реакций. Для этого разрабатывались изотопомерный анализ меченых соединений, основанный на применении спектроскопии тритиевого ЯМР, и высокоселективные лигандообменные хроматографические процессы, применяемые для разделения на оптические изомеры меченных тритием аминокислот.

Научная новизна.

Впервые проведено целенаправленное комплексное исследование твердофазных каталитических реакций, используемых для получения кратно-меченных тритием препаратов, что составило основу нового научного направления в химии изотопно-модифицированных соединений. Разработан метод.высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), позволивший впервые синтезировать равномерно меченные тритием, органические соединения. Ранее такие соединения были недоступны. Обнаружено*

и исследовано явление изотопного уравновешивания водорода газовой фазы и водородных атомов в молекуле твердого органического соединения, позволившее впервые получить аминокислоты и пептиды с практически полным замещением водорода на тритий. Впервые в исследовании твердофазных реакций использован тритиевый ЯМР и квантово-химические расчеты, что позволило определить механизм реакции ВТКИО. Показано, что изотопный обмен в твердофазных реакциях может быть описан как синхронный перенос водорода между насыщенным углеродным атомом и модельным кислотным центром. При этом образуется переходное состояние с пентакоординированным углеродным атомом, а легкость его образования определяет реакционную способность С-Н связей в биоорганических соединениях по отношению к спилловер-водороду. В спектроскопии тритиевого ЯМР аминокислот и пептидов были определены константы спин-спинового взаимодействия и изотопные химические сдвиги, что явилось основой для разработки метода суперпозиции теоретических мультиплетов (СТМ), используемого для анализа состава сложных смесей изотопомеров в препарате меченного тритием соединения. Метод СТМ и данные хроматомасс-спектроскопии были использованы для определения состава изотопомеров соединений, меченных тритием и дейтерием. Анализ изотопомеров меченных тритием соединений позволил получить ценную информацию об особенностях твердофазных реакций. Определены основные физико-химические закономерности твердофазных реакций изотопного обмена и гидрирования. Получены экспериментальные данные о реакционной способности органических соединений со спилловер тритием, проведено квантово-химическое моделирование этого взаимодействия и сделано предположение о природе этого явления.

Практическая значимость работы.

На основе проведенных исследований разработаны методы синтеза кратномеченных тритием соединений, что позволило получить меченные тритием аминокислоты и пептиды по своим основным свойствам не уступающие, а в ряде случаев и превосходящие препараты ведущих фирм производителей изотопной продукции. Впервые получены равномерномеченные тритием аминокислоты и кратномеченные тритием пептиды с изотопной меткой во всех аминокислотных фрагментах. Равномерно меченный тритием валин был использован в качестве мишени для физико-химических исследований по определению массы нейтрино.

4

Кратномеченные тритием пептиды были использованы для проведения исследований по фармакокинетике и рецепторному связыванию. Для хроматографического разделения рацематов меченных тритием аминокислот были синтезированы хиральные сорбенты на полистирольном и полиакриламидном каркасах. Приоритет разработанных технологий защищен патентами России, США, Англии и Франции. Практическая реализация разработанного направления позволила внедрить технологии высокомеченных тритием соединений на экспериментально-производственной базе ИМГ РАН и на 2-ом опытном заводе ГИПХ на 64 меченный тритием препаратов, значительная часть которых поставлялись через В.О. "Изотоп".

Автор защищает созданное научное направление в химии изотопно-модифицированных соединений, основанное на использовании твердофазных каталитических реакций с активированным тритием:

1. Высокотемпературный твердофазный каталитический обмен является универсальной реакцией, позволяющей получать кратномеченные тритием соединения различных классов. Замещение водорода на изотопный атом происходит при сохранении конфигурации асимметрических углеродных атомов в физиологически активных соединениях.

2. В твердофазных каталитических реакциях изотопного обмена и гидрирования принимает участие спилловер-водород, генерируемый металлом-катализатором платиновой группы. Феномен спилловера водорода представляет протон-электронную пару, мигрирующую по поверхности неорганического носителя, что и является причиной наблюдаемой корреляции - реакционная способность водорода в реакции ВТКИО тем выше, чем выше квантово химически рассчитанное сродство к протону для связанного с ним С-атома аминокислоты. Пространственное разнесение твердого органического соединения и металла-катализатора позволяет повысить химический выход меченого соединения.

3. Твердофазный изотопный обмен при температуре 180°С и выше сопровождается явлением изотопного уравновешивания атомов водорода твердого органического соединения и трития газовой фазы, при этом степень замещения 1Н на 3Н в меченом органическом соединении определяется только соотношением этих изотопных атомов в системе. В условиях изотопного уравновешивания получаются равномерномеченные тритием соединения.

4. Механизм реакции ВТКИО представляет одноцентровый синхронный обмен водорода твердого органического соединения на тритий кислотного центра, при этом реакция проходит через переходное состояние с пятикоординированным С-атомом и химической связью между обменивающимися атомами 1Н и 3Н. Исследованный механизм обуславливает наблюдаемую антибатную зависимость -способность H в соединении к замещению тем выше, чем ниже квантово химически рассчитанная Еакг реакции обмена водорода.

Апробация работы.

г

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 19 всесоюзных и международных конгрессах, конференциях, симпозиумах и конференциях, в том числе: на Международном симпозиуме "Прогресс в хроматографии' (Карлсбад, ЧССР, 1979), на 6-ом Международном симпозиуме "Достижения в хроматографии" (Братислава, ЧССР, 1980), на 1-ом Всесоюзном совещании по получению и выделению радиоактивных изотопов (Ташкент, 1980), на 12 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Баку, 1981), на 2-м Симпозиуме стран СЭВ по получению меченных тритием соединений (Ленинград,1981), на международной конференции "Селективные сорбенты" (Прага, ЧССР, 1982), на Всесоюзной конференции "Биологически активные пептиды" (Рига, 1983), на 11-ой Радиохимической конференции (Марианские Лазне, ЧССР, 1987), на 3-ем, 4-ом, 5-ом, 6-ом Международных симпозиумах "Синтез и использование изотопно-меченных соединений (Инсбрук, Австрия, 1988; Торонто, Канада, 1991; Страсбург, Франция, 1994; Филадельфия, США, 1997), на 1-ом, 2-ом, 3-ем Всесоюзных совещаниях по проблеме "Биологически активные соединения, меченные радиоактивными соединениями" (Звенигород, 1985, 1988, 1991), на 2-ом, 3-ем Международном конгрессе по аминокислотам, пептидам и аналогам (Вена, Австрия, 1991, 1993), на 2-ой Конференции "Современные тенденции в химической кинетике и катализе" (Новосибирск, 1995), на 18-ой ежегодной конференции по теоретической химии (Лас Вегас, США, 1996).

Публикации.

Основные результаты исследований по материалам диссертации опубликованы в 58 работах, представлены в 16 российских и иностранных патентах.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ 1. Введение.

При взаимодействии газообразного водорода с нанесенными катализаторами металлов платиновой группы происходит миграция водородных атомов, связанных с поверхностными атомами металла, на носитель. Этот эффект был назван спилловером водорода (СВ). СВ отличается высокой реакционной способностью к гидрогенолизу органических и неорганических соединений. Впервые СВ был обнаружен при восстановлении трехокиси вольфрама до вольфрамовой бронзы при комнатной температуре3

В Лаборатории изоюпнозамещенных физиологически активных соединений ИМГ РАН предложено использовать твердофазные реакции для получения меченных изотопами водорода органических соединений. В качестве объекта данного исследования были выбраны реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО) и твердофазного каталитического гидрирования (ТКГ). На момент начала данного исследования в литературе отсутствовали данные по теоретическому исследованию механизма реакции между твердым органическим соединением и СВ. В ходе исследования было показано, что твердофазные реакции обладают рядом интересных особенностей. Реакция ВТКИО обладает высокой стереоселективностью. Замещение атома водорода на изотопный происходит с сохранением конфигурации асимметрических углеродных атомов. Это позволяет в ряде случаев достичь практически полного замещения водорода на изотопный атом с сохранением высокой оптической чистоты биоорганического соединения. Региоселекгйвность распределения изотопной метки при твердофазном каталитическом изотопном обмене отличается от наблюдаемой при жидкофазных каталитических процессах и при твердофазном изотопном обмене под действием атомизированного трития. Причиной такой различной реакционной способности водорода в органических соединениях является различие в механизмах этих реакций. Реакция ТКГ также может протекать с высокой стереоселективностью, сопровождаясь в ряде случаев значительным изотопным обменом. При этом общее включение трития в молекулу , при гидрогенолизе кратных связей может значительно превысить стехи�