Получение меченных тритием гуминовых веществ и исследование их свойств

Позднякова, Виолетта Юрьевна

Получение меченных тритием гуминовых веществ и исследование их свойств тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.14 ВАК РФ

Позднякова, Виолетта Юрьевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2006 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.14 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Получение меченных тритием гуминовых веществ и исследование их свойств»

Автореферат диссертации на тему "Получение меченных тритием гуминовых веществ и исследование их свойств"

На правах рукописи

Позднякова Виолетта Юрьевна

ПОЛУЧЕНИЕ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ СВОЙСТВ

Специальность 02.00.14 - радиохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре радиохимии, Химического факультета на кафедре органической химии Химического факультета на кафедре общего земледелия факультета Почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Бадун Г. А.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Сидоров Г.В.

доктор химических наук Алентьев А.Ю.

Ведущая организация: Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН

Защита состоится "25" мая 2006 года в 15®® на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.42 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, кафедра радиохимии, ауд. 308.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан " Z S " CUy2006 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 501 001 49

кандидат химических наук

Бунцева И.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Меченные тритием соединения нашли широкое применение в решении многих научных задач, так как тритий обладает уникальными ядерно-физическими свойствами (максимальная энергия бета-излучения 18.6 кэВ, период полураспада 12.3 года), тритиевую метку можно ввести практически в любую органическую молекулу, работа с меченными тритием веществами не требует чрезвычайных мер радиационной защиты, а удельная радиоактивность соединения, содержащего один атом трития на молекулу, составляет 1.07 ТБк/ммоль. В настоящее время разработано большое число методов, позволяющих получить меченные тритием соединения самых разных классов с высокой удельной радиоактивностью.

Современные исследования сложных природных образований выдвигают особые требования к меченым веществам. Так как такие системы содержат сложные смеси макромолекул переменного состава и нерегулярного строения, а для их описания используют интегральные характеристики состава, строения и других показателей, то для изучения подобных объектов с помощью радиоактивной метки требуется неизбирательное введение трития и его равномерное распределение по компонентам объектов. Причем процедура введения метки должна быть универсальной, а меченый препарат должен полностью сохранять свойства исходного. Перспективным видится использование метода термической активации трития, с помощью которого возможно неселективное введение метки в самые разные химические соединения.

Примером сложных природных образований являются гуминовые вещества (ГВ). За последние годы резко возросло число исследований физико-химических свойств ГВ и их физиологической активности с целью применения ГВ в сельском хозяйстве, ветеринарии, медицине, а также в качестве геохимических барьеров для экотоксикантов и радионуклидов. В настоящее время для изучения свойств ГВ используют титриметрические и другие аналитические методы анализа, различные варианты хроматографии, методы спектроскопии13С-ЯМР, ПМР и др. Несомненно, меченные тритием препараты могут быть мощным инструментом в исследовании свойств ГВ и их поведения в различных системах, в том числе в определении способности ГВ связываться с биологическими мембранами и усваиваться высшими растениями. Для таких исследований необходимо знать гидрофобность и поверхностную активность ГВ. Однако в настоящее время нет прямых методов определения таких свойств ГВ. В последние годы на Химическом факультете МГУ был разработан метод исследования адсорбции белков на границе раздела водный раствор-толуол со сцинтиллирующими добавками (метод сцинтиллирующей фазы). Адаптация данного метода к исследованию поверхностно-активных свойств ГВ и оценке их гидрофобности может помочь в прогнозировании их поведения в самых разных системах.

Цель настоящей работы - разработка способа получения меченных тритием ГВ с равномерным распределением метки по компонентам препаратов и изучение их гидрофобных и поверхностно-активных свойств методом сцинтиллирующей фазы (СФ).

Объекты исследования - гуминовые вещества (ГВ), представляющие собой сложные смеси устойчивых к биодеструкции высокомолекулярных темноокрашенных органическйх соединений природного происхождения, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов среды. Гуминовые вещества являются макрокомпонентой органического вещества почвенных и водных экосистем, а также твердых горючих ископаемых. Характерной особенностью этих веществ являются: нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов, полидисперсность. Различают несколько групп ГВ: 1) гуминовые кислоты (ГК), растворимые только в щелочных растворах; 2) гиматомелановые кислоты (ГМК), извлекаемые из сырого остатка (геля) гуминовых кислот этиловым спиртом; 3) фульвокислоты (ФК), растворимые в воде, щелочных и кислых растворах; 4) гумин - практически нерастворимое и неизвлекаемое из природных тел и компостов органическое вещество.

Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:

1. Разработаны принципы введения тритиевой метки в природные и искусственные смеси биологически активных молекул посредством реакций атомарного трития, полученного при диссоциации трития на вольфрамовой проволоке при 1800-2000 К. Впервые получены меченные тритием ГВ с равномерным распределением метки по компонентам препаратов и удельной радиоактивностью, достаточной для их использования в химических и биохимических исследованиях. Разработана методика очистки меченых препаратов с помощью диализа через мембраны с различным размером пор. Идентичность исходных и меченых препаратов подтверждена с помощью эксклюзионной хроматографии.

2. Разработан новый вариант метода сцинтиллирующей фазы с целью его использования для определения гидрофобности и поверхностной активности ГВ и других сложных природных и искусственных смесей молекул. С помощью тритиевой метки впервые определены коэффициенты распределения ГВ в двухфазных системах толуол-вода и октанол-вода, а также получены изотермы адсорбции ГВ на границе раздела толуол-вода. Полученные результаты позволили построить шкалу гидрофобности и поверхностной активности ГВ.

Практическая значимость работы:

гидрофобности и поверхностной активности. Такая информация очень важна для прогнозирования поведения этих веществ в различных условиях и предсказания их биологической активности.

2. Меченные тритием ГВ использовали в экспериментах по исследованию связывания их с биологическими мембранами микроорганизмов и для определения их поступления в растения через корневую систему.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 8, 9, 10-ой Международных научных конференциях по селекции атомов и молекул (Звенигород, Россия, 2003-2005 г.), на 4-ой Российской конференции по радиохимии (Озерск, Россия, 2003), на Международной конференции, организованной Болгарским гуминовым обществом (София, Болгария, 2003), на ХП-ом Международном Симпозиуме Международного Гуминового Общества (IHSS) (Sao Paulo, Brazil, 2004), на 7-ом российско-финском симпозиуме по радиохимии (Санкт-Петербург, Россия, 2005), на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 2003, 2004, 2005", на московском семинаре Межведомственного научного совета по радиохимии при президиуме РАН и ФА РосАтом.

Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 4 статьях в научных журналах, в 8 статьях в научных сборниках и в 10 тезисах докладов на международных и всероссийских научных конференциях. По результатам диссертационной работы подана заявка на патент РФ.

Вклад автора в разработку проблемы. В основу диссертации положены результаты научных исследований, выполненных непосредственно автором в период 2002-2006 гг. Работа выполнялась на кафедре радиохимии Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Отдельные разделы работы выполнялись на кафедре органической химии Химического факультета МГУ и на кафедре общего земледелия факультета Почвоведения МГУ. Работа проведена при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты 03-03-32410 и 01-03-32664) и гранта FE 75184, ВА 31/139166/02/U (Research Center for Environment and Health, GSF, Neuherberg, Germany).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 34 рисунками и 18 таблицами. Работа состоит из введения, трех глав (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов, списка цитируемой литературы, который содержит 214 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана важность проблемы изучения свойств ГВ, сформулирована цель, показаны научная новизна и практическая значимость работы, обозначены основные этапы исследования. .

Первая глава посвящена обзору литературы. В ней приведена характеристика ГВ, проведен анализ существующих методов определения гидрофобности и поверхностной активности ГВ, рассмотрены возможные методы введения радионуклидов в ГВ, методы введения трития в органические молекулы, изложены основы метода термической активации трития, изложена суть метода СФ и его возможности в исследовании поверхностной активности и гидрофобности органических веществ.

Вторая глава содержит описание экспериментальных методик, использованных в работе.

Введение трытиевой метки в препарат. Тритиевую метку в исследуемые препараты вводили с помощью метода термической активации трития. Описаны основные процедуры подготовки веществ к введению тритиевой метки и проведения эксперимента по обработке мишеней атомарным тритием.

Очистка меченных тритием препаратов. Описаны методики очистки и радиохроматографического анализа использованных в работе индивидуальных низкомолекулярных соединений, моделирующих компоненты ГВ. В работе были использованы различные варианты тонкослойной и колоночной хроматографии. Разделение аминокислот и определение их радиоактивности проводили на аминокислотном анализаторе с проточным измерением радиоактивности элюата. На всех стадиях работы проводили контроль радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилляционного счета.

Очистку меченных тритием препаратов ГВ от лабильной метки осуществляли с помощью диализа в фосфатном буфере с концентрацией 0.028 М при pH 6.8 через мембраны соответствующего размера (MWCO от 2 до 12 кДа (Merk,Germany)) в течение не менее 30 суток при 4°С. Подбором размера пор мембраны минимизировались потери препарата во время диализа и сохранялось молекулярно-массовое распределение.

Определение молекулярно-массового распределения гуминовых и гуминоподобных веществ с помощью эксклюзионной хроматографии. Гель-хроматографическое фракционирование препаратов проводили на хроматографической системе Abimed. ГВ регистрировали спектрофотометрически при 254 нм. Для получения хроматографического профиля по радиоактивности меченого препарата собирали фракции и измеряли их радиоактивность в сцинтилляционной жидкости OptiPhase HiSafe3 на сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1215. Контроль равномерности введения тритиевой метки осуществляли с помощью сравнения профилей выхода с колонки исходного и меченого препаратов по УФ-поглощению при 254 нм, а также по профилю радиоактивности меченого препарата.

Исследование гидрофобных и поверхностно-активных свойств меченных тритием препаратов проводили с использованием метода СФ. Эксперимент проводили в стандартных сцинтилляционных пластиковых флаконах диаметром 1.5 см. Во флакон сначала вносили 0,8 мл раствора

меченого вещества, а затем сверху аккуратно добавляли 3 мл толуола, содержащего 0.45 масс.% 2,5-дифенилоксазола. После добавления органической фазы флакон помещали в жидкостной сцинтилляционный спектрометр RackBeta 1215 и измеряли его радиоактивность через определенные промежутки времени. После уравновешивания системы отбирали 2 мл органической фазы в другой флакон и измеряли скорость счета отобранной органической фазы и остатка. В независимых экспериментах исследовали распределение ГВ между водной фазой и октанолом. В этом случае для определения концентрации меченого препарата проводили отбор проб из водной и октанольной фаз и измеряли их радиоактивность в сцинтилляционной жидкости OptiPhase HiSafe 3. С помощью меченных тритием препаратов и метода сцинтиллирующей фазы были найдены величины адсорбции исследуемых веществ на границе раздела фаз двух жидкостей и коэффициенты распределения ГВ в системах толуол-вода и октанол-вода.

Определение факторов бионакопления гуминвых веществ бактериями и высшими растениями. Меченные тритием препараты ГВ использовали для исследования их связывания тетрациклин-устойчивым штаммом грам-отрицательной бактерии Escherichia coli. Описаны эксперименты по определению изотерм связывания ГВ бактериями. Количество ГВ определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного счета.

Поглощение ГВ высшими растениями изучали на ростках мягкой пшеницы Triticum aestivum L. Количество ГВ, поступивших в растения, рассчитывали на основании данных о начальной удельной радиоактивности растворов и удельной радиоактивности растворов после нахождения в них растений. Распределение ГВ в растении определяли с помощью авторадиографии, в качестве фотографического детектора использовали рентгеновскую пленку Retina ХВМ.

В третьей главе представлены полученные экспериментальные результаты, а также их обсуждение.

Оптимизация условий введения тритиевой метки Модельные эксперименты

В настоящей работе метод термической активации трития впервые был использован для получения меченных тритием ГВ, представляющих собой сложные смеси органических соединений природного происхождения, что потребовало проведения модельных экспериментов с целью подбора оптимальных условий введения тритиевой метки. В качестве модельных веществ были использованы следующие индивидуальные вещества:

• гомологический ряд альфа-аминокислот от глицина до норлейцина, а также п-аминобензойная кислота, аспарагиновая кислота и лизин;

• поверхностно-активные вещества (ПАВ): бромиды алкилтриметил-аммония с алкильными группами Ci2H25, С|4Н29, С16Н33 (DTAB, ТТАВ, СТАВ) и тритон ТХ-100;

• аминосахар: глюкозамин.

Изучение закономерностей введения трития в аминокислоты и сахара с помощью метода термической активации трития чрезвычайно важно, так как они входят в состав макромолекул ГВ. С помощью ПАВ моделировали введение трития в углеводородные фрагменты молекул. На индивидуальных веществах была исследована зависимость выхода меченых соединений от времени реакции, массы мишени и температуры атомизатора. Анализ литературных данных позволил сразу предположить, что наилучшие условия для получения меченых соединений с минимальным количеством побочных продуктов и наиболее равномерным распределением трития по компонентам сложных смесей молекул создаются при бомбардировке холодных (77 К) мишеней потоком атомов, долетающих до мишени без потери энергии за счет столкновений с молекулами трития в газовой фазе. Для используемых в работе реакционных сосудов это условие выполняется при давлении газа не выше 0.5 Па. Соответственно, дальнейшие исследования проводили при давлении трития 0.5 Па.

Было изучено влияние времени реакции на соотношение выходов меченых соединений при обработке атомами трития смеси аминокислот глицина (Gly) и серина (Ser) и аминосахара глюкозамина(Оат). Найденные значения удельной радиоактивности Ser и Gam нормировали на радиоактивность Gly, что позволяло нивелировать влияние невоспроизводимых факторов эксперимента, в том числе изменения изотопного состава газа и каталитической активности вольфрама. Оказалось, что закономерности взаимодействия атомарного трития с аминокислотами и сахарами различаются. При малых временах реакции скорость образования меченого Gam была в несколько раз выше, чем для аминокислот, что связано с активирующим действием гидроксильных групп. Однако из-за того, что у Gam больше функциональных групп, вероятность его деструкции под действием атомарного трития тоже выше, что приводило к уменьшению отношения радиоактивностей Gam и Gly при больших временах реакции. Следовательно, для получения меченных тритием Сахаров с помощью метода термической активации трития необходимо использовать более мягкие условия, чем при введении трития в аминокислоты, и прежде всего, уменьшать время воздействия атомарного трития на мишень. Таким образом, сокращение времени обработки атомами трития сложных смесей молекул должно способствовать уменьшению количества меченых побочных продуктов.

Масса мишени. При малых временах реакции атомов трития с твердыми мишенями в реакцию вступают молекулы, находящиеся только в тонком поверхностном слое. Соответственно, максимально высокая удельная радиоактивность в этом случае будет достигаться при количестве вещества в мишени, достаточном только для образования мономолекулярного слоя на стенках реакционного сосуда. Специфика получения мишеней в методе термической активации трития такова, что для полного покрытия стенок реакционного сосуда веществом необходим приблизительно его

десятикратный избыток от расчетного, необходимого для равномерного мономолекулярного покрытия. Для стандартных реакционных сосудов с площадью мишени около 150 см2 этому соответствует 0.1-0.2 мг вещества. Систематического исследования влияния массы мишени на удельную радиоактивность образующихся меченых соединений не проводили, так как подобные работы были выполнены для целого ряда низкомолекулярных веществ [1, 2]. Так как ГВ представляют собой смеси макромолекул со средней молекулярной массой от 8 до 40 кДа, то для получения мишени, гарантировано покрывающей стенки реакционного сосуда, необходимо от 0.2 до 0.6 мг. Анализ результатов по получению меченных ГВ подтвердил правильность такого выбора.

Температура атомизатора. При взаимодействии атомов трития с органическими молекулами помимо образования меченого материнского соединения возможно образование побочных продуктов. Для изучения влияния температуры источника атомов на соотношение основной и побочных реакций была проведена реакция атомов трития с аспарагиновой кислотой (Asp) и лизином (Lys) в интервале температур атомизатора 16902010 К. В результате замещения карбоксильных групп на тритий из Asp могли образовываться альфа- и бета-аланин (а-А1а и ß-Ala), а при замещении аминогруппы на тритий в Lys - норлейцин (Nie).

Оказалось, что зависимость выхода меченых материнских соединений от температуры атомизатора имела экстремальный характер с максимумом при 1800 К для Lys и 1900 К для Asp. Вместе с тем радиоактивность побочных продуктов увеличивалась с ростом температуры атомизатора. Соответственно, отношение радиоактивности побочных продуктов к радиоактивности меченых материнских соединений тоже росло при увеличении температуры вольфрамовой проволоки от 3.5 % до 42.5 % для пар a-Ala/Asp и ß-Ala/Asp, от 1 % до 6 % для пары Nie/Lys. Аналогичная зависимость выхода меченого материнского соединения от температуры атомизатора была получена для п-аминобензойной кислоты и для гомологического ряда альфа-аминокислот от Gly до Nie. Вместе с тем наблюдалась безусловная закономерность увеличения молярной радиоактивности аминокислот и их радиохимического выхода с увеличением длины углеводородного хвоста для всех температур атомизатора.

Из проведенных экспериментов следует, что соотношение скоростей реакций образования меченого материнского соединения и побочных продуктов декарбоксилирования и дезаминирования сильно зависит от температуры источника атомов. При возрастании температуры атомизатора доля побочных продуктов росла, причем скорость реакции декарбоксилирования не зависела от положения карбоксильной группы в молекуле. Следствием этого является экстремальная зависимость радиохимического выхода и удельной радиоактивности меченого материнского соединения от температуры источника атомов. При температуре выше 1900 К выход меченого материнского соединения начинал уменьшаться ввиду конкуренции побочных реакций. .

Также было изучено влияние температуры вольфрамовой проволоки на выход бромидов алкилтриметиламмония с углеводородными радикалами: С12Н25, С14Н29 и С|бНзз, являющимися катионными поверхностно-активными веществами (КПАВ). Радиохимический выход меченого материнского соединения для всех КПАВ оказался примерно одинаковым 80±10% и мало зависел от температуры вольфрамовой проволоки. Это свидетельствует о том, что эти вещества практически не подвергаются деструкции под действием атомарного трития. Однако в случае бромидов тетраметиламмония и тетрабутиламмония выход материнского соединения был не более 3 %. Столь малые выходы для бромидов тетраалкиламмония с небольшими алкильными группами свидетельствуют о том, что увеличение выхода меченого материнского соединения для КПАВ связано с увеличением размера углеводородного хвоста, и подтверждают предположение о том, что глубина зоны, в которой происходит образование меченых соединений, составляет около 1 нм.

Обнаруженные закономерности образования меченых аминокислот, Сахаров и ПАВ были использованы для выбора условий введения трития в гуминовые и гуминоподобные вещества.

Получение меченных тритием гуминовых веществ

Анализ влияния условий проведения эксперимента по введению трития в ГВ на характеристики меченого продукта провели на примере коммерческого препарата ГК угля леонардита (Humintech Ltd, Дюссельдорф, Германия). Условия экспериментов и основные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Условия введения тритиевой метки и характеристика меченного тритием препарата ГК угля.

Серия эксперимента Условия введения метки Уд.р/акт. ГБк*г' (100% тритий) Выход, %

давление трития, Па масса мишени, мг время реакции , с температура атомизатора, К

1-ая серия 0.5 2 20 1950 14 23.4"

2-ая серия 0.5 0.26 10 1950 726 94.9

0.5 0.26 20 1950 197 86.8

0.5 0.26 40 1950 571 83.1

Примечание: (*) - реакция проводилась импульсами по 10 секунд с полным обновлением состава газовой фазы, (**) - очистка препаратов первой серии проводилась с помощью диализной мембраны MWCO 12 кДа, для остальных препаратов использовали мембраны MWCO 2 кДа.

В первой серии масса мишени составляла 2 мг, введение тритиевой метки осуществляли двумя импульсами по 10 с при температуре вольфрамового атомизатора 1950 К. Во второй серии экспериментов масса

мишени составляла 0.26 мг, а время реакции варьировали в пределах 10-40 с при давлении трития 0.5 Па и температуре атомизатора 1950 К. Удельная радиоактивность препаратов первой серии оказалась в пределах 10-50 ГБк* г "'в пересчете на 100 %-ный тритий, что существенно меньше, чем получено во второй серии (200-700 ГБк*г'). Прежде всего, это связано с тем, что масса мишени в первой серии экспериментов была практически на порядок больше. При лиофилизации водных растворов ГВ на стенках реакционного сосуда образовывалась плотная мишень с неразвитой поверхностью. В этом случае реакция с атомарным тритием протекала в тонком слое, включающем в себя только молекулы на поверхности мишени. Легко подтвердить соответствующими расчетами, что в первой серии экспериментов масса препарата, взятого для приготовления мишени, превышала необходимую для полного покрытия стенок реакционного сосуда величину примерно в 10 раз.

Увеличение радиоактивности препаратов с увеличением количества вступающего в реакцию трития и времени реакции может не произойти из-за того, что проницаемость твердых мишеней для атомарного трития ограничена. Как было показано на модельных соединениях, увеличение времени реакции может приводить к увеличению количества меченых побочных продуктов. Из результатов экспериментов второй серии следует, что увеличение времени реакции с 10 до 40 с приводило к снижению выхода меченых ГК угля, а также к снижению его удельной радиоактивности. На первый взгляд, сильное снижение удельной радиоактивности препарата при времени реакции 20 с, а затем ее рост при 40 с реакции выглядит необычным. Однако необходимо учесть то, что исследуемый препарат представлял собой смесь молекул со средней молекулярной массой 13 кДа. Причиной такой зависимости могло быть то обстоятельство, что при 1950 К создавался столь интенсивный поток атомов трития, что за первые 10 с достигалась максимальная радиоактивность молекул поверхностного слоя мишени. При более длительных экспозициях внешний слой молекул уже подвергался существенной модификации, а образование меченых соединений во внутренних слоях мишени происходило медленнее из-за сильного градиента потока атомов вглубь мишени. При очистке меченого препарата модифицированные молекулы удалялись, и так как количество молекул в мишени все равно примерно на порядок превышало количество молекул, способных реагировать с атомарным тритием, то «разбавление» меченых молекул немечеными приводило к слабой зависимости выхода меченого продукта от времени реакции и существенным колебаниям удельной активности препаратов. Аналогичные закономерности наблюдались при введении трития в модельные смеси аминокислот [3]. Таким образом, на примере ГК угля было показано, что для получения наибольшего выхода меченого продукта необходимо бомбардировать мишень атомами трития только 10 с.

В следующей серии экспериментов провели исследование влияния температуры атомизатора на образование меченных тритаем ГК угля.

Соответственно, время реакции выбрали равным 10 с, а давление газа составляло 0.5 Па. На рисунке 1 показана зависимость удельной радиоактивности препаратов от температуры атомизатора. Зависимость имела такой же вид, как и у аминокислот, только максимум радиоактивности достигался при температуре атомизатора 1950 К. Так как в состав периферической части молекул ГВ входят в основном аминокислоты и сахара, а закономерности введения трития в сахара можно ожидать такими же, или даже с более ярко выраженной тенденцией к разрушению, то сходство найденных зависимостей вполне обоснованно. Необходимо отметить, что при температуре атомизатора 2000 К интенсивность потока атомов трития была настолько велика, что приводило к увеличению образования модифицированных меченых молекул, следствием чего явилось снижение выхода основного продукта.

Рисунок 1. Зависимость удельной радиоактивности препаратов ГК угля от температуры атомизатора.

Некоторое различие в зависимостях выхода и удельной радиоактивности меченых продуктов от температуры атомизатора для индивидуальных аминокислот и ГВ может быть связано с тем, что в состав ГВ помимо аминокислотно-углеводной периферии входит и гидрофобное ядро с высоким содержанием ароматических и алифатических углеводородных фрагментов Для углеводородов наблюдается монотонное увеличение рассматриваемых характеристик с ростом температуры атомизатора вплоть до 2000 К. Нельзя исключить и незначительную модификацию меченых молекул ГВ за счет реакций декарбоксилирования, дезаминирования и дегидроксилирования, скорость которых возрастает гораздо быстрее при увеличении температуры, чем реакция замещения водорода на тритий по связи С-Н, как это наблюдалось в экспериментах с аминокислотами, сахарами. Так как ГВ представляют собой высокомолекулярные соединения стохастического строения, то модификация некоторых молекул за счет указанных выше процессов не должна сильно изменить свойства исследуемых препаратов.

Очистка меченных тритием гуминовых веществ от лабильного трития

Атомарный тритий, получаемый при термической диссоциации на вольфрамовой проволоке, способен замещать любые стерически доступные атомы водорода в молекулах мишени. При этом тритий, который заместил водород в составе углеводородного скелета, представляет собой необменный или скелетный тритий. В то же время тритий, который заместил водород функциональных групп, и находится в составе карбоксильных, гидроксильных и аминогрупп, представляет собой подвижный или обменный тритий, который легко обменивается в воде. Поэтому для получения меченного тритием соединения исключительно важным этапом является очистка меченого препарата от лабильной (способной обмениваться с водой) метки. Тщательность такой очистки определяет достоверность результатов, полученных при использовании радиоактивной метки. Поэтому особое внимание в нашей работе было уделено выбору оптимального способа очистки меченого препарата от лабильной метки.

Так как ГВ представляют собой набор молекул, масса которых составляет от тысячи до десятков тысяч Дальтон, то вполне вероятно, что у таких макромолекул есть функциональные группы, содержащие водород, обмен которого с растворителем затруднен. Следовательно, для удаления трития из таких положений требуются или жесткие условия обмена, или длительное время для достижения равновесия. Первый путь может быть реализован нагреванием и изменением рН раствора, однако для ГВ он неприемлем из-за опасности необратимых изменений препаратов. В данной работе мы показали, что для удаления основной части лабильного трития необходимо выдерживать раствор меченого ГВ в фосфатном буфере при рН 6.8 в течение 30 суток при 4° С. Для контроля за полнотой обмена выдерживали 1-2 мл препарата в пробирке, отделенной диализной мембраной с соответствующим размером пор, от 1 л фосфатного буфера, который периодически заменялся. В случае, если размер пор превышал допустимый для рассматриваемого препарата, то происходили значительные потери вещества, и изменялся молекулярно-массовый состав препарата (молекулы меньших масс проходили через мембрану). Для большинства препаратов использование мембраны с М\УСО 2 кДа было оптимальным, при этом потери вещества сводились к минимуму и сохранялось молекулярно-массовое распределение молекул.

Подтверждение равномерности введения метки в гуминовые вещества

Для оценки идентичности исходного и меченого препарата, очищенного от лабильной метки, проводили их гель-хроматографирование с регистрацией по УФ-поглощению при 254 нм. Об идентичности препаратов судили по совпадению УФ профилей исходного и меченого препаратов. В большинстве случаев наблюдалось полное совпадение профилей по УФ-поглощению исходных и меченых ГВ (рис. 2), что означало сохранение молекулярно-массового распределения в препарате.

объем элюентя, мл

Рисунок 2. Профили выхода по УФ-поглощению (1, 2) и радиоактивности (3) при эксклюзионной хроматографии препаратов ГК угля: 1 - исходный препарат; 2, 3 меченый препарат, очищенный с помощью диализа.

Иногда происходило небольшое смещение пика выхода с колонки меченого препарата в область более высоких молекулярных масс. Причиной такого смещения заключалась в частичной потере низкомолекулярных фракций препарата при диализе.

Одновременно с гель-хроматографическим анализом проводили его фракционирование, и радиоактивность собранных фракций измеряли с помощью жидкостного сцинтилляционного счета. В большинстве случаев полученный профиль по радиоактивности совпадал с профилем по УФ-поглощению (рис. 2), что свидетельствовало о равномерном распределении метки по компонентам ГВ. В случае, когда введение тритиевой метки проводили в неоптимальных условиях, профиль по радиоактивности не всегда совпадал с профилем по УФ-поглощению, что свидетельствовало о наличии в меченом препарате модифицированных молекул, которые не удалялись при диализной очистке.

Характеристика меченных тритием гуминовых веществ

При выполнении работы было получено 28 меченных тритием препаратов ГВ из различных источников происхождения (10 групп). В таблице 2 приведены данные по удельной радиоактивности и выходу некоторых меченых препаратов ГВ. При малых временах реакции (10 с), давлении трития 0.5 Па, температуре атомизатора от 1900 до 2000 К, массе мишени 0.25-0.35 мг и при использовании диализных мембран МЖЮ 2 кДа достигались удельные радиоактивности 0.2-0.7 ТБк*г"\ Было показано, что при использовании мембран с большим размером пор для диализной очистки происходило обеднение препаратов низкомолекулярными фракциями, однако удельная радиоактивность при этом не менялась. Это является

дополнительным доказательством равномерности распределения трития по компонентам ГВ.

Таблица 2. Характеристики меченных тритием препаратов ГВ

Препарат Источник Средняя мол. масса, кДа Удельная р/акг-ть, ТБк*г1 Выход, %

ГК угля коммерческий препарат, (леонардит) 20.0 0.72 96

ГМК угля получен из коммерческого препарата (леонардита) 18.0 0.28 * 21

ГК торфа сфагновый верховой торф (Тверская обл.) 32.2 0.28 81

ФК торфа Сфагновый верховой торф (Тверская обл.) 15.4 0.18 53*

ГК почвы чернозем (Липецкая обл.) 15.1 0.17 89

ФК почвы чернозем (Липецкая обл.) 11.3 0.63 85

ФК почвы дерпово-подзол почвы (Московская обл.) 11.1 0.35 82

Примечание: (*) - произошли неконтролируемые потери препарата в процессе очистки.

Адаптация метода сцинтиллирующей фазы к исследованию свойств гуминовых веществ

В методе СФ следят за поведением меченного тритием вещества по его излучению, которое регистрируется в органической фазе (сцинтиллирующая жидкость на основе толуола) с помощью жидкостного сцинтилляционного спектрометра. Учитывая малый пробег бета-частиц трития, также происходит регистрация излучения из тонкого (около 1 мкм) слоя водной фазы, что позволяет непосредственно определять количество ПАВ на границе раздела двух жидкостей. Важным достоинством такого подхода является возможность непрерывного измерения скорости счета меченного тритием вещества без нарушения целостности системы. В данной работе был предложен ряд усовершенствований метода СФ, позволяющих использовать его как для исследования кинетики адсорбции, так и равновесной адсорбции веществ самой разной природы на границе раздела органическая «сцинтиллирующая фаза» - водный раствор, а также для определения коэффициента распределения веществ в этой системе.

Так как регистрация излучения трития в рассматриваемой системе возможна из органической фазы и из тонкого слоя водного раствора на границе раздела фаз, то скорость счета слагалась из двух составляющих: «объемной» составляющей (1у), обусловленной регистрацией меченого соединения, растворенного в толуоле,

1у = Еуас0Г|У (1)

и «поверхностной» составляющей (18), относящейся к регистрации бета-излучения трития из тонкого (около 1 мкм) поверхностного слоя водной фазы на границе раздела с органической фазой

15 = еуа(0.5 Г+0.27 с^И)^, (2)

где с,, и с» - концентрации меченого соединения в органической и водной фазах, Г - величина удельной адсорбции поверхностно-активного вещества на границе раздела фаз, Бу - эффективность регистрации излучения в органической фазе, V - объем органической фазы, в - площадь границы раздела, Ь - толщина зоны водной фазы, из которой возможна регистрация излучения трития, а - удельная радиоактивность меченого соединения.

Эффективность регистрации трития в объеме органической фазы определяли с помощью методов внешнего и внутреннего стандартов. Эффективность регистрации с поверхности раздела фаз принимали равной 0.5еу Для адсорбционных слоев ПАВ и 0.27еу для регистрации излучения из приповерхностного слоя водной фазы, ограниченного пробегом бета-частиц трития в воде, что и отражено в формуле (2).

Для разделения вклада «объемной» и «поверхностной» составляющих в скорость счета препарата использовали два способа. По первому способу готовили серию образцов с разным количеством органической фазы. Определяли зависимость равновесной скорости счета препарата от объема толуола, аппроксимировали экспериментальные значения прямой, по углу наклона определяли «объемную» составляющую скорости счета и концентрацию меченых молекул в толуоле, а «поверхностную» составляющую находили экстраполяцией скорости счета к нулевому объему толуола.

По второму способу определения 1У и к водному раствору меченого вещества добавляли V мл органической фазы, после достижения равновесия в системе измеряли скорость счета флакона (I), отбирали в другой флакон VI мл органической фазы и повторно измеряли скорость счета отобранного раствора (10 и остатка (12). «Объемную» составляющую скорости счета определяли из соотношения 1у = (У/У])-1ь «поверхностную» составляющую рассчитывали по двум выражениям: ^ = I - (У/У|)-11 и 1!) = 12-(У/Уг1)11. Расхождение между значениями «поверхностной» составляющей скорости счета, рассчитанной разными способами, не превышало 5 %. Обычно использовали 3 мл органической фазы, после уравновешивания системы отбирали 2 мл раствора.

Начальную концентрацию меченого соединения в водной фазе определяли, отбирая аликвоту раствора и измеряя ее радиоактивность. Равновесную концентрацию меченого соединения в водной фазе (с*) рассчитывали, учитывая переход вещества в органическую фазу и его концентрирование на межфазной границе, а также контролировали в отдельных экспериментах, отбирая аликвоты на счет. Коэффициент

распределения вещества между водной и органической фазой определяли по соотношению Б = с0Г| /с*,.

В отличие от первоначального варианта метода [4] вместо стандартного стеклянного флакона объемом 20 мл использовали полипропиленовый флакон объемом 7 мл, что принципиально изменило геометрию границы раздела фаз. Так как в случае используемого в классическом варианте метода СФ стеклянного флакона водная фаза смачивала его поверхность и образовывался вогнутый мениск границы раздела фаз, то существенный вклад в скорость счета с границы раздела фаз вносила поверхность, непосредственно прилегающая к стенкам флакона, что затрудняло интерпретацию результатов. В случае полипропиленового флакона водная фаза не смачивала его стенки, и образовывался выпуклый мениск, а при объеме водной фазы меньше 0.7 мл водная фаза представляла собой каплю на дне флакона. В этом случае практически можно пренебречь трехфазным контактом стенка флакона - водная фаза - органическая фаза.

Таким образом, представилось возможным использовать два варианта проведения эксперимента в пластиковом флаконе малого размера: в виде двухслойной и капельной систем. Двухслойная система реализовывалась при объеме водной фазы более 0.7 мл, при этом объем органической фазы мог составлять от 2 до 5 мл. Капельная система реализовывалась при объемах водной фазы менее 0.6 мл. При изучении зависимости скорости счета флакона от объема водной фазы было установлено, что для капельной системы скорость счета флакона росла с увеличением объема водной фазы, а при образовании двухслойной системы скорость счета не зависела от объема водной фазы. Время установления равновесия в исследуемых системах зависело от молекулярной массы (диффузионной подвижности) молекул и лежало в пределах от 5 часов (тритиевая вода) до 6 суток (ГВ).

На примере препарата ГК угля провели сопоставление двухслойной и капельной систем при исследовании адсорбции на границе толуол-вода. Разделение объемной и поверхностной составляющих скорости счета проводили с помощью отбора часта толуола в другой флакон после уравновешивания системы. На рис. 3 представлены зависимости количества адсорбированного вещества на границе раздела от концентрации ГК в водном растворе для объемов водной фазы 0.2 и 1.0 см3. Оказалось, что зависимости имеют сходный вид с выходом на плато при концентрации ГК более 40 мг*см'3. Отношение количества вещества на границе раздела толуол-вода в двухфазной системе к капельной системе составило 1.98±0.04. Такое же соотношение было получено и в экспериментах с СТАВ. Учитывая, что в случае капельной системы водная фаза имела форму, близкую к форме шара, а контактом водной фазы со стенками полиэтиленового флакона можно пренебречь, то можно принять площадь границы раздела для капли объемом 0.2 см3 равной 1.65 см2. Тогда для двухфазной системы, которая реализуется при объеме водной фазы > 0.7 см3, площадь границы раздела будет, исходя из указанного выше соотношения количеств вещества, равна 3.3 см2. Предельная величина адсорбции ГК угля на границе раздела толуол-

вода, рассчитанная из данных капельной и двухслойной систем, оказалась равной 71+7 нг*см'2.

Рисунок. 3. Зависимость количества ГК угля, адсорбировавшегося на границе раздела толуол-вода, от концентрации ГК угля в водном растворе:

1 - капельная система, объем водной фазы 0.2 мл;

2 - двухслойная система, объем водной фазы 1.0 мл.

С помощью тритиевой воды были подтверждены найденные параметры системы. Так, растворимость воды в толуоле оказалась равной 0.39±0.03 г/л при 22° С, что хорошо согласуется с литературными данными. Толщина зоны регистрации бета-частиц трития из водной фазы (Ь), оцененная из выражения (2) при условии равномерного распределения меченого вещества в водной фазе (Г = 0), составила 1.6±0.4 мкм.

Разработанный вариант метода СФ был использован для исследования распределения между фазами альфа-аминокислот с неразветвленной углеводородной цепью: аланина, норвалина и норлейцина. На рис. 4 представлена зависимость скорости счета от концентрации аминокислот аланина и норвалина в водной фазе. Видно, что для аланина скорость счета росла практически линейно во всем диапазоне концентраций. Для норвалина получена аналогичная зависимость при рН 1.6, однако при рН 6.0 и 7.8 при концентрации выше 3 г*л-1 наблюдались более высокие значения скорости счета. Отбором части толуольной фазы в другой флакон определили объемную и поверхностную составляющую скорости счета. Оказалось, что для аланина рост скорости счета с увеличением концентрации раствора удовлетворительно описывается выражением (2), в котором величина Г в пределах ошибки эксперимента равна нулю, а толщина зоны регистрации трития из водной фазы составляет 1.6±0.8мкм. Аналогичная зависимость скорости счета от концентрации раствора получена и для норвалина при рН 2. Однако в нейтральном и слабощелочном растворе норвалина при концентрации больше 3 г*л"' возрастала поверхностная составляющая скорости счета, что свидетельствовало о концентрировании норвалина на границе раздела фаз.

ъ6

§ Л

х 4 £ £ „

4 С, г/л 6

Рисунок 4. Зависимость равновесной скорости счета двухфазной системы толуол-вода от концентрации аминокислоты в водном растворе: 1 -аланин при рН 6.0; 2 - норвалин при рН 1.6; 3 - норвалин при рН 6.0; 4 - норвалин при рН 7.8.

0 10 20 С.мМ

Рисунок 5 Изотерма адсорбции норлейцина на границе раздела толуол-вода при рН 6.0.

Количество адсорбированного вещества в данном эксперименте можно было определить с большой погрешностью из-за того, что эта величина была невысокой и, соответственно, скорость счета флаконов при определении поверхностной и объемной составляющих также была маленькой. Повысить точность определения можно, используя вещества с более высокой удельной радиоактивностью, однако в этом случае в сцинтилляционные флаконы пришлось бы вносить препараты с большой радиоактивностью. Такой же эксперимент с норлейцином позволил построить изотерму адсорбции норлейцина на границе раздела толуол-вода (рис.5). Предельная величина адсорбции достигалась при концентрации норлейцина в водном растворе более 1 г*л"' и составила 3.6+1.6 мкмоль*м"2, что соответствует площади поверхности, приходящейся на одну молекулу, равной 0.46Ю.20 нм2.

В случае поверхностно-активных веществ, адсорбция которых на границе раздела толуол-вода оказывается значительной при концентрации в водном растворе до 100мг*л"', метод сцинтиллирующей фазы позволяет надежно определить избыточное количество вещества на границе раздела фаз. Например, для СТАВ были найдены величины избыточного количества молекул на границе раздела толуол-вода, которые вполне согласуются с данными, полученными другими методами. Так при концентрации 0.03 мМ количество молекул СТАВ на границе раздела было найдено равным (4.1 ±0,7)* 10"7, что достаточно для образования адсорбционного слоя с расположением углеводородных «хвостов» параллельно границе раздела. При концентрации 0.43 мМ эта величина достигала (3.0±0,4)*10-6 моль*м"2, что соответствует насыщенному монослою ПАВ с ориентацией молекул перпендикулярно границе раздела.

Определение гидрофобности и поверхностной активности гуминовых веществ с помощью метода сцинтиллирующей фазы

С помощью меченных тритием ГВ и нового варианта метода СФ были определены коэффициенты распределения ГВ между водой и толуолом, а также найдена величина адсорбции на границе раздела фаз двух жидкостей. Зависимость равновесной концентрации ГВ в органической фазе от их концентрации в водной фазе имела линейный характер, что позволило рассчитать коэффициенты распределения исследуемых веществ между водой и толуолом (К,„). Так как для характеристики гидрофобности вещества принято использовать коэффициент распределения между октанолом и водой (Кот), то с помощью меченных тритием ГВ были определены соответствующие коэффициенты. Концентрацию ГВ в воде и октаноле определяли по радиоактивности отбором проб на счет.

Найдена хорошая линейная корреляция между К^ и К«*, (рис. 6). Это означает, что с помощью метода СФ и меченных тритием препаратов можно получать количественные характеристики гидрофобности ГВ. С помощью коэффициентов распределения между толуолом и водой была построена шкала гидрофобности ГВ. Оказалось, что гидрофобность ГВ увеличивается в следующем порядке:

ФК почв < ГК почв < ГК торфа ~ ФК торфа < ГК угля

_ -2,0

"я

ш -2,5

£-зо

г -з,5 *

-3 5 -3,0 -25 -2,0

1д Кол(оггаиол/вода]

Рисунок 6. Корреляция между коэффициентами распределения ГВ в системах толуол-вода (Км) и октанол-вода (Кои).

Рисунок. 7. Изотермы адсорбции ГК (1) и ФК (2) торфа на границе раздела фаз толуол-вода.

Удельная радиоактивность меченых ГВ оказалась достаточной для достоверного определения количества ГВ на границе раздела фаз в диапазоне концентрации в водной фазе 0.1-100 мг*л'. При более высоких концентрациях работа затруднялась необходимостью учета цветового гашения в водном растворе, что затрудняло определение количества вещества на границе раздела. Однако при таких высоких концентрациях обычно уже происходило образование насыщенного адсорбционного слоя. Определение количества ГВ на границе толуол-вода в широком интервале

построить изотермы адсорбции, которые в большинстве случаев оказались Лэнгмюровского типа (рис. 7).

При увеличении концентрации препарата в водной фазе в диапазоне от 0.1 до 5 мг*л"' наблюдалось быстрое увеличение количества адсорбированных меченых молекул ГВ на границе раздела толуол-вода. При концентрации от 20 до 60 мг*л"' происходило насыщение адсорбционного слоя, и при дальнейшем увеличении концентрации вещества в водной фазе количество молекул ГВ на границе раздела практически не менялось. Величина предельной адсорбции лежала в пределах от 0 08 мг*м"2 (ФК почвы) до 2.8 мг*м'2 (ГК торфа). На основании проделанных экспериментов был получен ряд изменения адсорбции исследованных препаратов на границе толуол-вода, который выглядит следующим образом: ФК почв < ГК почв < ГК угля < ФК торфа < ГК торфа Было показано, что гидрофобность препаратов мало менялась при их дальнейшем фракционировании с помощью диализных мембран с порами разного размера или выделения высоко- и низкомолекулярных фракций при эксклюзионной хроматографии меченых препаратов. В то же время было найдено, что количество вещества, способного адсорбироваться на границе раздела толуол-вода сильно возрастало для препаратов, обедненных низкомолекулярными компонентами.

Использование разработанных методов для исследования физико-химических свойств биологически активного препарата лигфол

Разработанные в работе методы и подходы были использованы для получения меченного тритием биологически активного препарата лигфол, который является продуктом переработки целлюлозы и представляет собой гуминоподобное вещество. Введение трития осуществляли в условиях, который оказались оптимальными при работе с ГВ. Процедуры очистки и анализа также были проведены по аналогичной схеме.

Как оказалось, исследованный препарат лигфол, в отличие от ГВ, имел в своем составе достаточно много низкомолекулярных фракций, что привело к значительным его потерям при диализной очистке и к изменению молекулярно-массового распределения, что было подтверждено с помощью эксклюзионной хроматографии. Вместе с тем лигфол не меняет своих свойств в результате ряда последовательных процедур растворения-лиофилизации, что и было использовано для удаления лабильной метки. Суммарное время выдерживания раствора лигфола, как и в случае диализной очистки, составило 30 суток, что обеспечило полное удаление трития из лабильных положений. При эксклюзионной хроматографии препаратов было обнаружено, что максимум кривой элюирования диализованного препарата сдвинут в сторону больших молекулярных масс. Тем не менее, для обоих меченых препаратов наблюдалось хорошее совпадение профилей их выхода по УФ-поглощению и по радиоактивности, что свидетельствовало о равномерном распределении трития по компонентам препаратов.

В таблице 3 приведены основные характеристики меченых препаратов лигфола. Препараты с такой удельной радиоактивностью вполне пригодны для проведения химических и биохимических исследований с регистрацией их количества по радиоактивности.

Таблица 3. Характеристика меченых препаратов лигфола.

Препарат Способ очистки от лабильной метки Исходная радиоактивность, МБк Радиоактивность после очистки, МБк Удельная радиоактивность очищенного препарата, 1'Бк/г Выход (остаток после очистки), %

реальная (25%-ный тритий) пересчет на 100%-ный тритий

1 диализ 165 49.7 115 460 67%

2 лиофилизация 149 58.3 93 370 98%

Исследование гидрофобных и поверхностно-активных свойств меченных тритием препаратов лигфола проводили с использованием метода СФ. Оказалось, что коэффициент распределения лигфола между водной фазой и толуолом зависел от способа удаления лабильной метки и составил 0.0031+0.001 для диализованного препарата и 0.0020+0.001 для лиофилизованного препарата. Для системы октанол-вода коэффициент распределения лигфола тоже зависел от способа очистки меченых препаратов: Ко« = 0.0065+0.003 для диализованного препарата и К0„ = 0.0052+0.003 для лиофилизованного. Зависимость коэффициента распределения между органической и водной фазой от способа очистки препарата свидетельствует о том, что гидрофобные свойства препарата неодинаковы для его различных фракций, и высокомолекулярные фракции лигфола более гидрофобны. Так, при диализной очистке из препарата удалялись низкомолекуляные фракции, и происходило увеличение коэффициента распределения между органической и водной фазами. Аналогичная зависимость коэффициента распределения от фракционного состава препаратов наблюдалась для ГК угля, очищенных через диализные мембраны с различными размерами пор.

Изотермы адсорбции на границе раздела толуол-водный раствор у препаратов лигфола, подвергнутых диализу и лиофилизации, также различались. Для диализованного препарата наблюдались более высокие значения избыточного количества вещества на границе раздела во всем диапазоне концентраций. В области концентраций в водной фазе 40-80 мг*л"', когда для большинства препаратов ГВ наблюдается образование насыщенного адсорбционного слоя на границе раздела толуол-вода, величины избыточного количества вещества составили 54+8 нг*см 2 для диализованного препарата и 33+12 нг»см"2 для лиофилизованного препарата. Для диализованного препарата наблюдалась тенденция роста количества вещества на границе раздела при увеличении концентрации в водной фазе от

40 до 80 мг*л"', тогда как для диализованного препарата достигалась предельная величина адсорбционного слоя.

Найденные величины предельной адсорбции свидетельствуют о том, что для лигфола характерна довольно низкая адсорбционная способность на гидрофобных поверхностях. Величина адсорбции при концентрации 40-80 мг*л"' у лигфола выше, чем у ГК почв, однако значительно ниже, чем у ГК торфа, для которых характерная величина адсорбции составляет в указанных условиях 150-330 нг*см"2.

Исследование связывания гуминовых веществ бактериями и высшими растениями

Несмотря на разнообразие данных, свидетельствующих о физиологической активности ГВ по отношению к различным биологическим объектам, механизм их действия до сих пор не установлен. В частности, нерешенным остается вопрос о возможности поступления ГВ в клетки живых организмов. Полученные меченные тритием препараты ГВ позволили впервые получить доказательства их поступления в бактерии и растения и дать количественную характеристику этому процессу.

Взаимодействие гуминовых веществ с бактериями Escherichia coli. Полученные результаты показали, что факторы бионакопления ГВ варьируются в пределах 0.9-1.8 л*кг"' для ФК и 2.3-13 л*кг"' для ГК. При этом было показано, определенное количество сорбированных ГВ поступает внутрь клетки, т.е. способно проникать через мембрану. Количество поглощенных клетками бактерий ГВ изменялось от 0.9 до 5.5 нг/млн. клеток.

Взаимодействие гуминовых веществ с растениями Triticum aestivum L. Установлено, что факторы бионакопления ГВ растениями мягкой пшеницы Triticum aestivum L. лежат в пределах 3.2-38.7 л*кг"', при этом минимальные значения этого показателя наблюдали для ГМК угля, а максимальные - для ГК торфа.

Распределение ГК угля в тканях высших растений с помощью авторадиографии показало, что максимальная концентрация ГВ наблюдается в корневой части растений, тогда как в надземную часть поступает лишь их незначительная часть. При этом распределение ГК в органах растений также оказалось неоднородным: в участках апикальных меристем корней и побегов было отмечено локальное возрастание концентраций ГВ в 1.8-2.1 раза.

, ВЫВОДЫ

препаратов создаются при давлении газа не выше 0.5 Па, времени реакции 10 секунд и температуре атомизатора от 1900 до 2000 К. Равномерность распределения трития по компонентам меченых препаратов гуминовых веществ подтверждена с помощью эксклюзионной хроматографии.

2. Для очистки меченых препаратов гуминовых веществ от лабильной метки предложено использовать диализ через мембраны с размером пор MWCO 2-12 кДа в фосфатном буфере при рН 6.8 в течение 30 суток при 4° С. Показано, что при использовании мембран с большим диаметром пор возможно обеднение препаратов низкомолекулярными фракциями, однако удельная радиоактивность препаратов оставалась при этом постоянной, что подтверждало равномерность распределения трития по компонентам препарата.

3. Разработан новый вариант метода сцинтиллирующей фазы с целью его использования для определения гидрофобности и поверхностной активности гуминовых и гуминоподобных веществ. Достоверность получаемых результатов была подтверждена при исследовании меченных тритием аминокислот и поверхностно-активных веществ.

4. С помощью метода сцинтиллирующей фазы определены коэффициенты распределения гуминовых веществ различного происхождения в системе толуол-вода, а также получены изотермы адсорбции гуминовых веществ на границе раздела толуол-вода. Найдена хорошая корреляция между коэффициентами распределения гуминовых веществ в системах толуол-вода и октанол-вода, что позволило построить шкалу гидрофобности, согласно которой гидрофобность гуминовых веществ увеличивается в следующем порядке: ФК почв < ГК почв < ГК торфа « ФК торфа < ГК угля. Получен ряд адсорбционной способности гуминовых веществ на границе толуол-вода, который выглядит следующим образом: ФК почв < ГК почв < ГК угля < ФК торфа < ГК торфа.

5. Разработанные методики были использованы для получения меченного тритием биологически активного препарата лигфол (гуминоподобное вещество). Равномерность распределения трития по компонентам лигфола подтверждена с помощью эксклюзионной хроматографии. С помощью меченного тритием лигфола и метода сцинтиллирующей фазы были определены коэффициенты распределения лигфола между водой и толуолом, а также найдена величина адсорбции на границе раздела толуол-вода.

6. С помощью жидкостного сцинтилляционного счета и авторадиографии на примере бактерий Escherichia coli и растений мягкой пшеницы Triticum aestivum L была показана возможность использования меченных тритием препаратов ГВ в биологических исследованиях, направленных на изучение поглощения и распределения сложных смесей органических веществ природного происхождения в живых организмах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ

ПУБЛИКАЦИЯХ:

Заявка на патент

1. Бадун Г.А. Позднякова В.Ю., Чернышева М.Г., Куликова Н.А., Перминова И.В., Шмит-Копплин Ф. Способ получения меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ. Заявка на патент 2005139586. Дата поступления 19.12.2005. Статьи в журналах

1. Badun G.A., Pozdnyakova V.Yu., Kudryavtsev A.V., Perminova I.V. Preparation of tritium-labeled humic substances using thermal activation method. // Ecology and Future. Bulgar. J. of Ecological Science, 2003, V.2, N 3-4, P.26-27.

2. Бадун Г.А., Ксенофонтов А.Л., Лукашина E.B., Позднякова В.Ю., Федосеев В.М. Сравнительное исследование взаимодействия атомарного трития с глюкозамином и аминокислотами. // Радиохимия, 2005, Т.47, № 3, С. 281-283.

3. Бадун Г.А., Чернышева М.Г., Позднякова В.Ю., Федосеев В.М. Новый вариант метода сцинтиллирующей фазы. // Радиохимия, 2005, Т.47, № 6, С. 536-540.

4. Чернышева М.Г., Бадун Г.А., Тясто З.А., Позднякова В.Ю., Федосеев В.М., Ксенофонтов А.Л. Неравновесные процессы при взаимодействии горячих атомов трития с охлажденными твердыми мишенями. Влияние температуры атомизатора на образование меченых веществ. // Радиохимия, 2007, Т.49, № 1 (в печати).

Статьи в научных сборниках

1. Badun G.A., Pozdnyakova V.Yu., Chernysheva M.G., Shchepina N.E., Fedoseev V.M. Determination of hydrophobicity and surface activity of substances in system toluene - water with help of tritium labeled compounds. // Proc. of 8th Int. Sc. Conf. "Physical and Chemical Processes on Selection of Atoms and Molecules" October 6-10, 2003. Zvenigorod, Russia, P.193-198.

2. Badun G.A., Pozdnyakova V.Yu., Chernysheva M.G., Tyasto Z.A, Perminova I.V. Use of tritium labeled preparations for direct measurements of humic substance hydrophobicity and their interfacial adsorption in toluene-water system. // Proceed. XII Intern. Meeting of IHSS "Humic Substances and Soil and Water Environment" July 25-30, 2004, Colina Verde Hotel, Sao Pedro, Sao Paulo, Brazil, P.251-253.

3. Kulikova N.A., Badun G.A., Perminova I.V., Pozdnyakova V.Yu., Belyaeva E.Yu., Kudryavtsev A.V. Tritium-labeled humic preparations as a perspective tool for membranotropic studies. // Proceed. XII Intern. Meeting of IHSS "Humic Substances and Soil and Water Environment" July 25-30, 2004, Colina Verde Hotel, Sao Pedro, Sao Paulo, Brazil, P.383-385.

4. Badun G.A., Chernysheva M.G., Pozdnyakova V.Yu., Tyasto Z.A., Fedoseev V.M., Shchepina N.E. Nonequilibrium processes during tritium atoms interaction formed by thermal dissociation on tungsten wire with targets of complex chemical composite. // Proc. of 9th Int. Sc. Conf. "Physical and Chemical Processes on

Selection of Atoms and Molecules" October 4-8, 2004, Zvenigorod, Russia, P.149-153.

5. Позднякова В.Ю., Чернышева М.Г., Бадун Г.А., Перминова И.В., Федосеев В.М. Получение меченных тритием гуминовых препаратов и изучение их гидрофобных и поверхностно-активных свойств. // Сборник докладов 10-ой Всеросс. (междунар.) научной конф. «Физико-хим. процессы при селекции атомов и молекул» Звенигород, 3-7 октября 2005 г. ЦНИИАТОМИНФОРМ, 2005, С.284-287.

6. Badun G.A., Chernysheva M.G., Mikhalina E.V., Pozdnyakova V.Yu., TyastoZ.A., FedoseevV.M. Investigations of nonequilibrium processes in the interaction of hot tritium atoms generated on tungsten filaments with cooled solid targets: probability of reaction during first collision and characteristic size of reaction zone. // Proceed. 7th Russian-Finnish Symposium on Radiochemistry "Modern Problems of Radiochemistiy - 2005" Saint-Petersburg, Russia. November 16- 18, 2005, P.59-60.

7. Pozdnyakova V.Yu., Badun G.A., Chernysheva M.G., Tyasto Z.A., FedoseevV.M., Perminova I.V. Tritium Probe for Investigation of Humic Materials. // Proceed. XIII Intern. Meeting of IHSS "Humic Substances - Linking Structure to Functions" July 30-August 4,2006, Karlsruhe, Germany (in press).

8. Kulikova N.A., Badun G.A., Korobkov V.I., Pozdnyakova V.Yu., Perminova I.V. Uptake of humic acids by wheat plants: direct evidence using tritium tritium autoradiography. // Proceed. XIII Intern. Meeting of IHSS "Humic Substances - Linking Structure to Functions" July 30-August 4, 2006, Karlsruhe, Germany (in press).

Тезисы докладов на научных конференциях

1. Бадун Г.А., Позднякова В.Ю., Чернышева М.Г. Модификация метода «сцинтиллирующей фазы» для исследования поведения вещества в системе водный раствор - граница раздела - органическая фаза. // Тезисы докл. 4-ой Росс. конф. по радиохимии. 20-25 окт. 2003 г. Озерск, Россия, С.293.

2. Позднякова В.Ю., Бадун Г.А., Кудрявцев А.В., Перминова И.В., Федосеев В.М.. Получение меченных тритием гуминовых веществ и исследование их физико-химических свойств. // Тезисы докл. 4-ой Росс, конф. по радиохимии. 20-25 окт. 2003 г. Озерск, Россия, С.293-294.

3. Бадун Г.А., Позднякова В.Ю., Чернышева М.Г., Щепина Н.Е., Федосеев В.М. Определение гидрофобности и поверхностной активности веществ в системе толуол-вода с помощью меченных тритием соединений. // Тезисы докл. 6-ой Всеросс. (междунар.) научной конф. "Физико-хим. процессы при селекции атомов и молекул" Звенигород, 6-10 октября 2003 г.

4. Бадун Г.А., Чернышева М.Г., Позднякова В.Ю., Тясто З.А., Федосеев В.М., Щепина Н.Е. Неравновесные процессы при взаимодействии атомов трития, полученных при термической диссоциации на вольфрамовой проволоке, с мишенями сложного химического состава. // Тезисы докл. 9-ой Всеросс. (междунар.) научной конф. «Физико-хим. процессы при селекции атомов и молекул» Звенигород, 4-8 октября 2004 г., С.36.

5. Позднякова В.Ю., Чернышева М.Г., Бадун Г.А., Перминова И.В., Федосеев В.М. Получение меченных тритием гуминовых препаратов и изучение их гидрофобных и поверхностно-активных свойств. // Тезисы докл. 10-ой Всеросс. (междунар.) научной конф. «Физико-хим. процессы при селекции атомов и молекул» Звенигород, 3-7 октября 2005 г., С.49.

6. Позднякова В.Ю. Получение меченных тритием компонентов гуминовых веществ и их анализ с помощью гель-хроматографии. //Материалы Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундамент, наукам «Ломоносов-2003». Секция Химия, Т.2, М., С.328.

7. Позднякова В.Ю., Чернышёва М.Г. Использование метода сцинтиллирующей фазы для исследования поверхностно-активных и гидрофобных свойств компонентов гуминовых веществ. // Материалы Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундамент, наукам «Ломоносов-2004» 12-15 апр. 2004 г. Секция химия, Т.1, М., С.154.

8. Чернышёва М.Г, Позднякова.В.Ю. Кинетические аспекты использования метода сцинтиллирующей фазы для исследования гидрофобных и адсорбционных свойств веществ. // Материалы Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундамент, наукам «Ломоносов-2004». 12-15 апр. 2004 г. Секция химия, Т.1, М., С.163.

9. Чернышёва М.Г., Тясто З.А., Позднякова В.Ю. Взаимодействие «горячих» (1600-2000 К) атомов тритая с холодными (77К) мишенями аминокислот и алкилтриметиламмоний бромидов. // Материалы Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундамент, наукам «Ломоносов-2005». 12-15 апр. 2005 г. Секция Химия, Т.2, М., С.133.

10. Позднякова В.Ю., Чернышёва М.Г. Специфика поведения меченных тритием гуминовых веществ в двухфазных системах вода-толуол и вода-октанол. Материалы Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундамент, наукам «Ломоносов-2005». 12-15 апр. 2005 г. Секция Химия, Т.2, М., С. 124.

В автореферате использованы ссылки на работы:

[1] Хэ Дон Гир, Бадун Г.А., Ярцева И.В., Розенберг С.Г., Зимакова Н.И., Симонов Е.Ф., Филатов Э.С. Получение меченных тритием препаратов асалина для медицинских исследований. II Вестн. ун-та, сер. 2, Химия, 1992, Т.ЗЗ, № 5, С.455-459.

[2] Сидоров Г.В., Бадун Г.А., Баитова Е.А., Байтов A.A., Платошина A.M., Мясоедов Н.Ф., Федосеев В.М. Сравнительное изучение реакций термически активированного трития и твердофазной каталитической гидрогенизации тритием с сахарами и диазинами. // Радиохимия. 2005, Т.47, № 3, С.284-288.

[3] Бадун Г.А., Лукашина Е.В., Ксенофонтов А.Л., Федосеев В.М. Кинетические закономерности образования меченых продуктов при действии атомарного трития на замороженные растворы и лиофилизованные смеси аминокислот. // Радиохимия. 2001, Т.43, № 3, С.272-276.

[4] Алентьев А.Ю., Филатов Э.С. Радиометрический метод исследования межфазных границ двух несмешивающихся жидкостей. // Радиохимия. 1991, Т.ЗЗ, С.80-87.

¿РШ

»-9314

Подписано в печать 21.04.2006 Формат 60x88 1/16. Объем 3.75 пл. Тираж ЮОэкз. Заказ № 513 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Позднякова, Виолетта Юрьевна

w 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гуминовые вещества

1.2. Гидрофобность гуминовых веществ и методы определения коэффициентов распределения

1.3. Поверхностно-активные свойства гуминовых веществ

1.4. Исследование адсорбционных явлений на границе раздела жидкость-жидкость

1.5. Введение радионуклидов в гуминовые вещества

1.6. Метод сцинтиллирующей фазы

1.7. Методы введения трития в органические молекулы

1.7.1. Химический синтез

1.7.2. Биосинтез меченых соединений

1.7.3. Изотопный обмен

1.7.4. Ядерно-химические и физико-химические методы 39 # 1.7.5. Метод термической активации трития

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и оборудование

2.2. Препараты гуминовых веществ и лигфола

2.3. Схема проведения эксперимента с гуминовыми веществами

2.4. Получение меченных тритием гуминовых веществ

2.4.1. Приготовление мишеней

2.4.2. Введение тритиевой метки

2.5. Методы исследования 54 ^ 2.5.1. Измерение радиоактивности

2.5.2. Определение содержания трития в газе

2.5.3. Удаление трития из лабильных положений молекул

2.5.4. Хроматографический анализ

2.5.5. Определение молекулярно-массового распределения гуминовых а веществ

ВВЕДЕНИЕ

2.5.6. Исследование гидрофобных и поверхностно-активных свойств гуминовых веществ

2.5.7. Исследование взаимодействия гуминовых веществ с бактериями и растениями

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оптимизация условий введения тритиевой метки. Модельные эксперименты

3.2. Получение меченных тритием гуминовых веществ

3.3. Очистка меченных тритием гуминовых веществ от лабильной метки

3.4. Подтверждение равномерности введения метки в гуминовые вещества

3.5. Характеристика меченных тритием гуминовых веществ

3.6. Адаптация метода сцинтиллирующей фазы к исследованию свойств гуминовых веществ

3.7. Определение гидрофобности и поверхностной активности гуминовых веществ с помощью метода сцинтиллирующей фазы

3.7.1. Определение коэффициентов распределения гуминовых веществ в системах толуол-вода и октанол-вода

3.7.2. Определение изотерм адсорбции гуминовых веществ на границе раздела толуол-вода

3.7.3. Влияние фракционного состава на гидрофобность и поверхностную активность гуминовых веществ

3.8. Использование разработанных методов для исследования физико-химических свойств биологически активного препарата лигфола

3.9. Исследование связывания гуминовых веществ бактериями и высшими растениями

3.9.1. Взаимодействие гуминовых веществ с бактериями Escherichia coli

3.9.2. Взаимодействие гуминовых веществ с растениями

Trilicum aestivumL.

4. ВЫВОДЫ

Введение диссертация по химии, на тему "Получение меченных тритием гуминовых веществ и исследование их свойств"

В последние годы активно проводятся исследования сложных природных систем, содержащих в своем составе продукты жизнедеятельности и распада живых организмов. Важным представителем таких объектов являются гуминовые вещества (ГВ). Характеристика физико-химических свойств ГВ важна для понимания того, как эти вещества влияют на поведение и транспорт различных химических и радиоактивных загрязнений в окружающей среде [1, 2, 3, 4], при очистке воды [5, 6, 7], а также при исследовании их биологической активности и способности проникать через биологические мембраны [8]. В качестве важнейших характеристик ГВ, которые определяют их поведение в объектах окружающей среды и их биологическую активность, необходимо рассматривать гидрофобность и поверхностно-активные свойства. Несмотря на большое число методов, которые используются для изучения свойств ГВ (титриметрические и другие аналитические методы анализа, различные варианты хроматографии, методы спектроскопии 13С-ЯМР, ПМР) [9, 10, 11, 12], прямых методов определения поверхностно-активных свойств и гидрофобности ГВ не существует.

В последние годы на Химическом факультете МГУ был разработан метод исследования адсорбции белков на границе раздела водный раствор-толуол со сцинтиллирующими добавками (метод сцинтиллирующей фазы) [13]. Адаптация данного метода к исследованию поверхностно-активных свойств ГВ и оценке их гидрофобности может помочь в прогнозировании поведения ГВ в самых разных системах. Однако для реализации данного метода необходимо иметь меченные тритием соединения.

При изучении механизмов биологической активности ГВ следует ответить на вопрос: проницаемы ли биологические мембраны для ГВ? С этой целью необходимо получить прямые данные о проницаемости и сорбционной способности биомембран в отношении ГВ, что достоверно можно сделать только с помощью меченных радионуклидами препаратов. До сих пор наибольшее распространение получило использование меченых углеродом-14 ГВ, получаемых с помощью синтеза из веществ, считающихся предшественниками ГВ, либо после компостирования выращенных на меченом субстрате растений. Однако получаемые меченые препараты не обладали высокой удельной радиоактивностью и отличались по своим свойствам от природных ГВ, что затрудняло интерпретацию получаемых результатов.

Вследствие этого перспективным представляется использование в таких исследованиях в качестве радиоактивной метки трития, который можно ввести в компоненты природных препаратов гуминовых веществ изотопным замещением протия. Меченные тритием соединения нашли широкое применение в решении многих научных задач, так как тритий обладает уникальными ядерно-физическими свойствами (максимальная энергия бета-излучения 18.6 кэВ, период полураспада 12.3 года). Тритиевую метку можно ввести практически в любую органическую молекулу, работа с меченными тритием веществами не требует чрезвычайных мер радиационной защиты, а удельная радиоактивность соединения, содержащего один атом трития на молекулу, составляет 1.07 ТБк/ммоль. В настоящее время разработано большое число методов, позволяющих получить меченные тритием соединения самых разных классов с высокой удельной радиоактивностью [14,15].

Объекты исследования - гуминовые вещества (ГВ), представляющие собой сложные смеси устойчивых к биодеструкции высокомолекулярных темноокрашенных органических соединений природного происхождения, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов среды. Гуминовые вещества являются макрокомпонентой органического вещества почвенных и водных экосистем, а также твердых горючих ископаемых. Характерной особенностью этих веществ являются: нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов, полидисперсность. Различают несколько групп ГВ: 1) фульвокислоты (ФК), растворимые в воде, щелочных и кислых растворах; 2) гуминовые кислоты (ГК), растворимые только в щелочных растворах; 3) гиматомелановые кислоты (ГМК), извлекаемые из сырого остатка (геля) гуминовых кислот этиловым спиртом; 4) гумин - практически нерастворимое и неизвлекаемое из природных тел и компостов органическое вещество.

Научная новизна работы сформулирована в виде следующих положений, которые выносятся на защиту:

Практическая значимость работы:

1. Разработанные методики были использованы для введения тритиевой метки в ГВ различной природы и происхождения, а также гуминоподобное вещество лигфол, обладающее биологической активностью и используемое в ветеринарии. С помощью меченных тритием гуминовых и гуминоподобных веществ получены их количественные характеристики гидрофобности и поверхностной активности. Такая информация очень важна для прогнозирования поведения этих веществ в различных условиях и предсказания их биологической активности.

2. Меченные тритием ГВ были использованы в экспериментах по исследованию их связывания с биологическими мембранами микроорганизмов и для определения их поступления в растения через корневую систему.

Заключение диссертации по теме "Радиохимия"

выводы

1. Разработан способ получения меченных тритием гуминовых веществ с равномерным распределением метки по компонентам препарата. Для выбора оптимальных условий введения тритиевой метки в гуминовые вещества были проведены модельные эксперименты с индивидуальными веществами. Было установлено, что наилучшие условия для получения меченых гуминовых веществ с минимальным количеством побочных продуктов и равномерным распределением трития по компонентам препаратов создаются при давлении газа не выше 0.5 Па, времени реакции 10 секунд и температуре атомизатора от 1900 до 2000 К. Равномерность распределения трития по компонентам меченых препаратов гуминовых веществ подтверждена с помощью эксклюзионной хроматографии.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Позднякова, Виолетта Юрьевна, Москва

1. Malcolm R.L. Geochemistry of stream fiilvic and humic substances. // In: Aiken G. R., McKnight D.M., Wershaw R.L., MacCarthy P. (editors). Humic substances in soil, sediment, and water. New York: Wiley, 1985, P. 181-209.

2. Сапожников Ю.А., Алиев P.A., Калмыков C.H. Радиоактивность окружающей среды. Теория и практика. // М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2006,286С.

3. Fettig J. Characterization of NOM by adsorption parameters and effective diffusivities. // Environ Int., 1999, V.25, P.335-346.

4. Ratnaweera H, Hiller N, Bunse U. Comparison of the coagulation behavior of different Norwegian aquatic NOM sources. // Environ Int., 1999, V.25, P.347-356.

5. Pempkowiak J, Kozuch J, Grzegowska H, Gjessing E.T. Biological vs. chemical properties of NOM isolated from selected Norwegian lakes. // Environ. Int., 1999, V.25, P.357-366.

6. Перминова И.В. Анализ, классификация и прогноз свойств гумусовых кислот. // Дисс.док.хим.наук. М., 2000,359С.

7. Попов А.И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование. // Изд-во С.-Пегерб. Ун-та, 2004,248С.

8. Красиков В.Д. Основы планарной хроматографии. // СПб.: ХИМИЗДАТ, 2005,232С.

9. Калабин Г.А., Каницкая Л.В., Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. // Изд-во: Химия, 2000, 408С.

10. Алентьев АЛО., Филатов Э.С. Радиометрический метод исследования межфазных границ двух несмешивающихся жидкостей. // Радиохимия, 1991, Т.ЗЗ, С.80-87.

11. Шевченко В.П., Нагаев И.Ю., Мясоедов Н.Ф. Меченные тритием липофильные соединения. // М.: Наука, 2003,246С.

12. Филатов Э.С., Симонов Е.Ф. Физико-химические и ядерно-химические способы получения меченых органических соединений и их идентификация. // М.: Энергоатомиздат, 1987,348С.

13. Stevenson F.J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. // 2nd ed.; John Wiley & Sons. Ltd: New York, 1994.

14. Aiken G.R. Humic Substances in soil, sediment and water. // John Wiley & Sons. Ltd: New York, 1985.

15. Орлов Д.С., Садовникова JI.K. Сравнительное изучение сорбционного поглощения тяжелых металлов гуминовыми кислотами различного происхождения. // Докл. РАН, сер. «Геохимия», 1995, Т.345, №4, С.1-3.

16. Thurman Е.М. Organic geochemistry of natural waters. // Martinus Nijhof / Dr. W. Junk Publishers, Dordrecht. The Netherlands, 1985, P.451.

17. Орлов Д.С. Химия почв. // Москва. Изд-во МГУ, 1992,259С.

18. Александрова Л.Н. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. // Л., 1980.

19. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв. // М., 1974,177С.

20. Орлов Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. // М., 1990,325С.

21. Данченко H.H. Функциональный состав гумусовых кислот: определение и взаимосвязь с реакционной способностью. //Дисс. канд. хим. наук. Москва, 1997, 138С.

22. Piccolo A., Conte P., Cozzolino A. Chromatographic and Spectrophotometric Properties of Dissolved Humic Substances Compared with Macromolecular Polymers. Soil Sci., 2001, V.166, Is.3, P. 174-185.

23. Swift R. Molecular weight, shape, size and charge characteristics of humic substances: some basic considerations. // In: Humic substances II. Hayes H.B., MacCarthy P., Malcom R.L., Swift R.S. (Eds.), John Wiley and Sons Ltd., 1989, P.449-465.

24. Kleinhempel D. Ein Beitrag zur Theorie des Huminstoffzustandes. // Albrecht-Thaer-Archiv., 1970, Is.14, P.3-10.

25. Орлов Д.С. Гуминовые вещества в биосфере. // Соросовский образовательный журнал, 1997, №2, С.56-63.

26. Rice J.A., MacCarthy P. Statistical evaluation of the elemental composition of humic substances. // Org. Geochem., 1991, V.17, P.635-648.

27. Bollag J.-M., Mayers K. Detoxification of aquatic and terrestrial sites through binding of pollutants to humic substances. // Sci. Total Environ., 1992, V.l 17/118, P.357.

28. Нефтепродукты: методы испытаний. 4.1. // Москва, Изд-во стандартов, 1977,379С.

29. Harvey G.R., Boran D. A., Tokar J.M. The structure of marine fiilvic and humic acids. // Marine Chemistry, 1983, V.12, P.l 19-132.

30. Кононова M.M. Органическое вещество почвы. // Москва. Изд-во МГУ, 1963,242 С.

31. Cameron R.S., Thornton В.К., Swift R.S., Poosner A.M. Molecular weight and shape of humic acid from sedimentation and diffusion measurements on fractionated extracts. // J. Soil Sci., 1972, V.23, P.394-408.

32. Rebecca Sutton and Garrison Sposito. Molecular Structure in Soil Humic Substances: The New View. // Environmental Science & Technology, 2005, Vol.39, No.23, P.9009-9015.

33. Piccolo A. The supramolecular structure of humic substances. // Soil Sci., 2001, V.l66, P.810- 832.

34. MacCarthy P. The principles of humic substances. // Soil.Sci., 2001, V.l 66., P.73 8-751.

35. Wershaw R.L. Molecular aggregation of humic substances. // Soil Sci., 1999., V.l64, P.803-811.

36. Варшал Г.М., Кощеева И.Я., Сироткина И.С. и др. Изучение органических веществ поверхностных вод и их взаимодействие с ионами металлов. // Геохимия, 1979, Т.4, С.598-607.

37. Линник П.И., Набиванец Б.И. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Л., Гидрометеоиздат, 1986,286С.

38. Chaney К., Swift R.S. The influence of organic matter on aggregate stability in some British soils. //J. Soil Sci., 1984, V.35, P.223-230.

39. Варшал Г.М., Буачидзе H.C. Исследование сосуществующих форм ртути (II) в поверхностных водах. //Ж. Анал. Химии, 1983, Т.38(12), С.2155-2167.

40. Landrum P.F., Nihart S.R., Eadie В.J., Herche L.R. Reduction in bioavailability of organic contaminants to the amphipod Pontoporeia Hoyi by dissolved organic matter of sediment interstitial waters // Environ. Toxicol. Chem., 1987, V.6, P.l 1-20.

41. Bollag J.-M., Mayers K. Detoxification of aquatic and terrestrial sites through binding of pollutants to humic substances // Sci. Total Environ., 1992, V.l 17/118, P.357-366.

42. Schepetkin I., Khlebnikov A., Kwon B. Medical Drugs from Humus Matter: Focus on Mumie. // Drug Development Research. 2002, V.57, P.140-159.

43. Милошенко Т.П., Михайленко C.A., Щипко М.Л. Использование некондиционных бурых углей для получения ценных химических продуктов. // Тезисы первой Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ». Сыктывкар, 2000,312С.

44. Kwon B.S., Khlebnikov A.I., Schepetkin I.A. and Woo S.B. Fulvic acid fractions from mumie. // Proceedings of the 8th Korea-Russia International Symposium on Science and Technology, Russia, Tomsk, 2004, Vol.3, P.352-355.

45. Schepetkin I.A., Khlebnikov A.I, Ah S.Y., Woo S.B., Jeong C.S., Klubachuk O.N., Kwon B.S. Characterization and biological activities of humic substances from mumie. // J Agric Food Chem., 2003, V.51, Is.18, P.5245-5254.

46. Leo A., Hansch C. and Elkins D. Partition coefficients and their uses. // Chem. Rev., 1971, V.71, P.525-616.

47. Ravera F., Ferrari M., Liggieri L. Adsorption and partitioning of surfactants in liquid/liquid systems. Advances in Colloid and Interface Science, 2000, V.88, P.l29-177.

48. Petersen R.C., Kullberg A. The octanol/water partition coefficient of humic material and its dependence on hydrogn ion activity. // Vatten, 1985, V.41, P.236-239.

49. Martin A.J.P., Synge R.L.M. A new form of chromatogram employing two liquid phases. 1. A theory of chromatograhpy. 2. Application to the micro-determination of the higher monoamino-acids in protein. // BiochemJ., 1941, V.35, P. 1358.

50. Consden R., Gordon A.N., Martin A.J.P. Qualitative analysis of proteins: a partition chromatographic method using paper. // BiochemJ., 1944, V.38, P.224.

51. Ksenija Najesnik-Dejanovic, Stephen E. Cabaniss. Revers-Phase HPLC Method for Measuring Polarity Distributions of Natural Organic Matter. Environ.Sci.Technol., 2004, V.38, P.l 108-1114.

52. Per Kr. Egeberg, James J. Alberts. Determination of hydrophobicity of NOM by RP-HPLC, and the effect of pH and ionic strength. Water Research, 2002, V.36, P.4997-5004.

53. Hansch С. Structure-activity relationships of chemical mutagens and carcinogens. // Sci.Total Environ., V. 109/110, P. 17-29.

54. Leo A., Hansch C. Role of Hydrophobic Effects in Mechanistic QSAR. // Perspectives in Drug Discovery and Design, 1999, V.17, P.l-25.

55. Patlewicz G.Y., Rodford R.A., Ellis G. and Barratt M.D. A QSAR Model for the Eye Irritation of Cationic Surfactants. //Toxicology in Vitro, 2000, V.14, P.79-84.

56. Chiou C.T., Partition and adsorption of organic contaminants in environmental systems. // New York, John Wiley & Sons, Inc., 2002,257P.

57. Doucette W.J., Andren A.W. Estimation of Octanol/Water Partition Coefficients: Evaluation of Six Methods for Highly Hydrophobic Aromatic Hydrocarbons. // Chemosphere, 1988, V.17, Is.2, P.345-359.

58. Zou J.-W., Jiang Y.-J., Hu G.-X., Zeng M., Zhuang S.-L., Yu Q.-S. QSPR/QSAR studies on the physicochemical properties and biological activities of polychlorinated biphenyls. // Acta Physico Chimica Sinica, 2005, V.21, Is.3, P.267-272.

59. Mackay D. Correlation of bioconcentration factors. // Environmental Science and Technology, 1982, V.16, Is.5, P.274-278.

60. Лактионов Н.И. Гумус как природное коллоидное поверхностно-активное вещество. // Харьков, 1978,28С.

61. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы. //М., 1989,462С.

62. Hayase К., Tsubota Н. Sedimantary humic acid and fulvic acid as surface active substances. // Geochim. Cosmochim. Acta, 1983, V.47, P.947-952.

63. Guetzloff T.F., Rice J.A. Does humic acid form a micelle? // Science of the Total Environment, 1994, V.152, Is.l, P.31-35.

64. Piccolo A. New insights on the Conformational Structure of Humic Substances as Revealed by Size Exclusion Chromatography. // Proceed. 8th Meeting of the International Humic Substances Society, Wroclaw, Poland, 1997, P. 19-37.

65. Kawahigashi M., Fujitake N. Surface-active properties of particle size fractions in two humic acids. // Soil Science and Plant Nutrition, 1998, V.44, Is.4, P.497-505.

66. Engebretson R. R., Von Wandruszka R. The effect of molecular size on humic acid associations. // Org. Geochem., 1997, V.26, Is.l 1-12, P. 759-767.

67. Kawahigashi M., Fujitake N., Tsurudome Т., Suzuki S. and Otsuka H. Changes in Configurations and Surface Active Properties of Humic Acid with Increasing Concentration of

68. NaCl. // Proceed. 8th Meeting of the International Humic Substances Society, Wroclaw, Poland, 1997, P.127-132.

69. Tombacz E., Rice J.A. Effect of Conformational Changes on Aggregation Processes in Humic Acid Solutions. // Proceed. 8th Meeting of the International Humic Substances Society, Wroclaw, Poland, 1997, P.43-51.

70. Ferrari M., Liggieri L., Ravera F., Amodio C., Miller R. Adsorption kinetics of alkylphosphine oxides at water/hexane interface. 1. Pendant drop experiments. // J. Colloid Interface Sci., 1997, V.186, Is.l, P.40-45.

71. Fainerman V.B., Miller R., W~ustneck R., Makievski A.V. Adsorption of proteins at liquid/fluid interfaces.//J. Colloid Interface Sci., 1996, V.183, Is.l, P.26-34.

72. Northcott G.L., Jones K.C. Experimental approaches and analytical techniques for determining organic compound bound residues in soil and sediment. // Environ. Pollut., 2000, V.108, Is.l, P.19-43.

73. Kang K.H., Dec J., Park H., Bollag J.M. Transformation of the fungicide cyprodinil by a laccase of Trametes villosa in the presence of phenolic mediators and humic acid. // Water Res., 2002, V.36, Is. 19, P.4907-4915.

74. Xu F., Bhandari A. Retention and extractability of phenol, cresol, and dichlorophenol exposed to two surface soils in the presence of horseradish peroxidase enzyme. // J. Agric Food Chem., 2003, V.51, Is.l, P.183-188.

75. Ertunc Т., Hartlieb N., Berns A., Klein W., Schaefler A. Investigations on the binding mechanism of the herbicide simazine to dissolved organic matter in leachates of compost. // Chemosphere, 2002, V.49, Is.6, P.597-604.

76. Dec J., Haider K., Bollag J.M. Release of substituents from phenolic compounds during oxidative coupling reactions. // Chemosphere, 2003, V.52, Is.3, P.549-556.

77. Kappler Andreas, Ji Rong, Brune Andreas. Synthesis and characterization of specifically 14C-labeled humic model compounds for feeding trials with soil-feeding termites. // Soil Biol. Biochem., 2000, V.32, Is.(8-9), P.l271-1280.

78. Ji Rong, Kappler Andreas, Brune Andreas. Transformation and mineralization of synthetic 14C-labeled humic model compounds by soil-feeding termites. // Soil Biol. Biochem., 2000, V.32, Is(8-9), P.1281-1291.

79. Kukkonen J.V.K. Characterization of 14C labelled humic substances. // Proceed, of 20th International Meeting of the International Humic Substances Society, Boston, USA, 2002, P.121.

80. Warwick P., Randall A., Pia Lassen, Carlsen L. Radiolabelling of humic material by enzymatically mediated incorporation of I4C-phenol. // Chemosphere, 1997, V.35, Is.6, P. 1161-1174.

81. Fairhurst A.J., Warwick P., Richardson S. The effect of pH on Europium-mineral interactions in the presence of humic acid. // Radiochim. Acta, 1995, V.69, P.103-111.

82. Kupsch H., Franke K., Degering D., Troger W., Butz T. Speciation of aquatic heavy metals in humic acids by ,1ImCd/199mHg TDPAC. Radiochim. Acta, 1996, V.73, Is.3, P.145-147.

83. Rossler D., Franke K., Suss R., Becker E., Kupsch H. Synthesis and chromatographic characterization of Tc-99m.technetium-humic acid species. // Radiochim. Acta, 2000. V.88(2), P.95-100.

84. Warwick P., Carlsen L., Randall A., Zhao R., Lassen P. I4C and I25I labelling of humic materiel for use in environmental studies. // Chem. Ecology, 1993, V.8, P.65-80.

85. Franke K., Patt J.T., Patt M., Kupsch H., Steinbach J. A new technique for radiolabelling of humic substances. // Radiochem. Acta, 2004, V.92, P.359-362.

86. Wang C., Wang Z., Yang C., Wang W., Peng A. The evidence for the incorporation of fulvic acid into the bone and cartilage of rats. // Sci. Total Environ., 1996, V.191, Is.3, P. 197-202.

87. An Peng, Wen-Hua Wang, Chun-Xia Wang, Zi-Jian Wang, Hai-Feng Rui, Wai-Zhe Wang, and Zi-Wei Yang. The Role of Humic Substances in Drinking Water in Kashin-Beck Disease in China.// Environ. Health Perspect, 1999, V.107, P.293-296.

88. Peflerkorn E., Widmaier J., Elfarissi F. Aluminium ions at polyelectrolyte interface. II. Role in surface-area-exclusion chromatography of humic acid. // Colloid Polym. Sci., 2001. V.279, P.439-497.

89. Эванс Э. Тритий и его соединения. // Атомиздат. М., 1970,312 С.

90. Miller R., Fainerman V.B., Makievski A.V., Kragela J., Grigoriev D.O., Kazakov V.N., Sinyachenko O.V. // Adv. Colloid Interface Sci., 2000, V.86, P.39-82.

91. Kiss E., Borbas R. Protein adsorption at liquid/liquid interface with low interfacial tension. // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2003, V.31, Is.(l-4), P.169-176.

92. Алентьев А.Ю., Измайлова B.H., Ямпольская Т.П. Распределение сывороточного альбумина в системе вода-межфазный адсорбционный слой-углеводород. // Коллоидный журнал, 1992, Т.54, С.14-20.

93. Egan J., Nugent R., Filer С. Potent antiviral agent WIN 54954: high specific activity labeling with tritium. // Appl. Radiation and Isotops, 2004, V.60, P.851-853.

94. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием биологически важных диазинов. // Успехи химии, 1999, Т.68, №3, С.254-266.

95. Мясоедов Н.Ф., Сидоров Г.В. Введение метки в компоненты нуклеиновых кислот гидрогенолизом соответствующих предшественников. 6. Изучение катализаторов гидрогенолиза. Радиохимия, 1981, Т.23, №2, С.288-295.

96. Tomboly С., Dixit R., Lengyel I., Borsodi A., Toth G. Preparation of Specifically Tritiated Endomorphins // J. Labelled. Cpd. Radiopharm., 2001, V.44, Is.5, P.355-363.

97. Su X., Siddiqui A., Swaminathan S., Wilson W.K., Schroepfer G.J. Preparation of 25,26,26,26,27,27,27-Heptafluoro-15-Ketosterols Labeled at C-23 with Deuterium or Tritium. J. Label. Сотр. Radiopharm., 1998, V.40, Is.l, P.63-74.

98. Ruan В., Wilson W.K., Pang J., Schroepfer Jr. Synthesis of 3a-3H.cholesta-5,8-dien-3p-ol and tritium-labeled forms of other sterols of potential importance in the Smith-Lemli-Optiz syndrome. Steroids, 2000, V.65, Is.l, P.29-39.

99. Watanabe H., Kawase A., Okavo K. et al. Synthesis of tritiated la,25-Dihydroxy-2P-(3-Hydroxypropoxy)Vitamin D3 (ED-71)1. J. Label. Сотр. Radiopharm., 1999, V.42, Is.6, P.519-526.

100. Angelini G., Margonelli A., Ragni P. et al. Synthesis of Tritialed 1-Octadecyl1

101. Phosphothionyl-myo-l-H.-Inositol. A new Inhibitor of Phosphatidylinositol-Specific Phospholipase-C. //J. Label. Comp.Radiopharm., 1997, V.39, Is.9, P.747-756.

102. De Cupere V.M., Biltresse S., Marehand-Brynaert J., Rouxhet P.G. Radiolabeling of Pluronic amphiphilic copolymer for adsoфtion studies. // J. of Colloid and Interface Science, 2003, V.259, P. 163-170.

103. Wichmann J., Huguenin P., Adam G. Synthesis of (2S,2'R,3'R)-2-(l,3H.,2',3'-Dicarboxylcyclopropyl)-glycine ([3H]-DCG-IV). // J. Label. Comp.Radiopharm., 2000, V.43, Is.l, P.l-10.

104. Watanabe H., Akiyama M., Kawanishi Т., Kubodera N. Synthesis of tritiated la,25-dihydroxy-22-oxavitamin D3. // J. Label. Comp.Radiopharm., 1995, V.36, Is.7, P.645-654.

105. Mais D.E., Chen L.Z.,Wagoner M.A. Synthesis and characterization of tritium-labelled RU486. // J. Label. Comp.Radiopharm., 1995, V.36, Is. 12, P. 1199-1203.

106. Prihar, H.S., Campbell, P., Feingold, D.S., et al. Biosynthesis of heparin. Hydrogen exchange at carbon 5 of the glycuronosyl residues. // Biochemistry, 1980, V.l 9, Is.3, P.495-500.

107. Lee, S., Kirschning, A., MuDller, M., Way, C., Floss, H.G. Enzymatic synthesis of 7-14C, 7-3H.- and [l-,3C]sedoheptulose 7- phosphate and [l-,3C]ido-heptulose 7-phosphate. // Journal of Molecular Catalysis В Enzymatic, 1999, V.6, Is.3, P.369-377.

108. Hsi R.S.P., Witz D.F., Stolle W.T., et al. Biosynthesis of tritium, deuterium and carbon-13 labeled cycloheximide. // Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1980, V.l 7, Is.5, P.613-626.

109. Panneels V., Macours P., Van den Bergen H., Braekman J.-C., Van Sande J., Boeynaems J.-M. Biosynthesis and metabolism of 2-iodohexadecanal in cultured dog thyroid cells.//Journal of Biological Chemistry, 1996, V.271, Is.38, P.23006-23014.

110. Sidorov G., Zverkov Yu., Shram S., Lazurkina Т., Myasoedov N. Chemical and enzymatic synthesis of tritium labelled coenzymes. // Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 2003, V.46, Is.5, P.465-473.

111. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф., Мишин В.И., Крамеров В.Н. Методы изотопного обмена в синтезе меченных тритием органических соединений. // Журнал прикладной химии, 1999, Т.72, №12, С.2017.

112. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Синтез меченных тритием биологически важных диазинов. // Успехи химии, 1999, Т.68, №3, С.254-266.

113. Myasoedov N.F., Sidorov G.V., Kramerov V.N., Mishin V.I. Synthesis of Physiologically Active Tritieted Compounds Using High Specific Activity Tritiated Water // J. Label.Comp.Radiopharm., 1999,V.42, N.9, P.859-866.

114. Buchman O., Pri-Bar J., Shimoni M., Smoskovitz L. Use of a nonspecific method of tritiation of organic molecules. // J. Label. Compounds, 1974, V.10, Is.2, P.345-354.

115. Нагаев И.Ю., Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф. Экспересс-метод введения тритиевой метки в фармпрепарат. // Радиохимия, 1999, Т.41, №4, С.289-299.

116. Sidorov G.V., Myasoedov N.F. The solid-state synthesis of tritium labelled heterocyclic bases. // Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 1994, V.34, Is.4, P.353-358.

117. Сидоров Г.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение реакции твердофазной каталитической гидрогенизации пуринов тритием. // Радиохимия, 1995, Т.37, Jfc3, С.270-274.

118. Розанов В.В., Крылов О.В. Спилловер водорода в гетерогенном катализе. // Успехи химии, 1997,1.66, №2, С.117-130.

119. Miller J.T., Pei S. Hydrogenation and deuterium exchange by spillover hydrogen of ethylbenzene adsorbed on H-USY zeolite. // Applied Catalysis A: General, 1998, V.168, Is.l, P.l-7.

120. АН M.A., Kimura Т., Suzuki Y., Al-Saleh M.A., Hamid H., Inui T. Hydrogen spillover phenomenon in noble metal modified clay-based hydrocracking catalysts. // Applied Catalysis A: General, 2002, V.277, P.63-72.

121. Al-Saleh M.A., Hossain M.M., Shalabi M.A., Kimura Т., Inui T. Hydrogen spillover effects on Pt-Rh modified Co-clay catalysts for heavy oil upgrading. // Applied Catalysis A: General, 2003, V.253, P.453—459.

122. Нейман JI.А., Смоляков B.C., Шишков A.B. Радиоизотопные методы в физико-химической биологии. Использование реакций атомарного трития. // Итоги науки и техники. Серия: Общие проблемы физико-химической биологии. М.: ВИНИТИ. 1985, Т.2, 208 С.

123. Бадун Г.А., Волкова С.В., Кузьмичева О.Н.,. Михалина Е.В, Тясто З.А. Мониторинг потока «горячих» атомов трития в методе термической активации. // Радиохимия, 2005, Т.47, N°2, С.178-181.

124. Химическая энциклопедия», М., 1995, Т.4, С.275.

125. Langmuir. The dissociation of hydrogen into atoms. // J. Am. Chem. Soc., 1912, V.34, P.860-877.

126. Langmuir J. A chemically active modification of hydrogen. // J. Am. Cherm. Soc., V.34, P.1310-1325.

127. Miyake Y., Shimomura K., Mills A.P.Jr., Marangos J.P., Nagamine K. Thermionic emission of hydrogen isotopes (Mu, H, D and T) from W and interpretation of a role of the hot W as an atomic hydrogen source". // Surface Scince, 1999, V.433-435, P.785-789.

128. Макаров В.А., Филатов Э.С., Несмеянов Ан.Н. Реакции атомов водорода с замороженными углеводородами при 77 К. I. Циклогексан. // Химия высоких энергий, 1969, Т.З, №.5, С.413-420.

129. Филатов Э.С., Симонов Е.Ф., Шишков А.В., Могильников В.П. Получение а-аланина-3Н воздействием атомарного трития, нагретого до 2000 К, на твердую мишень аланина при 77 К. // Радиохимия, 1979, Т.21, №.6, С.909-913.

130. Бадун Г.А., Филатов Э.С. Характеристики источника атомарного трития, используемого для получения меченых соединений. // Атомная энергия, 1987, Т.63, №2, С. 123-124.

131. Бадун Г.А., Федосеев В.М. Проницаемость липидных мембран для атомарного трития или эффект «соскальзывания» атомов и его роль в методе тритиевой планиграфии. // Радиохимия, 2001, Т.43, №3, С.267-271.

132. Богачева Е.Н., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова J1.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью тритиевой планиграфии. // Молекуляр. биол., 1996, Т.30, №.3, С.637-646.

133. Богачева Е.Н., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова J1.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью тритиевой планиграфии. II. Порядок укладки определяет структуру. // Молекуляр. биол., 1996, Т.30, №.4, С.885-892.

134. Богачева Е.Н., Мороз А.П., Шишков А.В., Баратова J1.A. Полуэмпирический метод моделирования пространственной структуры белков с помощью метода тритиевой планиграфии. III. Лизоцим как модель а/р-белка. // Молекуляр. биол., 1997, Т.31, №.3, С.500-505.

135. Bogacheva E.N., Gol'danskii V.I., Shishkov A.V., Galkin A.V., Baratova L.A. Tritium planigraphy: From the accessible surface to the spatial structure of a protein. // Proc Natl Acad Sci U S A., 1998, V.95, Is.6, P.2790-2794.

136. Шишков A.B., Баратова JI.A. Тритиевая планиграфия биологических систем. // Успехи химии, 1994, Т.63, №.9, С.825-841.

137. Баратова JI.A., Богачева Е.Н., Гольданский В.И., Колб В.А., Спирин А.С., Шишков А.В. Тритиевая планиграфия биологических макромолекул. // М.: Наука, 1999, 175С.

138. Богачева Е.Н., Шишков А.В. Тритиевая планиграфия как инструмент исследования пространственной структуры белков и их комплексов. // Молекуляр. биол., 2000, Т.34, №.5, С.839-853.

139. Бадун Г.А., Михалина Е.В., Тясто З.А. Определение вероятности реакции атомов трития с полиэтиленом при первом соударении в условиях метода термической активации. // Радиохимия, 2006, Т.48, №5 (в печати).

140. Бадун Г.А. Дисс. канд. хим. наук. // М., 1988,161С.

141. Бадун Г.А., Костин А.И., Филатов Э.С. Реакции атомов трития с полиэтиленом в интервале температур 290-55 К. // Радиохимия, 1985, Т.27, №2, С.222-227.

142. Бадун Г. А., Филатов Э.С. Реакция атомов трития с аминокислотами, дейтерированными аминокислотами и смесями аминокислот. Свойство аддитивности и изотопный эффект. // Радиохимия, 1988, Т.30, №4, С.531-537.

143. Филатов Э.С., Орлова М. А., Симонов Е.Ф. Реакция атомов трития с фенилаланином и тирозином в интервале температур 77-400 К. // Вести. Моск. ун-та, сер. химия, 1980, №1, С.49-52.

144. Краснянский А.В., Светликин С.М., Фирсова Л.П. Взаимодействие атомарного трития с циклогексеном. // Вест. моек, ун-та, сер. химия, 1977, Т.18, №3, С.310-312.

145. Краснянский А.В., Несмеянов Ан.Н., Фирсова Л.П. Реакции атомов трития с алкилбензолами при 77К. // Вест. моек, ун-та, сер. химия, 1976, Т.17, №2, С.195-199.

146. Филатов Э.С., Симонов Е.Ф., Шишков А.В., Могильников В.П. Получение альфа-аланина -3Н воздействием атомарного трития , нагретого до 2000 К, на твердую мишень аланина при 77 К. // Радиохимия, 1979, Т.21, №6, С.909-913.

147. Орлова М.А., Симонов Е.Ф., Филатов Э.С. Исследование реакций атомарного трития с аминокислотами. III. Низкотемпературные реакции атомов трития с фенилаланином и тирозином. // Химия высоких энергий, 1979, Т.13, №.5, С.468-473.

148. Баратова Л.А., Румянцев Ю.М., Симонов Е.Ф., Унукович М.С., Цыряпкин В.А., Шишков А.В. // Химия высоких энергий, 1981, Т.15, №4, С.370-373.

149. Баратова Л.А., Гольданский В.И., Румянцев Ю.М., Унукович М.С., Шишков А.В. Свободные аминокислоты как модель остатков в развернутой полипептидной цепи // Молекуляр. биол., 1982, Т.16, №1, С.117-122.

150. Асатрян Р.С., Герман К.Э., Филатов Э.С., Несмеянов Ан.Н. Механизм взаимодействия атомарного трития с функциональными группами аминокислот. Квантовохимические расчеты и эксперимент. // Радиохимия, 1982, Т.24, №.5, С.567-569.

151. Гедрович А.В., Гольданский В.И., Румянцев Ю.М., Унукович М.С., Шишков А.В. Получение меченых полипептидов и белков с использованием термически активированных атомов трития. // Радиохимия, 1984, Т.26, №.4, С.483-494.

152. Бадун Г. А., Филатов Э.С. Реакция атомов трития с аминокислотами, дейтерированными аминокислотами и смесями аминокислот. Свойство аддитивности и изотопный эффект. // Радиохимия, 1988, Т.30, №4, С.531-536.

153. Бадун Г.А. Изотопный эффект в реакции атомарного трития с твердой мишенью глициллейцина. // Радиохимия, 1990, Т.32, №5, С.125-126.

154. Гедрович А.В., Бадун Г.А. Исследование пространственной структуры белков методом тритиевой планиграфии. Короткие пептиды как модель полностью развернутой полипептидной цепи. // Молекуляр. биол., 1992, Т.26, №3, С.558-563.

155. Volynskaya A.V., Kasumov Е.А., Bogacheva E.N., Shishkov A.V., Goldanskii V.I. Determination of the accessible surface of globular proteins by means of tritium planigraphy // Eur. Biophys. J., 1994, V.23, Is.2, P.139-143.

156. Бадун Г.А., Филатов Э.С. О возможности получения Н-пантетина методом термической активации трития. // Радиохимия, 1991, Т.ЗЗ, №1, С.75-77.

157. Бадун Г.А., Лукашина Е.В., Ксенофонтов АЛ., Федосеев В.М. Кинетические закономерности образования меченых продуктов при действии атомарного трития назамороженные растворы и лнофнлизованные смеси аминокислот. // Радиохимия, 2001, Т. 43, №3, С.272-276.

158. Дон Гир, Бадун Г.А., Ярцева И.В., Розенберг С.Г., Зимакова Н.И., Симонов Е.Ф., Филатов Э.С. Получение меченных тритием препаратов асалина для медицинских исследований. // Вестн. ун-та, сер. 2. Химия, 1992, Т.ЗЗ, №5, С.455-459.

159. Барросо Э.О., Бадун Г.А., Симонов Е.Ф. Реакции атомарного трития с сарколизином. // Вестник ун-та. Сер.2. Химия, 1994, Т.35, №1, С.48-50.

160. Moser Н., Nordin P., Senne J. Labeling carbohydrates by exposure to energetic tritium atoms. // Int. J. Appl. Rad. Isot., 1964, V.15, P.557 -559.

161. Krylova O.O., Melik-Nubarov N.S., Badun G.A., Ksenofontov A.L., Menger F.M., Yaroslavov A.A. Pluronic L61 Accelerates Flip-Flop and Transbilayer Doxorubicin Permeation. // Chemistry, 2003, V.9, Is. 16, P.3930-3936.

162. Agafonov D.E., Kolb V.A., Spirin A.S. Proteins on ribosome surface: Measurements of protein exposure by hot tritium bombardment technique. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, V.94, Is.24, P. 12892-12897.

163. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. // Anal. Chem., 1958, V.30, Is.7, P.l 190-1206.

164. Perminova I.V., Frimmel F.H., Kovalevskii D.V., Abbt-Braun G., Kudryavtsev A.V., Hesse, S. Depelopment of a predictive model for calculation of molecular weight of humic substances. // Wat. Res., 1998, V.32, P.872-881.

165. Badun G.A., Lukashina E.V., Batuk O.N., Ksenofontov A.L., Fedoseev V.M. Atomic tritium as a surface nanoprobe in a structural investigation of molecular assemblies. // Materials Science and Engineering, 2003, V.23, P.797-800.

166. Баранов В.Ф. Дозиметрия электронного излучения. // М.: Атомиздат, 1974,229С.

167. Beaglehole D., Lawson F., Harper G., Hossain M. Tryptophan, tryptophan-leucine, and BSA adsorption at an oil-water interface. // J Colloid Interface Sci., 1997, V.192, Is.l, P. 266-268.

168. Vaidya S.S., Ofoli R.Y. Adsorption and interaction of fibronectin and human serum albumin at the liquid-liquid interface. // Langmuir, 2005, V.21, Is.13, P.5852-5858.

169. Сумм Б.Д., Горюнов Ю. В. Физико-химические основы смачивания и растекания. // М.: Химия, 1976,232С.

170. Hernandez M.J., Pellicer J., Delegido J., Dolz M. Rheological characterization of easy-to-disperse (ETD) carbopol hydrogels. // Journal of Dispersion Science and Technology, 1998, V. 19, Is.l, P.31-42.

171. Химическая энциклопедия. // M.: Большая Российская Энциклопедия, 1995, Т.4, С.605.

172. Поверхностно-активные вещества и моющие средства. Справочник под ред. А.А. Абрамзона и Г.М. Гаевого. // Л.: Химия, 1979,376С.

173. Atkin R., Craig V.S.J., Wanless E.J., Biggs S. Mechanism of cationic surfactant adsorption at the solid-aqueous interface. // Adv. Colloid Interface Sci., 2003, V.103, P.219-304.

174. Pliska V., Schmidt M., Fauchere J.-L. Partition coefficients of amino acids and hydrophobic parameters к of their side-chains as measured by thin-layer chromatography. // J.Chromatog., 1981, V.216, P.79-92.

175. Yunger L.M., Cramer R.D. Measurement and correlation of partition coefficients of polar amino acids. // Mol. Pharmacol., 1981, V.20, P.602-608.

176. Klein R., Moore M., Smith M. Selective diffusion of neutral amino acids across lipid bilayers. // Biochim. Biophys. Aata, 1971, V.233, P.420-433.

177. Опыт доклинического исследования на примере Олипифата. "Лигфарм" ООО; НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова МЗ РФ / В.А. Филов (ред.), A.M. Беркович (ред.). СПб.: Ника, 2002,287С.

178. Ivanov S.D., Kovan'ko E.G., Yamshanov V.A., Berkovich A.M., Filov V.A. Radiobiological effects of olipifat during radiation exposure. // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2005, V.140, Is.4, P.428-431.

179. Vigneault В., Percot A., Lafleur M. and Campbell P.G.C. Permeability changes in model and phytoplankton membranesin the presence of aquatic humic substances. // Envir.Sci.Technol., 2000, V.34, P.3907-3913.

180. Visser S.A. Surface active phenomena by humic substances of aquatic origin. // Rev.Sci.Eau., 1982, V.l, P.285-296.

181. Campbell P.G., Twiss M.R., and Wilkinson K.J. Accumulation of natural organic matter on the surfaces of living cells -implications for the interaction of toxic solutes with aquatic biota. // CanJ.Fish.Aquat.Sci., 1997,V.54, P.2543-2554.

182. Fein J.B., Boily J.-F., Guclu K. and Kaulbach E. Experimantal study of humic acid adsorbtion onto bacteria and Al-oxide mineral surfaces. // Chem.Geol., 1999, V.162, P.33-45.

183. McClaine J.W. and Ford R.M. Reversal of Flagellar Rotation Is Important in Initial Attachment of Escherichia coli to Glass in a Dynamic System with High- and Low-Ionic-Strength Buffers. // Appl. Environ. Microbiol., 2002, V.68, P.1280-1289.

184. Vigneault В., Percot A., Lafleur M. and Campbell P.G.C. Permeability changes in model and phytoplankton membranes in the presence of aquatic humic substances. // Environ. Sci. Technol., 2000, V.34, P.3907-3913.

185. Sauerbeck D., Furh F. Decomposition and humification of labelled plant residues in the field. Trans, of the Int. Symp. "Humus et Planta IV", Prague, 1971, P.173-182.

186. Горовая А.И., Орлов Д.С., Щербенко О.В. Гуминовые вещества. Строение, функции, механизм действия, протекторные свойства, экологическая роль. // Киев, Наукова Думка, 1995,302С.1. ВЫРАЖЕНИЕ ПРИЗНАТЕЛЬНОСТИ

187. Огромная благодарность сотрудникам кафедры радиохимии за помощь и поддержку в работе. Особая благодарность М.Г. Чернышевой, ЗА. Тясто, Е.В. Михалиной.

188. Самая большая благодарность супругу Ю.И. Позднякову за веру, терпение и поддержку. Отдельная благодарность маме и дочке Катюше, которые также активно мне помогали.