Деструкция хитозана под действием некоторых ферментных препаратов медицинского назначения тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

1С0ПИСИ

ЧЕРНОВА ВАЛЕНТИНА ВИТАЛЬЕВНА

ДЕСТРУКЦИЯ ХИТОЗAHA ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

2 7 ОКТ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Уфа-2011

4858456

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет».

Научный руководитель:

доктор химических наук, доцент Кулиш Елена Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Сигаева Наталия Николаевна

кандидат химических наук Понеделькина Ирина Юрьевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится 28 октября 2011 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 002.004.01 в Учреждений Российской академии наук Институте органической химии Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Башкортостан, г. Уфа, пр. Октября, 71, зал заседаний. Тел./факс: (347) 2356066, e-mail: chemorg@anrb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Уфимского научного центра РАН.

Автореферат разослан _28 сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений в области поиска новых материалов для медицины стало изучение, создагаш и внедрение в практику материалов на основе хитозана. Уникальный комплекс нативных свойств хитозана - биосовместимость, биодеградируемость, нетоксичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности, позволяют отнести этот аминополисахарид к немногочисленной группе промышленно доступных, экологически безопасных полимеров и, в перспективе, -к потенциально новым биоматериалам на его основе, исключительно подходящим для использования в медицинских целях. Поскольку хитозан достаточно быстро претерпевает биодеградацию под действием ферментов живого организма, не образуя токсичных веществ, он может стать прекрасным биоразлагаемым защитным материалом для лечения открытых ран и ожогов. Особый интерес могут представлять ферментсодержащие пленочные хитозановыс материалы, которые целесообразно использовать на стадии очищения раны от некротических тканей и в косметической терапии келоидных рубцов. При этом существует принципиальная возможность регулирования скорости ферментативного разложения материалов на раневой поверхности.

В связи с этим особую актуальность приобретает целенаправленное изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана под действием неспецифических для хитозана ферментов, присутствующих на ране, а также поиск путей регулирования ферментативной устойчивости пленочных материалов, полученных на его основе.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» по теме «Химия и физико-химия полимеров и полимерных систем медицинского назначения» (ГР № 01.2006.10183). Научные исследования проводились при поддержке РФФИ проекта: «Физико-химические основы создания физиологически активных полимерных материалов с управляемыми свойствами для медицинского применения на основе полимеров природного происхождения» (грант р поволжье а №08-03-97030), а также ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (г/к №02.740.11.0648).

Цель работы. Изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана в растворе и в пленочных образцах, полученных из раствора, и поиск путей регулирования его ферментативной устойчивости.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: -изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана под действием ряда ферментных препаратов в растворе;

-изучение особенностей ферментативной деструкции пленочных хитозановых материалов, полученных методом формования из раствора;

-установление возможной причины деструкции хитозана под действием неспецифических ферментов;

-модификация пленочных образцов с целью регулирования их ферментативной устойчивости;

-изучение закономерности ферментативной деструкции ферментсодержащих пленочных материалов на основе хитозана.

Научная новизна и практическая значимость. В результате исследования закономерностей ферментативных превращений хитозана в растворе и твердой фазе:

- выявлена роль надмолекулярных эффектов при ферментативной деструкции хитозана под действием неспецифических для него ферментов в растворе и в твердых пленках;

- показано, что в области разбавленных растворов в термодинамически хороших растворителях макромолекулы хитозана в различной степени ассоциированы, что в свою очередь является причиной наблюдающейся зависимости скорости деструкции от термодинамического качества растворителя и концентрации раствора; в ферментативной дест-

рукшш пленочных образцов хитозана надмолекулярный эффект проявляется как зависимость скорости и степени ферментативной деструкции от степени кристалличности образцов и плотности упаковки макроцепей;

- выявлена принципиальная возможность регулирования ферментативной устойчивости пленочных образцов путем их направленной структурной модификации, при которой изменяется плотность упаковки макромолекул (перевод хитозана из солевой формы в основную, изотермический отжиг), следствием чего является уменьшение степени ферментативной деструкции пленок; добавление второго полимера -поливинилового спирта или полвдиметилдиаллиламмоний хлорида, склонного к образованию гегероассоциатов с хитозаном в растворе, напротив, приводит к увеличению степени ферментативного разложения пленки, вследствие понижения плотности упаковки макромолекул;

- показано, что ферментативной деструкции подвергается преимущественно аморфная фаза хитозана, в результате - повышается степень кристалличности деструкгированных образцов; в случае твердых пленок с иммобилизованными ферментными препаратами повышение степени кристалличности хитозана приводит к повышению устойчивости пленок к последующему процессу ферментативного разложения при внешнем контакте с ферментами.

Разработаны принципиальные подходы к созданию пленочных хитозановых материалов с регулируемой биоустойчивостью, соответствующих современным требованиям к временным покрытиям для защиты и лечения ожоговых и гнойных ран. Материалы могут быть рекомендованы для клинического применения.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Мевду-народвой конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, МГУ, 2008 г. и 2011 г.), IX и X Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008 г. и Нижний Новгород, 2010 г.), Всероссийской конференции, посвященной 40-летию кафедры высокомолекулярных соединений ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» «Высокомолекулярные соединения. Наука и практика» (Уфа, 2008 г), VII Всероссийской конференции «Химия и медицина. 0рхимед-2009» (Уфа, 2009 г.), XVI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2009г.), V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры - 2010» (Москва, 2010г.), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии. Теория и практика» (Уфа,2010 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые материалы, химические технологии и реагенты для промышленности, медицины и сельского хозяйства на основе нефтехимического и возобновляемого сырья» (Уфа,2011 г.)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 2 / печатных работ, из них 6 статей - в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК для публикации материалов диссертационных исследований, 4 статьи - в сборниках статей и 2 статьи - в материалах Международных конференций, тезисы 2 докладов - на Международных и 6 докладов - на Всероссийских конференциях, получен 1 патент РФ с решением о выдаче.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 152 источника. Работа включает 14 таблиц и 41 рисунок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Ферментатнвная деструкция хитозана под действием ферментных препаратов медицинского назначения.

1.1. Ферментативная деструкция хитозана в растворе.

Протекание деструктивных превращений хитозана (ХТЗ) исследовано вискозимет-рическим методом, который позволяет установить факт протекания деструкции по уменьшению вязкости растворов ХТЗ в присутствие ферментных препаратов. Показано, что добавление к раствору ХТЗ ферментных препаратов «Лираза», «Трипсин», «Коллаге-наза КК», «Пепсин» сопровождается существенным уменьшением относительной вязкости раствора полимера. Наиболее интенсивно уменьшение вязкости происходит в первые несколько суток - затем скорость снижения вязкости раствора ХТЗ в присутствии фермента уменьшается (рис. 1).

Рис.1. Зависимость изменения относительной вязкости 2% раствора ХТЗ от времени выдержки раствора с ферментными препаратами «Лираза» (1), «Трипсин» (2), «Коллагеназа»(3) и «Пепсин» (4). Раствор в 1 % уксусной кислоте. Массовое отношение (%) хитозан:фермент = 95:5.

Аналогичного вида зависимости наблюдаются и для изменения характеристической вязкости ХТЗ, выделенного из раствора, после взаимодействия с ферментными препаратами. Кривая изменения вязкости от времени в начальный период имеет линейный характер и исходит из начала координат (рис. 2), что свидетельствует о разрыве макроцепей по закону случая. Со временем степень ферментативного гидролиза гликозидных связей уменьшается, что видно по уменьшению тангенса угла наклона кривых (рис. 2 а, кривая I), и при длительных временах выдержки раствора ХТЗ с ферментом выходит на плато (рис. 2).

_1, сутки__4 . и СУТКИ

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости ХТЗ, выделенного из 2% раствора, от времени выдержки раствора с ферментными препаратами «Лираза» (1а), «Трипсин» (2а), «Коллагеназа»( 1 б) и «Пепсин» (26). Раствор в 1 % уксусной кислоте. Массовое отношение (%) хитозан:фермент = 95:5.

1.1.1. Возможные причины изменения вязкости растворов хитозана под действием ферментных препаратов. Возможность действия ферментных препаратов как протеаз.

Среди исследованных ферментных препаратов только «Лираза» представляет собой группу ферментов под общим названием гиалуронидаз, обладающих активностью в отношении гидролитического расщепления и деполимеризации полисахарида - гиалуро-новой кислоты - основного компонента соединительной ткани. Гиалуроновые кислоты представляют собой высокомолекулярные линейные биополимеры, построеные из чередующихся остатков О-глюкуроновой кислоты и 1\!-ацетил-0-глшсозамина, соединённых |3-(1-4)- и (5-(1-3)-связями, т.е. являются веществами с близкой к ХТЗ химической структурой. Соответственно, можно было бы предположить, что эта близость химической структуры и заставляет работать фермент в процессе ферментативной деструкции ХТЗ. Однако, наблюдаемые закономерности получаются аналогичными и в случае использования ферментных препаратов - «Коллагеназа», «Трипсин» и «Пепсин», являющихся протеазами (рис. 1, кривые 2-4, и 2, кривые 16, 2а, 26). Поскольку протеолитические ферменты не должны вызывать гидролиз полисахарида, естественным было бы предположить, что деструкции подвергаются ковалентно связанные с ХТЗ фрагменты белковых примесей, перешедшие из хитин-минерально-белкового комплекса. Однако, ферментативный гидролиз карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), которая априори не содержит веществ белкового происхождения, но имеет так же как и ХТЗ р-гликозидные связи, под действием «Трипсина», «Пепсина», «Лиразы» и «Коллагеназы», в водном растворе приводит к аналогичным зависимостям (рис. 3) - закономерному уменьшению и относительной, и характеристической вязкости растворов по мере их выдержи с ферментами. Таким образом, причина падения характеристической вязкости не связана с наличием в полимерах примесей белка.

Рис. 3. Зависимость изменеиия относительной (а) вязкости 2% раствора КМЦ и характеристической вязкости (б), выделенной из 2% раствора КМЦ, в воде от времени выдержки раствора с ферментным препаратом «Лираза» (1), «Трипсин» (2), «Коллагена-за»(3) и «Пепсин» (4). Массовое отношение (%) КМЦ : фермент = 95 : 5.

1.1.2. Возможные причины изменения вязкости растворов хитозана в присутствии ферментных препаратов. Протекание кислотного гидролиза в растворе уксусной кислоты.

В принципе изменение вязкости раствора полимера может являться следствием гидролиза раствором уксусной кислоты, а не действия собственно ферментных препаратов. Основанием для выдвижения такого предположения служит факт, что в отсутствие фермента, растворение ХТЗ в уксусной кислоте сопровождается резким, правда однократным изменением (уменьшением) в значениях его характеристической вязкости (табл. 1). Дополнительный прогрев переосажденного образца также сопровождается некоторым уменьшением значения вязкости. Для определения причин изменения характеристической вязкости ХТЗ в присутствии ферментных препаратов и уменьшения вязкости в отсутствие ферментов после переосаждения полимера поставлены независимые эксперименты по определению молекулярных масс ХТЗ методом скоростной седиментации и определению продуктов ферментативного гидролиза полисахаридов - восстанавливающих Сахаров. Как видно из данных табл. 1 и для переосажденного и для прогретого образца ХТЗ, значение константы седиментации и коэффициента диффузии фактически совпадает с их значения-^ ми для исходных образцов ХТЗ.

Это свидетельствует о том, что значение молекулярной массы ХТЗ в процессе его прогрева и переосаждения не изменяется, соответственно, растворение ХТЗ в растворе уксусной кислоты, не приводит к деструкции полимера. Напротив, выдержка ХТЗ в уксуснокислом растворе в присутствии фермента приводит к значительному уменьшению константы седиментации и увеличению коэффициента диффузии, а следовательно, значительному уменьшению молекулярной массы ХТЗ, имеющему место в результате протекания процесса ферментативной деструкции.

Некоторые физико-химические характеристики образцов хитозана, определенные в ацетатном буфере с рН=4,5

Образец ХТЗ* Используемый фермент м. дл/г &>*10"ед. Сведб. М^ПО"5 М5а* 10°

ХТЗ-1 _ 4,45 3,00 1,30 1,71 1,60

ХТЗ-11 _ 3,69 ЗЛО 1,35 1,63 1,57

ХТЗ-12 _ 3,50 3,15 1,38 1.62 1,59

ХТЗ-!3 лираза 1,10 1,84 4,00 0,21 0,25

ХТЗ-11 коллагеназа 0,60 1,79 5,70 0,15 0,21

ХТЗ-1' трипсин 1,80 1,97 3,50 0,30 0,42

ХТЗ-2 _ 6,10 7,13 1,02 4,17 3,34

ХТЗ-21 _ 4,90 7,20 1,10 3,78 3,12

ХТЗ-З _ 3,45 2,15 1,49 0,89 0,99

ХТЗ-З1 - 2,82 2.20 1,56 0,84 0,97

Примечание: * - молекулярная масса, используемых в работе образцов хитозана, 160 кДа (ХТЗ-1), 350

Да(ХТЗ-2), 100 кДа (ХТЗ-З).

1 -образец ХТЗ переосажден из раствора в уксусной кислоте;

2 -образец исходного ХТЗ, раствор которого в ацетатном буфере был подвергнут дополнительному прогреванию при температуре порядка 70-80°С;

3 - образец ХТЗ выделен из ферментсодержащего раствора в 1% уксусной кислоте, время выдержки ХТЗ в растворе - 40 суток, содержание фермента - 5% от массы ХТЗ.

Определение концентрации восстанавливающих Сахаров в ходе эксперимента также показало, что выдержка растворов ХТЗ в присутствии ферментных препаратов приводит к закономерному накоплению восстанавливающих Сахаров в соответствии со схемой, в то время как в отсутствии ферментного препарата этого не наблюдается (табл. 2).

Количество восстанавливающих Сахаров, образующихся при выдержке растворов ХТЗ-1 в уксусной кислоте

Используемый фермент Количество восстанавливающих сахароз, мг/0,1 мл, образующихся при выдержке растворов в течении, суток

1 2 5 10 20

_ 0,070 0,070 0,070 0,070 0,070

лираза 0,106 0,150 0,204 0,241 0,300

пепсин 0,150 0,188 0,241 0,343 0,370

коллагеназа 0,124 0,168 0,222 0,331 0,343

трипсин 0,088 0,115 0,186 0,204 0,213

1.1.3. Возможные причины изменения вязкости растворов хитозана в присутствии ферментных препаратов. Действие ферментов как гликозпдаз.

Полученные экспериментальные данные позволяют предположить, что во всех использованных нами ферментных препаратах присутствуют ферменты с Д-гликозидазной активностью. Это может иметь место, так как все используемые в работе ферменты получены из биоматериала: «Коллагеназа» - из гепатопанкреаса промысловых видов камчатского краба, «Лираза» - из семенников крупного рогатого скота, «Трипсин» и «Пепсин» -из поджелудочной железы крупного рогатого скота и свиньи. Они могут иметь в качестве примесных ферменты, содержащиеся в лизосомах, среди которых и р-гликозидазы, назначение которых - лизис протеогликанов, составляющих основу соединительной ткани живых организмов.

Для всех использованных в работе ферментных препаратов было проведено определение р-гликозидазных активностей - общей, экзо- и эндогликозидазной. Обращает на себя внимание, что значения общей и экзо-гликозидазной активности ферментных препаратов (табл. 3) несколько отличаются от их способности гидролизовать хитозан (см. рис. 1 и 2). Данный факт можно объяснить тем, что основной вклад в изменение характеристической вязкости ХТЗ вносят только эндо-гликозидазы.

Таблица 3

Значение гликозидазной активностей используемых в работе ферментов*

Ферментный препарат общая Р- гликозидазная активность, Е/г экзо- Р-гликозидазная активность, Е/г ЭНДО- Р- гликозидазная активность, Е/г

«Трипсин» 46,1 40,3 14,1

«Пепсин» 124,5 76,5 96,1

«Коллагеназа» 166,3 80,1 115,9

«Лираза» 70,1 64,2 28,8

Примечание: * в качестве субстрата были использованы - целлюлозная масса в случае определения общей р-гликозидазной активности; л-китрофенид-р-О-глюкопиранозид в случае определения экзо-Р-гликозидазггой активности и водорастворимая КМЦ в случае определения эндо-р-гликозидазной активности.

За единицу общей р-гликозидазной активности принимали количество ферментного препарата, которое образует 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров за 1 минуту гидролиза 50 мг целлюлозной массы при комнатной температуре. За единицу эндо-Р-гликозидазной активности принимали количество ферментного препарата, который статистически расщепляет 1 мкмоль гпикозидных связей за 1 минуту при комнатной температуре. За единицу экзо-глнкозидазпой активпости принимали количество ферментного препарата, которое образует 1 мкмоль л-нитрофенола за 1 мин при инкубации раствора субстрата - п-нитрофенил-р-В-плюкопиранозида, при комнатной температуре.

Таким образом, причина уменьшения характеристической вязкости ХТЗ, а также накопления восстанавливающих Сахаров в деструктированном ХТЗ в присутствии исследованных ферментных препаратов, связана с протеканием гидролиза основной цепи ХТЗ, вследствие наличия в них (3- гликозидаз.

1.1.4. Проявление надмолекулярных эффектов в ходе ферментативного гидролиза

хитозана в растворе

Растворы полярных полимеров вообще и ХТЗ в частности склонны к структурированию, т.е. к формированию различных флуктуационных надмолекулярных структур. Об этом свидетельствуют как литературные данные, так и наши собственные исследования.

Как правило, при описании вязкостных свойств разбавленных растворов, исходят из линейной зависимости приращения вязкости от концентрации полимерного раствора. Однако, в случае полярных полимеров, к которым относится и ХТЗ, существует вероятность протекания обратимых агрегационных процессов, которые могут иметь место не только в области полуразбавленных, но даже и в области разбавленных растворов.

В этом случае вклад в вязкость вносят не отдельные частицы с объемом Го, а их ассоциаты, объем которых V(n) зависит не только от числа составляющих его частиц п, но и от плотности их упаковки, характеризуемой фрактальной размерностью D :

V(n)= VonVD

В результате неплотной упаковки частиц в ассоциате их вклад в вязкость начинает зависеть от концентрации нелинейно:

Ati~4acs,S> 1

Обработка экспериментальных зависимостей удельной вязкости растворов ХТЗ от концентрации в двойных логарифмических координатах позволяет определить степенной показатель S, соответствующие значения которого представлены в табл. 4. Во всех рассматриваемых случаях, значения показателя 5, определенные при концентрациях ХТЗ в растворе даже меньших, чем точка кроссовера, превышают значение 1, что однозначно говорит о том, что растворы ХТЗ в уксусной кислоте представляют собой структурированные системы и процессы ассоциации в полимерном растворе начинаются уже в области разбавленных растворов.

Таблица 4

Значения характеристических вязкостен [г)] и степенного показателя <5 для различных образцов ХТЗ, определенные в ацетатном буфере с рН=4,5 до (0) и после (1) переосаждения из раствора в уксусной кислоте

Образец Mo, дл/г 00 Гп1ь дл/г S,

ХТЗ-1 4,45 1,28 3,11 1,22

ХТЗ-2 6,10 1,21 4,90 1,18

ХТЗ-З 3,45 1,31 2,82 1,25

Для раствора в ацетатном буфере переосажденного ХТЗ наряду с уменьшением характеристической вязкости уменьшается и степень структурирования раствора (табл. 4). Тем не менее, раствор все равно остается ассоциированным. Вероятно, образцы ХТЗ, прошедшие стадию растворения и переосажденния из раствора, характеризуются различной структурой ассоциатов в растворе. Это может быть обусловлено, например, перераспределением внутри- и межмолекулярных водородных связей. Разрушаются подобного рода ассоциаты по всей вероятности под действием больших сдвиговых напряжений, например, в условиях скоростной седиментации (ускорение 105ё).

Соответственно степени ассоциации раствора изменяется и степень ферментативного разложения полимера (рис. 4).

Рис. 4. Изменение характеристической вязкости образцов ХТЗ-1 (1), ХТЗ-2(2) и ХТЗ-З (3) в ходе ферментативной деструкции в 1% уксусной кислоте под действием фермента «Коллагеназа». Массовое отношение (%) хнтозан : фермент = 95:5.

Очевидно, что именно процессы структурообразования, имеющие место в растворах ХТЗ, обусловливают и зависимость изменения относительной вязкости ХТЗ в ходе деструкции от его концентрации в растворе (рис. 5). Наблюдаемые экстремальные зависимости глубины протекания деструктивного процесса от содержания ХТЗ в растворе, по всей вероятности, связаны с появлением в системе после точки кроссовера ассоциатов макромолекул.

(а)

1.0 2,0 3,0

концентрация хиточана в растворе. г/Л-ч

концентрация хптоына а растворе, г/дг

концентрация хнтозаш к распноре, г/л1

Рис. 5. Зависимость изменения относительной вязкости раствора ХТЗ-1 в 1 % уксусной кислоте от концентрации ХТЗ в растворе. Время выдержки раствора ХТЗ с ферментным препаратом - «Коллагеназа» (а), «Трипсин» (б), «Лираза» (в) - 5 суток. Массовое отношение (%) ХТЗ:фермент в растворе 99 : 1 (1), 95 : 5 (2) и 90 : 10 (3). Точка кроссовера - 0,35 г/дп.

Можно предположить, что фермент преимущественно влияет только на звенья по-лисахаридных цепей на поверхности макромолекулярных ассоциатов. Поскольку степень ассоциации ХТЗ при переходе к полуразбавленным растворам растет (доступность звеньев полимера для взаимодействия с ферментом уменьшается), влияние фермента с повышением концентрации полимерных цепей уменьшается. Очевидно, перекрывающиеся между собой ассоциаты макромолекул, находящиеся в полуразбавленном растворе, создают определенные диффузионные затруднения для реакций фермента.

В результате ферментативного гидролиза, степень кристалличности образцов ХТЗ, выделенных из раствора, заметно увеличивается (рис. 6). Вероятно ферменты разрушают участки макромолекул с наименее упорядоченной первичной химической структурой, которые в последствие при формировании твердого полимера образуют аморфную фазу.

Рис.6. Рентгенограмма образцов ХТЗ-З, полученных до (1) и после ферментативной экспозиции с ферментным препаратом «Коллагеназа» (2).

Таким образом, наблюдаемые особенности ферментативной деструкции ХТЗ в растворе, а именно: зависимость степени изменения вязкости от концентрации полимера в растворе, увеличение степени кристалличности образцов ХТЗ после ферментативной экспозиции, наблюдаемая корреляции между глубиной ферментативной деструкции и степенью ассоциации раствора, позволяют трактовать их с позиции проявления надмолекулярных эффектов, свойственных для макромолекулярных реакций.

1.2. Ферментативная деструкция пленочных образцов хитозана

Как и в случае деструкции ХТЗ в растворе, при деструкции пленочных образцов ХТЗ в контакте с растворами ферментных препаратов, моделирующей биоразложение полимерного материала на раневой поверхности, изменение вязкости полимера во времени имеет нелинейный характер. Для всех полученных из растворов в уксусной кислоте пленок и всех используемых ферментов наиболее значительное падение характеристической вязкости происходитв начальном периоде в течение 15-20 минут. Дальнейшая ферментативная экспозиция пленочных образцов, сказывается на степени уменьшения характеристической вязкости в существенно меньшей степени (рис. 7).

Переход к гетерогенной системе пленка хитозана - раствор фермента, мот бы сопровождаться существенным уменьшением степени деструкции, вследствие уменьшения доступности реагентов для взаимодействия друг с другом. Тем не менее, при сравнимом количестве фермента, степень падения характеристической вязкости ХТЗ в пленках больше, чем в растворе. Данный эффект обусловлен значительно более высокими локальными

концентрациями и ХТЗ, и фермента на границе раздела фаз, чем их средние концентрации в растворе.

Рис.7. Зависимость изменения характеристической вязкости ХТЗ-З, в пленочном образце, полученном из 1% уксусной кислоты, в зависимости от времени контакта с раствором ферментного препарата «Коллагеназа». Массовое отношение (%) хитозан : фермент = 99 : 1 (1), 95: 5 (2) и 90: 10(3).

При получении пленочных образцов ХТЗ из растворов в уксусной кислоте степень его структурированности (ассоциации) изменяется. Об этом свидетельствует не только уменьшение характеристической вязкости ХТЗ, выделенного из пленочного образца (без контакта с ферментом), но и уменьшение показателя д (табл. 5). Варьирование концентрации уксусной кислоты, используемой при приготовлении пленок, изменяет термодинамическое качество растворителя по отношению к ХТЗ, степень его протонирования в растворе и как следствие степень ассоциации (надмолекулярную структуру) раствора.

Пленочные образцы ХТЗ, полученные из уксусной кислоты разной концентрации, неравнозначны по своей надмолекулярной организации, о чем свидетельствуют данные рентгенофазового анализа (рис. 8).

Таблица 5

Вязкостные характеристики пленочных образцов ХТЗ-З* и их устойчивость к ферментативной деструкции.

Ферментативный препарат - «Коллагеназа». Количество фермента - 5% от массы хитозана. Время контакта пленки с «Коллагеназой» - 1 час.

Концентрация уксусной кислоты (г/дл), используемой при приготовлении пленок [т)], дл/г, определенная в растворе уксусной кислоты <5 Степень ферментативной деструкции пленок, А[г)]

1 7,74 1,16 1.15

5 12,6 1,12 0.95

10 9,25 1,15 1.10

70 8,14 1,13 0.80

Примечание: значения <5 определены для разбавленного раствора полимера из пленочного образца в соответствующей уксусной кислоте

Ебою

0,00 ¿0,00 20.00 50,00 40,00 50,00

Рис, 8. Рентгенограммы хитозановых пленок из ХТЗ-З, полученных из 1% (1), 10% (2) и 70% (3) уксусной кислоты. Время предварительного выдерживания раствора хитоза-на перед формированием пленки - 24 часа.

Принципиально важным, является то, что предыстория получения пленки (концентрация раствора уксусной кислоты) сказывается не только на степени структурирования системы 5, но и на степени ферментативного разложения пленок (табл. 5). Таким образом, • варьирование надмолекулярной структуры является фактором, оказывающим влияние на степень ферментативного разложения пленочных образцов ХТЗ и, соответственно, основой практического регулирования ферментативной устойчивости материалов.

2. Регулирование ферментативной устойчивости пленочных хитозановых покрытий

Наряду с варьированием термодинамического качества растворителя, направленное структурообразованяе, а следовательно и управление степенью ферментативного разложения пленочного покрытия может быть достигнуто путем модификации пленочных образцов. В качестве способов модификации структурного состояния пленок с целью регулирования их ферментативной устойчивости, были выбраны: 1) перевод солевых хитозановых пленок в основную форму; 2) добавление второго инертного полимера, который в выбранных условиях ферментативному разложению не подвергается; 3) проведение изотермического отжига пленок; 4) изменение степени кристалличности.

2.1. Модификация пленочных хитозановых образцов. Перевод солевых пленок в основную форму.

Выдержка хитозановых пленок в растворе гидроксида натрия сопровождается переходом ХТЗ из солевой формы в основную. Изменение химической и надмолекулярной структуры ХТЗ при переводе в основную форму, приводят к ряду изменений. Во-первых, степень структурирования системы увеличивается (табл. 6). Во-вторых, с увеличением степени структурирования степень деструкции пленочных образцов в существенной мере снижается как результат уменьшения степени доступности хитозановых звеньев для взаимодействия с ферментом.

Степень ассоциации ХТЗ-1 в растворах модифицированных образцов, полученных из 1% уксусной кислоты, и их устойчивость к ферментативной деструкции. Ферментативный препарат - «Коллагеназа». Количество фермента - 5% от массы хитозана. Время контакта пленки с «Коллагеназой» - 1 час.

Время выдержки пленки в растворе гидроксида натрия, час. 5" Степень ферментативной деструкции модифицированных пленок, Д[т|]

0 1,22 1,32

3 1,23 0,70

12 1,30 0,64

24 1,31 0,62

4В 1,31 0,61

Примечание: 6- определено для разбавленного раствора в ацетатном буфере с рН=4,5

2.2. Модификация пленочных хнтозановых образцов. Введение второго полимера.

Добавление второго полимера, ограниченно совместимого с ХТЗ, способно оказать существенное влияние на надмолекулярную структуру полимерной системы, а следовательно и на ее ферментативную устойчивость. В качестве второго полимера были выбраны два водорастворимых полимера - физиологически активный поликатион полидиме-тилдиаллилламмоний хлорид (ПДМДААХ), и поливиниловый спирт (ПВС). Оба карбо-цепных полимера в выбранных условиях ферментативному разложению не подвергаются. Об этом свидетельствует факт постоянства их относительной и характеристической вязкости после длительной выдержки их растворов в присутствии ферментных препаратов.

При добавлении второго полимера к раствору ХТЗ происходит повышение суммарной вязкости растворов двух полимеров (рис. 9), свидетельствующее согласно литературным данным об образовании гетероассоциатов в смеси полимеров и понижению плотности упаковки надмолекулярных образований. Как следствие, в смесевых пленочных образцах, ферментативное разложение происходит быстрее, чем в пленках чистого хитозана (табл. 7).

Рис. 9. Значение суммарной характеристической вязкости смесей хитозана с ПДМДААХ (1) и ПВС (2), выделенных из пленок, сформированных из 1% уксусной кислоты.

Ферментативная устойчивость пленочных образцов из смесей ХТЗ-З с другими полимерами к действию ферментного препарата «Коллагеназа». Массовое отношение (%) хитозан : фермент = 95 : 5.

Второй полимер Содержание второго полимера, % масс. Степень ферментативной деструкции пленок, Д[т1]

ПДМДААХ 0 1,08

10 1,50

20 1,43

30 1,39

40 1,32

ПВС 0 1,08

10 1,22

20 1,35

30 1,33

40 1,30

2.3. Модификация пленочных хитозановых образцов. Изотермический отжиг.

Изотермический отжиг - это стандартный прием структурной модификации поли-мфов, сопровождающийся релаксацией неравновесных конформационных структур, формирующихся в ходе получения пленки, и, как следствие, релаксацией свободного объема.

СН;ОН

Результатом этих процессов является увеличение плотности упаковки макромолекул и увеличение степени структурирования системы (табл. 8). Соответственно, уменьшается и степень ферментативной деструкции полимера. Фактически, степень ферментативного разложения термомодифицированных образцов близка к той, которая наблюдается для основных пленок. Необходимо учитывать так же, что параллельно с физико-механическими процессами, протекающими при отжиге пленок, может происходить и химический процесс — сшивание хитозановых цепей, что также сопровождается уплотнени-

ем пленочного образца, а следовательно, должно приводить к увеличению его устойчивости к ферментативной устойчивости (табл. 8).

Таблица 8

Степень ассоциации растворов хитозана, полученных растворением отожженых пленочных образцов в ацетатном буфере с рН=4,5

I

! I

Концентрация уксусной кислоты (г/дл), используемой при приготовлении пленок Время изотермического отжига (120°С) пленки, мин S Степень ферментативного разложения пленок, A[rj]

5 0 1.13 1.38

30 1.17 1.29

60 1.22 1.25

10 0 1.14 1.36

60 1.20 1,13

50 0 1.10 1.58

60 1,21 1,22

70 0 1.09 1.59

60 1.22 1.10

' 2.4. Возможность изменения степени кристалличности. Ферментсодержащие пленки.

' Очевидная взаимосвязь между степенью упорядоченности ХТЗ в пленочных

образцах и степенью его ферментативного разложения прослеживается при | сопоставлении образцов ХТЗ, характеризующихся различной степенью кристалличности. Например, образцы ХТЗ-1, ХТЗ-2 и ХТЗ-З различаются видом рентгенограмм (рис. 10), соответственно степенью кристалличности. Сравнение с данными табл. 4 показывает, что этот ряд отвечает возрастанию степени структурирования полимеров в растворе и степени ферментативной устойчивости пленочных покрытий, сформированных из растворов в уксусной кислоте (табл. 9).

Рис. 10. Рентгенограммы порошков ХТЗ-З (1), ХТЗ-1 (2), ХТЗ-2 (3).

Степень ферментативной устойчивости пленок из образцов хитозана с разной кристалличностью, полученных из раствора в 1% уксусной кислоте, к действию ферментного препарата «Коллагеназа». Массовое отношение (%) хитозан : фермент =95:5.

Образец хитозана Индекс кристалличности, % Степень ферментативной деструкции пленок, ДМ

ХТЗ-1 26 1,32

ХТЗ-2 22 1,46

ХТЗ-З 30 1.08

В качестве своеобразного пути повышения степени кристалличности хитозановых пленок можно рассмотреть разрушение аморфной части полимера ферментами, введенными в пленку на стадии ее формирования, С увеличением количества фермента в пленке степень деструкции ХТЗ при внешнем контакте с раствором фермента уменьшается (рис. 11). При содержании фермента в пленке порядка 10 %, контакт хитозановой пленки с ферментосодержащей подложкой фактически не вызывает дальнейшего уменьшения характеристической вязкости. Поскольку в соответствие с данными рентгеноструктурного анализа (см. рис. 6) при ферментолизе ХТЗ индекс кристалличности возрастаем, становится возможным образцы с различным содержанием фермента в пленке характеризовать как образцы с различной степенью кристалличности.

Рис. 11. Изменение характеристической вязкости ХТЗ-З, выделенного из ферментосодержащих пленок с концентрацией фермента 0(У), 3(2), 5 (5) и 10 (4) мае. %, после контакта с раствором ферментного препарата «Коллагеназа» с концентрацией 5 мае. %, по отношению к массе ХТЗ, в зависимости от времени контакта.

Таким образом, исследование ферментосодержащих хитозановых пленок подтверждает существование взаимосвязи между степенью и скоростью ферментативного превращения ХТЗ и его надмолекулярным состоянием, в частности, индексом кристалличности и плотностью его упаковки в сформированной пленке, степенью структурированности раствора, из которого получается пленка. Немаловажным является факт, что протеолити-ческий фермент, выделяясь из хитозановой пленки, сохраняет свою активность на высоком уровне.

3. Некоторые практические следствия

На базе Республиканского ожогового центра МУ ГКБ №18 были проведены клинические исследования пленочных покрытий на основе ХТЗ. Испытания проводились по нескольким направлениям:

1) при лечении ожогов II - Ш А степени;

2) для защиты свободных аутодерматраксплантатов после пересадки на гранулирующие раны после некрэктомий при глубоких ожогах III Б -IV степени и донорских ран;

3) для лечения послеожоговых рубцов.

Установлено, что пленки индивидуального ХТЗ в солевой форме обладают рядом неоспоримых достоинств - они полностью атравматичны, обладают хорошей совместимостью с тканями организма, отсутствием местного раздражающего и аллергического действия, хорошей ранозаживляющей способностью, высокой сорбционной емкостью (рис. 12, кривая 1).

Рис. 12. Кинетика набухания в парах воды пленочных образцов хито-зана, полученных из 1%-ной уксусной кислоты, в солевой форме (1), основной форме (2) и подвергнутых изотермическосу отжигу (3).

Кроме того, образцы пленок испытьгвались на микробиологическую активность. Проведено порядка 100 испытаний в отношении микроорганизмов, выделенных из ожоговых ран у тяжело пострадавших. Как видно из данных табл. 10, пленки ХТЗ в солевой форме проявляют хорошие бактерицидные свойства. Однако, в солевой форме пленки обладают малой ферментативной устойчивостью и через 2-3 дня нахождения на ране теряют целостность, начинают фрагментироваться. Полная биодеградация пленок происходит в течении 8-10 дней, что сопоставимо со сроком начала эпителизации. Но в некоторых случаях требуются более длительные сроки нахождение пленки на ране.

Таблица 10

Микробиологическая активность хитозановых пленок

Характеристика пленки (способ модификации) Количество чувствительных к образцам штаммов / диаметр зоны просветления, мм

Stahhylococcus aureus Pseudomonas aerugenosa

Пленка в солевой форме 5 из 5 /10 3 из 5/10

Перевод в основную форму 2 из 5/ 2 -/-

Изотермический отжиг 5 из 5/ 9 3 из 5 /9

Пленка хитозана с ПВС 4 из 5/10 3 из 5/ 9

Хитозановые пленки в основной форме разлагаются на ране существенно медленнее, чем ^модифицированные, но механические качества таких пленок крайне низки -пленки оказываются после модификации неровными и неоднородными, не прилегают плотно к защищаемой поверхности.

Пленки, прошедшие изотермический отжиг, даже на 11 день пребывания на ране сохраняют целостность, обеспечивая надежную защиту раневой поверхности. Полная биодеградация пленочного покрытия в этом случае происходит за 20-25 дней. Более того, термомодифицированные образцы, в отличие от основных пленок, отличаются хорошими механическими свойствами, влагопоглощающей способностью (рис. 12, кривая 3) и микробиологической активностью на уровне исходных солевых пленок (табл. 10).

Пленки ХТЗ-ПВС имеют хорошие механические качества, высокую микробиологическую активность, кроме того, они легко перфорируются на стандартном оборудовании в полимерные сетки, хорошо зарекомендовавшие себя в лечении хирургических ран (защита донорских ран). Использование перфорированных хитозановых пленок или индифферентных сетчатых покрытий, имлрегнированных ХТЗ, оказалось эффективным для защиты кожного трансплантата после операции по аутодермапластике. Именно в этих случаях имела место хорошая фиксация трансплантата на поверхности раны, исключающая его дрейф. Отмечено также значительное ускорение процесса эпителизации без инфекционных осложнений именно в случаях, когда происходила защита кожного лоскута хитозановой сеткой. Эпителизация в испытательной группе составляла 90% раневой поверхности, в то время как в контрольной группе - 76%. Длительность пребывания больных сопоставимых по объему ожогового поражения в стационаре после выполнения первой аутодермопластики сократилась в среднем на 2,5 суток.

В клинических исследованиях испытаны полимерные сетчатые покрытия, импрег-нированные ХТЗ с двумя ферментами - «Коллагеназой» и «Лиразой» при лечении гипертрофических и келлоидных рубцов. Эффект уменьшения выраженности рубцевания проявляется в обоих случаях, но в большей степени при использовании ферментного препарата «Коллагеназа».

Таким образом, применение пленок и сеток на основе хитозана позволяет:

1) уменьшить экссудацию с поверхности раны;

2) обеспечить адгезию и фиксацию аутодермотрансплантата к ране;

3) уменьшить бактериальную инвазию;

4) при закрытии донорских рая значительно уменьшить количество перевязок и ускорить эпителизацию по сравнению с традиционными методами;

5) визуально контролировать состояние раны, благодаря прозрачности пленки;

6) уменьшить выраженность процесса формирования гипертрофической рубцовой ткани.

выводы

1. Установлен факт протекания ферментативной деструкции хитозана по механизму случайного разрыва цепей под действием ферментных препаратов «Коллагеназа», «Лир аза», «Трипсин» и «Пепсин», вследствие наличия в них сопутствующих лизосомальных ферментов с ^-гликозидазной активностью. Ферментативная деструкция хитозана как в растворе, так и в сформированных из растворов твердых пленочных образцах выражается в уменьшении молекулярной массы хитозана в 5-11 раз.

2. Найдена качественная зависимость между степенью ферментативной деструкции хитозана и надмолекулярным состоянием хитозановых полимерных систем. Показано, что даже в области разбавленных растворов в термодинамически хороших растворителях макромолекулы хитозана в различной степени ассоциированы. В свою очередь это является причиной наблюдающейся зависимости скорости деструкции от термодинамического качества растворителя и концентрации раствора. В деструкции пленочных образцов хитозана при контакте с растворами ферментов надмолекулярный эффект проявляется как зависимость скорости и степени ферментативной деструкции от степени кристалличности образцов и плотности упаковки макроцепей. Предыстория формирования пленочных образцов, по крайней мере, качество растворителя, концентрационный режим раствора и состав смесей с другими полимерами определяет ферментативную устойчивость пленок.

3. Выявлена принципиальная возможность регулирования ферментативной устойчивости пленочных образцов путем их направленной структурной модификации. Показано, что при переводе хитозана из солевой формы в основную и проведении изотермического отжига, плотность упаковки макромолекул увеличивается, следствием чего является уменьшение степени ферментативной деструкции пленок. Добавление второго полимера, склонного к образованию гетероассоциатов с хитозаном в растворе, -поливинилового спирта или полидимегилдиаллиламмоний хлорида, напротив, приводит к увеличению степени ферментативного разложения пленки, вследствие понижения плотности упаковки макромолекул.

4. Показано, что при использовании хитозана как матрицы-носителя ферментных препаратов, деструкции под действием иммобилизизованных ферментов подвергается аморфная фаза хитозана, следствием чего является повышение степени кристалличности образцов и соответствующее повышение их устойчивости к процессу ферментативного разложения при внешнем хонтакте с ферментами.

5. Разработан ряд материалов на основе хитозана, в том числе ферментосодержащие пленочные покрытия. Материалы могут быть рекомендованы в качестве временных защитных покрытий при лечении ожогов, защите донорских ран и аутодерматрансплантатов при операциях на глубоких ожогах и консервативном лечении гипертрофических и келоидных рубцов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Колесов C.B. Пленки биомедицинского назначения на основе хитозана. // Вестник Башкирского университета. - 2007. - Т. 12. - №3. - С.23-25.

2. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Володина В.П., Колесов C.B. Ферментативное разложение пленочных покрытий на основе хитозана. // Материаловедение. - 2008. - №7.

- С.36-39.

3. Кулиш Е.И., Володина В.П., Чернова В.В., Колесов C.B., Монаков Ю.Б., Заиков Г.Е. Ферментативная деструкция хитозана. // Пластмассы. - 2008. - №5. - С.32-38.

4. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Колесов C.B. Пленочные полимерные покрытия на основе хитозана. //Пластмассы. -2008. - №6. - С.36-39.

5. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Володина В.П., Колесов C.B. Биодеградация пленочных полимерных покрытий на основе хитозана. // Вестник Башкирского университета. - 2008. - Т. 13. - №1. - С.23-26.

6. Чернова В.В., Володина В.П., Кулиш Е.И., Колесов C.B. Деструкция хитозана в растворе под действием фермента гяалуронидазы. // Вестник Башкирского университета.

- 2009. - Т. 14 - №1. - С.44-47.

7. Kulish E.I., Volodina V.P., Chernova V.V., Abdullina L.B. and Kolesov S.V. The Destruction Of Chitosan Films Under The Action Of Non-Specific Enzyme. // Polymers Research Journal. - 2009. - V. 2. -1.4. - P. 493-496.

8. Kulish E.I., Volodina V.P., Chernova V.V., Kolesov S.V. and Zaikov G.E. The Ensy-matic Destruction Of Chitosan Films Under The Action of Non-Specific Enzymes. // Polymers Research Journal. - 2008. - V. 2. -1. 3. - P. 367-370.

9. Kulish E.I., Volodina V.P., Chernova V.V., Kolesov S.V. and Zaikov G.E. Biodégradation of Film Polymer Coating on the Basis of Chitosan. // Biotechnology, Biodégradation, Trend in Polymer Research. Editors: Gennady E. Zaikov, Alfonso Jimenez / Nova Publishers Press.-2009.-P. 95-101.

10. Chernova V.V., Kulish E.I., Volodina V.P., Kolesov S.V., Monakov Y.B. and G.E.Zaikov. Macromolecular effects in chitosan enzymatic degradation in solution. // Cellulose chemistry and technology, advances in chemistry, physics and technology of polysaccharides and lignin. - 2008. -V.42. -№9-10. - P. 513-523.

11. Хунафин C.H., Гилъманов А.Ж., Кунафин M.C., Гизатуллин Т.Р., Зинатуллин P.M., Гизатуллин Р.Х., Мухаметзянов A.M., кунафин А.С., Хатмуллина К.Р., Мусина Ф.С., Галимова Э.Ф., Колесов C.B., Кулиш Е.И., Монаков Ю.Б., Чернова В.В. Способ лечения и профилактики гипертрофических и келоидных рубцов с использованием хитозана // Патент РФ по заявке № 2010105500/10(007710) от 15.02.2010 г. с решением о выдаче от 22.02.2011г.

12. Чернова В.В., Кулиш Е.И., Володина В.П., Колесов C.B. Влияние неспецифических ферментов на хитозан. // Материалы Девятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Ставрополь, 2008. - С. 234-236.

13. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Володина В.П., Торлопов М.А., Колесов C.B. Деградация полисахарадов под действием неспецифических ферментов // Материалы Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». Нижний Новгород, 2010. - С.274-278.

14. Чернова В.В., Володина В.П., Кулиш Е.И. Пленки хитозана с регулируемой биодеетрукцией // Сборник трудов Всероссийской научной конференции «Высокомолекулярные соединения. Наука и практика». - Уфа, 2008. - С.201-203.

15. Чернова В.В, Кулиш Е.И. Ферментативная деструкция хитозановых пленок. Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». -Москва, 2008.-С. 217.

16. Кулиш Е.И., Чернова В.В., Володина В.П., Колесов C.B. Неспецифический ферментолиз хитозана // Сборник тезисов докладов и сообщений XVI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». - Яльчик, 2009. - С.123.

17. Чернова В.В., Кулиш Е.И., Зинатуллин Р.М., Володина В.П. Клинические исследования противоожоговых хитозановых материалов // Сборник тезисов доклада VII Всероссийской конференции «Химия и медицина. Орхимед 2009». - Уфа, 2009. - С.78-79.

18. Чернова В.В., Вильданова Р.Ф., Володина В.П., Кулиш Е.И. Использование метода скоростной седиментации для анализа процесса ферментативной деструкции хитозана // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии. Теория и практика». - Уфа, 2010 г. - С.110

i). Чернова В.В., Кулиш Е.И., Володина В.П., Торлопов М.А, Колесов C.B. Ферментативная деструкция полисахаридов // Сборник материалов пятой всероссийской Карганской конференции «Полимеры-2010». - Москва, 2010. - С. 151.

20 Чернова В.В., Хуснутдинова АР., Кулиш Е.И. Метод определения концентрации восстанавливающих Сахаров как способ изучения процессов ферментативного разложения хитозановых материалов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новые материалы, химические технологии и реагенты для промышленности, медицины и сельского хозяйства на основе нефтехимического и возобновляемого сырья». - Уфа, 2011. - С.339-340.

2Í. Вильданова Р.Ф., Чернова В.В. Влияние условий формирования хитозановых пленок, на их ферментативную устойчивость. // Материалы XVIII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». - Москва, 2011.-С.175.

с>)

Отпечатано в типографии ГОУ ВПО «Башгосмедуниверситет РОСЗДРАВА» Лицензия №0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 17.09.2011 г. Тираж 120 экз. Заказ № 136. 450000, г.Уфа, ул. Ленина, 3.

ВВЕДЕНИЕ.

I ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1 Природные полисахариды хитин и хитозан.

1.1 Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана.

1.2 Структурные характеристики хитина и хитозана.

1.3 Деструкция хитозана.

1.3.1 Химическая деструкция хитозана.

1.3.2 Ферментативная деструкция хитозана.

1.4 Свойства и применение хитозана.

1.5 Применение хитозана в медицине.

1.5.1 Полимерные покрытия для лечения и защиты ожоговых и гнойных ран.

1.5.2 Полимеры как носители ферментных препаратов.

1.5.3 Хитозан как носитель иммобилизованных ферментов.

Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений в области поиска новых материалов для медицины стало изучение, создание и внедрение в практику материалов на основе хитозана. Уникальный комплекс нативных свойств хитозана - биосовместимость, биодеградируемость, нетоксичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности, позволяют отнести этот аминополисахарид к немногочисленной группе промышленно доступных, экологически безопасных полимеров и, в перспективе, - к потенциально новым биоматериалам на его основе, исключительно подходящим для использования в медицинских целях. Поскольку хитозан достаточно быстро претерпевает биодеградацию под действием ферментов живого организма, не образуя токсичных веществ, он может стать прекрасным биоразлагаемым з ащитн ы мм ате р и ал о м для'лечения открытых ран и ожогов. Особый интерес могут представлять ферментсодержащие пленочные хитозановые материалы, которые целесообразно использовать на стадии очищения раны от некротических тканей и в косметической, терапии келоидных рубцов. При этом существует принципиальная возможность регулирования скорости ферментативного разложения материалов на раневой поверхности.

В связи с этим особую актуальность приобретает целенаправленное изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана под действием неспецифических для хитозана ферментов, присутствующих на ране, а также поиск путей регулирования ферментативной устойчивости пленочных материалов, полученных на его основе.

Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» по теме «Химия и физико-химия полимеров и полимерных систем медицинского назначения» (ГР № 01.2006.10183). Научные исследования проводились при поддержке РФФИ проекта: «Физико-химические основы создания физиологически активных полимерных материалов с управляемыми свойствами для медицинского применения на основе полимеров природного происхождения» (грант рповолжьеа №08-03-97030), а также ФЦП «Научные и» научно-педагогические кадры инновационной России» (г/к №02.740.11.0648).

Цель работы. Изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана в растворе и в пленочных образцах, полученных из раствора, и поиск путей регулирования его ферментативной устойчивости.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: -изучение закономерностей ферментативной деструкции хитозана под действием ряда ферментных препаратов в растворе;

-изучение особенностей ферментативной деструкции пленочных хитозановых материалов, полученных методом формования из раствора;

-установление возможной причины деструкции хитозана под действием неспецифических ферментов;

-модификация пленочных образцов- с целью регулирования их ферментативной устойчивости;

-изучение закономерности ферментативной деструкции ферментсодержащих пленочных материалов на основе хитозана.

Научная новизна. В результате исследования закономерностей ферментативных превращений хитозана в растворе и твердой фазе:

- выявлена роль надмолекулярных эффектов при ферментативной деструкции хитозана под действием неспецифических для него ферментов в растворе и в твердых пленках; показано, что в области разбавленных растворов в термодинамически хороших растворителях макромолекулы хитозана в различной степени ассоциированы, что в свою очередь является причиной наблюдающейся 6 зависимости скорости деструкции от термодинамического качества растворителя и концентрации раствора; в ферментативной деструкции пленочных образцов хитозана надмолекулярный эффект проявляется как зависимость скорости и степени ферментативной деструкции от степени кристалличности образцов и плотности упаковки макроцепей; выявлена принципиальная возможность регулирования ферментативной устойчивости пленочных образцов путем их направленной структурной модификации, при которой изменяется плотность упаковки макромолекул (перевод хитозана из солевой формы в основную, изотермический отжиг), следствием чего является уменьшение степени ферментативной деструкции пленок; добавление второго полимера -поливинилового спирта или полидиметилдиаллиламмоний хлорида, склонного к образованию гетероассоциатов с хитозаном в растворе, напротив, приводит к увеличению степени ферментативного разложения пленки, вследствие понижения плотности упаковки макромолекул;

- показано, что ферментативной деструкции подвергается преимущественно аморфная фаза хитозана, в результате — повышается степень кристалличности деструктированных образцов; в случае твердых пленок с иммобилизованными ферментными препаратами повышение степени кристалличности хитозана приводит к повышению устойчивости пленок к последующему процессу ферментативного разложения при внешнем контакте с ферментами.

Практическая ценность. Разработаны принципиальные подходы к созданию пленочных хитозановых материалов с регулируемой биоустойчивостыо, соответствующих современным требованиям к временным покрытиям для защиты и лечения ожоговых и гнойных ран. Материалы могут быть рекомендованы для клинического применения.

Личный вклад автора. Автор лично участвовал в разработке основной идеи исследования, выработке методологии его выполнения, проведении экспериментальных исследований и анализе результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, МГУ, 2008 г. и 2011 г.), IX и X Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Ставрополь, 2008 г. и Нижний Новгород, 2010 г.), Всероссийской конференции, посвященной 40-летию кафедры высокомолекулярных соединений ГОУ ВПО «Башкирский государственный университет» «Высокомолекулярные соединения. Наука и практика» (Уфа, 2008 г), VII Всероссийской конференции «Химия и медицина. 0рхимед-2009» (Уфа, 2009 г.), XVI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2009г.), V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры — 2010» (Москва, 2010г.), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы химии. Теория и практика» (Уфа,2010 г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием' «Новые материалы, химические технологии и реагенты для промышленности, медицины и сельского хозяйства на основе нефтехимического и возобновляемого сырья» (Уфа,2011 г.)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 21 печатных работ, из них б статей - в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК для публикации материалов диссертационных исследований, 4 статьи - в сборниках статей и 2 статьи - в материалах Международных конференций, тезисы 2 докладов - на Международных и 6 докладов — на Всероссийских конференциях, получен 1 патент РФ с решением о выдаче.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 152 источника. Работа включает 14 таблиц и 41 рисунок.

выводы

1. Установлен факт протекания ферментативной деструкции хитозана по механизму случайного разрыва цепей под действием ферментных препаратов «Коллагеназа», «Лираза», «Трипсин» и «Пепсин», вследствие наличия* в них сопутствующих лизосомальных ферментов с Р~ гликозидазной активностью. Ферментативная деструкция хитозана как в растворе, так и в сформированных из растворов твердых пленочных образцах выражается в уменьшении молекулярной массы хитозана в 5-11 раз.

2. Найдена качественная зависимость между степенью ферментативной деструкции хитозана и надмолекулярным состоянием хитозановых полимерных систем. Показано, что даже в области разбавленных растворов в 5 термодинамически хороших растворителях макромолекулы хитозана в различной степени ассоциированы. В свою очередь это является причиной наблюдающейся зависимости скорости деструкции от термодинамического качества растворителя и концентрации раствора. В деструкции пленочных образцов хитозана при контакте с растворами ферментов надмолекулярный эффект проявляется как зависимость скорости и степени ферментативной деструкции от степени кристалличности образцов и плотности упаковки макроцепей. Предыстория формирования.пленочных образцов, по крайней мере, качество растворителя, концентрационный режим раствора и состав смесей с другими полимерами определяет ферментативную устойчивость пленок.

3. Выявлена принципиальная возможность регулирования ферментативной устойчивости пленочных образцов путем их направленной структурной модификации. Показано, что при переводе хитозана из солевой формы в основную и проведении изотермического отжига, плотность упаковки макромолекул увеличивается, следствием чего является уменьшение степени ферментативной деструкции пленок. Добавление второго полимера, склонного к образованию гетероассоциатов с хитозаном в растворе, - поливинилового спирта или полидиметилдиаллиламмоний хлорида, напротив, приводит к увеличению степени ферментативного разложения пленки, вследствие понижения плотности упаковки макромолекул.

4. Показано, что при использовании хитозана как матрицы-носителя ферментных препаратов, деструкции под действием иммобилизизованных ферментов подвергается аморфная фаза хитозана, следствием чего является повышение степени кристалличности образцов и соответствующее повышение их устойчивости к процессу ферментативного разложения при внешнем контакте с ферментами.

5. Разработан ряд материалов на основе хитозана, в том числе ферментосодержащие пленочные покрытия. Материалы могут быть рекомендованы в качестве временных защитных покрытий при лечении ожогов, защите донорских ран и аутодерматрансплантатов при операциях на глубоких ожогах и консервативном лечении гипертрофических и келоидных рубцов. ь t

Заключение у

Таким образом, проведенные исследования позволяют с уверенностью говорить о том, что в присутствии ферментных препаратов «Коллагеназа»,

Лираза», «Пепсин» и «Трипсин», происходит процесс ферментативной деструкции хитозана. Об этом говорит совокупность экспериментальных фактов по изучению растворов и пленочных образцов хитозана данными вискозиметрии, скоростной седиментации и определения концентрации восстанавливающих Сахаров. Наиболее вероятная причина ферментативной деструкции - наличие в ферментных препаратах сопутствующих ферментов с

3-гликозидазной активностью, вероятно лизосомального происхождения. По этой причине изучаемые нами ферментные препараты также являются причиной ферментативной деструкции другого полисахарида с (3гликозидной связью — карбоксиметилцеллюлозы, и не вызывают распад полисахаридов крахмала и пектина, имеющих а-гликозидную связь.

Использование вискозиметрии в качестве метода исследования, позволило выявить существенную роль надмолекулярных эффектов в процессе ферментативного разложения хитозана. Данные эффекты проявляются и при изучении исходных, не подвергнутых деструкции образцов хитозана, и в ходе изучения процесса деструкции хитозана как в растворе, так и в твердой фазе. Причина этого — высокая склонность хитозана, как полярного полимера, склонного к межмолекулярному взаимодействию, к процессам ассоциации, имеющим место даже в разбавленном растворе. Именно в силу этой причины образцы хитозана, прошедшие предварительно стадию растворения и переосажденные из раствора, характеризуется иной надмолекулярной структурой ассоциатов в растворе, нежели исходный полимер. По этой же причине проявляется зависимость степени ферментативной деструкции хитозана от его концентрации в растворе. По этой причине проявляется зависимость степени ферментативной деструкции

109 хитозана в растворе от степени его ассоциации в растворе. Не менее ярко надмолекулярный эффект проявляется в процессе ферментативной деструкции хитозановых пленок, сформированных путем удаления растворителя (уксусной кислоты). Например, прослеживается очевидная взаимосвязь между значением степени ассоциации раствора хитозана, характеристической вязкости хитозана, определенной для пленочных образцов, и условиями их формирования (концентрацией уксусной кислоты, используемой в процессе получения пленок и временем предварительной выдержки раствора). Принципиально важным, однако, является то, что предыстория получения пленки сказывается не только на степени структурирования системы, но и на степени ферментативного разложения пленок. Таким образом, варьирование надмолекулярной структуры является фактором, оказывающим влияние на степень ферментативного разложения пленочных образцов хитозана. В связи с этим, существует принципиальная возможность, варьируя структуру полученного из раствора пленочного материала, регулировать доступность звеньев хитозана для взаимодействия с ферментом в процессе деструкции, а, следовательно, регулировать скорость и степень- разложения пленки. Проведенные исследования* подтвердили возможность регулирования ферментативной- устойчивости хитозановых пленок за счет направленного структурообразования, осуществляемого в процессе модификации. Например, в пленках, подвергнутых изотермическому отжигу, происходит изменение морфологии пленочного образца, а именно, увеличение степени его кристалличности, а также увеличение плотности упаковки макромолекул. Следствием этого является повышенная ферментативная устойчивость пленок по сравнению с пленками, полученными в солевой форме. Исследованные в качестве вторых полимеров -модификаторов поливиниловый спирт и полидиметилдиаллиламмоний хлорид, наоборот, разрыхляют систему вследствие образования гетероагрегатов из макромолекул, вследствие чего смесевые пленки разлагаются с несколько большей скоростью, нежели исходные, немодифицированные солевые пленки.

С практической точки зрения наилучшие результаты были достигнуты при использовании термомодифицированных и ферментсодержащих пленок. Именно в этих случаях получаемые пленочные материалы обладали хорошими физико-механическими качествами, высокой влагопоглощающей способностью, прекрасными бактерицидными свойствами и повышенной устойчивостью к биоразложению.

1. Muzzarelli R.A.A. Chitin. Oxford: Pergamon Press, 1977. - 309 p.

2. Быкова B.M., Немцев C.B Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука, 2002. -С. 7-23.

3. Феофилова Е.П., Терешина В.М Перспективные источники получения хитина из природных объектов // Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы V Всерос. конф. М.: ВНИРО, 1999. — С. 76-78.

4. Гальбрайх JI.C. Хитин и хитозан: строение, свойства, применение // Соровский образовательный журнал. Серия химия. — 2001. — Т.7, № 1. — С.51-56.

5. Muzzarelli R.A.A. Chitin in nature and technology/ R. A. A. Muzarelli, C. Jeuniaux, G. W. Gooday // New York: Plenum Press, 1986. 420 p.

6. Муринов К.Ю., Монаков Ю.Б. Выделение хитозана из природного сырья // Вестник Башкирского университета. — 2003. №1. - С. 30-33.

7. J 7. Нудьга JI.A., Плиско Е.А., Данилов С.Н. Получение хитозана иизучение его фракционного состава // Журнал общей химии. — 1971. — т.41 — С. 2555-2558.

8. Немцев C.B. Способы получения хитина и хитозана // Совершенствование производства хитина и хитозана из панцирьсодержащихsотходов криля и пути их использования: материалы III Всесоюз. конф. М.: ВНИРО, 1991.-С. 7-15.

9. Маслова Г.В. Теория и практика получения хитина электрохимическим способом // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука, 2002. - С. 24-43.

10. Куприна Е.Э., Водолажская C.B. Способы получения и активации хитина и хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение /под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. — М.: Наука, 2002. — С. 44-63.

11. Маслова Г.В., Куприна Е.Э., Сподобина J1.A. и др. Спосрб получения хитина из панцирьсодержащего сырья. A.c. 175188 А 23 1 1/33 СССР, 1990.

12. Нудьга Л.А., Баклагина TO.F., Петропавловский- Г.А. и др. Надмолекулярная организация и физико-механические свойства волокна из хитина с низкой степенью дезацетилирования // Высокомолекулярные соединения. 1991.-Сер. Б, Т. 33, № 11.-С. 864-868.

13. Штагер В.П., Валеев Н.Х., Язев В.А., Кощеев Г.И. Способ получения хитозана. Заявка 99125648/04 А, 30.11.1999, С08В31/18.

14. Касьянов Г.И.', Квасенков О.И., Николаев А.И., Касьянова Е.Е. Способ получения хитозана. Заявка 97104789/04, 26.03.1997, С08В37/08.

15. Быков В.П., Сныткин И.И., Быкова В.М., Кривошеина Л.И., Недосекова Т.М., Новиков A.B., Панов К.Н., Фурман Д.И. Способ получения хитозана из ракообразных. Заявка 95121269/04, 26.12.1995, A23L1/33.

16. Иванов A.B., Гартман О.Р., Цветкова A.B., Полторацкая Е.Б. Способ получения хитозана. Заявка 95121269/04, 26.12.1995; С08В37/08.

17. Сливкин А.И, Лапенко, В.Л., Кулинцов П. И., Болгов A.A. Способ получения хитозана из хитина. Заявка 2007131895/13, 22.08.2007, A23L1/33.

18. Варламов В.П., Стояченко И.А., Буданов М.В. Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана. Пат. №2073016 РФ. Опубл. в Б.И. 1997.-№4.

19. Танако К., Цумаки К., Нива Т. Водорастворимые низкомолекулярные хитозаны и способы их получения. Заявка- 2-69502 Япония, МКИ С 08 В 37/08, А 61 К 7/001.№63-220377; Заявл. 5.09.88; Опубл. 8.03.90.

20. Chitin and Chitozan: Sources, Chemistry, Biochemistry,Physical Properties and Application. / Ed. T. Anthonsen. — London. N.-Y.: Elsevier Applied Science, 1990.-830 p.

21. Гамзазаде А.И. Структурная неоднородность как фактор изменчивостисвойств хитина и хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и115применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. — М.:Наука, 2002. С. 112-118.

22. Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Терешина В.М., Козлов В.П. Полиаминосахариды мицелиальных; грибов: новые биотехнологии и перспективы практического использования // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. - Т. 32, № 5. - С. 483-492.

23. Плиско Е.А., Нудьга JI.A., Данилов С.Н. Хитин и его химические превращения // Успехи химии. 1977. -T.XLVI, Вып.8. - С. 1470-1487.

24. Rinaudo M., Milas M., Le Dung P. Characterization of chitosan. Influence of ionic strength and degree of acetylation on chain expansion // Int. J. Biol. Macromol. 1993. -V. 15, № 5. - P. 281-285.

25. Вихорева Г.А., Роговина C.3., Пчелко O.M1., Гальбрайх JI.C. Фазовое состояние и реологические свойства системы хитозан-уксусная кислота-вода // Высокомолекулярные соединения. — 2001. — Т.43Б, № 6. — С. 1079-1084.

26. Миронов A.B., Вихорева Г.А., Кильдеева Н.Р., Успенский С.А. Причины нестабильности вязкостных свойств уксуснокислотных растворов хитозана // Высокомолекулярные соединения. 2007. — Т.49 Б, № 1. - С. 136138

27. Нудьга JI.A., Петров В.А., Бочек A.M., Каллистов О.В., Петрова С.Ф., Петропавловский Г.А. Молекулярные и надмолекулярные превращения врастворах хитозана и аллилхитозана // Высокомолекулярные соединения. -1997. Т.39 Б, № 7. - С. 1232-1239.

28. Rinaudo М., Pavlov G., Desbrieres J. Influence of acetic acid concentration on the solubilization of chitosan // Polymer. 1999. - V. 40. - P. 7029-7032.

29. Горбачева И.Н., Овчинников Ю.К., Гальбрайх Л.С., Трофимов Н.А., Мажоров В.В. Рентгенографическое изучение структуры хитозана // Высокомолекулярные соединения. — 1988. Т. 30 А, №12. - С. 2512-2515.

30. В.Н. Цветков, В.Е. Эскин, С.Я. Френкель. Структура макромолекул в растворах. М.: Наука, 1964. - 720 с.

31. Федосеева Е.Н., Смирнова Л.А., Федосеев В.Б. Вязкостные свойства растворов хитозана и его реакционная способность // Вестник Нидегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2008. - № 4. - С. 5964.

32. Банникова Т.Е., Ильина А.В., Варламов В.П. Некоторые свойства солейIнизкомолекулярного хитозана в растворах и в сухом виде // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: материалы VI1 международ, конф. М.: ВНИРО, 2001. - С. 265-269.

33. Samuels R.J. Solid State Characterization'of the Structure of Chitosan'Films //J. Polym. Sci. Polym. Physics Ed. 1981. -V. 19, № 7. P. 1081-1105.

34. Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С. Пленки и волокна на основе хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука, 2002. - С. 254-279.

35. Титова Е.Ф., Белавцева Е.М., Гамзазаде А.И., Скляр A.M., Павлова С.А., Рогожин С.В. Изучение структурообразования хитозана в растворах методом электронной микроскопии // Acta Polymerica. 1986. - V 37, № 2. -P. 121-124.

36. Ikeda H., Yamamura S., Takayama K., Nagai T. Physicochemical properties of chitosan film1 prepared on a metal plate loaded with electric charge // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1996. - V. 44, № 7. - P. 1372-1375.

37. Ikeda H., Uchiyama К., Takayama К., Nagai Т. Chitosan Film Prepared on a Metal Plate Loaded with Electric Charge // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1995. - V. 43, № 12. - P. 2211-2214.

38. Ikeda H., Takayama K., Nagai T. Drug Permeation Behavior in Chitosan Film Prepared on the Metal Plate Loaded with Electric Charge // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 1997. - V. 45, № 1. - P. 221-223.

39. Синицына Г.М., Влодавец И.Н., Ребиндер П.А. // Докл. АН СССР. -1967. Т. 175, №2. - С. 399-402.

40. Николаев А.Ф., Прокопов А.А., Шульгина Э.С. Термические и деформационные свойства хитозановых пленок // Журнал прикладной химии. 1985. - Т. LVII, № 8. - С. 1870-1874.

41. Алексеев B.JL, Кельберг Е.А., Бронников С.В., Евмененко Г.А. Структурные и механические свойства пленок, полученных из смесей хитозана и полиэтиленоксида // Высокомолекулярные соединения. 2001. -Т. 43 Б, № 10.-С. 1856-1860.

42. Mi Zhang, Tianwei Tan. Insecticidal and Fungicidal' Activities of Chitosan and Oligo-chitosan // J. Bioactive Compatible Polym. 2003. - V. 18. - P.391-400.

43. Галлиаскарова Г.Г. Закономерности деструкции хитозана под действием перекиси водорода и озона: автореф. дис. . канд. хим. наук. -Уфа, 1997.

44. Комаров Б.А., Албулов А.И. Способ получения водорастворимой формы хитозана. Пат. 2001115860/04 Россия, 2003.

45. Муринов К.Ю., Волошин А.И., Красногорская И.Н., Соков Ю.Ф. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Изв. РАН. Сер. хим. 2002. - №1. - С.52-55.

46. Shih-Chang Hsu, Trong-Ming Don, Wen-Yen Chiu. Free radical degradation of chitosan with potassium persulfate, Polymer Degradation and Stability// Polym. Degrad. Stab. 2002. - №75. - P.73-83.

47. Федосеева E.H., Семчиков Ю.Д., Смирнова JI.A. Деструкция хитозана в растворах под действием окислительно-восстановительной системы // Высокомолекулярные соединения. Сер. Б. — 2006. — Т. 48, №10. — С. 1930 -1935.

48. Varum K.M., Ottoy М.Н., Smidsrod. О. Acid hydrolysis of chitosans // Carbohydr. Polym. 2001. - V. 46, №1. - P. 89-98.

49. Муллагалиев И.Р., Кабальнова H.H., Галиаскарова Г.Г., Монаков Ю.Б. Окислительная деструкция хитозана при озонировании // Журнал прикладной химии. 1997. - Т. 70, №10. - С. 1709-1712.

50. Муринов К.Ю., Курамшина А.Р., Хисамутдинов P.A., Кабальнова H.H. Окисление хитозана гипохлоритом и хлоритом натрия // Башкирский химический журнал. 2003. - Т. 10, №1. - С. 44-46.

51. Гизатуллина Г.А., Новиков В.Ю., Коновалова! И.Н. Деполимеризация хитина и хитозана при кислотном гидролизе // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы VIII Международ, конф. М.: ВНИРО, 2006. - С. 27-30.

52. Новиков В.Ю., Долгопятова Н.В., Коновалова И.Н., Путинцев Н.М. Исследование механизма кислотного гидролиза хитина и хитозана // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы X Международ, конф. М.: ВНИРО; 2010. - С. 50-53.

53. Новиков В.Ю. Кислотный гидролиз хитина и хитозана // Журнал прикладной химии. 2004. - Т.77, №3. - С. 490-493.

54. Рогожин C.B., Гамзазаде А.И., Членов М.А., Леонова Е.Ю., Скляр A.M., Дотдаев С.Х. Частичный кислотный гидролиз хитозана // Высокомолекулярные соединения. 1988. — Т. ХХХ(А), №3. - С. 610-616.

55. Журавлева Н.В., Лукьянов П.А. Хнтинолитические ферменты: источники, характеристика и применение в биотехнологии // Вестник ДВО РАН. 2004. - № 3. - С. 76-86.

56. Fukumizo Т. Chitinolitic enzymes: catalysis, substrate binding, and their application // Curr. Protein Peptide Sci. 2000. - V. 1, № 1. - P. 105-124.

57. Koga D., Mitsutomi M., Kono M., Matsumiya M. Biochemistry of chitinase // Chitin and Chitinases / Eds Jolles P., Muzzarelli R.A.A. Ancona: Atec. Grottammare, 1999.-P. 111-123.

58. Ильина A.B., Ткачева Ю.В., Варламов В.П. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. - Т.38, №2. - С. 132135.

59. Zhang Н., Du Y., Yu. X., Mitsutomi М., Aiba S. Preparation of chitosanoligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohydrate Research. 1999. - V.320. - P. 257-260.

60. Fu J.Y., Wu S.H., Chang S.T., Sung H.Y. Characterization of three chitosanase isozymes isolated from a commercial crude porcine pepsin preparation // JournaLagriculture food chemistry. 2003. - V.51, №4. - P. 1042-1048i

61. Hung Т.Н., Chang S.T., Sung H.Y., Chens C.T. Purification and characterization of hydrolase with chitinase and chitosanase activity from commercial stem bromelane. // Journal agriculture food chemistry. — 2002. V.50, №16.-P. 4666-4673-.'

62. Ильина A.B., Варламов В.П. Энзимология синтеза и деградации хитина и хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.:Наука, 2002. - С. 79-90.

63. Ильина А.В., Варламов В.П. Влияние степени ацетилирования на ферментативный гидролиз хитозана препаратом Целловиридин Г20х. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39, № 3. - С. 273-277.

64. Ильина А.В., Варламов В.П. Ацетилирование низкомолекулярного водорастворимого хитозана // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: материалы VI Межд. конф. М: ВНИРО, 2001. - С. 280-283.

65. Большаков И.Н. Инновационные аспекты применения хитозана в медицине // Рыбпром. 2010. - № 2. - С.46-47.

66. Пат. 4701444. США // РЖХим. 1988. №18. О 251П

67. Пат. 51-150398 Яп. // РЖХим. 1985. №21. О 344П.

68. Нудьга J1.A. Производные хитина и хитозана и их свойства // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.:Наука, 2002. - С. 141-177.

69. Чирков С.Н. Противовирусные свойства хитозана // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.:Наука, 2002. - С.327-338.

70. Галиаскарова Г.Г., Муллагалиев И.Р., Монаков Ю.Б. Применение в медицине хитина и его модифицированных производных // Башкирский химический журнал. — 1996. — Т. 3, вып. 5-6. — С. 3-12.

71. Плиско Е.А., Нудьга JI.A., Данилов С.Н. О-алкилирование хитозана // Журнал общей химии. 1972. - Т. XLIII, №12. - С. 2752-2756.

72. Нудьга J1.A., Плиско Е.А., Данилов С.Н. N алкилирование хитозана // Журнал прикладной химии. - 1973. - Т.23, №12. - С. 2756-2760.

73. Горовой JT.B., Косяков В.Н. Сорбционные свойства хитина и его производных // Хитин и хитозан: получение, свойства и применение // под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. — М.:Наука, 2002. С. 217-246.

74. Knorr D. Use of chitonous polymers in food a challenge for food research and development // Food technology. 1984. - № 1. - P. 85-99.

75. Дубинская A.M., Добротворская A.E. Применение хитина и его производных в фармации // Хим.-фарм. журнал. 1989. - № 5. - С. 623-628.

76. Тосленко А .Я., Попова В.Г. Хитин и его производные в биотехнологии: обзор, информ. /Гл. управ, микробиол. пром-сти при Сов. М-ов СССР. — М., 1982.-40 с.

77. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. — М.:Наука, 2002. 365 с.

78. Червинец В.М., Смоленская Л.П., Чекесов М.И., Албулов А.И. Опыт лечения язвенной' болезни двенадцатиперстной кишки хитозаном // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: матер. VI Международ, конф. М.: ВНИРО, 2001. С. 255-258.

79. Заявка 19742318 Германия, МПК6 С 08 L 5/08, С 08 L 21/02. Опубл. 01.04.1999. РЖХ 00.09-19Ф.48П.

80. Чирков С. И. Противовирусные свойства хитозана // Новые достижения в исследовании хитина и. хитозана: матер. VI Международ, конф. М.: ВНИРО, 2001. - С. 120-124.

81. Жоголев К.Д., Никитин В.Ю., Цыган В.И., Егоров В.Н. Разработка и изучение некоторых лекарственных форм препаратов на основе хитозана// Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: матер. VI Международ, конф. М.: ВНИРО, 2001. - С. 163-167.

82. Hirano S., Tanaka Y., Hasegava M. et al. Effect of sulfated derivatives of chitosan on some blood coagulant factors // Carbohydr. Res. 1985. - V. 137. - P. 205-215.

83. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Efficacy of lactosaminated and intact N-succinylchitosanmitomycin С conjugates against M5076 liver metastatic cancer // J. Pharm. Pharmacol. 2002. - V. 54, № 4. - P. 529-537.

84. Kum Young Ho, Choi Hyung-Min, Yoon Jung Нее Synthesis of a quaternary ammonium derivative of chitosan and its application to a cotton antimicrobial finish// Text. Res. J. 1998. - V. 68, № 6. - P. 428-434.

85. Гамзазаде А.И., Корнилова Г.В., Карамов Э.В. Биологическая активность некоторых производных сульфата хитозана.// Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: матер. VII Международ, конф. М.: ВНИРО, 2003. - С. 165-166.

86. Сливкин А.И., Лапенко В.Л., Арзамасцев А.П., Болгов А.А. Аминоглюканы. в качестве биологически активных компонентов лекарственных средств // Вестник ВГУ. Сер.: Химия. Биология. Фармация. -2005.-№2.-С. 73-87.

87. Симко И.В., Лазаренко В.И., Большаков И.Н., Кузовников В.В. Способ лечения атрофии зрительного нерва; Пат. РФ №2309749. МПК7 А61К 31/722, 31/726,31/727,38/30, приоритет №2006120253/14 (021998) от 08.06.2006.

88. Кузовников В.В., Большаков И.Н1, Лазаренко В.И. Способ профилактики прогрессивной близорукости. Пат. РФ № 2275917. МПК7 А61 КЗ 1/722, А61 К 31/728, А61 К 38/18, А61 Р27/02,.приоритет № 2005108099 (009669) от 23.03.2005.

89. Барахтенко Н.Н., Левенец А.А., Большаков И.Н. «Бол-хитал» новый инновационный продукт в челюстно-лицевой хирургии // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: матер. IX Междун. конф. — М.: ВНИРО, 2008. - С. 138-140.

90. Ueno Н., Mori Т., Tanaka I., Kaba N., Matsuura M., Okumura M., Kadosawa Т., Fujinada Т. Accelerating effects of chitosan for healing at early phase of experimental open wound in dogs // Biomaterials, 1999. V. 20. p. 14071414.

91. Березин И.В., Клячко H.JL, Левашов A.B., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты кн. 7 // Биотехнология: 8 кн. / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. М.: Высшая школа, 1987. -159 с.

92. Н. Ф. Казанская, Н. И. Ларионова, В. П. Торчилин. Ферменты и белковые препараты в медицине // Биотехнология: уч. пособие / под ред. Баева A.A.-М.: Наука, 1984.-С. 113-125.

93. Кузьмина H.A. Основы биотехнологии Электронный ресурс. // Учебное пособие, Омский Государственный Университет. Режим доступа: http://wvvw.biotechnolog.ru/prombtyprombtl02.htm

94. Беленова A.C. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: автореф^ дис. .г канд. биол. наук. Воронеж, 2011. - 24 с.5 124. Коллахит. Раневые покрытия. Электронный ресурс. Режим доступа:http://kollahit.ru.

95. Информационный сайт Научно-исследовательского института текстильных материалов Электронный ресурс. — Режим доступа: http://www.polyferm.ru.

96. Тихонов В.Е., Краюхина М.А., Гнатюк Н.Г., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Новое лекарственное средство на основе хитозана «Адгелон-гель» // Новые достижения в исследовании хитина и хитозана: материалы VI Международ, конф. - М. ВНИРО, 2001. - С. 235-236.

97. Горбачева И.Н., Овчиников Ю.К., Гальбрайх JI.C., Трофимов Н.А., Мажоров В.В. Рентгенографическое изучение структуры хитозана // Высокомолекулярные соединения. 1988. - Т.ЗО А, №12. - С. 2512- 2515.

98. Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико-химию растворов полимеров. М.: Химия, 1978. - 320 с.

99. Будтов В.П. Физическая химия растворов полимеров. — СПб.: Химия, 1992.-384 с.

100. Рабинович M.JL, Клесов А.А., Березин И.В. Вискозиметрический анализ кинетики гидролиза карбоксиметилцеллюлозы // Биоорганическая химия. -1977. Т. 3, № 3. - С.405-414.

101. Клесов А.А., Рабинович М.Л., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораги С.Ю. Ферментативный гидролиз целлюлозы. I. Активность и компонентный состав целлюлазных комплексов из различных источников // Биоорганическая химия. 1980. - Т. 6, № 8. - С.1225-1242.

102. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды). — М.: Высшая школа, 1977. — 224 с.

103. Папков С.П. Равновесие фаз в системе полимер-растворитель. М.: Химия; 1981.-272 с.

104. Чалых А.Е., Герасимов В.Н., Михайлов Ю.Н. Диаграммы фазового состояния полимерных систем. М.: Янус К, 1998. - 199 с.

105. Samuels R.J. Solid State Characterization of the Structure of Chitosan Films // J. PolymSci. Polym. Physics Ed. 1981. - V. 19, № 7. - P.1081-1105.

106. Геллер Б.Э., Геллер A.A., Чиртулов В.Г. Практическое руководство по физикохимии волокнообразующих полимеров: учебное пособие для вузов. 2-е изд. -М.: Химия, 1996. 432 с.

107. Лопатин С.А., Дербенева М.С., Куликов С.Н., Варламов В.П., Шпигун О.А. Фракционирование хитозана методом ультрафильтрации // Журнал аналитической химии. 2009. - Т. 64, № 6. - С. 666-670.

108. Черкасова Е.И., Смирнова Я.А., Смирнов В.Ф. Измерение молекулярной массы олигомеров хитозана // Высокомолекулярные соединения. 2006. - Сер. Б, Т. 48, № 3. - С. 557-560.

109. Аринштейн А.Э. Влияние агрегационных процессов на вязкость суспензий // Журнал экспериментальной и теоретической физики. — 1992. —Т. 101, Вып. 4.-С. 1209-1215.

110. Иващенко Г.Л., Шахтшнейдер, В.В.Болдырев, Н.Г.Базарнова, А.В.Иванов, О.Р.Гартман. Механическая активация, как способ получения водорастворимых форм хитина и хитозана в твердой фазе // Химия в интересах устойчивого развития. 2002. — №10. - С. 69-76.

111. Чеботок Е. Н., Новиков В. Ю., Коновалова И. Н. Влияние кристалличности хитина и хитозана на кинетику щелочного деацетилирования // Журнал прикладной химии. 2007. - Т. 80, вып 10. -С. 1724-1729.

112. Чалых А.Е., Сапожникова И.Н., Булгакова P.A., Соколова Н.П. Закономерности фазовых и конформационных переходов в системе ПВХ-МЭК // Высокомолекулярные соединения-1987 Сер.А, Т. 29, № 8. - С. 1749-1754.

113. Колесов C.B., Кулиш Е.И., Минскер K.G. Роль надмолекулярной структуры в процессе деструкции поливинилхлорида в растворе // Высокомолекулярные соединения. -1994. Сер. Б, Т. 36, № 8. - С. 1383-1384.

114. Кулиш Е.И., Колесов C.B., Минскер К.С., Заиков Г.Е. Влияние структурно-физического состояния поливинилхлорида в растворе на его термический распад // Высокомолекулярные соединения. 1998. - Сер. А, Т. 4, №8.-С. 1309-1313.

115. Кулиш Е.И., Герчиков А .Я., Чирко К.С., Колесов C.B., Заиков Г.Е. Особенности окисления полибутадиена в растворе // Высокомолекулярные соединения. -2004. Сер. Б, Т. 46. № 2. - С. 349-353.

116. Эмануэль Н.М., Бучаченко А.Л. Химическая физика старения и стабилизации полимеров. -М.: Наука, 1982. 359 с.

117. Федосеева E.H., Алексеева М.Ф., Смирнова JI.A. Механические свойства пленок хитозана различной молекулярной массы // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. -2008. № 5. — С. 5862.

118. Кулезнев В.Н.Смеси полимеров. М.: Химия, 1980. - 304 с.

119. Зоткин М.А., Вихорева Г.А., Кечекьян A.C. Термомодификация хитозановых пленок в форме солей с различными кислотами // Высокомолекулярные соединения. 2004. - Сер. Б, Т. 46, № 2. - С. 359-363.

120. Бабаев М.С., Кулиш Е.И., Мударисова Р.Х., Колесов C.B. Изучение взаимодействия хитозана с трипсином // матер, пятой Всерос. каргинской конференции «Полимеры 2010». М., 2010. - С. 137.

121. Мударисова Р.Х., Бабаев М.С., Галяутдинов A.A., Кулиш Е.И. Ферментсодержащие хитозановые пленки // тезисы докладов 8 Всерос. конф. с международным участием Химия и медицина. Уфа, 2010. - С.258-259.1.