Синтез и изучение свойств оксилипинов грибной и растительной природы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

9

На правах рукописи

Гроза Наталья Викторовна

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ОКСИЛИПИНОВ ГРИБНОЙ И РАСТИТЕЛЬНОЙ ПРИРОДЫ

02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□031Т6834

Москва-2007

003176834

Работа выполнена на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им НА Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им М В Ломоносова и в лаборатории по исследованию эйкозаноидов отделения гинекологии университетского медицинского центра им Бенджамина Франклина Свободного Университета (Берлин, Германия)

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Мягкова Галина Ивановна

Официальные оппоненты

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Степанов Александр Евгеньевич

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Терешина Вера Михайловна

Ведущая организация НИИ Физико-химической биологии

им А Н Белозерского Московского государственного университета им МВ Ломоносова

Защита состоится «_24_» декабря 2007 г в _J_5_ часов на заседании Диссертационного Совета Д 212 12001 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им MB Ломоносова по адресу 119571, Москва, пр Вернадского, д 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им М В Ломоносова С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www mitht ru

2/

Автореферат разослан « » ноября 2007 г

*

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник /) /) Лютик А И

Общая характеристика работы* Актуальность проблемы. Микозы сопровождают человеческую цивилизацию не одно тысячелетие Возбудителями микозов являются микроскопические грибы, одноклеточные или многоклеточные эукариоты -хемоорганогетеротрофы по способу питания В настоящее время наблюдается значительный рост заболеваемости микозами из-за миграции населения и изменения образа жизни в индустриальных странах Особенно ощутим вред микозов в трансплантологии, онкогематологии, неонаталогии, а наиболее распространенные возбудители микозов, такие как дрожжи Candida spp, уверенно вытесняют с лидирующих позиций внутрибольничных бактериальных возбудителей Микозы лидируют в структуре СПИД-ассоциированных патологий, поражая организм, лишенный иммунной защиты Для разработки эффективных подходов к терапии и диагностике микологических инфекций актуальным является фундаментальное изучение метаболических и сигнальных процессов, определяющих вирулентные свойства, механизмы развития и патогенеза болезнетворных грибов.

В последнее время интенсивно исследуется липидный метаболизм грибов с целью выявления потенциальных клеточных мишеней, знания о которых могут открыть перспективы создания новых фунгицидных или фунгистатических препаратов Особенное внимание привлекают оксилипины,

* В руководстве работой принимал участие с н с , к х н Иванов И В Список сокращений СОХ — циклооксигеназа, DiHETE - дигидроксиэйкозатетраеновая кислота, DMF - диметияформамид, ЕЕТ - эпоксиэйкозатетраеновая кислота, GC-MS -хромато-масс-спектрометрия, HETE - гидроксиэйкозатетраеновая кислота, HTDE -гидрокситетрадекадиеновая кислота, HODE - гидроксиоктадекадиеновая кислота, НОТгЕ -гидроксиоктадекатриеновая кислота, НМРА - гексаметилтриамид фосфорной кислоты, LOX - липоксигеназа, PGB2 - простагландин Вг (9-оксо-(155)-гидрокси-проста-(52,8(12),13£/)-триен-1-овая кислота), PGE2 - простагландин Ез (9-оксо-(1 la,15SJ-дигидрокеи-проста-(52,13£^-диен-1-овая кислота), THF - тетрагидрофуран, TMS -триметилсилильный, ТпНЕТЕ - тригадроксиэйкозагетраеновая кислота, prCOX-2-pLUC -репортерный вектор, содержащий промоторную конструкцию гена сох-2, лигированную с геном люциферазы, PPARy D/N - плазмида, содержащая точечную мутацию в кодирующей области гена белка PPARy (изоформы рецептора PPAR), IKK D/N - плазмида, содержащая точечную мутацию в 1кВ киназном домене IKK-белкового комплекса, ответственного за фосфорилирование процессингового протеина, обеспечивающего действие транскрипционного фактора NF-кВ, prNF-xB-pLUC - репортерный вектор, содержащий промоторный участок гена nf-кВ транскрипционного фактора NF-кВ, лигированный с геном люциферазы, AK (АА) - арахидоновая кислота ((5Z,SZJ1 Z. 142)-эйкозатетраеновая), ПНЖК - природные полиненасыщенные жирные кислоты

3

представляющие широкое семейство окисленных производных полиненасыщенных жирных кислот и выполняющие регуляторную и сигнальную функции в организме животных, растений и грибов Среди них гидроксилипины - гидроксипроизводные жирных кислот - наиболее распространены в царстве грибов и играют важную роль в процессах роста и развития этих микроорганизмов (Tsitsigianms et al, 2007) 3- и 18-Гидроксиполиеновые кислоты были обнаружены как продукты трансформации эндогенных и экзогенных жирных кислот в некоторых видах микроскопических грибов и дрожжей (Mucor genevensis, Dipodascopsis uninucleata, Lipomyces yarrowi, Candida albicans, Gaeumannomyces gramims), показано их участие в росте и морфогенезе грибов, а также в модуляции защитных реакций клеток млекопитающих (Deva et al, 2000) Для изучения процессов окисления липидных компонентов клеточных мембран растений и грибов, а также с целью выяснения механизмов действия биологически активных оксилипинов необходимы препаративные количества образцов этих соединений, что делает актуальным поиск эффективных методов их получения

Оксилипины, являющиеся производными длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот, достаточно трудно выделить из природных источников в количествах, необходимых для проведения биохимических исследований Поэтому для изучения механизмов биосинтеза липидных метаболитов в грибах и трансдукции сигналов в животных клетках при микозном поражении актуальной задачей является разработка новых подходов к химическому (в том числе препаративному), ферментативному, микробиологическому синтезу 3-гидрокси- и 18-гидроксипроизводных жирных кислот, их предшественников и изотопно-меченных аналогов

Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им НА Преображенского МИТХТ им MB Ломоносова в рамках бюджетной темы № 1Б-4-355 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины», по грантам РФФИ 02-03-33138, 04-03-32454,

05-03-32392, президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2013 2003 3, а также частью работ, выполняемых в плане проекта по исследованию 3-гидроксиполиеновых жирных кислот в лаборатории эйкозаноидов кафедры гинекологии медицинского университетского центра Свободного Университета Берлина (Германия) при поддержке У\У-фонда (грант N1-1/77643)

Цель работы. Цель настоящей работы состояла в синтезе, наработке и изучении биохимических свойств новых и известных 3- и 18-гидроксилипинов природной структуры Основными задачами исследования явились

1) разработка новых методических подходов к химическому и ферментативному синтезу, в том числе препаративному, 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных,

2) изучение метаболизма полученных 3- и 18-гидроксиполиеновых кисло!1 в дрожжах, характеристика профиля образующихся метаболитов и кинетйкй окислена гидроксикислот,

3) исследование ферментативных превращений синтезированных З-гидроксшшпинов и их аналогов с использованием оксигеназ млекопитающих, определение влияния 3-гидроксикислот на передачу сигналов в животных клетках на моделях хозяин-патоген

Научная новизна.

-Разработаны новые схемы получения и осуществлен препаративный химический синтез

а) оптически активных 3-гидроксилипияов 3(/?)-гидрокси-(5Д82,112,142)-зйкозатеграеновой кислоты (3(/?)-НЕТЕ) и ее аналогов, 3(/?)-гидрокси-(52,82>тетрадекадиеновой кислоты (3(/?)-НТТ)Е) на основе полиацетиленовых предшественников с использованием оптически активных исходных синтонов,

б) 18-гидроксипроизводных арахидоновой кислоты 18-гидрокси-(52,82,11г,142)-эйкозатетраеновой кислоты (18-НЕТЕ), 3(Я),18(Д/5)-дигидрокси-(52,82,11X,142)-эйкозатетраеновой кислоты (3,18-В1НЕТЕ) и их аналогов,

в) ffl-гидроксипроизводных линолевой и а-линоленовой кислот -18-гидрокси-(92,122Г)-октадекадиеновой кислоты (18-HODE) и 18-гидрокси-(9Z, 12Z, 152)-октадекатриеновой кислоты (18-НОТгЕ)

-Впервые получены кратно-меченные тритием аналоги 3-НЕТЕ и 3,18-DiHETE

-Разработан способ ферментативного получения дигидроксипроизводных ПНЖК на примере окисления 3-НЕТЕ соевой 15-LOX Впервые получена 3(/?),15(5)-дигидрокси-(57,82,1 12,13£)-эйкозатетраеновая кисло га

(3,15-DiHETE), подобраны условия для ее выделения с применением ВЭЖХ на хиральной фазе

-Впервые установлено, что дрожжи Dipodascopsis uninucleata и условно-патогенный штамм Candida albicans способны синтезировать ди- и тригидроксиполиеновые продукты из экзогенных моногидроксиполиеновых жирных кислот Определены кинетические параметры взаимодействия синтезированных жирнокислотных субстратов с клетками дрожжей С albicans, показано, что 3-НЕТЕ является хорошим субстратом для С albicans -Впервые показано, что 3-НЕТЕ и ее производные подвергаются ферментативной трансформации под действием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих с образованием метаболитов, аналогичных продуктам окисления арахидоновой кислоты.

-Установлена принципиальная возможность участия 3-гидроксикислот в трансдукции сигналов при взаимодействии хозяин-патоген, и впервые показано, что 3-НЕТЕ является модулятором клеточных сигналов и миметиком арахидоновой кислоты при взаимодействии с клетками млекопитающих

Практическая значимость. Практическое значение представляют разработанные универсальные подходы к химическому синтезу ациклических производных природных полиненасыщенных кислот, основанные ьа ацетиленовой стратегии и позволяющие получать аналоги арахидоновой, линолевой, линоленовой кислот, в том числе радиоактивно-меченные и модифицированные заместителями и функциональными группировками с различной степенью гидрофильности, предназначенные для исследования механизмов биологического действия оксилипинов Способы химического и

ферментативного синтеза оксилипинов, а также методы очистки целевых продуктов, разработанные в ходе выполнения исследования, позволяют нарабатывать индивидуальные образцы этих соединений в количествах, достаточных для проведения биохимических исследований, важных для медицины Полученные данные по изучению метаболизма и ферментативной трансформации оксилипинов природной структуры могут быть использованы при поиске новых малотоксичных соединений с потенциальной фармакологической активностью Основные положения, выносимые на защиту.

1 Разработка новых путей препаративного химического синтеза природных 3- и 18-гидроксилипинов, а также их аналогов и кратно-меченных тритием производных

2, Разработка способа ферментативного получения

3,15-дигидроксиэйкозатетраеновой кислоты на примере окисления 3-НЕТЕ при помощи соевой 15-LOX, оптимизация условий выделения DiHETE с применением ВЭЖХ

3 Изучение метаболизма синтезированных 3- и 18-гидроксилипинов в клетках дрожжей, выделение продуктов и исследование кинетики окисления гидроксикислот

4 Исследование ферментативной трансформации синтезированных оксилипинов с использованием оксигеназ млекопитающих, выделение и идентификация продуктов оксигенации

5 Изучение влияния 3-гидроксипроизводных жирных кислот на трансдукцию сигналов в животных клетках с применением известных биологических моделей и репортерных систем

Публикации. Результаты работы отражены в 12 публикациях, в том числе в 3 статьях в зарубежных журналах, 1 статье в российском журнале и 8 тезисах докладов на международных и российских научных конференциях Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международном симпозиуме «Recent BioMedical Advances in Eicosanoid Research» (Берлин, 2002), на VIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии 2002» (Уфа, 2002), на I Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2003), на

XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), на Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова (Москва, 2004)

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на стр машинописного текста, содержит рисунков, 3 таблиц, £ схем, состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего ссылок

Результаты работы и их обсуждение

Перспективность изучения влияния жирнокислотных метаболитов на трансдукцию сигналов и формирование ответа в клетке, низкое содержание их в природных источниках, отсутствие высокочистых стандартов, трудности биотехнологического получения, малоэффективность известных способов синтеза оксилипинов и изотопно-меченых аналогов стимулировали проведение исследований в области их химического и ферментативного синтеза Для исследования механизмов ферментативной трансформации и биологических эффектов оксилипинов в клетках млекопитающих и грибов в качестве субстратов были выбраны жирнокислотные производные грибного происхождения и их аналоги оптически активные Я-энантиомеры -3(Д)-ШТ>Е, 3(Д)-НЕТЕ, 3(Д),18(/?/5)-01НЕТЕ и их кратно-меченные тритием производные, а также 18-НЕТЕ - в качестве инструмента для изучения биосинтеза БйЕТЕ С целью исследования механизмов защиты высших растений от грибковых и бактериальных патогенов были синтезированы со-гидроксияьные производные эндогенных полиненасыщенных кислот растительного происхождения 18-НСЮЕ и 18-НОТгЕ

1. Синтез 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных

Особенности строения минорных природных полиеновых кислот и оксилипинов потребовали разработки новых универсальных схем их синтеза Основные задачи химического синтеза ациклических полиненасышенных

соединений заданной структуры, в том числе изотопно-меченых, представлены на рис 1

К настоящему времени имеется достаточное количество публикаций, посвященных синтезу гидроксилированных метаболитов арахидоновой кислоты Так как в природных объектах найдены производные жирных кислот с различной конфигурацией центров асимметрии, подходы к их синтезу должны являться регио- и стереоспецифичными Основной структурной особенностью природных эйкозаноидов этого класса является наличие системы метиленразделенных Z,Z- (ЕЕТ, HETE, 18/20-гидрокси-АК) или сопряженных £,2-двойных связей (DiHETE) Существует три основных подхода к химическому синтезу ациклических производных ПНЖК Первый способ («биомиметический») основывается на модификации природных эйкозаноидов, что требует выделения труднодоступных исходных соединений (Manna et al, 1983) Другим более общим и широко используемым способом получения является конденсация по Виттигу, с помощью которой были синтезированы 16-, 17- и 18-гидроксиэйкозатетраеновые кислоты (Несктап et al, 1996)

Рис 11- етереоселективное введение (Л)-гидрокси- или метокси-группы в положение 3, 2 - создание системы метиленразделенных г^мс-двойных связей с использованием водорода или трития, 3 - изменение количества двойных связей п = 1, 2, 3, 4 - введение гидроксигруппы в положение ю-З, 5 — получение жирных кислот и их аналогов, отвечающих шЗ или шб природной структуре, 6 - введение гидроксильной группы в ю-положение

Однако этот метод не дает возможности получения кратно-меченных изотопами аналогов оксилипинов, а также достаточной энантиомерной чистоты синтезируемых продуктов В нашей лаборатории предложен третий метод создания г/ис-двойных связей при синтезе эйкозаноидов и родственных соединений, основанный на стереонаправленном восстановлении ацетиленовых предшественников ПНЖК (Иванов и др, 1995), который получил развитие в настоящей работе благодаря применению новых хиральных и бифункциональных ключевых синтонов и позволил получить кратно-меченные тритием оксилипины (схема 1)

Схема 1

гсн2)5со2я

COjH

R-=4cHz)3co2h r= -ссн2)«со2н

XX

/ ■

,со2н

X=-Ii-3H

у=-оя -оснз

Z= -ОН -OBz

По данной методологии ключевая реакция кросс-сочетания сопровождается образованием высокореакционноспособных медных комплексов [RC=CCuX]"M+ терминальных ацетиленов без их предварительного металлирования и пропаргильных иодидов in situ, что позволяет проводить конденсации с высокими выходами (75-89%) в достаточно мягких условиях, а также применять в качестве пропаргильных компонентов тозилаты и галогениды Также синтетическое исследование

10

решало задачу расширения границ метода для создания функционализированных полиненасыщенных структур

Для получения ациклических дигидроксиполиеновых кислот из монофункционализированных ПНЖК в данной работе были применены методы ферментативного синтеза, широко используемые в настоящее время для получения различных метаболитов длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот

1 1 Полный химический синтез 3-гидроксиполиеновых кислот и их аналогов

Ранее был осуществлен химический синтез 3(Я)-НЕТЕ, основанный на трансформации 5,6-эпокси-АК (ВкаП ег а1, 1998) Однако этот метод не позволяет получать 3-гидроксипроговодные меченных или короткоцепных жирных кислот Нами была разработана новая схема химического синтеза 3-гидроксиполиеновых соединений, основанная на полиацетиленовой стратегии, и получены оптически активные 3(Я)-гидрокси-(52,82,112,142)-эйкозатетраеновая (3(Я)-НЕТЕ, 9а) (схема 2А) и 3(7?)-гидрокси-(52,82)-тетрадекадиеновая (3(Л)-НТБЕ, 14) кислоты (схема 2Б) природной структуры В качестве исходного материала для получения ключевого хирального синтона 5 был выбран (/?)-(-)-эпихлоргидрин (1), оксирановый цикл которого был раскрыт реакцией с этинилтриметилсилилбораном, образующимся из этинилтриметилсилана 2 под действием ВиГл в присутствии эфирата трехфтористого бора (Yamaguchl а!, 1983) В результате удаления ТМБ защиты с ацетиленовой группы был получен хлорашшкоя 3 Замещение хлора на цианогруппу давало цианид 4, омыление и последующее метилирование которого приводило к соединению 5 В соответствии с разработанной нами стратегией получение полиацетиленовых предшественников 3(Л)-гидроксикислот 7 и 12 проводили с использованием кросс-сочетания оптически активного гидроксилсодержащего ацетиленового соединения - метил-3(/?)-гидрокси-5-гексиноата (5) и пропаргильных бромидов 1-бром-тетрадека-2,5,8-триина (6) или 1-бром-2-октина (11) с последующим гидрированием на катализаторе Линдлара и омылением метиловых эфиров 8 и 13 Синтезированные полиеновые соединения 8 и 13

были дополнительно очищены при помощи препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе

Схема 2 А

он

VA.

■Cl

83'

^COOCHo

ОН

VXCN

ОН

^Ч^Дх^СООСНз

80 % 5 +

64% / h 79 % \ е

3Н 3Н3Н 3Н 9Н ' ' ' .СООН

3Н 3Н 3Н 3Н 10

ОН

СООСНз

77%/ g 89 %\f

QCH3

■СООН

ОН

СООН

96

(a) 1) TMSCaCH (2), n-BuLi, BF3 Et20, THF, -78°C, 40 мин, 2) NH4F, THF, 20°C, 2 ч,

(b) NaCN, 18-краун-6, CH3CN, 80°C, 4 ч, (с) 1) NaOH, Зч, 90°C, 2) CH2N2, EtjO, (d) Cul, Nal, K2C03 DMF, 20°C, (e) Н2/кат Линдлара, хинолин, бензол, 10°С, (f) LiOH, МеОН, 20°С, 8ч, (g) 1) Mel, NaH, DMF, 20°C, 2) LiOH, MeOH, 20°C, 20 ч (h) 1) Т2/кат Линдлара, хинолин, бензол, 400 гПа, 2) LiOH, МеОН, 20°С

Метоксильный аналог 3(7?)-НЕТЕ (96) бьш получен действием иодистого метила на полиен 8 в присутствии гидрида натрия с последующим щелочным омылением Кратномеченный тритием аналог 3(/?)-НЕТЕ -[5,6,8,9,11,12,14,15-3Н]-3(Я)-гидрокси-(5г, 8Z, 11Z, 142)-эйкозатетраеновая кислота (10) — со специфической молярной радиоактивностью 1 65 Ки/ммоль была получена при использовании в процессе гидрирования полиинового предшественника 7 газовой смеси тритий/водород, содержащей 1% трития*,

"■Получение меченных тритием 3-гидроксиполиеновых кислот проводили под руководством ведущего научного сотрудника лаборатории изотопно-модифицированных физиологически активных веществ Института молекулярной генетики РАН д х н Шевченко В П

с последующим омылением (схема 2А) В ходе синтеза не наблюдалось рацемизации по С-3 положению, что было подтверждено анализом продуктов 9а, 96, 14 при помощи ВЭЖХ на хиральной фазе С целью оптимизации условий проведения ключевых реакций предварительно нами был получен рацемат 3(/У6')-НЕТЕ (9с) на основе гас-эпихлоргидрина

Схема 2 Б

(а)Си1,ад,К2СОз ОМР,20°С, (Ь) Н2/кат Линдлара, хинолин, бензол, «"С, (с) 1лОН, МеОН, 20°С, 8 ч

1.2 Способ ферментативного получения 3(7?),15(Л')-дигидрокси-(5Z,8Z,llZ,13J!J)-эйкoзaтeтpaeнoвoй кислоты (15а)

Для получения дигидроксипроизводных жирных кислот нами бьш разработан метод ферментативного синтеза 3,15-01НЕТЕ (15а) с применением индивидуального препарата соевой 15-ЬОХ-1 и 3(/?)-НЕТЕ (9а) в качестве субстрата (схема 3) Концентрация субстрата (9а) была увеличена в 1 5 раза, а концентрация фермента - в 2 раза по сравнению с проводимыми ранее экспериментами по липоксигеназному окислению арахидоновой кислоты (1уапоу еь а!, 1998), так как 3-гидроксиарахидоновая кислота является худшим субстратом для липоксигеназы Продукт ферментативной реакции 15а был выделен после очистки с применением ВЭЖХ на обращенной фазе с выходом 34% (образование сопряженного диена фиксировали при А. 234 нм) Для дополнительного подтверждения энантиомерной чистоты 3,15-ВхНЕТЕ был получен метиловый эфир (156), подобраны условия проведения анализа этого соединения с применением ВЭЖХ на хиральной фазе элюирование

раствором гексан/этанол (10% об этанола) давало одиночный пик (Ш =31 36 мин) с оптической чистотой более 96%

Схема 3

(a) 15-LOX, боратный буфер pH 9 0, (б) CH2N2, Et20

Структура соединения была подтверждена GC-MS анализом TMS-производного продукта 156, согласно которому были идентифицированы ионные фрагменты (m/z) 175 [+CH(OTMS)CH2COOCH3], 173 [+CH(OTMS)(CH2)4CH3], а также молекулярный ион с m/z 479 [М+-15]

1.3 Химический синтез 18(Л/У)-гидрокси-(5^,82Г,11^,14^-эйкозатетра-еновой кислоты (26), 3(Ä),18(ii/S)-ÄHrHflpoKCH-(5Z,8Z,llZ,14Z)-3ftK03a-тетраеновой кислоты (29) и ее меченного тритием аналога (31)

Были разработаны новые универсальные подходы к химическому синтезу 18-гидрокси-(52,82,112,142)-эйкозатетраеновой кислоты (18-НЕТЕ, 26) (схема 4), 3(R), 18(/У5>дигидрокси-(52,82,11Z, 142)-эйкозатетраеновой кислоты (3,18-DiHETE, 29) и ее кратно-меченного тритием аналога 31 (схема 5) с использованием ацетиленовой стратегии Получение рацематов 26 и 29 является приемлемым, так как разделение оптических изомеров возможно с помощью ВЭЖХ на хиральной фазе В качестве исходного компонента при синтезе 18-НЕТЕ был выбран гас-1 -хлор-З-пентанол (16), который превращали в иодид 17 по стандартной методике Алкилирование этинилтриметилсилана 2 с использованием иодида 17 и BuLi в THF/HMPA приводило к образованию триметилсилильного производного гептинола 18 Кросс-сочетание бифункционального пропаргильного фрагмента 20 с бензоилированным производным 19 давало метиленразделенный трииновый спирт 21 с выходом 74% Замена ОН-группы в соединении 21 на Вг и кросс-сочетание бромида 22 с терминальным ацетиленовым производным 23 позволили получить тетраацетиленовый предшественник 24, последующее

14

гидрирование которого на катализаторе Линдлара, а затем одновременное удаление бензоильной и метальной защитных групп в условиях щелочного гидролиза привели к 18(7?/5)-гидроксиэйкозатетраеновой кислоте 26

Схема 4

(a) Nal, ацетон, 75°С, 15 ч, (b) TMSCsCH (2), n-BuLi, THF, НМРА, -20°С, S ч, (с) BzCl, Ру, бензол, 20°С, 10 ч, затем NH4F, THF, 20°С, 2 ч, (d) 7-бром-2,5-гептадиин-1-ол (20), Cul, Nal, К2С03 DMF, 20°С, 12 ч, (е) CBr4, PPh3, СН2С12,20°С, 1ч, (f) Cul, Nal, К2С03 DMF, 20°С, (g) Н2/кат Линдлара, хинолин, бензол, 10°С, (h) NaOH, MeOH/HjO, 20°С

Синтез 3(/г),18(й/5)-дигидрокси-(52,82,112,142)-эйкозатетраеновой кислоты (29) и ее меченного тритием аналога 31 осуществлен исходя из одного тетраацетиленового предшественника 27, полученного реакцией кросс-сочетания метил-3(й)-гидрокси-гексиноата (5) и гас-З-бензоилокси-14-бромтетрадека-6,9,12-триина (22) в присутствии иодида меди (I) Стереоспецифическое гидрирование тройных связей соединения 27 на катализаторе Линдлара при соотношении долей катализатора и субстрата 2 1 по массе с последующей очисткой восстановленного продукта при помощи ВЭЖХ на обращенной фазе приводило к бензоил-замещенному тетраеноату 28 с выходом 64% (схема 5)

Схема 5

■СООСНз

COOR

79% d

OR2

28 R^CHj, R2=Bz

29 R!=R2=H

3H 3H

86% d

OR2

30 R-i=CH3, R2=Bz

31 R<=R2=H

(a ) Cul, Nal, K2COs DM F, 20°C, (b) Н2/кат Линдлара, хинолин, бензол, (с) 3Н2/кат Линдлара, хинолин, бензол, 440 гПа, (d) NaOH, Ме0Н/Н20, 20°С

[5,6,8,9,ll,12,14,15-3H]-3(i?),18(i2/5)-flHrHflpoKCH-(5Z,8Z,llZ,14Z)-эйкозатетраеновая кислота (31) со специфической молярной радиоактивностью 1 7 Ки/ммоль была получена гидрированием соединения 27 в смеси водород/тритий (99 1), аналогично получению меченой 3(/?)-НЕТЕ (10), с последующим удалением защитных групп поглощение _ _

Î - - - - 3{R),t8{S»

a(R).18(R)

JW/Y.

V

<0 « минуты

Рис 2 ВЭЖХ метилового эфира 3(К), 18(/?А)-В1НЕТЕ на хиральной фазе Опга1 Раек АО (ВА1СЕЬ, Франция), подвижная фаза гексан/этанол (10% об этанола), X 210 нм

Рацемат 29 был разделен на оптические изомеры с применением ВЭЖХ на хиральной фазе, индивидуальные Я,Я- и Д5-изомеры выделены с оптической чистотой более 97%. Как видно из рис 2, разница во временах удерживания двух диастереомеров невелика Однако данный метод позволяет получать количества оптически чистой ЮШЕТЕ, достаточные для проведения биохимических исследований

1.4. Синтез ш-гидроксильных производных линолевой и ос-линоленовой кислот

На основе полиацетиленовых предшественников была разработана универсальная схема получения 18-гидроксипроизводных природных полиненасыщенных жирных кислот 18-гидрокси-(92,122,152)-октадекатриеновой кислоты (18-НОТгЕ, 39) и 18-гидрокси-(9/, 12/)-октадекадиеновой кислоты (18-НООЕ, 40) (схема 6) Полиацетиленовые предшественники 37 и 38 были получены с использованием реакции кросс-сочетания единого для двух полиненасыщенных кислот пропаргильного фрагмента 35 с 3,6-гептадиин-1-олом (34) и 6-гептин-1-олом (36), соответственно

Схема 6

.СООН

/=Хсо

-СООН

-ОН

3,6-Гептадиин-1-ол (34), в свою очередь, получали с применением реакции кросс-сочетания З-бутин-1-ола (32) и 1-тозилокси-З-триметилсилил-2-пропина (33) с последующим удалением триметилсилильной защиты Каталитическое гидрирование метиловых эфиров полиацетиленовых кислот 37 и 38 на катализаторе Линдлара в присутствии хинолина и их последующее омыление приводило к образованию полиненасыщенных жирных кислот 39 и 40, соответственно (схема 6) Структура всех полученных соединений была охарактеризована и подтверждена данными 'Н-, 13С-ЯМР-спектров, масс-спектров и элементного анализа

Таким образом, была разработана синтетическая стратегия получения природных 3- и 18-гидроксилипинов, дигидроксиполиеновых кислот и их кратно-меченных тритием аналогов Схемы синтеза позволяют получать ациклические производные жирных кислот с различной длиной цепи, варьировать функциональные заместители, количество и положение двойных связей путем подбора синтетических блоков с заданными структурными характеристиками Оптимизация условий выделения оксилипинов, в том числе оптически активных, с помощью ВЭЖХ позволила получить эти соединения в препаративных количествах для использования в биологических исследованиях

2. Изучение ферментативной трансформации, метаболизма 3- и 18-гидроксилипинов и их влияния на передачу сигналов в клетках млекопитающих*

З-Гидроксипроизводные жирных кислот играют важную роль в процессах адгезии, роста и репродукции клеток дрожжей Вместе с тем остаются невыясненными как механизмы взаимодействия патогенных грибов с животными тканями, так и возможность трансформации грибных оксилипинов ферментами окисления липидов млекопитающих Актуальным в этой связи является изучение метаболизма оксилипинов в грибах, продуктов взаимодействия оксилипинов с оксигеназами млекопитающих, оксилипин-

* Эксперименты были выполнены в лаборатории по исследованию эйкозаноидов (рук РЬ Б С Нигам) отделения гинекологии университетского медицинского центра им Бенджамина Франклина Свободного Университета Берлина

ассоциированной трансдукции сигналов в животных клетках с целью выявления механизмов патогенеза болезнетворных грибов.

2.1. Исследование ферментативной трансформации 3-гидрокси-эйкозатетраеновон кислоты (9с) и ее аналогов с использованием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих

С целью выяснения возможности участия 3-гидроксикислот в ферментативном каскаде окисления липидов млекопитающих были проведены исследования по окислению З^.^-НЕТЕ (9с) и ее метилового эфира очищенными ферментными препаратами липоксигеназ млекопитающих. Были использованы липоксигеназа лейкоцитов свиньи (/(125)-ЬОХ) и эпидермальная липоксигеназа ((12Л)-ЬОХ), полученная генноинженерным методом. Продукты окисления были выделены с помощью экстракции и последующей ВЭЖХ на обращенной фазе. Наличие 3-гидроксигруппы было установлено с применением хромато-масс-спектрометрии. Было обнаружено образование конъюгированного диена, 3,12-ОШЕТЕ (41) (рис. 3).

3,12Л)ЩЕТЕ

3" -

минуты

Рис. 3. Аналитическая ОФ ВЭЖХ продуктов окисления 3(Л/5)-НЕТЕ под действием /(125)-ЬОХ (А); метилового эфира 3(Л/5)-НЕТЕ - под действием (12Л)-ЬОХ (В) и /(125)-ШХ (С), подвижная фаза Ме0Н/Н20/АсОН (80:20:0.1% об.)

минуты

Рис. 4. ВЭЖХ на хиральной фазе заметилированных образцов 3,12-В1НЕТЕ, образованной действием /(125)-ЬОХ (А), (12Л)-ЬОХ (В), подвижная фаза гексан/этанол (10% об. этанола)

Анализ дигидроксшсислот с применением ВЭЖХ на хиральной фазе не показал предпочтительного окисления R- или .S'-энантиомера по С-3 положению жирной кислоты какой-либо из липоксигеназ (рис 4)

Также были проведены исследования по взаимодействию 3(Л)-метокси-ЕТЕ (96) с овечьей циклооксигеназой СОХ-2 Продукты окисления были выделены при помощи известного метода (Hamberg et al, 1998) и затем разделены с применением ВЭЖХ на обращенной фазе Структура полученных продуктов установлена с использованием GC-MS анализа метиловых эфиров их TMS-производных Соединения были идентифицированы как простагландин 3(/?)-метокси-РОЕ2 (42) и 3(/?)-метокси-11(5)-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (43)

осн.

3(й)-Метокси-11(S)-HETE

yj\=A/V

он

3(R)-MeTOKCM-ll(S)-HETE (43)

° ОСНз

минуты

3(Л)-метокси-РОВ2 (44)

Рис 5 Аналитическая ВЭЖХ на обращенной фазе продуктов окисления 3(/?)-метокси-ЕТЕ (96) (100 мкМ) под действием СОХ-2 млекопитающих (20 мкг), подвижная фаза СН3СЫ/Н20/Ас0Н (85 15 0 05 % об )

Щелочной гидролиз 3(Я)-метокси-РОЕ2 (42) приводил к продукту его дегидратации/изомеризации - циклопентеноновому простагяандину 3 (/?)-метокси-РОВ2 (44), который легко детектировался при 278 нм (рис 5) Структура РвВг подтверждена данными масс-спектра его ТМБ-производного Проведенные исследования показали, что 3-гидроксиполиеновые кислоты и их аналоги могут служить субстратами для ферментов окисления липидов млекопитающих - липоксигеназ и циклооксигеназ При окислении 3-гидроксипроизводных жирных кислот образуются метаболиты, аналогичные оксигенированной АК, за исключением

наличия 3-гидроксигруппы, что, вероятно, делает их узнаваемыми для клеток грибов. Таким образом, можно заключить, что 3-НЕТЕ и ее аналоги являются миметиками арахидоновой кислоты в процессах вторичного окисления. Вследствие доступности генно инженерных ферментов энзиматический синтез 3-гидроксиэйкозаноидов открывает перспективы для изучения потенциальной биологической активности данных соединений в стимуляции клеток млекопитающих в ответ на инфекционное поражение.

2.2. Исследование метаболизма 3(Д/5)-НЕТЕ (9с) и 18(Д/5>НЕТЕ (26) в клетках дрожжей Dipodascopsis uninucleata и Candida albicans

Для выяснения путей метаболизма 3-гидроксиэйкозаноидов в клетках грибов было проведено исследование деградации рацемической 3(/?,£)-НЕТЕ (9с) дрожжами Dipodascopsis uninucleata (UOFS Y 128). Клетки на репродуктивной стадии развития инкубировали с субстратом 3(К^)-НЕТЕ, после чего определяли степень превращения R- и S-энантиомеров. Остаток 3(Я,Л')-НЕТЕ был выделен из супернатанта при помощи стандартных процедур с применением ВЭЖХ на обращенной фазе, и энантиомерный состав проанализирован с использованием ВЭЖХ на хиральной фазе.

Рис. 6. Деградация 3(&S)-HETE (9с) культурой клеток дрожжей Dipodascopsis uninucleata. ВЭЖХ на хиральной фазе (Chiral Pack AD) (CH3CN/H20/H3P04 95:5:0.1 % об.). Соотношение энантиомеров 3(S)/3(R) в %: после 6 ч 71/29; после 12 ч 78/22; после 24 ч 91/9.

поглощение

(s) (r)

минуты

Результаты ВЭЖХ показали (рис 6), что преимущественному метаболизму в дрожжах Dipodascopsis unmucleata подвергается изомер 3(/?)-НЕТЕ, в то время как 3(,S)-HETE практически не расходуется

Следующим этапом работы явилось изучение продуктов окисления АК и ее производных - 3(Д5}-НЕТЕ (9с), 18(/?,5>НЕТЕ (26) - в клетках Dipodascopsis unmucleata или Candida albicans 1386 (бронхогоолят), которые были инкубированы с жирнокислотными субстратами Ранее 3,18-DiHETE была обнаружена на стадии развития гиф в дрожжах Candida albicans как продукт трансформации экзогенной АК (Deva et al, 2000) Нами были проведены исследования на предмет обнаружения данного метаболита в разных типах дрожжей при добавлении 3-НЕТЕ в питательную среду Продукты метаболизма дрожжей были выделены при помощи модифицированного (применением этилацетата в качестве растворителя для экстракции) метода (Bhgh et al, 1959) с последующей хроматографией на обращенной фазе и препаративной тонкослойной хроматографией полярных компонентов на силихагеле TMS-производные метиловых эфиров продуктов окисления были проанализированы с применением GC-MS на наличие 3-гидроксиэйкозаноидов Результаты анализа ионных фрагментов позволили идентифицировать 3,18-DiHETE, 3,18,20-TriHETE (полученные в результате трансформации АК, 3-НЕТЕ и 3,18-DiHETE) как в дрожжах Candida albicans (А), так и в Dipodascopsis unmucleata (В) (рис 7) На наличие 3-гидроксиметаболитов были тестированы как клеточный лизат, так и супернатант, 3-оксилипины были обнаружены в каждой фракции Важным представляется тот факт, что Di- и Тп-НЕТЕ экскретируются в межклеточное пространство и, по-видимому, участвуют в передаче клеточных сигналов При сравнении масс-спектров 3,18-DiHETE, полученной микробиологическим синтезом, со спектром химически синтезированного стандарта 3,18-DiHETE (29) установлена их полная идентичность В результате проведенных экспериментов можно сделать вывод о том, что (ю-З)-гидроксилирование полиненасыщенных кислот является общим процессом для указанных типов дрожжей

оосн АК.

сн

1)А,В

а(ощ3 о

<хоа%

MmeiFA

/=V'=\X4/oot WWW

rv-vV™

W\==/\/\/ "

3-НЕГЕ

18-HEXB (26)

l)A,B

MBfiffA

1) А, В

»(СВй

■131

-»-175

389'

Рис 7 Продукты метаболизма АК, 3-НЕТЕ, 18-НЕТЕ в клетках дрожжей

С целью определения скорости метаболизма жирнокислотных субстратов дрожжами Candida albicans оксиметрическим методом (электрод Кларка) была исследована кинетика общего поглощения кислорода клетками условно-патогенного штамма дикого типа 1386 в присутствии субстратов АК, 3(Д/£)-НЕТЕ (9с), 18(A«)-HETE (26) в диапазоне концентраций от 5 до 20 мкМ

Km Vmax

<рМ) |iM OtJ(mm xI0"«lls)

АА 6 3 ± 0 5 83+0 5

3-НЕТЕ 5.2 ± 0 9 7.8±0 8

18-НЕТЕ 13.4 ±15 «¿±07

[S] (ММ)

Рис 8 Кинетические кривые зависимости скорости поглощения 02 клетками Candida albicans от концентрации жирнокислотных субстратов Условия 0,1 М фосфатный буфер, предварительно насыщенный 02 Значения Кт и Vmax рассчитаны по уравнению Лайнуивера-Берка (1/[S] от 1 /V), исходя из результатов 4 экспериментов

Оказалось, что условные величины Кт для АК и 3(R/S)-HETE были одного порядка, тогда как для 18(/МУ)-НЕТЕ условное значение Кт было в два раза выше, а скорость поглощения кислорода ниже (рис 8) Можно предположить, что АК и 3(i£/S)-HETE являются более предпочтительными субстратами для клеток гриба Candida albicans, чем 18(йА')-НЕТЕ; и в первую очередь подвергаются клеточному метаболизму

2.3. Изучение влияния 3-гидроксилипинов на передачу сигналов в клетках млекопитающих с применением известных репортерных систем*

Следующим этапом биологических исследований было изучение влияния 3(Д/5)-НЕТЕ (9с) и 3(/?)-НЕТЕ (9а) на трансдукцию сигналов в клетках человека Известно, что циклооксигеназы (СОХ-1, СОХ-2) катализируют ключевые реакции биосинтеза простаноидов Внешние физиологически различные клеточные стимулы, такие как факторы роста, цитокины, регулируют уровень экспрессии генов сох-1 и сох-2 Повышение уровня экспрессии гена индуцибельной СОХ-2 сопровождает множество патологических и онкологических процессов ревматоидный артрит, опухоли желудка, кишечника, молочной железы С целью определения возможности модуляции активности гена сох-2 с помощью 3-гидроксилипинов было исследовано изменение уровня его экспрессии как под воздействием дрожжей Candida albicans, питавшихся субстратом АК, так и в присутствии индивидуальной 3-НЕТЕ в среде инкубации В качестве экспериментального животного объекта была выбрана культура клеток человека эпителоидной карциномы матки — Не La. клетки, которая в комбинации с С albicans является моделью вульвовагинального кандидоза

HeLa клетки подвергали временной трансфекции 1) репортерным вектором, содержащим конструкцию функциональной области гена сох-2,

лигированного с геном люциферазы (prCOX-2-pLUC), 2) либо аналогичной

*

* Плазмиды, содержащие конструкцию промотора гена СОХ-2, лигированного с геном люциферазы, и другие векторы, клонированные в Е colt, были любезно предоставлены научным сотрудником лаборатории по исследованию эйкозаноидов Свободного Университета Берлина Р Shankaranarayanan

плазмидой, содержащей функциональную область гена транскрипционного фактора NF-/rfB (prNF-AÜ-pLUC). Дополнительно применяли D/N плазмиды, содержащие нарушенные функциональные области генов: а) изоформы ядерного рецептора PPARy (PPARy D/N), б) 1кВ киназы 1КК-киназного белкового комплекса, ответственного за фосфорилирование процессингового протеина ОТ-теВ-зависимого сигнального пути (IKK D/N).

Hela+cox-2 Не!а+сох-2 Не|а+сох-2

+C3V-2 Tcav 3

Рис. 9. Контроль - нетрансфицированные HeLa клетки. Мутанты cav2, cav3 (кратность инфекции =5) инкубировали с трансфицированными 1.5 мкг плазмиды -327/+59 prCOX-2-pLUC HeLa клетками 5-6 ч при 37°С. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы-/ие/субстрат (Promega) (относительные световые единицы).

Трансфицированные HeLa клетки были заражены С. albicans (ослабленные мутанты cav2 и cav3, питавшиеся АК) или обработаны 3(Л/5)-НЕТЕ (9с), либо 3(/?)-НЕТЕ (9а), затем внутриклеточная жидкость была исследована на люциферазную активность (счетчик-сцинтиллятор). Результаты эксперимента показали, что мутанты Candida albicans, питавшиеся АК, селективно повышали уровень экспрессии гена сох-2 в HeLa клетках (рис.9). Было выявлено, что 3(Л,5)-НЕТЕ (9с), добавленная в инкубационную среду вместо инфекции, повышала уровень экспрессии гена сох-2 в дозозависимой манере (рис. 10), как и было установлено ранее для АК. Аналогичный эксперимент с применением препарата оптически активного изомера 3(Я)-НЕТЕ (9а) не показал изменений в уровне экспрессии гена сох-

2. Опираясь на эти данные, можно сделать вывод о том, что энантиомер 3(7?)-НЕТЕ (9а) не влияет на уровень экспрессии гена сох-2 в клетках млекопитающих.

'Ю'оооо'а-

500000 -

Hela+empty Hela+cox-2 ' Hela+cox-2 Hela+cox-2 Hela+cox-2 Hela+cox-2 vec. +1pl MeOH +3-HETE +3-HETE +3-HETE

1 (jM 5 pM 10 MM

Рис. 10. Контроль - HeLa клетки, трансфицированные пустым люциферазным вектором pGL3. 3(.R/S)-HETE в кнцентрациях 1, 5, 10 мкМ инкубировали с трансфицированными 1.5 мкг плазмиды-327/+59 prCOX-2-pLUC HeLa клетками 2 ч при 37°С. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы -/кс/субстрат (относительные световые единицы).

Каскад окисления полиненасыщенных жирных кислот вовлечен в такой важный физиологический ответ организма, как развитие воспаления. Семейство ядерных рецепторов, в которое входит PPAR (рецепторы, активируемые веществами, вызывающими пролиферацию пероксисом), является связующим звеном между регуляцией транскрипции некоторых генов, клеточными ответами и производными жирных кислот. PPARy - одна из изоформ ядерного рецептора PPAR. Поэтому представлялось интересным изучение влияния оксилипинов на PPAR-ассоциированный путь клеточных сигналов в COX-2-зависимом ответе HeLa клеток, инфицированных ослабленной Candida albicans. Результаты экспериментов по котрансфекции HeLa клеток плазмидой prCOX-2-pLUC и плазмидой PPARy D/N показали, что ядерный рецептор PPARy участвует в COX-2-зависимых сигналах трансдукции, вызываемых мутантом дрожжей Candida albicans cav2,

питавшимся AK. Инфекция не повышала уровня экспрессии СОХ-2 в присутствии штазмиды PPARy D/N (рис. 11).

В данной работе проводились исследования по изучению влияния 3-гидроксилипинов на сигнальные внутриклеточные механизмы, ассоциированные с действием фактора NF-кВ. Последний представляет собой редокс-чувствительный гетеродимерный транскрипционный фактор, связанный с пролиферацией, апоптозом, воспалением, иммунным, стрессовым ответом и другими регулируемыми процессами клеток млекопитающих.

2000000 1500000 1000000 •500000-о

Heia Hei а+ Hela+ Не!а+ Не,а+ Не1а+

empi/vec сох-2 сох-2+ сох-2+ спх~2+

PPARgamma cav.2 PPARgamma

D/N D/N

+cav-2

Рис. 11. Контроль - нетрансфицированные HeLa клетки; HeLa клетки, травсфицированные пустым вектором pGL3. Мутант cav2 (кратность инфекции =5) преинкубировали с трансфицированными 1.5 мкг плазмиды -327/+59 prCOX-2-pLUC и 1.5 мкг плазмиды PPARy D/N HeLa клетками 2 ч при 37°С. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы - lue/субстрат (относительные световые единицы).

Эксперименты по котрансфекции HeLa клеток люциферазным вектором (prNF-/cB-pLUC) и плазмидой IKK D/N показали, что 3(R/S)-НЕТЕ (9с) влияет на регуляцию экспрессии гена транскрипционного фактора NF-кВ. В то же время данное производное жирной кислоты не повышало уровня экспрессии гена nf-кЬ в присутствии плазмиды IKK D/N (рис. 12).

12000001000000 -800000 -600000 -400000 -200000 -о 4

HeLa+empty HeLa+NFkB HeLa+NFkB HeLa+NFkB HeLa+NFkB vec. +10 ^M +IKKD/N +IKK D/N

3-HETE +10 |JM 3-HETF.

Рис. 12. Контроль - HeLa клетки, трансфицированные пустым вектором pGL3, Hela клетки, трансфицированные prNF-KB-pLUC. 3(Л/5)-НЕТЕ в концентрации 10 мкМ инкубировали с трансфицированными 1.5 мкг штазмиды prNF-xB-pLUC и плазмидой 1.5 мкг IKK D/N HeLa клетками 2 ч при 37°С. Внутриклеточную среду анализировали по активности люциферазы - lue/субстрат (относительные световые единицы).

Таким образом, было показано, что и Candida albicans, питавшаяся арахидоновой кислотой, и 3-гидроксилипины, добавленные в среду инкубирования, способны модулировать передачу сигналов в клетках млекопитающих на моделях кандидоза и, следовательно, могут участвовать в формировании воспалительного ответа по сценарию прооксидативного стресса, как и арахидоновая кислота. Также было показано, что механизмы, связанные с ядерным рецептором PPAR и транскрипционным фактором NF-кВ, влияют на передачу сигналов, вызываемых микозной инфекцией или 3-гидроксиполиеновыми кислотами в животных клетках.

Выводы

1. Разработаны новые схемы препаративного химического синтеза:

а) оптически активных 3-гидроксилипинов: 3(Ä)-HTDE, 3(7?)-НЕТЕ, 3(ß),18(i?/S)-DiHETE с использованием хиральных ^исходных синтонов. Впервые получены кратно меченные тритием аналоги 3(/?)-НЕТЕ и 3 (Я), 18(ß/S)-DiHETE;

б) 18-гидроксипроизводных полиненасыщенных жирных кислот: 1 '¿(R/S)-НЕТЕ, 18-HODE, 18-НОТгЕ.

■

2 Разработан способ ферментативного получения дигидроксильных ПНЖК на примере окисления 3-НЕТЕ соевой 15-LOX Впервые получена 3(/?),15(5}-DiHETE, подобраны оптимальные условия для ее выделения с применением ВЭЖХ на хиральной фазе

3 Впервые показано, что дрожжи Dipodascopsis unmucleata и Candida albicans способны синтезировать ди- и тригидроксиполиеновые продукты из моногидроксипроизводных полиненасыщенных жирных кислот Определены кинетические параметры взаимодействия синтезированных жирнокислотных субстратов и клеток дрожжей Candida albicans, установлено, что 3-НЕТЕ является хорошим субстратом для клеток С albicans

4 Впервые показано, что 3-НЕТЕ и ее производные подвергаются ферментативной трансформации под действием липоксигеназ и цивслооксигеназы млекопитающих с образованием оксигенированных метаболитов - аналогичных продуктам окисления арахидоновой кислоты

5 Выявлено, что 3-гидроксиполиеновая кислота селективно модулирует передачу клеточных сигналов в модельных системах хозяин-патоген Впервые показано, что при взаимодействии с клетками млекопитающих 3-НЕТЕ является миметиком арахидоновой кислоты и действует как провоспалительный агент

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Groza N V , Ivanov IV , Romanov S G , Myagkova G I, Nigam S A novel synthesis of 3(J?)-HETE, 3(i?)-HTDE and enzymatic synthesis of 3(i?),15(S)-DiHETE//Tetrahedron -2002 -V 58 -P 9859-9863

2 Romanov S G , Ivanov IV, Groza N V , Kuhn H, Myagkova G1 Total synthesis of (5Z,8Z, 11Z, 14Z)-18- and 19-oxoeicosa-5,8,l 1,14-tetraenoic acids // Tetrahedron -2002 -V 58 -P 8483-8487

3 Groza N V , Ivanov IV , Romanov S G , Shevchenko V P , Myasoedov N.F , Myagkova GI, Nigam S Synthesis of tritium labelled 3(7?)-HETE and 3(jR),18(/?/S)-DiHETE through a common synthetic route // J Labelled Comp Radiopharm -2004 -V 47 -P 11-17

4 Гроза H В , Иванов И В , Голованов А Б , Мягкова Г И Химический синтез омега-гидроксипроизводных растительных жирнокислотных субстратов // Вестник МИТХТ -2006 -Т 1,№4 - С 29-32

29

5 Groza N V, Ivanov IV, Romanov S G , Myagkova G I, Nigam S Chemical synthesis of fimgal and mammalian hydroxy eicosatetraenoic acids // Recent BioMedical Advances in Eicosanoid Research book of abstracts of International Symposium -Berlm -2002 -P 57

6 Гроза H В , Иванов И В , Романов С Г , Нигам С , Мягкова Г И Метаболиты полиненасыщенных жирных кислот микроорганизмов // Тезисы докладов III съезда Биохимического Общества - Санкт-Петербург -2002 -С 332

7 Иванов И В, Гроза Н В, Романов С Г, Нигам С, Мягкова Г И Ферментативный синтез различных 3(Я)-гидроксиоксилипинов // Тезисы докладов VIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии 2002» - Уфа - 2002 - С 88-89

8 Гроза Н В , Иванов И В , Романов С Г , Нигам С, Пушков А А, Мягкова Г И Синтез гидроксипроизводных арахидоновой кислоты и их аналогов // Тезисы докладов XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии -Казань -2003.-С 222

9 Гроза Н В , Иванов И В , Романов С Г , Нигам С , Мягкова Г.И Метаболизм моногидроксипроизводных полиненасыщенных жирных кислот в грибах // Сборник «Успехи медицинской микологии» по материалам I Всероссийского конгресса по медицинской микологии — Москва - 2003 - Т I - С 277-278

10 Гроза HB, Иванов ИВ, Романов СГ, Мягкова Г И Получение биологически активных метаболитов грибкового происхождения - HETE(s), DiHETE(s) - и их изотопно-меченных аналогов // Сборник «Успехи медицинской микологии» по материалам II Всероссийского конгресса по медицинской микологии -Москва -2004 -Т III - С 142-143

11 Гроза Н В , Иванов И В , Мягкова Г И Взаимодействие грибковых бета-гидроксиполиненасыщенных жирных кислот с ферментами окисления липидов // Тезисы докладов Международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова - Москва - 2004 - С 96

12 Гроза HB, Иванов ИВ, Романов СГ, Фойзнер И, Мягкова Г И Разработка методов химического синтеза аналогов субстратов окисления липидов мембран растений // Тезисы докладов X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии XXI века» -Волгоград -2004 -Т 1 -С 243-244

Подписано в печать Н О-} Формат 60x84/16 Бумага

писчая

Отпечатано на ризографе Уч изд Листов 1 0 Тираж 100 экз Заказ № _

Московская государственная академия тонкой химической технологии им МВ Ломоносова Издательско-полиграфический центр 119571, г Москва, прос Вернадского, 86

Список сокращений

1. Введение

2. Литературный обзор

2.1. Введение

2.2. Оксилипины - сигнальные молекулы процессов развития микроорганизмов и взаимодействия хозяин-грибной патоген

2.2.1. Пути биосинтеза оксилипинов

2.2.2. Роль грибных оксилипинов

2.2.3. Гены биосинтеза оксилипинов в грибах Aspergillus

2.2.4. Профиль оксилипинов грибного происхождения

2.2.5. Регуляция оксилипин-зависимых путей в грибах рода Aspergillus

2.2.6. Оксилипины и вторичный метаболизм в грибах

2.2.7. Оксилипины в процессах патогенеза грибковых поражений

2.2.8. Оксилипины как молекулы межклеточного сообщения

2.2.9. Модели восприятия оксилипиновых сигналов

2.3. Механизмы митохондриального (i-окисления полиненасыщенных жирных кислот

2.3.1. Активация жирных кислот

2.3.2. Карнитин-зависимое проникновение ЖК в митохондрии

2.3.3. Ферменты цепи р-окисления

2.3.4. р-Окисление ненасыщенных жирных кислот разного типа

Микозы сопровождают человеческую цивилизацию не одно тысячелетие. Возбудителями микозов являются микроскопические грибы, одноклеточные или многоклеточные эукариоты - хемоорганогетеротрофы по способу питания. В настоящее время наблюдается значительный рост заболеваемости микозами из-за миграции населения и изменения образа жизни в индустриальных странах. Особенно ощутим вред микозов в трансплантологии, онкогематологии, неонаталогии, а наиболее распространенные возбудители микозов, такие как дрожжи Candida spp., уверенно вытесняют с лидирующих позиций внутрибольничных бактериальных возбудителей. Микозы лидируют в структуре СПИД-ассоциированных патологий, поражая организм, лишенный иммунной защиты. Для разработки эффективных подходов к терапии и диагностике микологических инфекций актуальным является фундаментальное изучение метаболических и сигнальных процессов, определяющих вирулентные свойства, механизмы развития и патогенеза болезнетворных грибов.

В последнее время интенсивно исследуется липидный метаболизм грибов с целью выявления потенциальных клеточных мишеней, знания о которых могут открыть перспективы создания новых фунгицидных или фунгистатических препаратов. Особенное внимание привлекают оксилипины, представляющие широкое семейство окисленных производных полиненасыщенных жирных кислот и выполняющие регуляторную и сигнальную функции в организме животных, растений и грибов. Среди них гидроксилипины - гидроксипроизводные жирных кислот - наиболее распространены в царстве грибов и играют важную роль в процессах роста и развития этих микроорганизмов. 3- и 18-Гидроксиполиеновые кислоты были обнаружены как продукты трансформации эндогенных и экзогенных жирных кислот в некоторых видах микроскопических грибов и дрожжей (Mucor genevensis, Dipodascopsis uninucleata, Lipomyces yarrowii, Candida albicans, Gaeumannomyces graminis), показано их участие в росте и морфогенезе грибов, а также в модуляции защитных реакций клеток млекопитающих. Для изучения процессов окисления липидных компонентов клеточных мембран растений и грибов, а также с целью выяснения механизмов действия биологически активных оксилипинов необходимы препаративные количества образцов этих соединений, что делает актуальным поиск эффективных методов их получения.

Оксилипины, являющиеся производными длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот, достаточно трудно выделить из природных источников в количествах, необходимых для проведения биохимических исследований. Поэтому для изучения механизмов биосинтеза липидных метаболитов в грибах и трансдукции сигналов в животных клетках при микозном поражении актуальной задачей является разработка новых подходов к химическому, ферментативному, микробиологическому синтезу 3-гидрокси- и 18-гидроксипроизводных жирных кислот, их предшественников и изотопно-меченных аналогов.

Таким образом, целью настоящей работы является синтез, наработка и изучение биохимических свойств новых и известных 3- и 18-гидроксилипинов природной структуры. Основные задачи исследования состояли в разработке новых методических подходов к химическому и ферментативному синтезу, в том числе препаративному, 3- и 18-гидроксилипинов, их аналогов и меченных тритием производных; в изучении метаболизма синтезированных 3- и 18-гидроксиполиеновых кислот в дрожжах и их ферментативных превращений с использованием оксигеназ млекопитающих; в определении влияния 3-гидроксилипинов на передачу сигналов в животных клетках.

Настоящая работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках темы № 1Б-4-355 «Синтез супрамолекулярных структур на основе порфиринов, липидов и углеводов с целью изучения процессов, протекающих в клетке и создания препаратов для онкологии, генной терапии и других областей медицины», по грантам РФФИ 02-03-33138, 04-03-32454, 05-03-32392, президента РФ по поддержке ведущих научных школ № НШ-2013.2003.3, а также частью работ, выполняемых в плане проекта по исследованию 3-гидроксиполиеновых жирных кислот в лаборатории эйкозаноидов кафедры гинекологии медицинского университетского центра Свободного Университета Берлина (Германия) при поддержке VW-фонда (грант Ni-1/77643).

2. Литературный обзор

2.1. Введение

Оксилипины представляют собой широкое семейство метаболитов окисления и последующей конверсии полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и играют регуляторно-физиологическую роль в живом организме. Известно, что оксигенированные соединения липидной природы важны для жизнедеятельности позвоночных, беспозвоночных, растений, водорослей, грибов, бактерий [1]. Как особая группа организмов, имеющих огромное экономическое и экологическое значение, грибы включают патогены человека, животных, сельскохозяйственных культур, а также организмы, используемые в пищу и ответственные за циркуляцию органической материи в природе. Как правило, термин «грибы» объединяет совершенные грибы, такие как зигомицеты, аскомицеты, базидомицеты, дейтеромицеты и несовершенные (как оомицеты), имеющие схожую с истинными грибами морфологию и экологию, но не родственные по филогенетическим признакам.

Оксилипины образуются в грибах путем введения кислорода в молекулу жирной кислоты под действием различных ферментных систем - липоксигеназной, циклооксигеназной, цитохром Р-450-зависимой монооксигеназной. Субстратами для окисления в биосинтезе оксилипинов служат различные жирные кислоты. Полиненасыщенные жирные кислоты состава С20 (арахидоновая и эйкозапентаеновая кислоты) встречаются у низших грибов и составляют около 30% их жирнокислотного состава, редко - у высших грибов (от 2% до 6%) [2]. Наиболее распространенными субстратами в грибах являются линолевая и олеиновая кислоты состава Cig.

Другим важным источником образования оксилипинов является путь р-окисления липидных компонентов клетки, который характерен для животных, растений, грибов. Кроме важности данного метаболического пути для энергетических целей и поставки углеродного сырья, метаболиты неполного р-окисления выполняют как физиологические, так и патофизиологические функции при взаимодействии микро- и макроорганизмов.

Патогенные микробы и их хозяева имеют целый комплекс сигнальных механизмов для защиты от изменений окружающей среды и выработки факторов для выживания. Недавние исследования показали, что оксилипины являются новым классом сигнальных молекул, участвующих в отношениях хозяин-патоген [3]. Среди оксилипинов микроорганизмов окисленные производные грибов наиболее хорошо охарактеризованы, и установлено, что они действуют гормоноподобным образом и участвуют в модуляции периодичности и равновесия между половой и бесполой стадией спорообразования, а также в продукции микотоксинов. Были проведены и другие исследования по выявлению роли грибных оксилипинов в патогенезе микозов, в частности аспергиллезов и кандидозов. Полученные результаты позволили сделать предположение, что оксилипины хозяев и микроорганизмов могут обоюдно влиять на метаболизм, восприимчивость и сигнальные процессы [3].

Предполагают, что оксилипины также играют важную роль в инфицировании высших организмов патогенными микроорганизмами на уровне клеточных сигналов и участвуют в построении устойчивого симбиоза хозяин-патоген [3]. До сих пор механизмы действия известных оксилипинов микроорганизмов, возможные аспекты их фармакологического применения, способы их получения на основе коммерчески доступных штаммов остаются невыясненными, что делает весьма важными исследования в данной области.

5. Выводы

1. Разработаны новые схемы препаративного химического синтеза: а) оптически активных 3-гидроксилипинов: 3(7?)-HTDE, 3(i?)-HETE, 3(Л),18(.К/5)-DiHETE с использованием хиральных исходных синтонов. Впервые получены кратно-меченные тритием аналоги 3(Д)-НЕТЕ и 3(i?),18(/2/5)-DiHETE; б) 18-гидроксипроизводных полиненасыщенных жирных кислот: 18(i?/.S)-HETE, 18-HODE, 18-НОТгЕ.

2. Разработан способ ферментативного получения дигидроксильных ПНЖК на примере окисления 3-НЕТЕ соевой 15-LOX. Впервые получена 3(i?),15(5)-DiHETE, подобраны оптимальные условия для ее выделения с применением ВЭЖХ на хиральной фазе.

3. Впервые показано, что дрожжи Dipodascopsis uninucleata и Candida albicans способны синтезировать дм- и тригидроксиполиеновые продукты из моногидроксипроизводных полиненасыщенных жирных кислот. Определены кинетические параметры взаимодействия синтезированных жирнокислотных субстратов и клеток дрожжей Candida albicans, установлено, что 3-НЕТЕ является хорошим субстратом для клеток С. albicans.

4. Впервые показано, что 3-НЕТЕ и ее производные подвергаются ферментативной трансформации под действием липоксигеназ и циклооксигеназы млекопитающих с образованием оксигенированных метаболитов - аналогичных продуктам окисления арахидоновой кислоты.

5. Выявлено, что 3-гидроксиполиеновая кислота селективно модулирует передачу клеточных сигналов в модельных системах хозяин-патоген. Впервые показано, что при взаимодействии с клетками млекопитающих 3-НЕТЕ является миметиком арахидоновой кислоты и действует как провоспалительный агент.

1. Herman R.P. Oxylipin production and action in fungi and related organisms // 1. Eicosanoids and Related Compounds in Plants and Animals (Rowley, A.F. et ah, eds), Princeton University Press, 1998.-P. 115-130.

2. Weete, J.D. Lipid biochemistry of fungi and other organisms // New York: Plenum Press, 1980.-P. 49-95.

3. Funk C.D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology // Science. -2001.-Vol. 294.-P. 1871-1875.

4. Wang X. Lipid signalling // Curr. Opin. Plant Biol. 2004. - Vol. 7. - P. 329-336.

5. Shah J. Lipids, lipases, and lipid-modifying enzymes in plant disease resistance // Annu. Rev. Phytopathol. 2005. - Vol. 43. - P. 229-260.

6. La Camera S., Gouzerh G., Dhondt S., Hoffmann L., Fritig В., Legrand M., Heitz T. Metabolic reprogramming in plant innate immunity: the contributions of phenylpropanoid and oxylipin pathways // Immunol. Rev. 2004. - Vol. 198. - P. 267-284.

7. Noverr M.C., Erb-Downward J.R., Huffnagle G.B. Production of eicosanoids and other oxylipinsby pathogenic eukaryotic microbes // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - Vol. 16. - P. 517-533.

8. Hornsten L., Su C., Osbourn A.E., Garosi P., Hellman U., Wernstedt C., Oliw, E.H. Cloning of linoleate diol synthase revealshomology with prostaglandin H synthases // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 28219-28224.

9. Tsitsigiannis D.I., Zarnowski R., Keller N.P. The lipid body protein, PpoA, coordinates sexual and asexual sporulation in Aspergillus nidulans II J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. -P. 11344-11353.

10. Tsitsigiannis D.I., Kowieski T.M., Zarnowski R., Keller N.P. Endogenous lipogenic regulators of spore balance in Aspergillus nidulans // Eukaryot. Cell. 2004. - Vol. 3. - P. 1398-1411.

11. Tsitsigiannis D.I., Bok J.W., Andes D., Nielsen K.F., Frisvad J.C., Keller N.P. Aspergillus cyciooxygenase-like enzymes are associated with prostaglandin production and virulence // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 4548-4559.

12. Tsitsigiannis D.I., Kowieski T.M., Zarnowski R., Keller N.P. Three putative oxylipin biosynthetic genes integrate sexual and asexual development in Aspergillus nidulans II Microbiology.-2005.-Vol. 151.-P. 1809-1821.

13. Cristea M., Osbourn, A.E., Oliw, E.H. Linoleate diol synthase of the rice blast fungus Magnaporthe grisea // Lipids. 2003. - Vol. 38. - P. 1275-1280.

14. Oakley A J. Glutathione transferases: new functions // Curr. Opin. Struct. Biol. 2005. -Vol. 15.-P. 716-723.

15. Mueller M.J. Archetype signals in plants: the phytoprostanes // Curr. Op in. Plant Biol. -2004.-Vol. 7.-P. 441-448.

16. Beneke E.S., Rogers A.L. Medical mycology and human mycoses // Belmont: Star Pub. Co., 1996.-P. 19-189.

17. Новое в систематике и номенклатуре грибов // Под ред. Дьякова Ю.Т., Сергеева Ю.В., М.: Национальная академия микологии, 2003. С. 136-163.

18. Jacobs Р.Н., Nail L. Fungal disease: biology, immunology, and diagnosis // New York: Dekker., 1997.-P. 116-171.

19. Akashi Т., Kanbe Т., Tanaka K. The role of the cytoskeleton in the polarized growth of the germ tube in Candida albicans I I Microbiology. 1994. - Vol. 140. - P. 271-280.

20. Yokoyama K., Kaji H., Nishimura K., Miyaji M. The role of microfilaments and microtubules in apical growth and dimorphism of Candida albicans // J. Gen. Microbiol. -1990.-Vol. 136.-P. 1067-1075.

21. Kock J.L., Strauss C.J., Pohl C.H., Nigam S. The distribution of3-hydroxy oxylipins in fungi // Prostaglandins Other Lipid Mediators. 2003. - Vol. 71. - P. 85-96.

22. Champe S.P., el-Zayat A.A. Isolation of a sexual sporulation hormone from Aspergillus nidulans И J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171 - P. 3982-3988.

23. Mazur P., Meyers H., Nakanishi K. Structure and synthesis of sporogenic psi factors from Aspergillus nidulans II J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1991. - Vol. 20. - P. 1486-1487.

24. Bowers W.S., Hoch H.C., Evans P.H., Katayama M. Thallophytic allelopathy: isolation and identification of laetisaric acid // Science. 1986. - Vol. 232. - P. 105-106.

25. Noverr M.C., Toews G.B., Huffnagle G.B. Production of prostaglandins and leukotrienes by pathogenic fungi // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 400-402.

26. Noverr M.C. and Huffnagle G.B. Regulation of Candida albicans morphogenesis by fatty acid metabolites // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 6206-6210.

27. Коек J.L., Coetzee D.J., van Dyk M.S., Truscott M., Botha A., Augustyn O.P. Evidence for, and taxonomic value of, an arachidonic acid cascade in the Lipomycetaceae // Antonie Van Leeuwenhoek. -1992. Vol. 62. - P. 251-259.

28. Jensen E.C., Ogg C., Nickerson K.W. Lipoxygenase inhibitors shift the yeast/mycelium dimorphism in Ceratocystis ulmi II Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. - P. 2505— 2508.

29. Alem M.A., Douglas L.J. Prostaglandin production during growth of Candida albicans biofilms // J. Med. Microbiol. 2005. - Vol. 54. - P. 1001-1005.

30. Fuqua C., Parsek M.R., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication: acyl-homoserine lactone quorum sensing // Annu. Rev. Genet. 2001. -Vol. 35.-P. 439—468.

31. Nickerson K.W., Atkin A.L., Hornby J.M. Quorum sensing in dimorphic fungi: farnesol and beyond // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - Vol. 72. - P. 3805-3813.

32. Oh K.B., Miyazawa H., Naito Т., Matsuoka H. Purification and characterization of an autoregulatory substance capable of regulating the morphological transition in Candida albicans I/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 4664^668.

33. Wang L.H., He Y., Gao Y., Wu J.E., Dong Y.H., He C., Wang S.X., Weng L.X., Xu J.L., Tay L., Fang R.X., Zhang L.H. A bacterial cell-cell communication signal with cross-kingdom structural analogues // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 51. - P. 903-912.

34. Semighini C.P., Hornby J.M., Dumitru R., Nickerson K.W., Harris S.D. Farnesol-induced apoptosis in Aspergillus nidulans reveals a possible mechanism for antagonistic interactions between fungi // Mol. Microbiol. 2006. - Vol. 59. - P. 753-764.

35. Matsuda Y., Beppu Т., Arima K. Crystallization and positional specificity of hydroperoxidation of Fusarium lipoxygenase // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - Vol. 530. -P. 439-450.

36. Huber S.M., Lottspeich F., Kamper J. A gene that encodes a product with similarity to dioxygenases is highly expressed in teliospores of Ustilago maydis. Mol. Genet. Genomics. 2002. - Vol. 267. - P. 757-771.

37. Shim W.-B. and Dunkle L.D. Identification of genes expressed during cercosporin biosynthesis in Cercospora zeae-maydis II Physiol. Mol. Plant Pathol. 2002. - Vol. 61. - P. 237-248.

38. Su С., Oliw E.H. Purification and characterization of linoleate 8-dioxygenase from the fungus Gaeumannomyces graminis as a novel hemoprotein // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271.-P. 14112-14118.

39. Blee E. Impact of phyto-oxylipins in plant defense // Trends Plant Sci. 2002. - Vol. 7. - P 315-322.

40. Feussner I., Wasternack C. The lipoxygenase pathway // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. -Vol. 53.-P. 275-297.

41. Calvo A.M., Gardner H.W., Keller N.P. Genetic connection between fatty acid metabolism and sporulation in Aspergillus nidulans II J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 2576625774.

42. Murphy DJ. The biogenesis and functions of lipid bodies in animals, plants and microorganisms // Prog. Lipid Res. 2001. - Vol. 40. - P. 325-438.

43. Kim H., Han K., Kim K., Han D., Jahng K., Chae K. The veA gene activates sexual development in Aspergillus nidulans II Fungal Genet. Biol. 2002. - Vol. 37. - P. 72-80.

44. Busch S., Eckert S.E., Krappmann S., Braus G.H. The COP9 signalosome is an essential regulator of development in the filamentous fungus Aspergillus nidulans II Mol. Microbiol. 2003.-Vol. 49.-P. 717-730.

45. Han S., Adams Т.Н. Complex control of the developmental regulatory locus brlA in Aspergillus nidulans II Mol. Genet. Genomics. 2001. - Vol. 266. - P. 260-270.

46. Han K.H., Han K.Y., Yu J.H., Chae K.S., Jahng K.Y., Han D.M. The nsdD gene encodes a putative GATA-type transcription factor necessary for sexual development of Aspergillus nidulans II Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 41. - P. 299-309.

47. Rawson R.B. The SREBP pathway-insights from Insigs and insects //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. - Vol. 4. - P. 631-640.

48. Brodhagen M., Keller N.P. Signalling pathways connecting mycotoxin production and sporulation // Mol. Plant Pathol. 2006. - Vol. 7. - P. 285-301.

49. ButnickN.Z., Yager L.N., Hermann Т.Е., Kurtz M.B., Champe S.P. Mutants of Aspergillus nidulans blocked at an early stage of sporulation secrete an unusual metabolite // J. Bacterid. 1984. - Vol. 160. - P. 533-540.

50. Jump D.B. Dietary polyunsaturated fatty acids and regulation of gene transcription // Curr. Opin. Lipidol. 2002. - Vol. 13. - P. 155-164.

51. Yu J.H., Keller N.P. (2005) Regulation of secondary metabolism in filamentous fungi // Annu. Rev. Phytopathol. 2005. - Vol. 43. - P. 437-458.

52. Tsitsigiannis D.I., Keller N.P. Oxylipins act as determinants of natural product biosynthesis and seed colonization in Aspergillus nidulans II Mol. Microbiol. 2006. - Vol. 59. - P. 882— 892.

53. Tag A., Hicks J., Garifullina G, Ake C. J., Phillips T.D., Beremand M., Keller N. G-protein signalling mediates differential production of toxic secondary metabolites // Mol. Microbiol. -2000.-Vol. 38.-P. 658-665.

54. Fernandes M., Keller N.P., Adams Т.Н. Sequence-specific binding by Aspergillus nidulans AflR, a C6 zinc cluster protein regulating mycotoxin biosynthesis // Mol. Microbiol. 1998. -Vol. 28.-P. 1355-1365.

55. Shimizu K., Keller N.P. Genetic involvement of cAMP-dependent protein kinase in a G protein signaling pathway regulating morphological and chemical transitions in Aspergillus nidulans II Genetics. 2001. - Vol. 157. - P. 591-600.

56. Maggio-Hall L.A., Wilson R.A., Keller N.P. Fundamental contribution of p-oxidation to polyketide mycotoxin production in planta // Molec. Plant-Microbe Inter. 2005. - Vol. 18. -P. 783-793/

57. Smith W.L., DeWitt D.L., Garavito R.M. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology // Annu. Rev. Biochem. 2000. - Vol. 69. - P. 145-182.

58. Wilson R.A., Chang P.K., Dobrzyn A., Ntambi J.M., Zarnowski R., Keller N.P. Two Д9-stearic acid desaturases are required for Aspergillus nidulans growth and development // Fungal Genet. Biol. 2004. - Vol. 41. - P. 501-509.

59. Deva R., Ciccoli R., Kock L., Nigam S. Involvement of aspirin-sensitive oxylipins in vulvovaginal candidiasis // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - Vol. 198. - P. 37-43.

60. Alem M.A., Douglas L.J. Effects of aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs on biofilms and planktonic cells of Candida albicans II Antimicrob. Agents Chemother. -2004.-Vol. 48.-P. 41-47.

61. Wasternack C., Hause B. Jasmonates and octadecanoids: signals in plant stress responses and development // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2002. - Vol. 72. - P. 165-221.

62. Siedow J.N. Plant lipoxygenase structure and function // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. - 1991. - Vol. 42. - P. 145-188.

63. Hamberg M., Gardner H.W. Oxylipin pathway to jasmonates: biochemistry and biological significance//Biochim. Biophys. Acta.- 1992. Vol. 1165.-P. 1-18.

64. Song W., Funk E., Brash A.R. Molecular cloning of an allene oxide synthase: a cytochrome P450 specialized for the metabolism of fatty acid hydroperoxides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993.-Vol. 90.-P. 8519-8523.

65. Hamberg M. Pathways in the biosynthesis of oxylipins in plants // J. Lipid Mediators. -1993.-Vol. 6.-P. 375-384.

66. Matsui K., Shibutani M., Hase Т., Kajiwara T. Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is a cytochrome P450 (CYP74B) // FEBS Lett. 1996. - Vol. 394. - P. 21-24.

67. Zimmerman D.C., Coudron C.A. Identification of Traumatin, a Wound Hormone, as 12-Oxo-trans-10-dodecenoic Acid // Plant Physiol. 1979. - Vol. 63. - P. 536-541.

68. Gardner H.W. Recent investigation into the lipoxygenase pathway of plants // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1084. - P. 221-39.

69. Calvo A.M., Hinze L.L., Gardner H.W., Keller N.P. Sporogenic effect of polyunsaturated fatty acids on development of Aspergillus spp II Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. -P. 3668-3673.

70. Burow G.B. et al. Seed lipoxygenase products modulate Aspergillus mycotoxin biosynthesis // Mol. Plant Microbe Interact. 1997. - Vol. 10. - P. 380-387.

71. Gardner H.W. et al. Soybean lipoxygenase is active on nonaqueous media at low moisture: a constraint to xerophilic fungi and aflatoxins? // J. Am. Oil Chem. Soc. 1998. - Vol. 75. -P. 1801-1808.

72. Doehlert D.C. et al. Evidence implicating the lipoxygenase pathway in providing resistance to soybean against Aspergillus flavus I/ Phytopathology. 1993. - Vol. 183. - P. 1473-1477.

73. Goodrich-Tanrikulu M., Mahoney N.E., Rodriguez S.B. The plant growth regulator methyl jasmonate inhibits aflatoxin production by Aspergillus flavus II Microbiology. 1995. - Vol. 141.-P. 2831-2837.

74. Zeringue, H.J. Possible involvement of lipoxygenase in a defense response in aflatoxigenic Aspergillus cotton plant interactions // Can. J. Bot. 1996. - Vol. 74. - P. 98-102.

75. Slusarenko A.J. The role of lipoxygenase in plant resistance to infection // In Lipoxygenase and Lipoxygenase Pathway Enzymes (Piazza, G.J., ed.), AOCS Press, Champaign, IL, 1996. -P. 176-197,.

76. Oliw E.H. Plant and fungal lipoxygenases // Prosaglandins & other Mediators. 2002. - Vol. 68-69.-P. 313-323.

77. Burow G.B., Gardner H.W., Keller N.P. A peanut seed lipoxygenase responsive to Aspergillus colonization // Plant Mol. Biol. 2000. - Vol. 42. - P. 689-701.

78. Wilson R.A., Gardner H. W., Keller N.P. Cultivar-dependent expression of a maize lipoxygenase responsive to seed infesting fungi // Mol. Plant Microbe Interact. 2001. -Vol. 14.-P. 980-987.

79. Matsui K. Green leaf volatiles: hydroperoxide lyase pathway of oxylipin metabolism // Curr. Opin. Plant Biol. -2006. Vol. 9. - P. 274-280.

80. Yu J.H. Heterotrimeric G protein signaling and RGSs in Aspergillus nidulans II J. Microbiol. -2006.-Vol. 44.-P. 145-154/

81. Xu J.R., Peng Y.L., Dickman M.B., Sharon A. The dawn of fungal pathogen genomics // Annu. Rev. Phytopathol. 2006. - Vol. 44. - P. 337-366.

82. Assmann S.M. G proteins go green: a plant G protein signaling FAQ sheet // Science. 2005. -Vol. 310.-P. 71-73.

83. Obinata H., Hattori Т., Nakane S., Tatei K., Izumi T. Identification of 9-hydroxyoctadecadienoic acid and other oxidized free fatty acids as ligands of the G protein-coupled receptor G2A // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 40676^10683.

84. Farmer E.E., Almeras E., Krishnamurthy V. Jasmonates and related oxylipins in plant responses to pathogenesis and herbivory // Curr. Opin. Plant Biol. 2003. - Vol. 6. - P. 372-378.

85. Duplus E., Forest C. Is there a single mechanism for fatty acid regulation of gene transcription? // Biochem. Pharmacol. 2002. - Vol. 64. - P. 893-901.

86. Calvo A.M., Wilson R.A., Bok J.W., Keller N.P. Relationship between secondary metabolism and fungal development // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. - Vol. 66. - P. 447^159.

87. Kunau W.-H., Dommes V., Schultz H. (3-Oxidation of fatty acids in mitochondria, peroxisomes and bacteria : a century of continued progress // Prog. Lipid Res. 1995. - Vol. 34. - P. 267-342.

88. Murthy M.S.R., Pande S.V. Mechanism of carnitine acylcarnitine translocase-catalyzed import of acylcarnitines into mitochondria // J. Biol. Chem. 1984. - Vol. 259. - P. 90829089.

89. Izai K., Uchida Y., Orii Т., Hashimoto T. Novel fatty acid beta-oxidation enzymes in rat liver mitochondria. I. Purification and properties of very-long-chain acyl-coenzyme A dehydrogenase//J. Biol. Chem. 1992.-Vol. 267.-P. 1027-1033.

90. Sato K., Nishima Y., Shiga K. Electron-transferring flavoprotein has an AMP-binding site in addition to the FAD-binding site // J. Biochem. 1993. - Vol. 114. - P. 215-222.

91. Miyazawa S., Furuta S., Osumi Т., Hashimoto Т., Ui N. Properties of peroxisomal 3-ketoacyl-coA thiolase from rat liver // J. Biochem. -1981.- Vol. 90. P. 511 -519.

92. Kunau W.-H., Dommes P. Degradation of unsaturated fatty acids. Identification of intermediates in the degradation of cis-4-decenoly-CoA by extracts of beef-liver mitochondria // Eur. J. Biochem. 1978. - Vol. 91. - P. 533-544.

93. Cuebas D., Schultz H. Evidence for a modified pathway of linoleate degradation. Metabolism of 2,4-decadienoyl coenzyme A // J. Biol. Chem. 1982. - Vol. 257. - P. 14140-14144.

94. Eaton S., Bartlett K., Pourfarzam M. Mammalian mitochondrial beta-oxidation // Biochem. J. 1996. - Vol. 320. - P. 345-357.

95. Smeland Т.Е., Nada M., Cuebas D., Schultz H. NADPH-dependent beta-oxidation of unsaturated fatty acids with double bonds extending from odd-numbered carbon atoms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - Vol. 89. - P. 6673-6677.

96. Nada M., Rhead W., Sprecher H., Schulz H., Roe C. Evidence for intermediate channeling in mitochondrial beta-oxidation // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 530-535.

97. Manna S., Viala J., Yadagiri J., Falck J.R. Synthesis of 12(S), 20-, 12(S), 19(R)-, and 12(S), 19(S)-Dihydroxyeicosa-cis-5,8,14-trans-10-tetraenoic acids, metabolites of 12(S)-HETE // Tetrahedron Lett. 1986. - Vol. 27. - P. 2679-2682.

98. Иванов И.В., Гроза H.B., Мнасина E.E., Мягкова Г.И. Синтез арахидоновой кислоты и ее ацетиленового предшественника// Биоорган. Химия. 1995. - Т. 21. - С. 802-805.

99. Yamaguchi M., Hiaro I. An efficient method for the alkylation of oxyranes using alkynyl boranes // Tetrachedrom Lett. 1983. - Vol. 24. - P. 391-394.

100. Ames A.E., Covell A.N., Goodburn T.G. Synthesis of Long-chain acids. Part V. Synthesis of some co-hydroy-acetylenic acids // J. Chem. Soc. 1963. - P. 5889-5893.

101. Ivanov I. V., Schwarz K., Holzhutter H., Myagkova G.I., Kuhn H. co-Oxidation impairs oxidizability of polyenoic fatty acids by 15-lipoxygenases: consequences for substrate orientation at the active site // Biochem. J. 1998. - Vol. 336. - P. 345-352.

102. Groza N.V., Ivanov I.V., Romanov S.G., Myagkova G.I., Nigam S. A novel synthesis of 3(Д)-НЕТЕ, 3(7?)-HTDE and enzymatic synthesis of 3(/?),15(S)-DiHETE // Tetrahedron. -2002. Vol. 58. - P. 9859-9863.

103. Romanov S.G., Ivanov I.V, Groza N.V., Kuhn H., Myagkova G.I. Total synthesis of5Z,8Z, 11Z, 14Z)-18- and 19-oxoeicosa-5,8,l 1,14-tetraenoic acids // Tetrahedron. 2002. -Vol. 58. - P. 8483-8487.

104. Иванов И.В., Гроза H.B., Мягкова Г.И. Синтез а,со-дикарбоновых полиненасыщенных кислот. II. Химический синтез диендикарбоновых кислот с различной длиной цепи // Биоорган, химия. 1998. - Т. 24. - С. 454-457.

105. Sprecher Н. The organic synthesis of unsaturated fatty acids // Prog. Chem. Fatts and Other Lipids.- 1978.-Vol. 15.-P. 219-254.

106. Lapitskaya M.A., Vasiljeva L.L., Pivnitsky K.K. A chemoselective synthesis of functionalized 1,4-alkadiynes // Synthesis. 1993. - P. 65-66.

107. Deva R., Ciccoli R., Schewe Т., Kock J.L., Nigam S. Arachidonic acid stimulates cell growth and forms a novel oxygenated metabolite in Candida albicans II Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1486. - P. 299-311.

108. Ivanov I., Romanov S., Ozdoba C., Holzhutter H., Myagkova G., Kuhn H. Enantioselective substrate specificity of 15-lipoxygenase 1 // Biochemistry. 2004. - Vol. 43. - P. 1572015728.

109. Hamberg M. Stereochemistry of oxygenation of linoleic acid catalyzed by prostaglandin-endoperoxide H synthase-2 // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - Vol 349. - P. 376-380.

110. Bligh E.J., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Med. Sci. 1959. - Vol. 37. - P. 911-917.

111. Nigam S. Extraction of eicosanoids from biological samples // In Prostaglandins and related compounds (Benedetto C., et al., eds) IRL Press, Oxford., 1987. -P. 45-52.

112. Prabhune A., Fox S., Ratledge C. Transformation of arachidonic acid to 19-hydroxy- and 20-hydroxy-eicosatetraenoic acids using Candida bombicola // Biotechnology Letters. -2002. Vol. 24. - P. 1041-1044.

113. Vane J.R., Bakhle Y.S., Botting R.M. Cyclooxygenases 1 and 2 // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1998. - Vol. 38. - P. 97-120.

114. Bruckmann A., Kunkel W., Hartl A., Wetzker R., Eck R. A phosphatidylinositol 3-kinase of Candida albicans influences adhesion, filamentous growth and virulence // Microbiology. -2000. Vol. 146. - P. 2755-2764.

115. Автор выражает свою благодарность научному руководителю доктору химических наук, профессору Мягковой Галине Ивановне за помощь в работе.

116. Автор особо признательна к.х н. Иванову Игорю Владимировичу за непосредственное руководство работой, помощь в проведении эксперимента, в идентификации соединений, выделенных из природных источников и в обсуждении полученных результатов.

117. Автор благодарен всему коллективу кафедры Химии и технологии биологически активных соединений за поддержку при выполнении работы.