Синтез меченных тритием биологически важных диазинов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.14 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ВАШ Институт молекулярной генетики

На правах рукописи

Р Г Б ОД

Сидоров Георгии Васильевич

•! Г «г,«! Л

I J МС1\

Синтез меченных тритием биологически важных диазинов

02.00.14 - радиохимия

02.00.10 - биоорпаничесхая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора хишгчесгих наук

/У?

Москва, 1999 г.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор доктор химических наук, профессор

Федосеев В.М.

Очкин А.В.

Ефимов В.А.

Ведущая организация: Российский научный центр «Прикладная химия»

Защита состоится 22 дехабря 1999 г. в 10 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.59.01 в Институте геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН по адресу: 117975, ГСП-1, Москва, В-334, ул. Косыгина, 19

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке института.

Диссертация в виде научного доклада разослана 19 ноября 1999 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук

Кодеин**) Корчемная Е.К.

ГРЯ-/.4-4 О

рэсспис^лп , государственная

I. Общая характеристика работы _ ¿9 /

Актуальность темы

Среди большого количества физиологически активных веществ диазины занимают особое место. К основным биологически активным диазинам относятся пурины, пиримидины и их производные, Пуриновые и пиримидиновые основания - аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил являются мономерными единицами, входящими в состав нуклеиновых кислот, составляющих основу генетического кода всего живого. Не менее важную роль играют производные диазинов. Это пуриновые и пиримидиновые нуклеозиды и нуклеотиды различной степени фосфорилирования, их природные и синтетические аналоги, а также представители гормонов растений - цитокинины (6-аминозамещенные пурина). Далее под термином диазины будут подразумеваться все перечисленные выше соединения. Диазины играют существенную роль в процессах, происходящих во всех живых организмах. Одним из главных инструментов для изучения роли диазинов на молекулярном уровне является наличие аналогов этих соединений, меченных радиоактивными изотопами. Особое место среди них занимают препараты, меченные тритием.

Интерес исследователей к меченным тритием соединениям практически не ослабевает уже более 30 лет. Это обусловлено ценными ядерно-физическими свойствами трития. Период полураспада трития (12,262 года) достаточно велик для проведения продолжительных экспериментов. Малая энергия р-частиц трития (Етах= 18,6 кЭв) определяет низкую радиотоксичность тритиевых препаратов, что позволяет работать с десятками и сотнями милликюри меченых соединений без специальных мер защиты. Развитие метода и установок жидкостного сцинтилляционного счета позволяет регистрировать тритий с эффективностью до 60%. Замена одного атома водорода тритием дает препарат с молярной радиоактивностью (Амол) 29,12 Ки/ммоль. Использование íaкиx препаратов и современных сцинтилляционных счетчиков трития позволяет зарегистрировать менее 10'14 моля меченого соединения. Однако это определяет и специфические требования к подобным препаратам, так как требует практически полного замещения как минимум одного атома водорода тритием. Для современных исследований зачастую необходимы препараты со значительно большей степенью замещения атомов водорода на тритий, т.е.

содержащие в молекуле два и более атомов трития. Основной характеристикой любого метода получения соединений, меченных тритием, является степень изотопного замещения водорода тритием в молекуле или величиной Аыол. Химический выход меченного тритием соединения не так существенен. Это объясняется тем, что стоимость меченого препарата значительно (на несколько порядков) выше стоимости исходного изотопного сырья и не меченого предшественника для введения тритиевой метки. Поэтому низкий с точки зрения классической химии выход (3 - 5%) вполне оправдан в синтезе меченных тритием соединений при условии достижения высоких значений Амсш. Основными параметрами, характеризующими тот или иной метод синтеза меченного тритием соединения, являются величина АЫОл, химическая и радиохимическая чистота получаемого соединения. Под радиохимической чистотой подразумевается доля изотопа, связанного с целевым соединением.

Для синтеза меченных тритием диазинов пригодны практически все современные методы получения меченных тритием соединений. Это реакции изотопного обмена в растворе и без растворителя, химические и энзиматические методы. Развитие различных методов синтеза меченных тритием диазинов обусловлено спецификой их дальнейшего использования для решения разнообразных задач. Очень часто, например, требуются препараты с определенным положением метки. Это достигается, как правило, направленным химическим синтезом. Требования, предъявляемые к меченым препаратам, диктуют свою специфику к выбору методов получения меченных тритием диазинов. Поэтому изучение различных реакций синтеза меченных тритием диазинов актуально как для решения конкретных задач по введению трития в то или иное соединение, так и для выявления общих закономерностей в синтезе меченных тритием соединений этого класса. Это необходимо, поскольку синтез каждого соединения представляет самостоятельную технологическую задачу.

В области синтеза меченных тритием диазинов имелось много неясного в понимании механизма реакций, влияния на степень изотопного замещения водорода тритием (Амол) природы исходных соединений, концентрации газообразного трития, активности применяемых катализаторов. Не было единого подхода к синтезу меченных тритием соединений этого класса, что подразумевает оценку различных методов введения трития с точки зрения предельно достижимой величины Амол и создание единых схем синтеза,

позволяющих из ограниченного количества предшественников синтезировать весь набор меченных тритием диазинов. Мы оцениваем, что номенклатура подобных соединений составляет более 100 наименований. Поиск групповых методов и подходов введения трития во многие соединения значительно облегчает технологию получения и снижает их себестоимость. Современные эксперименты по физико-химической биологии и фармакологии требуют препараты с химической и радиохимической чистотой более 97%. Это потребовало специальных методов очистки подобных препаратов.

Результатом решения указанных проблем явилась организация серийного выпуска белее ста наименований меченных тритием диазинов и их производных и обеспечение ими различных работ по физико-химической биологии, медицине и сельскому хозяйству.

Данная работа является частью плановой тематики лаборатории изотопно меченных физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН (тема 1.4 «Физиологически активные вещества, включая изотопно-меченые, для исследований в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и медицины» плана НИР института).

Цель исследования

Целью настоящей работы являлось:

- изучение реакционной способности водорода диазинов и их производных в реакциях замещения на тритий, разработка общих подходов введения тритиевой метки в диазины и синтез препаратов с требуемыми характеристиками

- разработка единых схем синтеза, позволяющих из ограниченного количества предшественников получать наибольшее количество меченых препаратов, не уступающих по своим характеристикам лучшим зарубежным аналогам

Научная новизна

Исследована реакционная способность водорода диазинов и их производных в реакциях замещения на тритий, влияние условий реакции с участием газообразного трития и влияние строения субстрата на выход и А„0л получаемых соединений. Выявлено влияние изотопных эффектов в системе водород - палладий - вода на величину Амол соединений, получаемых в реакциях с участием газообразного трития. Предложена модель каталитических

реакций в растворе с участием газообразного трития, хорошо объясняющая экспериментальные данные. Исследована реакция твердофазной каталитической гидрогенизации диазинов и их производных с газообразным тритием и выявлены общие закономерности этой реакции. Эти исследования позволили разработать общий подход к синтезу меченных тритием физиологически активных соединений, содержащих в своем составе диазины и создать технологические схемы, позволяющие из ограниченного количества меченных тритием предшественников получать практически все представители этого класса соединений. Все получаемые соединения не уступают (а зачастую превосходят) по своим характеристикам аналогичные препараты ведущих зарубежных фирм.

Практическая значимость работы

Разработаны групповые методы получения меченных тритием диазинов и их аналогов. Эти методы основаны на сочетании радиохимических методов введения трития и последующем проведении энзиматических реакций для получения изотопно модифицированных соединений. Показано, что метод твердофазной каталитической гидрогенизации (ТКГ), позволяет синтезировать в одну стадию кратно меченные тритием препараты, которые были недоступны ранее или синтез которых был сопряжен со значительными экспериментальными трудностями. В работе получили дальнейшее развитие традиционные методы введения трития, такие как реакции каталитического дегалогенирования, восстановления и гидрирования с участием газообразного трития в растворе. Практическая реализация разработанного направления позволила организовать серийный выпуск меченных тритием диазинов на экспериментально-производственной базе ИМГ РАН и внедрить полученные разработки на 2-ом опытном заводе НПО ГИПХ. 69 наименований препаратов внесены в номенклатурный справочник изотопной продукции (В/О «Изотоп», Москва, 1997 г.). На эти препараты разработаны и утверждены отраслевые технические условия (ТУ 95 1622-93 - ЛУ), которые являются основным документом по стандартизации данного вида изотопной продукции. С 1981 г. по настоящее время по разработанной автором технологии около 20 кюри меченных тритием диазинов и их производных было поставлено в более чем 60 научных организаций страны. Проведенная автором работа позволила

полностью обеспечить потребности страны в данном виде изотопной продукции. С 1994 г. эта продукция поставляется и на экспорт.

С использованием меченных тритием гормонов растений разработан способ их количественного определения в растительных экстрактах. Этот способ отличается от известных тем, что в едином аналитическом процессе можно определять все гормоны растений - ауксины, гиббереллины и цитокинины с высокой чувствительностью, что позволило определять фитогормоны не в целом растении, а в отдельных его частях, - в листьях, стеблях и корнях.

В результате осуществлено решение научной проблемы, имеющей важное народно-хозяйственное значение.

Автор защищает созданное научное направление в химии меченных тритием биологически активных веществ, основанное на использовании каталитических реакций с газообразным тритием и тритиевой водой:

1. Каталитические реакции в растворе (дегалогенирование, восстановление, гидрирование, изотопный обмен) и модель этой реакции с участием газообразного трития.

2. Реакции твердофазной каталитической гидрогенизации, позволяющие получать кратно меченные тритием соединения.

3. Общие схемы синтеза меченных тритием диазинов. В основу схем положено сочетание радиохимических методов введения трития и энзиматических реакций для получения изотопно модифицированных соединений.

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на 11 всесоюзных и международных совещаниях, конференциях и симпозиумах, в том числе на I (Прага, 1977 г.) и II (Ленинград, 1982 г.) Симпозиумах стран - членов СЭВ «Органические, соединения, меченные радиоактивными изотопами», II совещание по ферментам и микроорганизмам (Минск 1978 г.), II Всесоюзном совещании по ферментам (Москва 1978), I, II и III Всесоюзном совещании по проблеме "Биологически активные соединения, меченные радиоактивными изотопами" (Звенигород, 1985,1988 и 1991 г.), II Радиохимической конференции (ЧССР, 1987 г.), 4, 5 и 6 Международных симпозиумах «Синтез и использование

изотопно-меченых соединений» (Торонто, Канада, 1991 г.; Страсбург, Франция, 1994 г.; Филадельфия, США, 1997 г.).

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 37 работах и 10 Российских изобретениях и патентах.

II. Основное содержание работы

Введение

Среди биологически важных диазинов, пиримидин (Рис. 1, 1) заслуживает наибольшего внимания, поскольку его производные - урацил (2), тимин (3) и цитозин (4) входят в состав нуклеиновых кислот. К другим производным пиримидина, не содержащим конденсированных колец, относятся барбитураты (5), аллоксан (6) и оротовая кислота (7). Из полициклических производных пиримидина, таких как птеридин (8), ключевым соединением является пурин (9). Его производные аденин (10) и гуанин (11) относятся к азотистым основаниям, также входящим в состав рибо- и дезоксирибонуклеиновых кислот. Другие производные пурина, такие как гипоксантин (12), ксантин (13), теобромин (14), теофиллин (15), кофеин (16) и мочевая кислота (17) являются важными природными соединениями, обладающими биологической активностью. Рибоза и 2'-дезоксирибоза присоединяются к азотистым основаниям (1-17) через 1М-гликозидную связь, образуя соответственно дезоксирибо- (18а) и рибонуклеозиды (18Ь), а фосфорные эфиры нуклеозидов образуют нуклеотиды (18с-18е). Таким образом, перечислены практически все соединения, которые объединены общим названием компоненты нуклеиновых кислот. Количество таких соединений для оснований (2-4, 10, 11), входящих в состав нуклеиновых кислот, более 40.

К гормонам растений или фитогормонам относятся, главным образом, ауксины, цитокинины и гиббереллины. Диазины входят в состав цитокининов. Они являются производными 6-аминопурина, например кинетин (Рис. 2, 19), зеатин (20), бензиламинопурин (21), ускоряющими прорастание и цветение, задерживающими увядание растений. Один из ауксинов (от греческого «аихет» - растение), названный гетероауксином, был в 1934 г. идентифицирован как индолил-3-уксусная кислота (ИУК, 22).

18а: I* = Н, Я-, = Н 18Ь: I* = ОН, Я, = Н

18с: Я,= Н2Р03 18(1: Н3Р205 18а: ^ = Н4Р3О7

Я =

Н,

ОН

18а-е

Рис. 1. Пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды и нуклеотиды. Пиримидин (1), урацил (2), тимин (3),цитозин (4), барбитураты (5), аллоксан (6), оротовая кислота (7), птеридин (8), пурин (9), аденин (10), гуанин (11), гипоксантин (12), ксантин (13), теобромин (14), теофиллин (15), кофеин (16), мочевая кислота (17), дезоксирибо- (18а) и рибонуклеозиды (18Ь), нуклеотиды (18с-18е).

н

СН2 СН3

но

26а: И = Н 26Ь: Я = Ме

27а:Я = Н 27Ь: Я = Н2РОа

ОН

СН2СООН

ЫН

22

О

НгМ

HN

А,

НО(СН2)2ОСН2 25

Рис. 2. Фитогормоны - кинетин (19), зеатин (20), бензиламинопурин (21), индолил-3-уксусная кислота (22), гиббереллин (23); терминаторы синтеза ДНК - азидотимидин (24), ацикловир (25), нуклеозидфосфинаты (26а), нуклеозидметилфосфинаты (26Ь), 5'-0-фосфонилметил-2'-дезоксинуклеозиды (27а) и соответствующие нуклеотиды (27Ь).

н. „н

щ

СО1МН2

ОН ОН

СГ>

^он ои ч0"

О-Р-О-Р—о

II

о

28

о н

СН2-С— сн—С —14— сн2-сн2-с — N

II

СН3 о Н

—с СН3ОН

он

НО-Р-О-Р-0

II

о

о

СН,

I '

снг

¿Н

29

он

НО— Р — о ОН

II

о

Рис. 3. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД, 28) и коэнзим А (29)

Терминаторами синтеза ДНК чаще всего оказываются аналоги компонентов нуклеиновых кислот с измененной гетероциклической, гликозидной и/или фосфорной частью молекулы, такие как азидотимидин (Рис. 2, 24),

N

ацикловир (25), нуклеозидфосфинаты (26а) и нуклеозидметилфосфинаты (26Ь), 5'-0-фосфонилметил-2'-дезоксинуклеозиды (27а) и соответствующие нуклеотиды (27Ь). Они являются потенциальными ингибиторами ретро вирусов, в том числе вируса иммунодефицита человека.

К диазинам относятся некоторые коферменты, такие как никотинамидадениндинуклеотид (НАД, Рис. 3, 28) и коэнзим А (29). НАД+ является главным акцептором электронов при окислении «топливных молекул», таких как глюкоза и жирные кислоты. Коэнзим А играет основополагающую роль в процессе генерирования энергии при окислении питательных веществ, в частности является переносчиком активированных ацетильных групп.

В настоящей работе разработаны методы получения указанных выше соединений, меченных тритием. Основное внимание уделено общим методам, дающим возможность синтеза наибольшего количества указанных соединений с максимальной для данного метода молярной радиоактивностью.

Методы получения меченных тритием диазинов

Для синтеза меченных тритием диазинов использовали следующие каталитические реакции:

а) дегалогенирование газообразным тритием

1Ч-На1 -► Я-3Н

б) восстановление функциональных групп газообразным тритием

я-с=о-- Р*-С3Н-ОН

I 7

н н

К-СН2ОН -►

в) изотопный обмен

Р-Н -► Я-3Н

Эти реакции (или реакции гидрогенолиза) проводят в растворе. При осуществлении реакций по пп. а,б получаются соединения, содержащие до одного атома трития на молекулу с А„ол не превышающей обычно 15-20 Ки/ммоль. Однако уже в середине 70-х годов потребовались препараты с Амол до 40 - 60 Ки/ммоль, т.е. содержащие два атома трития в молекуле. В ряде случаев требуются величины Амол 70 -100 Ки/ммоль, что отвечает замене 3-4 атомов водорода на тритий. Для увеличения Амоп был разработан новый метод - твердофазная каталитическая гидрогенизация (ТКГ). Суть метода в

проведении реакций (пп. б, в) без растворителя при температуре 100 - 250 °С. Это позволило существенно увеличить степень изотопного замещения водорода тритием, особенно в реакции изотопного обмена, а также совместить реакции восстановления и изотопного обмена в едином процессе, Методы синтеза меченных тритием диазинов изложены в обзоре (Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием биологически важных диазинов // Успехи химии. - 1999. - Т.68, № 3, - С.254-266). Требования к высоким и сверхвысоким величинам AMOn заставили изменить и стратегию синтеза. Общий подход заключался во введении трития в сравнительно простые соединения, которые выдерживают жесткие условия реакции, приводящей к замене нескольких атомов водорода на тритий, и модификации полученного меченого соединения энзиматическими методами.

Все разработки внедрены на производственной базе ИМГ РАН и РНЦ «Прикладная химия» (Санкт-Петербург).

Реакции гидрогенолиза

В качестве модели для изучения процесса гидрогенолиза выбрана реакция каталитического дегалогенирования в растворе. Это объяснялось тем, что продукт реакции химически отличается от исходного соединения, что облегчает трактовку полученных экспериментальных данных, а наличие большого набора галоген замещенных предшественников позволяет исследовать практически все интересующие соединения.

Кинетика и модель реакции гидрогенолиза

Известно1,2, что большая часть сорбированного палладием водорода находится в растворенном состоянии, образуя твердый раствор, называемый а-фазой (до 3 атомных процентов) и ß-фазой (свыше 56 атомных процентов). В реакциях гидрирования количество поверхностно-адсорбированного водорода определяет каталитическую активность палладия.

Каталитическую активность связывают со степенью насыщения палладия водородом. Известно3, что ß-фаза палладия не обладает каталитической активностью в реакции гидрирования. С учетом этого реакцию гидрогенолиза

1. А.А.Алчуджан,А.В.Фрост//Журн. Физ. Химии, 26, 1015 (1952)

2. A.A. Алчуджан, A.B. Фрост//Жури. Физ. Химии, 26, 1591 (1952)

3. A.A. Алчуджан Н Жури. Физ. Химии, 26, 1730 (1952)

можно представить схемой 1. Согласно схеме 1 параллельно с реакцией дегалогенирования идет растворение водорода в палладии. Этот процесс приводит, по-видимому, к изменению активности катализатора и, в итоге, к

практически полной его дезактивации (при образовании РЬН*раств.).

*

Р<) + Н2-- (МН) аде! (РЙН) раств.-- (Рс1Н)раств.

+ +

ВВг РШг

RH + НВг ЯН + НВг Схема 1. Схема реакции гидрогенолиза.

Сказанное выше определило наш подход к исследованию кинетики реакции гидрогенолиза. Эксперименты проводили в специальных ампулах, позволяющих проводить предварительную обработку суспензии катализатора водородом перед введением раствора галоген замещенного соединения и отбор проб в ходе реакции.

Для анализа и математического описания предложенной схемы введем понятие «каталитическая емкость». Эта величина пропорциональна количеству взятого в реакцию палладия и по мере образования гидрида она меняется. Введем следующие обозначения:

т0 - исходная «каталитическая емкость» палладиевого катализатора по - исходное количество галоген замещенного соединения ¡1 - количество продукта дегалогенирования в момент времени т V - количество гидрида палладия, образовавшегося в момент времени т 1<1 и к*1 - константы скорости реакции дегалогенирования соответственно с

металлическим палладием и его гидридом к2 и к'г - константы скорости образования гидридов палладия Без учета адсорбции компонентов реакционной смеси на катализаторе, при постоянном давлении газовой фазы и при условии, что реакция протекает в кинетической области, система дифференциальных уравнений, описывающая эту схему, может быть записана следующим образом: г с1ц/ск = Мто - у)(п0 - ц) (1) сМс!т = к2(т0 - V) (2)

Уравнение (1) отражает саму реакцию дегалогенирования, а уравнение (2) - изменение активности катализатора при образовании гидрида палладия. Решая систему уравнений относительно ц, получаем:

ц/п0 = 1 - exp(-ki/k2 -m0b) (3) где b = 1 - ехр(-к2т)

Кинетика реакции каталитического дегалогенирования 5-бром-2'-дезоксиуридина представлена на рис. 4. Аналогичные кривые были получены и для других соединений. Подобный вид кинетической кривой, как и предполагалось выше, можно объяснить изменением активности палладиевого катализатора в ходе реакции при растворении водорода в палладии, и обусловлен различной адсорбционной способностью к водороду металлического палладия и его гидридов.

Время, мин.

Рис. 4, Кинетика реакции каталитического дегалогенирования 5-бром-2'-дезоксиуридина. 1 - время обработки катализатора водородом - 0 мин., 2 -15 мин., 3-30 мин., 4 - 33 мин., 5 - 38 мин.

На рис. 4 точками отмечены экспериментальные данные, а сплошной линией представлены кривые, рассчитанные по уравнению (3). Как видно из рис. 4, экспериментальные данные хорошо описываются уравнением (3).

В табл. 1 приведены вычисленные из кинетических кривых значения констант скоростей реакций дегалогенирования и образования гидрида палладия для исследованных соединений и величины Амоп продуктов дегалогенирования тритий-протиевой смесью (1:1000).

Полученные экспериментальные данные подтверждают предложенный механизм реакции дегалогенирования, а аналитическое выражение (3) хорошо описывает схему этой реакции. Из данных табл. 1 видно, что величины к2 и к'2 различны для разных соединений. Эти константы отражают процесс образования гидрида палладия и не должны зависеть от природы исходного галоген замещенного соединения. По-видимому, различие в значениях к2 и к'2 обусловлено тем, что при выводе кинетического уравнения мы не учитывали адсорбцию компонентов реакционной смеси на поверхности катализатора. Можно предположить, что чем выше адсорбция компонентов реакционной смеси на поверхности катализатора, тем менее открыта его поверхность для атаки водородом и, следовательно, значения к2 и к'2 должны быть меньше.

Табл. 1. Кинетические параметры реакции каталитического дегалогенирования некоторых бромзамвщенных компонентов нуклеиновых кислот. Тритий-протиевая смесь (1:1000).

Соединение t, °С Дегалогенирова-ние, k * 104 (с"1) Обр. гидрида Pd, к -104 (с'1) к-|/к2 Амол Ки/моль Еакт ккал/моль

ki k'i к2 к'г

8-бром- 21 0,31 0,45 1,67 1,67 0,18 3,4 3,53

АМФ

8-бром- 22 4,03 1,55 8,33 3,33 0,48 10,5 6,81

гуанозин

5-бром- 22 4,03 1,55 8,33 3,33 0,48 10,5 6,57

уридин

5-бром-2-дезокси- 22 2,40 1,00 0,20 0,20 12 40 8,03

уридин

Из данных табл. 1 видно, что энергия активации реакции каталитического

дегалогенирования изученных нами соединений различна. Это связано, по-

видимому, с изменением механизма реакции при переходе от одного

соединения к другому. Известно4, что на поверхности гетерогенного

катализатора в реакции гидрирования водородом могут реализоваться

два граничных случая. Первый случай, когда на поверхности катализатора

находится гидрируемое соединение, а водород отсутствует. Реакция имеет

"ударный" механизм, порядок реакции, как правило, нулевой по веществу и

первый по водороду. Энергия активации реакции не зависит от природы

4. Д.В. Сокольский, A.M. Сокольская // Метаплы - катализаторы гидрогенизации, Наука, Каз. ССР, Алма-Ата, с. ! 36 и след. (1970)

гидрируемого соединения и приблизительно постоянна и равна 10 - 12 ккал/моль (энергия активации водорода). Второй случай, когда на поверхности катализатора находится водород, а соединение "ударяется" о хемосорбированный слой. Реакция имеет первый порядок по веществу и нулевой по водороду. Энергия активации в этом случае равна 3,5 - 6,0 ккал/моль. По-видимому, эти случаи реализуются при дегалогенировании различных бромзамещенных производных компонентов нуклеиновых кислот. Так в случае дегалогенирования 5-бромдезоксиуридина энергия активации равна 8,03 ккал/моль, а 8-бром-АМФ - 3,53 ккал/моль.

Как правило, при высоких значениях энергии активации реакции каталитического дегалогенирования, растворение изотопов водорода в палладии и изотопный обмен с водой затруднены. В этом случае молярная радиоактивность продукта реакции дегалогенирования должна быть высокой.

"Ударный" механизм иллюстрируется при рассмотрении кинетики реакции каталитического дегалогенирования соединений, содержащих два атома галогена, таких как2,8-дихлоаденин (рис. 5) и 5-бром,6-хлорурацил (рис. 6).

Рис.5 Рис.6

Рис. 5. Кинетика реакции каталитического дегалогенирования 2,8-дихлораденина (1). 2 - монохлораденин; 3 -аденин.

Рис. б. Кинетика реакции каталитического дегалогенирования 5-бром.б-хлорурацила (1). 2 - урацил.

У 2,8-дихлораденина атомы галогена находятся на противоположных сторонах молекулы. При "ударе" о катализатор атомы галогена отщепляются последовательно (т.н. "двух ударный" механизм), что видно из кинетики этой

реакции, характерной для последовательных реакций (Рис. 5). Орто положение атомов галогена у 5-бром,6-хлорурацила приводит к одновременному их отщеплению (т. н. "одноударный" механизм, Рис. 6).

Влияние изотопии на молярную радиоактивность продуктов реакции гидрогенолиза тритием

Как правило, AMon продуктов гидрогенолиза тритием ниже Амол исходного трития. Разбавление трития происходит на поверхности катализатора в результате протекания параллельной реакции изотопного обмена с протонами растворителя и лабильными атомами водорода маркируемого соединения. В зависимости от соотношения скоростей основной реакции и изотопного обмена с растворителем, на поверхности катализатора может существовать тритий -протиевая смесь различного состава. Для понимания зависимости Амол продукта реакции от соотношения скоростей реакций гидрогенолиза и изотопного обмена с растворителем, рассмотрены процессы, протекающие с участием изотопов водорода (протия и трития) в системе "водород - палладий - вода".

Коэффициент разделения изотопов водорода при растворении в палладии5 при 20 °С аН-т = 2,8. Палладий является катализатором реакции гомомолекулярного изотопного обмена, которая имеет место при высоких концентрациях трития. В этой реакции, для трития с концентрацией 50% при 20 °С ан-т = 3,6 и 4,7 для 100% -ного трития6.

В тройной системе "водород - палладий - вода" общий коэффициент разделения протий - тритий6 ан-т= 12.

Таким образом, наличием довольно больших коэффициентов разделения протий - тритий в системе "водород - палладий - вода" можно, по-видимому, объяснить большие различия в молярной радиоактивности соединений, получаемых в исследуемых реакциях, а также различия при проведении этой реакции в среде высоко- и низкопроцентного трития.

Были проанализированы процессы с различной кинетикой:

1. скорость реакции гидрогенолиза сравнима или больше скорости изотопного обмена с растворителем. При этом возможны два крайних случая:

5. F. Botter, J. Menes, S. Tistchenko, G. Dirán // Bul!. De la Soc. Chim. De France, 11, 3374 (1965)

6. G. Sicking // Z. Phys. Chem. (BRD), 93, 53 (1964)

а) вкладом реакции гомомолекулярного изотопного обмена можно пренебречь. Амол продукта гидрогенолиза будет равна Амол исходного трития с учетом изотопии при растворении и адсорбции на палладии. Для этого процесса ан-т = 2,5 (получено исключением вклада реакции гомомолекулярного изотопного обмена на палладии и разделения изотопов при растворении в палладии в изотопное равновесие "водород - палладий - вода";

б) на палладии устанавливается изотопное равновесие, т.е. идет реакция гомомолекулярного изотопного обмена (ан-т = 4,7 для 100%-ного или 3,6 для 50%-ного трития).

2. Скорость реакции гидрогенолиза меньше скорости изотопного обмена. При рассмотрении этого процесса необходимо учитывать изотопное равновесие в системе "водород - палладий - вода" (ан-т= 12).

В табл. 2 приведены расчетные данные, иллюстрирующие влияние концентрации трития на величину молярной радиоактивности продукта гидрогенолиза для процессов с различной кинетикой.

Рассмотрение практических результатов реакций химического синтеза (Табл. 3 и 4) показывает, что с учетом эффекта разделения изотопов водорода на палладии расчетные величины Амол (в скобках) хорошо совпадают с экспериментальными значениями. Так эффектом фракционирования изотопов водорода на палладии хорошо объясняются величины молярной активности в среде высокопроцентного трития (95%, Оп. 1,2, 5, 10, 11, 12, 14, 15, 25, Табл. 3) и разбавленного трития (Оп. 6, 9,17,23, Табл. 3).

В реакции изотопного обмена (Табл. 5) величины Ам0Л различных диазинов лежат в широком диапазоне и совпадение расчетных и экспериментально полученных величин Амол указывает лишь на то, что реакция изотопного обмена прошла практически количественно. Ниже, в гл. II.2.3, будут рассмотрены причины; приводящие к препаратам с различными величинами Ат„.

Таким образом, различия в величинах Амол связаны с большими значениями коэффициентов разделения изотопов водорода на палладии. Для уменьшения этого влияния на величину А„ол целевых соединений можно рекомендовать увеличение скорости основной реакции, применение катализаторов с низкой растворимостью водорода.

Табл. 2. Влияние изотопии на величину молярной радиоактивности продуктов реакции гидрогенолиза.

Концентрация 3Н, % Амол- (Ки/ммоль) для следующих значений ССн-т

2.5 3.6 4.7 12

99 28.3 27.8 26.0

95 25.4 23.3 17.8

90 22.2 19.1 12.5

85 19.5 15.9 9.3

80 17.1 13.4 7.3

75 15.1 13.2 5.8

70 13.3 11.5 4.7

60 10.2 8.6 3.2

50 7.7 6.3 2.2

Табл. 3. Основные характеристики меченых пуриновых и

пиримидиновых соединений, полученных в реакции каталитического

дегалогенирования тритием. Катализатор - палладий на носителе. В скобках расчетные величины Амол с учетом изотопии.

№ Меченое соединение Характеристики меченого Концентра-

п/п соединения ция трития,%

Ки/ммоль Выход, %

1 [2-аН]Аденин 24(23,3) 50 95

2 [2,8-3Н]Аденин 48 (47) 46 95

3 [8-3Н] Аденозин 9,8 (9,3) 19,5 85

4 [8-3Н] АМФ 6,2(9,3) 49,0 85

5 [8-3Н] 3\5'-цАМФ 21,6 (23,3) 26,7 95

6 д[8-3Н] АМФ 7,3 (5,8) 61,0 75

7 [8-3Н] Гуанозин 12,7(12,5) 45,4 90

8 [8-3Н] ГМФ 11,0 (9,3) 46,2 80

9 [8-3Н] 3',5'-цГМФ 5,5 (4,7) 55,0 70

10 д[8-3Н] ГМФ 14,0 (17,8) 29 95

11 Тимидин([3Н-метил])фосфонат 17,2 (17,8) 70,3 95

12 [2'-3Н] Тимидинфосфонат 18,5 (17,8) 71,5 95

13 [5-3Н] Урацил 18,0 (17,1) 79 80

14 [6-3Н1 Урацил [5,6-Н] Урацил 23,8 (25,4) 70 95

15 44 (50) 11,4 95

16 [5-3Н] Уридин 21,0 (22,2) 21 90

17 [5-3Н] Уридин 13,0 (13,3) 65 70

18 [5-3Н] УМФ 3,7 (7,3) 96 80

19 д[5-3Н] Уридин 21,2 (19,5) 92 85

20 д[2'-3Н] Уридин 23,1 (25,4) 83 95

21 д[5-3Н] УМФ 8,6(7,3) 43 80

22 [5-3Н] 3',5'-цУМФ 12,2 (12,5) 61 90

23 [5-3Н] ЦМФ 3,7 (4,7) 34 70

24 д[5-3Н] ЦМФ 16,3 (15,1) 74 75

25 [5-3Н] 3',5'-цЦМФ 18,1 (17,8) 54 95

Табл. 4. Меченные тритием соединения, полученные в реакции каталитического восстановления тритием. В скобках расчетные величины Амоп с учетом изотопии.

Предшественник Целевое соединение Амол,

Ки/ммоль

5-ГМ-дУридин [метил-аН]Тимидин 27,5 (27,8)

5-ГМ-Урацил [метил-3Н]Тимин 25,0 (25,4)

5-Формилурацил [метил-3Н]Тимин 55 (55,6)

5-ГМ-дУМФ [метил-3Н]ТМФ 11,9(12,5)

2',3'-дезокси-2',3'- [в.г'.з'^нр'.з1- 73,2 (76,2)

дегидроаденозин дидезоксиаденозин

3'-дезокси-2',3'- [2',3'-3Н]2',3'- 52,1 (50,8)

дегидротимидин дидезокситимидин

2',3'-дидезокси-2',3'- [2',3'-3Н]2',3'-диде- 59,2 (55,6)

дегидроцитидинфосфонат зоксицитидинфосфонат

Гиббереллин Аз Гиббереллин Ai 34,0

Табл. 5. Жидкофазный каталитический гетерогенный изотопный обмен диазинов с газообразным тритием. В скобках расчетные величины Амоп с учетом изотопии.

Соединение Продолжительность Амоп,

реакции, мин. Ки/ммоль

Аденозин 90 20,6 (23,3)

Дезоксиаденозин 90 25,6 (25,4)

2',3'-Дидезоксиаденозин 180 23,3 (25,4)

АМФ NN4 соль 90 12,2(17,8)

АМФ ТОА соль 90 0,1 (17,8)

д-АМФ 90 2,1 (17,8)

д-АМФ 120 8,6 (17,8)

д-АМФ 300 15,0(17,8)

д-АТФ 300 13,4(17,8)

3',5'-циклоАМФ 90 22,0 (22,2)

д-ГТФ 120 0,2 (17,8)

НАД 120 17,8(17,8)

Цитозин (З-О-арабинозид 180 16.2 (17,8)

Цитозин р-0-арабинозид-5'- 180 3,24(17,8)

монофосфат

02,2'-циклоцитидин 180 15,7(17,8)

02,2'-циклоцитидин-5'-монофосфат 180 4,3 (17,8)

ИУК 180 3,5 (17,8)

Гиббереллин Аз 90 21 (23,3)

Влияние конформации исходного соединения на молярную радиоактивность продукта реакции гидрогенолиза тритием

Конформация, т.е. взаимное расположение в пространстве остатка сахара и гетероциклического основания определяется главным образом двумя угловыми величинами. Одна из них - двугранный угол, образуемый плоскостями основания

и пентафуранозного остатка. Другая величина характеризует их взаимное расположение - гликозидный торсионный угол фсм- Этот угол определяется в виде относительного положения связи С(1')-0(1') сахара и плоскости гетероциклического кольца7 как показано на рис. 7.

Рис. 7. Относительное положение связи С(1')-0(1') сахара и плоскости гетероциклического кольца

Свободное вращение вокруг гликозидной связи в нуклеозидах и нуклеотидах затруднено. Наименьшие взаимодействия наблюдаются при значениях фСы -30 и +150°. Принято считать8, что соединения имеют АНТИ-конформацию, когда (pCN = -30 ± 45° и СИН-, когда cpCN = 150 ± 45°.

Конформацию интересующих нас соединений изучали методом кругового дихроизма (КД). На рис. 8 приведена конформация изученных нами соединений по данным спектроскопии КД. Известно9 образование структуры, состоящей из спирально расположенных плоских слоев и тетрамерных единиц 5'-ГМФ, образованных соединением через водородные связи: N(1) и N(2) - доноры, а 0(6) и N(7) - акцепторы.

Рис. 8. Конформация (по данным спектроскопии КД) бромзамещенных пуриновых (1, син-) и пиримидиновых (2, анти-) нуклеотидов в растворе.

7. Н.Н. Преображенская, З.А. Шабарова // Успехи химии, 38, 222, (1969)

8. J. Donohue, K.N. Truebold // J. Mol. Biol., 2, 363 (1960)

9. T.J. Pinnavaia, H.T. Miles, E.D. Becker. // J. Amer. Chem. Soc., 97,7198 (1975)

3' 2'

NH

1

2

Результаты изучения конформации интересующих нас соединений дают возможность оценить влияние их пространственной структуры на ход реакции гидрогенолиза. Из данных табл. 3 следует, что для производных урацила и цитидина молярная радиоактивность меченых соединений уменьшается в следующей последовательности: основание и дезоксирибонуклеозид > рибонуклеозид > дезоксирибонуклеотид и нуклеозид-3',5'-циклофосфат > рибону1слеотид.

В растворе 5-бромзамещенных пиримидиновых рибонуклеотидов существует внутримолекулярная водородная связь с участием 2-кето кислорода и 2'-гидроксила рибозы. Помимо этого, структура этих соединений приобретает дополнительную жесткость при взаимодействии отрицательно заряженной фосфатной группы с гетероциклическим основанием. По-видимому, подобная "ригидная" структура плохо фиксируется на поверхности гетерогенного катализатора, чем объясняется низкая Амол продукта этой реакции. В молекуле пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов отсутствует внутримолекулярная водородная связь и вращение пиримидинового основания вокруг Ы-гликозидной связи облегчено. 5-бромзамещенные пиримидиновые дезоксирибонуклеотиды, по-видимому, легче адсорбируются на поверхности палладиевого катализатора в силу их конформационной подвижности. В результате выход и молярная радиоактивность д[5-3Н]УМФ и д[5-3Н]ЦМФ значительно выше, чем у соответствующих р ибоп роизводн ых.

Отсутствие 5'-фосфатной группы в молекуле 5-бромуридина приводит к резкому увеличению (по сравнению с соответствующими нуклеотидами) Амол продукта реакции. Отсюда следует, что именно 5'-фосфатная группа снижает реакционную способность пиримидиновых рибонуклеотидов в реакции дегалогенирования тритием. Таким образом, уменьшение Аыол в рассмотренном выше ряду пиримидинов хорошо объясняется конформационными различиями этих соединений в растворе.

8-Бромзамеиценные пуриновые нуклеотиды, по данным спектрам КД, имеют в растворе СИН-конформацию (рис. 8). Продукты дегалогенирования этих соединений имеют в растворе конформацию, близкую к АНТИ. Отсюда можно предположить, что адсорбция на палладиевом катализаторе 8-бромзамещенных пуриновых производных и продуктов их дегалогенирования будет различной.

Син-конформация 8-бромзамещенных пуриновых нуклеотидов не препятствует протеканию реакции дегалогенирования. Однако Амол продуктов реакции относительно низкая. Мы предположили, что адсорбция на катализаторе продуктов дегалогенирования выше, чем у исходных соединений, и в результате конкуренции за реакционные центры скорость основной реакции дегалогенирования может уменьшиться. Это приведет, в свою очередь, к снижению А„ол в силу причин, обсуждавшихся выше.

Для проверки этого предположения рассмотрим данные табл. 5. По величине АМОл пуринов, получаемых в реакцию каталитического изотопного обмена с тритием можно судить о степени адсорбции данного соединения (являющегося продуктом дебромирования в реакции дегалогенирования) на поверхности палладиевого катализатора. Как видно из данных табл. 5, включение трития в производные аденина довольно высокое, а в гуаниновых низкое. Полученные данные говорят о том, что, как и предполагалось, производные аденина сильнее сорбируются на поверхности палладиевого катализатора, чем их галогензамещенные производные, а производные гуанина (также как и их 8-бромзамещенные производные) - очень слабо (из-за межмолекулярных взаимодействий, о которых говорилось выше).

Связь кинетических параметров реакции гидрогенолиза с молярной радиоактивностью меченого соединения

Как видно из табл. 1, в случае реакции дегалогенирования, например, 8-бромгуанозина и 5-бромдезоксиуридина, более высоким значениям константы скорости реакции в первом случае отвечают меньшие значения величин Амол. Увеличение скорости реакции гидрогенолиза (к1), приводит к увеличению молярной радиоактивности продукта реакции. Напротив, увеличение скорости растворения протия и/или трития в палладии (кг) приводит к увеличению степени их фракционирования и обогащению твердой фазы и адсорбированного водорода протаем, т.е. к снижению молярной радиоактивности. Таким образом, молярная радиоактивность продукта реакции каталитического дегалогенирования тритием связана со значениями величин к1 и кг. Наблюдается четкая зависимость от соотношения к^г молярной радиоактивности продукта дегалогенирования тритием (Рис. 9а), независимо от природы взятого в реакцию соединения.

а б

Рис. 9. а - зависимость от соотношения к^кг молярной радиоактивности продуктов реакции каталитического дегалогенирования тритий - протиевой смесью (1:1000, Ки/моль) - 1 и высокопроцентным тритием (Ки/ммоль) -2; б - зависимость выхода тритиевой воды в реакции каталитического дегалогенирования от величины кг.

Из рис. 9а видно, что при соотношении к^кг, равном 1,2 и выше, молярная радиоактивность продукта реакции гидрогенолиза постоянна и близка к максимальной при замене атома галогена атомом трития. Это говорит в пользу того, что на величину молярной радиоактивности продукта реакции гидрогенолиза тритием решающее влияние оказывает эффект фракционирования изотопов водорода при растворении их в палладии.

Согласно предложенной модели реакции гидрогенолиза, чем больше значение к2, тем интенсивнее должен идти изотопный обмен на палладии между тритием и растворителем. Этот процесс вызывает разбавление исходного газа и приводит к преимущественному включению трития в растворитель. Экспериментальные данные (рис. 96) подтверждают эти предположения.

Влияние активности палладиевых катализаторов на молярную радиоактивность и выход продукта реакции гидрогенолиза тритием

Согласно предложенной модели реакции гидрогенолиза, "каталитическая емкость" палладия (то) характеризует активность катализатора. Обработка экспериментальных кинетических кривых дегалогенирования с помощью уравнения (3) дает нам значение произведения к • то. Считая константу скорости реакции гидрогенолиза (к-|) данного соединения постоянной, можно

оценить относительную активность различных катализаторов в этой реакции, изучая кинетику реакции дегалогенирования соединения на различных катализаторах. Эти данные позволяют оценить их "каталитическую емкость" (т0).

Изменение АМОл можно рассчитать из данных рис. 9а. Изменение выхода продукта дегалогенирования можно выразить соотношением (4):

1 - ехр(-к1/кг * гпрЬ)

1 - ехр(-к1/к2 х т'оЬ)

где то и т'о - каталитическая емкость двух различных катализаторов.

В табл. 6 приведены расчетные и экспериментальные данные, характеризующие реакцию дегалогенирования тритием некоторых производных гуанозина на различных образцах палладиевого катализатора, отличающихся каталитической емкостью то. В этой же табл. приведены данные по изменению выхода и молярной радиоактивности продуктов дегалогенирования, наблюдаемые в эксперименте и рассчитанные по уравнению 4. Как видно из табл. 6, изменение выхода и молярной радиоактивности продукта каталитического дегалогенирования тритием удовлетворительно объясняется изменением активности катализатора.

Табл. 6. Характеристики реакции дегалогенирования тритием 8-бромгуанозина и 8-бромГМФ на разных партиях палладиевого катализатора.

Соедине- т0 катали- Выход, АмОЛ, Изменение выхода Изменение А„„,

ние затора % Ки/ммоль Практич. Теор. Практич Теор.

[8-'Н]Гуа- 1,50 45,4 12,7 1,62 1,78 2,54 2,18

НОЗИН 0,69 28,0 5,0

[8-"Н]ГМФ 1,00 75,0 4,8 0,75 0,50 0,44 0,34

2,92 99,0 11,0

Выше отмечалось, что максимальная величина АМол достигается при значениях (к1/к2)гпо, равных 1,0 - 1,2 и выше, Поэтому изменение активности палладиевых катализаторов должно в заметной степени сказываться на изменении выхода и молярной радиоактивности соединений, для которых это значение меньше единицы.

Согласно модели реакции гидрогенолиза, "каталитическая емкость", при прочих равных условиях, пропорциональна количеству взятого в реакцию катализатора. Увеличение молярного соотношения палладий - 8-бром-АМФ с

0,25 до 1,5 (2, рис. 10) приводит к увеличению Амол АМФ и выходу кривой на стационарное состояние. Это увеличение связано с повышением величины т0, а, следовательно, и параметра (к1/кг)то.

60 г

О

1

I 30 =-

ООО—о

5 20 I-

10 г 0

,1

,1 1,0 10,0 Молярное соотношение палладий/ЯВг

Рис. 10. Зависимость от соотношения вещество - катализатор молярной радиоактивности д[5-3Н]уридина (1) и [8-3Н]АМФ (2).

Согласно данным табл. 1, Амол [8-3Н]АМФ, близкую к максимальной, можно достичь при увеличении значения (к^^то в 5 - 6 раз (с 0,2 до 1,0 - 1,2), что хорошо совладает с данными, представленными на рис. 10. В случае дегалогенирования 5-бромдезоксиуридина, значение (кДг^о уже отвечает стационарному состоянию и дальнейшее его увеличение не вызовет повышения Амол (1, рис. 10), что также наблюдается в эксперименте.

Способы увеличения молярной радиоактивности препаратов, получаемых в реакции гидрогенолиза тритием

Предложенный механизм реакции гидрогенолиза тритием, изучение общих закономерностей протекания реакций гидрогенолиза с участием пуриновых и пиримидиновых соединений дают возможность наметить ряд путей для увеличения молярной радиоактивности продукта реакции. Например, величина Амол меченого соединения пропорциональна значению (к<Д2)то (Рис. 9а). Отсюда увеличение АМОл продукта реакции гидрогенолиза тритием связано с увеличением скорости основной реакции (к1) и активности палладиевого катализатора (то), со снижением скорости образования гидрида палладия (кг) или с одновременным изменением всех этих параметров. Ниже будут рассмотрены возможные пути осуществления этих предложений.

Конформационная или структурная модификация исходного соединения

Сущность этого пути состоит в синтезе производных соединения, участвующего в реакции гидрогенолиза, которые либо сильнее сорбируются на поверхности палладиевого катализатора, либо обладают более высокой реакционной способностью, в силу, например, большей конформационной подвижности и т.п.

В пиримидинах, как это отмечалось выше, наименее реакционно-способными соединениями в реакции дегалогенирования тритием являются 5-бромзамещенные рибонуклеотиды. Взаимодействие фосфатной группы с гетероциклическим основанием приводит к образованию так называемой «ригидной» структуры и, как следствие, к снижению молярной радиоактивности целевого соединения. Поэтому различные модификации, приводящие к уменьшению «ригидности», могут привести к увеличению молярной радиоактивности продукта дегалогенирования тритием.

Возможным путем уменьшения влияния 5'-фосфатной группы на пиримидиновое основание в реакции дегалогенирования рибонуклеотидов является блокирование 5'-фосфата длинной алифатической цепочкой, например, при образовании три-н-октиламмониевой соли рибонуклеотида.

В табл. 7 приведены результаты дегалогенирования тритием три-н-октиламмониевых солей пиримидиновых и пуриновых нуклеотидов, Каталитическое дегалогенирование три-н-октиламмониевых солей пиримидиновых рибонуклеотидов дает увеличение А„ол продукта реакции (см. Табл. 1). Результаты реакции с пуринами можно объяснить различной степенью адсорбции на катализаторе три-н-октиламмониевых солей бромированных и не бромированных нуклеотидов.

Табл. 7. Каталитическое дегалогенирование тритием три-н-октиламмониевых солей (TOA) рибонуклеотидов.

№ п/п TOA соль Меченое соединение

Выход, % Амол, Ки/ммоль

1 5-Вг-УМФ 80 19,0

2 5-Вг-ЦМФ 74 25,0

3 8- Вг-АМФ 28 16,7

4 8- Вг-ГМФ 4 0,8

Повышение эффективности применяемого катализатора

Ранее было показано, что растворение водорода в палладии является основной причиной снижения Амол продукта дегалогенирования. Известно10, что растворимость водорода в палладии уменьшается линейно с ростом дисперсности металла (отношение числа атомов на поверхности к числу атомов в объеме металла). Уменьшая количество палладия на единицу поверхности носителя, можно получить катализатор с очень высокой степенью дисперсности металла. Нами были приготовлены катализаторы с низким, менее 1%, содержанием палладия на носителе. Эти катализаторы были изучены в реакции каталитического дегалогенирования тритием.

20 -

10

,01 ,10 1,00 % Pd/BaSC>4

100 200 300 Время, мин.

Рис. 11 Рис. 12

Рис. 11. Зависимость Амол [8-3Н]гуанозина от содержания палладия на носителе.

Рис. 12. Кинетика реакции дегалогенирования 5-бромуридина (о) и 5-бромдезоксиуридина (□) на катализаторе 0,05% PdSiOi.

На рис. 11 приведена зависимость молярной радиоактивности [8-3Н]гуанозина, полученного в реакции дегалогенирования высокопроцентным тритием от содержания палладия на сульфате бария. Во всех экспериментах отношение палладий - 8-бромгуанозин было одинаковым.

10. М. Boudart, Н. Hwang // J. Catal., 39,44 (1975)

Из полученных данных видно, что при содержании палладия на сульфате бария ниже 0,1%, молярная радиоактивность [8-3Н]гуанозина резко возрастает. В присутствии катализатора 0,01% Рс1/Ва504 молярная радиоактивность меченного тритием гуанозина близка к максимальной. Аналогичные данные были получены для катализатора 0,05% палладия на силикагеле (0,05% Рс1/8Ю2). Увеличение геометрической поверхности носителя при переходе к силикагелю приводит к увеличению процентного содержания палладия, обуславливающего этот эффект. В табл. 8 приведены характеристики реакции дегалогенирования некоторых бромзамещенных компонентов нуклеиновых кислот в присутствии катализаторов с низким содержанием палладия.

Табл. 8. Дегалогенирование бромзамещенных компонентов нуклеиновых кислот на низкопроцентных палладиевых катализаторах.

Исходное Соединение Катализатор Меченое соединение

Выход, % АМОл, Ки/ммоль

5-Вг-УМФ 0,01% Рс1/Ва304 15 25,1

5-Вг-дЦМФ 0,05% РсМБЮг 30 25,8

8-Вг-аденозин 0,05% Рй/БЮг 30 25,0

8-Вг-АМФ 0,05% Ра/БЮг 14,4 25,0

8-Вг-ГМФ 0,05% Рй/ЭЮг 30 17,0

Из табл. 8 видно, что Амол продукта дегалогенирования близка к максимально достижимой и практически не зависит от природы исходного бромзамещенного соединения. Это объясняется тем, что в данных катализаторах водород и/или тритий не растворяются и гидридная фаза отсутствует. С учетом коэффициента разделения протий - тритий при фазовом и адсорбционном равновесии на палладии, равном 2,5, молярная радиоактивность продукта реакции дегалогенирования 95%-ным тритием на низкопроцентном палладиевом катализаторе должна составлять 25,4 Ки/ммоль (см. табл. 2). Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с этой величиной.

Изучение кинетики реакции дегалогенирования (рис. 12) показало, что при переходе к низкопроцентному палладиевому катализатору порядок реакции дегалогенирования становится нулевым. При этом кинетические кривые дегалогенирования изученных соединений практически совпадают. Изменение порядка реакции связано, по-видимому, с изменением механизма процессов, протекающих на палладиевом катализаторе. Данные, приведенные на рис. 12 отвечают первому случаю "ударного" механизма реакции дегалогенирования,

т.е. когда водород на катализаторе отсутствует. В пользу этого утверждения говорит нулевой порядок реакции и высокая молярная радиоактивность продукта дегалогенирования.

Таким образом, основной причиной снижения Амол соединений, получаемых в реакции гидрогенолиза (дегалогенирование, гидрирование, изотопный обмен) является наличие больших коэффициентах разделения протий - тритий в системе водород - палладий - вода.-Достижение максимальных величин АМОл в реакциях гидрогенолиза тритием будет, следовательно, заключаться в снижении влияния этого эффекта, а именно, повышении скорости основной реакции (применение более активных катализаторов), уменьшении степени растворения водорода в палладии (катализаторы с низким, менее 0,1%, содержанием палладия на носителе), структурной модификации исходных соединений. Вопрос о том, какой именно прием необходим для увеличения АЫОл, решается в каждом конкретном случае в зависимости от природы исходного соединения с учетом предложенной нами модели реакции гидрогенолиза.

Реакция изотопного обмена с тритиеаой водой

В компонентах нуклеиновых кислот наиболее легко обменивается протон, связанный с атомом С(8) пуриновых оснований'1. Водород, связанный с атомом С(2) обменивается существенно труднее12. Мы изучали зависимость от рН скорости изотопного обмена АТФ ГТФ с водой. Некоторые кинетические характеристики этой реакции приведены в табл. 9.

Полученные данные позволяют выбрать оптимальные условия введения трития в 8-ое положение пуринов, а также решить обратную задачу - реобмен трития из 8-ого положения для получения, например, [2-3Н]адениновых соединений из соответствующих [2,8-3Н]соединений.

Табл. 9. Кинетические характеристики реакции изотопного обмена АТФ и ГТФ с водой.

PH kx 105, сек"1 АТФ Еакг (ккал/моль) k х 105, сек"1 ГТФ Earn* (ккал/моль)

2 1,31 19,5 8,65 20,1

7 7,26 25,8 32,2 22,4

11 11,2 21,8 165 15,4

11. K.R. Shelton, J.M. Clark II Biochemistry, 6,2735 (1967)

12. J.L. Wong, J.H.Jr. Keek. H J. Chem. Soc. Chem. Communs., 4, 125 (1975)

А„ол соединений, получаемых этим методом, ограничена Амол применяемой тритиевой воды. Обычно эта величина не превышает 100 - 200 Ки/мл (3 - 6% от теоретически достижимой величины). Тритиевая вода с более высокой Амол не стабильна из-за саморадиолиза. Мы предложили использовать в реакциях изотопного обмена раствор высокоактивной тритиевой воды в инертном безводном органическом растворителе. В этом случае имеется возможность применения тритиевой воды с очень высокой, вплоть до теоретической, Амол.

Тритиевую воду со сверхвысокой А„0л получали окислением высокопроцентного газообразного трития над оксидом палладия в сухом (содержание воды менее 0,05%) органическом растворителе. Изучали влияние различных гетерогенных и гомогенных палладиевых катализаторов, массовой доли тритиевой воды на выход и Амол получаемых соединений.

Предварительные исследования показали, что при концентрации тритиевой воды выше 2% в органическом растворителе достигается максимальная Амол меченых соединений. Изучение влияния различных катализаторов на изотопный обмен 6-бензиламинопурина с тритиевой водой в ДМФА показало, что лучшие результаты достигаются, как правило, в случае применения катализатора 5% PCÍ/AI2O3. Для рибозы и 2'-дезоксирибозы наибольшая величина молярной радиоактивности была достигнута в случае катализатора PdO. Оптимальная продолжительность реакции изотопного обмена 10 часов.

В табл. 10 приведены значения величин Амол меченных тритием соединений, полученных в реакции изотопного обмена с высокоактивной тритиевой водой. Из этих данных видно, что А„ол получаемых соединений достаточно высокая. Тритиевая метка вводится как в соединения относительно простого строения (рибоза, 2'-дезоксирибоза), так и в соединения довольно сложного строения, такие как гиббереллины, фузикокцин-Н и никотинамидаденин динуклеотид. Предложенный нами способ позволяет получать меченные тритием соединения, содержащие легко восстанавливаемые или гидрируемые группы, например гиббереллины, 17а-метиландростендиен-1,4-ол, 17а-метиландростендиен-5-диол-Зр-17а, зеатин, и зеатинрибозид. Проведение каталитических реакций изотопного обмена с участием газообразного трития для подобных соединений затруднительно, а

зачастую практически невозможно. Это обусловлено тем, что в подобных условиях происходит преимущественное гидрирование этих соединений. К недостаткам метода можно отнести относительно большой расход изотопа и связанная с этим повышенная радиационная опасность при работе с большими количествами тритиевой воды по радиоактивности.

Табл. 10. Меченные тритием соединения, полученные в реакции изотопного обмена с высокоактивной тритиевой водой.

Соединение Ам0Л1 Соединение Амол,

Ки/ммоль Ки/ммоль

17а-метиландростендиен- 5.40 Никотинамид аденин 4.50

1,4-ол динуклеотид

17а-метиландростендиен- 6.10 3- И ндол илу ксусная 9.75

5-диол-Зр-17а кислота

Гиббереллин Ai 5.5 Бензиладенин 24.5

Гиббереллин Аз 4.9 Фузикокцин-Н 10.8

Зеатин 18.0 Рибоза 7.10

Зеатинрибозид 16.5 2'-Дезоксирибоза 6.50

Твердофазная каталитическая гидрогенизация

При изучении реакций гидрогенолиза было установлено, что основным негативным процессом, влияющим на Амол целевого соединения, является параллельная реакция изотопного обмена трития с протонами растворителя и фракционирование изотопов водорода на палладии. Поэтому кардинальным способом уменьшения влияния этих процессов будет отказ от применения растворителя. Этот прием был впервые предложен13 в 1967 г. на примере дегалогенирования 5-иод-урацила в твердой фазе без растворителя. В последующих работах было показано14,15, что в аналогичных условиях протекают реакции гидрирования и изотопного обмена, что позволило назвать его твердофазной каталитической гидрогенизацией (ТКГ). Сущность метода состоит в обработке газообразным тритием твердой смеси предшественника и катализатора. Для интенсификации процесса предлагался внешний подвод энергии. Наиболее предпочтительным оказалось инициирование реакции нагреванием реакционной смеси.

13. Н.Ф. Мясоедов //A.c. 243621 СССР,&ол. юобрет. 39, 159 (1976)

14. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozic, E.M. Dorokhova, N.F. Myasoedov // J. Labelled Compd. Ratiopharm., 29,997 (1991)

15. Yu.A. Zolotarev, V.S. Kozic, E.M. Dorokhova, D.A. Zaitsev, N.F. Myasoedov, S.G. Rosenberg // J. Radioanal, Nucl. Chem. Articles, 162,3 (1992)

В основе ТКГ лежит спилловер водорода, активированного на катализаторе и его диффузия в слой органического соединения16,17, где протекают самые разнообразные реакции гидрогенолиза. В работе исследовано влияние температуры, состава твердой фазы, строения исходных соединений на ход реакции ТКГ.

Влияние температуры и состава твердой фазы на реакцию ТКГ

Изучение реакции ТКГ трития с гетероциклическими основаниями показало (рис. 13), что в интервале температур 150 - 170 °С наблюдается резкое увеличение степени изотопного замещения тритием вплоть до теоретической. В этой реакции тритий равновероятно включался во 2-ое и 8-ое положения аденина, хотя известно18, что в обычных реакциях изотопного обмена, протон во 2-ом положении примерно в 1000 раз менее подвижен, чем аналогичный в 8-ом положении.

Из данных гидрирования 5-формипурацила (Рис. 14) видно, что, начиная с определенной температуры, включение трития в тимин становится больше стехиометрического, отвечающего восстановлению формильной группы. Было установлено, что в выбранных условиях наряду с реакцией восстановления протекает параллельная реакция изотопного обмена водорода формильной группы на тритий. Практическим результатом явился синтез тимина, в котором практически все атомы водорода полностью замещены тритием (Амол выше 100 Ки/ммоль).

Было установлено, что для соединений, которые в ходе реакции подвергаются термической деструкции с ростом температуры и весового соотношения катализатор/соединение величина АМОл целевого соединения увеличивается, а его выход падает (рис. 15). Эту зависимость можно назвать типичной, т.к. она характерна практически для всех подобных соединений.

Существенную роль играет природа носителя палладиевого катализатора. Было установлено, что эффективность носителей палладиевых катализаторов в реакции ТКГ аденинозых нуклеозидов падает в следующем ряду: Pd/CaCOj > Pd/BaS04 > Pd/Al203 > Pd/C. Роль носителя палладиевого катализатора

Тб. A.V. Filikov, N.F. Myasoedov // J. Radioanal. Nucí. Chem. Lett.,85, 373 (1984)

17. A.V. Filikov, N.F. Myasoedov//J. Catal., 130,355 (1991)

18. J.L. Wong, J.H.Jr. Keek. II J. Chem. Soc. Chem. Communs. ,4, 125 (1975)

Рис.13 Рис.14

Рис. 13. Зависимость от температуры молярной радиоактивности аденина (1), гуанина (2), ксантина (3) и гипоксантина (4), полученных в реакции ТКГ тритием.

Рис. 14. Кинетика реакции ТКГ 5-формилурацила тритием (1:1000). 1 80 °С, 2 - 100°С, 3-120 °С, 4 -150 °С.

Рис. 15. Зависимость выхода (1) и Аюп (2) кинетина, полученного в реакции ТКГ тритием от температуры (а) и соотношения катализатор/вещество (б).

существенна и до конца не выяснена. Так для пуриновых оснований и нуклеозидов, как отмечалось выше, наиболее эффективным носителем является карбонат кальция. Для остальных исследованных соединений более эффективным оказался сульфат бария. Введение в состав твердой фазы инертного неорганического носителя (карбонат кальция, оксид алюминия) позволило увеличить выход дезоксинуклеозидов, особенно 2'-дезоксиаденозина. Это важно для термически не стойких соединений, т.к. позволяет повысить Амол при удовлетворительном выходе целевых соединений.

Таким образом, варьирование условий реакции ТКГ (температура, природа катализатора, состав твердой фазы, продолжительность реакции) дает широкие возможности для синтеза меченых соединений с требуемыми характеристиками.

Влияние структуры исходных соединений на включение трития в реакции ТКГ

Проведение реакции ТКГ тритием при 150 °С и выше дает возможность практически полного изотопного замещения (Рис. 13) всех атомов водорода в молекуле исходного соединения на тритий. Однако практически полное изотопное замещение наблюдается только для соединений относительно простого строения, таких как пуриновые основания. Изучение внутримолекулярного распределения трития ряда соединений (Табл. 11) показывает, что включение трития в пуриновое часть исходной молекулы зависит от природы исходного соединения.

Табл. 11. Внутримолекулярное распределения трития пуриновых соединений, получаемых в реакции ТКГ.

Исходное Амоп, Км/ммоль Доля трития в Амол основания,

соединение основании Ки/ммоль

Аденозин 120 0,48 58

Гуанозин 69 0,30 21

Ацикловир 129 0,14 18

АМФ 12,5 0,12 1,5

АТФ 12,3 0,13 1,6

НАД 111 0,013 1,4

Коэнзим А 1,80 0,89 1,6

Так, в случае нуклеозидов, включение трития в пуриновую часть молекулы практически количественное. При переходе к соединениям более сложного строения, таким как АМФ, АТФ и коэнзимы, включение трития в пуриновую часть

молекул существенно ниже. При этом величины Амол, приходящейся на долю пуринового основания практически одинаковы. Мы связываем этот эффект с наличием определенной конформации этих соединений и стерическим препятствием протекания реакции ТКГ тритием с пуриновой частью молекулы. Отсюда можно заключить, что реакция ТКГ наиболее интенсивно протекает с «открытыми» частями молекулы. Пуриновые основания не имеют вторичной структуры, поэтому для этих и подобных соединений наблюдается практически полное изотопное замещение тритием.

Из данных, представленных в табл. 11 можно заключить, что основным фактором, приводящим к резкому снижению реакционной способности пуринового основания в реакции ТКГ тритием, является наличие 5-фосфатной группы нуклеотида.

Влияние пространственной структуры на включение трития в реакции ТКГ может служить основой метода «тритиевого зонда». Сущность метода состоит в проведении реакции ТКГ тритием в контролируемых, стандартных условиях и анализе внутримолекулярного распределения трития полученного соединения. По величине АЫОл фрагментов молекулы можно судить о том, какие части исследуемой молекулы лежат на поверхности. Такой подход может быть особенно полезен для сложных макромолекул, исследование которых обычными физическими методами (ЯМР, рентгеноструктурный анализ и др.) сопряжено с трудностями обработки экспериментальных данных.

Практическое применение реакции ТКГ тритием

В табл. 12 суммированы результаты применения реакции ТКГ для синтеза меченных тритием диазинов. Из этих данных видно, что АМОл получаемых соединений выше аналогичной величины, достигаемой другими методами. Для соединений относительно простого строения достигнуто практически полное изотопное замещение водорода тритием.

Варьирование составом твердой фазы и температурой дает широкие возможности целенаправленного изменения выхода и Ат„ целевых соединений. Этот метод, также как и другие реакции изотопного обмена, не требует синтеза специальных предшественников, а возможности более полного изотопного замещения водорода тритием у него существенно выше. Метод позволяет вводить тритий как в относительно простые соединения (гетероциклические

основания), так и в довольно сложные, - такие как олиго-, полинуклеотиды, никотинамидадениндинуклеотид, коэнзим А и РНК.

К недостаткам метода можно отнести термическую деградацию исходного соединения. В случае синтеза меченного тритием 2',5'-олигоаденилата, в продуктах реакции был обнаружен продукт изомеризации, а именно 3',5'-изомер. При повышении температуры реакции ТКГ происходит гидрирование 5,6-двойной связи пиримидинов.

Табл. 12. Диазины, полученные в реакции ТКГ тритием.

Соединение 1,°С Амол, Ки/ммоль

Аденин 170 54.2

Гуанин 210 24.9

Ксантин 180 25.1

Гипоксантин 200 51.1

Тимина) 140 85

ТиминЬ) 170 110

Тиминс) 170 115

Урацил 170 49

Бензиладенин 190 180

Теофиллин 160 24,8

Фурфур ил аденин 160 160

Аденозин 210 120

2'-дезоксиаденозин 190 84

Гуанозин 210 69

2'-дезоксигуанозин 200 35

Тимидин 160 76

З'-Азидотимидин 120 30

Ацикловир 210 125

2',3'-дидезокситимидин 120 66

З'-Азидотимидинфосфонат 120 63

Ацикловирфосфонат 120 56

АМФ 150 15

АТФ 150 10

2',5'-АрАрАр 200 58

3',5'-АрА 110 9.2

3',5'-АрАрА 110 50

3',5'-рАрАрАр 110 27

Поли-А (7-8Э) 180 10.2*

Поли-У (12Б) 180 12.0*

РНК 158 180 12.1*

Никотинамидадениндинуклеотид 110 111

Коэнзим А 180 3,9

а) из 5-формилурацила

с) из тимина

•удельная радиоактивность в Ки/г

Ь) из 5-оксиметилурацила

с!) из 5-оксиметилдезоксиуридина

Однако, как видно из изложенного материала, упомянутые выше недостатки реакции ТКГ не являются решающими, так как тщательный выбор условий проведения процесса позволяет свести к минимуму (насколько это возможно) побочные реакции и синтезировать соединения, содержащие гидрируемые группы (5,6-двойная связь пиримидинов) и термически не стойкие соединения (олиго-, полинуклеотиды, РНК).

Сравнительные характеристики различных методов синтеза меченных тритием биологически важных диазинов приведены в табл. 13.

Табл. 13. Сравнительные характеристики различных методов синтеза меченных тритием биологически важных диазинов.

Способ Использу- Способ Достигаемая

введения трития емая реакция проведения реакции Обычно Амол (Ки/ммоль)

Дегалоиди- В растворе 15-45

рование

В твердой фазе 5-20

Химический Гидрирова- В растворе 15-40

синтез ние,

восстановление В твердой фазе 40-90

С 6Н- В растворе 5-10

растворите-

лем

С В растворе до 25

высокоактив-

ной водой

Изотопный обмен С газообраз- В растворе 5-25

ным тритием В твердой фазе 20 - 120, до 250

Энзиматические методы модифицирования меченных тритием диазинов

Биосинтез нукпеозидов и нуклеотидов хорошо изучен. В 1960 году Е. Канеллакис и сотр.19 предложили использовать энзиматические реакции для синтеза меченых предшественников нуклеиновых кислот. Общие подходы к биосинтезу нукпеозидов и нуклеотидов изложены в работе20.

19. Е. Canellacis, М.Е. Gottesmsm, Н.О. Kämmen//, Biochim. Biophys. Acta, 39, 82 (1960)

20. М.Д. Франк-Каменецкая // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М. 1989.

В предлагаемой работе основное внимание было уделено практическому использованию ферментативных методов синтеза меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот из ограниченного числа меченых предшественников. Существенное внимание при разработке технологии получения компонентов нуклеиновых кислот из этих предшественников уделялось влиянию молярной радиоактивности субстрата на выход продуктов реакции и совершенствованию условий проведения реакции для оптимального выхода конкретных соединений. Напомним преимущества энзиматических реакций в синтезе меченых соединений:

- одно стадийность процесса без предварительной защиты активных функциональных групп

- возможность практически полного превращения субстрата в целевое соединение

- высокая радиохимическая чистота получаемых препаратов, обусловленная тонкой фермент-субстратной специфичностью.

Типы энзиматических реакций и используемые ферменты приведены в табл. 14.

Табл. 14. Энзиматические реакции и используемые ферменты

№ Энзиматическая реакция Фермент и его источник

1 5'-фосфорилирование нуклеозидмоно-фосфатов до ди- и трифосфатов Нуклеозидмоно- и дифосфаткиназы из дрожжей или Е. Coli

2 Синтез нукпеотидов из оснований и Э-рибозы Полиферментный препарат из £ Coli

3 Перенос 2'-дезоксирибозы с одного основания на другое TpaHC-N-дезоксирибозилаза из печени крыс

4 5'-фосфорилирование нуклеозидов до нуклеозидмонофосфатов Фосфотрансфераза из моркови или Erwinia Herbicola

На сочетании радиохимических и энзиматических методов было разработано несколько схем синтеза меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот. Это определялось тем, что именно эти соединения пользуются стабильно высоким спросом и их номенклатура достаточно велика (нумерация схем синтеза соответствует типам используемых энзиматических реакций, приведенным в таблице 14).

1. Препараты, содержащие один атом трития (Амол до 25 Ки/ммоль)

[3Н]НМФ -»[3Н]НДФ + [3Н]НТФ

2. Кратномеченые препараты (АМОл 40 Ки/ммоль и более) [3Н]Основание +■ Д-Рибоза -» [3Н]НМФ + [3Н]НДФ + [3Н]НТФ

Тиминовые соединения (Амол до 130 Ки/ммоль)

3. [3Н]Тимин + 2'-дезоксиуридин -> [3Н]Тимидин + Урацил

4. [3Н]Тимидин + ПНФФ [3Н]ТМФ + ПНФ

В основу первой схемы для получения соединений, содержащих в молекуле один атом трития (Амол до 25 Ки/ммоль) положен синтез меченных тритием нуклеозидмонофосфатов. Проведение реакции энзиматического фосфорилирования этих соединений дает преимущественно соответствующие нуклеозидтрифосфаты (Табл. 15). Возможно целенаправленное получение нуклеозид-5'-дифосфатов путем изменения количества креатинфосфата (КрФ) в реакционной смеси. Было установлено, что максимальный' выход нуклеозиддифосфатов может быть достигнут при содержании 10% КрФ в реакционной смеси от теоретического (Рис. 16). Возможно решение обратной задачи, а именно ферментативное дефосфорилирование нуклеозид-5'-монофосфатов до нукпеозидов. Эту реакцию осуществляли с помощью щелочной фосфатазы из Е, coli, иммобилизованной на сефарозе 4В (Рис. 17). Таким образом, изменяя условия проведения энзиматической реакций, можно получать весь набор нуклеотидов данного основания разной степени фосфорилирования.

Табл. 15.Энзиматическое фосфорилирование меченных тритием нуклеозид-5'-монофосфатов.

Субстрат Выход нуклеозид-5'-ФосФатов, %

Моно- ди- три-

[8-3Н]АМФ - - 92-96

[8-3Н]ГМФ* 5-10 1-5 85-94

д[8-3Н]АМФ 10-15 3-5 80-87

д[8-3Н]ГМФ 10-15 3-5- 80-87

[5-3Н]УМФ 4-6 1-3 90-95

[5-3Н]ЦМФ 5-7 5-8 85-90

д[5-3Н]ЦМФ 20-30 8-10 50-60

В основе второй схемы, для получения препаратов, содержащих два и более атомов трития в молекуле, лежал биосинтез из соответствующих оснований и D-рибозы под действием ферментной фракции, выделенной из Е. Coli. На рис. 18 и 19 приведена кинетика реакции фосфорибозилирования аденина и урацила соответственно.

% КрФ (от теор.)

Рис. 16 Зависимость выхода АДФ (1) и УДФ (2) от содержания креатинфосфата в реакционной смеси.

Время, мин

Рис. 17. Расщепление [8-3Н]АМФ до [8-3Н]Аденозина щелочной фосфатазой из Е. Coli (39 ед/мг.). Концентрация [8-3Н]АМФ: 10 мМ -1, 30 мМ -2, 50 мМ - 3.

10 20 Брели, юн

30

10 20 Время, млн.

30

Рис. 18 Рис. 19

Кинетика энзиматического фосфорибозилирования [2,8-3Н]аденина (Рис. 18) и [5,6-3Н]урацила (Рис. 19). 1 - основание, 2 - нуклеозид-5'-монофосфат, 3 - нуклеозид-5'-дифосфат, 4 - нуклеозид-5'-трифосфат.

Для синтеза из тимина кратно меченого тимидина и его нуклеотидов применяли иную схему. На первой стадии проводили реакцию транс-Ы-дезоксирибозилирования тимина до тимидина под действием фермента, выделенного из печени крыс. В качестве донора дезоксирибозы служил 2'-дезоксиуридин. На рис. 20 приведена кинетика этой реакции.

а б

100

се

О X 2 СО

50

100

50

А 3

2 4 6 8 д-урщиьЛиМ'Н

10

0 50 100

Время, мин

Рис. 20. Зависимость выхода тимидина от избытка 2'-дезоксиуридина (а) и от времени проведения реакции (б). 1 • Амол = 4,0 Ки/ммоль, 2 - Амол = 41 Ки/ммоль, 3 - Аыол= 88 Ки/ммоль.

Максимальный выход тимидина, меченного тритием, достигается при десятикратном избытке 2'-дезоксиуридина (Рис. 20а) в течение 90 минут (Рис. 206). При получении меченных тритием препаратов с помощью энзиматических реакций возникает вопрос о влиянии молярной радиоактивности субстрата на выход продукта реакции. Из-за высоких лучевых нагрузок возможно ингибирование ферментов, как под действием р-излучения трития, так и за счет продуктов радиолиза. Для препаратов тимина с молярной радиоактивностью 4 -40 Ки/ммоль скорости реакций довольно близки и выход тимидина составляет «90% (рис. 206). Участие в реакции тимина с Амол 88 Ки/ммоль привело к заметному снижению скорости реакции через »5 минут инкубации (выход тимидина »65%). Увеличение количества ферментного препарата вдвое позволило снизить эффект ингибирования и через 90 минут инкубации выход тимидина составлял 80 - 85%. Следует отметить, что при использовании д[2'-3Н]уридина в качестве донора дезоксирибозы получается тимидин с меткой в гетероциклической и сахарной частях молекулы. Таким способом был синтезирован [метил, 2',6-3Н]тимидин с Амол более 130 Ки/ммоль.

Для перехода к соответствующим нуклеотидам использовали реакцию 5'-фосфорилирования нуклеозидов. Источником фосфата в этом случае служит паранитрофенилфосфат. Полученный таким образом меченный тритием тимидин-5'-монофосфат можно превратить в соответствующий ди- и трифосфат используя реакцию энзиматического фосфорилирования, о которой говорилось выше.

Сочетание радиохимических и энзиматических методов позволило разработать общие схемы синтеза более 100 наименований меченных тритием соединений.

Практическое применение научных разработок

Выполненные исследования позволили осуществить комплекс мер по организации производства в стране меченных тритием диазинов и их производных. Эти меры включали в себя следующее:

- разработку общих схем синтеза необходимых предшественников и меченых препаратов

- выделение необходимых ферментов

- применение эффективных методов выделения и очистки меченых соединений. Для этих целей были развиты методы ионообменной и высокоэффективной (ВЭЖХ) хроматографии.

- обессоливание элюатов после проведения хроматографической очистки. В случае использования летучих буферов (главным образом на основе триэтиламмонийбикарбоната) обессоливание заключалось в простой отгонке растворителя с последующим удалением остатка буфера отгонкой с 50%-ным этанолом. Для удаления нелетучих солевых буферов было проведено исследование адсорбции и десорбции пуринов и пиримидинов на активированных углях различных марок и выбраны оптимальные условия проведения этой операции. В случае необходимости следы солей удаляли на ЗерЬайехС-Ю.

- обеспечение аналитического контроля готовых меченых препаратов. Чистоту препаратов определяли методами тонкослойной радиохроматографии и ВЭЖХ.

- определение условий и сроков хранения, гарантирующих качество препаратов.

Основным документов, стандартизующим качество выпускаемых препаратов является разработанные в ИМГ РАН отраслевые технические условия «Биологически активные соединения, меченные тритием» (ТУ 95 162298 ЛУ). В результате осуществления всего приведенного выше комплекса мер значительно расширена номенклатура меченых препаратов, выпускаемых в РФ. Это относится как к серийно изготовляемым препаратам, включенным в каталог В.О. «Изотоп», так и к препаратам, поставляемым по договорам в СНГ и по контрактам за рубеж. На рис. 21 приведены данные по поставкам указанных препаратов через В.О. «Изотоп» (в пределах бывшего СССР). Меченные тритием соединения поставлялись более чем в 60 различных организаций в пределах бывшего СССР, что позволило полностью обеспечить потребности страны в подобных препаратах.

С 1994 года поставки внутри страны сократились, экспортные поставки возросли. Экспортная деятельность потребовала проведения дополнительных работы по улучшению таких характеристик, как качество препаратов (химическая и радиохимическая чистота более 97%; согласно ТУ 95 1622-98 ЛУ эта величина более 95%) и выпускной формы (фасовка, сопроводительная документация,

паспортизация), гарантирующие сохранность меченого соединения как в процессе транспортирования, так и хранения. Результаты экспортной деятельности приведены на рис 22. С 1981 года по настоящее время по разработанной технологии было поставлено более 20 кюри меченных тритием диазинов и их производных.

>5

О

и X

ь Я

о ш

а> о

т з:

Ж о

г

о

ье Л

X

40 35 30 25 20 1 5 1 0 5 0

В

а 2

2

О

10 О

1980 1982 1984 1986 1988 1989 1990 1991 1992 1993 Поставки по годам

Рис. 21. Поставки меченных тритием соединений через В.О. «Изотоп» (в пределах бывшего СССР). Белые столбцы - количество наименований; черные - объем поставок в Кюри.

40

5

а 2

ьв

2

о

ю О

1994 1995 1996 1997 1998 Поставки по годам

Рис. 22. Экспорт меченных тритием соединений. Белые столбцы-объем поставок в Кюри; черные - объем продажи в тыс. $.

В заключении остановлюсь еще на одном аспекте практического применения меченных тритием гормонов растений. С помощью меченных тритием гормонов растений, методы получения которых были разработаны в предлагаемой работе, был предложен новый способ их количественного

«А

30 и

1-

20 пГ 2

>■

10 О

2

определения в растительных экстрактах. Сущность предлагаемого способа заключается в использовании метода изотопного разведения. Меченные тритием гормоны растений с высокой молярной радиоактивностью добавляли в растительный материал на стадии экстракции. Далее, после проведения предварительной очистки выделяли индивидуальные соединения. По уменьшению молярной радиоактивности рассчитывается содержание анализируемого гормона в растительном экстракте. Способ отличается от известных тем, что в едином аналитическом процессе можно определить все гормоны растений - ауксины, гиббереллины и цитокинины с чувствительностью, превышающей известный мировой уровень. Это позволило впервые определять фитогормоны не в целом растении, а в отдельных его частях, а именно в листьях, стеблях и корнях. Метод защищен двумя патентами России и был опробован в Лаборатории профессора Э.С. Пирузян.

Выводы

1. Разработаны общие принципы синтеза меченых тритием биологически важных диазинов, основанные на детальном изучении каталитических реакций дегалогенирования, восстановления, изотопного обмена с использованием газообразного трития и изотопного обмена с высокообогащенной тритиевой водой.

2. На основе исследования кинетики реакции каталитического дегалогенирования в растворе предложена модель реакции гидрогенолиза. Дано кинетическое описание процесса гидрогенолиза, которое наряду с основной реакцией рассматривает изменение активности палладиевого катализатора в ходе реакции. Установлено, что молярная радиоактивность продукта реакции гидрогенолиза тритием определяется соотношением констант скоростей основной реакции и растворения водорода в палладии.

3. Исследовано влияние конформации луриновых и пиримидиновых соединений в растворе на молярную радиоактивность продуктов реакции гидрогенолиза тритием. Показано, что большие различия в молярной радиоактивности различных соединений одного и того же основания объясняются наличием в растворе свернутой конформации, которая стерически препятствует протеканию основной реакции гидрогенолиза. Предложен способ увеличения молярной радиоактивности пуринов, заключающийся в структурной модификации исходного соединения.

4. Установлено, что основной причиной, приводящей к снижению молярной радиоактивности соединений, получаемых в реакции гидрогенолиза тритием, является наличие больших коэффициентов разделения протий -тритий в системе водород - палладий - вода. Предложено применение катализаторов с низким (менее 0,05%) содержанием палладия на носителе, уменьшающих коэффициент разделения изотопов водорода.

5. Разработана модификация реакции изотопного обмена диазинов с тритиевой водой, заключающаяся в использовании раствора высокообогащенной тритиевой воды в безводном органическом растворителе. Исследовано влияние различных гетерогенных и гомогенных катализаторов, массовой доли тритиевой воды на выход и молярную радиоактивность диазинов, получаемых в этой реакции.

6. Предложен новый метод - реакция твердофазной каталитической гидрогенизации диазинов газообразным тритием. Исследовано влияние состава твердой фазы, температуры и структуры исходных соединений на выход и молярную радиоактивность продуктов этой реакции. Показано, что с увеличением температуры и весового соотношения катализатор/вещество молярная радиоактивность меченных тритием диазинов растет, а выход падает. Установлено, что при температуре 160 °С и выше происходит резкое увеличение степени включения трития в диазины, что позволяет получать ранее не доступные кратно меченые препараты.

7. Исследованы энзиматические реакции синтеза более сложных соединений из относительно простых и доступных меченых предшественников, позволяющие целенаправленно модифицировать меченные тритием компоненты нуклеиновых кислот.

8. Разработаны общие схемы синтеза меченных тритием • диазинов. В основу схем положено введение трития в относительно простые соединения на первой стадии и проведение знзиматических реакций модифицирования меченого соединения на второй стадии.

9. С использованием меченных тритием гормонов растений разработан способ их количественного определения в растительных экстрактах, основанный на методе изотопного разбавления. Способ отличается от известных тем, что использование фитогормонов с высокой молярной радиоактивностью и снижение потерь на всех стадиях подготовки пробы дало возможность в едином аналитическом процессе определять с высокой чувствительностью все гормоны растений - ауксины, гиббереллины и цитокинины.

На основе выполненных исследований разработаны методы синтеза и налажен серийный выпуск более 100 наименований меченных тритием диазинов (69 наименований внесены в каталог В.О. «Изотоп»), Все соединения не уступают (а зачастую превосходят по своим характеристикам) препаратам ведущих зарубежных фирм.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.c. 412764 СССР, МКИ С 07d 51/50. Способ получения меченных тритием нуклеозидтрифосфатов / О.В. Лавров, Н.С. Марченков, К.С. Михайлов, Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров (СССР). - №1737609/23-4; Заяв.12.01.72; Опубл. 25.10.76, Бюл.№ 39.-4с.

2. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Исследование изотопного обмена водорода в пуринах с водой И Радиохимия. -1974. - Т. 16, № 6. - С.922-926.

3. Усатый А.Ф., Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Исследование спектров КД нуклеозидов в боратном буфере // Биоорганическая химия. - 1979. -Т.5, № 3. -С.370-375.

4. Сидоров Г.В., Усатый А.Ф., Мясоедов Н.Ф. Исследование спектров кругового дихроизма бромзамещенных фрагментов нуклеиновых кислот. I. Спектры КД 8-бромзамещенных пуриновых нуклеотидов II Химия природных соединений. -1979. -Т.2. -С.199-204.

5. Мясоедов Н.Ф.. Сидоров Г.В., Усатый А.Ф. Исследование спектров кругового дихроизма бромзамещенных фрагментов нуклеиновых кислот. II. Спектры КД 5-бромзамещенных пиримидиновых нуклеотидов // Химия природных соединений. - 1979. - Т.2. - С.204-208.

6. Мясоедов Н.Ф., Петреник Б.В., Сидоров Г.В., Усатый А.Ф. Бромпроизводные рибонуклеозид-3',5'-циклофосфатов // Химия природных соединений. -1979. -Т.2, - С.208-213.

7. A.c. № 801505 СССР, МКИ 3 С07 239/55. Способ получения 5-(метил-3Нз)-2,4-(1н,Зн)-пиримидиндиона / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, Е.К. Иванькова, А.Л. Воронков (СССР). № 2786114/23-04; Заяв. 29.06.79; Опубл. 15.03.94, Бюл. № 5 - Зс.

8. A.c. № 899552 СССР, МКИ 3 C07D 239/55. Способ получения урацила-6-3Н / Н.Ф. Мясоедов, Е.К. Иванькова, A.B. Потапова, Г.В. Сидоров (СССР). № 2787790/23-04; Заяв. 29.05.79; Опубл. 23.01.82, Бюл. № 3. - 2с.

9. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. I. Гидрогенолиз тритием 8-бромзамещенных пуриновых соединений // Радиохимия. -1980. -Т.22, № 4. - С.574-578.

10. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. II. Гидрогенолиз тритием 5-бромзамещенных пиримидиновых соединений // Радиохимия. - 1980. -Т.22, № 4. - С. 579-584.

11. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф.. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. III. Применение жидкостной колоночной хроматографии для препаративного разделения меченных тритием нуклеотидов // Радиохимия. - 1980. - Т.22, № 6. - С.911-917.

12. Мясоедов Н.Ф., Квятковский Ю.Г., Сидоров Г.В. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. IV. Применение активированных углей для обессоливания растворов меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот // Радиохимия. -1980.-Т.23, № 1. - С.122-126.

13. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. V.

Изучение кинетики и механизма реакции каталитического дегалоидирования // Радиохимия. - 1981. - Т.23, № 2. - G. 281-287.

14. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. VI. Изучение катализаторов гидрогенолиза II Радиохимия. - 1981. - Т.23, №2. -С.288-295.

15. Введение тритиевой метки в. компоненты: нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников VII. Получение меченных тритием аденина, аденозинмоно-, ди- и трифосфагов высокой удельной радиоактивности / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, О.Б. Кузнецова, В.М. Минов, Е.К. Иванькова, М.Д. Франк-Каменецкая, Т.Ю. Лазуркина, В.А. Орлова // Радиохимия. - 1981.- Т.23, №4. - С.607-613.

16. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Определение радиохимической чистоты меченных тритием нукпеозид-5'-трифосфатов с применением микроколонок с ПЭИ-целлюлозой II Органические соединения, меченные радиоактивными изотопам I - М.; ЦНИИАтоминформ, 1982. 4.2 - С. 266-270.

17. Введение тритиевой метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. VII. Получение меченных тритием урацила, уридин-5'-моно, ди- и трифосфатов высокой молярной активности / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, О.Б. Кузнецова, М.Д. Франк-Каменецкая, Т.Ю. Лазуркина, В.А. Орлова. II Радиохимия. - 1984. - Т.25, №3. -С.341-345.

18. A.c. № 1098232 СССР, МКИ С 07D 473/34, С07В 23/00, А 61К 31/52. Способ получения меченного тритием аденина / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, А Л. Воронков, Ю.Г. Квятковский (СССР). - № 3555214/23-04; Заяв. 23.02.83; Опубл. 15.03.94, Бюл.№ 5. -4 с.

19. A.c. СССР № 1127280 СССР, МКИ С 07Н 19/06, С 07В 23/00. Способ получения (метил-3Н2)тимидина / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, Ю.Г. Квятковский, Е.К. Иванькова (СССР). - № 3564178/23-04; Заяв. 08.02.83; Опубл. 15.03.94, Бюл,№ 5 - 3 с.

20. A.c. № 1140418 СССР, МКИ С 07С 101/08, С 07В 59/00. Способ получения ß-аланина, меченого радионуклидом / А.Л. Воронков, Ю.Г. Квятковский, Н.Ф.Мясоедов, Г.В. Сидоров (СССР). - №3687851/23-04; Заяз. 09.01.84; Опубл. 15.03.94, Бюл.№5.-4с.

21. Е.К. Иванькова, Г.В. Сидоров, Н.Ф. Мясоедов. Получение меченного тритием тимидина высокой удельной активности // Радиохимия. - 1981. - Т.23, №2. - С.296-300.

22. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф., Иванькова Е.К. Получение меченных тритием гетероциклических оснований содержащих метку в "нестандартных" положениях // Биологически активные соединения, меченные радиоактивными изотопами: Тез. I Всесоюз. сов. - М. 1985. - С. 18.

23. Синтез нуклеотидов из меченых оснований и D-рибозы / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, М.Д. Франк-Каменецкая, Г.В.-Книжникова. //1 Всесоюз. сов. по проблеме Биологически активные ■ соединения, меченные радиоактивными изотопами: Тез. Докл. -М. 1985. - С. 19.

24. Меченные тритием цитидиновые производные, обладающие противолейкозной активностью / В.П. Резчиков, В.Д. Забелина, Н.М. Фертукова, Г.В. Сидоров, Н.Ф. Мясоедов II I Всесоюз. сов. по проблеме Биологически активные соединения, меченные радиоактивными изотопами: Тез. докл. -М. 1985.-С.81.

25. А.с. № 1513854 СССР, МКИ С 07 С 59/00. Способ получения (1,5-3H)-D-рибозы / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, Ю.Г. Квятковский (СССР). - № 4324373/31-04; Заяв. 31.08.87; Опубл. 15.03.94, Бюл.№ 5. -3 с.

26. А.с. № 1545504 СССР, МКИ С 07В 59/00. Способ получения меченных тритием пуриновых оснований / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, А.Л. Воронков, Ю.Г. Квятковский, Е.К Иванькова (СССР). - №4139146/31-04; Заяв. 27.10.86; Опубл. 15.03.94, Бюл.№ 5.-3 с.

27. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Ведение тритиевой метки в аналоги пуриновых и пиримидиновых соединений с использованием каталитического изотопного обмена с газообразным тритием // II Радиохимическая конференция: Тез. междунар. конф. - Марианске Лазне, 1987. -С.27.

28. Sidorov G.V., Myasoedov N.F. Multiple tritium labelling of thymine and its derivatives // J. Radioanal and Nucl. Chem., Articles. - 1988. - V.121, № 2. - P.461-467.

29. Сидоров Г.В., Квятковский Ю.Г. Изучение устойчивости меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот высокой молярной радиоактивности // Биологически активные соединения, меченные радиоактивными и стабильными изотопами: Тез. II Всессюз. сов,- М. 1988. -С.31.

30. Квятковский Ю.Г., Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии для выделения и анализа меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот высокой молярной радиоактивности // III International Simposium on Organic Labelled Compounds: Тез. Ill Международного симпозиума. - Marianske Lazne, 1988. - C.36.

31. Myasoedov N.F., Sidorov G.V. The combination of chemical reaction and isotopic exchange reactions In the synthesis of tritium-labelled compounds II Third International Symposium on The syntesis and Application of Isotopically Labelled Compounds. Ihnsbruck, Austria, 1988. - P.601.

32. A.c. № 1704065 СССР, МКИ G 01N 30/06. Способ количественного определения ауксинов и цитокининов в растительном материале. Н.Ф. Мясоедов, Э.С. Пирузян, Г.В. Сидоров, В.М. Юсибов (СССР). - № 4707555/25; Заяв. 20.06.89; Опубл. 07.01.92, Бюл. № 1.-3 с.

33. Myasoedov N.F., Sidorov G.V., Lushkina O.V. The solid-state synthesis of tritium labelled heterocyclic bases, nucleotides and their analogues // Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds I Eds. E. Buncel, G.W. Kabalka; -Toronto, Canada,: Elsevier, 1991. - P.460-464.

34. Sidorov G.V., Lushkina O.V., Myasoedov N.F. Synthesis of tritium labelled phytogormones // Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds I Eds. E. Buncel, G.W. Kabalka; - Toronto, Canada,: Elsevier, 1991. - P.465-469.

35. Патент 2076318 РФ, МКИ 6 G 01 N 30/06. Способ определения . фитогормонов в растительном материале / Н.Ф. Мясоедов, Г.В. Сидоров, О.В.

Лушкина (РФ). - №92014707/25; Заяв.28.12.92; Опубл. 27.03.97, Бюл.№ 9. -4 с.

36. Лушкина О.В., Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Твердофазный синтез меченных тритием цитокининов И Биоорганическая химия. - 1993. - Т.19, № 1. -С.113-116.

37. Лушкина О.В., Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченной тритием индолил-3-уксусной кислоты // Биоорганическая химия. - 1993. - Т.19, № 1. -С.117-121.

38. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием терминаторов синтеза ДНК// Биоорганическая химия. - 1993. - Т.19, № 12, - С.1115-1219.

39. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф.. Введение тритиевой метки в терминаторы синтеза ДНК твердофазной каталитической гидрогенизацией II Биоорганическая химия. - 1993. - Т. 19, № 12. - С. 1220-1225.

40. Sidorov G.V., Myasoedov N.F., Yasko N.F. The synthesis of some tritiumlabelled terminators of DNA synthesis // J. of Labelled Compd. and Radiopharm. -1994.-V.34, №4, P.339-351.

41. Sidorov G.V., Myasoedov N.F. The solid-state synthesis of tritium-labelled heterocyclic bases // J. of Labelled Compd. and Radiopharm. - 1994. - V.34, № 4, P.353-358.

42. Sidorov G.V., Lushkina O.V., MyhovYu.V., Myasoedov N.F. Tritium labelled phytohormons and their application for analysis of plant extracts II Synthesis and Applications of Isopically Labelled Compounds / Eds. by J.Allen . - John Wiley & Sons Ltd, 1995. - P.161-165.

43. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение реакции твердофазной каталитической, гидрогенизации пуринов тритием II Радиохимия. - 1995. - Т.37, № 3. - С.270-274.

44. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Одностадийные методы получения меченного тритием тимидинмонофосфата Н Биоорганическая химия. - 1996. -Т.22, № 4. - С.291-296.

45. Фосфорилирование 5'-0-фосфонилметилтимидина и его включение в ДНК клеток HELA / М.В. Ясько, Г.В. Сидоров, Р.В. Кондратов, B.C. Прасолов, Н.Ф. Мясоедов, А.А. Краевский. II Биоорганическая химия - 1998. -Т.24, № 1. -С.21-24.

46. Myasoedov N.F., Sidorov G. V. Synthesis of tritium-labelled diazines and their analogues // J. of Labelled Compd. and Radiopharm. - 1998. - V.41, № 11. -P.993-1003.

47. Myasoedov N.F., Sidorov G. V., Kramerov V.N., Mishin V.I. Synthesis of physiologically active tritiated compounds using hihg specific activity tritiated water// J. of Labelled Compd. and Radiopharm. -1999. -V. 42, № 9. - P.859-866.

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую признательность члену-корреспонденту РАН Николаю Федоровичу Мясоедову за постоянный интерес, проявляемый в' ходе выполнения всего цикла исследований, обсуждение важных результатов и ценные замечания в процессе написания данной работы.

Выражаю благодарность за помощь в проведении этого исследования моим коллегам Воронкову А.Л., Иваньковой Е.К., Квятковскому Ю.Г., Лушкиной О.В.

Содержание

Общая характеристика работы 3

Актуальность темы 3

Цель исследований 5

Научная новизна 5

Практическая значимость работы 6

Защищаемое направление 7

■. Основное содержание работы 8

Введение 8

1. Методы получения меченных тритием диазинов 11

2. Реакции гидрогенолиза 12

2.1. Кинетика и модель реакции гидрогенолиза 12

2.2. Влияние изотопии на молярную радиоактивность 17 продуктов реакции гидрогенолиза тритием

2.3. Влияние конформации исходного соединения на 20 молярную радиоактивность продукта реакции гидрогенолиза тритием

2.4. Связь кинетических параметров реакции гидрогенолиза 23 с молярной радиоактивностью меченого соединения

2.5. Влияние активности лалладиевых катализаторов на 24 молярную радиоактивность и выход продукта реакции гидрогенолиза тритием

3. Способы увеличения молярной радиоактивности 26 препаратов, получаемых в реакции гидрогенолиза тритием

3.1. Конформационная или структурная модификация 27 исходного соединения

3.2. Повышение эффективности применяемого катализатора 28

4. Реакция изотопного обмена с тритиевой водой 30

5. Твердофазная каталитическая гидрогенизация 32

5.1. Влияние температуры и состава твердой фазы на 33

реакцию ТКГ

5.2. Влияние структуры исходных соединений на включение 35 трития в реакции ТКГ

5.3. Практическое применение реакции ТКГ тритием 36

6. Энзиматические методы модифицирования меченных 38 тритием диазинов

7. Практическое применение научных разработок 43

8. Выводы 47

Список работ, опубликованных по теме диссертации 49