Биологически активные метаболиты факультативных морских грибов, выделенных из грунтов дальневосточных морей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Юрченко Антон Николаевич

Биологически активные метаболиты факультативных морских грибов, выделенных иг груптов дальневосточных морей

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005&о

2 0 НОЯ 2014

Владивосток — 2014

005555738

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова

ДВО РАН

Научные руководители: кандидат химических наук

Афпятуллов Шамил Шерибзяиович

доктор химических наук, старший научный сотрудник Калиоовскин Анатолий Иванович

Официальные оппоненты: Имбе Андрей Борисович

доктор биологических наук, зав. лабораторией сравнительной биохимии, Институт биологии моря им. A.M. Жирмунского ДВО РАН

Чибиряев Андрей Михайлович

кандидат химических наук, доцент, с.н.с., Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Ведушая организация: Новосибирский институт органической хи-

мии им. H.H. Ворожцова СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится 26 декабря 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан «2» ноября 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Черников О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование метаболитов микроскопических грибов оказало существенное влияние на развитие химии и медицины. После откры+ия пенициллина в 1929 году началось интенсивное изучение наземных микроскопических грибов, которые оказались богатыми источниками биологически активных соединений. За 70 с лишним лет было исследовано более 100 тысяч метаболитов из этих микроорганизмов. Более 10 тысяч из них были биологически активными и более восьми тысяч проявляли антибиотические и антиопухолевые свойства. Хотя исследования наземных грибов интенсивно продолжаются и в настоящее время, число новых метаболитов, выделяемых из них, снижается, так как около 90% культур синтезируют уже известные соединения. Поэтому закономерен интерес к изучению метаболитов грибов из других мест обитания, в том числе и из морских. Несмотря на то, что изучение морских грибов как источников биологически активных соединений было начато еще в 50-х годах прошлого столетия, они остаются еще мало изученными объектами по сравнению с наземными экоформами.

Физические факторы, воздействующие на морские грибы - высокое содержание ионов натрия, низкие температуры, олиготрофный тип питания, высокое гидростатическое давление - обуславливают способность морских грибов к синтезу необычных по структуре метаболитов с разнообразной биологической активностью. Так, из морских грибов были выделены уникальные по структуре биологически активные соединения, которые не были обнаружены у наземных экоформ, несмотря на более чем 70-летнюю историю таких исследований. К таким соединениям относятся большое количество хлорсодержащих метаболитов, макролиды и пептиды с высокой антивирусной активностью. Среди морских грибов были найдены продуценты соединений с фермент-ингибирующей, противовоспалительной, антифунгальной и антибактериальной активностью, в том числе в отношении лекарственно-устойчивых штаммов бактерий. Целый ряд метаболитов морских грибов находятся в настоящее время на различных стадиях клинических испытаний как потенциальные противоопухолевые препараты.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и установление строения вторичных метаболитов факультативных морских грибов, изолированных из образцов грунта, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) провести отбор новых перспективных грибов-продуцентов, выделенных из образцов грунта, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях;

2) выделить индивидуальные природные соединения из экстрактов изолятов отобранных грибов;

3) установить строение новых метаболитов и идентифицировать ранее известные соединения;

4) исследовать биологическую активность выделенных соединений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Из экстрактов восьми штаммов морских грибов, выделенных из образцов грунта, собранных в Охотском и ЮжноКитайском морях (Isaria felina, Aspergillus carneus, Myceliophthora lutea, A. versicolor, Cun-ularia inaequalis, Wardomyces inflatus, Pénicillium citrinum и Acremonium roseum) в результате хроматографического разделения были выделены 40 индивидуальных соединений различной химической природы. При помощи спектральных методов анализа и химических превращений установлено строение 18 новых соединений: десяти хроменов, двух бензопиранов, двух пирановых поликетидов, одного фенольного поликетида, одного ди-фенилового эфира, одного меротерпеноида, одного изопреноида. Идентифицированы структуры 22 ранее описанных соединений. Установлено строение двух спироцикличе-ских артефактных продуктов хроматографического разделения экстракта Myceliophthora lutea.

Впервые исследована цитотоксическая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток ряда метаболитов морских грибов. Впервые изучена способность некоторых грибных метаболитов индуцировать экспрессию белка теплового шока Hsp70.

Практическое значение данного исследования состоит в развитии методов выделения и установления строения новых природных низкомолекулярных метаболитов из морских грибов.

Положения, выносимые на защиту.

1) Морские грибы Isaria felina К.ММ 4639, Aspergillus carnetis, Myceliophthora lulea, A. versicolor KMM 4647 и Curvularia inaequalis являются богатыми источниками хроме-нов, бензофурановых и пирановых поликетидов и меротерпеноидов.

2) В морском грибе Isaria felina найдены новые высокоокисленные хромены оксира-пентины B-J с редкой для природных соединений метилбутенинильной боковой цепью, а также новые пирановые поликетиды исарикетиды А и В.

3) Предложена возможная схема биосинтеза оксирапентинов А-К и акремина S из общего пренилфенольного предшественника, а также исарикетидов А и В из предполагаемого пентакетидного предшественника.

4) В экстракте гриба Aspergillus carneus обнаружены новые поликетиды варатерпол В и глицерилдиорциновая кислота, а также новое декалиновое производное декумбенон D. Глицерилдиорциновая кислота является первым описанным глицериновым производным орциновых эфиров.

5) В морском грибе Myceliophthora lutea найдено новое бензофурановое производное изоакремин D.

6) В морском грибе A. versicolor обнаружен новый меротерпеноид аспердемин. Апробация работы. Материалы работы были представлены на XIV Всероссийской

молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2012), IV Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology» (Новосибирск, 2012), 2nd International workshop on marine biore-sources of Vietnam (Ханой, 2013), 2nd International Symposium on Life Sciences (Владивосток, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Личпын вклад автора в проведение исследования. Автором был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и сделаны доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, посвященного некоторым классам вторичных метаболитов морских грибов, выделенных из донных осадков, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 228 цитируемых работ. Работа изложена на 177 страницах, содержит 21 таблицу и 33 рисунка.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям к.х.н. Афиятуллову Ш.Ш. и д.х.н. Калиновскому А.И. Также автор благодарит Сметанину О.Ф. за бесценную помощь в работе, д.б.н. Пивкина М.В., к.б.н. Худякову Ю.В., к.б.н. Киричук Н.Н. за наращивание исследованных штаммов грибов и определение антибактериальной активности выделенных соединений, к.х.н. Дмитренка П С. и Моисеенко О.П. - за получение масс-спектров, к.ф.-м.н. Глазунова В.П. и Ким Н.Ю. - за получение ИК и УФ-спектров, к.х.н. Ермакову С.П., к.б.н. Юрченко Е.А., к.х.н. Дышлового С.А. - за проведение испытаний биологической активности выделенных нами веществ.

Некоторые используемые сокращения: HRMALDIMS - масс-спектрометрия высокого разрешения с лазерной десорбцией/ионизацией; HREIMS - масс-спектрометрия высокого разрешения с ионизацией электронным ударом; HRESIMS - масс-спектрометрия

высокого разрешения с электро-распылительной ионизацией; COSY — корреляционная спектроскопия; DEPT - неискаженное улучшение переносом поляризации; НМВС - гете-роядерная корреляция через несколько связей; HSQC — гетероядерная одноквантовая когерентность; NOE - ядерный эффект Оверхаузера; NOESY - двумерная спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера; ROESY - двумерная спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат; РСА - рентгеноструктурный анализ; (7?)-МТРА-С1 - хлорангидрид (Д)-а-метокси-а-(трифторметил)фенилуксусной кислоты.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Скрининг

Для поиска перспективных источников биологически активных соединений были выделены более 1000 изолятов грибов из донных осадков, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях. Этилацетатные экстракты всех выделенных грибов исследовались методом ТСХ, изучалась их антимикробная активность в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также дрожжевых грибов. На основании полученных результатов были отобраны для дальнейшей работы восемь штаммов грибов-микромицетов: Isaria felina, Aspergillus carneus, Myceliophthora lutea, A. versicolor, Curvu-laria inaequalis, Wardomyces inflatiis, Pénicillium citrinum и Acremonium roseum.

Из этилацетатных экстрактов выбранных грибных штаммов было выделено 40 индивидуальных метаболитов, из которых 18 являются новыми.

2. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Isaria felina КММ 4639

Гриб I. felina был выделен из образца донных осадков, собранных в заливе Ванфонг (Южно-Китайское море).

Из этилацетатного экстракта I. felina при культивировании на агаризованном пивном сусле были получены новые окенрапентины В (1), D-H (3—7) и J (9), известный оксира-пентин А (11), а также известные циклодепсипептиды исаридин Е (327) и изоисариин В (328). На модифицированной среде с добавлением антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) дополнительно продуцировались новые оксирапентины С (2), I (8) и К (10), а также новый поликетид исарикетид А (12) и бензофуран акремин S (326). При этом продукция оксирапентинов G и H и пептидов не была зафиксирована. На рисовой среде были получены только шесть оксирапентинов (А, В, D-G) и акремин S. Самым бедным по продукции метаболитов оказалась культивирование на рисовой среде с добавление бромида калия. На этой среде продуцировались три основных оксирапентина (В, Е и F), а также исарикетиды А и В (13), последний из которых на других средах не продуцировался.

1

Бругго-формула соединения 1 была определена как С18Н22О6 на основании данных НЯЕЭШЗ (т./: 334.1429 [М]+) и подтверждена данными спектров |3С ЯМР. Анализ 'Н и 13С ЯМР-данных соединения 1 при помощи ИЕРТ и ШОС выявил наличие трех метальных групп, одной метштеновон, пяти окисленных метановых групп, а также трех четвертичных зр3-гибридизованных атомов углерода, связанных с кислородными функциями. Оставшиеся сигналы в углеродном спектре при ¿¡с 170.3 (С), 125.3 (С), 124.3 (СН2), 86.6 (С) и 83.8 (С) были отнесены к карбонильной группе, дизамещенной терминальной двойкой и тройной связям.

Прямое сравнение спектров 'Н и 13С ЯМР соединения 1 и известного оксирапенти-на А (11) выявило ряд сходств, включая сигналы трех метальных (¿н 1.26, 1.43, 1.90; ¿с 25.4, 21.6, 23.0), одной ацетильной (<5н 2.13; ¿t 170.9, 20.9) и двух метиленовых групп (¿н 2.50, 1.50, ¿с 32.4; ёц 5.41, 5.33, бс 124.3), подтверждающих, что соединение 1 содержит кольцо А и боковую цепь, идентичные таковым в оксирапентине А.

Наблюдаемые НМВС-взаимодействия H-4'a с С-Г (¿с 83.8), С-2' (<JC 86.6) и С-5' (Зс 23.0) и Н-5' с С-2', С-3' (¿с 125.4) и С-4' (<5С 124.3) совместно с взаимными дальними COSY-корреляциями между Н-4'а,Ь и Нз-5' указывают на наличие З-метилбут-З-ен-1-инильной боковой цепи в соединении 1. НМВС-корреляции от синглетных сигналов Нз-10 и Нз-11 к С-1 (<5С 74.5) и С-2 (дс 73.7), от Н-2 к С-1, С-3 (<5С 32.4), С-4 (<5С 53.0) и карбонильному углероду С-1" (¿с 170.3), от Н-ЗР к С-1, С-2, С-4 и С-9 (Sc 63.8), а также дальние COSY-взаимодействия между Нз-11 и Н-9 позволяют установить структуру кольца А и положение ацетатной группы при С-2. Разница в две единицы в молекулярной массе соединений 11 и 1 указывает на наличие гидроксильной группы в 1 вместо карбонильной группы в И. НМВС-корреляции от Н-За,Р к С-5 (¿с 60.0), от 6-ОН к С-5 (Sc 60.0) и С-6 (¿с 64.6) и от Н-8 к С-6, С-7 (Sc 51.7) и С-Г (<5С 83.8) устанавливают положение гидроксильной группы при С-6 и присоединение боковой цепи к С-7. COSY-45 и HSQC-спектры соединения 1 выявляют системы спин-спинового взаимодействия протонов в кольце В -(-СНО(6)-СНО(5)-) и (>СН(9)-СНО(8)-). Спектры 'Н и иС ЯМР показывают сигналы, относящиеся к тризамещенным эпокси-метинам С-5 (Sн 3.01, 1Н, уш.с; ¿с 60.0, 1Jch 184 Гц) и С-8 3.40, 1Н, уш.с; 6с 60.1, 'jCH 180 Гц). Эти данные и НМВС-взаимодействия Н-2 с С-4, Н-5 с С-3, С-4 и С-7 (Sc 51.7), Н-9 с С-7 и С-8 (Sc 60.1) показывают положение эпокси-групп при С-4, С-5 и С-7, С-8.

Рисунок 1 - А. Ключевые ЫОН-корреляции в молекуле оксирапентина В (1).

Б. Общий вид молекулы оксирапентина В (1) по данным РСА.

Ю ШЕ-взаимодействия 6-ОН/Н3-2", Н-5; Н-Зр/Н-5 и Н-За/Н-9, Н3-11 указывают на г/ггс-сочленение колец А и В, а также р-ориентацию ацетата и гидроксильной группы и а-ориентацию 4,5-эпоксида в соединении 1 (рис. 1А). Структура и относительные конфигурации стереоцентров соединения 1 были подтверждены рентгеноструктурным анализом монокристалла, полученного перекристаллизацией из смеси н-гексан-этилацетат (рис. 1Б).

laR=(S)-MTPA lb R=(«)-MTPA

Рисунок 2 - Значения ДS (<5S-c5R) (м.д.) для МТРА-эфиров оксирапентина В (1).

Абсолютные конфигурации стереоцентров соединения 1 установлены модифицированным методом Мошера. Этерификация (К)- и (5)-МТРА-хлоридами гидроксильной группы при С-6 привела к образованию (5}- и (Д)-МТРА-эфиров 1а и 1Ь, соответственно. Разница химических сдвигов Д6(6х-5л) (рис. 2) указывает на 65 конфигурацию и, таким образом, позволяет определить абсолютную стереоструктуру соедиения 1 с 2Д, 45, 55, 65, 7Я, 85 конфигурациями. Соединение 1 было названо оксирапентином В.

Брутто-формула соединения 2 была определена как С^НггОс, согласно НЯЕЭШЗ пику т/г 334.1427 [М]+ и 13С ЯМР анализу.

Основные пики в спектрах 'Н и 13С ЯМР соединения 2 соответствовали пикам ок-сирапентина В за исключением сигналов, относящихся к кольцу В. Структуры кольца А и боковой цепи в соединении 2 были установлены на основании НМВС- и дальних COSY-взаимодействий, подобных наблюдаемым для оксирапентина В (рис. ЗА). COSY-корреляции Н-8 с Н-9 и 8-ОН и НМВС-корреляция от 8-ОН к С-8 (¿с 70.32) указывают на положение ОН-группы при С-8. Спектр С ЯМР соединения 2 содержал сигналы при <5С 58.8 (д, 'Jch = 185.6 Гц) и 57.5 (д, 'Jch = 183.6 Гц), характерные для эпоксидных атомов углерода. Спектр 'н ЯМР выявил наличие двух эпокси-протонов при <5н 3.35 (уш.д, J= 2.5 Гц) и 3.77 (уш.д, J = 2.5 Гц). Эти данные совместно с НМВС-корреляциями от Н-За,р и Н-9 к С-4 (<5С 56.7) и С-5 (5С 58.8), от Н-5 к С-6 (<5С 57.5) и С-7 (<5С 52.8) и от Н-8 к С-6, С-7 и С-1' (¿fc 84.4) показывают положение эпоксигрупп в соединении 2 при С-4-С-5 и С-6-С-7. Относительная конфигурация стереоцентров соединения 2 была установлена на основании данных экспериментов разностного NOE и констант взаимодействия 2Усн• Ю NOE-взаимодействия Н-5/Н-ЗР, Н-6; Нз-10, Н3-П/Н-2; Н-За/Н-9, Н3-11 и Н-8/Н-9 (рис. ЗБ), a также значения констант взаимодействия Vcs-ш (+ 8.1 Гц) и 2Jc6-n¡ (+ 7.4 Гц) указывали на цис-сочленение колец А и В, Р-ориентацию боковой цепи, ацетатной и гидроксильной групп и a-ориентацию эпокси-групп в соединении 2. Таким образом была установлена структура соединения 2, которое было названо оксирапентином С. Абсолютная конфигурация стереоцентров оксирапентина С была предложена в соответствии с предполагаемым путем биосинтеза оксирапентинов (рис. 12).

Брутто-формула соединения 3 была определена как C1RH24O7 на основании данных HRESIMS и 13С ЯМР. Сравнение спектров ЯМР соединения 3 со спектрами оксирапентинов В (1) и С (2) показало ряд сходств, включая три метальные 1.30, 1.39, 1.91; Se 21.9, 26.3, 23.1) и две метиленовые группы (¿н 2.51, 1.78, ¿fc 31.4; <5н 5.39, 5.33, ¿с 123.8).

Структура боковой цепи соединения 3 была установлена на основании НМВС- и дальних COSY-корреляций и является идентичной боковым цепям оксирапентинов В и С. НМВС-взаимодействия от еннглетов Нз-10 и H3-11 к С-1 (й: 76.5) и С-2 {Se 71.0), от Н-2 к С-1, С-3 (¿с 31.4) и С-4 (¿с 73.9), от Н-3/?к С-1, С-2, С-4 и С-9 (Se 60.1), от 2-ОН к С-2 и С-3 позволили установить структуру кольца А и гидроксильной группы при С-2. Метальная группа при Su 1.51 (с) взаимодействует в НМВС-эксперименте только с четвертичным углеродом при Se 108.8 (С-12), что показывает наличие ортоацетатного фрагмента в струк-

2

А

Б

Рисунок 3 - Ключевые НМВС- (А) и NOE-корреляции (Б) в соединении 2.

туре соединения 3. Ключевые НМВС-взаимодействия от 7-ОН к С-6 (<5fc 72.7), С-7 (¿с 6S.6), С-8 (¿с 75.8) и С-Г (¿fc 86.7), от 5-ОН к С-5 (¿с 70.8) и С-6 и от Н-5 к С-3, С-4, С-6, С-7 и С-9 выявляют положение боковой цепи при С-7 и двух гидроксильных групп при С-7 и С-5. Оставшиеся сигналы двух окисленных третичных углеродов и одного окисленного четвертичного атома углерода связаны с ортоэфирной группой. Это предположение подтверждается НМВС-корреляциями от Н-6 и Н-8 к С-12.

Рисунок 4 - Ключевые Ж)Е-, взаимодействия в молекуле оксирапентина

О(З).

Относительная конфигурация стереоцентров соединения 3 была установлена на основании КОЕЗУ-корреляций между Н-За и 5-ОН, Н-9, Н3-11, между 5-ОН и Н-6, 7-ОН и между Н-9 и 7-ОН (рис. 4). Взаимодействия ЫОЕ наблюдались между 2-ОН и Н-Зр, Нз-10, Нз-13 и между Н-5 и Н-Зр. Все эти данные и НМВС-корреляция Н-5 с С-1' (\У-тип) позволяют установить хроменовый скелет с Р-аксиальным гидроксилом при С-2, а-аксиальными гидроксилами при С-5 и С-7, а также 4,6,8-ортоацетатной группой и боковой цепью в р-ориентации. Соединение 3 было названо оксирапентином О. Абсолютная конфигурация стереоцентров оксирапентина Э была определена на основании биогенетического родства с остальными оксирапентинами (рис. 10).

Брутто-формула соединения 4 была определена как С16Н20О5 на основании данных Е81М5 высокого разрешения и была подтверждена анализом ЯМР 13С спектров.

Ас'"0

ОАс"

НО' ^ ; ОН

О"

4 4а

В ЯМР-спектрах соединения 4 сигналы протонов и атомов углерода практически совпадают с соответствующими сигналами в спектрах оксирапентина В (1), за исключением сигналов С-1, С-2, С-3 и Н-2, Н-10, Н-11 в кольце А. Разница в 42 единицы массы между соединением 4 и оксирапентином В и отсутствие сигнала карбонильного углерода в 13С ЯМР-спектре соединения 4 позволяет предположить наличие гидроксильной группы в соединении 4 вместо ацетатной функции оксирапентина В. Данные С08У-45 спектра и НМВС-корреляции Н-Зр/С-1 (¿с 76.1), С-2 (¿с 72.5), С-4 (¿с 52.7); Н-9/С-4 и Нз-10,11/С-1, С-2 позволяют установить положение гидроксильной группы при С-2 и строение кольца А. Таким образом была установлена плоская структура соединения 4, названного оксирапентином Е.

Строение оксирапентина Е было подтверждено ацетилированием его и оксирапентина В уксусным ангидридом в пиридине. В результате были получены два соединения, которые по данным масс- и ЯМР-спектров имели одинаковую структуру, соответствую-

щую формуле 4а. Полученное соединение можно назвать ацетатом оксираиентина В или диацетатом оксираиентина Е.

Абсолютная конфигурация стереоцентров оксираиентина Е была установлена соответственно определенной ранее для оксирапентина В, как 2R, 45, 55, б5, 1R, 85.

HRESIMS-пик [M+Na]+ при tn/z 375.1418 указывает для соединения 5 на брутто-формулу С18Н24О7, которая соответствует семи степеням ненасыщености.

Сравнение спектров 'Н и 13С ЯМР соединения 5 и оксирапентина В (1) показало ряд сходств, включая сигналы трех метальных (5Н 1-23, 8с 25.2; 8Н 1.44, & 21.1; 8н 1.91, й: 23.3), ацетатной (8н2.11, ¿с 20.7; ¿¡с 169.7) и двух метиленовых (5н 1.65, 2.56, ¿с 32.0; 5н 5.28, 5.38, ¿с 123.3) групп. Боковая цепь соединения 5 была идентична боковой цепи оксирапентина В, что подтверждается НМВС-корреляциями Н-6, Н-8/С-1' (<% 87.3); Н2-4УС-2' (¿с 86.2), С-3' 125.8), С-5' (¿с 23.3) и Н3-57С-2', С-3', С-4' (¿с 123.3). Спектр 13С ЯМР содержит сигналы при ¿с 56.8 и 63.4 (д, 'Усн = 180.4 Гц), характерные для эпоксидных атомов углерода. 'Н ЯМР-спектр также показывает наличие одного эпокси-протона при <5н 3.05. Вместе с НМВС-корреляциями от Н-За,р и Н-9 к С-4 (¿с 56.8) и С-5 (¿с 63.4) эти данные указывают на локализацию эпокси-группы при С-4-С-5. СОБУ-корреляции Н-5 с Н-6, 6-ОН с Н-6, Н-9 с Н-8 и 8-ОН с Н-8 показывают наличие гидроксильных групп в 6 и 8 положениях, что подтверждается НМВС-корреляциями от 6-ОН к С-6 (¿с 69.5) и от 8-ОН к С-8 (¿с 72.4). Дальние НМВС-взаимодействия от 7-ОН к С-7 (¿с 70.8), С-8 и С-1' (¿Ь 87.3) указывают локализацию гидроксила при С-7.

Рисунок 5 - А. Значения Д<5 (с^-ЛО (м.д.) для МТРА-эфиров оксирапентина Б (5) Б. Ключевые ЬЮЕ-взаимодействия в молекуле оксирапентина Б (5)

Этерификация (Я)- и (5)-МТРА-хлоридами гидроксильных групп при С-6 и С-8 привела к (5)- и (й)-МТРА-диэфирам 5а и 5Ь, соответственно. Разница химических сдвигов Д6(55-5я) (рис. 5А) указывала на 65 и 85 конфигурации, соответственно. Константы взаимодействия 2Ун«-с5 (-4.23 Гц) и 2/н9-с8 (-4.05 Гц), а также Ш КОЕ-корреляции (рис. 5Б) Н-2/Нз-Ю, Нз-11; Н-За/Н-9 и Н-Зр/Н-5 свидетельствуют об а-ориентацин эпоксида и гидро-ксильной группы при С-8 и [3-ориентации ацетатной фуппы и гидроксильной группы при С-6. Эти данные позволяют определить абсолютные конфигурации стереоцентров соединения 5 как 2Д, 45, 55, 65, 85, 95. 5-конфигурация хирального центра С-7 была предложена на основании биогенетических соображений (рис. 11). Соединение 5 было названо окси-рапентином Р.

Пик НЯЕЗМЗ [М-Н]+ при т/: 309.1349 указывал на брутто-формулу соединения 6 как С16Н22О6. Разница в молекулярной массе (42 единицы массы) между соединениями 6 и

б"

5

5, а также данные ЯМР предполагают наличие гидроксильной группы в соединении 6 вместо ацетата в соединении 5. Это предположение подтверждается НМВС-взаимодействиями от 2-ОН к С-1 (¿с 75.2), С-2 (¿с 70.3) и С-3 (<5Ь 34.6). Соединение 6 было названо оксирапентином в.

6 7

Брутто-формула соединения 7 была определена как С^НгбОя на основании пика НЯЕЗШЭ при m/z 393.1515 [М+№]+ и данных 13С ЯМР. Основные сигналы спектров 'Н и 13С ЯМР (табл. 5) соединения 7 соответствовали оксирапентину Б (5) за исключением протонных и углеродных сигналов кольца В. Химические сдвиги С-4 (¿с 72.3) и С-5 (¿с 73.3), а также разница в молекулярной массе в 18 единиц массы между 7 и 5 указывали на наличие виц диола вместо эпокси-группы в соединении 5. НМВС-взаимодействия от 4-ОН к С-4 и С-5, от 5-ОН (8Н 4.75) к С-4, С-5 и С-6 (¿с 75.2), от 6-ОН к С-5 и С-6, от 7-ОН к С-1', С-6, С-1 и С-8 и от 8-ОН к С-7, С-8 и С-9 (¿с 69.9) позволили установить положение всех гидроксильных групп в молекуле соединения 7. Структура и относительные конфигурации стереоцентров соединения 7 были подтверждены рентгеноструктурным анализом монокристалла, полученного перекристаллизацией из этилацетата (рис. 6).

Рисунок 6 - Общий вид молекулы оксирапентина Н (7) по данным РСА.

Абсолютные конфигурации соединения 7 были определены как 2Н, 4Й, 551, 65, 7Д, 85, 95 на основании биогенетического родства с оксирапентинами В, рий (рис. 11). Соединение 7 было названо оксирапентином Н.

Брутто-формула соединения 8 была определена как С^НгоОв (подобно 7) на основании НШ^ШЗ-пика при т': 393.1508 [М+Ка]+и данных 13С ЯМР. Значительные отличия данных *Н и ,3С ЯМР по сравнению с оксирапентином Н (7) наблюдались для С-2 69.2), С-3 (¿с 28.8), С-4 (¿с 79.8), С-5 (¿с 68.9) и С-6 (& 74.3) атомов.

Рисунок 7 - Ключевые !ЧОЕ8У-корреляции в оксирапентине I (8).

НМВС-корреляции от 2-ОН к С-1 (Sc 75.0), С-2 и С-3, сдвиг сигнала ЯМР С-4 в слабое поле позволяют сделать вывод наличии ацетатной группы в соединении 7 при С-4, вместо С-2, как в оксирапентине Н.

NOESY-корреляции (рис. 7) Н-2/Н3-10, H3-ll; Н-6/5-ОН; 2-ОН/Н3-Ю; Н-9/Н-За, Н3-11, 5-ОН и 7-ОН, a также КССВ протонов Н-8 (Su 3.95, дд, J = 6.4, 9.7 Гц) и Н-9 (<5н 3.78, д, J= 9.8 Гц) позволяют установить, что относительные конфигурации стереоцентров соединения 8 идентичны таковым в структуре оксирапентина Н (7). Абсолютные конфигурации стереоцентров соединения 8 предложены на основании биогенетических соображений (рис. 11). Соединение 8 было названо оксирапентином I.

Брутто-формула соединения 9 была определена как С18Н24О7 (идентично оксирапен-тину F (5)) на основании пика HRESIMS при т/: 375.1418 [M+Na]+ и данных 13С ЯМР. Основные различия в спектрах ЯМР по сравнению с оксирапентином F наблюдались в сигналах, относящихся к кольцу В. Спектры 'Н и 13С ЯМР соединения 9 указывали на наличие одного четвертичного атома углерода при ¿с 55.4 (С) и одного тризамещенного эпокси-метина при ^ 3.60 и Sc 64.3 (д, '/сн= 185.6 Гц).

COSY- и HSQC-спектры соединения 9 позволили выявить последовательности взаимодействующих протонов в кольце В: (-СНО (5)-СНО (6Н и (-СНО (8)-СН (9)<). Эти данные, а также НМВС-корреляции от Н-2, Н2-3 и Н-9 к С-4 (¿с 71.1), от Н2-3 к С-5 (¿t 72.1), от Н-6 к С-4, С-5, С-7 (<5fc 55.4), С-8 (<5с 64.3) и С-Г (¿с 83.0) i' от Н-8 к С-7, С-9 (¿t 72.7) и С-Г позволяют установить углеродный скелет соединения 9. Эти данные также указывают на положение гидроксильных групп при С-4, С-5 и С-6 и позволяют определить положение эпоксида при С-7 и С-8. NOE-корреляции Н-2 с Нз-10 и Нз-11 указывают на p-ориентацию ацетата при С-2. Константа взаимодействия 2Уно-с5 (-2.3 Гц) указывает на Р-ориентацию Н-5, в силу угкг-взаиморасположения Н-6 и 5-ОН. a-Ориентации Н-9 и эпокси-группы и p-ориентации 4-ОН, 6-ОН и боковой цепи были предложены на основании биогенетического родства с оксирапентинами A-I (рис. 10). Соединение 9 было названо оксирапентином J.

Брутто-формула соединения 10 была определена как С18Н24О7 на основании HRE-SIMS-пика при т/: 375.1414 [M+Na]+ и данных ЬС NMR. Сравнение спектров ЯМР соединения 10 со спектрами оксирапентинов В и F позволяет обнаружить некоторые сходства, включая две метильные 1.11, 1.43; Sq 21.8, 25.3), метиленовую (Sa 2.75, 1.59, Sc

32.2) и ацетатную (<5н 2.08, Sc 169.8, 20.8) группы, подтверждающие, что соединение 10 содержит в своей структуре кольцо А идентичное таковому в структурах соединений 1 и 5. Анализ данных DEPT и HSQC выявил наличие двух третичных оксигенированных атомов углерода (Sc 62.5, 82.3), двух четвертичных метальных № 1.42, 1.53; ¿с 24.4, 27.9) и двух оксигенированных метиновых (<5н 3.20, 4.70; ¿с 56.7, 64.2) групп. Оставшиеся функциональности соответствуют сигналам при Sc 190.1 (С), 165.6 (С) и 111.0 (С), свидетельствуя о наличии тетразамещенного енонового хромофора.

Данные COSY и взаимные корреляции НМВС между метинами С-8 (¿с 64.2) и С-9 (Sc 69.9) и корреляции от Н-2 (<5н 4.99) к С-4 (<5fc 62.5) и Н-За (<5н 2.75) к С-4 и С-5 (Sc 56.7, Д, ^сн = 184.2 Гц) позволяют определить положение гидроксильной группы при С-8 и эпоксида при С-4-С-5. НМВС-взаимодействия от Н3-4' (4i 1-53) и Н3-5' (Sa 1.42) к С-2' (4

47.3) и С-3' (¿с 82.3), от Н2-2' к С-1' (¿с 190.1) и С-3', от Н-2'/? (¿н 1.59) к С-7 (¿fc 111.0) и от

9

10

Н-9 (А 4.25) к С-7, а также сдвиг в слабое поле сигнала С-б (й; 165.6) указывает на 6(7)-ен-1'-оновое расположение тетразамещенного еноиа и позволяет полностью установить структуру соединения 10. ШЕ-корреляции Н-2/Нз-10 (4; 1.11) и Н3-11 (ён 1.43); Н-3а (3н 2.75) /Н-9 и Н-3Р /Н-5 (<% 3.20) указывают на г/нс-сочленение колец А и В, /^-ориентацию ацетата и а-ориентацию эпокси-группы.

10aR = (5)-MTPA 10bR = (/?)-MTPA

Рисунок 8 - Значения ДS (<5S—¿R) (м.д.) для МТРА-эфиров оксирапентина К (10)

Обработка соединения 10 (R)- и (5)-МТРА-хлоридами привела к этерификации гид-роксильной группы при С-8 и образованию (S)- и (Я)-МТРА-эфиров 10а и 10Ь, соответственно. Разница в химических сдвигах A8(8,s-6^) (рис. 8) указывает на 8R конфигурацию и позволяет установить абсолютные конфигурации остальных стереоцентров соединения 10 как 2R, 4R, 5S, 9S. Эта стереоструктура не противоречит структурам биогенетической серии оксирапентинов (рис. 10). Соединение 10 было названо оксирапентином К.

Стоит отметить, что кроме новых оксирапентинов В-К (1-10) из гриба Isaria felina также был выделен известный оксирапентин А (11), ранее выделявшийся японской группой из наземного изолята Beauvería felina (= I. felina). Структура оксирапентина А была определена нами на основании данных РСА.

11 г 12

Брутто-формула соединения 12 была определена как СмН^Ов на основании пика НИЕвШБ при mlz 335.0730 [М+Ыа]+. Анализ данных 'Н и 13С ЯМР выявил наличие одной метальной (^ 2.05, 20.7), двух метоксильных (^ 3.81, 4.13; &с 52.7, 63.6) и двух окси-генированных метиленовых групп (^ 4.54 б, 2Н, 5.06 в, 2Н; ¿с 54.4, 58.0), а также двух четвертичных ^р'-гибридизованных атома углерода (¿с 110.6, 120.5) и одной дизамещен-ной двойной связи (¿с 132.4, СН, 125.7, СН). Оставшиеся функциональности соответствуют углеродным сигналам при ¿с 155.8 (С), 164.5 (С), 167.6 (С), 171.7 (С) и 172.4 (С), что позволяет предположить наличие сложноэфирных или ¿р'-гибридизованных атомов углерода, связанных с кислородом. НМВС-взаимодействия от Н-7 к С-4 (& 120.5), С-6 (¿£ 155.8), С-8 (¿с 125.7) и С-9 (¿с 167.6), от Н-8 к С-6, С-7 (¿с 132.4) и С-9, от Н3-10 к С-9 и от Нг-5 к С-4 и С-6 выявляют положение основной боковой цепи. КССВ протонов Н-7 (<5н 7.71, д, J= 15.5 Гц) и Н-8 6.70, д, 7= 15.5 Гц) указывают на ^-конфигурацию двойной связи С-7-С-8. ^-конфигурация была также установлена для двойной связи С-4-С-6 на основании МОЕЗУ-корреляции между Н-5 и Н-7. НМВС-корреляции от Н2-1 и Н2-5 к С-Г (¿с 171.7) (\У-тип), от Н2-1 к С-2 (¿с 164.5) и С-3 (¿с 1 Ю.б), от Нз-2' к С-Г и от Н3-2" к С-Г (<% 172.4), а также слабопольные химические сдвиги С-1 (6с 58.0) и С-5 (£; 54.4) позволяют определить положение в пирановом кольце ацетатной и карбоксиметильной групп при С-2 и С-3, соответственно, и установить структуру соединения 12. Соединение 12 было названо исарикетидом А.

но

.....-он

I 1Н ^й / ' \

МеО

13 14

Пик НЯЕЗШЯ при т/: 270.0743 [М+Ыа]+ позволил установить брутто-формулу соединения 13 как С12Н14О7. Данные спектров 'Н и 13С ЯМР соединения 13 были близки таковым для исарикетида А (12) за исключением отсутствия сигналов ацетата. На основании этого структура соединения 13 была определена как деацетилированное производное исарикетида А. Соединение 13 получило название исарикетид В.

Брутто-формула соединения 14 была установлена как СцНцОз на основании пика ННЕБШЗ с тУ: 229.0840 [М+№]+. 'Н и 13С ЯМР-спектры соединения 14 содержат сигналы 1,2,4-тризамещенного бензольного кольца (<% 7.53, 7.43, 7.28; ¿с 119.7, 111.2, 123.5), двух метальных (<5н 1 68 э, 6Н; ¿с 28.7) и гидроксиметильной 4.76; й; 65.7) групп, четырех ^г-гибридизованных четвертичных атомов углерода (¿с 128.6, 135.6, 154.3, 163.7), включая два оксигенированных атома, одного я/Лгибридизованного метинового атома углерода 6.57, ¿с 100.3) и одного оксигенированного ¿р3-гибридизовапного атома углерода (¿с 69.3). НМВС-взаимодействия (рис. 9) от Н-3 к С-2 (¿с 163.7), С-За (¿с 128.6) и С-7а (¿с 154.3); от Н-4 к С-3 (¿Ь ЮО.З), С-6 (¿с 123.5), С-За и С-7а; и от Н-6 к С-7а указывают на наличие в структуре соединения 14 бензофуранового ядра. Корреляции от Нз-2' и Нз-3' к четвертичным атомам углерода при ¿с 69.3 (С-Г) и 163.7 (С-2) и от Н-3 к С-1', а также взаимные корреляции от Н-4 и Н-6 к С-1" позволяют установить структуры и положение 2-гидроксиизопропильнон и гидроксиметильной групп при С-2 и С-5, соответственно.

Рисунок 9 — Основные НМВС-взаимодействия в молекуле акремина S (14).

Эти данные выявили, что соединение 14 является структурным изомером бензофу-рана изоакремина D (18). Соединение 14 было названо акремином S.

Кроме соединений 1-14 из экстракта гриба lsaria felina были выделены известные циклодепсипептиды исаридин Е и изоисариин В. Эти пептиды ранее были описаны в наземном изоляте lsaria felina.

Предполагаемый путь биосинтеза

Ранее было показано, что многие грибные бензофураны образуются из орто-пренилированных фенолов, которые могут являться продуктами как шикиматного, так и полиацетатного пути биосинтеза. Мы предполагаем, что в случае оксирапентинов орто-пренилированный фенольный предшественник i-1 окисляется и пренилируется с образованием дипренилгидрохинона i-2. Модификация одного из пренильных остатков происходит через окисленный интермедиат i-З, который под действием дегидрогеназы (DHG) и ацетиленазы превращается в метилбутенинильную боковую цепь i-4. Хиноновое производное i-5, полученное из i-4, подвергается окислению монооксигеназой (MOG) с образованием триэпоксида i-б. Гидролиз эпоксида боковой цепи в ¡-7 с последующей циклизацией в пирановый цикл приводит к образованию оксирапентинового скелета в i-8. Ацилиро-вание кетона i-8 приводит к окснрапентину А (11), а восстановление дает оксирапентин Е (4), который при при ацилировании образует оксирапентин В (1), а при селективном гидролизе эпоксидгидролазой (EHL) и ацилировании - оксирапентин J (9). Гидролиз обоих эпоксидных циклов оксирапентина Е через менее устойчивый карбокатион при С-8 при-

водит к полиолу i-9. В результате ацилирования i-9 по 4-ОН, 6-ОН или 8-ОН с дальнейшей циклизацией ацетата на две других гидрокспльных группы образуется оксирапентин D (3). Согласно нашему предположению, последовательное действие EHL и редуктазы на эпоксид при С-7-С-8 в i-8 приводит к интермедиату i-Ю, боковая цепь которого после гидратации тройной связи циклизуется на гидроксил при С-6 с образованием оксирапен-тина К (10) (рис. 10). Предшественником оксирапентина К равновероятно может выступать пероксид i-11, образующийся при действии диоксигеназы (DOG) на двойную связь С-7-С-8 (рис. 11). Оксирапентины с цис-диолами при С-7 и С-8 могут быть образованы действием редуктазы на пероксид в i-11. Образующийся при этом оксирапентин G (6) является прямым предшественником оксирапентинов F (5) и I (8), а гидролиз EHL эпоксида оксирапентина F приводит к образованию оксирапентина Н (7).

Рисунок 10 — Предполагаемая схема биосинтеза оксирапентинов А (11), В (1), О (3), Е (4),

.1(9) и К (10).

Образование оксирапентина С (2) также предполагается из предшественника ¡-1, окисление которого происходит в орто-положенне (относительно имеющегося гидрокси-ла) с образованием дипренилированного о-резорцина ¡-12. Образование метилбутени-нильной боковой цепи происходит сходным с описанным на рис. 15 путем. Кето-таутамер ¡-14 под действием ЕНЬ превращается в триэпоксид ¡-15, который после частичного восстановления редуктазой дает диол ¡-16. Гидролиз ¡-16 ЕНЬ с образованием фуранового кольца А и дальнейшее ацилирование приводит к образованию оксирапентина С (рис. 12).

оксирапентин Н (7) оксирапентин F (5) оксирапентин I (8)

Рисунок 11 - Предполагаемая схема биосинтеза оксирапентинов F-I (5-8).

Рисунок 12 — Предполагаемая схема биосинтеза оксирапентина С (2).

3.3. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus carneus

Гриб Aspergillus carneus был выделен из образца песчаного грунта, собранного в Охотском море (восточно-сахалинский шельф).

Из гриба A. carneus были получены три новых соединения - варатерпол В (15), гли-церилдиорциновая кислота (16) и декумбенон D (17). Совместо с ними также были выделены семь известных соединений: декумбенон В, версиол, зтилаверантин, 6,8-диметилаверуфин, стеригматоцистин, аверсин и радиклоновая кислота.

Брутто-формула соединения 15 была определена как С15Н20О5 на основании пика HRESIMS 281.1391 ([M-Hf), а также подтверждена данными 13С ЯМР. Спектр 'Н ЯМР соединения 15 содержит сигналы тризамещенного бензольного кольца (8н 7.24, 7.35, 7.42), девяти алифатических протонов (5Н 1.03, 1.15, 1.36, 1.40, 1.51, 1.78, 1.95,3.25, 3.34) и двух метальных групп (6н 0,82, 1.59). Данные 13С ЯМР указывают на наличие двух метальных (5с 16.9, 28.8), четырех метиленовых групп (5с 22.5, 34.6, 43.7, 68.4), в том числе одной оксигенированной (8с 68.4), одного ^р3-гибридизованного метанового атома углерода (5с

36.8), трех метановых (5с 118.6, 121.5, 127.6) и трех четвертичных ароматических атома углерода (5с 133.2, 137.3, 156.8), оксигенированного четвертичного атома углерода (5с

77.9) и карбоксильной группы (5с 171.3).

Взаимодействия НМВС (рис. 13) от Н-3 (8Н 7.24) к С-1 (8С 156.8) и С-5 (5С 133.2), от Н-4 (5Н 7.42) к С-2 (5С 137.3) и С-6 (5С 118.6) и от Н-6 (5Н 7.35) к С-2 и С-4 (5С 121.5), совместно с op/no-КССВ между Н-3 и Н-4 (J3.4 = 8.0 Гц) устанавливают 1,2,5-тризамещенное бензольное кольцо в структуре 15. НМВС-корреляции от Н2-8 (5н 1.78, 1.95) к С-7 (5с 77.9), С-9 (5С 22.5) и С-14 (5С 28.8), от Н2-Ю (6Н 1.03, 1.36) к С-8 (5С 43.7), С-9, С-11 (5С 36.8), С-12 (5с 68.4) и С-13 (8с 16.9), от Н3-13 (5Н 0.82) к С-10 (8с 34.6), С-11 и С-12 и от Нз-14 (8н 1.59) к С-7 и С-8 устанавливают структуру боковой цепи, метилированной по С-7 и С-11. Присоединение боковой цепи при С-2 однозначно определяют НМВС-кросс-пики Н-З/С-7 и Нз-14/С-2. НМВС-взанмодействия от Н-4 и Н-6 к карбоксилу С-15 (8с 171.3) указывают на его положение при С-5. Сдвиг значений сигналов С-1, С-7 и СНг-12 в слабое поле указывает на наличие в этих положениях гидроксильных групп.

ноос

15

НОО^ -

"ОН

15

Рисунок 13 - Основные НМВС-корреляции в структуре варатерпола В (15).

Таким образом, плоская структура соединения 15 была установлена. Структура 15 очень близка структуре известного метаболита наземного Pénicillium sp. варатерпола, содержащей гидроксиметиленовую группу вместо карбоксильной. Соединение 15 было названо варатерпол В.

(-)HRESIMS-nnk (m/: 347.1136) соединения 16 соответствует брутто-формуле С18Н20О7, что подтверждается данными 13С ЯМР. Анализ спектра 'Н ЯМР выявил наличие пяти ароматических (8н 6.35, 6.36, 6.38, 6.45, 6.49), пяти алифатических протонов (5ц 3.70, 3.80, 4.10, 4.43, 4.48), двух метальных (8н 2.30, 2.53) и одной карбоксильной группы (5н 11.4). В спектре 13С ЯМР также был обнаружен сигнал карбоксильной группы (5с 171.6), а также сигналы двух метальных (8с 21.4, 24.5), двух метиленовых (8с 63.5, 66.0), алифатической (8с 70.1) и пяти ароматических метинов (8С 103.3, 105.1, 112.7, 113.1, 113.7) групп и семи £р2-гибридизованных четвертичных атомов углерода (8с 106.6, 141.3, 143.6, 155.8, 156.6, 162.7, 165.3).

Расщепление протонов Н-2 (8Н 6.36, т, / = 2.1 Гц), Н-2' (8Н 6.25, д, У = 2.3 Гц) и Н-6' (8Н 6.38, д, ./ = 2.6 Гц) указывает на мета-расположение протонов Н-2, Н-4 и Н-6 и Н-2' и Н-6'. НМВС-корреляции (рис. 14) от Н-2 к С-1 (8С 155.8), С-3 (8С 156.6), С-4 (8С 112.7) и С-6 (8с 113.7), от Н-4 к С-3 и С-5 (8С 141.3), от Н-6 к С-1, С-5 и С-7 и от Н3-7 к С-4 и С-6 позволили установить орциновый фрагмент молекулы 16. Остаток о-орселлиновой кислоты в структуре 16 был установлен на основании НМВС-взаимодействий Н-2' с С-Г (8с 162.7), С-3' (8С 165.3), С-4' (6с 106.6) и С-6' (8С 113.1), Н-6' с С-1' и С-4', Н3-7' с С-4', С-5' (5с 143.6), С-6' и С-8' (8С 171.6) и 8-СООН с С-3' и С-4'. Корреляции от Н2-1" к С-2" (5С 70.1) и от Н-2" к С-3" (8с 66.0) позволили определить глицериновый фрагмент в структуре молекулы 16. Присоединение орцина и глицерина к о-орселлиновой кислоте через С-1-0-С-1' и С-Г'-О-С-З', соответственно, однозначно устанавливается НМВС-кросс-пиками Н-2/С-1', Н-2УС-1 и Н2-1"/С-8'.

Таким образом была установлена структура соединения 16, которое было названо глицерилдиорциновой кислотой.

Брутто-формула соединения 17 была определена как С18Н28О4 на основании НКЕЗШБ-пика т/: 331.1883 [М+Ыа]+ и подтверждена данными спектра 13С ЯМР.

Спектральные характеристики соединения 17, а также НМВС-корреляции (рис. 15) практически полностью соответствовали известному декумбенону А за исключением протонных и углеродных сигналов СН2-1 (8С 67.8, 8Н 3.65, 3.95) и СН2-2 (8С 40.5, 8Н 2.33, 3.37). Данные СОЗУ-спектра указывают на наличие системы спин-спинового взаимодействия протонов (-СН20(Г)-СНз(2')). Положение этоксила при С-1 определяется взаимными НМВС-корреляциями между метиленами С-1 и С-Г. Таким образом, структура соеди-

16

Рисунок 14 - Ключевые НМВС-корреляции в структуре глицерилдиорциновой кислоты (16)

нения 17 соответствовала 1-О-этилдекумбенону А. Соединение было названо декумбено-ном D.

Рисунок 15 — Основные ПМВС-корреляции в структуре декумбенона D (17).

Остальные метаболиты А. carneus согласно полученным ЯМР-данным идентифицированы с известными грибными терпеноидами декумбеноном В и версиолом и поликети-дами этилаверантином, 6,8-диметилаверуфином, стеригматоцистином, аверсином и радн-клоновой кислотой. Радиклоновая кислота ранее не описывалась для грибов рода Aspergillus.

3.4. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Myceliophthora lutea

Штамм гриба Myceliophthora lutea был выделен из образца грунта, собранного в Сахалинском заливе Охотского моря.

Из гриба М. lutea при культивировании на агаризованном пивном сусле был выделен новый изоакремин D (18) и известный акремин А (19). Также были получены два новых продукта самоциклизации акремина А - спироакремины А (19-1) и В (19-2), являющиеся артефактами выделения.

Брутго-формула изоакремина D (18) была определена как С12Н14О3 на основании EIMS высокого разрешения и подтверждена данными спектров 13С ЯМР.

18

Спектр 'Н ЯМР соединения 18 содержит три ЗН-синглетных сигнала в области 5н 1.55-2.27 м.д., что указывает на присутствие в его структуре трех четвертичных метальных групп. Присутствующие в спектре синглетные сигналы при 8Н6.45, 6.92, 7.15 м.д., интенсивностью один протон каждый, были отнесены сигналам ароматических протонов.

Данные РЕРТ и ШС!С-спектров подтверждают наличие трех метальных групп (6с 17.6, 31.0, 31.0), а также указывают на присутствие трех метановых групп (8с 101.2, 106.5, 113.4). Остальные шесть атомов углерода были отнесены к четвертичным атомам (5с 165.9, 153.0, 150.8, 128.6, 123.1, 69.7).

Положение метальной группы 1" (<5с 17.6, 5н 2.27) при С-6 было установлено НМВС-взаимодействиями Н3-1" с С-5 (<5С 153.0 м.д.), С-6 (<5С 123.1) и С-7 (<5С 113.4). Синг-леты Нз-2' и Нз-3' были отнесены к геминальным метальным группам на основании взаимных НМВС-корреляций друг с другом и корреляций от метальных протонов к четвертичному углероду С-Г (<5с 69.7 м.д.), связанному с кислородом. Значения сигналов углеродных атомов С-2 (йс 165.9) и С-7а (6с 150.8) в "С ЯМР-спектре соединения 18 указывают на связь этих атомов с атомом кислорода. Положение двух гидроксильных групп при С-1' и С-5 однозначно устанавливается НМВС-взаимодействиями от протонов гидро-

ксильных групп к соответствующим атомам углерода. Эти данные позволяют сделать вывод, что соединение 18 является 2-(1'-гидрокси-Г-метилэтил)-6-метилбензофуран-5-олом.

Анализ литературных данных, выявил, что спектральные характеристики соединения 339 близки к таковым известного акремина О (спектры 'Н ЯМР полностью совпадают), выделенного итальянскими учеными из гриба Асгетотит Ы$5о1с1е5. Более того структурная формула, приписываемая итальянскими авторами для акремина В полностью совпадает со структурой соединения 18. Тем не менее, значительные отличия данных спектров 13С ЯМР для соединения 18 и акремина О, а также существенная разница в температурах плавления этих веществ (соединение 18 - 260-262 °С, акремин Б - 142-145 °С) позволяют утверждать, что соединение 18 является новым, и оно было названо изоакре-мином Р.

По данным масс-спектрометрии высокого разрешения (НЯЕШБ), молекулярный ион соединения 19 имеет массу 226.1221, что соответствует брутто-формуле С^Н^О^.

Близкие значения сигналов протонов и углеродных атомов в 'Н и |3С ЯМР спектрах соединения 19 и акремина А из Асгетотит Ы$501с1е5, а также данные рентгенострук-турного анализа для соединения 19 указывали на идентичность этих соединений.

Следует отметить, что при хранении акремина А (19) в хлороформе на свету происходит образование двух новых соединений - спироакреминов А (19-1) и В (19-2). В то же время при хранении акремина А в хлороформе в темноте подобного превращения не происходит. По-видимому, под действием света происходит фотохимическая реакция, приводящая к изменению конфигурации двойной связи, что делает возможным дальнейшую циклизацию. Хлороформ является донором протонов, необходимых для циклизации. Гидроксильный кислород боковой цепи атакует электрон-дефицитный енонный углерод С-5 с образованием спиросоединений 19-1 и 19-2.

Брутто-формула соединения 19-1 была определена на основании данных масс-спектра высокого разрешения и спектров ЯМР 'Н и 13С. Анализ 'Н и 13С и ОЕРТ-спектров соединения 19-1 доказывают существование карбонильной группы (¿с 211.2), трех четвертичных атомов углерода, связанных с кислородными функциями (<5с 90.0, 95.7, 76.5), двух метиленовых (<5с 49.2, 44.6), одной оксиметиленовой (5с 70.4) и трех метильных групп (¿с 25.9, ¿н 1-39; ¿с 28.6, ¿и 1.31; ¿с 29.9, <5н 1.30). Спектральные данные указывают на присутствие в структуре соединения 19-1 одной дизамещенной двойной связи (<5с 138.4, 8н 5.88; ¿с 128.9, ¿и 5.61) и соответствуют бициклической структуре соединения.

'Н-'Н СОБУ ЯМР-спекгр позволил идентифицировать две спин-спиновые системы, соответствующие С-11/С-3/С-4 и С-13/С-9/С-10 фрагментам в соединении 19-1. НМВС-корреляции Нз-13/С-7, С-8 и С-9; Н2-6/С-5, С-7 и С-10 устанавливают структуру цикло-гексанонового фрагмента 19-1 и положение гидроксильной и карбонильной групп при С-7 и С-8, соответственно. Корреляции от Н-3 к С-5 (<5С 95.7), от Н-6(5 к С-8 (¿с 76.5), и от Нг-6 к С-4 подтверждают существование спироциклической системы в соединении 19-1. Константа спин-спинового взаимодействия между Н-3 и Н-4 (Д4 = 5.9 Гц) является типичной для 1/нс-двойной связи в пятичленном цикле.

Относительные конфигурации асимметрических атомов углерода в 19-1 были определены на основании ГГОЕЗУ-экспериментов и значений констант спин-спинового взаимодействия соответствующих протонов. МОЕБУ-корреляции Н-З/Н-4, Нз-11, Нз-12; Н-4/Н-6а, Н-10; Н-10/Н3-13, а также значение КССВ протонов Н-10 и Н-9 (Ч^до = 4.7 Гц)

подтверждают, что шестичленный цикл в 19-1 существует в конформации псевдо-кресла, в котором Н-ба, Н-10 и Нз-13 находятся в аксиальном положении.

19-laR = (5>MTPA 19-2а R = (5)-МТРА 19-lb R = (R)-MTPA 19-2b R = (ft)-MTPA А Б

Рисунок 16 - Разница в химических сдвигах между (5)-и (Й)-МТРА эфирами (А) спироакремина А (19-1) и (Б) спироакремина В (19-2).

Абсолютная конфигурация стереоцентров соединения 19-1 была установлена по методу Мошера. Этерификация 19-1 (/?)- и (£)-МТРА-хлоридами по гидроксильной группе при С-10 привела к образованию (S)- и (Д)-МТРА эфиров, 19-1а и 19-lb, соответственно. Разница в химических сдвигах (Д6,?-5л) в протонных спектрах эфиров (рис. 16А) указывает на 10S конфигурацию, а, следовательно, с учетом указанных ранее NOESY-взаимодействий, углеродные атомы С-5 и С-8 должны иметь S и R конфигурации, соответственно. Соединение 19-1 было названо спироакремином А.

Соединение 19-2 подобно спироакремину А (19-1) имело брутго-формулу СиН^Оч, рассчитанную на основании данных HREIMS. Анализ спектральных данных соединения 19-2 и сравнение их с данными для спироакремина А указывает на присутствие в 19-1 такого же спнро[4,5]деценового скелета.

Абсолютная конфигурация хиральных центров соединения 19-2 подобно спироакремину А установлена на основании метода Мошера (рис. 16Б). NOE-взаимодействие между Н-4 и H-9ß в эфирах 19-2а и 19-2Ь указывает на R конфигурацию С-5. Таким образом, было установлено, что соединение 19-2 является эпимером спироакремина А по спиросте-реоцентру. Соединение 19-2 получило название спнроакремин В.

3.5. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus versicolor

Изолят гриба Aspergillus versicolor был выделен из образца донных осадков, собранного в Сахалинском заливе Охотского моря.

При культивировании гриба А. versicolor на рисовой и кукурузной средах был выделен новый меро'терпеноид аспердемин (20).

Брутто-формула соединения 20 была определена как CjiHisO; на основании данных HRESIMS и была подтверждена анализом спектров ЯМР 13С.

Данные 'Н и 13С ЯМР, DEPT и HSQC-спектров 20 указывают на наличие пяти метальных (8с 15.4, 19.0, 21.7, 25.9, 33.1 м.д.), трех метиленовых (Sc 16.1, 39.2, 46.3 м.д.) и пяти метановых групп (5с 43.2, 49.1, 67.5, 68.0, 99.9 м.д.). Остальные восемь атомов углерода были отнесены к четвертичным (6С 171.3, 163.6, 161.9, 159.9, 97.0, 84.8, 80.0, 43.9 м.д.).

Частичные структуры а и b для 20 были определены в результате анализа данных 'Н-'Н COSY н НМВС-экспериментов (рис. 17).

НМВС-корреляции метиленового протона H2-11а к С-8, С-9 (<5с 43.2), С-12 (Sc 97.0) и С-16 (<5с 161.9) указывают на то, что С-11 (¿с 16.1) является связующим атомом между фрагментами а и Ь.

Между С-8 и С-16 располагается пирановый кислород, что подтверждается сигналами двух атомов углерода в области слабого поля (Sс 80.0 и 161.9 м.д., соответственно). Таким образом, была получена полная плоская структура соединения 20.

Относительная стереохимия соединения 20 была определена на основании данных COSY- и ROESY-экспериментов (рис. 18).

ОН

20

Рисунок 17 - Фрагменты структуры аспердемина (20). Ключевые НМВС- (стрелки) и СОБУ-взаимодействия (жирные линии).

ROESY-корреляции от Нз-19 к Н2-2Р и Нэ-21 и от Нз-20 к Н-5 устанавливают траис-сочленение колец А и В. Это подтверждается дальними COSY-взаимодействиями от Н-5 к Нз-19 и Нз-21.

Кросс-пики Нз-19/6-ОН и Нз-19/Нз-18 указывают на то, что эти группы находятся по одну сторону молекулы. На основании этих данных, а также корреляций от Н-5 к Н-9, и дальних COSY-взаимодействий между Н-9 и Н3-18, Н3-19 сочленение колец В и С было установлено как транс.

оАн/1 J Н 20aR = (S)-MTPA

20bR = («)-MTPA

Рисунок 18 - А. Основные ROESY-взаимодействия в молекуле аспердемина (20)

Б. Значения Д5 (6s- 6R) (Гц) для МТРА-эфиров аспердемина (20)

Абсолютная конфигурация соединения 20 была установлена с помощью модифицированного метода Мошера. Взаимодействие с (R)- и (5)-МТРА-хлорангидридами привело к этерифнкация гидроксильной группы при С-1 с образованием (S)- и (R)-МТРА-эфиров, соответственно. Разница значений химических сдвигов для S- и Л-МТРА эфиров (рис. 18Б) позволила определить конфигурацию С-1, как S. Учитывая данные ROESY-экспериментов, конфигурации остальных асимметрических центров были установлены как 5(5), 6(й), 8(Я), 9(/?), 10(/?). Соединение 20 было названо аспердемином.

Кроме аспердемина (20) из гриба Aspergillus versicolor были выделены два известных соединения - диорцин и виридикатол. Оба метаболита ранее были описаны для многих грибов рода Aspergillus, в том числе Aspergillus versicolor.

3.6. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Curvularia

inaequciHs

Изолят гриба Curvularia inaequalis был выделен из образца грунта, собранного в Охотском море у побережья о. Шикотан.

Из этилацетатного экстракта гриба С. inaequalis, культивированного на среде авизованном пивном сусле были выделены шесть известных соединений - (+)-фомалактон, курвулапирон, радицинин, (-)-асперпентин и цинодонтин.

Структурная индентификация соединений была проведена на основании данных одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Абсолютная конфигурация стереоцентров (-)-асперпентина была подтверждена методом Мошера.

3.7 Установление строения индивидуальных соединении нз гриба JVardomyces inflatus

Штамм гриба Wardomyces inflatus был изолирован из образца грунта, собранного в Сахалинском заливе Охотского моря.

Из гриба W. inflatus при культивировании на агаризованном пивном сусле было выделено одно известное соединение - эуяваникол А.

Структурная индентификация эуяваникола А была проведена на основании данных одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Абсолютная конфигурация всех хиральных центров эуяваникола А была подтверждена методом Мошера.

3.8. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Penicillium citrinum

Изолят гриба Penicillium citrinum был выделен из образца грунта, собранного при кернении метановых газогидратных залежей в Охотском море.

Из гриба P. citrinum был выделен один известный метаболит - 3,5-диметил-8-метокси-3,4-дигидро- 1Н-изохромен-6-ол.

Структурная индентификация соединения была проведена на основании данных одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

3.9. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Acremonium roseum

Изолят гриба Acremonium roseum был выделен из образца грунта, собранного в заливе Пильтун Охотского моря.

Из гриба A. roseum, культивированного на рисовой среде, были получены два известных стероида - пероксид эргостерина и эргост-6,8,22-триен-3р-ол.

Структурная индентификация соединений была проведена на основании данных одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

3.10 Биологическая активность выделенных соединений

Биологическая активность метаболитов Isarittfelina.

Показано, что оксирапентины А и D ингибируют рост грамположительных бактерий (Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis) с МИК 150 и 140 мкМ, соответственно.

Исарикетид А проявил цитотоксическое действие на клетки THL-1 и HL-60 с HKjo 37.4 и 4.3 мкМ, что сравнимо с активностью цисплатина, использованного в качестве положительного контроля.

Оксирапентин А проявил умеренное цитотоксическое действие против клеток SK-Mel-5, SK-Mel-28, T-47D с ИК5о 19, 17 и 25 мкМ, соответственно, что в 7-15 раз ниже, чем показано для цисплатина.

Оксирапентины A, D, F и J на 100% ингибировали образование колоний клеток SK-Mel-28 в субцитотоксических концентрациях (10, 200, 200 и 100 мкМ, соответственно). Вещество сравнения дакарбазин в концентрации 200 мкМ не показал значительного влияния на образование колоний клеток.

Для оксирапентина J показана способность индуцировать экспрессию белка теплового шока Hsp70 в концентрации 100 мкМ.

Биологическая активность метаболитов Aspergillus carneiis.

Показано, что этилаверантин и 6,8-ди-О-метилаверуфин ингибируют рост клеток карциномы Эрлиха с ЭД50 15.8 и 47.8 мкМ, соответственно.

Для стернгматоцистина показано цитостатическое действие на яйцеклетки морских ежей. В концентрации от 71.0 мкМ стеригматоцистнн на 100% останавливал развитие оплодотворенных яйцеклеток на стадии 4 бластомера.

Биологическая активность метаболитов Myceliopltthora lutea.

Показано, что изоакремин D токсичен в отношении бактерии Staphylococcus aureus с МИК 970.9 мкМ).

Впервые показано ингибирующее влияние изоакремина D, акремина А и спироакре-минов А и В на оплодотворяющую способность сперматозоидов морского ежа (ИК50 = 194.2,221.2, 66.4 и 132.7 мкМ, соответственно).

Цитостатическую активность в отношении яйцеклеток Strongylocentrotus intermedins показал изоакремин D. При действии его в концентрации 242.7 мкМ только 35-50 % эмбрионов проходили стадию бластулы.

Биологическая активность метаболитов Aspergillus versicolor.

Показано ингибирующее влияние диорцина (ИК50 0.078 мМ) на оплодотворяющую способность сперматозоидов морских ежей Strongylocentrotus intermedins.

Для диорцина была также определена цитотоксическая активность в отношении клеток селезенки мышей линии CD-I с МИК 0.11 мМ.

Биологическая активность метаболитов Curvularia inaequalis.

(+)-Фомапактон, курвулапирон и радицинин проявили цитотоксическое действие против клеток карциномы Эрлиха при ЭД50 138, 264 и 198 мкМ, соответственно.

Биологическая активность метаболитов Wnrdomyces injlatus.

Эуяваникол А проявил слабое цитотоксическое действие на развивающиеся эмбрионы морских ежей Strongylocentrotus intermedins, в концентрации 13.9 мкМ оказав 100 % ингибирование деления оплодотворенных яйцеклеток ежа на стадии 4-х бластомеров.

ВЫВОДЫ

1. Из грибов-микромицетов, выделенных из образцов грунта, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях отобраны восемь перспективных штаммов-продуцентов вторичных метаболитов: Isaria felina КММ 4639, Aspergillus carneus, Ну-celiophthora lutea, A. versicolor KMM 4647, Cunnilaria inaequalis, Wardomyces injlatus, Pénicillium citrinum и Acremonium roseum.

2. Выделено 40 индивидуальных соединений различной химической природы. Установлено строение 18 новых низкомолекулярных вторичных метаболитов. Проведена структурная идентификация 22 метаболитов с известными веществами.

3. Установлено строение 10 новых хроменовых производных оксирапентинов В-К, двух пирановых поликетидов исарикетидов А и В и бензофурана акремина S из гриба 1. felina. Показано наличие редкой для природных соединений 4,6,8-ортоацетатной группы в структуре оксирапентина D. Предложена возможная схема биосинтеза оксирапентинов А-К и акремина S из общего пренилфенольного предшественника, а также исарикетидов А и В из предполагаемого пентакетидного предшественника.

4. Установлено строение двух новых поликетидов варатерпола В и глицерилдиорци-новой кислоты и нового декалинового производного декумбенона D из гриба Aspergillus carneus. Глицерилдиорцнновая кислота является первым глицериновым производным орциновых эфиров.

5. Установлено строение нового бензофуранового производного изоакремина D из гриба M. lutea.

6. Установлено строение нового меротерпеноида аспердемина из гриба A. versicolor.

1. Показано, что метаболит I. felina исарикетид А обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток HL-60 и ТНР-1, сопоставимой с активностью цисплатина.

Основные публикации по теме диссертации

1. Сметанина О.Ф., Калиновский А.И., Кича А.А., Юрчеико А.Н., Пивкин М.В., Кузнецова Т.А. Производное дегидродекалина из морского изолята гриба Wardomyces inflatus // Химия природ, соединений. 2009. № 5. С. 621-631.

2. Юрчеико А.Н., Сметанина О.Ф., Калиновский А.И., Пивкин М. В., Дмитренок П. С., Кузнецова Т. А. Новый меротерпеноид из морского гриба Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. //Изв. АН Сер. хим. 2010. № 4. С. 834-838

3. Сметанина О.Ф., Юрчеико А.Н., Пивкин М.В., Юрченко Е.А., Афиятуллов Ш.Ш. Изохроменовый метаболит факультативного морского гриба Pénicillium citrinum II Химия природ, соединений. 2011. № 1. С. 106

4. Сметанина О.Ф., Юрчеико А.Н., Калиновский А.И., Бердышев Д.В., Герасименко А.В., Пивкин М. В., Слинкина Н.Н., Дмитренок П. С., Мензорова Н.И., Кузнецова Т. А. Биологически активные метаболиты морского изолята гриба Myceliophthora lulea II Химия природ, соединений. 2011. № 3. С. 345-349.

5. Smetanina О.F., Yurchenko A.N., Afiyatullov Sh.Sh., Kalinovsky A.I., Pushilin M.A., Khudyakova Yu.V., Slinkina N.N., Ermakova S.P., Yurchenko E.A. Oxirapentyns B-D produced by a marine sediment-derived fungus Isaria felina (DC.) Fr. // Phytochem. Lett. 2012. V. 5. P. 165-169.

6. Юрчеико A.H., Сметанина О Ф., Худякова Ю.В., Киричук H.k., Афиятуллов Ш.Ш. Тритерпеноидные метаболиты морского изолята гриба Acremonium roseum Petch. // Химия природ, соединений. 2012. № 6. С. 982-983

7. Юрчеико А.Н., Сметанина О Ф., Худякова Ю.В., Киричук Н.Н., Юрченко Е.А., Афиятуллов Ш.Ш. Метаболиты морского изолята гриба Curvularia inaequalis И Химия природ, соединений. 2013. № 1. С. 144—145

8. Юрченко А.Н., Сметанина О Ф., Худякова Ю.В., Киричук Н.Н., Чайкина Е.Л., Анисимов М.М., Афиятуллов Ш.Ш. Новый оксирапентин Е из морского изолята гриба Isaria felina II Химия природ, соединений. 2013. № 5. С. 738-740

9. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Pushilin M A., Glazunov V.P., Khudyakova Y.V., Kirichuk N.N., Ermakova S.P., Dyshlovoy S.A., Yurchenko E.A., Afiyatullov S.S. Oxirapentyns F-K from the Marine-Sediment-Derived Fungus Isaria felina KMM 4639 //J. Nat. Prod. 2014. V. 77, No. 6. P. 1321-1328.

Тезисы докладов

1. Юрчеико A.H., Сметанина О.Ф. Новые оксирапентины B-G из факультативного морского гриба Isaria felina KMM 4639 // XIV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. МЭС ТИБОХ, 11-18 сентября 2012 г.: сборник трудов. Владивосток: ДВО РАН, 2012. С. 68.

2. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Ermakova S.P., Afiyatullov Sh.Sh. New oxirapentyns B-G from marine-derived fungus Isaria felina KMM 4639 // IV Annual Russian-Korean Conference "Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology", Novosibirsk, 18-21 of September, 2012: book of abstracts. Novosibirsk, 2012. P. 68

3. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Ermakova S.P., Afiyatullov Sh.Sh. Biologically active compounds from marine-derived fungi from the South China Sea // 2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam, Hanoi, 5-6 of June, 2013: book of abstracts. Hanoi, 2013. P. 82-86

4. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Kirichuk N.N., Afiyatullov Sh.Sh. Biologically active substances from marine-derived fungi from far eastern seas // 2nd International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, September 4-9, 2013: Pro-gramm&Abstracts. Vladivostok: Dalnauka, 2013. P. 34.

Юрченко Антон Николаевич

Биологически активные метаболиты факультативных морских грибов, выделенных из грунтов дальневосточных морей

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 21.10.2014. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 499.

Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10