Строение и биологическая активность вторичных метаболитов факультативных морских грибов рода Aspergillus

Журавлева, Олеся Игоревна

Строение и биологическая активность вторичных метаболитов факультативных морских грибов рода Aspergillus тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Журавлева, Олеся Игоревна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Владивосток МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Строение и биологическая активность вторичных метаболитов факультативных морских грибов рода Aspergillus»

Автореферат диссертации на тему "Строение и биологическая активность вторичных метаболитов факультативных морских грибов рода Aspergillus"

005531821

На правах рукописи

Журавлева Олеся Игоревна

Строение и биологическая активность вторичных метаболитов факультативных морских грибов рода ASPERGILLUS

02.00.10- Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-1 АВГ 2813

Владивосток-2013

005531821

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук

Афиятуллов Шамил Шерибзянович

Официальные оппоненты: Деев Сергей Михайлович

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, зав. лабораторией молекулярной иммунологии

Московкина Таисия Васильевна

кандидат химических наук, Дальневосточный федеральный университет, кафедра органической химии Школы естественных наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биологии моря им. A.M. Жирмунского ДВО РАН, г. Владивосток

Защита состоится «3» сентября 2013 г. в Ю00 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан i-B ui-c>J-&. 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование вторичных метаболитов морских грибов является относительно молодой, но быстро развивающейся областью биоорганической химии. Начиная с открытия цефалоспорина С, выделенного из культуры Cephalosporium sp. в 1949 году и до 1992 года было описано только 15 метаболитов из морских грибов. Интенсивное изучение грибов микромицетов как источников биологически активных соединений было начато в начале двухтысячных годов. К настоящему времени описано более 1000 новых метаболитов из грибов, выделенных из морских источников.

Морские грибы принято разделять на две группы: облигатные морские грибы - те, что растут и размножаются исключительно в морских и эстуарных местах обитания и факультативные морские грибы - те, что обитают в пресной воде или на суше, но могут расти (и возможно, размножаться) в морской среде. Было установлено, что физиологические и биохимические свойства морских грибов обусловлены влиянием таких специфических факторов среды обитания, как высокая концентрация солей, гидростатическое давление, низкие температуры, неравномерное распределение питательных веществ и специфические, истинно морские источники питания. Это предполагает наличие у морских грибов некоторых биохимических особенностей, обуславливающих биосинтез необычных по структуре и биологическому действию соединений. В настоящее время из морских грибов выделены мощные антивирусные соединения, антибиотики, эффективно подавляющие развитие возбудителей туберкулеза и метициллин- и ванкомицин-устойчивых штаммов Staphylococcus aureus, вещества, обладающие цитотоксической активностью в отношении различных типов опухолевых клеток.

Получение новых структурных вариантов биологически активных соединений из морских грибов, а также обнаружение высокопродуктивных продуцентов уже известных соединений, играющих важную экологическую роль в морском сообществе, являются основными факторами, которые поддерживают интерес к исследованию метаболитов морских грибов на высоком уровне.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и установление строения вторичных метаболитов факультативных морских грибов рода Aspergillus (семейство Ascomycetes).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести отбор новых перспективных грибов-продуцентов рода Aspergillus;

2) выделить индивидуальные природные соединения из экстрактов изолятов отобранных грибов;

3) установить строение новых метаболитов;

4) провести структурную идентификацию известных ранее соединений;

5) исследовать биологическую активность выделенных соединений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из экстрактов изолятов трех штаммов морских грибов рода Aspergillus {A. carneus КММ 4638, A. sulphureus КММ 4640 и A. fumigatus КММ 4631) в результате хроматографического разделения были выделены 38 индивидуальных соединений различной химической природы. При помощи спектральных методов анализа и химических превращений установлено строение 14 новых соединений: 9 алкалоидов, 4 изопреноидов (включая меротерпеноиды) и 1 арил-С-гликозида. Идентифицированы структуры 24 ранее известных соединений, включая два метаболита, впервые выделенные из природных объектов.

Впервые исследована цитотоксическая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток некоторых метаболитов морских грибов. Впервые изучено действие ряда алкалоидов в отношении неспецифической эстеразы клеток карциномы Эрлиха, а также их действие на мультилекарственную устойчивость и индукцию раннего апоптоза в этих клетках.

Практическое значение данного исследования состоит в развитии методов выделения и установления строения новых природных низкомолекулярных метаболитов из морских грибов.

Положения, выносимые на защиту.

1) Морские грибы Aspergillus cameus КММ 4638, Aspergillus sulphureus КММ 4640 и Aspergillus fumigatus КММ 4631 являются богатым источником алкалоидов, изопреноидов и меротерпеноидов.

2) В морском грибе A. cameus найдены новые пренилированные алкалоиды карнеамиды А-С, которые содержат необычную для данной группы соединений 2,2-диметил-2,8-дигидропирано[3,2-{]индольную кольцевую систему.

3) Предложена возможная схема биосинтеза карнеамидов А-С из бревианамида F и цикло{дегидро-[_-пролил-1_-триптофана).

4) В экстракте гриба A. cameus идентифицированы карнехиназолины B-D, которые являются новыми представителями хиназолиновых алкалоидов с дополнительными степенями окисления в ароматическом кольце.

5) В морском грибе A. sulphureus обнаружено новое декалиновое производное декумбенон С, обладающее высокой цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток меланомы человека.

6) В экстракте морского гриба A. fumigatus идентифицированы новые алкалоиды

- спиротрипростатин F и фумихиназолин К и 6Д16/?-диацетокси-25-гидрокси-3,7-диоксо-29-нордаммара-1,17(20)-диен-21,24-лактон.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в секции Химия (подсекция «Химия живых систем») (Москва, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного некоторым классам вторичных метаболитов морских грибов рода Aspergillus, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 132 цитируемые работы. Работа изложена на 111 страницах, содержит 14 таблиц, 4 схемы и 17 рисунков.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н. Афиятуллову Ш.Ш. Также автор благодарит к.б.н. Киричук Н.Н. за наращивание исследованных штаммов грибов и определение антибактериальной активности выделенных соединений, к.х.н. Денисенко В.А. - за получение и помощь в интерпретации ЯМР спектров, к.х.н. Дмитренка П.С. и Моисеенко О.П. - за получение масс-спектров, к.ф.-м.н. Глазунова В.П. и Ким Н.Ю. - за получение ИК, УФ и КД спектров, д.б.н. Калинина В.И. и д.х.н. Авилова С.А. - за полезные научные консультации, д.б.н. Анисимова Н.Н., к.б.н. Аминина Д.Л., к.х.н. Ермакову С.П., к.б.н. Юрченко Е.А., к.х.н. Вищук О.С., Чайкину Е.Л. и аспиранта Менчинскую Е.С. - за проведение испытаний биологической активности полученных нами веществ.

Некоторые используемые сокращения. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТСХ - тонкослойная хроматография; HR-MALDI-MS -масс-спектрометрия с лазерной десорбциец/ионизацией высокого разрешения; HR-EI-MS - масс-спектрометрия с ионизацией электронным ударом высокого разрешения; HR-ESI-MS - масс-спектрометрия высокого разрешения с электрораспылительной ионизацией; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; с - синглет, д -дублет, дд - дублет дублетов, т - триплет, дт - дублет триплетов, м - мультиплет, ш

- широкий; COSY - корреляционная спектроскопия; DEPT - неискаженное усиление переносом поляризации; НМВС - гетероядерная многополосная корреляция; HSQC -гетероядерная одноквантовая корреляция; NOE - ядерный эффект Оверхаузера; NOESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера и обмена; КД - круговой

дихроизм; УФ - спектроскопия в ультрафиолетовой (УФ) области электромагнитного спектра; ИК- спектроскопия в инфракрасных лучах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Скрининг, обработка культуры гриба и выделение индивидуальных

соединений

Проведенный в лаборатории химии микробных метаболитов скрининг экстрактов изолятов морских грибов из донных осадков, водорослей и макроорганизмов Охотского моря позволил отобрать наиболее перспективные штаммы микроорганизмов для дальнейших химических исследований. Штаммы грибов наращивались в небольших количествах на различных средах и по результатам тонкослойной хроматографии их этилацетатных экстрактов были выбраны образцы, наиболее богатые по качественному и количественному составу метаболитов.

В результате для дальнейшей работы были выбраны штаммы грибов A. carneus КММ 4638, A. sulphureus КММ 4640 и A. fumigatus КММ 4631. Ферментацию всех штаммов проводили при 25 °С в 10 колбах Эрленмейера (500 мл), каждая из которых содержала 20 г риса, 20 мг дрожжевого экстракта, 10 мг КН2РО4 и 40 мл натуральной морской воды.

По окончании инкубационного периода мицелий гриба вместе со средой измельчали и трижды экстрагировали этилацетатом. Экстракт концентрировали в вакууме, полученный сухой остаток растворяли в системе метанол-вода (1:4, 0.1 л) и последовательно экстрагировали гексаном (0.1 л * 3) и этилацетатом (0.1 л * 3). Этилацетатные экстракты упаривали досуха, остатки хроматографировали на колонках с силикагелем в системе гексан->этилацетат (ступенчатый градиент с увеличением полярности элюента). Полученные фракции делили методом обращенно-фазной и нормально-фазной ВЭЖХ на полупрепаративных и аналитических колонках. В результате из грибов A. carneus, A. sulphureus и А. fumigatus было выделено 38 индивидуальных соединений, из которых 14 метаболитов были новыми.

2. Установление строения индивидуальных соединений из A. carneus КММ 4638

Из этилацетатного экстракта культуры гриба A. carneus, ассоциированного с морской бурой водорослью Laminaria sachalinensis (Miyabe), собранной на глубине 1.5 м возле острова Кунашир (Курильские острова, Охотское море), методами колоночной хроматографии и ВЭЖХ были выделены новые соединения: карнеамиды А-С (1-3), карнехиназолины B-D (4-6), дигидроцинереаин (7), дримановый сесквитерпеноид (8), карнесоран (9), арил С-гликозид карнемицин А (10) и 16 известных метаболитов, из которых карнехиназолин А (11) и карнемицин В (12) впервые выделены из природных объектов.

Брутто-формула формула соединения 1 определена как C26H29N3O3 на основании анализа MALDI масс-спектра высокого разрешения (найдено: m/z 432.2262 [М+Н]\ вычислено 432.2282) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. В ИК-спектре наблюдались полосы поглощения при 3488, 3461 и 3385 (NH), 1682 (СО) и 1435 см"1 (ароматическая система).

'Н ЯМР спектр 1 содержал сигналы двух NH групп (<5Н 7.84 и 5.69), шести олефиновых метиновых ((5Н 5.59, 6.10, 6.14, 6.43, 6.73 и 7.09), одной олефиновой метиленовой (бн 5.14 и 5.17) и четырех метильных групп (<5Н 1.42, 1.43, 1.51, 1.52), наряду с сигналами одной метановой и трех метиленовых групп. Анализ 13С ЯМР спектра (DEPT) подтвердил наличие четырех метильных групп (бс 27.7, 27.8 (2), 27.9) и указывал на присутствие двух амидных карбонильных групп (<5С 156.4 и 162.6), одного sp2- (<5С 149.9) и одного sp3- (<5С 75.9) гибридизированных атомов углерода,

связанных с кислородом, шести Брг- (5С 98.0, 115.5, 118.7, 123.4, 129.4 и 145.8) и одного ер3- (5С 57.3) гибридизированных атомов метиновых групп наряду с сигналами одного эр2- (5с 112.2) и трех ер3- (5с 30.6, 27.9 и 45.5) гибридизированных атомов метиленовых групп, шести эр2- (бс 104.5, 116.4, 123.2, 133.1, 134.9 и 140.4) и одного ер3- (5с 38.9) гибридизированных четвертичных атомов углерода.

1Н-13С НМВС корреляции (рис. 1) N4-1 с С-2 (5С 140.4), С-3 (5С 104.5), С-8 (5С 134.9), С-9 (5С 123.2); Н-4 с С-3, С-б (5С 149.9), С-8 и Н-7 с С-5 (5С 116.4), С-6, С-8 и С-9 наряду с 1Н-15М НМВС корреляцией между Н-7 и N-1 (5М 130.2) указывали на присутствие трехзамещенного индольного кора в молекуле 1. Корреляции Н-25 с С-26 (5С 129.4), С-27 (50 75.9), С-5, С-6; Н3-28,29 с С-25 (50 1 23.3), С-26, С-27 и Н-4 с С-3, С-25 свидетельствовали о наличии в молекуле 1 2,2-диметил-2,8-дигидропирано[3,2-^индольной системы (номенклатура ИЮПАК). Корреляции, наблюдаемые в СОЗУ-45 и НБОС спектрах, а также кросс пики Н2-20/С-22 (5С 38.9); Н-21/С-23 (5С 27.8), С-24 (5С 27.9); Н-21,23,24/С-2 и Н-2Ш-1 в НМВС спектрах указывали на присутствие обратной пренильной группы при С-2 в пираноиндольном фрагменте.

Рисунок 1 - Основные COSY (жирные линии) и НМВС (стрелки) корреляции для карнеамидов А (1) и В (2).

Наличие в ИК-спектре полосы поглощения при 1682 см"1 и отсутствие полосы Амид II указывало на присутствие в соединении 1 дикетопиперазиновой системы. Это предположение подтверждалось наличием сигналов амидных карбонильных групп

при 5С 156.4 и 5С 162.6 (С-18 и С-12) в ,3С ЯМР спектре 1. Анализ COSY и НМВС спектров, а также кросс пики между Н-14,15,16 и N-13 (<5М 146.7) в 1H-15N НМВС спектре свидетельствовали о наличии ненасыщенного пролинового фрагмента в дикетопиперазиновой части молекулы 1. Связь пренилированного пираноиндольного кора с дикетопиперазиновой частью молекулы через метиленовый мостик была подтверждена корреляциями Н2-10/С-2, С-3, С-9, С-11 (5С 57.3), С-12 и H2-10/N-19 (6N 119.3) в НМВС спектрах. Таким образом, структура 1 была установлена, и это соединение было названо карнеамидом А.

При гидрировании карнеамида А над катализатором Адамса было получено его гексагидропроизводное 1а. Анализ кислотного гидролизата 1а с использованием L-FDAA производных (метод Мерфи) показал присутствие остатка L-пролина. Таким образом, конфигурация асимметрического центра при С-17 была определена как S. В КД-спектре соединения 1а наблюдались характеристические полосы поглощения при Ajo? + 0.70, Л264 + 1.68 и Л231 + 1.57. Эти данные хорошо сочетались с таковыми для L-триптофил-1_-пролилдикетопиперазина и 1_-пролил-2-(1', 1 '-диметилпропил)-1_-триптофилдикетопиперазина, что позволило однозначно установить конфигурацию асимметрического центра при С-11 в соединении 1а и карнеамиде А (1) как S.

Брутто-формула соединения 2 определена как C26H27N3O3 на основании анализа (+)HR-MALDI масс-спектра (найдено: m/z 429.2032 [М]\ вычислено 429.2048) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. В 1Н ЯМР спектре 2 наблюдался сигнал амидного протона при 7.97 м.д., а в ИК-спектре содержались полосы поглощения при 3585 и 3346 см"1, соответствующие валентным колебаниям вторичной аминогруппы.

В ЯМР спектрах 2 сигналы водородных и углеродных атомов пироиндольного кора и дикетопиперазиновой части молекулы были близки соответствующим сигналам в спектрах карнеамида А (2). В спектрах 2 отсутствовали сигналы протонных и углеродных атомов винильной группы и появлялись сигналы двух олефиновых метиновых групп при б 5.74 д (8.8), 120.9 (СН) и 5.76 д (8.8), 142.1 (СН). 'Н-,3С НМВС-корреляции (рис. 1) Н-20/С-18 (5С 156.2), С-21 (<5С 142.1), С-22 (бс 37.6); Н-21/С-2 (бс 139.8), С-23 (5С 25.3), С-24 (5С 32.1) и H-20.21/N-19 (6N 124.9) в 1H-15N НМВС спектре указывали на замыкание цикла между дикетопиперазиновой частью молекулы и изопренильным фрагментом. Таким образом, структура 2 была установлена, и соединение было названо карнеамидом В. Абсолютная конфигурация хирального центра при С-11 в 2 была предположена как S на основании его биогенетической связи с карнеамидом А.

Брутто-формула соединения 3 определена как C26H29N3O3 на основании анализа (+)HR-MALDI масс-спектра (найдено: m/z 432.2297 [М+Н]\ вычислено 432.2282) и была подтверждена данными ,3С ЯМР спектра. В спектрах ЯМР соединения 3 сигналы водородных и углеродных атомов практически совпадали с таковыми для карнеамида В (2) за исключением сигналов пролинового кольца и С-18 карбонильной группы. Корреляции, наблюдаемые в COSY-45 спектре, и НМВС корреляции Н-17/С-16 (бс 29.1), С-18 (бс 165.5) указывали на присутствие в молекуле этого соединения насыщенного пролинового фрагмента. Конфигурация С-17 асимметрического центра в 3 установлена как S при помощи модифицированного метода Мерфи. Абсолютная конфигурация С-11 хирального центра в 3 была предположена на основании его биогенетической связи с карнеамидом А, а соединение было названо карнеамидом С.

Из культуры гриба A. carneus были выделены бревианамид F (13) и трудноразделимая смесь 13 и цикпо(дегидро-1.-пролил-1--триптофана) (14), который был идентифицирован по протонному спектру. На схеме 1А представлен предполагаемый путь биосинтеза карнеамидов А и В из 14, а на схеме 1Б -карнеамида С из бревианамида F (13). Серии параллельных реакций биосинтеза включают в себя обратное пренилирование в положение 2 индольного кольца, окисление в положение 6, нормальное пренилирование в необычное для данной группы алкалоидов положение 5 и 5,6-циклизацию с образованием пиранового цикла. Таким образом, мы получаем карнеамид А и неизвестный предшественник ¡ (схемы

1А, Б). Карнеамиды В и С могут быть получены в результате внутримолекулярной N1-19-С-20 циклизации из карнеамида А (1) (схема 1А) и предшественника і (схема 1Б), соответственно. В силу того, что данной циклизации препятствует повышенная электроотрицательность на атомах N-19 и С-20, по-видимому, образование карнеамидов В (2) и С (3) идет через промежуточные соединения.

Данная схема биосинтеза позволяет предположить 5 конфигурацию хирального центра при С-11 для карнеамидов В и С.

Схема 1А - Предполагаемый путь биосинтеза карнеамидов А (1) и В (2).

Карнеамиды А-С являются первыми представителями пренилированных индольных алкалоидов, содержащих необычную для данного семейства 2,2-диметил-2,8-дигидропирано[3,2-^индольную кольцевую систему (номенклатура ИЮПАК). В структурах карнеамидов В и С также присутствует индолоазоциновая трициклическая субъединица, которая крайне редко встречается в природных пренилированных алкалоидах. К настоящему моменту известен только один метаболит, содержащий подобную кольцевую систему - (+)-дезоксиизоаустамид, выделенный из почвенного гриба Aspergillus ustus.

Брутто-формула соединения 11 определена как C1sH2iN302 на основании анализа HR-EI масс-спектра (найдено: m/z 311.1622 [М]\ вычислено 311.1634) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. В ИК-спектре 11 присутствовали полосы

поглощения NH (3355 см"'), СО (1726 и 1691 см"1) и ароматической системы (1605 см" 1>- ,

В Н ЯМР спектре 11 наблюдались сигналы амидного протона (бн 7.55), орто-замещенного ароматического кольца (бн 7.48, 7.70, 7.77 и 8.28), олефинового протона (бн 6.44), трех метиновых (бн 2.28, 2.61 и 5.42) и четырех метильных групп (5Н 0.97, 1.14, 1.17 и 1.20). Анализ данных 13С ЯМР (DEPT) спектров показал наличие двух амидных карбонильных групп (бс 160.8, 164.6), пяти sp2- (бс 125.5, 126.9, 127.0, 127.5 и 134.7) и трех sp3- (бс 26.3, 33.5 и 60.3) гибридизированных атомов метиновых групп, четырех четвертичных sp2- гибридизированных атомов углерода (5с 120.2, 125.6, 144.9 и 147.2) наряду с сигналами четырех метильных (бс 17.5, 19.7, 22.1 и 22.2) групп.

COSY-45 и HSQC спектры 11 свидетельствовали о наличии в структуре молекулы изопропильной и 19-метилпропил-18-иденовой групп. Химические сдвиги С-4, С-6-С-12 атомов в спектре карнехиназолина А оказались близки соответствующим сдвигам в спектрах фумихиназолинов A-G, выделенных из морского гриба Aspergillus fumigatus, что указывает на присутствие в молекуле хиназолинового фрагмента. 1Н-13С НМВС корреляции Н3-16,17/С-14 (бс 60.3); Н-20.21/С-18 (бс 125.5); Н-19/С-3 (бс 125.6); Н-14/С-1 (5С 164.6), С-4 (5С 144.9) и С-12 (5С 160.8); Н-18/С-1, С-4; Н-10/С-6 (50 147.2), С-12; Н-9/С-7 (бс 127.5), С-11 (бс 120.2); Н-8/С-6, С-10 (бс 127.0); Н-7/С-9 (бс 126.9), С-11, С-12 и корреляции H-7/N-5 (бм 230.3), H-14.18/N-2 (6N 128.5) в 1H-'5N НМВС спектре позволили определить положение изопропильной и 19-метилпропил-18-иденовой групп при С-14 и С-3, соответственно, и установить структуру соединения 11, которое было названо карнехиназолином А.

Конфигурация двойной связи С-3=С-18 была определена как Z на основании NOE корреляции между NH-2 (5Н 7.55) и Н-19 (бн 2.61). Абсолютная конфигурация хирального центра при С-14 в 11 была установлена как S на основании образования L-валина при кислотном гидролизе соединения (метод Мерфи).

Брутто-формула соединения 4 определена как С^Нг^зОз на основании анализа HR-EI-MS (найдено: m/z 327.1573 [М]*, вычислено 327.1583) и подтверждена данными

5 R,=R2=OH И R!=R2=H

13С ЯМР спектра. Сравнение 13С ЯМР спектра 4 со спектром карнехиназолина А (11) показало хорошее совпадение сигналов углеродных атомов за исключением С-6-С-8 и С-10 сигналов. 1Н и 13С ЯМР спектры 4 указывали на присутствие в молекуле трехзамещенного бензольного кольца (5Н 7.29, 7.37, 7.75; бс 117.3, 127.9, 117.5) и sp2-гибридизированного атома углерода, связанного с кислородом (5С 151.4). Кросс пики Н-10/С-12 (5С 160.3) и 7-OH/N-5 (йм 208.3) в НМВС спектрах 4 установили положение гидроксильной группы в бензольном кольце при С-7.

Абсолютная конфигурация асимметрического центра при С-14 в 4 была определена как S при помощи метода Мерфи. На основании всех приведенных данных структура 4 была установлена, и соединение получило название карнехиназолин В.

Брутто-формула 5 была определена как C18H21N3O4 на основании анализа (-)HR-MALDI масс-спектра (найдено: m/z 342.1489 [М-Н]~, вычислено 342.1459) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. Сигналы ЯМР спектров 5 хорошо согласовывались с таковыми для карнехиназолина А (11) за исключением сигналов протонов и углеродов ароматического кольца. В 1Н и 13С ЯМР спектрах соединения 5 наблюдались сигналы четырехзамещенного бензольного кольца (<5Н 7.10, 7.74; бс 116.5, 119.0), и двух sp2- гибридизированных атомов углерода, связанных с кислородом (5С 136.5 и 147.3). НМВС корреляции Н-10/С-6 (5С 135.9), С-8 (5С 147.3), С-12 (5с 160.0) и Н-9/С-7 (50 1 36.5), С-11 (5С 113.1), С-12 позволили установить положение гидроксильных групп в бензольном кольце при С-7 и С-8. Таким образом, соединение 5 является дигидроксипроизводным карнехиназолина А и было названо карнехиназолином С. Конфигурация асимметрического центра при С-14 в 5 установлена как S при помощи метода Мерфи.

Брутто-формула соединения G была определена как C18H23N3O3 на основании анализа HR-ESI масс-спектра (найдено: m/z 352.1629 [M+Na]\ вычислено 352.1632) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. В 13С ЯМР спектре 6 сигналы углеродных атомов оказались близки сигналам в спектре карнехиназолина В (4) за исключением С-1, С-3, С-4, С-16 и С-18-С-21 сдвигов. Последовательные COSY корреляции от Н-3 к Нз-20,21, а также НМВС корреляции Н-З/С-18 (5с 46.6), С-19 (5С 24.9); Н-18/С-19, С-20 (5С 23.2), С-21 (5С 21.3) показали наличие изобутильной группы в молекуле 6. Кросс пики Н-З/С-1 (5С 167.6), С-4 (5С 150.2) и Н2-18/С-4, наблюдаемые в НМВС спектре, установили положение изобутильной группы при С-3. Таким образом, структура 6 была установлена, и соединение получило название карнехиназолин D.

Абсолютная конфигурация хирального центра С-14 в 6 была определена как S на основании образования L-валина при кислотном гидролизе соединения (метод Мерфи). NOE корреляции между одним из протонов метиленовой группы (СН2-18) при 1.88 м.д. и Н-15 (5н 2.20), Н3-16 (5Н 1.04) и Н3-17 (5Н 1.23) протонами характерны для дикетопиперазинового кольца, находящегося в конформации лодки с двумя большими заместителями в син-1,4-диаксиальном положении. Эти данные позволили определить конфигурацию С-3 асимметрического центра в G как S.

Таким образом, карнехиназолины B-D являются новыми представителями хиназолиновых алкалоидов с дополнительными степенями окисления в ароматическом кольце, что впервые показано для алкалоидов этой группы.

Брутто-формула соединения 7 была определена как C18H23N3O3 на основании анализа (+)HR-ESI масс-спектра (найдено: m/z 352.1628 [M+Na]\ вычислено 352.1632) и была подтверждена данными С ЯМР спектра. ИК-спектр соединения 7 содержал полосы поглощения характерные для NH-группы (3405 см"1), амидных карбонилов (1691 и 1676 см"1) и ароматической системы (1601 см"1).

'О

В 1Н ЯМР спектре 7 наблюдались сигналы амидного протона (5Н 5.96), четырех олефиновых метиновых (5Н 5.62, 6.06, 6.15 и 6.73), четырех метановых (<5Н 1.76, 2.28, 4.55 и 5.17), одной метиленовой (бн 1-69 и 2.29) и четырех метильных (5Н 1.00, 1.04, 1.09 и 1.11) групп. 13С ЯМР (DEPT) спектр 7 указывал на присутствие двух амидных карбонильных групп (<5С 161.1 и 166.8), четырех sp2- (<5С 117.2, 125.6, 128.1 и 143.2) и четырех sp3- (5С 24.4, 31.7, 51.7 и 61.3) гибридизированных атомов метиновых групп, трех четвертичных sp2- гибридизированных атомов углерода (5С 110.7, 156.4 и 162.4) наряду с одной метиленовой (бс 40.2) и четырьмя метильными (бс 18.5, 19.9, 20.8 и 23.5) группами.

Анализ COSY (рис. 2) и HSQC спектров показал присутствие в молекуле 7 изобутильной и изопропильной групп и изолированной спиновой системы четырех ароматических протонов. Химические сдвиги С-7-С-14 атомов в спектре 7 оказались близки соответствующим сдвигам в спектре джаноксепина, выделенного из почвенного гриба Aspergillus janus, что говорит о присутствии в молекуле оксепинового (А) и пиримидинового (В) колец. Величины химических сдвигов атомов С-1 (5С 61.3), С-2 (бс 166.8), С-4 (<5С 51.7) и С-5 (<5С 156.4) и НМВС корреляции (рис. 3) Н-1 с С-2, С-5 и Н2-19 с С-5 указывали на наличие пиразинового кольца (кольцо С) в молекуле 7. Сочленение колец В и С подтверждалось корреляциями ме>кцу Н-1 и С-14 (5с 161.1) и между NH-3 и С-5. НМВС корреляции Н3-17,18/С-1; Н-16/С-1, С-2; Н-20/С-4 и Н-19/С-4, С-5 установили положение изопропильной и изобутильной групп при С-1 и С-4, соответственно. Таким образом, структура соединения 7 была установлена.

Абсолютная конфигурация хирального центра при С-1 в 7 была установлена как S на основании образования L-валина при кислотном гидролизе соединения (метод Мерфи). NOE корреляция (рис. 2) между Н-4 (5Н 4.66) и Н-16 (5Н 2.31) в спектре 7, снятом в CD3OD, указывала на то, что эти протоны находятся по одну сторону кольца С. Эти данные позволили определить абсолютную конфигурацию асимметрического центра при С-4 как R.

Рисунок 2 - 1Н-1Н COSY и ключевые НМВС и NOE корреляции для дигидроцинереаина (7).

Соединение 7 имеет в структуре молекулы оксепиновую систему, подобную цинереаину, выделенному из плесневого гриба Botrytis cinerea, но отличается наличием насыщенной С-4-С-19 связи. Таким образом, это соединение было названо дигидроцинереаином.

Брутто-формула соединения 8 была определена как С15Н20О4 на основании анализа (+)HR-EI масс-спектра (найдено: m/z 264.1353 [М]+, вычислено 264.1362) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. В ИК-спектре 8 присутствовали полосы поглощения гидроксильной группы (3355 см'1), сопряженной (1684 см"1) и эфирной (1789 см"1) карбонильных групп.

1Н ЯМР спектр соединения 8 содержал сигналы трех метильных (<5Н 1.05, 1.14 и 1.20), одной олефиновой метиновой групп (5н 5.97) и одной метиленовой группы, связанной с атомом кислорода (5н 4.86 и 5.11). Анализ данных 13С ЯМР (DEPT) спектров показал наличие 15 углеродных атомов, включая два углерода эфирной карбонильной (5С 173.8) и сопряженной кетонной (5С 198.2) групп, два олефиновых углерода (5С 126.1 и 149.5), два углерода, связанных с кислородом (5С68.4 и 74.5), и три метильные группы (5С 18.9, 21.4 и 33.4). Кроме того, в спектре присутствовали сигналы двух четвертичных sp3- гибридизированных атомов углерода (5С 32.5 и 44.5), одной метиновой (5с 55.0) и трех метиленовых групп (5С 17.2, 29.9 и 42.9). На основании этих данных было предположено, что соединение 8 относится к дримановому сесквитерпеноиду с лактонным кольцом и сопряженной кетонной группой.

НМВС корреляции Н3-14 с С-2 (50 17.2), С-3 (5С 42.9), С-4 (50 32.5) и С-5 (5С 55.0); Нз-15 с С-1 (5с29.9), С-5 и С-10 (5С44.5); Н-5 с С-1, С-3, С-4, С-10, С-13 (5С21.4) и С-14 (5С 33.4) и Н-1а с С-2, С-5 и С-10 определили структуру кольца А, включая положение трех метильных групп при С-4 и С-10. Дальние корреляции между Н2-12 и С-8 (5С 149.5), С-9 (5С 74.5) и С-11 (5С 173.8) подтвердили присутствие в структуре 8 у-лактонного кольца, включающего в себя С-8, С-9, С-11 и С-12 (5С 68.4) атомы углерода. Положение гидроксильной группы при С-9, кетонной группы при С-6 и двойной связи между С-7 и С-8 было установлено корреляциями Н3-15/С-9; Н-7/С-5, С-9, С-12 и Н-5/С-6 (5С 198.2), С-7 (5С 126.1) в НМВС спектре.

Относительная стереохимия 8 была установлена на основании NOE корреляций Нз-15/Н-1/3, Нз-13 и Н-5/Н-1а, Н-За, 9-ОН, Н3-14 и дальних COSY корреляций между Нз-15 и Н-5, Н-10Г.

На основании этих данных структура 8 была установлена как 9а-гидрокси-5а-дрим-7-ен-6-он-11,12-олид. Абсолютная конфигурация 8 была определена сравнением значения его угла удельного оптического вращения ([а]э = - 55.7°) с таковым для (-)-дрименина ([a]D = - 58.6°), выделенного из растений рода Drimys.

Соединение 8 является новым представителем дримановых сесквитерпеноидов, содержащим в структуре молекулы у-лактонное кольцо и карбонильную функцию в положении 6, что впервые показано для соединений этой группы.

Брутто-формула 9 была определена как С,9Н2204 на основании анализа (+)НИ-ЕЭЬМЭ (найдено: т/г 337.1409 [М+№]+, вычислено 337.1410) и подтверждена

данными 13С ЯМР спектра. В ИК-спектре наблюдалась полоса поглощения при 3578 см"1 характерная для гидроксильной группы.

Сигналы протонных и углеродных атомов в ЯМР спектрах 9 оказались близки соответствующим сдвигам в спектрах дигидробензофуранового производного аваджанорана, выделенного из морского гриба Асгетопшт ер. А\Л/А16-1. Это позволило предположить наличие в молекуле 9 двух ароматических колец, связанных эфирным мостиком и 15-гидрокси-15-метилэтилдигидрофуранового фрагмента. Химические сдвиги сигналов атомов С-8-С-11 и НМВС корреляции Н2-13/С-8 (<5С 115.0), С-9 (5С 161.5), С-10 (5С 105.8) и Н-14/С-8, С-9 установили положение дигидрофуранового фрагмента при С-8-С-9 ароматического кольца, в отличие от аваджанорана, который характеризуется С-9-С-10 сочленением. Таким образом, структура 9 была установлена, и соединение получило название карнесоран. Абсолютная конфигурация хирального центра при С-14 не была определена.

Брутто-формула соединения 10 была определена как С24Н34О9 на основании анализа (+)НР?-Е51-М5 (найдено: т/г 489.2073 [М+Ма]\ вычислено 489.2095) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. Анализ 1Н и 13С ЯМР спектров 10 показал наличие в его структуре 1,2,3,5,6-пентазамещенного бензольного кольца (5н 6.30; бс 113.0), двух эр2- гибридизированных атомов углерода, связанных с кислородом (5С

Корреляции, наблюдаемые в COSY спектре, и НМВС корреляции (рис. 3) указывали на присутствие в структуре 10 нонадиенильного фрагмента, связанного с ароматическим кольцом. Корреляция межцу Н2-17 и Н3-18 в COSY спектре и НМВС корреляции Н2-17/С-7 (5с 173.6), С-18 (5С 15.1) и Н-4/С-6 (5Н 106.5), С-7 свидетельствовали о наличии в структуре 10 этильной группы, связанной сложноэфирной связью с ароматическим кольцом. Корреляции, наблюдаемые в COSY-45 и HSQC спектрах, показали наличие в структуре молекулы одного моносахаридного остатка, который был установлен как /З-глюкопираноза в 'С« конформации анализом НМВС, NOESY спектральных данных, а также на основании значений констант спин-спинового взаимодействия кольцевых протонов. Химический сдвиг С-1' атома (бс 76.7) и НМВС корреляции Н-17С-1 (бс 163.0), С-2 (5С 111.4), С-3 (5С 165.1) указывали на то, что соединение 10 является С-гликозидом. Положение заместителей в бензольном кольце 10 было определено на основании НМВС корреляций меаду Н-4 и С-1, С-2, С-6 (50 1 06.6) и С-7 (5С 173.6) и между Н2-8 и С-4 (5С 113.0), С-5 (5С 148.4) и С-6.

Обе двойные связи в нонадиенильном фрагменте 10 имеют Е-конфигурацию. Данное заключение сделано на основании значения констант спин-спинового взаимодействия (15.1 Гц и 15.0 Гц) ме>еду протонами двойных связей в 1Н ЯМР спектре, снятом в C5D5N. Таким образом, структура 10 была установлена, и это соединение получило название карнемицин А.

Рисунок 3 - Основные COSY (жирные линии) и НМВС (стрелки) корреляции для карнемицина А (10).

Брутто-формула соединения 12 была определена как С23Н32О9 на основании анализа (+)HR-ESI масс-спектра (найдено: m/z 475.1932 [M+Na]*, вычислено 475.1939) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. Данные 1Н ЯМР спектра соединения 12 были идентичны таковым для 3-(/3-С-глюкозил)-6-(3,5-нонадиенил)-2,4-дигидроксиметил бензоата, полученного при метанолизе стромемиЦина, выделенного из гриба Emericella variecolor, ассоциированного с морской губкой. Соединение 12 было нами впервые выделено из природного объекта и названо карнемицином В.

Структуры известных соединений, выделенных из A. cameus, были определены как бревианамид F, цикло(дегидро-1--пролил-1--триптофан), цинереаин, аспергиллицин А, аверсин, (2'Е,4'Е,6'£)-6-(1,-карбоксиокта-2,,4,,6,-триен)-11,12-эпокси-9,11-дигидроксидрим-7-ен, устосолат А, (2'Е,4'Е,6'Е)-6-(1'-карбоксиокта-2',4'16'-триен)-11,12-эпокси-9-гидроксидрим-7-ен, стробилактон А, 3/3,9аг,11-тригидрокси-6-оксодрим-7-ен, 2сг,9сг,11-тригидрокси-6-оксодрим-7-ен, 5аг,8а-эпидиокси-24(К)-метилхолеста-6,22-диен-З/З-ол, 5а,8сг-эпидиокси-24(5)-метилхолеста-6,9(11),22-триен-3/3-ол и эргоста-6,8,22-триен-З/З-ол на основании данных 1Н, 13С и двумерной (COSY, HSQC, НМВС и NOESY) ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии и сравнении этих данных с литературными значениями.

3. Установление строения индивидуальных соединений из Л. зи/рМигеив КММ

4640

Из этилацетатного экстракта культуры гриба А. гиф/тгеиз, выделеного из

илистого песка, собранного на глубине 26 м (восточносахалинский шельф, Охотское

море), методами колоночной и ВЭЖХ были получены одно новое декалиновое

производное декумбенон С (15) и четыре известных метаболита: декумбеноны А (16)

и В (17), диорцинол и бревианамид Р (13). Структурная идентификация известных

метаболитов была проведена на основании данных двумерной ЯМР спектроскопии

(СОЭУ, НЭОС, НМВС и МОЕЭУ), масс-спектрометрии и сравнения с литературными данными.

Брутто-формула соединения 15 была определена как С1бН2б05 на основании анализа (+)НК-Е51-М5 (найдено: т/г 321.1683 [М+ЫаГ, вычислено 321.1672) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. ИК-спектр соединения 15 содержал полосы поглощения ОН групп (3491 см"1) и СО (1692 см"1) группы.

В 1Н ЯМР спектре 15 наблюдались сигналы трех метильных (бн 0.96, 1.08 и 1.80) и двух олефиновых метиновых (бн 5.42 и 5.46) групп, одной метиленовой (бн 3.86) и одной метиновой групп (бн 4.29), связанных с атомом кислорода наряду с сигналами двух метиновых и трех метиленовых групп. ,3С ЯМР (йЕРТ) спектр указывал на присутствие кетонной карбонильной группы (бс 216.0), одной двухзамещенной двойной связи (бс 131.2 и 134.2), одной метиленовой (бс 58.3) и одной метиновой (бс 69.8) групп, связанных с кислородом, двух третичных гидроксильных функций (бс 71.3 и 74.4) наряду с сигналами трех метильных (бс 14.7, 21.6 и 26.1), трех метиленовых

(5с 43.6, 43.9 и 49.2), двух метиновых (5С 22.2 и 44.0) групп и одного насыщенного четвертичного атома углерода (5С 57.0).

Корреляции, наблюдаемые в COSY-45 и HSQC спектрах 15, указывали на наличие в структуре молекулы спиновых систем: -CHOH-CH2-CH(CH3)-CH2- (С-6-С-9) и -СН=СН- (С-11-С-12). Эти данные и НМВС корреляции Н-5/С-4 (5С 57.0), С-6 (5С 69.8), С-9 (5С 49.2), С-10 (5С 71.3), С-13 (5С 74.4); Н-11/С-9, С-10, С-13; Н3-16 (5Н 0.96)/С-7 (50 43.9), С-8 (5С 22.2), С-9 позволили установить наличие декалиновой системы в структуре 15 и определить положение одной метильной группы и трех гидроксильных групп при С-8, С-6, С-10 и С-13, соответственно. COSY корреляции между Н2-1 и 1-ОН, Н2-2 и НМВС корреляции Н2-1/С-2 (5С 43.6), С-3 (5С 216.0) и Н3-15/С-3, С-4, С-5 (5С 44.0), С-13 указывали на С-4 положение гидроксипропионильной и метильной групп в 15. Кросс пики НИ4/С-4, С-12 (бс 134.2), С-13 и Н-12/С-10, С-11 (5С 131.2), С-13, наблюдаемые в НМВС спектре, установили локализацию метильной группы при С-13 и положение двухзамещенной двойной связи меиеду 11 и 12 атомами углерода.

Таким образом, структура соединения 15 была установлена. Так как подобные декалиновые производные декумбеноны А (16) и В (17) были выделены ранее из почвенного гриба Pénicillium decumbens, соединение 15 было названо декумбеноном С.

В NOESY спектре соединения 15 наблюдались корреляции Н-5/Н-6, Н-7/3, Н-9/3, Н3-14; 6-ОН/Н-8, Н-9а На-9, Н3-15 и Ю-ОН/Н-8, Н-9ог и Н3-15 (рис. 4), что позволило определить относительную конфигурацию асимметрических центров декумбенона С.

Н3С

Рисунок 4 - Ключевые NOE корреляции для декумбенона С (15).

Абсолютная конфигурация асимметрического центра С-6 в 15 была установлена модифицированным методом Мошера. При этерификации соединения 15 (И)- и (5)-МТРА хлорангидридами были получены (Э)- и (/3)-МТРА эфиры 15а и 15Ь, соответственно. Сравнение 1Н ЯМР спектров полученных диастереоизомеров и измерение разниц химических сдвигов Дб(бз-бя) (рис. 5) позволили установить

конфигурацию асимметрического центра С-6 как S. Таким образом, декумбенон С (15) имеет 4R, 5S, 6S, 8S, 10S, 13R конфигурации асимметрических центров.

+0.21

+0.22

_ Н Н''

+0.14 у h RQ н +0.10 +0.

+0.73

+0.20

-0.12

Н Н -0.34 +0.14

н О

15а: R=(S)-MTPA 15b: R=(/Í)-MTPA

Рисунок 5 - Разница в химических сдвигах между (S)- и (R)-MTPA эфирами декумбенона С (15).

4. Установление строения индивидуальных соединений из Л. Гит/да^ КММ

4631

Из этилацетатного экстракта культуры гриба А. (ит/да^в, ассоциированного с мягким кораллом в/ли/ала эр., собранным на глубине 52 м у берегов острова Кунашир, Курильские острова, Охотское море, были выделены новые алкалоиды -спиротрипростатин Я (18) и фумихиназолин К (19), новый 29-нордаммарановый тритерпеноид (20) и четыре известных алкалоида.

Брутто-формула соединения 18 была определена как СггИге^Об на основании анализа (+)НК-Е31-МЭ (найдено: т/г 450.1657 [М + №]\ вычислено 450.1636) и была подтверждена данными 13С ЯМР спектра. В УФ-спектре 18 имелись максимумы при ).тах 220 (1д 4.24) и 274 (1д 3.44) нм, характерные для поглощения замещенного бензольного кольца. В ИК-спектре наблюдались полосы поглощения при 3444 (1МН), 1715 (СО, у-лактам), 1686 и 1636 см"1 (СО).

О 9" ОН °

-------

Н3СО

21 18

1Н ЯМР спектр 18 содержал сигналы трехзамещенного бензольного кольца (бн 6.97, 6.56 и 6.45), олефинового протона (бн 4.89), N14 протона (бн 8.1), метоксигруппы (бн 3.79) и двух метальных (бн 1.62 и 1.11) групп наряду с сигналами трех метановых и трех метиленових групп. Данные йЕРТ и НЭОС спектров 18 подтверждали наличие двух метальных групп (<5С 18.0 и 25.3) и метоксигруппы (5С 55.5), а также указывали на присутствие трех амидных карбонильных групп (5С 181.3, 169.0 и 165.1), эр2-гибридизированного атома углерода, связанного с кислородом (6с 160.7), четырех эр2- (5С 97.4, 107.6, 121.6 и 127.3) и трех вр3- (5С 75.5, 60.7 и 57.5) гибридизированных атомов метановых групп, пяти четвертичных углеродов и трех метиленовых групп.

В ЯМР спектрах 18 сигналы водородных и углеродных атомов практически совпадали с соответствующими сигналами в спектрах спиротрипростатинов С-Е, выделенных из гриба Л. ЮтідаШ, ассоциированного с голотурией, за исключением

сигналов С-2 и С-7а углеродных атомов. Данные СОБУ-45 спектра и НМВС корреляции (рис. 6) позволили установить структуру соединения 18.

Рисунок 6 - Ключевые НМВС корреляции для

спиротрипростатина F (18).

" 18

NOE корреляции между Н-4 и Н-8, Н-19 и между 9-ОН и Н-12, Н-18 показывали, что первые три протона находятся по одну сторону молекулы, а 9-ОН, Н-12 и Н-18 ориентированы в противоположном направлении. Анализ кислотного гидролизата 18 с использованием L-FDAA производных (метод Мерфи) показал присутствие остатка L-пролина и позволил установить конфигурацию С-12 асимметрического центра в 18 как S. Таким образом, абсолютные конфигурации асимметрических центров в 18 были определены как 3S,8S,9R,12S,18S, и это соединение было названо спиротрипростатином F (18).

Брутто-формула соединения 19 была определена как C21H16O2N4 на основании анализа (+)HR-EI-MS (найдено: m/z 356.1292 [Mf, вычислено 356.1268) и была подтвермедена данными ,3С ЯМР спектра.

1Н ЯМР спектр 19 содержал сигналы двух NH протонов (5Н 7.49 и 8.15), двух орто-замещенных бензольных колец (5Н 7.09, 7.20, 7.33, 7.40, 7.43, 7.62, 7.72 и 8.28), одной метиновой (5Н 6.08), одной метиленовой (5Н 3.40 и 3.55) и одной метильной групп (5Н 2.26).

С ЯМР спектр (DEPT) показал наличие двух амидных карбонилов (5С 160.2 и 170.3), восьми sp2- (5с 111.3, 118.4, 120.6, 123.5, 126.9, 127.3, 127.6 и 134.5) и одного sp3- (5с 54.5) гибридизированных атомов углерода метиновых групп, семи sp2-гибридизированных четвертичных атомов углерода (5С 107.5, 120.7, 127.8, 132.3, 134.5,146.9 и 153.2), одной метиленовой (5С 26.0) и одной метильной (5С 18.1) групп.

Анализ COSY и HSQC спектров, а также НМВС корреляции Н-19 с С-17 (5С 107.5), С-18 (5С 132.3), С-20 (5С 134.5) и С-25 (5С 127.8); Н-21 с С-23 (бс 120.6), С-25 и Н-24 с С-17, С-20 и С-22 (5с 122.5) указывали на присутствие двухзамещенного индольного кора в 19. Химические сдвиги атомов С-4, С-6-С-12 оказались близки соответствующим сдвигам в спектрах фумихиназолинов A-G, что говорит о

присутствии в молекуле хиназолинового фрагмента. НМВС корреляции Н-7/С-4 (5С 153.2), С-9 (5С 127.3), С-11 (5С 120.7), С-12 (5С 160.2); Н-10/С-6 (5С 146.9), С-8 (5С 134.5), С-12; Нз-16/С-З (5С 54.8), С-4; Н-14/С-4, С-1 (5С 170.3) и Н-15Ь/С-1 и С-14 (бс 54.5) подтверждали наличие пиразино[2,1-Ь]хиназолин-3,6-дионовой системы (номенклатура ИЮПАК) в 19. Связь двухзамещенного индольного фрагмента и пиразиновой части через метиленовый мостик (СН2-15) была подтверждена НМВС корреляциями Н-15Ь/С-1, С-14, С-17, С-18, С-25 и Н-14/С-17. Дальние корреляции Н3-16/С-З, С-18 в НМВС спектре указывали на наличие углерод-углеродной связи между атомами 3 и 18 и позволили установить структуру соединения 19, которое было названо фумихиназолином К. Масс-спектрометрические данные также подтверждали строение молекулы алкалоида. Так, наличие пиков ионов с m/z 227 и 129 в EI-MS (рис. 7) соответствовало фрагментам, образующимся в результате разрыва связей С-14-С-15 и С-З-С-18.

Рисунок 7 - Фрагментация молекулярного иона [М]+ (m/z 356.13) фумихиназолина К в EI-MS.

Относительная конфигурация соединения 19 была предложена на основании NOE корреляций Нг-15 с Н-14 и Н-24; Н3-16 с NH-2 и NH-19 и NH-19 с Н-21, а также дальней COSY корреляции между Н-14 и NH-2 (W-тип), что хорошо согласуется с компьютерной трехмерной моделью фумихиназолина К (19) (рис. 8).

Рисунок 8 - Ключевые NOE корреляции для фумихиназолина К (19).

Брутто-формула соединения 20 была определена как СззНмОэ на основании анализа (+)HR-ESI-MS (найдено: m/z 607.2879 [М + Na]\ вычислено 607.2878) и была подтвер>вдена данными 15С ЯМР спектра.

В ЯМР спектрах 20 сигналы углеродных и водородных атомов оказались близки соответствующим сдвигам в спектрах хельволовой кислоты (21) и 6Д16/?-диацетокси-25-гидрокси-3,7-диоксо-29-нордаммара-1,17(20)-диен-21-овой кислоты (22) за исключением сигналов боковой цепи.

22 R =

Корреляции, наблюдаемые в COSY и НМВС спектрах, указывали на присутствие в структуре соединения следующего фрагмента: -СН2-СН2-СН(0)~ (С-22-С-24). НМВС корреляции Н3-26/С-24 (5с 83.7), С-25 (5С 71.1) и Н3-27/С-24, С-25 указывали на наличие трехзамещенного этандиольного фрагмента в 20. НМВС корреляции Н-16/С-17 (5С 151.7), С-20 (123.8); Н-22а/С-17, С-20, С-21 (5С 167.8) и С-23 (5С 23.4) и Н-24/С-22 и сдвиги сигналов атомов С-22, С-26 и С-27 в сильное поле указывали на наличие (21—>24) лактона в структуре 20. Данное заключение согласуется с разницей в 2 единицы молекулярной массы между 20 и 6Д16/?-диацетокси-25-гидрокси-3,7-диоксо-29-нордаммара-1,17(20)-диен-21-овой кислотой (22).

Относительная конфигурация тетрациклической части 20 была установлена на основании NOE и дальних COSY корреляций, а также сравнения этих данных с литературными данными для 22. Кросс пики, наблюдаемые в NOESY спектре 20 между Н-22а и НИЗ, Н-24 указывали, что данные протоны находятся по одну сторону остова молекулы и определяли конфигурацию асимметрического центра при С-24. На основании всех приведенных данных, структура 20 была установлена как 6Д16/?-диацетокси-25-гидрокси-3,7-диоксо-29-нордаммара-1,17(20)-диен-21,24-лактон.

Кроме новых соединений 18-20 из A. fumigatus были выделены известные алкалоиды - спиротрипростатин А, 6-метоксиспиротрипростатин В, триптохивалин F и спиро-3-оксоиндольный алкалоид. Структурная идентификация известных соединений были проведена на основании данных двумерной ЯМР спектроскопии (COSY, HSQC, НМВС и NOESY), масс-спектрометрии и сравнения с литературными данными.

5. Биологическая активность выделенных соединений

Цитотоксическое действие карнеамидов А (1) и В (2) и карнехиназолинов А (11) и В (4) было изучено в отношении трех линий опухолевых клеток: рака молочной железы человека (T-47D) и меланомы (SK-Mel-5 и SK-Mel-28) с помощью MTS-метода. Результаты показали, что исследуемые алкалоиды не проявляют активности в концентрациях £ 100 мкМ в отношении этих клеток.

Цитотоксическая активность в отношении клеток асцитной карциномы Эрлиха была исследована для карнехиназолина D (6), дигидроцинереаина (7), цинереаина, нового меротерпеноида карнесорана (9) и аверсина с помощью МТТ-метода. Показано, что в концентрациях до 100 мкМ все соединения не проявляют цитотоксического действия в отношении этих клеток. Для этих же соединений была исследована способность усиливать экспрессию белка теплового шока Hsp70 в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Инкубирование опухолевых клеток с

веществами в концентрации 50 мкМ не приводит к увеличению экспрессии белка Hsp70 в клетках.

Карнеамид В (2) и карнехиназолины А (11) и В (4) в концентрации 4 мг/мл не показывают антимикробной активности в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus АТСС 21027 и Bacillus cereus АТСС 10702, грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и Escherichia coli АТСС 15034 и дрожжевых грибов Candida albicans КММ 453.

Цитотоксическая активность декумбенонов А (15), В (16) и С (17) и диорцинола in vitro была изучена в отношении клеток рака кишечника человека (НСТ-116) и меланомы человека (SK-Mel-5 и SK-Mel-28) с помощью MTS-метода. Полученные результаты приведены в таблице 1. Диорцинол проявляет слабый эффект в отношении клеток НСТ-116 с ИК5о 22.8 мкМ. Декумбеноны А-С в концентрациях до 100 мкМ были нетоксичны в отношении клеток НСТ-116.

Декумбенон С оказывает цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток меланомы SK-Mel-5 с ИК5о 0.9 мкМ. Дакарбазин, используемый в качестве положительного контроля, на 15 % подавляет рост клеток SK-Mel-5 в концентрациях 100-400 мкМ.

Таблица 1 - Определение цитотоксической активности декумбенонов А-С и диорцинола

Соединение ИК5о, мкМ

SK-MEL-28 SK-MEL-5 НСТ 116

15 70 0.9 116

16 74 80 >160

17 50 54 >160

диорцинол 40 9.6 22.8

Было исследовано действие соединений 15-17 и диорцинола на пролиферацию раковых клеток с помощью МТЭ-метода. К клеткам 5К-Ме1-28 и НСТ-116 добавляли исследуемые вещества в концентрации 20 мкМ и наблюдали их рост в течении 24, 48 и 72 часов. К клеткам меланомы ёК-Ме1-5 добавляли вещества 16, 17 и диорцинол в концентрации 20 мкМ и соединение 15 в концентрации 0.5 мкМ. Уменьшение скорости пролиферации для соединений 15 и 17 было показано для всех клеточных пиний в отличие от соединений 16 и диорцинола, которые проявляют незначительное ингибирование пролиферации клеток меланомы (5К-МЕ!_-5 и ЗК-МЕ1.-28) и клеток рака кишечника. Показано, что в течении 48 часов декумбенон С (15) ингибирует рост клеток меланомы ЭК-Ме1-28 на 41 %, 5К-Ме1-5 на 62 % и НСТ-116 на 21 %; декумбенон А - на 22 % (ЗК-МЕ1_-28), 42 % (ЭК-МЕЬб) и 15 % (НСТ-116), декумбенон В - на 49 % (5К-МЕ1--28), 60 % (ЗК-МЕ1.-5) и 15 % (НСТ-116) и диорцинол - на 17 % (ЗК-МЕ1.-28), 38 % (5К-МЕ1.-5) и 21 % (НСТ-116). Дакарбазин в концентрации 200 мкМ не оказывает значительного влияния на пролиферацию данных типов клеточных линий (ингибирование роста не превысило 10 % для ЭК-Ме1-28 и НСТ-116 и 15 % для ЗК-Ме1-5).

Изучено также действие декумбенонов А-С и диорцинола на формирование и рост колоний клеток НСТ-116 и ЗК-Ме1-5 с помощью метода мягкого агара (рис. 9). Клетки обрабатывали исследуемыми веществами в нетоксичных концентрациях и инкубировали в течение 3 недель. Показано, что соединения 15 (0.25 мкМ), 16 (20 мкМ), 17 (12.5 мкМ) и диорцинол (20 мкМ) ингибируют рост колоний клеток меланомы ЭК-Ме!-5 на 76 %, 67 %, 59 % и 31 %, соответственно. С другой стороны, в концентрациях 25 мкМ, 40 мкМ (для 16 и 17) и 20 мкМ (для 15 и диорцинола) исследуемые метаболиты проявляют слабый ингибиторный эффект на рост колоний опухолевых клеток рака кишечника НСТ-116 (рис. 9). Дакарбазин в концентрации 200

мкМ показывает незначительную способность подавлять рост колоний опухолевых клеток данного типа.

700 500

•/.

ЇІ % 33.% J

JlL

Дакзгбйзмн 1S

17 Диорцикап

0 ДзиарЬэжн 15

17 Диоршкоя

Рисунок 9 - Ингибирующее действие соединений 15-17 и диорцинола на формирование колоний клеток меланомы SK-Mel-5 (А) и рака кишечника человека

НСТ-116 (Б).

Таким образом, было показано, что декумбенон С (15) обладает антипролиферативным действием, подавляет рост колоний меланомы и клеток рака кишечника человека в нецитотоксических концентрациях и может рассматриваться в качестве кандидата для дальнейшего исследования его противоопухолевых свойств.

Фумихиназолин К (19) и 29-нордаммарановый тритерпеноид (20) в концентрации 4 мг/мл не показывает антимикробной активности в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus АТСС 21027 и Bacillus cereus АТСС 10702, грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и Escherichia соИ АТСС 15034 и дрожжевых грибов Candida albicans КММ 453.

Цитотоксическая активность в отношении неспецифической эстеразы клеток карциномы Эрлиха, а также действие на мультилекарственную устойчивость (MDR) и индукцию раннего апоптоза в этих клетках были исследованы для 19 и известных алкалоидов, выделенных из A. fumigatus. Показано, что фумихиназолин К (19) не проявляет активности в отношении исследуемых тест-систем. Известные соединения - спиротрипростатин А, 6-метоксиспиротрипростатин В и спиро-3-оксоиндольный алкалоид в концентрации 100 мкг/мл проявляют выраженную ингибиторную активность в отношении цитоплазматической неспецифической эстеразы в клетках карциномы Эрлиха. Спиро-З-оксииндольный алкалоид индуцирует ранний апоптоз (конденсация хроматина) в клетках карциномы Эрлиха в нетоксической концентрации 3.125 мкг/мл.

5. ВЫВОДЫ

Впервые изучены вторичные метаболиты трех изолятов морских грибов Aspergillus carneus КММ 4638, Aspergillus sulphureus КММ 4640 и Aspergillus fumigatus КММ 4631. Выделено 38 индивидуальных соединений различной химической природы. Установлено строение 14 новых соединений: 9 алкалоидов, 4 изопреноидов (включая 2 меротерпеноида) и 1 арил-С-гликозида. Проведена структурная идентификация 24 соединений с известными веществами.

Установлено строение новых пренилированных алкалоидов карнеамидов А-С из гриба A. carneus. Показано, что эти метаболиты содержат необычную для данной группы соединений 2,2-диметил-2,8-дигидропирано[3,2-Г|индольную кольцевую систему. Предложена возможная схема биосинтеза карнеамидов А-С из бревианамида F и цикло(дегидро-[_-пролил-1_-триптофана).

3. Установлено строение карнехиназолинов B-D из гриба A. carneus, которые являются новыми представителями хиназолиновых алкалоидов с дополнительными степенями окисления в ароматическом кольце.

4. Установлено строение новых соединений из гриба A. carneus: оксепин-содержащего алкалоида - дигидроцинереаина, арил С-гликозида - карнемицина А, дриманового сесквитерпеноида - 9а-гидрокси-5а-дрим-7-ен-6-он-11,12-олида и меротерпеноида - карнесорана.

5. Установлено строение нового декалинового производного - декумбенона С из гриба A. sulphureus. Показано, что оно проявляет высокую цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток меланомы человека.

6. Установлено строение новых алкалоидов - спиротрипростатина F и фумихиназолина К и нового нордаммаранового производного - 6Д16/?-диацетокси-25-гидрокси-3,7-диоксо-29-нор-даммара-1,17(20)-диен-21,24-лактона из гриба A. fumigatus.

Основные публикации по теме диссертации

1. Zhuravleva O.I., Afiyatullov Sh.Sh., Denisenko V.A., Ermakova SP., Slinkina N.N., Omitrenok P.S., Kim N.Yu. Secondary metabolites from a marine-derived fungus Aspergillus carneus Blochwitz // Phytochemistry. 2012. V. 80. P. 123-131.

2. Zhuravleva O.I., Afiyatullov Sh.Sh., Vishchuk O.S., Denisenko V.A., Slinkina N.N., Smetanina O.F. Decumbenone C, a new cytotoxic decaline derivative from the marine fungus Aspergillus sulphureus KMM 4640 // Arch. Pharm. Res. 2012. V. 35, No 10. P. 1771-1776.

3. Afiyatullov Sh.Sh., Zhuravleva O.I., Antonov A.S., Kalinovsky A.I., Pivkin M.V., Menchinskaya E.S., Aminin D.L. New metabolites from the marine-derived fungus Aspergillus fumigatus II Nat. Prod. Comm. 2012. V. 7, No 4. P. 497-500.

4. Афиятуллов Ш.Ш., Журавлева О.И., Чайкина Е.Л., Анисимов М.М. Новый спиротрипростатин из морского изолята гриба Aspergillus fumigatus // Химия природ, соед. 2012. № 1.С. 90-92.

5. Журавлева О. И., Лещенко Е. В. Новые хиназоликовые алкалоиды из морского гриба Aspergillus carneus // Тез. докл. XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва. (11-15 апреля 2011). М., 2011. С. 392.

Журавлева Олеся Игоревна

Строение и биологическая активность вторичных метаболитов

факультативных морских грибов рода ASPERGILLUS

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 15.07.2013 Формат 60x84/16 Усл. печ. л. 1,33 Тираж 120 экз. Заказ 420 Отпечатано в Типографии ИД ДВФУ 690990, г. Владивосток, ул. Пушкинская, 10

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Журавлева, Олеся Игоревна, Владивосток

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Журавлева Олеся Игоревна

Строение и биологическая активность вторичных метаболитов факультативных

морских грибов рода Aspergillus

02.00.10 - биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

о со

со -О Научный руководитель:

к.х.н. Афиятуллов Ш.Ш.

СМ 00

3 °

Владивосток -2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.........................................................................................4

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.....................................................................9

2.1. Биологически активные соединения морских грибов..................................9

2.2. Алкалоиды и дикетопиперазины............................................................9

2.3. Пептиды........................................................................................25

2.4. Терпеноиды и меротерпеноиды............................................................30

2.5. Антрахиноны..................................................................................38

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................................41

3.1. Скрининг, обработка культуры гриба и выделение

индивидуальных соединений..............................................................41

3.2. Установление строения индивидуальных соединений

из А. сагпеш КММ 4638....................................................................41

3.3. Установление строения индивидуальных соединений

из А. 8и1ркигет КММ 4640................................................................66

3.4. Установление строения индивидуальных соединений

из А. fumigatus КММ 4631..................................................................70

3.5. Биологическая активность выделенных соединений..................................78

3.5.1. Биологическая активность некоторых вторичных метаболитов

А. сагпеш КММ 4638...................................................................78

3.5.2. Биологическая активность некоторых вторичных метаболитов

А. ьгйрЫгет КММ 4640................................................................79

3.5.3. Биологическая активность некоторых вторичных метаболитов

А. fumigatus КММ 4631.................................................................81

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................83

4.1. Приборы и оборудование...................................................................83

4.2. Хроматография................................................................................83

4.3. Биологический материал....................................................................84

4.4. Выделение соединений из А. сатеия КММ 4638......................................84

4.5. Выделение соединений из А. 5и1р1шгет КММ 4640..................................91

4.6. Выделение соединений из А. fumigatus КММ 4631...................................92

4.7. Определение биологической активности выделенных соединений................94

4.7.1. Определение цитотоксической активности и действия на формирование и рост колоний опухолевых клеток Т-47Б,

8К-Ме1-5, 8К-Ме1-28 и НСТ-116.....................................................94

4.7.2. Определение цитотоксической активности и способности усиливать экспрессию белка Нзр70 в клетках

асцитной карциномы Эрлиха..........................................................95

4.7.3. Определение цитотоксической активности и действия на ранний апоптоз и мультилекарственную устойчивость

опухолевых клеток асцитной карциномы Ерлиха.................................96

4.7.4. Определение антимикробной активности...........................................97

5. ВЫВОДЫ...........................................................................................98

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..............................................99

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование вторичных метаболитов морских грибов является относительно молодой, но быстро развивающейся областью биоорганической химии. Начиная с открытия цефалоспорина С, выделенного из культуры Cephalosporium sp. в 1949 году, и до 1992 года было описано только 15 метаболитов из морских грибов. Интенсивное изучение грибов микромицетов как источников биологически активных соединений было начато в начале двухтысячных годов. К настоящему времени описано более 1000 новых метаболитов из грибов, выделенных из морских объектов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести отбор новых перспективных грибов-продуцентов рода Aspergillus;

2) выделить индивидуальные природные соединения из экстрактов изолятов отобранных грибов;

3) установить строение новых метаболитов;

4) провести структурную идентификацию известных ранее соединений;

5) исследовать биологическую активность выделенных соединений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из экстрактов изолятов трех штаммов морских грибов рода Aspergillus (A. carneus КММ 4638, A. sulphureus КММ 4640 и A. fumigatus КММ 4631) в результате хроматографического разделения были выделены 38 индивидуальных соединений различной химической природы. При помощи спектральных методов анализа и химических превращений установлено строение 14 новых соединений: 9 алкалоидов, 4 изопреноидов (включая меротерпеноиды) и 1 арил-С-гликозида. Идентифицированы структуры 24 ранее известных соединений, включая два метаболита, впервые выделенные из природных объектов.

Из гриба Aspergillus sp., ассоциированного с мидией Mytilus edulis galloprovincialis (полуостров Ното, Японское море) выделена большая группа пренилированных индольных алкалоидов - нотоамиды A-R, структуры некоторых представлены ниже. Эти соединения являются дипренилированными производными цикло-Ь-пролил-L-триптофана. Один из пренильных остатков образует при замыкании 1,7-дигидропирано[2,3-я]индольную кольцевую систему. Среди них нотоамиды А (8), В (9), N (10) и I (11), которые содержат бицикло[2,2,2]диазооктановый фрагмент, образующийся при замыкании второго пренильного остатка на дикетопиперазиновую систему [8-10]. Абсолютная конфигурация асимметрических центров соединений 8-11 была определена сравнением их КД спектров со спектром бревианамида В [11].

Нотоамиды С (12), М (13) и Q (14) содержат обратную пренильную группу при С-3 и карбонильную функцию при С-2 [8, 9, 12]. Абсолютная конфигурация асимметрических

указывал на присутствие двух амидных карбонилов (<5С 156.4 и 162.6), одного sp2- (öc 149.9) и одного sp3- (öc 75.9) гибридизированных атомов углерода, связанных с кислородом, шести sp2- (öc 98.0, 115.5, 118.7,123.4, 129.4 и 145.8) и одного sp3- (Öc 57.3) гибридизированных атомов метановых групп наряду с сигналами одного sp2- (Sc 112.2) и трех sp3- (¿с 30.8, 27.9 и 45.5) гибридизированных атомов метиленовых групп, шести sp2- (öc Ю4.5, 116.4, 123.2, 133.1, 134.9 и 140.4) и одного sp3- (öc 38.9) гибридизированных четвертичных атомов углерода.

Таблица 1 - Данные спектров ЯМР 'Н (CDC13, 700 МГц) и 13С (CDC13, 176 МГц)

карнеамида А (150).

Атом 8с. мульт. 5Н (J в Гц) НМВС NOESY

1 (NH) 7.84, с 2, 3, 8, 9 7, 23, 24

2 140.4, С

3 104.5, С

4 115.5, СН 7.09, с 3, 6, 7, 8, 9, 25 10, 11,25

5 116.4,С

6 149.9, С

7 98.0, СН 6.73, с 5, 6, 8, 9 1

8 134.9, С

9 123.2, С

10 30.8, СН2 а: 3.65, дд (3.6, 14.6) Ь: 3.18, дд (11.2, 14.6) 2,3,9,11,12 2,3,9,11,12 4, 11,23,24 4, 23, 24

11 57.3, СН 4.50, д (9.7) 10, 12 4, 10, 19

12 162.6, С

14 45.5, СН2 4.07, м 15, 16, 17 15

15 27.9, СН2 2.78, тд (3.0, 9.2) 14, 16, 17, 18 14, 16

16 118.7, СН 6.14, т (3.0) 14, 15, 17, 18 15

17 133.1,С

18 156.4, С

19 (NH) 5.69, с 12, 17 10, 11

20 112.2, СН2 а: 5.17, дд (0.9, 10.0) Ь: 5.14, дд (0.9, 3.2) 2,21,22 2,21,22 21,23,24 21,23, 24

21 145.8, СН 6.10, дд (10.0, 17.4) 2, 22, 23, 24 20, 23, 24

22 38.9, С

23 27.8, СНз 1.51,с 2, 20,21,22, 24 1, 10, 20,21

24 27.9, СНз 1.52, с 2, 20,21,22, 23 1, 10, 20,21

25 123.4, СН 6.43, д (9.7) 4, 5, 6, 27, 28, 29 4, 26

26 129.4, СН 5.59, д (9.7) 5, 27, 28, 29 25, 28, 29

27 75.9, С

28 27.7, СНз 1.42, с 25, 26, 27, 29 26

29 27.8, СНз 1.43, с 25, 26, 27, 28 26