Кинетические закономерности ферментативного гидролиза хитозана под действием гиалуронидазы в присутствии некоторых антибиотиков - низкомолекулярных электролитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

На правах рукописи

у ¿>

ТУКТАРОВА ИРИНА ФАНИСОВНА

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ХИТОЗАНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГИАЛУРОНИДАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ НЕКОТОРЫХ АНТИБИОТИКОВ - НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭЛЕКТРОЛИТОВ

Специальность 02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

швг т

005561695

Уфа-2015

005561695

Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений и общей химической технологии химического факультета ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет».

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент,

Кулиш Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

зав. кафедрой полимеров ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» Шиповская Анна Борисовна

кандидат химических наук, доцент, заместитель заведующего кафедрой общеобразовательных дисциплин

филиала ФГБОУ ВПО «Уфимский государственный авиационный

технический университет» в г. Туймазы Тимербаева Гузель Рамилевна

Ведущая организация: ФГБУН «Институт физической химии

и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук»

Защита состоится 15 октября 2015 г. в на заседании Диссертационного совета Д 212.013.10 на базе ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, Химический факультет, ауд. 311. e-mail: dissovet2@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет».

Автореферат разослан « % » _2015 г.

Ученый секретарь j /

диссертационного совета, / /

доктор химических наук, профессор v "7Г~~/—Ю.А. Прочухан

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время для решения медико-биологических задач востребованы самые разнообразные полимерные материалы. Например, биоинертные, биостабильные материалы, не изменяющие своих характеристик в процессе эксплуатации. С другой стороны, необходимы биоассимилируемые полимеры, которые, напротив, должны растворяться под действием ферментов организма человека с образованием нетоксичных продуктов. Такие полимеры могут быть использованы для создания полимерных лекарственных форм с контролируемым выходом препаратов и регулируемой скоростью биодеструкции, специализированных материалов для адресной доставки в орган-мишень, создания временных заместителей тканей в реконструктивной хирургии и др. Скорость биодеструкции полимерного материала играет при этом ключевую роль, поскольку не только определяет срок службы материала, но и контролирует скорость высвобождения лекарственного вещества в случае использования полимерных лекарственных форм.

Синтетические полимерные материалы, например, полиметилметакрилат, полиэтилентерефталат и др., разрушаются в организме человека крайне медленно. Природные полимеры животного происхождения, такие как коллаген или гиалуроновая кислота, напротив, разрушаются слишком быстро, поскольку в организме человека присутствуют ферменты, специфически расщепляющие эти полимеры.

Решением данной проблемы может стать использование таких природных полимеров, например, на основе хитозана (ХТЗ), для биодеструкции которых в организме человека нет специфических ферментов, и, следовательно, скорость деструкции материалов на основе этого полимера в организме будет ниже, чем биополимеров животного происхождения.

Работ, посвященных процессам ферментативного превращения ХТЗ достаточно много. Однако в подавляющем большинстве работ, процесс ферментативного гидролиза ХТЗ рассмотрен лишь на качественном уровне. Работ по определению количественных характеристик процесса ферментативного гидролиза ХТЗ под действием неспецифических ферментов, тем более в виде пленочного материала для медицинского применения, фактически нет. Равно как нет и работ, в которых было бы рассмотрено влияние лекарственных соединений на процесс ферментативного превращения ХТЗ.

В связи с этим, изучение кинетических закономерностей процесса ферментативного гидролиза ХТЗ, в том числе в присутствии лекарственного соединения, под действием неспецифического ферментного препарата, присутствующего в организме человека, например, гиалуронидазы, способной вызвать распад р-гликозидной связи в ХТЗ, представляется важной задачей, как с научной, так и с практической точек зрения.

Работа выполнена при поддержке государственного задания Минобрнауки России «Научные основы создания биодеградируемых пленочных систем на основе хитозана для регулируемого транспорта лекарственных препаратов» № 107.13; гранта РФФИ и Республики Башкортостан (грант р поволжье а № 11-03-97016); Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (проект по госконтракту № 02.740.11.0648 на 2010-2012 гг. и проект по заявке 2012-1.1-12-000-1015-027 (соглашение № 8444, утв. 31.08.2012 г.) на 2012-2012 гг.), государственного задания Минобрнауки России по научно-исследовательской работе № 2687 в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности по заданию № 2014/7.

Целью работы является установление кинетических закономерностей процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе и в пленках в отсутствии и в присутствии некоторых антибиотиков аминогликозидного ряда (амикацина и гентамицина) и цефалоспоринового ряда (цефазолина и цефатоксима), являющихся низкомолекулярными электролитами (НМЭ).

Задачи работы:

— определение кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе под действием фермента гиалуронидазы;

— установление влияния некоторых электролитов (в том числе антибиотиков), на кинетические параметры процесса ферментативного гидролиза ХТЗ;

- изучение кинетических закономерностей ферментативного гидролиза пленочных хитозановых материалов, полученных из раствора;

- установление физико-химических способов регулирования скорости биоразложения полимерной матрицы-носителя лекарственного соединения.

Научная значимость работы. В ходе диссертационного исследования впервые:

- описан процесс ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе под действием неспецифического фермента гиалуронидазы в отсутствии и в присутствии некоторых антибиотиков аминогликозидного и цефалоспоринового ряда в рамках схемы Михаэлиса-Ментен и рассчитаны кинетические параметры процесса — значения константы Михаэлиса Кт, максимальной скорости гидролиза Утах и отношения Ута/Кт, представляющего собой константу скорости ферментативного гидролиза при малых концентрациях субстрата;

- показано, что влияние НМЭ, в том числе лекарственных соединений (антибиотиков), представляющих собой НМЭ, на процесс ферментативного гидролиза ХТЗ состоит в снижении Утах и увеличении Кт;

- доказано, что количественные закономерности ферментативного гидролиза пленочного материала на основе ХТЗ, моделируются закономерностями ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе.

Практическая значимость работы. Установлено, что в качестве физико-химического способа уменьшения скорости ферментативного гидролиза ХТЗ, с целью увеличения срока службы пленочного материала на раневой поверхности, может быть использовано введение в пленочный материал НМЭ, в том числе и лекарственных соединений, вызывающих уменьшение размеров макромолекулярного клубка и соответственное уменьшение доступности звеньев ХТЗ для взаимодействия с ферментом. Найденные в работе закономерности ферментативного гидролиза ХТЗ и влияния на скорость этого процесса некоторых лекарственных соединений-антибиотиков могут быть востребованы при создании лекарственных покрытий для защиты раневых поверхностей различной этиологии.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XXII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит-2014), Пермь, 2014; XX Международном научном форуме «Ломоносов-2013», Москва, 2013; XXI Международном научном форуме «Ломоносов-2014», Москва, 2014; XXII Международном научном форуме «Ломоносов-2015», Москва, 2015; VI Международной школе-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании», Уфа, 2013; VII Международной школе-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании»,

Уфа, 2014; IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии, Уфа-Абзаково, 2013; X Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии, Уфа-Абзаково, 2015; Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования», Уфа, 2013; Всероссийской научной конференции «Теоретические и экспериментальные исследования процессов синтеза, модификации и переработки полимеров», Уфа, 2013.

Публикации. По материалам работы опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах, 11 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Авторский вклад. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах исследования. Все приведенные в диссертации экспериментальные результаты получены автором лично либо при его участии.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 240 источников. Работа включает 17 таблиц и 40 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, указаны ее цель и задачи, представлены научная новизна, практическая значимость работы.

В первой главе диссертации представлен обзор литературы, посвященный описанию физико-химических аспектов применения полимеров в медицине, основным кинетическим закономерностям деструкции полимеров и кинетике ферментативных реакций.

Вторая глава содержит описание объектов и методов исследования, методики получения растворов и полимерных пленок на основе ХТЗ, в том числе в композиции с лекарственными соединениями.

В работе использовали полимер природного происхождения ХТЗ с молекулярной массой М1(/=113000 Да, степенью деацетилирования ~ 84%, производства ЗАО «Биопрогресс» (г. Щелково, РФ).

В качестве лекарственных веществ были использованы антибиотики аминогликозидного ряда — амикацина сульфат (АМ(804)2), амикацина хлорид (АМСЦ), гентамицина сульфат

(ГМ(804)г) и антибиотики цефалоспоринового ряда — цефазолина натриевая соль (ЪГаЦФЗ) и цефотаксима натриевая соль (КаЦФТ). В качестве низкомолекулярных солей также использовали хлорид натрия (КаС1) и сульфат натрия (Ыа2В04).

Третья глава посвящена обсуждению и интерпретации полученных экспериментальных результатов.

Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты

Задача определения скорости ферментативного гидролиза ХТЗ сводится к определению степени уменьшения его молекулярной массы во времени при выдерживании ХТЗ с раствором ферментного препарата. Самым простым и надежным способом определения молекулярной массы полимеров является вискозиметрический метод, основанный на использовании уравнения Марка-Куна-Хаувинка [?/]=.04а, связывающего молекулярную массу М полимера со значением его характеристической вязкости [7]. Однако для расчета значений М по экспериментально определенным значениям [»/], необходимо знание констант К и а, характеризующих конформационное состояние полимера в растворе. В связи с этим, первоочередной задачей стало определение коэффициентов в уравнении Марка-Куна-Хаувинка К и а, как для исходного ХТЗ в 1% растворе уксусной кислоты, так и для всех анализируемых нами систем. С этой целью было проведено фракционирование исходного ХТЗ на 10 фракций и определение молекулярных масс фракций прямым независимым методом, сочетающим скоростную седиментацию и диффузию. Для исследуемого нами образца ХТЗ в растворе 1% уксусной кислоты значения коэффициентов в уравнении Марка-Куна-Хаувинка составили £=0,56*10"4 и а=1,02, что позволяет говорить о том, что конформация ХТЗ в 1% растворе уксусной кислоты представляет собой развернутый макромолекулярный клубок.

В присутствии некоторых НМЭ, в том числе ряда антибиотиков аминогликозидного (амикацина в виде сульфата и хлорида) и цефалоспоринового (натриевой соли цефазолина) рядов, конформационное состояние ХТЗ в существенной мере изменяется, о чем свидетельствуют как закономерные изменения показателей К и а в уравнении Марка-Куна-Хаувинка, так и уменьшение значений характеристической вязкости [77] ХТЗ (см. табл.1).

Следует отметить, что изменение конформационного состояния ХТЗ, имеющее место при добавлении к его раствору НМЭ, в том числе и лекарственных соединений, необходимо принимать во

внимание при определении скорости ферментативного гидролиза, поскольку связь характеристической вязкости с молекулярной массой в случае систем ХТЗ-НМЭ-растворитель будет уже не такая, как в исходной системе ХТЗ-растворитель.

Таблица 1.

Значения характеристической вязкости хитозана и констант в

уравнении Марка-Куна-Хаувинка, определенные для растворов хитозана в 1% растворе уксусной кислоты в присутствии некоторых низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков.

Используемый НМЭ Соотношение ХТЗ:НМЭ, моль/моль [17], дл/г К*10\ дл/г а

- 1:0 7,80±0,23 0,56±0,02 1,02±0,03

АМ(804)2 1 0,01 5,65±0,17 1,73±0,05 0,89±0,03

1 0,05 5,45±0,17 2,28+0,07 0,87±0,03

1 0,10 5,28±0,16 3,19±0,09 0,83±0,02

АМСЦ 1 0,01 5,80±0,17 1,63±0,05 0,90±0,03

1 0,10 5,48±0,16 2,84±0,08 0,85±0,03

ГМ(804)2 1 0,01 5,60±0,17 1,68±0,05 0,90±0,03

1 0,10 5,31±0,16 3,31±0,09 0,83±0,03

ЫаЦФЗ 1 0,01 7,50±0,23 1,53±0,05 0,93±0,02

1 0,10 5,67±0,17 1,68±0,05 0,90±0,03

ЫаЦФТ 1 0,01 7,47±0,22 1,42±0,04 0,93±0,03

1 0,10 5,72±0,17 1,66±0,05 0,90±0,03

ЫаС1 1 0,05 6,88±0,21 1,64±0,05 0,92±0,03

1 0,50 5,43±0,16 2,36±0,07 0,86±0,03

Ыа2804 1 0,02 6,84±0,21 1,59±0,05 0,92±0,03

1 0,20 5,49±0,16 2,28±0,07 0,87±0,03

Зависимости изменения характеристической вязкости от времени выдержки ХТЗ с раствором ферментного препарата, представлены на рис. 1. Из рис. 1 видно, что с увеличением времени выдержки раствора ХТЗ с ферментом, характеристическая вязкость закономерно уменьшается, что свидетельствует об уменьшении молекулярной массы полимера.

Для всех изучаемых растворов ХТЗ при небольших временах гидролиза (в течение 10-15 минут) кривые уменьшения характеристической вязкости носят линейный характер. Именно на этом участке были определены значения [77] необходимые для расчета значений начальной скорости ферментативного гидролиза У0. Значения скорости ферментативного гидролиза У0 рассчитывали по формуле:

Уо - ^хтз концентрация ХТЗ,

К1/а11]с1/а-

(1)

где Схтз ~ концентрация Х13, подвергающегося процессу ферментативного гидролиза в растворе (г/дл); / — время гидролиза, мин.; К и а - константы в уравнении Марка-Куна-Хаувинка; [/7]0 и [77], — характеристическая вязкость раствора ХТЗ до начала деструкции и в момент времени г соответственно.

[17], дл/г

Рисунок 1. Зависимость

характеристической вязкости хитозана, выделенного из раствора с концентрацией 0,1% (/), 1,0% (2) и 2,0% (3) от времени контакта с ферментным препаратом. Содержание ферментного препарата в 1% растворе уксусной кислоты — 1 мг.

время контаетнроеания с распюром ферментного препарата, мин

Аналогичные зависимости изменения характеристической вязкости от времени ферментативного гидролиза наблюдаются при всех изучаемых нами содержаниях фермента.

Наблюдаемые зависимости начальной скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата, могут быть описаны в рамках схемы Михаэлиса-Мэнтен. На рис. 2 представлена зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза У0 от концентрации ХТЗ в растворе. Из данных рис. 2 видно, что кривые имеют классический вид и представляют собой часть гиперболы.

Представление экспериментальных данных в двойных обратных координатах (графический метод Лайнуивера-Берка) (рис. 3), позволяет точно определить значение константы Михаэлиса Кт и максимальной скорости Утах (табл.2) в уравнении Михаэлиса-Ментен (2):

Углах!

V = (2)

где Утах - максимальная скорость ферментативной реакции при данной концентрации субстрата; Кт — константа Михаэлиса, характеризующая сродство фермента к субстрату, и численно равная той концентрации субстрата 5, при которой скорость ферментативной реакции V достигает половины максимальной скорости Угти.

4 5 Ст. г/лл

Рисунок 2. Зависимость начальной скорости ферментативного

гидролиза хитозана от концентрации хитозана в растворе. Содержание ферментного

препарата в 1% растворе уксусной кислоты - 1 (У), 2 (2) и 3 (3) мг.

|/г«чо;

дл'мгн

2 3 4 5

1/Схтэ, дл/г

Рисунок 3. Зависимость начальной скорости ферментативного

гидролиза хитозана в двойных обратных координатах.

Содержание ферментного

препарата в 1% растворе уксусной кислоты - 1 (/), 2 (2) и 3 (3) мг.

Как видно из представленных в табл. 2 данных, значение константы Михаэлиса Кт является величиной практически постоянной, не зависящей от содерх<ания фермента и характеризующей сродство данного фермента к субстрату. Значение Кта3,4 г/дл является достаточно большой величиной. Например, константа Михаэлиса в случае гидролиза ХТЗ под действием хитозаназ, имеет на порядок меньшее значение. Данный факт обусловлен, вероятно, тем, что гиалуронидаза не является специфическим для ХТЗ ферментом, а рН раствора ХТЗ в 1% растворе уксусной кислоты не соответствует рН-оптимуму действия гиалуронидазы.

При низких концентрациях субстрата скорость реакции У0 прямо пропорциональна концентрации субстрата и поэтому реакция имеет первый порядок по ХТЗ. При этом, параметр Ута/Кт имеет физический смысл константы скорости реакции при малых концентрациях субстрата. При этом, зависимость скорости ферментативного гидролиза от концентрации субстрата на начальном этапе апроксимируется прямой с наклоном Утаа/Кт (табл. 2).

При проведен™ реакции в условиях избытка субстрата, максимальная скорость реакции Утах линейным образом зависит от содержания фермента.

Добавление в раствор уксусной кислоты низкомолекулярных солей-сильных электролитов - хлорида и сульфата натрия приводит к изменению кинетических параметров процесса - уменьшению Утах и увеличению Кт. Увеличение и без того большого значения К„, свидетельствует об ухудшении сродства между ферментом и

субстратом, очевидно вызванного уменьшением размеров макромолекулярного клубка (см. табл. 1)

Таблица 2.

Значения констант в уравнении Михаэлиса-Мэнтен для раствора хитозана

Изучаемая система Содержание ферментного препарата, мг кт, г/дл г*(дл*мин)"1 утаукт* ю6, мин"1

Раствор ХТЗ в 1% уксусной кислоте 1 3,37±0,10 0,50±0,02 0,15±0,01

2 3,44±0,10 0,92±0,03 0,26±0,01

3 3,42±0,10 1,51±0,05 0,44±0,01

Раствор ХТЗ:Ыа2504 в 1 % уксусной кислоте с мольным соотношением 1:0 Д 1 4,20±0,13 0,41±0,01 0,10±0,01

Раствор ХТЗ:КаС1 в 1% уксусной кислоте с мольным соотношением 1:0,5 1 4,12±0,12 0,38±0,01 0,09±0,01

Таким образом, вещества, представляющие собой НМЭ, в том числе и лекарственные вещества-антибиотики, способные оказывать влияние на конформационное состояние субстрата (см. табл. 2), по всей вероятности, способны оказать влияние и на процесс протекания реакции ферментативного гидролиза ХТЗ.

Ферментативный гидролиз хитозана в растворе уксусной кислоты в присутствии лекарственного соединения -сульфата амикацина

Наблюдаемые зависимости начальной скорости ферментативного гидролиза ХТЗ в присутствии АМ(804)2 от концентрации субстрата (ХТЗ) также могут быть описаны в рамках схемы Михаэлиса-Мэнтен, при этом введение АМ(804)2 сказывается на скорости процесса, о чем свидетельствуют кинетические параметры процесса (табл.3).

Обращает на себя внимание тот факт, что добавление АМ(804)2 вызывает одновременное уменьшение значения Утах и увеличение значений константы Михаэлиса, также как и в рассмотренных ранее случаях ферментативного гидролиза ХТЗ в присутствии хлорида и сульфата натрия, что позволяет формально описать действие АМ(804)2 в рамках модели смешанного

ингибирования и указывает на возможность замедленного превращения субстрата в тройном комплексе «ХТЗ-фермент-НМЭ».

Таблица 3.

Значения констант в уравнении Михаэлиса-Мэнтен для системы ХТЗ-_АМ(5Р4)2 в 1% растворе уксусной кислоты._

Мольное соотношение компонентов ХТЗ:АМ(804)2 Кт, г/дл V *10б г тах > г/(дл*мин) мин"1

1:0,01 4,09±0,08 0,43±0,02 0,10±0,01

1:0,05 4,16±0,21 4,16±0,21 0,37±0,02

1:0,10 4,46±0,22 0,31 ±0,02 0,07±0,01

Однако, поскольку непосредственное введение АМ(804)2 в раствор гиалуронидазы никак не сказывается на ее ферментативной активности (табл. 4), можно предположить, что наблюдаемые изменения в кинетических параметрах процесса вызваны не действием АМ(804)2 как ингибитора, а его влиянием на конформационное состояние ХТЗ.

Таблица 4.

Изучаемая система Р-гликозидазная активность, Е/г

Раствор гиалуронидазы 70,1±2,1

Раствор гиалуронидазы в присутствии 0,1 М АМ(804)2 70,8±2,1

Раствор гиалуронидазы в присутствии 0,1 М ГМ(804)2 70,0±2,1

Раствор гиалуронидазы в присутствии 0,1 М ЫаЦФЗ 70,3±2,1

Раствор гиалуронидазы в присутствии 0,1 М NaЦФT 70,5±2,1

Очевидно, имеющее место уменьшение размеров макромолекулярного клубка ХТЗ в присутствии АМ(804)2 (см. табл.1) вызывает уменьшение доступности звеньев ХТЗ для реакции с ферментом, что в свою очередь, приводит к закономерному уменьшению скорости ферментативного гидролиза. Отметим, что присутствие других антибиотиков, представляющих собой НМЭ, в растворе гиалуронидазы, так же не влияет на ее активность, но вызывает конформационные изменения ХТЗ в растворе.

Учитывая, что материалы на основе ХТЗ могут быть использованы в качестве защитных раневых покрытий, а скорость ферментативного гидролиза ХТЗ будет определять срок службы пленочного материала на раневой поверхности, практическая значимость определения кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза ХТЗ, очевидна. Однако, вид материала (раствор, гель, пленка) может определять особенности кинетики данного процесса, поскольку с топохимической точки зрения, существует принципиальная разница между доступностью для фермента звеньев полимера в растворе и в твердой фазе. Для целого ряда полимерных материалов, например, полимерных пленок, протекание ферментативного гидролиза полимера начинается с поверхности и реализуется после проникновения внутрь полимерного материала биологически активной среды или адсорбции фермента на поверхности образца.

Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте. Подложка — раствор фермента в уксусной кислоте.

Для установления взаимосвязи между процессами ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе и в пленочных образцах, в первую очередь была изучена поверхностная деструкция пленок при контакте с подложкой, содержащей раствор фермента в 1% растворе уксусной кислоты.

В случае пленок, доступная для деструкции доля поверхностных звеньев может быть весьма мала по сравнению с общим числом гликозидных связей. В самом первом приближении задачу описания кинетики гидролиза пленки можно представить как определение скорости гидролиза в растворе с концентрацией ХТЗ (г/дл), соответствующей концентрации поверхностных звеньев С5 в объеме раствора фермента, т.е.:

где тш - масса мономерных звеньев ХТЗ на поверхности пленки, г; Кф - объем раствора ферментного препарата, с которым контактирует пленка, дл.

Для оценки массы мономерных звеньев ХТЗ на поверхности пленки использованы следующие рассуждения. Зная массу та пленочного образца, можно рассчитать число мономерных хитозановых звеньев изв, приходящихся на весь объем пленки:

Пзв = ™п— (4)

мзв

где М,и - молекулярная масса звена ХТЗ; Л'А - число Авогадро.

Допустим, что мономерное звено ХТЗ вписано в куб с гранью с/. Тогда объем, занимаемый мономерным звеном в объеме пленки, равен:

V =

(5)

где Уп- объем пленочного образца. Отсюда, размер грани с1=(Угзв)1в. Теперь можно оценить, сколько мономерных звеньев п.т, каждое из которых занимает площадь 5ЗВ= с?, размещается на поверхности пленки с общей площадью поверхности 5П, контактирующей с раствором ферментного препарата

Пзв = ^ (6)

¿зв

Сделать это возможно, зная точные значения площади поверхности пленочного образца, например, используя метод лазерной сканирующей микроскопии (рис. 4).

б)

V (ммI

0.0 0,5 1.0 1,5 2.0 2,5 3-0 7. Х(мО

200

150 100 50 О

I 8

I* им 200 150 100

50' О

0,0

1.0 и

Длина, ми

1.0 1,5

Длина, мм

Рисунок 4. Микрофотография и профиль поверхности пленки хитозана (а) и хитозан-АМ(804)2 (б)

Данные лазерной сканирующей микроскопии однозначно свидетельствуют о том, что пленки ХТЗ имеют рельефную поверхность. Очевидно, что вследствие шероховатости поверхности реальная поверхность пленки существенно выше, нежели геометрическая. Так, например, площадь поверхности пленки ХТЗ, определенная по данным лазерной сканирующей микроскопии 5„ скаи в среднем в 3,3 раза больше, чем геометрическая площадь поверхности

Исходя из определенных значений 8пска„ можно определить /1зв лежащих на поверхности пленки, а затем искомую величину С5 (см. табл. 5).

Таблица 5.

Значения площади поверхности пленочных образцов и

Система Геометрические размеры образца, мм ■^п скат ММ2 С5*104, г/дл

ХТЗ а=5; Ь=5; Ь=0,1 179±9 1,28±0,08

а=5; Ь=10; Ь=0,1 342±17 1,41 ±0,08

ХТЗ-АМ(804)2 состава 1:0,01 а=5; Ь=5; Ь=0,1 154±8 1,46±0,08

а=5; Ь=10; Ь=0,1 298±15 1,59±0,09

ХТЗ-АМ(804)2 состава 1:0,05 а=5; Ь=5; Ь=0,1 150±8 1,66±0,10

а=5; Ь=10; Ь=0,1 292±15 1,84±0,11

ХТЗ-АМ(804)2 состава 1:0,1 а=5; Ь=5; Ь=0,1 148±7 1,78±0,11

а=5; Ь=10; Ь=0,1 288±14 2,02±0,12

Более того, варьируя размеры пленочных образцов, можно

получить ряд пленок с различной концентрацией С$ звеньев ХТЗ на

поверхности и определить для них значение скорости ферментативного

гидролиза У0 по уравнению (1).

На рис. 5 приведены зависимости начальной скорости

ферментативного гидролиза ХТЗ в пленочных образцах от

концентрации поверхностных звеньев ХТЗ. V* ю".

" 18а=0,25*1СГ

Рисунок 5. Зависимость начальной скорости

ферментативного гидролиза хитозана в пленочных образцах от концентрации поверхностных звеньев

хитозана. Содержание

ферментного препарата 1 (1), 2 (2) и 3 (3) мг.

ио 1,20 1.20 1.20 С,*10\Г/ДД

Обращает на себя внимание, что тангенсы угла наклона кривой зависимости У0 от поверхностной концентрации звеньев ХТЗ на рисунке 5 практически совпадают со значениями Ута/Кт,

определенными при проведении процесса гидролиза в растворе (табл. 2).

Таким образом, обрабатывая зависимость У0 от С„ можно определить значения констант Ута/Кт, имеющих физический смысл константы скорости реакции при малых концентрациях субстрата, из данных по ферментативному гидролизу пленочных образцов (таблица 6).

Таблица 6.

Значение кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов ХТЗ и ХТЗ-АМС на подложке, смоченной раствором _ферментного препарата в 1% растворе уксусной кислоты_

Мольное соотношение компонентов ХТЗ:АМ(804)2 Содержание ферментного препарата, мг мин"1

1 0,16±0,01

1:0 2 0,25±0,01

3 0,42±0,02

1 0,10±0,01

1:0,01 2 0,21±0,01

3 0,30±0,02

1 0,09±0,01

1:0,05 2 0,13±0,01

3 0,28±0,01

1 0,07±0,01

1:0,10 2 0,15±0,01

3 0,21±0,01

Аналогичные закономерности были обнаружены и для пленочных систем ХТЗ-АМ(504). В этом случае также, как и при проведении гидролиза пленочных образцов ХТЗ, наблюдалось совпадение значений Утш/Кт, определенных при проведении ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе и в пленочных образцах (см. табл. 3 и 6). Более того, так же как и при проведении гидролиза ХТЗ в смеси с АМ(504) в растворе, наблюдается следующая закономерность — чем больше НМЭ находится в растворе, тем медленнее гидролизуется ХТЗ.

На основе полученных результатов можно предположить, что гидролиз пленочных образцов ХТЗ и ХТЗ-АМ(804)2 подчиняется тем же кинетическим закономерностям, что и ферментативный гидролиз в растворе при малых концентрациях субстрата. Это дает возможность определить кинетические параметры процесса даже в том случае, когда по каким-либо причинам провести ферментативный гидролиз в

растворе не представляется возможным. Например, невозможно исследовать процесс ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе, используя в качестве растворителя не кислую среду, а нейтральную (поскольку ХТЗ в нейтральных средах не растворяется). Между тем, с практической точки зрения, гораздо важнее знать скорость ферментативного гидролиза ХТЗ в средах, близких к нейтральным, нежели в растворе уксусной кислоты. В этом случае можно провести ферментативный гидролиз пленочных образцов, контактирующих с раствором ферментного препарата в нейтральной среде. Если при этом будет известна поверхностная концентрация звеньев ХТЗ, станет возможным рассчитать значение параметра Ута/Кт аналогично тому, как это было показано на примере пленочных образцов ХТЗ и ХТЗ-АМ(804)2.

Ферментативный гидролиз хитозана в пленках, полученных из раствора в уксусной кислоте. Подложка -раствор фермента в воде и растворе Рингера-Локка

В табл. 7 представлены результаты расчетов кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза, определенного по данным измерения характеристической вязкости ХТЗ, выделенного из пленочных образцов, от времени контакта пленки с раствором ферментного препарата в воде и растворе солей, имитирующих по составу плазму крови (раствор Рингера-Локка). Из данных табл. 7 видно, что найденные ранее закономерности, связанные с замедлением процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в присутствии НМЭ в растворе уксусной кислоты и в пленках, контактирующих с раствором ферментного препарата в уксусной кислоте, сохраняются и при проведении гидролиза пленочных образцов ХТЗ, контактирующих с раствором ферментного препарата в воде и в растворе Рингера-Локка. Как видно из данных табл. 7, найденные ранее закономерности по влиянию АМ(804)2 на скорость ферментативного гидролиза ХТЗ сохраняются - чем больше АМ(804)2 находится в пленке ХТЗ, тем меньше Ута/Кт, т.е. тем медленнее деструктирует пленка.

Можно отметить также отсутствие принципиальных отличий между значениями параметра УтаУКт, характеризующего скорость протекания процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов, полученных при использовании раствора фермента в воде и в растворе Рингера-Локка. Для расширения круга используемых лекарственных соединений рассмотрен процесс ферментативного гидролиза пленочных образцов ХТЗ с еще одним антибиотиком аминогликозидного ряда — сульфатом гентамкцина и антибиотиками

цефалоспоринового ряда — натриевыми солями цефазолина и цефатоксима.

Таблица 7.

Значение кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов ХТЗ и ХТЗ-АМС на подложке с раствором ферментного препарата в воде и в растворе Рингера-Локка. Содержание ферментного _препарата — 1 мг.__

Мольное соотношение компонентов ХТЗ:АМ(804)2 Тип подложки Утах/Кт*Ю6, мин"1

1:0 Вода 0,30±0,02

Раствор Рингера-Локка 0,32±0,02

1:0,01 Вода 0,23±0,01

Раствор Рингера-Локка 0,24±0,01

1:0,05 Вода 0,20±0,01

Раствор Рингера-Локка 0,22±0,01

1:0,1 Вода 0,19±0,01

Раствор Рингера-Локка 0,21 ±0,01

Как показали проведенные исследования, для всех изученных пленочных систем «ХТЗ-лекарственное вещество» наблюдаются общие закономерности — параметр Ута/Кт, имеющий физический смысл эффективной константы скорости, закономерно уменьшается при введении в пленочный образец ХТЗ лекарственного вещества, представляющего собой НМЭ (табл. 8).

Таблица 8.

Значение кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов хитозана в смесях с низкомолекулярными электролитами на подложке, смоченной раствором ферментного препарата в растворе

Рингера-Локка. Содержание ферментного препарата 1 мг.

Изучаемая система Мольное соотношение компонентов ХТЗ:ЛВ (НМЭ) мин"1

ХТЗ-ГМ(804)2 1:0,01 0,25±0,01

1:0,1 0,21±0,01

ХТЗ-ЫаЦФЗ 1:0,01 0,28±0,01

1:0,1 0,25±0,01

ХТЗ-ИаЦФТ 1:0,01 0,27±0,01

1:0,1 0,24±0,01

ХТЗ-ЫаС! 1:0,05 0,26±0,01

1:0,5 0,23±0,01

Таким образом, изучение кинетических особенностей процесса ферментативного гидролиза ХТЗ, в том числе и в присутствии лекарственных соединений, под действием неспецифического ферментного препарата гиалуронидазы, присутствующего на раневой поверхности организма человека и способной вызвать распад Р-гликозидной связи в ХТЗ, выявило некоторые важные закономерности.

Во-первых, то, что ХТЗ представляет собой полиэлектролит, приводит к тому, что увеличение ионной силы раствора при добавлении НМЭ, в том числе и лекарственных соединений, сказывается на конформации макромолекулярных клубков ХТЗ, а именно, на уменьшении его размеров и увеличения плотности. Об этом свидетельствуют изменения характеристической вязкости ХТЗ, и констант в уравнении Марка-Куна-Хаувинка, определенные в присутствии НМЭ, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков. Важно, что изменение конформационного состояния ХТЗ, вызывное присутствием НМЭ, в том числе и лекарственных веществ-антибиотиков, оказывает принципиально важное влияние на процесс ферментативного гидролиза ХТЗ, поскольку уменьшает доступность звеньев ХТЗ для взаимодействия с ферментом.

Во-вторых, установлено, что ферментативный гидролиз ХТЗ может быть описан в рамках схемы Михаэлиса-Ментен. Изменение кинетических параметров процесса, вызванное присутствием НМЭ, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков во всех изученных случаях сводится к уменьшению Утах и увеличение Кт, а также уменьшению значения Утал/Кт, имеющего физический смысл константы скорости реакции. Увеличение и без того большого значения Кт, свидетельствует об ухудшении сродства между ферментом и субстратом, очевидно вызванного уменьшением размеров макромолекулярного клубка. При этом следует отметить, что уменьшение скорости ферментативного гидролиза происходит на фоне того, что изученные соединения не оказывают влияния на общую гликозидазную активность гиалуронидазы.

В-третьих, разработанный подход по изучению ферментативного гидролиза пленочных образцов ХТЗ и ХТЗ в смесях с лекарственным соединениями (антибиотиками), представляющими собой низкомолекулярные соли, с определением количества звеньев ХТЗ, лежащих на поверхности, позволил доказать сопоставимость кинетических параметров ферментативного гидролиза пленок ХТЗ и аналогичных им по составу растворов при малых концентрациях субстрата. Данный факт позволяет путем изучения процесса ферментативного гидролиза в растворе получать достоверные

результаты о кинетических параметрах процесса биодеструкции полимерного материала, и, наоборот, в тех случаях, когда исследование в растворе не представляется возможным. Таким образом, несмотря на принципиально различную топологию изучаемых систем (раствор ХТЗ — пленка ХТЗ) показано, что кинетические закономерности процесса гидролиза хитозана в растворе при малых концентрациях субстрата и монолитной пленки ХТЗ, едины. Роль среды, в котором растворен ферментный препарат сказывается на численном значении параметра Утах/Кт. Например, при замене подложки на которой находится ферментный препарат с уксусной кислоты на воду или раствор Рингера-Локка, происходит увеличение значения Утш/Кт, поскольку повышение рН благоприятно сказывается на активности ферментного препарата. Однако, независимо от выбранной среды, закономерности, связанные с замедлением процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в присутствии НМЭ, в том числе и лекарственных соединений-антибиотиков, имеют место не только при проведении ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе, но и при проведении деструкции пленочных образцов. При этом наблюдается корреляция между конформационным состоянием ХТЗ, который он имел в исходном растворе (значениями характеристической вязкости ХТЗ и параметра а в уравнении Марка-Куна-Хаувинка) и кинетическими параметрами процесса ферментативного гидролиза пленочных образцов ХТЗ (рис. 6)

АМ(804)2, бесцветыми точками -ХТЗ-ГМ(804)2, бесцветными квадратами -ХТЗ-ЫаЦФЗ, бесцветными треугольниками -ХТЗ-ЫаЦФТ, черными квадратами —ХТЗ-МаС1.

Таким образом, можно утверждать, что введение в пленочный материал на основе ХТЗ низкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений, вызывающих сжатие макромолекулярного клубка и соответственное уменьшение доступности звеньев ХТЗ для взаимодействия с ферментом, может

1.0 а

Содержание ферментного препарата 1 мг. Подложка — фермент в растворе Рингера-Локка. Черными точками обозначены пленки ХТЗ-

Рисунок 6. Зависимость кинетического параметра

Утах/Кт ПЛеНОЧНЫХ ОбраЗЦОВ

ХТЗ от параметра а в уравнении

Марка-Куна-Хаувинка.

быть рассмотрено в качестве способа направленного уменьшения скорости ферментативного гидролиза ХТЗ с целью потенциального увеличения срока службы пленочного материала на раневой поверхности.

Выводы:

1. Установлено, что процесс ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе уксусной кислоты под действием фермента гиалуронидазы описывается в рамках схемы Михаэлиса-Ментен и рассчитаны кинетические параметры процесса ферментативного гидролиза ХТЗ.

2. Показано, что влияние НМЭ, в том числе и лекарственных соединений, на процесс ферментативного гидролиза ХТЗ в растворе может быть формально объяснено в рамках модели смешанного неконкурентного ингибирования. Об этом свидетельствует факт снижения Утах и увеличения Кт, указывающий на возможность замедленного превращения субстрата (ХТЗ) в тройном комплексе «ХТЗ-фермент-НМЭ». Наиболее вероятной причиной изменения кинетических параметров процесса ферментативного гидролиза ХТЗ в присутствии НМЭ является уменьшение доступности звеньев ХТЗ для взаимодействия с ферментом, вызванное уменьшением размеров макромолекулярного клубка полиэлектролита и увеличением плотности упаковки его звеньев при изменении ионной силы раствора.

3. Показано, что закономерности ферментативного гидролиза пленочных материалов на основе ХТЗ, коррелируют с закономерностями гидролиза ХТЗ в растворе. Это подтверждается сопоставимостью кинетических параметров ферментативного гидролиза пленок ХТЗ и аналогичных им по составу растворов при малых концентрациях субстрата.

4. В качестве способа уменьшения скорости ферментативного гидролиза ХТЗ, с целью потенциального увеличения срока службы пленочного материала на раневой поверхности, может быть использовано введение в пленочный материал на основе ХТЗнизкомолекулярных электролитов, в том числе и лекарственных соединений (сульфатов амикацина и гентамицина, натриевых солей цефазолина и цефатоксима), являющихся сильными электролитами.

Список опубликованных работ по теме диссертации: Статьи в журналах:

1. Кулиш Е.И., Туктарова И.Ф.. Чернова В.В., Захаров

B.П., Колесов C.B. Кинетические особенности процесса ферментативного гидролиза пленок хитозана // Химическая физика. 2015. Т. 34. №4. С. 35-39.

2. Кулиш Е.И., Туктарова И.Ф.. Чернова В.В. Ферментативная устойчивость лекарственных пленочных материалов на основе хитозана//Перспективные материалы. 2014. № 6. С. 25-31.

3. Туктарова И.Ф.. Чернова В.В., Кулиш Е.И. Об особенностях вискозиметрического исследования хитозана в растворе уксусной кислоты // Бутлеровские сообщения. 2013. Т. 34. № 4. С. 102106.

4. Кулиш Е.И., Туктарова И.Ф.. Чернова В.В., Колесов

C.B. Изучение процесса ферментативного расщепления хитозана в растворе уксусной кислоты // Вестник Башкирского университета. 2013. Т. 18. №3. С. 688-690.

5. Кулиш Е.И., Туктарова И.Ф.. Чернова В.В., Абзальдинов Х.С., Заиков Г.Е. Изучение процесса ферментативного гидролиза хитозановых пленок с включенным антибиотиком цефазолином // Вестник Казанского технологического университета. 2013. Т. 16. № 14. С. 137-139.

6. Туктарова И.Ф.. Лаздин Р.Ю., Чернова В.В. Изучение влияния антибиотика сульфата гентамицина на процесс ферментативного гидролиза хитозана в растворе уксусной кислоты // Научно-технический вестник Поволжья. 2015. № 2. С. 41-43.

Статьи в сборниках научных трудов и тезисы докладов:

7. Туктарова И.Ф.. Чернова В.В., Кулиш Е.И. Особенности высвобождения лекарственных веществ в биодеградируемых системах на основе хитозана // Тезисы докладов IX всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии, 2013. Уфа-Абзаково. С.299.

8. Tuktaroval.F. The peculiarities of releasing medicinal preparations in biodegradable chitosan-based systems // Тезисы Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Актуальные вопросы науки и образования», 2013. Уфа. С.354.

9. Туктарова И.Ф. Ферментативная деструкция пленок хитозан-цефазолин // Материалы ХХМеждународного научного форума Ломсносов-2013, 2013. Москва.

10. Туктарова И.Ф.. Кулиш Е.И. Ферментативный гидролиз хитозана в присутствии амикацина сульфата // Тезисы

докладов VI Международной школы-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании». Уфа, 2013. С. 193.

11. Туктарова И.Ф.. Турина М.С. Ферментативный гидролиз материалов на основе хитозана // Материалы XXI Международного научного форума Ломоносов-2014,2014. Москва.

12. Туктарова И.Ф.. Галина А.Р., Кулиш Е.И. Ферментативный гидролиз хитозана в присутствии сульфата амикацина // Материалы II Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения В.А. Кухтина «Современные проблемы химической науки и фармации», 2014. Чебоксары. С. 212-213.

13. Туктарова И.Ф.. Лаздин Р.Ю. Биодеструкция лекарственных пленок хитозана неспецифическим ферментом гиалуронидазой // Тезисы докладов VII Международной школы-конференции для студентов, аспирантов и молодых ученых «Фундаментальная математика и ее приложения в естествознании». Уфа, 2014. С. 178-179

14. Туктарова И.Ф.. Кулиш Е.И. Ферментативная деструкция хитозана в присутствии антибиотика сульфата амикацина // Материалы VI Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2014». Москва, 2014. С. 542.

15. Туктарова И.Ф.. Кулиш Е.И., Чернова В.В. Кинетика ферментативного гидролиза пленочных покрытий на основе хитозана // Материалы XXII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Пермь- 2014. - С. 308-313.

16. Тимербаева Д. А, Туктарова И.Ф. Кинетические закономерности деструкции лекарственных пленочных хитозановых материалов под действием фермента человеческого организма — гиалуронидазы // Материалы XXI Международного научного форума Ломоносов-2015,2015. Москва.

17. Туктарова И.Ф., Чернова В.В., Шуршина А.С., Кулиш Е.И. Защитные раневые покрытия на основе хитозана с регулируемой скоростью биорезорбции и контролируемой скоростью выхода лекарственных препаратов // Тезисы докладов X Всероссийской конференции «Химия и медицина» с молодежной научной школой по органической химии, 2015. Уфа-Абзаково. С. 213.

ТУКТАРОВА ИРИНА ФАНИСОВНА

КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ХИТОЗАНА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ГИАЛУРОНИДАЗЫ В ПРИСУТСТВИИ НЕКОТОРЫХ АНТИБИОТИКОВ - НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭЛЕКТРОЛИТОВ

Специальность 02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Лицензия на издательскую деятельность ЛР№> 021319 от 05.01.99 г.

Подписано в печать 25.06.2015 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,38. Уч.-изд. л. 1,44. Тираж 110 экз. Заказ 275

Редакционно-издательский центр Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.

Отпечатано на множительном участке Башкирского государственного университета 450074, РБ, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.