Синтез меченных тритием стероидных гормонов и пептидов для определения их содержания, распределения и метаболизма в биологических объектах in vivo тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

ШЕВЧЕНКО Константин Валерьевич

СИНТЕЗ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ И ПЕПТИДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ СОДЕРЖАНИЯ, РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И МЕТАБОЛИЗМА В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ОБЪЕКТАХ ш viv¿

(02 00 10 - Биоорганическая химия 02 00 14 - Радиохимия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

□□ЗОВ 13 11

003061311

Работа выполнена на кафедре Биотехнологии Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им М В Ломоносова и Институте молекулярной генетики РАН

Научный руководитель кандидат химических наук

Научный консультант академик РАМН, доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор кандидат химических наук, доцент Ведущая организация

Нагаев Игорь Юлианович

Швец Виталий Иванович

Василенко Иван Александрович

Бадун Геннадий Александрович

Институт биоорганической химии им акад ММ Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Защита состоится " 17 " сентября 2007 г в 15 часов на заседании диссертационного совета Д212 12001 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им MB Ломоносова по адресу 119571, г Москва, пр Вернадского, д 86 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www mitht ru

Автореферат разослан " " U/Q/tSL 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212 12001,

канд химических наук Лютик А И

li/u

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Одной из важнейших задач, связанных с развитием фармакологии, является установление связи между строением органического соединения и его функцией Решение ее позволит определить структуру новых лекарственных средств с заранее заданными свойствами Успехи в изучении роли биологически активных соединений в различных биологических процессах в значительной мере определяются доступностью меченых аналогов этих соединений Среди меченых препаратов особое место занимают соединения, меченные тритием, т к тритий обладает ценными ядерно-физическими свойствами (достаточно большой период полураспада, низкая радиотоксичность, высокая молярная радиоактивность) Синтез меченных тритием органических соединений, в том числе различных стероидов и пептидов, открывает новые возможности для быстрого и надежного способа их обнаружения в различных биологических образцах, т к предел обнаружения составляет 10 14 М

Для введения трития в стероидные гормоны и пептиды можно использовать как жидкофазные и твердофазные методы, так и реакции изотопного обмена с газообразным тритием и тритиевой водой В данной работе наиболее часто для получения этих меченых препаратов использовалось гидрирование ненасыщенных предшественников стероидов, аминокислот и пептидов в атмосфере газообразного трития

Полученные перечисленными выше способами соединения использовали для разработки методов определения концентрации эндогенных биологически активных соединений в биологических пробах, а также содержания неприродных пептидов ln vivo

Получение меченных тритием стероидных гормонов и пептидов является актуальной задачей в связи с большим интересом к физиологической роли этих соединений Использование этих меченых препаратов для быстрого определения их содержания в биологических образцах представляет самостоятельный интерес в связи с актуальностью исследования метаболизма подобных препаратов при разработке новых лекарственных средств

Работа поддержана грантами 05-04-08132 офи-а. № И-0707. НШ-2150 2003 4. НШ-5638 2006 4

Цель исследования

Целью настоящей работы являлось

Синтез меченных тритием аминокислот, пептидов и стероидов и их использование для определения концентраций этих веществ в биологических объектах т vivo методом изотопного разбавления, а также исследование фармакокинетики и метаболизма семакса

Диссертация посвящена решению следующих задач

1 Отработка условий получения меченных тритием стероидных гормонов, аминокислот и пептидов с молярной радиоактивностью, необходимой для проведения биологических исследований

2 Разработка методов определения концентраций 5а- и 5Р-изомеров дигидропрогестерона и "свободного" тафтцина в биологических пробах с использованием их меченных тритием аналогов и флуоресцентных производных

3 Получение селективномеченного тритием по С-концевому пролину семакса для количественной оценки проникновения семакса в мозг при интраназальном введении

4 Исследование фармакокинетики и метаболизма семакса в мозге и его отделах, а также распределения семакса между отделами мозга

Научная новизна

Разработаны методы определения концентрации стероидных гормонов и пептидов в биологических пробах и выявлен ряд закономерностей, связанных с использованием лекарственных препаратов Предложен новый носитель - волокнистый углерод, использование которого позволило впервые ввести метку в лабильные, в условиях синтеза, соединения, а также повысить молярную радиоактивность ряда меченых препаратов Впервые получены селективно-меченные по пролину пептиды, относящиеся к классу глипролинов, необходимые для проведения биологических исследований, что позволило впервые определить содержание семакса и его метаболитов in vivo

Практическая значимость работы

Разработаны методы получения Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-L-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2, Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-D-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2, [0-3Н]диазепама, [0-3Н]этомидата, Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-L-[3,4-3H]Pro-Ile, [0-3Н]фенилаланина, 9а-фторо-16а-гидрокси-[0-3Н]преднизолона ([0-3Н]кеналога), [3,4-3Н]пролина, [С-3Н]эстрона, [С-3Н]эстрадиола, [0-3П]эстропсульфата, [1,2-3Н]андрост-4-ен-3,17-диона, [1,2-3Н]прогестерона, [С-3Н]тафтцина, 5а- и 5Р-[4,5-3Н]дигидропрогестеронов, [1-3Н]андрост-4-ен-3,17-диона, Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-[3,4-3H]Pro, Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-[3,4-3H]Pro Проведенные исследования позволили дать практические рекомендации по выбору оптимальных катализаторов, составу реакционной смеси, условий проведения реакций Основываясь на выявленных закономерностях, удалось вводить метку в лабильные соединения и повысить молярную радиоактивность меченых препаратов Отработаны методики определения концентрации тафтцина, семакса и стероидных гормонов в биологических пробах с чувствительностью до 2-3 нг/мл

Апробация

Основные положения работы докладывались на научных семинарах лаборатории изотопно-меченных физиологически активных веществ Института молекулярной генетики

РАН и совместных семинарах с сотрудниками МГУ им M В Ломоносова Также работа докладывалась на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (г Москва, 2003 гиг Санкт-Петербург, 2005 г ) и на 8 Международном симпозиуме по "Синтезу и применению изотопов и изотопномеченных соединений" (г Бостон, США, 2003 г )

Публикации

По теме диссертации опубликованы 18 научных работ, в том числе 7 тезисов и 1 патент

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из 4 глав (введение, литературный обзор, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы, содержащего 331 работу Работа изложена на 158 стр текста и содержит 57 таблиц и 27 рисунков

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Так как целью работы является количественная оценка содержания эндогенных стероидных гормонов и пептидов в биологических объектах, а также определение содержания и метаболизма экзогенных продуктов, необходимо было получение их радиоактивномеченных аналогов Известно, что содержание этих физиологически активных соединений в биологических образцах крайне низко Поэтому необходимо получать радиоактивномеченные аналоги с высокой молярной радиоактивностью Этому критерию соответствуют препараты, меченные тритием, т к включение в молекулу органического соединения одного атома трития соответствует радиоактивности примерно 30 Ки/ммоль (I 1 ПБк/моль), что дает возможность при молярной радиоактивности 1 1 ПБк/моль определять на счетчике LKB1215 PackBeta ~ 0 003 пмоль вещества Кроме того, так как период полураспада трития составляет примерно 12 5 лет, с препаратами, меченными тритием, удобно работать, они стабильны даже в течение самого длительного эксперимента Для количественного определения эндогенных продуктов нами использовался метод изотопного разбавления, при использовании которого содержание соединения рассчитывается по следующей формуле

C=M/V,

где С - концентрация эндогенного соединения, V - объем взятой пробы (мл),

M=(A/MRo)*MW*(MRo/MR-l),

А - активность меченого соединения, добавленного в пробу, [мкКи]

MW - молекулярный вес эндогенного соединения,

MR - конечная молярная радиоактивность меченого соединения после добавления в

пробу [Ки/ммоль]

MR0 - исходная молярная радиоактивность меченого соединения до добавления в пробу [Ки/ммоль]

Суть данного метода заключается в уменьшении молярной радиоактивности меченого аналога за счет его разбавления немеченым эндогенным соединением из биологической пробы Очевидно, что чем больше в биологическом образце данного стероидного гормона или пептида, тем меньше будет итоговая молярная радиоактивность смеси этого вещества с его меченым аналогом и, следовательно, больше будет отношение MRo/MR Кроме использования высокомеченных аналогов для расчета MR необходимо точное определение количества этих соединений в пробе В том случае, когда оптическое поглощение препаратов было недостаточным, необходимо было получение их флуоресцентномеченных производных

При использовании экзогенного пептида - семакса необходимо было получить его меченый по С-концевому пролину аналог, так как метаболизм в мозге происходит преимущественно за счет аминопептидаз Такой меченый препарат позволяет проследить весь метаболизм семакса, при этом все метаболиты имеют одинаковую молярную радиоактивность, что позволяет количественно определять содержание семакса и его метаболитов в биологических пробах Кроме того, при использовании меченого по С-концевому пролину семакса, общую картину не искажают и продукты, которые образуются под воздействием карбоксипептидаз (метка содержится только в пролине) Преимущества используемого меченого препарата позволили впервые оценить содержание семакса и его метаболитов in vivo в мозге крысы после его интраназального введения

Для решения первой задачи — введения тритиевой метки в искомые соединения — использовались хорошо известные и широко применяемые методы1 (жидкофазный, твердофазный метод и изотопный обмен с тритиевой водой), общие методики которых приведены ниже

Общая методика введения трития жидкофазным методом (проведение реакции меяеду раствором органического соединения и газообразным тритием):

Для проведения реакции в ампулу помещали катализатор, раствор исходного соединения и магнитную мешалку в полиэтиленовой или тефлоновой оболочке Содержимое ампулы замораживали жидким азотом, вакуумировали до остаточного давления 0 1 Па и заполняли газообразным тритием до 300-400 гПа Реакцию вели при 20-25°С и перемешивании в течение 0 25-20 ч Содержимое ампулы вновь замораживали жидким азотом и вакуумировали После удаления избыточного трития гетерогенный катализатор отфильтровывали и промывали растворителем Лабильный тритий удаляли многократным упариванием реакционной массы с протонными растворителями (как правило, с метанолом или водой)

1 В П Шевченко, И Ю Нагаев, Н Ф Мясоедов//Успехи химии Т 68 N 10 С 944 (1999)

Общая методика введения трития изотопным обменом с тритиевой водой

В одну из двух секций реакционной ампулы помещали PdO, 5% Pd0/Al203 В другую секцию помещали раствор исходного соединения в смеси диоксана с триэтиламином (10 1) и замораживали жидким азотом Затем реакционную ампулу вакуумировали до давления 0 1 Па, заполняли газообразным тритием При нагревании секции, в которой находились катализаторы (70°С, 10 мин), происходило восстановление окиси палладия с образованием изотопномеченной воды, которая конденсировалась в секции, охлаждаемой жидким азотом Затем удаляли избыток трития вакуумированием Охлаждение переносили на секцию, содержащую катализаторы, и переносили в нее раствор органического соединения с изотопномеченной водой Секцию ампулы с реакционной смесью запаивали и нагревали в термостате Потом ампулу вновь замораживали жидким азотом, вскрывали, растворители и изотопномеченную воду отгоняли в специальный приемник, а остаток растворяли в метаноле Катализаторы отфильтровывали, промывали метанолом, лабильный тритий удаляли упариванием фильтратов с метанолом

Общая методика введения трития твердофазным методом (проведение реакции

без растворителя при нагревании):

Для проведения реакций на первой стадии осуществляли нанесение вещества на катализатор Для этого проводили лиофилизацию, если вещество растворимо в воде, или упаривание смеси катализатора с раствором вещества на роторе с последующим удалением следов растворителя вакуумированием Затем катализатор с адсорбированным на нем веществом переносили в реакционную ампулу Такая методика позволила повысить молярную радиоактивность искомого препарата, так как при приготовлении смеси непосредственно в реакционной ампуле часть исходного соединения остается на ее стенках и при проведении тритиирования не вступает в соответствующие реакции Далее реакционную ампулу вакуумировали при комнатной температуре и заполняли газообразным тритием до давления 300-400 гПа Реакцию вели при нагревании (до 280°С) в течение 5-180 мин Избыточный тритий удаляли вакуумированием, содержимое ампулы растворяли в растворителе, содержащем метанол или воду, гетерогенный катализатор отфильтровывали, а лабильный тритий удаляли многократным упариванием реакционной массы с протонными растворителями

Если при использовании последнего метода молярная радиоактивность оказывалась недостаточно высокой, повысить молярную радиоактивность препарата удавалось при использовании дополнительных носителей В этом случае вещество упаривали с инертным носителем, который затем механически смешивали с катализатором При использовании этой модифицированной методики, твердофазный изотопный обмен удавалось осуществлять при более высокой температуре, что приводило к получению более высокомеченных препаратов

Анализ и препаративную очистку меченых препаратов осуществляли методом тонкослойной (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографий (ВЭЖХ) с использованием внешних стандартов, как правило не менее чем в двух системах Использование детектора по радиоактивности в данном приборе позволяло контролировать чистоту меченых препаратов и точно идентифицировать распределение искомых продуктов в биологических пробах

В данной работе при проведении твердофазных реакций, впервые, в качестве дополнительного носителя использован волокнистый углерод (ВУ) При этом оказалось, что один и тот же дополнительный носитель, в данном случае уголь, приготовленный по разным методикам, может существенно влиять на степень изотопного обмена и устойчивость субстрата(табл 1)

Таблица 1 Влияние на относительную молярную радиоактивность (ОМР) (за 100% принята максимальная молярная радиоактивность в данной серии экспериментов) и выход Ь-фенилаланина различных модификаций метода твердофазного каталитического изотопного обмена (время реакции - 25 мин, температура - 130 С)

Катализатор Носитель Выход, % ОМР, %

5% Pd/C - 1 -

5% Pd/C С (норит) <0 1 -

5% Pd/C С(ВУ) 16 100

5% Pd/СаСОз С (норит) 2 29

5% Pd/СаСОз С(ВУ) 39 44

5% Pd0/Al203 С (норит) 1 5 17

5% Pd0/Al203 С(ВУ) 41 35

5% Pd0/BaS04 С (норит) 2 22

5% Pd0/BaS04 С(ВУ) 35 47

Оказалось, что в случае использования 5% Pd/C выход фенилаланина составлял только 1%, а для смеси 5% Pd/C с углеродом фирмы "Норит", на который был нанесен фенилаланин, выход был еще ниже - 0 1% Большего выхода и молярной радиоактивности удалось получить при использовании волокнистого углерода Аналогичные результаты были получены при смешении систем ВУ-фенилаланин с 5% Pd/CaC03, 5% Pd0/BaS04 и 5% Pd0/Al203 (табл 1) Выходы фенилаланина при использовании ВУ были в 15-20, а молярные радиоактивности в 1 5-2 раза выше, чем для обычно используемого активированного угля "Норит" Причины подобного явления связывают с тем, что ВУ состоит из очень маленьких графитовых слоев, шириной 30-500 ангстрем, уложенных в высоко упорядоченные структуры2 Поэтому этот материал адсорбирует на порядок больше водорода, чем обычный углерод Кроме того, наблюдались существенные отличия в количестве водорода, адсорбированного и десорбированного при комнатной температуре из графитовых нановолокон, что предполагает наличие хемосорбции водорода Это было подтверждено методом температурно-программированной десорбции Кроме того, поскольку для полной

2 A Chambers,С Park.R Тепу,К Baker,NM Rodriguez //JPhysChem В , Vol 102, P 4253(1998)

десорбции требуется высокая температура, можно сделать вывод, что для такого прочного удерживания водорода необходимо химическое связывание3 Не удивительно, что такие свойства ВУ дают определенные преимущества по сравнению с использованием других носителей Большее насыщение молекулами трития всего объема реакционной массы должно положительно сказаться и на эффективности спилловера этого изотопа водорода и на увеличении концентрации активированных частиц трития непосредственно в зоне реакции Более высокий выход меченых органических соединений позволяет получать приемлемый выход для меченых препаратов при более высокой температуре (на 35-45°С выше, чем при стандартной методике) Последнее обстоятельство делает возможным значительно повысить их молярную радиоактивность (рис 1)

Температура, °С

Рисунок 1 Зависимость выхода и молярной радиоактивности (за 100% принималась максимальная молярная радиоактивность в данной серии экспериментов) Ь-фенилаланина от температуры (условия аналогичны приведенным в таблице 2) ■-■-■выход фенилаланина, ^ -относительная молярная радиоактивность

Как видно из приведенных данных, молярная радиоактивность при температуре 175°С возрастает примерно в три раза, что соответствует молярной радиоактивности порядка 1 11 ПБк/моль Падение молярной радиоактивности при дальнейшем повышении температуры вероятно связано с глубокой деструкцией фенилаланина и разбавлением трития протаем, образовавшимся при разложении фенилаланина

При использовании в качестве исходного соединения пролина, который был необходим для синтеза семакса, получен меченый препарат с молярной радиоактивностью примерно 0 8 ПБк/моль (табл 2)

1. Синтез меченных тритием стероидов

Метку в стероидные препараты вводили жидкофазным гидрированием двойных связей, твердофазным изотопным обменом, а также изотопным обменом с тритиевой водой

Первым методом синтезировали 5а-[4,5-3Н]прегнан-3,20-дион и 5р-[4,5-3Н]прегнан-3,20-дион, которые выполняют в живых организмах ряд функций, связанных с репродукцией (табл 3)

3 N Hitoshi, Y Toraoyuki, О Yosuke, Y Makoto, I Junichi, Y Masatoshi //Analytica Chimica Acta, 1997, v 344, p 233-240

Таблица 2 Выходы и молярные радиоактивности меченых препаратов с

использованием волокнистого углерода в качестве носителя

Соединение Условия реакции Выход, % Моляр радиоакт, ПБк/моль

О гА" Пролин 5%Pd/BaS04, 190° С, 7 5 мин 18-20 0 80-0 82

о N Фенил аланин 5% Pd/C, 140°С, 15 мин 16 0 45

Селективным гидрированием получены меченые прогестерон и андрост-4-ен-3,17-дион На первой стадии этого синтеза при использовании относительно простой методики получали предшественники, содержащие дополнительную С^Сг связь (обработка исходных стероидов 2,3-дихлоро-5,6-дициано-1,4-бензохиноном при кипячении в бензоле) Затем С]=С2 связь гидрировали в присутствии (РЬ3Р)3ЯЬС1 (соотношение катализатора и стероида -1 1 или 2 1, время реакции - 1-12 ч, в качестве растворителя использовали бензол, этилацетат или диоксан) Оптимальным оказалось использование диоксана Природа стероида сильно влияла на скорость гидрирования, например, через 2-3 ч реакции выход меченого андрост-4-ен-3,17-диона составил лишь 20%, в то время как дегидропрогестерон восстанавливался на 95% Поэтому время реакции в случае синтеза меченого андростендиона пришлось увеличить до 6-8 ч Все молярные радиоактивности меченых стероидов, полученных гидрированием С1=С2 связи оказались сопоставимы (рис 2)

Для проведения онкологических исследований в лаборатории биохимии опухолей НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН был необходим меченый андрост-4-ен-3,17-дион, содержащий метку только в первом положении Это связано с тем, что наиболее простой и надежный метод определения активности ароматазы основан на измерении радиоактивности тритиевой воды, образующейся при превращении [3Н]андростендиона в эстрон4 Поэтому для таких биологических исследований предпочтительно использовать [1-3Н]андростендион, который в ходе данной ферментативной реакции превращается в немеченый эстроген с образованием тритиевой воды, а непрореагировавший меченый андростендион легко отделяется Таким образом, измеряя радиоактивность тритиевой воды, легко определить активность ароматазы Синтез [1-3Н]андростендиона проводили выдерживанием [1,2-3Н]андрост-4-ен-3,17-диона 10 ч в щелочном растворе (рис 2)

Очевидно, что ввести дополнительную двойную связь в эстрадиол вышеприведенными методами нельзя Кроме того, для биологических исследований данный меченый препарат

4 L М Bershtein, D Vasilyev, A Kovalevsky et all //Exp Oncology -2003 -25(3) -p 228-230

необходимо было получить с молярной радиоактивностью 3-4 ПБк/моль, что при использовании жидкофазных методов невозможно

■Н]Н

Борогидрид натрия, НО' этанол, 15 мин, 0°С, [Щ]эстрадиол

30 мин, 23°С

5% Г<Ь/А1203,

180°С, 15 мин [Зщэстрон

(5 58 ПБк/моль)

(3 52 ПБк/моль) Н3С„

Эстрон

Комплекс 80з-пиридин, пиридин, 12 ч, 23°С,

Н3С0 (РЬ3Р)3КЬС1:

Н ]

ГнТ1

о"

0=6=0 6н

[3Н] эстронсульфат Н3С

ЫаОН,

МеОН Н20 (5 1), 3Н 5-10 ч, при 20°С

Андроста-1,4-диен -3,17-дион

О^СНз

[1,2-3Н]андрост-4 -ен-3,17-дион (1 6-2 4 ПБк/моль) СЦ

(РЬ3Р)зКЬС1, диоксан, 20°С, ЗН3Н 3 ч

сн,

.н,с

нтн

сг

1,2-Дегидро-прогестерон

О

[1,2-3Н] прогестерон (1 3-1 5 ПБк/моль)

[1-3Н]андрост-4 -ен-3,17-дион (О 8-0 9 ПБк/моль) СН3 Рисунок 2 Получение меченных тритием [С-3Н]эстрона, [С-3Н]эстрадиола, [С-3Н]эстронсульфата, [ 1,2-3Н] Андрост-4-ен-3,17-диона, [ 1 -3Н] Андрост-4-ен-3,17-диона, [ 1,2-3Н)Прогестерона

Твердофазный метод введения метки проводили, обрабатывая эстрон, нанесенный на 5%КЬ/А1203, при 150-210°С газообразным тритием (рис 2) С ростом температуры выход уменьшался с 67 до 41%, а молярная радиоактивность эстрона возрастала примерно в четыре раза Однако восстановления кетогруппы в этих условиях не происходило, т е меченый эстрадиол не образовывался Поэтому после введения метки в эстрон его восстанавливали борогидридом натрия до эстрадиола (рис 2)

Интересно, что при восстановлении молярная радиоактивность уменьшалась в 1 7 раза, что, по-видимому, связано с удалением трития из альфа-положений кетогруппы за счет кето-енольной таутомерии, что наблюдалось и при удалении трития из 2-положения [1,2-3Н]андрост-4-ен-3,17-диона щелочным гидролизом (рис 2)

Для лаборатории биохимии опухолей НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, в которой проводилось определение активности эстронсульфатазы был синтезирован [G-3Н]эстронсульфат Сульфатирование меченого эстрона проводили по модифицированному методу,5 используя в качестве реагента комплекс БОз-пиридин (рис 2) При этом оказалось, что при очистке образовавшегося меченого препарата необходимо было использовать не только метод ВЭЖХ, но и ТСХ, так как многие примеси, например, эстрадиолсульфат, можно гарантировано отделить только методом ТСХ

Для Московского НИИ глазных болезней им Гельмгольца изотопным обменом с тритиевой водой получен меченый кеналог (ацетонид 9а-фторо-16ос-гидроксипреднизолона), который легко гидрируется газообразным тритием В результате выход меченого препарата составил 22%, молярная радиоактивность 0 05 ПБк/моль, радиохимическая чистота 97-99% (табл 3)

2. Синтез меченных тритием пептидов

Необходимые предшественники для получения меченых пептидов синтезированы в секторе регуляторных пептидов ИМГ РАН

5 G N Ranadive, J S Mistry, К Damodaran et all //Clinical Chemistry -1998 -44 -p 244-249

Для введения метки в дерморфин и Р-казоморфин было использованы Туг-Рго-РЬе-Уа1-01и-3,4-дегидро-Ь-Рго-11е, Туг-0-А1а-РЬе-01у-Туг-3,4-дегидро-Ь-Рго-8ег-ЫН2 и Туг-Э-А1а-РЬе-01у-Туг-3,4-дегидро-0-Рго-8ег-ЫН2 Так как эти пептиды нерастворимы в апротонных растворителях, их обрабатывали газообразным тритием в присутствии катализатора в виде метанольных растворов При этом были получены меченые препараты с молярной радиоактивностью не более 0 4-0 5 ПБк/моль (табл 4)

Таблица 4 Выходы и молярные радиоактивности меченых пептидов

Соединение Предшественник Условия реакции Выход, % МР, ПБк/моль

[3,4-3Н-Ь-Рго] Дерморфин Туг-0-А1а-РЬе-01у-Туг- 3,4-дегидро-Ь-Рго-8ег- Ш2 РсЮ, метанол-уксусная кислота (20 1), 20°С, 16 ч 15 0 40

[3,4-3Н-В-Рго] Дерморфин Туг-0-А1а-РЬе-01у-Туг-3,4-дсгидро-П-Рго-8ег- >1Н2 Р(10, метанол-уксусная кислота (20 1), 20°С, 16 ч 11 0 42

[3,4-3Н-Ь-Рго] Дерморфин сЬ-Вос-Туг-0-А1а-РЬе- 01у-Туг-3,4-дегидро-Ь- Рго-8ег-ЫН2 5% Рс1/Ва804, диоксан, 20°С, 16 ч 32 2 20-2 60

Р-[3,4-3Н-Рго] Казоморфин Туг-Рго-РЬе-Уа1-01и-3,4-дегидро-Ь-Рго-Ие PdO, метанол-уксусная кислота (20 1), 20°С, 16 ч 40 0 37

Р-[3,4-3Н-Рго] Казоморфин с!1-Вос-Туг-Рго-РЬе-Уа1-01и(0В/1)- 3,4-дегидро-Ь-Рго-11е-ОВг1 5% Ра/ВаБОд, диоксан, 20°С, 16 ч 20 1 8-2 2

Меченный тритием семакс МеЮЫ-Н^-РЪе-Рго-С1у-3,4-дегидро-Рго РЮ2, ОМРА, 3 ч, 23°С 16 0 30

Меченный тритием семакс МеЬОШ-Н^-РЬе-Рго-01у-3,4-дегидро-Рго 5%Ра0/Ва504, БМРА, 90°С, 25 мин 3 0 19

Меченый тафтцин ТЬг-Ьуз-Рго-Аг§ 5% Рс1/СаС03 и КЪСЬ 170°С, 30 мин 5-10 2 20-3 00

Для синтеза пептидов с более высокой молярной радиоактивностью в качестве исходных препаратов использовали предшественники, которые содержали защитные группы [¿1-Вос-Туг-Рго-РЬе-Уа1-01и(ОВ21)-3,4-дегидро-Ь-Рго-11е-ОВ21, с!1-Вос-Туг-0-А1а-РЬе-01у-Туг-3,4-дегидро-0-Рго-5ег->Ш2 и (11-Вос-Туг-0-А1а-РЬе-01у-Туг-3,4-дегидро-Ь-Рго-Бег-ЫН2] В последнем случае восстановление двойной связи газообразным тритием в присутствии катализатора можно было проводить в апротонном растворителе При использовании диоксана, после удаления защитных групп, были получены меченые препараты с молярными радиоактивностями более 1 8 ПБк/моль Т е использование апротонных растворителей позволяет повысить молярную радиоактивность пептидов примерно в 4 раза (табл 4)

Различные методы оптимизации условий введения метки в Ме1-01и-Н15-РЬе-Рго-01у-3,4-дегидро-Рго (ненасыщенный по пролину семакс) приведены в таблицах 5 и 6 (за 100%

принята максимальная молярная радиоактивность в серии опытов, приведенных в этих таблицах)

Таблица 5 Гидрирование ненасыщенного семакса в растворе

Условия Выход, % Отн мол радиоакт, %

5% Ра/ВаБО,,, МеОН, 12 ч, 23 °С <3 20

РсЮ, МеОН, 12 ч, 23 °С 11 31

5% Рё/ВаЭОд, ОМРА, 12 ч, 23 °С <3 86

РсЮ, ОМРА, 12 ч, 23 °С <3 39

5% Р<Ю/Ва804, МеОН+АсОН, 2 ч, 23°С <10 28

5% РсЮ/Ва804, МеОН+АсОН, 12 ч, 23°С 50 24

РЮ2, МеОН, 3 ч, 23°С 26 56

РЮ2, ОМРА, 3 ч, 23°С 16 83

5% Р1/С, ОМРА, 3 ч, 23°С 13 5 69

5% ША120з, ОМРА, 3 ч, 23°С 0 -

5% Р1/С, ОМРА, 16 ч, 23°С 22 69

5% Р1/СаС03, ОМРА, 16 ч, 23°С 0 9

Таблица 6 Гидрирование ненасыщенного семакса твердофазным методом

Условия Выход, % Отн мол радиоакт , %

5%Рс1/СаСОз, ВУ, 100°С, 15 мин 62 13 6

5% Рс!/Ва804, ВУ, 100°С, 15 мин 30 83

5% РсЮ/Ва804, ВУ, 100°С, 15 мин 36 47

5% Рс1/Ва804, ВУ, 180°С, 3 мин <1 100 0

5%Рс1/А120з, 90°С, 25 мин 2 50 0

5% РёО/ВаЗОд, 90°С, 25 мин 3 52 8

Как видно из приведенных данных, наилучшими условиями для гидрирования ненасыщенного семакса являлись проведение гидрирования в растворе ОМРА в присутствии РЮ2 или 5% Рс1/Ва304 При этом меченый семакс имел молярную радиоактивность не более 0 3-04 ПБк/моль По-видимому, более низкая молярная радиоактивность при восстановлении терминального ненасыщенного пролина связана с тем, что в процессе гидрирования двойной связи принимает участие водород карбоксильной группы (рис 3), что приводит к резкому падению молярной радиоактивности

/=\ /=\ н, [Зн] н2о >4

Ясоон кат. * ЧЛс*° " Ч^АСООН

' I чЧл ' 4 Ч Л

И И ° Я ОлН к

Рисунок 3 Механизм гидрирования газообразным тритием соединений с

терминальным пролином Я - аминокислотная последовательность

Использование твердофазного метода оказалось, в данном случае, менее эффективным, хотя применение этого метода при введении трития в тафтцин дало хорошие результаты (табл 4)

Вторым методом для синтеза [3Н]семакса является конденсация трет-бутилоксикарбонильного производного Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly с меченым Pro

Для получения меченого пролина оптимальным оказался твердофазный метод (в качестве исходного соединения брали 3,4-дегидро-Рго) При этом оказалось, что лучше использовать катализаторы, импрегнированные солями родия (5% Pd0/BaS04, RhCl3, 180°С, 10 мин, выход 63%, молярная радиоактивность 0 55-0 58 ПБк/моль), или использовать в виде дополнительного носителя волокнистый углерод (5% Pd0/BaS04, ВУ, 180°С, 10 мин, выход 57%, молярная радиоактивность 0 85-0 95 ПБк/моль)

При получении меченого семакса конденсацией соответствующего предшественника с меченым пролином наилучшие результаты были получены при использовании карбонилдитриазола (выход 35-50%) Меченый семакс с высокой радиохимической чистотой получали после твердофазной экстракции и двух препаративных разделений методом ВЭЖХ сначала защищенного семакса, затем [3Н]семакса после снятия защитных групп кислотным гидролизом (радиохимическая чистота меченого семакса достигала 9798%)

По приведенной выше методике, конденсацией с меченым пролином, был получен меченный по С-концевому пролину селанк (Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro) с молярной радиоактивностью 0 5-0 9 ПБк/моль и выходом 15%

3. Подготовка образцов для тестирования пептидов и стероидов

3.1. Выделение биологически активных соединений из биологических проб

Биологические образцы (кровь, лимфа, гомогенизаты различных тканей, и др ) перед анализом должны пройти определенную обработку и подготовку В случае ВЭЖХ подготовка пробы заключается в удалении механических примесей, и как можно большего количества соединений, мешающих проведению анализа Для этого использовали экстракцию органическими растворителями и твердофазную экстракцию

В ряде случаев, например при выделении 5а- 5(3-дигидропрогестеронов, необходимы были дополнительные процедуры из-за наличия в пробах прогестерона и других ненасыщенных стероидов Поэтому перед анализом методом ВЭЖХ частично очищенную пробу обрабатывали перекисью водорода в щелочной среде В результате анализ 5а- 5(3-дигидропрогестеронов стал достоверным

При оптимизации любого из этих методов и для учета потерь анализируемых соединений при хранении, пробоподготовке и анализе использовали метод внутреннего стандарта

3 2. Получение флуоресцентных производных пептидов и стероидов

Как уже отмечалось выше, для повышения пределов обнаружения необходимо было получать соответствующие флуоресцентные производные Получение флуоресцентных производных тафтцина с о-фталевым диальдегидом (ОФА) проводили по методике6 Получение флуоресцентных производных тафтцина с бензоином проводили по методике 7

Найденный предел обнаружения тафтцина в виде флуоресцентного производного с ОФА для образцов плазмы крови и ликвора составляет 50-60 нг/мл, при соотношении сигнал/шум 3 1 Предел обнаружения тафтцина в виде флуоресцентного производного с бензоином для образцов плазмы крови и ликвора - 1-3 нг на пробу, при соотношении сигнал/шум 3 1 Для анализа коротких метаболитов семакса их флуоресцентные производные получали, используя дансилхлорид8 9 Предел обнаружения в этом случае достигал 10-20 нг/мл

Концентрацию стероидов, содержащих кето-группу, определяли после их реакции с дансилгидразином в присутствии уксусной кислоты 10

Получение дансильных производных по 3- и 17-кетогруппам с последующим флуоресцентным детектированием позволяет определять концентрацию указанных стероидов до 10-20 нг/мл

4. Использование меченых тафтцина, 5а-, Sß-дигидропрогестеронов и семакса для определения их концентрации в биологических объектах

4.1. Использование меченого тафтцина для определения концентрации тафтцина в биологических объектах

Задача определения концентрации "свободного" тафтцина в биологических объектах не решена до сих пор Однако выявление однозначных корреляционных зависимостей между уровнем содержания тафтцина в крови и состоянием организма позволило бы в конечном итоге осуществлять и диагностику заболеваний, связанных с функционированием иммунной системы, и контроль за состоянием больного Во всех известных нам работах, посвященных определению содержания тафтцина в крови, авторы не определяют уровень "свободного" тафтцина Они подвергают сыворотку процедуре протеолиза трипсином, при

6 R Schuster //J Chromatogr , 1988 Vol 431.P271

7 H Cui, J L Reubsaet, A Bult//J Chromatogr A 1996 Vol 736 P 91-96

8 С Gros, and В Labouesse //Eur J Biochem , 7,463,1969

9 W R Gray //Meth Enz, 25, 121,1972

10 Frei R W and Lawrence J F, J Chromatog, 83,321 (1973)

H

H

5a- и 5ß- Дигидропрогестероны (5a- и 5ß-прегнан-3,20-дионы)

которой тафтцин выщепляется из иммуноглобулина ^О I В конечном итоге, эти данные относятся к суммарному количеству тафтцина, складывающееся из количества "свободного" тафтцина и тафтцина, выделившегося в результате гидролиза белка Очевидно, что получаемая таким образом информация о содержании тафтцина вряд ли может быть правильно интерпретирована

Существуют два метода учета потерь при обработке образца и во время анализа метод внутреннего стандарта и метод изотопного разбавления, причем метод изотопного разбавления является более строгим и точным

Если с бензоином реагирует только А^, то при использовании о-фталевого альдегида получаются производные по всем первичным аминогруппам Очевидно, что перспективней использовать селективный реагент Основной проблемой при анализе производных бензоина является необходимость использования высоких значений рН подвижной фазы при рН ниже 8 5 интенсивность флуоресценции резко снижается и отклик детектора становится сильно зависимым от изменений температуры, состава элюента и других факторов Большинство сорбентов для ВЭЖХ созданы на основе силикагеля и подвержены гидролизу в этих условиях Поэтому для анализа бензоиновых производных желательно использовать специальные гидролитически устойчивые колонки на основе полимерных матриц Рассчитанные разными методами концентрации тафтцина приведены в таблице 7 и 8

Как видно из приведенных данных, использование анализа тафтцина в виде бензоиновых производных является наиболее предпочтительным (предел обнаружения - 2-3 нг/мл) Сходимость результатов при анализе параллельных проб - в пределах ±10%

Таблица 7 Результаты определения концентрации тафтцина в сыворотке крови, нг/мл

Сыворотка крови Софа* Сбенэ* Сбенз* *

№1 <50 26±4 29±5

№2 <50 4±2 2 5±1

№3 140±35 158±20 143±18

Примечание Концентрация тафтцина рассчитана методом изотопного разбавления (* и ** параллельные пробы), концентрация тафтцина ниже предела обнаружения метода изотопного разбавления при использовании ОФА-производных (<50 нг/мл)

Таблица 8 Определение концентрации тафтцина в спинномозговой жидкости (пробы

Концентрация тафтцина, нг/мл

Образец ОФА- Бензоиновые

производные* производные*

Ликвор № 1 <50** 21±3

Ликвор №2 <50 28±4

Ликвор№3 <50 16±3

* Концентрация тафтцина рассчитана методом изотопного разбавления ** <50 - концентрация тафтцина ниже предела обнаружения метода

4.2. Использование меченых 5а- 5(3-дигидропрогестеронов для определения их концентрации в биологических объектах

Другим примером успешного использования приведенного выше подхода является определение содержания стероидных гормонов в плазме крови у рожениц с нормальной и со слабой родовой деятельностью Для проведения этого исследования использовались меченные тритием 5а- и 5Р-изомеры дигидропрогестерона (анализ проводили в виде дансильных производных) (табл 9)

Таблица 9 Рассчитанные методом изотопного разбавления концентрации 5а- и 5Р-

изомеров дигидропрогестерона

Номер пробы Концентрации, нг/проба Номер пробы Концентрации, нг/проба

5а-изомер 5Р-изомер 5а-изомер 5Р-изомер

148 3 1 241 24 1 5

239 25 9 235 14 5 2 5

242 33 12 178 10 5 75

183 29 5 25 129 12 3

Полученные аналитические исследования подтвердили наличие натуральных антигестагенов и их роль в патогенезе слабой родовой деятельности, что открывает новые возможности фармакологической коррекции данной патологии путем использования соответствующих лечебных препаратов (работа проводилась совместно с Московской медицинской академией им Сеченова)

4.3. Использование меченого семакса для определения его концентрации и концентрации его метаболитов в биологических объектах

Получение экстрактов головного мозга крыс или его отделов, а также крови крыс проводили в МГУ им М В Ломоносова и Секторе регуляторных пептидов ИМГ РАН

В качестве меченного тритием аналога семакса использовался Ме1-С1и-Н13-РЬе-Рго-01у-[3Н]Рго (см раздел 2) Это связано с тем, что при деградации пептидов в мозге преобладает Ы-концевой протеолиз Поэтому все метаболиты будут иметь одну молярную радиоактивность, что повышает достоверность получаемых результатов Кроме того, все продукты, которые образуются под действием карбоксипептидаз (кроме пролина) не содержат метки, что также позволяет получать более достоверные результаты

Последнее связано с тем, что продукты (Ме1-01и-Н15-РЬе-Рго-01у, М^-^и-Н^-РЬе-Рго и т д), образующиеся под действием карбоксипептидаз, будут иметь близкое время удерживания с продуктами, образующимися при М-концевом протеолизе Следовательно, если все метаболиты, образующиеся под действием карбоксипептидаз и при М-концевом протеолизе, будут содержать тритиевую метку, то полученные при хроматографическом анализе данные окажутся противоречивыми, что сделает невозможным точное определение концентрации конкретных метаболитов семакса

Для изучения вопросов, связанных с проникновением семакса в мозг и кровь, а также со скоростью его распада, меченый семакс интраназально вводили крысам Через определенные промежутки времени после введения меченого препарата крыс декапитировали, из мозга и крови крысы экстрагировали продукты, содержащие пептидные фракции и по радиоактивности определяли концентрацию и степень метаболизма семакса, а также концентрацию вероятных продуктов его метаболизма за счет N-концевого протеолиза Для контроля за полнотой выделения меченых продуктов к биологическим образцам перед экстракцией добавляли стандартную смесь семакса и его метаболитов Пептидный состав проб анализировали методом ВЭЖХ

Полученные в ходе хроматографического разделения фракции, содержащие семакс или один из его метаболитов, собирали и определяли их радиоактивность Эти данные позволили оценить количества меченых соединений в пробе относительно интраназально введенного (рис 4,5) и рассчитать изменение во времени содержания семакса и его метаболитов в пробах (табл 10-12) Общую радиоактивность биологической пробы определяли, измеряя радиоактивность ее аликвоты перед анализом методом ВЭЖХ

Как видно из рисунков 4а и 46, наибольшая часть от введенной радиоактивности обнаруживается в мозге и крови в первые минуты после интраназального введения Так, через 2 мин в мозге обнаруживается, в среднем, 0 2% метки, а в крови 0 5% метки (в расчете на 1 г ткани) Затем происходит уменьшение радиоактивности за счет вымывания меченых соединений из тканей мозга и крови При этом основная часть метки теряется в течение первых 15 мин

В связи с тем, что в крови была обнаружена заметно большая концентрация радиоактивной метки, чем в мозге, необходимо было учесть ее вклад, связанный с наличием кровеносной системы в мозге Количество крови, находящейся в мозге, было рассчитано по данным работы 11 В этой работе было установлено, что количество радиоактивной метки, приходящейся на кровь в мозге, составляет в среднем 2 6% от радиоактивности крови во всем организме крысы Из этого следует, что количество радиоактивной метки, связанной с присутствием в мозге крови в расчете на 1 г мозга, оценивается в пределах 0 11%, те непосредственно в 1 г мозга через 2 мин находится не менее 0 09% от интраназально введенной радиоактивной метки (рис 4в)

Максимальное включение меченого семакса в мозг и кровь, естественно, также наблюдается в первые минуты после интраназального введения (около 0 1 и 0 12% в расчете на 1 г мозга и крови соответственно) (рис 5 а, б) Меньшее значение радиоактивности, связанной с семаксом, по сравнению с общей меткой, очевидно, свидетельствует о быстром метаболизме семакса под действием протеиназ

Проведенный расчет показал, что семакс, находящийся в кровеносных сосудах мозга, вносит заметно меньший вклад в общее количество семакса, обнаруженного в мозге Это

" V N Potaman, L V Antonova, V A Dubynin, D A Zaitzev, A A Kamensky, N F Myasoedov and V N Nezavibatko //Neuroscience Letters, T 127,1991, pp 133-136

связано с тем, что метаболизм семакса в крови идет более интенсивно, чем в мозге (табл 10, 11) Так, содержание семакса в крови, находящейся в кровеносных сосудах мозга в пересчете на 1 г мозга, составляет лишь около 0 03% от общего количества введенной метки Таким образом, около 0 07% семакса содержалось в 1г мозга крысы в первые минуты после интраназального введения (рис 5в) Из чего следует, что при введении семакса интраназально в мозге обнаруживается в 10-15 раз больше семакса, чем при введении семакса через инъекцию в кровь (0 005%) Таким образом, интраназальное введение семакса намного эффективней и проще, чем введение его через кровь

0 25 „ 02

1 015 *

01 -

0 05 -

0 204060 Время м

°7!

06 * 05

а)

1 04

£

и

0 204060 Время мин

Время мин

(а) (б) (в)

Рисунок 4 Изменение содержания суммарного количества семакса и его метаболитов (суммарная радиоактивность) в мозге без учета радиоактивности его кровеносной системы (а), в крови (б) и в мозге с учетом радиоактивности его кровеносной системы (в) крыс во времени после интраназально введенного меченого семакса (на оси ординат приведено содержание общей радиоактивности в 1 г ткани в процентах от интраназально введенной радиоактивности)

014 •

012 ■

£ 01 |

| 0 08

I 0 06

5 О 0 04

0 02 -0 ■ и

0 20 40 60

Время мин

01

0 09 :

„ 0 08 -

« 007 • / ч

| 0 06

8 005 -

«0 04

,<| 0 03

О 0 02 -0 01 —к

0 20 40 60

Время мин

(а) (б) (в)

Рисунок 5 Изменение содержания семакса в мозге без учета радиоактивности его кровеносной системы (а), в крови (б) и в мозге с учетом радиоактивности его кровеносной системы (в) крыс во времени после интраназально введенного меченого семакса (на оси ординат приведено содержание семакса (радиоактивность фракции семакса в 1 г ткани в процентах от интраназально введенного семакса)

Анализ данных, приведенных в табл 10 и 11 показал, что, кроме ожидаемых изменений, связанных с быстрым протеолизом семакса в мозге и крови и уже отмеченного эффекта, связанного с более интенсивным метаболизмом семакса в крови, чем в мозге, наблюдаются и другие закономерности

Например, как видно из таблиц 10 и 11, доля фракции Sem-З в суммарной радиоактивности образцов мозга, в исследованном интервале времени, растет, а в крови находится практически на одном уровне Последнее обстоятельство может свидетельствовать о несколько разном характере метаболизма семакса в мозге и крови По-видимому, это связано с тем, что в крови больший вклад вносят карбоксипептидазы, отщепляющие аминокислотные остатки с С-конца семакса, а образующийся меченый пролин быстро распределяется по другим тканям организма крысы

Таблица 10 Изменение процентного содержания Sem-3, Sem-4, Sem-5, Sem-6, Sem-7 в мозге крысы (за 100% принята суммарная радиоактивность семакса и его метаболитов

Время, мин Содержание, %

Sem-З Sem-4 Sem-5 Sem-6 Sem-7

2 1 9±0 3 5 8+0 9 8 5±1 3 6 8+1 0 77 1+11 6

5 19 3+2 9 5 7+0 9 10 2+1 5 1 4+0 2 63 3+9 5

15 45 9+6 9 4 3+0 7 3 2±0 5 6 7+1 0 39 9±6 0

30 41 7+6 3 10 2+1 5 5 1+0 8 114+17 31 6+4 7

60 51 5±7 7 8 8±1 3 7 0+1 1 9 7±1 5 23 1±3 5

* Sem-З обозначает сумму Pro, Gly-Pro и Pro-Gly-Pro, Sem-4 - Phe-Pro-Gly-Pro, Sem-5 -His-Phe-Pro-Gly-Pro, Sem-6 - Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, Sem-7 -Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro

Таблица 11 Изменение процентного содержания Sem-З, Sem-4, Sem-5, Sem-6, Sem-7 в крови крысы (за 100% принята суммарная радиоактивность семакса и его метаболитов

Время, мин Содержание, %

Sem-З Sem-4 Sem-5 Sem-6 Sem-7

2 57 4±8 6 6 4+1 0 1 6+0 2 7 3±1 1 27 3±4 1

5 52 9+7 9 10 5+1 6 2 4+0 4 9 3+1 4 24 9+3 7

15 30 5±4 6 27 6±4 2 8 2+1 2 10 0±1 5 23 7±3 6

30 60 1±9 0 14 9±2 2 6 7+1 0 8 5±1 3 9 8±1 5

60 55 0±8 3 10 4±1 6 10 7+1 6 13 7±2 1 10 2+1 5

Характер изменения содержания других метаболитов семакса в пробах мозга и крови также может свидетельствовать о том, что в крови больший вклад вносят ферменты, отщепляющие от семакса аминокислотные остатки с С-конца Так, например, зависимость от времени содержания пептидов 8ет-5 и 8ет-6 в мозге имеет максимум (5 и 30 мин соответственно), а в крови содержание 8сш-5 и Бст-б, вплоть до 60 мин, растет (табл 10,11) Последнее обстоятельство, по-видимому, свидетельствует о гидролизе семакса с образованием свободного меченого пролина, что приводит к быстрому уменьшению

суммарной радиоактивности в анализируемой пробе А, так как процентное содержание Sem-б и Sem-5 рассчитывается относительно общей радиоактивности анализируемой пробы, вклад их радиоактивности со временем увеличивается

Как уже отмечалось, метаболиты семакса, размером менее тетрапептида (Pro, Gly-Pro, Pro-Gly-Pro), обозначаются как фракция Sem-З (табл 10) Содержание этих метаболитов во фракции определяли методом ВЭЖХ

Имеются определенные трудности в получении достоверных данных при расчете концентрации Pro, Gly-Pro, Pro-Gly-Pro Например, точно определить концентрацию Pro-Gly-Pro проще при хроматографии биологических проб в свободном виде, тогда как концентрацию Pro более точно можно определить при хроматографии биологических проб в виде дансильных производных Концентрацию Gly-Pro определяли, анализируя хроматографические пробы в свободном виде или как разницу между радиоактивностью фракции Sem-З и суммарной радиоактивностью Pro и Pro-Gly-Pro (табл 12)

Как видно из табл 12, в качестве основного метаболита семакса в мозге крысы обнаруживается Pro-Gly-Pro В крови же в первые минуты, после введения семакса, большую часть метаболитов составляет сумма Pro и Gly-Pro, что свидетельствует в пользу более высокой активности в крови карбоксипептидаз

Таблица 12 Содержание отдельных метаболитов фракции Бет-З в мозге (М) и крови

Время , мин Содержание, %*

Pro Gly-Pro Pro-Gly-Pro

Мозг Кровь Мозг Кровь Мозг Кровь

5 6 1+0 9 37 1+5 6 17 6±2 6 22 2+3 3 76 3±11 5 40 7±6 1

15 4 4±0 7 9 7±1 5 9 2±1 4 31 6±4 7 86 4±13 0 58 7+8 8

30 2 1+0 3 8 9+1 3 6 1+0 9 24 0±3 6 91 8±13 8 67 0±10 1

60 1+0 2 7 6±1 1 8 3+1 3 18 0±2 7 90 7+13 6 74 4±11 1

* За 100% принято суммарное количество пептидов в Бет-З

Таким образом, в данной работе при использовании высокомеченного по С-концевому пролину семакса исследована фармакокинетика семакса и его метаболитов в мозге и крови крыс При этом установлено, что при введении семакса интраназально в мозге через 2 мин обнаруживается в 10-15 раз больше семакса, чем при введении путем инъекции Наибольшее содержание семакса в мозге и крови крыс наблюдается в первые минуты после интраназального введения Среди коротких метаболитов семакса, содержащих меченый пролин, наибольшая концентрация в мозге оказалась у трипептида Рго-С1у-Рго Кроме того, на основе полученных данных можно сделать определенные предположения о соотношении активностей протеиназ в мозге и крови крыс

Содержание семакса в мозжечке, базальных ганглиях, коре и гиппокампе мозга крысы было определено по методике, описанной выше При исследовании кинетики изменения содержания семакса на грамм ткани в этих отделах (рис 6) оказалось, что характер

изменения содержания семакса в разных отделах мозга идентичен изменению содержания семакса в целом мозге

0 25

0 20

* 0 15 -

-♦-Мозжечок

-Ш-Базальные

ганглии -А-Кора

-Х-Гиппокамп

| 0 10

0 05 -

0 00

60 120 180 Время, мин

0 00

60 120 Время, мин

180

а б

Рисунок 6 Изменение содержания [3Н]семакса в мозжечке, базальных ганглиях, коре, гиппокампе мозга крысы со временем при пересчете на грамм ткани с вычетом радиоактивности семакса, содержащегося в кровеносной системе мозга (за 100% принимали радиоактивность интраназально введенного семакса) а - шкала от 0 до 0 25 (кинетика от 0 до 180 мин), б - шкала от 0 до 0 02 (кинетика от 15 до 180 мин)

Таблица 13 Изменение концентрации [3Н|семакса в отделах мозга крысы со временем

Отдел мозга Время, мин

2 5 15 30 60 180

Мозжечок 31 6+4 1 25 9+2 7 17±1 2 18 2±0 4 8 4±0 3 5 9±0 5

Базальные ганглии 15 5±2 4 12 4+1 2 14 5+0 8 3 6+0 2 4 3±0 4 3 5±0 7

Кора 14 5±3 3 13 3±1 2 13 7±0 7 3 5+0 5 1 5±0 7 1 9±0 6

Гиппокамп 25 3±3 9 23 8±3 0 23 9+1 6 34 6±0 4 31 5+0 9 6 8+0 4

Суммарная концентрация метаболитов в этих отделах мозга 13 0 24 6 30 9 39 8 54 3 81 9

Т е происходило резкое уменьшение количества метки во всех отделах мозга, но если в течение 30 мин падение содержания семакса в гиппокампе и мозжечке было в 20-40 раз, то в базальных ганглиях и коре оно составило около 100-200 раз

В связи с этим представлял интерес расчет изменения концентрации семакса в разных отделах мозга относительно друг друга (табл 13) При этом метод расчета был следующим

за 100% принималась суммарная радиоактивность мозжечка, базальных ганглий, коры и гиппокампа при пересчете на грамм ткани без крови Затем, исходя из радиоактивности семакса в каждом из этих отделов мозга в каждом конкретном интервале времени, рассчитывался вклад семакса на грамм ткани мозжечка, базальных ганглий, коры и гиппокампа в процентах Такой подход позволил сравнить концентрацию семакса в перечисленных выше отделах мозга относительно друг друга в каждой временной точке и проследить изменение содержания семакса на грамм ткани мозжечка, базальных ганглий, коры и гиппокампа со временем

Как видно из таблицы 13, уже через 2 минуты после интраназального введения, концентрация семакса в мозжечке и гиппокампе примерно в 2 раза выше, чем в базальных ганглиях и в коре В дальнейшем (в интервале 30-60 мин) на фоне снижения общего количества семакса за счет его метаболизма, эта разница достигает максимальных значений В этот временной период концентрация семакса в этих отделах мозга отличается в 6-10 раз

Наблюдаемые закономерности, по-видимому, связаны с большей концентрацией специфических мест связывания в гиппокампе и мозжечке по сравнению с базальными ганглиями и корой головного мозга, т е эти два отдела можно рассматривать как отделы-мишени действия семакса

ВЫВОДЫ:

1 Синтезированы некоторые меченные тритием стероидные гормоны, аминокислоты, пептиды, в том числе селективномеченные по пролину пептиды, необходимые для проведения биологических исследований

2 Предложен новый носитель - волокнистый углерод, использование которого позволило ввести тритиевую метку в лабильные соединения и повысить молярную радиоактивность ряда меченых препаратов

3 Синтезированы [й-3 Н] эстрадно л, [0-3Н]эсгронсульфат, [1-3Н]андрост-4-ен-3,17-дион и [1,2-3Н]прогестерон, необходимые для оценки активности ароматазы и стероидсульфатазы

4 Разработана методика определения концентрации 5а- и 5Р-изомеров дигидропрогестерона в плазме крови, позволяющая определять нанограммовые количества этих стероидов с использованием флуоресцентных производных и радиоактивномеченных аналогов

5 Разработана методика определения концентрации "свободного" тафтцина в биологических пробах, позволяющая определять нанограммовые количества этого пептида с использованием флуоресцентных производных и радиоактивномеченных аналогов

6 Определена концентрации семакса и его метаболитов в мозге и его отделах, определена кинетика проникновения семакса в мозг и его отделы Показано, что наиболее стабильным метаболитом семакса в мозге является Рго-С1у-Рго

7 Установлено, что при интраназальном введении семакса наибольшая концентрация его наблюдается в первые минуты после введения, концентрация семакса в разных отделах мозга и скорость метаболизма в них заметно отличаются

8 Установлено, что через 30-60 мин после интраназального введения разница в содержании семакса на грамм ткани мозжечка и гиппокампа по сравнению с содержанием семакса на грамм ткани базальных ганглий и коры достигает максимальных значений В этот временной период концентрация семакса в этих отделах мозга отличается в 6-10 раз Таким образом, эти два отдела можно рассматривать как отделы-мишени действия семакса

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1 Шевченко В П, Нагаев И Ю, Шевченко К.В., Мясоедов Н Ф Изотопы Свойства, получение, применение "Синтез меченных тритием биологически активных соединений для исследования актуальных проблем биологии и медицины" //М -Физматлит -2005 - Т 2 - С 484-538

2 Шевченко В П , Нагаев И Ю , Шевченко К.В , Мясоедов Н Ф "Влияние природы катализатора и носителя на эффективность твердофазного изотопного обмена между газообразным тритием и фенилаланином" //Радиохимия - 2002 - Т 44 - № 6 -с 537-541

3 Шевченко В П , Нагаев И Ю , Шевченко К В , Мясоедов Н Ф , Бочкарева Н В , Коломиец Л А , Кондакова И В "Синтез высокомеченных тритием стероидных гормонов и их использование для оценки активности ароматазы" //Радиохимия -2004 - Т 46 - № 5 - С 458-463

4 Шевченко В П , Нагаев И Ю , Алфеева Л Ю , Андреева Л А , Шевченко К.В , Мясоедов Н Ф "Синтез Туг-Рго-РЬе-Уа1-01ц-Ь-[3,4-3Н]Рго-11е, Туг-0-А1а-РЬе-С1у-Туг-Ь-[3,4-3Н]Рго-8ег-ЫН2 и Туг-0-А1а-РЬе-01у-Туг-0-[3,4-3Н]Рго-8ег-Ы112) -меченых аналогов человеческого (З-казоморфина и дерморфина" //Радиохимия -2004 -Т 46 - № 1 -С 63-71

5 Шевченко К.В., Нагаев И Ю , Шевченко В П , Мясоедов Н Ф "Использование волокнистого углерода как носителя при введении трития в биологически активные соединения"//Радиохимия -2004 -Т 46 - №4 - С 370-372

6 Шевченко В П , Нагаев И Ю , Алфеева Л Ю , Андреева Л А , Климова П А , Малкин А В , Шевченко К.В., Мясоедов Н Ф "Синтез меченного тритием семакса" //Радиохимия - 2006 - Т 48 - № 3 - С 260-266

7 Шевченко В П , Нагаев И Ю , Алфеева Л Ю , Андреева Л А , Шевченко К.В., Мясоедов Н Ф "Синтез меченного тритием селанка" //Радиохимия - 2006 - Т 48 -№3 - С 267-271

8 Шевченко К.В., Нагаев И Ю , Алфеева Л Ю , Андреева Л А , Каменский А А, Левицкая Н Г , Шевченко В П , Гривенников И А , Мясоедов Н Ф "Кинетика проникновения семакса в мозг и кровь крыс при интраназальном введении" //Биоорганическая химия - 2006 - Т 32 - № 1 - С 64-70

9 Шевченко К.В., Алфеева JI Ю , Шевченко В П , Нагаев И Ю , Мясоедов Н Ф "Распределение семакса в различных отделах мозга крыс при интраназальном введении" //Доклады академии наук - 2006 т 409 - № 3 - С 1-2

10 БочкареваНВ, КондаковаИВ, КоломиецЛА, МунтянАБ, Шевченко В П, Нагаев И Ю , Шевченко К.В., Мясоедов Н Ф , Дорофеева Н Н "Синтез меченных тритием стероидов для оценки активности ароматазы и стероидсульфатазы в опухолях эндометрия" //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2006 -Т 142 -№ 10 - с 462-464

11 Nagaev I Yu, Shevchenko V Р, Shevchenko K.V., Myasoedov N F, Susan A "Tuftsin and dihydroprogesterone analysis in human plasma via an isotopic dilution method with tritium labeled analogs" //Eighth International Symposium on The Synthesis and Applications of Isotopes and Isotopically Labelled Compounds - Boston - USA - 1-5 June - 2003 -pp 50-51

12 ШевченкоВП, НагаевИЮ, Шевченко K.B., Мясоедов H Ф "Определение нанограммовых количеств тафтцина в плазме крови" //Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов - Москва - 2003 г - С 101

13 АндрееваЛА, Безуглов В В, НагаевИЮ, КлимоваПА, Шевченко К.В., Субботин С Н, Шевченко В П, Мясоедов Н Ф "Синтез меченного тритием семакса" //Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов - Москва -2003 г - С 58

14 Шевченко В П, Нагаев И Ю , Алфеева JIЮ , Андреева JI А, Шевченко К.В., Мясоедов Н Ф "Синтез Tyr-Pro-Phe-Val-Glu-L-[3,4-3H]Pro-Ile, Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-L-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2 и Tyr-D-Ala-Phe-Gly-Tyr-D-[3,4-3H]Pro-Ser-NH2) -меченых аналогов человеческого ß-казоморфина и дерморфина" //Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов — Москва - 2003 г - С 102

15 Шевченко К.В., НагаевИЮ, АлфееваЛЮ, АндрееваЛА, Каменский А А, Левицкая Н Г , Малкин А В , Шевченко В П , Мясоедов Н Ф "Использование меченного тритием семакса для изучения кинетики его проникновения в мозг" //Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов - Москва -2003 г - С 103

16 Шевченко К.В., НагаевИЮ, АлфееваЛЮ, АндрееваЛА, Каменский А А, Левицкая Н Г , Шевченко В П , Гривенников И А , Мясоедов Н Ф "Фармакокинетика семакса в мозге и крови крыс при интраназальном введении в организм крысы" //Тезисы на II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов - Санкт-Петербург - 2005 г - С 133

17 Шевченко К.В., Мясоедов Н Ф "Исследование устойчивости меченных тритием семакса и селанка в различных растворителях" //Тезисы на II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов - Санкт-Петербург - 2005 г - С 132

18 Шевченко В П , Мясоедов Н Ф , Нагаев И Ю , Шевченко К.В. "Способ анализа образца меченого органического соединения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" Патент №2247980 (10 03 05) на изобретение №2003136683

Заказ № 19/07/07 Подписано в печать 2 07 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

. ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ) \vw\v с/г ги , е-таг1 т/о@с/г ги

I. Введение

II. Литературный обзор

2.1. Нейропептиды, стероидные гормоны и их роль в биологических процессах

2.1.1. Происхождение и свойства нейропептидов и стероидных гормонов

2.1.2. Синтетические нейропептиды и стероидные гормоны

2.2. Основные методы введения метки в органические соединения

2.2.1. Введение метки обработкой растворов органических соединений газообразным тритием в присутствии катализатора

2.2.2. Дегалоидирование газообразным тритием

2.2.3. Селективный гидрогенолиз

2.2.4. Изотопный обмен в растворе

2.2.5. Введение метки изотопным обменом с тритиевой водой

2.2.6. Введение метки нагреванием смесей органических соединений с катализатором в атмосфере газообразного трития (твердофазный метод)

2.3. Получение меченых аминокислот и пептидов

2.3.1. Твердофазные методы введения тритиевой метки в аминокислоты и пептиды

2.3.2. Жидкофазные методы введения тритиевой метки в аминокислоты и пептиды

2.4. Получение меченых стероидов

2.5. Определение радиоактивности меченых препаратов и биологических пробах

2.5.1. Твердые сцинтилляторы

2.5.2. Жидкие органические сцинтилляторы

2.5.3. Измерение радиоактивности меченых препаратов

2.6. Получение флуоресцентномеченых органических соединений

2.6.1. Флуоресцентные реагенты и получение на их основе соответствующих производных

2.6.2, Специфические флуоресцентные производные аминокислот и пептидов.

2.7. Определения концентрации органических соединений в биологических ^ жидкостях

2.7.1. Методы определения содержания пептидов и стероидов

2.7.2. Методы выделения пептидов и стероидов из биологических объектов

2.7.3. Метод изотопного разбавления

2.7.4. Применимость приведенных выше методов оценки концентрации соединений ^ в биологических пробах

III. Экспериментальная часть

3.1. Материалы и методы

3.2. Приборное обеспечение

3.3. Определение молярной радиоактивности и радиохимической чистоты ^ меченых препаратов

3.4. Введение тритиевой метки в биологически активные соединения

3.5. Синтез меченных тритием биологически активных соединений из меченых предшественников

3.6. Синтез флуоресцентных производных биологически активных соединений

3.7. Обработка биологических проб для анализа

IV. Результаты и их обсуждение

4.1. Отработка условий получения меченых тритием препаратов

4.2. Синтез меченных тритием стероидных гормонов и пептидов

4.2.1. Синтез меченных тритием стероидов

4.2.2. Синтез меченных тритием пептидов

4.3. Сравнение различных методик выделения и хроматографического ^ тестирования пептидов и стероидов

4.3.1. Выделение физиологически активных соединений из биологических проб

4.3.2. Получение флуоресцентных производных пептидов и стероидов

4.4. Использование меченых тафтцина, 5а-, 5р-дигидропрогестеронов и семакса jjg для определения их концентрации в биологических объектах

4.4.1 Определение концентрации свободного тафтцина в биологических объектах

4.4.2. Использование меченых 5а- 5(3-дигидропрогестеронов для определения их концентрации в биологических объектах

4.4.3. Использование меченого семакса для определения его фармакокинетики и метаболизма в мозге крыс

4.4.4. Использование меченых [G- Н]эстрадиола, [1- Н]андрост-4-ен-3,17-диона, [G-3H]3cipoHсульфата и [1,2-3Н]прогестерона для проведения онкологических 130 исследований

V. Выводы

Биология и смежные дисциплины - биохимия, молекулярная биология, биоорганическая химия, медицина - являются теми областями, где применение методов анализа с использованием изотопов оказалось наиболее плодотворным. Сегодня развитие целого ряда разделов этих наук трудно представить себе без использования радиоактивных препаратов.

С различными областями медицины и биологии тесно связана и фармакология. Так, раскрытие этиологии и патогенеза многих заболеваний позволяет не только создать необходимый лекарственный препарат, но и разработать рациональные методы его применения. Благодаря успехам аналитической химии и разработке высокочувствительной аппаратуры стало возможным определение в тканях и жидкостях организма ничтожно малых концентраций лекарственных веществ, исследование их биотрансформации и выведения из организма.

Основными разделами фармакологии являются фармакодинамика и фармакокинетика. Предмет фармакодинамики - изучение совокупности эффектов лекарственного вещества и механизмов его действия, а предмет фармакокинетики - изучение путей поступления, распределения, биотрансформации и выведения лекарственных средств из организма больного. Кроме этого, фармакокинетика изучает процессы всасывания и связывания с белками. Фармакокинетика является относительно новой наукой. Ее развитие стало возможным, как уже упоминалось выше, благодаря разработке и внедрению в практику высокочувствительных методов определения содержания лекарственных веществ в биологических средах — газожидкостной хроматографии, ВЭЖХ, радиоиммунных, ферментно-химических и других методов. На основании данных о фармакокинетике того или иного препарата определяют дозы, оптимальный путь введения, режим применения препарата и продолжительность лечения. Регулярный контроль содержания лекарственных средств в биологических жидкостях позволяет своевременно корректировать лечение.

Использование меченых соединений повышает чувствительность анализа на 4-6 порядков по сравнению со спектральным, что позволяет надежно определять вещества при концентрациях, близких к тем, при которых проявляется их биологическая активность.

В научных исследованиях в основном используются органические соединения, содержащие в своем составе углерод-14 или тритий. Наиболее предпочтительными оказываются препараты с тритиевой меткой. Это связано с тем, что нижний предел содержания вещества, который достоверно может быть определен, зависит от величины молярной радиоактивности меченого соединения, а теоретически при введении одного атома трития в молекулу достигается молярная радиоактивность ~30 Ки/ммоль, тогда как введение одного атома углерода-14 дает только 64 мКи/ммоль.

Работа посвящена определению концентрации стероидных гормонов и нейропептидов в биологических объектах in vivo методом изотопного разбавления, а также исследование их фармакокинетики и метаболизма с использованием их меченных тритием аналогов.

Очень кратко об этих классах соединений можно сказать следующее. Пептиды - это полимерные молекулы, содержащие от двух до ста остатков аминокислот, соединенных между собой амидными (пептидными) связями. По размеру молекулы и своим свойствам пептиды стоят между высокомолекулярными белками и аминокислотами. Наиболее распространены линейные пептиды, однако известны также циклические пептиды, молекулы которых могут иметь различные размеры. Циклические пептиды образуются из линейных, когда пептидная связь связывает амино- и карбоксильную функцию N- и С-аминокислот.

По числу аминокислот, содержащихся в пептиде, различают ди-, три-, тетра-, пента-, гекса-, гепта-, окта-, нона-, декапептиды и т.д. Чтобы избежать проблемы, связанной с греческой нумерацией длинноцепочечных пептидов, Бодански предложил количество аминокислотных остатков пептида обозначать арабской цифрой и помещать перед словом "пептид". Например, 7-пептид, вместо гептапептид, 10-пептид вместо декапептид. Пептиды, в молекулах которых меньше 10 аминокислотных остатков, формально относятся к олигопептидам, а построенные из большего числа аминокислотных остатков (до ~100), - к полипептидам.

Аминокислота со свободной аминогруппой называется N-концевой аминокислотой. Аминокислота со свободной карбоксильной группой обозначается как С-концевая аминокислота.

Пептиды широко распространены в природе. Они присутствуют во всех клеточных организмах (пептидный пул). В настоящее время трудно систематически классифицировать пептиды по химическим и физическим критериям, поэтому обычно за основу берут их физиологическое действие. Из природных пептидных веществ наиболее изучены по своему действию пептидные гормоны, они имеют и наиболее известную структуру. Большое значение приобретают пептиды из животных и растительных ядов, а также пептидные антибиотики из микроорганизмов.

Химический синтез пептидов чрезвычайно важен и является специальным разделом синтетической органической химии. Первый пептидный синтез был проведен в Лейпциге в 1881 году Теодором Курциусом (1857-1928 г.г), В 1900 году Нобелевский лауреат Эмиль Фишер обратился к химии белка. Результаты, полученные им всего за пять лет в этой новой области, до сих пор считаются пионерскими. В докладе Химическому обществу 6 января 1906 года Фишер обобщил результаты своей работы в области химии аминокислот, пептидов и белков. Доклад Фишера привлек пристальное внимание исследователей, поскольку в нем были развиты основные принципы синтеза пептидов и белков, которые продолжают работать и сегодня.

В настоящее время все больший интерес вызывают биологически активные пептиды, особенно действующие на центральную нервную систему (ЦНС) и получившие название нейропептидов. Несомненно, что их число велико, но лишь немногие из них изучены в достаточной мере. Еще сложней довести нейропептид до применения его в медицинской практике. Это связано в первую очередь с тем, что в организме существует естественная система деградации пептидов, состоящая из различных протеаз, которая быстро расщепляет пептиды. При этом возникают новые пептиды со своим физиологическим спектром действия. Многообразие пептидов и их функций, быстрая деградация и в связи с этим неопределенность механизма действия конкретных пептидов - это основная проблема, связанная с разработкой лекарств на основе пептидов.

Для увеличения достоверности получаемых результатов при изучении механизмов действия пептидов необходимо как усовершенствование методов анализа сложных биологических смесей, так и получение изотопномеченных и модифицированных аналогов этих пептидов. Только при использовании этих инструментов можно определить орган-мишень для данного пептида, узнать распределение пептида между отделами этого органа, выяснить кинетику накопления и выведения пептида из этого органа, а также метаболизм пептида in vivo.

Класс стероидных гормонов является одним из представителей низкомолекулярных биорегуляторов. Только лишь в 80 годы появились достоверные сведения о механизме действия этих соединений [1]. Оказалось, что они участвуют в регуляции биосинтеза белков на уровне транскрипции. В организме стероидные гормоны переносятся с помощью специфических белков переносчиков. При взаимодействии с клеткой-мишенью стероидные гормоны, в отличие от пептидных гормонов, действуют на уровне мембран, входят внутрь клетки и в цитоплазме взаимодействуют со своими специфическими рецепторами. Затем гормон-рецепторный комплекс связывается с хроматином, инициируя транскрипцию специфических генов, что в дальнейшем приводит к стимулированию трансляции специфических ферментов.

Фундаментальная проблема, которая актуальна и по сегодняшний день - это установление связи между строением биологически активного соединения и его действием. Решение этой задачи позволило бы использовать как природные, так и модифицированные стероиды в качестве лекарственных препаратов. Известно, что стероидные гормоны выполняют в организме ряд функций, при этом каждая из них осуществляется с участием определенного рецептора. Таким образом, изучая механизм стероид-рецепторного взаимодействия, можно выяснить, какие фрагменты стероидных молекул отвечают за ту или иную их биологическую функцию. Это, с одной стороны, позволит использовать природные стероиды в тех случаях и методически таким образом, чтобы возможные его побочные действия минимально затрагивали его лечебные свойства. С другой стороны, это позволит, модернизируя соответствующим образом молекулы природного стероида, сохранить одни его биологические функции и удалить другие [2].

Меченные тритием стероиды эстрогенного, андрогенного и анаболического действия необходимы для оценки биологических характеристик соответствующих фармпрепаратов, для изучения процессов воспроизводства и повышения продуктивности животных. С помощью меченых аналогов стероидных гормонов исследуют различные метаболические процессы в норме и патологии, осуществляют диагностику различных заболеваний, а также определяют количественное их содержание в различных биологических жидкостях [3]. Актуальность синтеза меченых стероидов связана с использованием их природных предшественников для лечения целого ряда заболеваний: атеросклероза, астмы, ревматизма, экземы, аллергии, полиартрита, подагры, лучевой болезни, сахарного диабета, язвы и т.д.

Естественно, даже перечислить все эндогенные и экзогенные пептиды, а также весь класс стероидных гормонов невозможно. Поэтому в Литературном обзоре будут рассмотрены только те представители классов этих биологически активных соединений, которые будут объектами исследования в данной работе. В качестве таких пептидов были выбраны: семакс (аналог фрагмента АКТГ), p-казоморфин, дерморфин, тафтцин (Thr-Lys-Pro-Arg) и его аналог - селанк. В качестве стероидных гормонов эстрон, эстрадиол, прогестерон, андростендион и их производные.

Исследования биологических свойств этих соединений давно проводятся в ИМГ РАН. Например, в восьмидесятые годы в ИМГ РАН было показано, что присоединение Pro-Gly-Pro к АКТГ4.7 (биологически активному фрагменту АКТГ) существенно пролонгирует стимулирующее влияние на выработку навыков у животных в Т-образном лабиринте [4]. В 1986 году из целой серии аналогов АКТГ4-10 самым биологически активным оказался Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (семакс). Он оказался самым сильным активатором первичного обучения и самым сильным веществом, способствующим консолидации следа навыка в долговременной памяти. Кроме того, семакс оказывал наибольшее пролонгированное действие [5].

В дальнейшем, при содействии сотрудников МГУ им. М.В. Ломоносова было показано, что семакс наряду с ускорением процесса запоминания у крыс, увеличением числа активных реакций, улучшением длительного закрепления навыков и процессов адаптации усиливал сопротивление организма при гипоксии. В то же самое время семакс не оказывал воздействий на эмоциональные функции, моторные навыки, температуру тела, дыхательную и сердечную функции. Кроме того, тесты, выполненные на достаточно большом числе мышей и морских свинок, подтвердили, что семакс не вызывает аллергических реакций. На основе этого пептида разработана целая серия лекарственных препаратов, которые используются в качестве ноотропов, адаптогенов, нейропротекторов, в частности при лечении ишемического инсульта.

В последнее время семакс начал использоваться как средство, благоприятно действующее на процессы, способствующие улучшению зрительных функций, на проблемы, связанные с заболеваниями зрительного нерва. При этом оказалось, что он, особенно в острой стадии заболевания зрительного нерва, эффективно защищает нервную ткань от последствий повреждения, достоверно увеличивает положительную клиническую динамику, оцененную по приросту остроты зрения, суммарного поля зрения, повышению электрической чувствительности и проводимости зрительного нерва, улучшению цветового зрения. Большие надежды в лечении глазных заболеваний также связаны с производным преднизолона - кеналогом (последнее соединение активно используется в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца).

В настоящее время стало очевидно, что более детальное исследование молекулярных основ действия этого пептида невозможно без количественной оценки скорости его проникновения в мозг и различные отделы мозга, а также направление его протсолиза и определения продуктов этого протеолиза.

Проблема поиска новых средств адекватной коррекции страха, тревоги, составляющих патогенетическую основу многих психоэмоциональных расстройств, давно привлекает повышенное внимание фармакологов и клиницистов. Это связано, в частности, с тем, что наиболее широко используемые в клинической практике транквилизаторы, преимущественно бенздиазепинового ряда, характеризуются развитием большого числа нежелательных побочных эффектов: седация, миорелаксация, гипно-седативное, снотворное действие, нарушение обучения и памяти, толерантности и зависимости, феномена отмены и др.

Новым направлением в области создания эффективных и безопасных лекарственных средств для адекватного купирования страха, тревоги является создание анксиолитиков на основе эндогенных регуляторных пептидов. В Институте молекулярной генетики РАН совместно с Институтом фармакологии РАМН ведутся многолетние целенаправленные исследования по поиску и изучению нейротропного действия ряда эндогенных коротких пептидов. Результатом более чем 15-летнего исследования явилось создание оригинального пептидного соединения -селанка, обладающего анксиолитическим действием и безопасного для применения, так как он не имеет побочных эффектов, свойственных известным транквилизаторам-анксиолитикам. Улучшение процессов обучения и памяти, наряду с отсутствием нежелательных побочных эффектов, является преимуществом и дополнительным принципиальным отличием пептидного анксиолитика селанка от действия известных транквилизаторов-ксенобиотиков. На основе этого пептида также был разработан новый лекарственный препарат анксиолитического действия с ноотропным компонентом.

Работы с (3-казоморфином, дерморфином и его производными давно проводятся в Институте молекулярной генетики РАН. Их разнообразные биологические свойства будут подробно описаны в Литературном обзоре, особенно интересно их воздействие на ЦНС. Эта работа проводилась совместно с МГУ им. М.В.Ломоносова и Государственным учреждением Научный центр психического здоровья.

Совместно с Иркутским государственным медицинским университетом ведутся работы, связанные с проблемой органосохраняющей хирургии селезенки, направленные на определение содержания тафтцина в плазме крови и ликворе.' Этот интерес к тафтцину вызван обнаруженными у тафтцина свойствами, которые стимулирующим образом влияют на иммунные реакции как in vitro, так и in vivo. Так, например, активация лимфоцитов, определяющих гуморальные и клеточные иммунологические ответы, зависит от макрофагов, которые, обладая способностью распознавать чужеродные для организма соединения, связывают их, расщепляют и в виде фрагментов, содержащих антигенные детерминанты, передают далее лимфоцитам, как бы "обучают" их распознавать эти чужеродные тела. Механизмы, контролирующие иммуногенную активность макрофагов, мало изучены. Известно, что тафтцин стимулирует такой процесс "обучения" Т-лимфоцитов макрофагами [6]. Показано, что тафтцин значительно потенцирует иммуногенную активность макрофагов.

И, наконец, работы, связанные с синтезом меченных тритием стероидных гормонов ([0-3Н]эстрадиола, [1-3Н]андрост-4-ен-3,17-диона, [1,2-3Н]прогестерона, [0-3Н]эстрона, 5а- и 5Р-[4,5-3Н]дигидро-прогестеронов, [0-3Н]эстронсульфата) были поставлены и проведены для определения уровня половых гормонов, индекса свободных эстрогенов, активности ароматазы и т.д. у больных с железисто-кистозной гиперплазией эндометрия в сочетании с миомой и без миомы матки, а также для изучения проблем, связапых с родовой деятельностью. Биологическая часть этих работ проводилась на базе НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН и Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова.

Таким образом, получение меченных тритием нейропептидов и стероидных гормонов является актуальной задачей в связи с большим интересом к физиологической роли этих соединений. Использование этих меченых препаратов для быстрого определения их содержания в биологических образцах представляет самостоятельный интерес при разработке новых лекарственных препаратов, когда необходимо знать их фармакокинетику и метаболизм.

Подобная задача определяет и цели исследования: Отработку условий введения тритиевой метки в аминокислоты, пептиды и стероиды с использованием газообразного трития. Синтез меченных тритием аминокислот, пептидов и стероидных гормонов. Выбор условий для получения меченных тритием препаратов с высокой молярной радиоактивностью. Получение селективно-меченных тритием по пролину пептидов, необходимых для проведения биологических исследований. Получение флуоресцентных производных биологически активных соединений. Разработку методов определения концентраций "свободного" тафтцина, 5а- и 5Р-изомеров дигидропрогестерона, семакса и его метаболитов в биологических пробах.

При синтезе меченных тритием пептидов необходимо подчеркнуть следующее - из-за наличия в мозге N и С концевых моно- и дипептидаз целесообразно, чтобы меченная тритием аминокислота в пептиде являлась С-концевой аминокислотой, так как метаболизм пептидов в мозге происходит преимущественно за счет аминопептидаз. Поэтому при исследовании проникновения и метаболизма семакса, необходимо было получить меченный по С-концевому пролину семакс.

Такой меченый препарат позволяет проследить весь метаболизм семакса, при этом все метаболиты имеют одинаковую молярную радиоактивность, что позволяет количественно определять содержание семакса и его метаболитов в биологических пробах. Тогда как при использовании меченого по всем аминокислотам семакса возникает вероятность искажения получаемых данных. Последнее связано с тем, что в результате протеолиза такого меченого пептида образуется большее количество меченых метаболитов, которые при анализе аликвот методом ВЭЖХ мешают точно определить природу данного метаболита. Кроме того, при использовании меченого по С-концевому пролину семакса общую картину не искажают и продукты, которые образуются под воздействием карбоксипептидаз, так как они не содержат радиоактивности. Такие преимущества используемого меченого препарата позволили впервые оценить скорость проникновения и распределение по отделам мозга крысы семакса и его метаболизм in vivo. Получение флуоресцентных производных из меченных тритием препаратов позволяет учитывать потери части биологического материала при введении флуоресцентной группы, а также более точно определять итоговую молярную радиоактивность искомого соединения, что необходимо для количественной оценки препарата при использовании метода изотопного разбавления.

Поэтому ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР содержит сведения о происхождении и свойствах нейропептидов и стероидных гормонов, о методах введения тритиевой метки, методах синтеза и выделения препаратов, о методах дериватизации и хроматографического анализа этих соединений, о методе изотопного разбавления, а также рассматриваются вопросы, связанные с точностью счета, гашением, принципами счета, критериями счета, принципами жидкостной сцинтилляции.

И. Литературный обзор

V. Выводы

1. Синтезированы некоторые меченные тритием стероидные гормоны, аминокислоты, пептиды, в том числе селективномеченные по пролину пептиды, необходимые для проведения биологических исследований.

2. Предложен новый носитель - волокнистый углерод, использование которого позволило ввести тритиевую метку в лабильные соединения и повысить молярную радиоактивность ряда меченых препаратов.

3. Синтезированы [G- Н]эстрадиол, [G- Н]эстронсульфат, [1- Н]андрост-4-ен-3,17-дион и [1,2-3Н]прогестерон, необходимые для оценки активности ароматазы и стероидсульфатазы.

4. Разработана методика определения концентрации 5а- и 5(3-изомеров дигидропрогестеропа в плазме крови, позволяющая определять нанограммовые количества этих стероидов с использованием флуоресцентных производных и радиоактивномеченных аналогов.

5. Разработана методика определения концентрации "свободного" тафтцина в биологических пробах, позволяющая определять нанограммовые количества этого пептида с использованием флуоресцентных производных и радиоактивномеченных аналогов.

6. Определена концентрации семакса и его метаболитов в мозге и его отделах, определена кинетика проникновения семакса в мозг и его отделы. Показано, что наиболее стабильным метаболитом семакса в мозге является Pro-Gly-Pro.

7. Установлено, что при интраназальном введении семакса наибольшая концентрация его наблюдается в первые минуты после введения; концентрация семакса в разных отделах мозга и скорость метаболизма в них заметно отличаются.

8. Установлено, что через 30-60 мин после интраназального введения разница в содержании семакса на грамм ткани мозжечка и гиппокампа по сравнению с содержанием семакса на грамм ткани базальных ганглий и коры достигает максимальных значений. В этот временной период концентрация семакса в этих отделах мозга отличается в 6-10 раз. Таким образом, эти два отдела можно рассматривать как отделы-мишени действия семакса.

1. Овчинников Ю.А. "Биоорганическая химия" М. Просвещение. 1987. 815 с.

2. Резников А.Г. "Методы определения гормонов" Киев. Наукова Думка. 1982. 544 с.

3. Ашмарин И.П., Каменский А.А., Шелехов С.Л. "Действие фрагмента адренокортико-тропного гормона АКТГ(4-10) на обучение белых крыс при положительном подкреплении" //Докл. АН. СССР. 1978. т.240. №5. с.1245-1247

4. Антонова Л.В. "Влияние фрагментов АКТГ и их аналогов на обучение и некоторые физиологические реакции организма белых крыс" Автореферат дисс. канд. М. 1981

5. CelisM.E., TaleisnikS. "In vitro formation of a-MSH-releasing agent by hypothalamic extracts"//Experientia. 1971. vol.27, p.327-330

6. Ашмарин И.П., Стукалова П.В., Ещенко Н.Д. "Биохимия мозга" СПб. Изд. СПб гос. университета. 1999. 328 с.

7. Ашмарин И.П., Каразесва Е.П. "Нейрохимия" Изд-во института Биомедицинской химии РАМН. 1996. 269 с.

8. Зозуля А.А., Ступара О.Б., Кост Н.В. "Эндогенные опиоиды при заболеваниях сердечнососудистой системы" //Кардиология. 1999. №7. с.40-48

9. Olson G.A., Olson R.D., KastinA.J. "Endogenous opiates" //Peptides. 1997. vol.18. №10. p.1651-1688

10. Brantl V., Teschemacher H., HenschenA., LottspeichF. "Novel opioid peptides derived from casein (beta-casomorphins). I. Isolation from bovine cascin peptone" //Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1979. vol.360, p.1211-1216

11. ДубынинВ.А., ИвлеваЮ.А., Ромадинова H.H., Каменский A.A. "Физиология развития человека" Материалы международной конференции, посвященной 55-летию Института возрастной физиологии РАО. 2000. с.188-189

12. MeiselH., BockelmannW. "Bioactive peptides cncrypted in milk proteins: proteolytic activation and thropho-functional properties" //Antonie Van Leeuwenhoek. 1999. vol.76. №1-4. p.207-215

13. Meisel H. "Biochemical properties of regulatory peptides derived from milk proteins" //Biopolymers. 1997. vol.43. №2. p. 119-128

14. Кулаков В.И., Серов B.H., Абубакова A.M. "Обезболивание родов" М. Триада-Х. 1998. 152 с.

15. Teschemacher H., KochG. "Beeta-Casomorphins and Related Peptides" //Eds. Nyberg F. Upsala. 1990. p.143-149

16. Richardson B.C., MercierJ.C. "The primary structure of the ovine beta-caseins" //Eur. J. Biochem. 1979. vol.99. №2. p.285-297

17. Petrilli P., AddeoF., ChianeseL. "Primary structure of water buffalo beta-casein tryptic and CNBr peptides'7/Ital. J. Biochem. 1983. vol.32. №5. p.336-344

18. Greenberg R., Groves M.L., Dower H.J. "Human beta-casein. Amino acid sequence and identification of phosphorylation sites" //J. Biol. Chem. 1984. vol.259. №8. p.5132-5136

19. Зуфаров К.А. "Новые данные о пищеварительно-всасывательных функциях тонкой кишки и почек новорожденных" //Бюлл. эксперим. биол. мед. 1998. т.125. №1. с.4-11

20. Yen S.S.C., Quigley М.Е., Reid R.L. "Neuroendocrinology of opioid peptides and their role in the control of gonadotropin and prolactin secretion" //Am. J. Obstet. Gynecol. 1985. vol.152. №4. p.485-493

21. Bicknell R.J. "Endogenous opioid peptides and hypothalamic neuroendocrine neurones" l/i. Endocr. 1985. vol.107. №3. p.437-446

22. Broccardo M., Erspamer V., Falconieri E.G., Improta G., Linari G., Melchiorri P., Montecucchi P.C. "Pharmacological data on dermorphins, a new class of potent opioid peptides from amphibian skin" //Br. J. Pharmacol. 1981. vol.73. №3. p.625-631

23. Herz A. "Opioids II Handbook of experimental pharmacolology" //Berlin Springer. 1993. vol.2. p.205-229

24. Melchiorri P., Negri L. "The dermorphin peptide family" //Gen. Pharmac. 1996. vol.27. №7. p. 1099-1107

25. Negri L., Melchiorri P., Lattanzi R. "Pharmacology of amphibian opiate peptides" //Peptides. 2000. vol.21. №11.р.1639-1647

26. Negri L., Lattanzi R., Melchiorri P. "Production of antinociception by peripheral administration of Lys7.dermorphin, a naturally occurring peptide with high affinity for p-opiod receptors" //Br. J. Pharmacol. 1995. vol.114. №3. p.56-66

27. Емельянова Т.Г., Батурина Е.Ю., Воскресенская О.Г., Каменский А.А., Дейгин В.И., Ярова Е.П., Усенко А.Б. "Физиологические эффекты дерморфина и его аналога DAla4.-дерморфина" //Докл. АН. 1996. т.346. №2. с.272-273

28. Bloomfield G.A., Scott А.Р. "p-Melanocyte stimulating hormone" //Proc. Roy. Soc. Med. 1974. vol.67, p.748-749

29. Abe К., Butcher R.W., Nicholson W.E. "Adenosine 3,5-mo-nophosphate (cyclic AMP) as the mediator of the actions of melanocyte stimulating hormone (MSH) and norepinephrine on the frog skin" //Endocrinology. 1969. vol.84, p.362-368

30. Bloomfield G.A., Scott A.P., Rees L.H. "Melanocyte-stimulating hormone related peptides in human plasma"//J. Endocrinol. 1974. vol.63, p.51-53

31. Celis M.E., Hase S., Walker R. "Structure-activity studies of MSH-reiease-inhibiting hormone" //FEBS Letters. 1972. vol.27, p.327-330

32. Bodanszky M., Ondetti M.A., Rubin B. "Biologically active citrulline peptides" //Nature. 1962. vol.194, p.485-486

33. Bowers C.Y., Redding T.W., Schally A.V. "Effects of a- and P-melanocyte-stimulating hormones and other peptides on the thyroid in mice" //Endocrinology. 1964. vol.74, p.559-566

34. Bradshow S.D., Waring H. "Comparative studies on the biological activity of melanin-dispersing hormone (MDH)" //Colloq. Int. Centre Nat. Rech. Sci. 1968. vol.177, p.135-152

35. Blake J., Rao A.J., Li C.H. "Synthesis and biological activity of adrenocorticotropic peptides with cystine bridges" //Int. J. Peptide Protein Res. 1979. vol.13, p.346-352

36. Мельник Б.Е. "Интермедии" Кишинев. Штиинца. 1973. 124 с.

37. Штрауб Ф.Б. "Биохимия" Будапешт. Изд-во АН Венгрии 1965. 772 с.

38. Blake J., Li C.H. "Synthesis of 6-phenylalanine.-(l-^-adrenocorticotropic hormone and its steroidogenic, melanocyte-stimulating, and lipolytic activity" //Biochemistry. 1972. vol.11, p.3459-3461

39. BricaireH., Strauch G., Rifai M. "Stimulation de secretion d'hormone de croissance par 1'aMSH" //Ann. Endocrinol. 1974. vol.35, p. 159-164

40. Bower A., HadleyM.A. "Ionic requirements for melanophore-stimulating hormone (MSH) release"//Gen. Сотр. Endocrinol. 1972. vol.19, p. 147-158

41. Abe K., Nicholson W.E, Liddle G.W. "Normal and abnormal regulation of p-MSH in man" //J. Clin. Invest. 1969. vol.48, p. 1580-1535

42. Bower Sr.A., HadleyM.E., Hruby V.J. "Comparative MSH release-inhibiting activities of tocionic (the ring of oxytocin), and L-Pro-L-Leu-Gly NH2 (the side chain of oxytocin)" //Biochem. Biophys. Res. Communs. 1971. vol.45, p.l 185-1191

43. Кахана M.C. "Роль гипоталамуса в механизме гомеостаза желез внутренней секреции" //В кн.: Гипоталамо-эндокринные взаимоотношения. Кишинев, изд. КГУ. 1970. вып.2. с.3-48

44. Хертман Э. "Биохимия стероидов" Пер. с англ. Козлова JI.B. Под ред. Торгова. М. Мир. 1972. 175 с.

45. Мейнуоринг У. "Механизмы действия андрогенов" Пер. с англ. Новикова Е.А. Под ред. Протасовой М. Мир. 1979. 224 с.

46. Берштейн JI.M. "Роль экстрагонадных эстрогенов и гормональный канцерогенез" //Вестн. Рос. Акад. Мед. Наук. 1997. №8. с.54-58

47. Берштейн JI.M., Ларионов А.А., Поли Р. "Экспрессия гена ароматазы и модифицирующие ее факторы в ткани опухолей молочной железы" //Вопр. онкологии.-1999. т.45. №5. с.504-510

48. BulunS., Noble L., TakayamaK "Endocrine disorders associated with inappropriately high aromatase expression"//J. Steroid Biochem. Biol. 1997. vol.61. №3-6. p. 133-139

49. ГуменюкЕ.Г., Самородинова JI.A., ЦырлинаЕ.В. "Гормональный статус больных с гиперпластическими изменениями эндометрия и критерии выбора метода гормонотерапии дисфункциональными маточными кровотечений" //Вопр. онкологии. 1999. т.45. №2. с.147-152

50. Bulun S.E., Zeitoun К., Sasano Н., Simpson E.R. "Aromatase in aging women" //Semin. Reprod. Endocrinol. 1999. vol.17. №4. p.349-358

51. MadiganM., TroisiR., PotischmanN. "Serum hormone levels in relation to reproductive and lifestyle factors in postmenopausal women" //Cancer Causes Control. 1998. vol.9. №2. p. 199-207

52. Берштейн Л.М., Гамаюнова В.Б., Коваленко И.Г. "Содержание эстрогенов в опухоли и клинико-морфологическая характеристика рака эндометрия" //Вопр. онкологии. 1999. т.45. №2. с.142-146

53. Sasaki Н. "Aromatase activities of endometrial carcinomas and both basic and clinical analyses of endometrial hyperplasia as premalignant disease" //Nippon Sanka. 1993. vol.45. №9. p.763-765

54. Bulun S., Mahendroo M., Simpson E. "Polymerase chain reaction amplification fail to detect aromatase cytochrome P450 transcripts in normal human endometrium or decidua" //J. Clin. Endocrinol. Metab. 1993. vol.76. №6. p.1458-1463

55. Kitawaki J., Noguchi Т., Amatsu T. "Expression of aromatase cytochrome P450 protein and messenger ribonucleic acid in human endometriotic and adenomyotic tissues but not in normal endometrium"//Biol. Reprod. 1997. vol.57. №3. p.514-519

56. Noble L., Simpson E., Jons A., BulunS. "Aromatase expression in endometriosis" //J. Clin. Endocrinol. Metab. 1996. vol.81. №1. p.174-179

57. Bulun S.E,, Economos K., Miller D. "Aromatase cytochrome P450 gene expression in human malignant endometrial tumors" //J. Clin. Endocrinol. Metab. 1994. vol.79. №6. p. 1831-1834

58. Sasano H., KagaK., SatoS. "Aromatase cytochrome gene expression in endometrial carcinoma" //Br.J.Cancer. 1996. vol.74. №10. p.1541-1544

59. Urabe M., Yamamoto Т., Kitawaki J. "Estrogen biosynthesis in human uterine adenomyosis" //Acta Endocrinol. 1989. vol.121. №2. p.259-264

60. Watanabe К., Sasano H., Harada N. "Aromatase in human endometrial carcinoma and hyperplasia. Immunohistochemmical, in sutu hubridisation, and biochemical studies" //Am. J. Phatol. 1995. vol.146. №2. p.491-500

61. Yamamoto Т., Kitawaki J., Urabe M. "Estrogen productivity of endometrium and endometrial cancer tissue; influence of aromatase on proliferation of endometrial cancer cells" //J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 1993. vol.44. №4-6. p.463-468

62. Tada A., Sasaki H., Nakamura J. "Aromatase activity and the erffect of estradiol and testosteron on DNA synthesis in endometrial carcinoma cell lines" //J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1993. vol.44. №4-6. p.661-666

63. Герштейн E.C., Бочарова Л.Б., Ермилова В.Д. "Рецепторы эпидермального фактора роста и их лиганды в карциномах эндометрия: взаимосвязь с клинико-морфологическими факторами и рецепторами стероидов" //Вопр. онкологии. 2000. т.46. №2. с.180-186

64. Сметник В.П., Чернуха Е.С., Герштейн Е.С. "Рецепторы эпидермального фактора роста при аденоматозе эндометрия" //Бюлл. эксп. биол. и мед. 1999. т.127. №1. с.45-49

65. Берштейн Л.М., Гамаюнова В.Б., Квачевская Ю.О. "К вопросу о природе гиперинсулинемии у больных раком тела матки: сопоставление уровней инсулина и С-пептида в сыворотке крови"//Вопр. онкологии. 2000. т.46. №2. с.191-195

66. Избранные лекции по клинической онкологии //Под. ред. В.И. Чиссова. 2000. 735 с.

67. Бохман Я.В., Бонтэ Я., Вишневский А.С. "Гормонотерапия рака эндометрия" //СПб. 1992. 162 с.

68. СтепинаМ.Б. "Гормонотерапия диссеминированного рака молочной железы" //Практ. онкология. 2000. №2. с.12-18

69. Sugimura М., Terao Т. "Antiestrogen therapy of patients with uterine cancer" //Nippon Rinsho. 1994. vol.52. №3. p.804-808

70. Гершанович M., Чаудри X., Кампос Д. "Летрозол (Фемара), новый ингибитор ароматазы для лечения больных распространенным раком молочной железы" //Вопр. онкологии.1999. т.45. №4. с.361-368

71. Iveson Т J., Smith I.E., Ahern J. "Phase I study of the oral nonsteroidal aromatase inhibitor CGS 20267 in healthy postmenopausal women" //J. Clin. Endocrinol. Metabol. 1993. vol.77, p.324-331

72. Sasano H., Sato S., Ito K. "Effect of aromatase inhibitors on the pathobiology of human breast, endometrial and ovarian carcinoma" //Endocr. Relat. Cancer. 1999. vol.6. №2. p. 197-204

73. Yamamoto Т., Kitawaki J., Fukioka M. "Inhibitory effect of new androstendione derivative, 14-alpha-hydroxy-4-androstene-3,6,17-trione on aromatase activity of human uterine tumors" //J. Steroid. Biochem. 1990. vol.36. №6. p.517-521

74. Rose P.G., Brunetto V.L., Val Le L. "A phase II trial of anastrazole in advanced recurrent or persistent endometrial carcinoma: a Gynecologic Oncology Group study" //Gynecol. Oncol.2000. vol.78. №2. p.212-216

75. Berstein L.M., Kovalevskij A., Larionov A., Tsyrlina E., Vasilyev D., Zimarina Т., Thijssen J.H.H. "Aromatase activity in receptor negative breast and endometrial cancer" //Exp. Oncology. 2003. vol.25. №3. p.228-230

76. Камерницкий А.В., Левина И.С. "Прегна-О'-пентараны. II. Соотношение структура-активность" //Хим. фарм. журнал. 1991. №2. с.4-16

77. WiedDeD., JollesJ. "Neuropeptides derived from pro-opiocortin: behavioral, physiological and neurochemical effects" //Physiol.Rev. 1982. vol.62. №3. p.976-1059

78. Kovacs G.L., De Wied D. "Peptidergic modulation of learning and memory processes" //Pharmacol. Rev. 1994. vol.46. №3. p.269-291

79. Пономарева-Степная M.A., БахаревВ.Д., Незавибатько B.H., Андреева Л.А., АлфееваЛ.Ю., ПотаманВ.Н. "Сравнительные исследования аналогов АКТГ4-10 -стимуляторов обучения и памяти" //Хим-фарм. журн. 1986. т.20. №6. с.667-670

80. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В.Н., Антонова Л.Н., Андреева Л.А., АлфееваЛ.Ю., ПотаманВ.Н., КаменскийА.А., АшмаринИ.П. "Аналог АКТГ4-10 -стимулятор обучения пролонгированного действия" //Хим-фарм. журн. 1984. т.18. №7. с.790-795

81. Середенин С.Б., Козловская М.М., Бледнов Ю.А. "The anxiolytic action of an analog of the endogenous peptide tuftsin on inbred mice with different phenotypes of the emotional stress reaction'7/Журн. высш. нервн. деят. 1998. т.48. №1. с.153-160

82. Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В. "Ингибирующее действие семакса и селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека" //Биоорган, химия. 2001. №3. с. 180-183

83. Зозуля А.А., Мешавкин В.К., Торопов А.В., Гуревич К.Г., Кост Н.В. "Анксиолитическое действие даларгина на поведение крыс в конфликтном тесте Вогеля и приподнятом крестообразном лабиринте" //Бюл. экспер. биол. 1999. т. 127. №2. с.211-214

84. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю. Мясоедов Н.Ф. "Меченные тритием липофильные соединения" М. Наука. 2003.246 с.

85. Джеймс Б. "Гомогенное гидрирование" Мир. Москва. 1976. 570 с. James B.R. Homogeneous hydrogenation A Wiley-Interscience Publication Wiley J. & Sons. New York. 1973.

86. Миначев X.M., Дмитриев P.B., Штайнберг K.X. "Исследование спилловера дейтерия в реакции изотопного гетеромолекулярного обмена водорода на платино-цеолитных катализаторах". //Изв. АН СССР. Сер.хим. 1978. № 12. с.2682-2687

87. Augustine R.L., Tompson М.М. "Heterogeneous catalysis in organic chemistry. 6. An experimental description of the nature of the hydrogenation sites present on dispersed platinum catalysts"//J. Org. Chem. 1987. vol.52, p.1911-1915

88. Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. "Экспресс-метод введения тритиевой метки в фармпрепараты"//Радиохимия. 1999. т.41. №4. с.289-299

89. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Методы получения меченных тритием жирных кислот и их производных, оксилипинов и стероидов" //Успехи химии. 1999. т.68. №10. с.944-966

90. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Синтез и исследование тритий-меченных липидов и их аналогов" //Хим-фарм. журнал. 1999. т.ЗЗ. №6. с. 14-27

91. Макквиллин Ф.Дж. "Гомогенное гидрирование в органической химии" //Химия. М. 1980. 161 с. McQullin F.J. Homogeneous hydrogenation in organic chemistry D. Reidel Publishing Company. Dordrecht. Holland. 1976.

92. Shevchenko V.P., Myasoedov N.F. "Labelled Eicosanoids" //Isotopes in the Physical and Biochemical Sciences, vol.1. Labelled Compounds (Part B) / Edited by BuncelE. and Jones J.R.: Elsevier. N-Y. USA. 1991. p.179-231

93. Лавров О.В., Михайлов K.C., Мясоедов Н.Ф., Тельковская Т.Д. "Способ получения меченного тритием урацила"//А.С.243621 СССР (Приоритет 1967 г.). Бюлл.изобрет. 1976. т.39.с.159

94. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю. "Синтез меченных тритием соединений липидной природы" //Биоорган, химия 1999. т.25. №7. с.483-498

95. Do U.H., Hong Y., Tam P., Srinivasan P. "Synthesis of l-0-hexadecyl-l',2'-H-3.hexadecyl 2-acetyl-sn-glyceryl 3-phosphorylcholine and 1-O-alkyl [P-32]lysophosphatidycholine"//J. Label. Сотр. Radiopharm. 1996. vol.38. №2. p. 117-127

96. PichatL. "The Synthesis and applications of isotopically labeled compounds" //Proc. of Second International Symposium on The Synthesis and applications of isotopically labeled compounds /Ed. R.R.Muccino/. Kansas Sity. MO. USA. 1985. p.133-138

97. Huang D.W.W., Wang W. "Synthesis of 2,3-3H.-n-Bytil Alcohol" //J. Label. Compnd. Radiopharm. 1997. vol.39. №4. p.349-352

98. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Потапова А.В., Мясоедов Н.Ф. "Синтез меченных тритием лабильных азотсодержащих органических соединений" //Радиохимия. 1995. т.37. №3. с.265-269

99. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Введение тритиевой метки в биологически активные соединения, содержащие ароматические, гетероциклические фрагменты" //Радиохимия. 1998. т.40. №1. с.79-83

100. ChenJ., Prestwich G.D. "Synthesis of a Tritium-Labelled Diether Analog of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate" //J. Label. Compnd. Radiopharm. 1997. vol.39. №3. p.251-258

101. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Потапова A.B., Мясоедов Н.Ф. "Синтез меченного тритием циклогексилметиленамина" //Радиохимия. 1994. т.36. №5. с.445-449

102. Коваленко В.А., Пашков В.Н., Гришин Е.В., Овчинников Ю.А., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. "Получение биологически активного производного тетродотоксина, содержащего тритиевую метку" //Биоорган.химия. 1982. т.8. №5. с.710-712

103. Angustine R.L. "Catalytic Hydrogenation" //New York. Marcel Dekker. 1965. 284 c.

104. RylanderP.N. "Catalytic Hydrogenation over Platinum. Metals" New York. Academic Press. 1967. 321 p.

105. Hershberg E.B., OlivetoE., Rubin M., StaeudleH., KuhlenL. "Catalytic hydrogenation of cholesterol" //J. Am. Chem. Soc. 1951. vol.73. №3. p.l 144-1145

106. Rosenmund K.W. "New method for the preparation of aldehydes. I" //Ber. 1918. vol.51, p.585-594

107. Andre Т., Ulberg S. "Radioactive Tetracycline" //J. Amer. Chem. Soc. 1957. vol.79. №1. p.494-498

108. Gut M., Uskokovic M. "Incorporation of tritium in unsaturated steroids: pregnenolone-7aT and progesterone-7aT of very high specific activity" //Naturwissenshatten. 1960. vol.47. №2. p.40

109. GutM., Uskovic M. "Reduction of 7a-Bromosteroids with Tritium" //J. Org. Chem. 1962. vol.25. №5. p.792-796

110. Filip J. "Synthesis of oronic acid and 2-deoxyuridine labeled with tritium in position 5 with high molar activity" //Radioisotopy. 1970. vol.11. p.778-803

111. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. "Синтез меченных тритием биологически важных диазинов'7/Успехи химии. 1999. т.68. №3. с.254-266

112. Шевченко В.П., Безуглов В.В., Лазуркина Т.Ю., Потапова А.В., Мясоедов Н.Ф. "Исследование процесса включения трития в молекулы галоидзамещенных бензойных кислот, жирных кислот и простагландинов" //Радиохимия. 1986. т.28. № 3. с.376-380

113. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Введение метки жидкофазным селективным гидрированием в андростерон и факторы, влияющие на этот процесс" //Радиохимия 2002. т.44. №4. с.346-348

114. CernyB., JegorovA., PolivkovaJ., SedmeraP., HavlicekV. "Synthesis of co-3H-MeBmtl.-Cyclosporin A" //J. Label. Compnd. Radiopharm. 1998. vol.41. №4. p.267-272

115. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Введение тритиевой метки в иод-производные тиронина" //Радиохимия. 2000. т.42. №2. с. 173-175

116. Evans Е.А. "Tritium and its Compounds" //Butterworth Publishers. London. 1974. 822 p.

117. Myasoedov N.F., SidorovG.V., Kramerov V.N., Mishin V.I. "Synthesis of physiologically active tritiated compounds using high specific activity tritiated water" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1999. vol.42. №9. p.859-866

118. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Влияние спиловера трития на эффективность введения метки в органические соединения" //Радиохимия. 2002. т.44. №4. с.353-357

119. Розанов В.В., Крылов О.В. "Спилловер водорода в гетерогенном катализе" //Успехи химии. 1997. т.66. №2. с.117-130

120. Шевченко В.П, Нагаев И.Ю. Мясоедов Н.Ф. "Твердофазный метод введения тритиевой метки в биологически активные соединения" //Успехи химии. 2003. т.72. №5. с.471-497

121. Лобашина H.E., Саввин H.H., Мясников И.А. "Образование и перенос атомов водорода с металла-активатора на поверхности носителя (спилловер-эффект) и в газовую фазу" //Докл. АН. 1983. т.268. №6. с.1434-1437

122. Золотарев Ю.А. "Синтез и исследование меченных тритием аминокислот, пептидов и белков с использованием твердофазных реакций" //Диссертация на соискание степени доктора химических наук. ИМГ РАН. Москва. 1998. 68 с.

123. Золотарев Ю.А., ПенкинаВ.И., Доставалов И.Н., Мясоедов Н.Ф. "Получение меченных тритием оптических изомеров аминокислот лигандообменной хроматографией на полиакриламидном сорбенте с группировками L-фенилаланина" //Радиохимия. 1988. т.ЗО. №2. с.243-247

124. Zolotarev Yu.A., ZaitsevD.A., PenkinaV.I., Dostavalov I.N., MyasoedovN.F. "Ligand exchange chromatography for analysis and preparative separation of tritium-labeled amino acids" //J. Radioanal. Nucl. Chem. Art. 1988. vol.121. №2. p.469-478

125. Ингольд К. Теоретические основы органической химии. Изд. Мир. Москва. 1973. 1055 с. Ingold С.К. Structure and mechanism in organic chemistry. Cornell University Press. London. 1969.

126. Ласкателев E.B. "Квантово-химическое моделирование твердофазного изотопного обмена водорода в аминокислотах" Дисс. канд. хим. наук. ИНЭОС им. А.Н.Несмеянова РАН. Москва. 1997

127. Zolotarev Yu.A., Kozic V.S., Dorokhova E.M., Zaitsev D.A., Myasoedov N.F., Rozenberg S.G. "High-temperature solid-state catalytic isotope exchange with deuterium and tritium" //J. Radioanal. Nucl. Chem. Art. 1992. vol.162. №1. p.3-14

128. Марченков H.C. "Исследование твердофазного каталитического восстановительного дегалоидирования с целью введения тритиевой метки в рибонуклеозид-5'-трифосфаты" Дисс. канд. хим. наук. ИАЭ им. Курчатова И.В. Москва. 1974. 209 с.

129. Zolotarev Yu.A., Kozic V.S., ZaitsevD.A., DorokhovaE.M., MyasoedovN.F. "Tritium Incorporation in a-Amino Acids by Isotope Exchange Using High-temperature Solid-state Catalysis" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1991. vol.29. №5. p.507-517

130. Золотарев Ю.А., Борисов Ю.А. "Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена в гидроксипролине под действием спилловер-трития" //Изв. АН. Сер. хим. 1999. №6. с.1056-1060

131. Золотарев Ю.А., Ласкеров Е.В., КозикВ.С., Дорохова Е.М., Розенберг С.Г., Борисов Ю.А., Мясоедов Н.Ф. "Исследование твердофазного изотопного обмена водорода в L-аланине" //Изв. акад. наук. сер. хим. 1997. №4. с.757-762

132. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Влияние различных добавок на выход и молярную радиоактивность меченных препаратов при использовании твердофазного изотопного обмена" //Радиохимия. 2003. т.45. №1. с.78-82

133. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Влияние технеция на эффективность твердофазного изотопного обмена" //Радиохимия. 2002. т.44. №6. с.533-536

134. Delmon В. "A New Hypothesis Explaining Synergy Between Two Phases In Heterogeneous Catalysis The Case Of Hydrodesulfurization Catalysts" //Bulletin des Societes Chimiques Beiges. 1979. vol.88. №12. p.979-981

135. Delmon B. "A New Concept Explaining Catalytic Synergy between two Solid Phases" //React. Kinet. Catal. Lett. 1980. vol.13. №3. p.203-208

136. Delmon В., Ruiz P. "Synergy in selective catalytic oxidation" //React. Kinet. and Catal. Lett. 1987. vol.35. №1-2. p.303-314

137. Karroua M., Matralis H., Grange P. "Synergy between 'NiMoS' and C09S8 in the Hydrogenation of Cyclohexene and Hydrodesulfurization of Thiophene" //J. Catal. 1993. vol.139. №2. p.371-374

138. TopsoeH., Clausen B.S., MassothF.E. "Hydrotreting Catalysts. Science and Technology" //Springer. Berlin. 1996. 476 p.

139. Kim S.I., Woo S.I. "Effect of sulfiding temperatures on the formation of sulfides of molubdenium/alumina" //Appl. Catal. 1991. vol.74, p.109-113

140. Кондратьев С.И., Никишенко С.Б., АнтошинГ.В., СлинкинА.А., Федоровская Э.А., Миначев Х.М. "Изучение влияния кобальта на физико-химические и каталитические свойтсва дисульфида молибдена" //Кинетика и катализ. 1984. т.25. вып.5. с.1169-1174

141. CandiaR., Clausen B.S., BartholdyJ., TopsoeN.Y., LengelerB., TopsoeH. "Nature of active sites in sulfided HDS catalysis" Proceedings of the 8th International Congress on Catalysis. West Berlin, vol.1. Verlag Chemie. Weinheim. 1984. p.375-386

142. CandiaR., Clausen B.S., Topsoe H. "The Origin of Catalytic Synergy in Unsupported Cobalt-Molybdenum HDS Catalysts" //J. Catal. 1982. vol.77. №2. p.364-366

143. SorensenO., Clausen B.S., CandiaR., TopsoeH. "HREM and AEM studies of HDS catalysts: direct evidence for the edge location of cobalt in cobalt-molybdenium-sulfur" //Appl. Catal. 1985. vol.13. №2. p.363-372

144. SchefferB., Debeer V.H.J., OerivanE.M., ArnoldyP., Beer de V.H.J., MoulijnJ.A. "Sulfidability and Hds Activity of Co-Mo/A1203 Catalysts" //Appl. Catal. 1986. vol.25. №1-2. p.303-311

145. Попова H.H. "Физико-химические свойства Me-Tc катализаторов" Дис. канд. хим. наук. Инст. физической хим. РАН. Москва. 1992. 184 с.

146. Зайцев Д.А., Золотарев Ю.А., Мясоедов Н.Ф. "Синтез меченных тритием пептидов высокотемпературным твердофазным каталитическим изотопным обменом" //Докл. АН. 1990. т.313. №3. с.619-622

147. Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Васьковский Б.В., КостН.В., Гаранин С.К., Макарепкова В.П., Мясоедов Н.Ф. "Исследование твердофазного каталитического изотопного обмена водорода в деларгине" //Биоорган, химия. 2000. т.26. №7. с.512-515

148. Гринштейн Дж., ВиницМ. "Химия аминокислот и пептидов" Москва, изд-во Мир. 1965. 832 с.

149. Гершкович А.А., Кибирев В.К. "Химический синтез пептидов" Киев. Наукова думка. 1992.360 с.

150. Andrecva L.A., AlfeevaL.Y., PotamanV.N., Nezavibat'ko V.N. "Use of tetrabutylammonium salts of aminoacids in peptide syntesis" //Int. J. Peptide Res. 1992. №39. p.493-496

151. TombolyC., Dixit R., Lengyel I., BorsodiA., TothG. "Preparation of Specifically Tritiated Endomorphins" /13. Labelled. Сотр. Radiopharm. 2001. vol.44. №5. p.355-363

152. Эванс Э. "Тритий и его соединения" М. Атомиздат. 1970. 307 с.

153. Shevchenko V.P., Myasoedov N.F. "Preparation of Radiolabeled Lipids" Isotopes in the Physical and Biochemical Sciences, vol.1. Labelled Compounds (Part A) / Edited by Buncel E. and Jones J.R.: Elsevier. N-Y. USA. 1987. p.237-287

154. Myasoedov N.F. "Introduction Of Tritium Into Organic Compounds By Isotope Exchange Reaction" Hi. Label. Сотр. Radiopharm. 1993. vol.33. №5. p.391-402

155. Campbell M. "The Preparation Of Tritium-Labeled Steroids" In Isotopes in the Physical and Biochemical Sciences, vol.1. (Labelled Compounds. Pt. B). (Eds E.Buncel, J.R.Jones). Elsevier. New York. 1991. p.71-113

156. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Получение меченного тритием холестерина" //Радиохимия. 1993. т.35. №4. с.106-109

157. Крамеров В.Н. "Каталитические методы введения тритиевой метки в стероидные гормоны" Дис. канд. хим. наук. НПО Государственный институт прикладной химии, Ленинград, 1987. 204 с.

158. Myasoedov N.F., SidorovG.V., Kramerov V.N., MishinV.I. "Synthesis of Physiologicaly Active Tritiated Compounds Using High Specific Activity Tritiated Water" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1999. vol.42. №9p.859-866

159. PleissU. Proceedings of the Third International Symposium. "Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds" editors Baillie T.A. and Jones J.R. Innsbruck. Austria. 1988. p.521-524

160. Markos C.S., Dorn C.R., Zitzewitz D.J. "Synthesis of Canrenone and Related Steroids Labelled with Tritium, Carbon-14, and Sulfur-35" //J.Label.Comp. Radiopharm. 1988. vol.25. №5. p.515-530

161. MeyerM.D., Carson G.L., ToftD.O. "Synthesis of Highly Tritiated 7-Deoxy-7-Dihydroantheridiol and Antheridiol" //J.Label.Comp. Radiopharm. 1987. vol.24. №2. p.171-184

162. McCarthy P.A. "Synthesis of 5,6-3H2.CP-88,818 (P-[5,6-3H2]Tigogenin Cellobioside)" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1990. vol.28. №10. p.l 149-1160

163. Tait A.D. "Synthesis of 3a-3H.-Dehydroepiandrosterone and [3a-3H]-Pregnenolone" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1998. vol.40. №3. p.221-226

164. Parnes H., Shelton E.J. "High Specific Activity Stedoids. I: 17a-Ethylnylestradiol-9,l 1-3H. and Norethindrone-[9,l 1-3H]" //J.Label.Comp.Radiopharm. 1991. vol.29. №10 p.l 157-1165

165. DiBattista J.P., Webster F.X. "Synthesis of p-4,5-3H.-Cholestan-3-one, a Trail Following Pheromone Component of the Eastern Tent Caterpillar" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1996. vol.38. №12. p.1083-1085

166. Wagner H., Romer J. "Synthesis of 14a, 15a-3H.-Norgestrel" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1988. vol.25, p.645-652

167. Tang G.Z., PengC.T. "Labeling of Steroids by Activated Tritium" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1988. vol.25. №6. p.585-602

168. Смирнов A.H., Покровская E.В., Шевченко В.П. "Видовые и тканевые особенности распределения белков, связывающих 16а,17а-циклоалкановые производные прогестерона" //Биоорг. химия. 2002. т.28. №3. с.251-257

169. Corey E.J., NiwaH., KnolleJ. "Total Synthesis of (S)-12-Hydroxy-5,8,14-cis-10-trans-eicosatetraenoic Acid (Samuelsson's НЕТЕ)" //J. Amer. Chem. Soc. 1978. vol.100. №6. p.1942-1943

170. Watanabe IL, Akiyama M., Kawanishi Т., Kubodera N. "Synthesis of tritiated la,25-dihydroxy-22-oxavitamin D3" //J. Label. Сотр. Radiopharm. 1995. vol.36, p.645-654

171. Каклюшкина JI.H. "Синтез стероидных гормонов, двукратно меченных тритием" В сб.: Химия и технология изотопов и меченых соединений. Ленинград: ГИПХ. 1984. 211с.

172. Прайс В. "Регистрация ядерного излучения" Издательство иностранной литературы. Москва. 1960.464 с.

173. ШрамЭ., Ломбер Р. "Органические сцинтилляционные детекторы" Атомиздат. Москва. 1967. 184 с.

174. Bernstein W. "Liquid Scintillation Counting" //Pergamon Press. London. 1958. 74 p.

175. HaighC.P. "Scintillation counter for measuring hydrogen-3 and carbon-14" //Radioisotopes in Scientific Research, Proc. Intern. Conf. Paris. 1957. vol.1, p.663-674

176. Haigh C.P. "Liquid scintillation counting for tritium and carbon-14" //Nucl. Power. 1958. vol.3. p.585-587

177. Hodgson T.S., Gordon B.E., AckermanM.E. "Single-chennel counter for carbon-14 and tritium" //Nucleonics. 1958. vol.16. №7. p.89-94

178. Hodgson T.S., Gordon B.E. "A room temperature liquid scintillator in C.G. Bell and F.N. Hayes, eds., Liquid Scintillation Counting" //Pergamon Press. London. 1968. 78 p.

179. PringleR.W., Roulston K.I., Taylor H.W. "The scintillation counter as a low-resolution y-ray spectrometer" //Rev. Sci. Instr. 1950. vol.21, p.216-218

180. Pringle R.W., Turchinetz W., Funt B.L., Danyluk S.S. "Radiocarbon age estimates obtained by an improved liquid scintillation technique" //Science. 1957. vol.125, p.69-70

181. Hiebert R.D., Watts R.J. "Fast-concidence circuit for hydrogen-3 and carbon-14 measurements" //Nucleonics. 1953. vol.11. №12. p.38-41

182. Cameron J.F., Boyce I.S. "Liquid scintillation counting of tritiated water" //J. Intern. Appl. Radiation and Isotopes. 1960. vol.8, p.228-229

183. AgranoffB.W. "Si02 vials improve low-level counting" //Nucleonics. 1957. vol.15. №10. p.106-110

184. AgranoffB.W. "Liquid Scintillation Counting" //Pergamon Press. London. 1958.220 p.

185. Davidson J.D., Feigelson P. "Practical aspects of internal-sample liquid scintillation counting" //J. Intern. Appl. Radiation and Isotopes. 1957. Vol2. p.1-18

186. Lloyd R.A., Ellis S.C., Hallowes K.H. "Phosphorescence in liquid scintillation counting" //Tritium Phys. Biol. Sciences. Proc. Symposium Detection Use. Vienna. Austria. 1962. vol.1. p.263-279

187. HerbergR.J. "Phosphorescence in liquid scintillation counting of proteins" //Science. 1958. vol.128. №3317. p.199-200

188. DavidsonJ.D. "Homogeneous counting systems, in C.G.Bell and F.N.Hayes, eds., Liquid Scintillation Counting" //Pergamon Press. London. 1958. 88 p.

189. Рысьев О.А., Жарков A.B., ДолгиевЕ.И. "Сцинтилляционный метод измерения трития в биологии и медицине" //Атомиздат. Москва. 1978. 138 с.

190. Bailie L.A. "Determination of liquid scintillation counting efficiency by pulse-height shift" //J. Intern. Appl. Radiation and Isotopes. 1959. vol.8, p.1-7

191. BaillieLA. "Determination of liquid scintillation counting efficiency by pulse-height shift" //Adv. Tracer Methodol. 1963. vol.1, p.86-92

192. Bruno G.A., Christian J.E. "Correction for Quenching Associated with Liquid Scintillation Counting" //Anal. Chem. 1961. vol.33. №4. p.650-651

193. Иванов И.И., Модестов В.К., Штуккенберг Ю.М., Романцев Е.Ф., Воробьев Е.И. "Радиоактивные изотопы в медицине и биологии" Медгиз. Москва. 1955. 231 с.

194. Miller E.J., Narkates A.J., Niemann M.A. "Amino acid analysis of collagen hydrolysates by reverse-phase high-performance liquid chromatography of 9-fluorenylmethyl chloroformate derivatives"//Anal. Biochem. 1990. vol.190. №1. p.92-97

195. Box R., Woolley P., Pon C. "The binding of dansylated initiation factor 3 to the 30-S subunit of Escherichia coli: a fluorimetric and biochemical study" //Eur. J. Biochem. 1981. vol.l 16, №1. p.93-99

196. MiyanoH., Toyo'okaT., ImaiK., NakajimaT. "Influences of metal ions on the reaction of amino and imino acids with fluorogenic reagents" //Anal. Biochem. 1985. vol.150. №1. p.125-130

197. SandbergM., HagbergH., JacobsonL, KarlssonB., LehmannA., HambergerA. "Analysis of amino acids: neurochemical application" //Life Sci. 1987. vol.41. №7. p.829-832

198. Herraiz Т., Casal V., Polo M.C. "Reversed-phase HPLC analysis of peptides in standard and dairy samples using on-line absorbance and post-column OPA-fluorescence detection" //Z. Lebensm. Unters. Forsch. 1994. vol.199. №4. p.265-269

199. Ronnberg A.L., Hansson C., Drakenberg Т., Hakanson R. "Reaction of histamine with o-phthalaldehyde: isolation and analysis of the fluorophore" //Anal. Biochem. 1984. vol.139. №2. p.329-337

200. Chen R.F., Scott С., Trepman E. "Fluorescence properties of o-phthaldialdehyde derivatives of amino acids" //Biochim. Biophys. Acta. 1979. vol.576. №2. p.440-455

201. Lee K.S., DrescherD.G. "Derivatization of cysteine and cystine for fluorescence amino acid analysis with the o-phthaldialdehyde, 2-mercaptoethanol reagent" //J. Biol. Chem. 1979. vol.254. №14. p.6248-6251

202. Lai C.Y. "Detection of Peptides by Fluorescence Methods" //Methods Enzymol. 1977. vol.47. p.236-243

203. Yosuke 0., Masaaki K., Hitoshi N. "Fluorogenic reactions for biomedical chromatography" //J. of Chromatog. B. 1994. vol.659, p.85-107

204. KatoM., FukushimaT., Santa Т., HommaH., ImaiK. "Determination of D-amino acids, derivatized with 4-fluoro-7-nitro-2,l,3-benzoxadiazole (NBD-F), in wine samples by high-performance liquid chromatography" //Biomed. Chromatogr. 1995. vol.9. №4. p.193-194

205. HiratsukaT. "Involvement of the 50-kDa peptide of myosin heads in the ATPase activity revealed by fluorescent modification with 4-fluoro-7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazole" //J. Biol. Chem. 1986. vol.261. №16. p.7294-7299

206. Treuheit M.J., KirleyT.L. "Reversibility of cysteine labeling by 4-(aminosulfonyl)-7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole" //Anal. Biochem. 1993. vol.212. №1. p.138-142

207. Sucyoshi Т., Miyata Т., Iwanaga S., Toyo'oka Т., Imai K. "Application of a fluorogenic reagent, ammonium 7-fluorobenzo-2-oxa-l,3-diazole-4-sulfonate for detection of cystine-containing peptides"//J. Biochem. (Tokyo). 1985. vol.97. №6. p.1811-1813

208. Tuls J., Geren L., Lambeth J.D., Millett F. "The use of a specific fluorescence probe to study the interaction of adrenodoxin with adrenodoxin reductase and cytochrome P-450scc" //J. Biol. Chem. 1987. vol.262. №21. p. 10020-10025

209. KokR.J., VisserJ., MoolenaarF., ZeeuwdeD., MeijerD.K. "Bioanalysis of captopril: two sensitive high-performance liquid chromatographic methods with pre- or postcolumn fluorescent labeling" //J. Chromatogr. В Biomed. Sci. 1997. vol.693. №1. p.181-189

210. Meguro H., Kim J.H., Bai С., Nishida Y., Ohrui H. "Some applications of a chiral fluorometric reagent, (S)-TBMB carboxylic acid"//Chirality. 2001. vol.13. №8. p.441-445

211. Yoshida H., Nakano Y., Koiso K., Nohta H., Ishida J., Yamaguchi M. "Liquid chromatographic determination of ornithine and lysine based on intramolecular excimer-forming fluorescence derivatization" //Anal. Sci. 2001. vol.17. №1. p.107-112

212. Antonis De K.M., Brown P.R., Cohen S.A. "High-performance liquid chromatographic analysis of synthetic peptides using derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate" //Anal. Biochem. 1994. vol.223. №2. p.191-197

213. Foresta De В., Nguyen Le Т., Nicot C., Alfsen A. "Study of fluorescent tryptophyl residues and extrinsic probes for the characterization of molecular domains of Folch-Pi apoprotein" //Biochimie. 1979. vol.61. №4. p.523-533

214. Hitoshi N., Tomoyuki Y., Yosuke O., Makoto Y., Junichi I., Masatoshi Y. "Aromatic glycinonitriles and methylamines as precolumn fluorescence derivatization reagents for catecholamines" //Anal. Chim. Acta. 1997. vol.344, p.233-240

215. Hideko K., Tomomi N., Michiko M., Yoshikazu M. "Determination of peptides by high-performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection" //J. of Chromatog. A. 1997. vol.763, p.23-29

216. NeidleA., Banay-Schwartz M., Sacks S., DunlopD.S. "Amino acid analysis using 1-naphthylisocyanate as a precolumn high performance liquid chromatography derivatization reagent" //Anal. Biochem. 1989. vol.180. №2. p.291-297

217. TsugitaA., Kamo M., JoneC.S., ShikamaN. "Sensitization of Edman amino acid derivatives using the fluorescent reagent, 4-aminofluorescein" //J. Biochem. (Tokyo). 1989. vol.106. №1. p.60-65

218. Coleman R.D., Kim T.W., Gotto A.M. Jr, Yang C.Y. "Determination of cysteine on low-density lipoproteins using the fluorescent probe, 5-iodoacetamidofluoresceine" //Biochim. Biophys. Acta. 1990. vol.1037. №1. p.129-132

219. Ohkura Y., Kai M., Norta H. "Fluorogenic reactions for biomedical chromatography" //J. Chromog. B. Biomed. Appl. 1994. vol.659, p.85-107

220. Clark J.I., Garland D. "Fluorescein colchicine. Synthesis, purification, and biological activity" //J. Cell. Biol. 1978. vol.76. №3. p.619-627

221. ZhanW., Wang Т., Li S.F. "Derivatization, extraction and concentration of amino acids and peptides by using organic/aqueous phases in capillary electrophoresis with fluorescence detection" //Electrophoresis. 2000. vol.21. №17. p.3593-3599

222. Wang H., Li J., Yang T.X., Zhang H.S. "N-hydroxysuccinimidyl-fluorescein-O-acetate for precolumn fluorescence derivatization of amino acids and oligopeptides in liquid chromatography" //J. Chromatog. Sci. 2001. vol.39. №9. p.365-369

223. Ferrandiz C., Perez-Paya E., Braco L., Abad C. "Gln5 selectively monodansylated substance P as a sensitive tool for interaction studies with membranes" //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. vol.203. №l.p.359-365

224. Stockert J.C., TrigosoC.I. "Fluorescence of eosinophil leukocyte granules induced by the fluorogenic reagent 2-methoxy-2,4-diphenyl-3 (2H)-furanone" //Blood Cells. 1993. vol.19. №2. p.423-30; discussion p.431-433

225. Hitoshi Nohta, Shunya Noma And Yosuke Ohkura "Assay For Catechol-O-Methyltransferase In Erythrocytes Using A New Fluorogenic Substrate, 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)Naphthol,2-d.Thiazole"//J. Chromatog. Biomedical Applications. 1984. vol.308, p.93-196

226. Riccardo Basosi, Nicola D-Amelio, Elena Gaggeli, Rebecca Pogni and Gianni Valensin "Cis-trance Isomerization Of P-Casomorphin Peptides Bound To Copper(II): Integration EPR And NMR Studies" //J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2001. 2. p.252-257

227. Udenfriend S., Stein S., Bohlen P., Dairman W., Leimgruber W., Weigele M. "Fluorescamine; a reagent for assay of amino acids, peptides, proteins, and primary amines in picomole range" //Science. 1972. vol.178, p.871-872

228. Anderson R.A., Boronenkov I.V., Doughman S.D., KunzJ., Loijens J.C. "Phosphatidylinositol phosphate kinases, a multifaceted family of signaling enzymes" //J. Biol. Chem. 1999. vol.274. №15. p.9907-9910

229. Junichi I., Masaaki K., Yosuke O. "Determination Of p-Hydroxybestatin In Human Serum By High-Performance Liquid Chromatography Using Fluorescence Detection" //J. Chromatog. Biomedical Applications. 1985. vol.344, p.267-274

230. Eijiro K., Masaaki K., Yosuke O. "Phenylglyoxal as fluorogenic reagent selective for tryptophan" //Anal. Chim. Acta. 1991. vol.248, p.213-217

231. Masaaki К., Eijiro К., Yosuke О. "High-performance liquid chromatography of N-terminal tryptophan-containing peptides with precolumn fluorescence derivatization with glyoxal" //J. of Chromatog. A. 1993. vol.653, p.235-240

232. Spirer Z, Zakuth V., BogairN., Fridkin M. "Radioimmunoassay of the phagocytosis-stimulating peptide tuftsin in normal and splenectomized subjects" //Europ. J. Immunol. 1977. vol.7, p.69-74

233. Spirer Z., WeismanY., Zakuth V. "Decreased serum tuftsin concentrations in sickle cell disease"//Arch. Dis. Child. 1980. vol.55, p.566-567

234. Stabinsky Y., Gottlieb P., Zakuth Z. "Specific binding sites for the phagocytosis stimulation tuftsin on human polymorphonuclear leukocytes and monocytes" //Biochem. Biophys. Commun. 1978. vol.83. №2. p.599-606

235. Bar-Shavit Z., Terry S., BlumbergS., Goldman R. "Neurotensin macrophage interaction: specific binding and augmentation of phagocytosis" //Neuropeptides. 1982. vol.2, p.325-335

236. Siemion I.Z., Kluczyk A., Wieczorek Z. "Anti-IL-1 activity of peptide fragments of IL-1 family proteins" //Peptides. 1999. vol.19, p.373-382

237. Siemion I.Z., Kluczyk A. "Tuftsin: on the 30-year anniversary of Victor Najjar's discovery" //Peptides. 1999. vol.20, p.645-674

238. Murthy R., Furness J.B., Costa M. "Measurement and chromatographic characterization of vasoactive intestinal peptide from guinea-pig enteric nerves" //J. Chromatog. 1984. vol.336. №1. p.41-50

239. MantC.T., Hodges .R.S. (Eds.). "High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation, Analysis and Conformation" //CRC Press. 1991. 938 p.

240. Nairn J.O., Desiderio D.M., Trimble J. "The identification of serum tuftsin by reverse-phase high-performance liquid chromatography and mass spectrometry" //Anal. Biochem. 1987. vol.164. №l.p.221-226

241. Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Подвальнюк B.B., Аюшинова Н.И., Мясоедов Н.Ф. "Использование меченных тритием препаратов для анализа стероидов и пептидов в биологических объектах" //Радиохимия. 2002. т.44. №1. с.65-71

242. Hevesy G.V., Hobbie R. "Determination of the Molibdenum and Wolfram in rocks" //Ztschr. Analyt. Chem. 1932. vol.1988, p.1-4

243. Старик И.Е. "Определение радия с породах и минералах" //Пробл. сов. геол. 1933. т.З. с.70-74

244. Ruzicka J. "Isototopic dilution in inorganic and tracer analysis" //Chem. Listy. 1962. vol.56. p.783-794

245. Alimarin I.P., Bilimovitsch G.V. "The Isotope Dilution Method And Its Application To Analysis Of Inorganic Substances" //Int. J. Appl. Rad. Isotopes. 1960. p.169-181

246. Mayor R.H., Collins C.J. "Use of double dilution for the simultaneous determination of yield and activity of radioactive compounds" //J. Amer. Chem. Soc. 1951. vol.73, p.471-472

247. KestonA.S., Underfriend S., Canaan R.K., Keith R. "Л Method for the Determination of Organic Compounds in the Form of Isotopic Derivatives I. Estimation of aminoacids by the carrier technique" //J. Amer. Chem. 1949. vol.71, p.249-257

248. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шевченко K.B., Мясоедов Н.Ф. Изотопы в медицине "Синтез меченных тритием биологически активных соединений для исследования актуальных проблем биологии и медицины" М. Физматлит. 2005. т.2. с.484-538

249. Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В. "Способ анализа образца меченого органического соединения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" Патент № 2247980 (10.03.05) на изобретение № 2003136683

250. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф. "Влияние природы катализатора и носителя на эффективность твердофазного изотопного обмена между газообразным тритием и фенилаланином" //Радиохимия. 2002. т.44. №6. с.537-541.

251. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф., Бочкарева Н.В., Коломиец Л.А., Кондакова И.В. "Синтез высокомеченных тритием стероидных гормонов и их использование для оценки активности ароматазы" //Радиохимия. 2004. т.46. №5. с.458-463

252. Шевченко К.В., Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. "Использование волокнистого углерода как носителя при введении трития в биологически активные соединения"//Радиохимия. 2004. т.46. №4. с.370-372

253. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Климова П.А., Малкин А.В., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф. "Синтез меченного тритием семакса" //Радиохимия. 2006. т.48. №3. с.260-266

254. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., АлфееваЛ.Ю., Андреева Л.А., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф. "Синтез меченного тритием селанка" //Радиохимия. 2006. т.48. №3. с.267-271

255. Шевченко К.В., Алфеева Л.Ю., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Распределение семакса в различных отделах мозга крыс при интраназальном введении" //Докл. АН. 2006. т.409. №3. с. 1-2

256. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Синтез высокомеченных физиологически активных соединений с использованием газообразного трития для получения препаратов с определенным распределением метки" //Радиохимия. 2000. т.42. №2. с. 176-179

257. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шевченко K.B., Мясоедов Н.Ф. "Определение нанограмовых количеств тафтцина в плазме крови" Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов. Москва. 2003. с.101

258. Андреева Л.А., Безуглов В.В., Нагаев И.Ю., Климова П.А., Шевченко К.В., Субботин С.Н., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. "Синтез меченного тритием семакса" Тезисы на Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов. Москва. 2003. с.58

259. Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф. "Исследование устойчивости меченных тритием семакса и селанка в различных растворителях" Тезисы на II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Санкт-Петербург. 2005. с. 132

260. Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В. "Высокомеченный тритием 3Н.-7-хлоро-1,3-Дигидро-1-метил-5-фенил-2Н-1,4-бенздиазепин-2-он и способ его получения" Патент № 2247116 (27.02.05) на изобретение № 2003114116

261. Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В. "Высокомеченный тритием 3Н.-2-(имидазол-1-ил)-1-гидроксиэтан-1,1-дифосфониевая кислота" Патент № 2265025 (16.05.05) на изобретение № 2004120516

262. Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В. "Высокомеченный тритием 3Н.(8)-альфа-циано-3-феноксибензил-(Ж)-(2\2'-дибромвинил)-2,2-диметилцикло-пропанкарбоксилат" Патент № 2248965 (27.03.05) на изобретение № 2003136647

263. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Шевченко К.В., Мясоедов Н.Ф. "Влияние природы катализатора и носителя на эффективность твердофазного изотопного обмена между газообразным тритием и фенилаланином" //Радиохимия. 2002. т.44. №6. с.537-541

264. Gray W.R. "End-group analysis using dansyl chloride" //Meth. Enzym. 1972. vol.25, p.121-138

265. Chambers A., Park C., Baker R., Rodriguez N.M. "Hydrogen Storage in Graphite Nanofibers" //J. Phys. Chem. B. 1998. vol.102. №22. p.4253-4256

266. Gros C., Labouesse B. "Study of the dansylation reaction of amino acids, peptides and proteins" //Eur. J. Biochem. 1969. vol.7. №4. p.463-470

267. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. "Влияние спилловера трития на эффективность введения метки в органические соединения" //Радиохимия. 2002. т.44. №4. с.353-357

268. FleischT., AbermanR. "On the reduction of silver sulfide films by hydrogen spillover under ultra high vacuum conditions" //J. Catal. 1977. vol.50. №2. p.268-272

269. Борисов Ю.А., Золотарев Ю.А., Ласкеров E.B., Мясоедов Н.Ф. "Квантово-химический расчет модели спиловер водорода на графитовой подложке" //Изв. АН. Сер. хим. 1997. с.428-430

270. Ranadive G.N., Mistry J.S., Damodaran K., Khosravi M.J., Diamandi A., Gimpel Т., Castracane V.D., Patel S., StanczykF.Z. "Rapid, convenient radioimmunoassay of estrone sulfate" //Clinical Chemistry. 1998. vol.44. №2. p.244-249

271. Schuster R. "Determination of amino acids in biological, pharmaceutical, plant and food samples by automated precolumn derivatization and high-performance liquid chromatography" //J. Chromatogr. 1988. vol.431, p.271-284

272. ZamanN., VarsanyiM., Heilmeyer L.M.Jr., Sotiroudis T.G., Johnson C.M., CrabbJ.W. "Reaction of fluorescein isothiocyanate with an ATP-binding site on the phosphorylase kinase alpha subunit" //Eur. J. Biochem. 1989. vol.182. №3. p.577-584

273. FreiR.W., Lawrence J.F. "Fluorigenic labeling in high-speeed liquid chromatography" //J. Chromatog. 1973. vol.83, p.321-330

274. Апарцин K.A., Аюшинова Н.И., Барам Г.И. "Органосохраняющая хирургия селезенки" Под ред. Григорьев Е.Г., Апарцин К.А. //Новосибирск: Наука. 2001.400 с.

275. PotamanV.N., AlfeevaL.Y., Antonova L.V., Kamensky А.А., Levitzkaya N.G., Nezavibatko V.N. "N-terminal degradation of ACTH(4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes" //Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1991. vol.176. №2. p.741-746

276. Barth A., Romer W., Oettel M. "Influence of subchronic administration of oestrone-3-О-sulphamate on oestrone sulphatase activity in liver, spleen and white blood cells of ovariectomized rats."//Arch. Toxicol. 2000. vol.74, p.366-371

277. Scully R.E., Bonfiglio T.A., Kurman R.J. "Word Health Organisation-Hystological typing of tumors of the female genital tract" //Heidelberg:Springer-Verlag. 1994. p.26-28

278. Utsunomiya H., Suzuki Т., KitamuraT. "Steroid sulfatase and estrogen sulfotransferase in human endometrial carcinoma'V/Clin. Cancer Res. 2004. vol.10. №17. p.5850-5856