Наночастицы хитозана как носители биологически активных веществ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

Ваел Шехта Метвапли Эльсайед Елазаб

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАНА КАК НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Специальности: 02.00.06 - высокомолекулярные соединения 02.00.03 - органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 с оез гш

Москва 2012

005011590

Работа выполнена в Воронежском государственном университете на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидов

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент

Кузнецов Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Телешев Эдуард Никонорович

доктор химических наук, профессор Борисова Елена Яковлевна

Ведущая организация: Воронежский государственный университет инженерных технологий

Защита состоится 1 марта 2012 года в 15.00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.120.04 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу:

119571, г. Москва, пр. Вернадского, 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета 119571, г. Москва, пр. Вернадского, 86

Автореферат разослан | ,р | » 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совдха^

доктор химических наук, профессор ¿й-^^Грицкова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время значительное внимание многих исследователей приковано к проблеме выделения и химической модификации природных полимеров. Среди большого многообразия биополимеров особое место занимает хитозан. Уникальность хитозана обусловлена широким спектром проявляемых им свойств, среди которых следует особо выделить такие как биологическая активность, биосовместимость и нетоксичность. Это позволяет его использовать в химии, фармации, медицине, поэтому исследования, связанные с химией такого биополимера, как хитозан, является важной задачей полимерной химии. Учитывая его биологическую активность, биосовместимость и нетоксичность основным стратегическим направлением его использования является фармация и медицина, которая предъявляет определенные требования по величине молекулярной массы полимера. Задача получения низкомолекулярного хитозана, изучения механизма деструкции и управление процессом с целью синтеза продукта с необходимыми свойствами является актуальной как с теоретической, так и практической точек зрения.

Помимо этого, наличие в макромолекулах хитозана реакционноспособных групп обуславливает его способность к комплексообразованию, позволяющая осуществлять иммобилизацию биологически активных веществ. Учитывая его биосовместимость и нетоксичность возможно получение новых гидрофильных лекарственных форм на основе известных препаратов и веществ потенциально биологически активных с пролонгированным действием, что указывает на актуальность проведенных исследований.

Цель работы - синтез наночастиц хитозана с различной молекулярной массой и исследование их способности к комплексообразованию с биологически активными веществами для создания гидрофильных лекарственных форм.

Научная новизна.

Исследована возможность использования наночастиц хитозана в качестве носителей биологически активных веществ. Показано, что в присутствии триполифосфата натрия образуются наночастицы комплексов низкомолекулярного хитозана с модельными биологически активными веществами и известными лекарственными препаратами.

Изучена окислительная деструкция высокомолекулярного хитозана пероксидом водорода и получены его полимергомологи в широком диапазоне значений молекулярных масс. Установлена зависимость степени полимеризации хитозана от концентрации окислителя, температуры и продолжительности процесса. Найдено, что эффективным стоппером деструкции является водный раствор аммиака, не приводящий к понижению степени деацетилирования хитозана, как это происходит при использовании формалина.

Определены условия получения наночастиц низкомолекулярных хитозанов.с узким распределением по размерам. Показано, что размер частиц зависит от величины молекулярной массы хитозана, его концентрации и концентрации триполифосфата натрия, рН среды.

Впервые синтезирован и идентифицирован ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

Получена водорастворимая форма известного противотуберкулезного препарата гидразона изоникотиновой кислоты - 1-изоникотинил-2-В-глюкозилгидразона дигидрата.

Показано, что низкомолекулярные гомологи хитозана образуют комплексы с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным, а также рядом производных пиридазина, на основе которых получены наноразмерные частицы с узким распределением по размерам.

Получены наночастицы солей низкомолекулярного хитозана глутаминовой, янтарной и п-аминосалициловой кислот.

Практическая значимость работы.

Синтезировании полимерные комплексы хитозана с гидразидом изони-котиновой кислоты и его углеводным производным. Исследования в бакте-риостатической лаборатории Белгородского областного противотуберкулезного диспансера ппоказали, что они перспективны для их применения в медицинской практике.

Получен ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

Личный вклад автора. Автор лично выполнил большинство этапов работ, включая постановку задач, проведение эксперимента, анализ и обсуждение результатов. Автор защищает:

Усовершенствованный способ получения низкомолекулярных полимергомо-логов хитозана

Синтез наночастиц на основе хитозана с различной молекулярной массой Способы получения ряда 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов и 1-изоникотинил-2-0-глкжозилгидразона дигидрата

Получение комплексов наночастиц хитозана с низкомолекулярными биологически активными веществами

Апробация работы. Результаты работы докладавались на V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2010» (Москва, 2010г.), 7-ой Санкт-Петербургской конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011 г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ: 4 патента, 1 статья, 2 тезисов докладов конференций различных уровней. Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (189 наименований). Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 14 таблицы, 25 рисунков.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.

Глава 1. В Литературном обзоре дан подробный анализ публикаций, связанных с получением хитозана, его полимергомологов и их взаимодействий с низкомолеклярными биологически активными веществами.

Глава 2. В Экспериментальной части описаны методики синтеза и аналитической оценки исходных веществ и продуктов их взаимодействия, методы исследования полимеров (вискозиметрия, ИК-спектроскопия, ЯМР 'Н, масс-спектрометрия, динамическое светорассеяние, потенциометрическое титрование, химические методы определения молекулярных масс) и другие, используемые в работе.

Глава 3. Обсуждение результатов

3.1. Деструкция высокомолекулярных хитозанов

Изучено окислительное действие перекиси водорода на гликозидные центры, протекающей по схеме:

Преимуществом использования пероксида водорода в качестве деструкти-рующего агента является экологичность, его доступность, а также минимизация побочных реакций окисления функциональных групп в мягких условиях осуществления процесса.

В связи с этим изучена деструкция высокомолекулярного хитозана Н2О2, с целью получения полимергомологов со степенью полимеризации от 6 до 1 ООО аминоглюкозных единиц и сохранением СД более 90 %. Исследования проводились в 1-2 % водном растворе уксусной кислоты. Исследование влияния концентрации полимера показало, что оптимальной является 2 масс. %. Увеличение концентрации полимера приводило к заметному росту вязкости, что осложняло осуществление процесса в связи диффузионным фактором и, как следствие, получению полимеров с большой степенью дисперсности.

Важнейшим параметром, определяющим степень деструкции высокомолекулярного хитозана, соответственно, и молекулярную массу конечного продукта, является концентрация Н2О2 в реакционной среде. Исследования проводились при постоянной температуре 50 °С. Установлено, что с увеличением концентрации пероксида водорода молекулярная масса снижается. Однако, по мере повышения концентрации Н2О2 происходит увеличение степени дисперсности целевого продукта, о чем свидетельствует расширение величин молекулярных масс полимеров в серии параллельно выполненных при одинаковых условиях опытов. Так, при концентрации Н2О2 равной 2 масс. %, молекулярная масса изменялась в интервале 2,8-3,3 кДа, а при содержании 2,5 масс. % - 1,1-2,3 кДа. Это связано, по-видимому, с высокой интенсивностью процесса деструкции и сложностью конролирования и управления им. Дальнейшее повышение концентрации приводит к получению олигомеров.

Изучение влияния температуры на глубину протекания деструкцию исследовали в интервале 20-70 °С. Установлено, что более перспективным параметром, позволяющим в большей степени регулировать молекулярную массу образующихся полимергомологов, является температура. С ростом температуры при постоянстве остальных параметров реакции, молекулярная масса снижается. Причем величина молекулярной массы полимеров, полу-

ченных в серии параллельных опытов, изменяется в пределах 5-10%, что соответствует ошибке эксперимента.

Реакцию окисления прерывали добавлением водного раствора аммиака. Преимуществом данного метода в сравнение с применявшимся ранее формальдегидом является то, что в результате реакции с аммиаком образуются безвредные молекулярный азот и вода и не снижается степень деацетилиро-вания хитозана.

3.2. Получение наночастиц низкомолекулярного хитозана

В последнее время значительный интерес проявляется к наноструктури-рованным полимерам. В силу большой удельной поверхности наночастицы проявляют отличные от обычных полимеров свойства и существенное увеличение характерных. Это открывает большие возможности использования их в различных отраслях науки и техники. В частности при создании лекарственных веществ. Такие структуры имеют большое сродство к мембране клетки и малые размеры позволяют легко проникать в ядро клетки.

Однако основной проблемой при получении наночастиц является их устойчивость. В силу высокой удельной поверхностной энергии таких частиц они проявляют чрезвычайно высокую склонность к агрегации. Важнейшей задачей при получении наночастиц является придания им свойства устойчивости к агрегации. Повышение устойчивости может быть достигнуто созданием условий, препятствующих агрегации. К числу таковых относят создание двойного электрического слоя, структурных барьеров и т.д. Наиболее перспективным является первый.

Исследовано влияние на размер наночастиц хитозана с молекулярной массой 10 кДа природы и концентрации электролита, рН среды. В качестве электролитов, стабилизирующих частицы хитозана в дисперсии изучены ЫН4ОН и триполифосфат натрия (ТРР). Как установлено, в случае использования ЫН4ОН образуются не стабильные наночастицы хитозана, которые с течением времени агрегируют до больших размеров (рис.1).

t, min

Рис.1 Зависимость размера частиц нанохитозана от времени (NH4OH, С(хитозана)=0,2 мг/мл)

Использование ТРР приводит к образованию устойчивых во времени на-ночастиц хитозана. Установлено, что на размер частиц существенное влияние оказывает концентрация ТРР и хитозана. При концентрации хитозана менее ОД мг/мл получаются дисперсии с широким разбросом по размерам частиц. Наиболее стабильные результаты получены при концентрации хитозана 0,2 мг/мл, а в дальнейшем с ее увеличением размер частиц, сохраняя узкий интервал по размерам, растет.

Исследование влияния концентрации ТРР показало (рис.2), что с ее увеличением размер частиц снижается.

CfTPP) mg/ml

Рис. 2 Зависимость размера частиц хитозана (ММ=10 кДа) от концентрации ТРР (рН=4.0, С(хитозана)=2 мг/мл)

Изучение влияния рН среды в процессе получения дисперсий хитозана показало, что зависимость носит не линейный характер (рис.3, кривая 1). В области низких значений рН размер частиц с его ростом уменьшается, достигает минимального значения, а затем наблюдается их рост, связанный с уменьшением устойчивости частиц, на что указывает снижение снижение Ъ,-потенциала (рис.3, кривая 2).

—I-'-1-'-1-'-1-'-1---1-1-Г"

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

РН

Рис.3 Зависимость размера частиц хитозана (ММ=10 кДа) (2) и потенциала (1) от рН среды (С(хитозана)=2 мг/мл, С(ТРР)= 1,75 мг/мл)

Изучение влияния молекулярной массы хитозана в интервале 5-30 кДа показало, что размер его наночастиц изменяются несущественно. Это связано, по-видимому, с тем, что макромолекулы хитозана чрезвычайно склонны к ассоциации и в образовании наночастиц участвуют ассоциаты макомолекул.

3.3. Синтез производных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов. С целью исследования получения наночастиц полимерных комплексов с биологически активными веществами для получения их гидрофильных форм в качестве модельных соединений синтезирован ряд производныхЗ-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов.

Исходный 3-гидразино-4,5-дифенил-1-пиразоло[3,4-Ь]пиридазин был получен путем обработки 3-циано-4,5-дифенилпиридазин-3(2Н)-он РОС13 с образованием 2-хлор-3-циано-4,5-дифенилпиридазина и последующим взаимодействием с 85% гидразин гидратом по схеме:

Диазотированный арил амины, такие как анилин, о, м и р-толуидины, о-и р-анизидина, о- и м-хлоранилин, п-нитроанилина, р-нафтиламина и 3-аминопиридина в сочетании с активными соединениями, таких как ацетил-ацетона натрия буферный раствор ацетата, чтобы дать азобензола ацетилаце-тона с хорошими выходами (схема).

NaNCVHCI г _ -1 MeCOCH2COMe

NaN02/HCI г _ -1

Ar—NH2 -»- Ar—N=NCI

n_K°r> L -1

0-5°С и АсОЫа, 0-5°С

рН= 3-4

СОМе СОМе

Аг—Ы=Ы—СН — Аг-Ш-М=С

СОМе СОМе

где Аг = С6Н5, С1С6Н4, 2-МеС6Н4, 3-С1С6Н4) 3-МеС6Н4) 4-Ш2С6Н4, 4-МеС6Н4, 2-нафтил, 2-МеОС6Н4, 3-пиридил, 4-МеОС6Н4

Спектральные данные для таких соединений указывают им иметь конфигурацию гидразона.

Полученные соединения, реагируя с азобензолацетонами в абсолютном этаноле при температуре кипения дают 3-[4-арилазо-3,5-диметилпиразол-1-ил]-4,5-дифенил-1-пиразоло[3,4-Ь]пиридазин. по схеме:

,nhnh2

/

Ar-NH-N=C \

СОМе

СОМе

EtOH / HCl Reflux

Ме

где Аг = СбН5, 2-МеОС6Н4, 3-С1С6Н4,2-МеС6Н4, 4-МеОС6Н4, 4-Ш2С6Н4, 3-МеС6Н4, 2-С1С6Н4, 2-нафтил, 4-МеС6Н4

Структура соединений была подтверждена с помощью ИК-, ЯМР 1Н-, масс-спектрометрии и элементного анализа.

3.4. Синтез 1-изоникотинил-2-0-глюкозилгидразона Разработан способ получения 1-изоникотинил-2-0-глюкозилгидразона, предусматривающий конденсацию гидразида изоникотиновой кислоты с гидратом Э-инокозы по схеме:

н,о н о

гйн

+ н.н-ын-с-ч

—он .ы-Н ,

^ н

-Ы Н-С

I!

о

-• 2 Н 2 О

о н

Исходный гидразид изоникотиновой кислоты получен взаимодействием изоникотиновой кислоты с хлористым тионилом приводящим к образованию хлоргидрата изоникотиновой кислоты,

последующим действием абсолютным этанолом получен хлоргидрат этилового эфира изоникотиновой кислоты

С1

.о

.0

С1 + с2н5он

С1 + НС1

н

♦ •гг

I

н

Разложение карбонатом натрия солевой формы выделен этиловый эфир изоникотиновой кислоты, который при взаимодействии с гидразин гидратом получен гидразид изоникотиновой кислоты в соответствии со схемой:

Строение конечного 1-изоникотинил-2-В-глюкозилгидразона и промежуточных соединений подтверждено данными ИК-спектроскопии, элементного анализа температуры плавления и кипения.

3.5. Получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами

Как известно, хитозан благодаря биосовместимости, нетоксичности, а также наличия реакционноспособных амино- и гидроксигрупп является перспективным носителем лекарственных веществ, снижая при этом их токсичность и повышающим гидрофильность. Получение наночастиц полимерных комплексов хитозана с лекарственными веществами позволяет создавать лекарственные формы, увеличивающие их возможность проникновения в

н

клетки. В соответствии с этим получения наночастиц исследовано получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с 3-замещенными пиразоло[3,4-с]пиридазинами, являющимися потенциальными биологически активными веществами. Исследование проведено в присутствии ТРР.

Изучение влияния концентрации ТРР на степень связывания и размер частиц образующихся комплексов. Как установлено, с ростом концентрации ТРР степень связывания увеличивается достигая максимального значения 25 масс.% (рис.4), выходит на плато. Следует отметить, что средний размер частиц при этом снижается (рис.5).

0,6 0,8 1.0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 2,4 С(ТРР), шд/т!

Рис.4 Зависимость массовой доли 3-замещенных с]пиридазинов к комплексе с хитозаном (ММ = 10 кДа) от ТРР.

пиразоло[3,4-концентрации

C(TPP), mg/ml

Рис.5. Зависимость размера частиц комплекса хитозана с с 3-замещенными пиразоло[3,4-с]пиридазинами от концентрации ТРР.

Для подтверждения образования комплексов хитозана с производными пиридазинов проведено ИК-спектральное исследование. В ИК-спектрах комплексов наблюдается смещение полос поглощения, соответствующих валентным колебаниям -C=N- связей конденсированных ароматических колец пиразолопиридазинов с 1586-1580 до 1570-1565 см"1.

Исследован процесс комплексообразования низкомолекулярных гомологов хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты (ГИНК) в присутствии ТРР. Для подтверждения образования комплексов ГИНК с хитозаном проведено их исследование с помощью ИК-спектроскопии. В ИК-спектрах комплексов наблюдается смещение характеристических полос поглощения в сравнении с исходными хитозаном и ГИНК. В частности, смещение полосы поглощения соответствующей валентным колебаниям гидразидной >С=0 связи с 1654 см"1 в исходном ГИНК до 1663 см'1 свидетельствует об участии ее в образовании комплексов, вероятно с первичной или вторичной аминогруппой хитозана. На их участие указывает также смещение полосы поглощения в области 1616 см"1, отвечающей деформационным колебаниям первичной и вторичной аминогрупп в хитозане до 1631 см"1 в комплексе. Кроме

этого в комплексообразовании согласно данным ИК-спектроскопии участвует «пиридиновый» атом азота ГИНК, на что указывает смещение полосы поглощения, соответствующей валентным колебаниям -С=Ы- ароматического цикла ГИНК с 1584 см"1 до 1560 см"1. Видимо, взаимодействие «пиридинового» атом азота ГИНК происходит со связями Р=0 молекул ТРР.

С целью определения оптимальных условий взаимодействия хитозана с ГИНК, проведено исследование влияния их мольного соотношения на степень связывания. Изучение проведено в интервале 1.0-1.8 мольного избытка по отношению к хитозану. Установлено, что введение исходного мольного соотношения более 1.0, в изученном интервале, не приводит к увеличению массовой доли ГИНК в образующемся комплексе. Контроль содержания ГИНК в комплексе осуществляли по данным ИК-спектроскопии аналогично предыдущему.

Аналогичным образом получены наноразмерные комплексы низкомолекулярного хитозана с 1-изоникотинил-2-0-глюкозилгидразон дигидратом, глутаминовой, янтарной и п-аминосалициловой кислотами. Образование комплексов подтверждено данными ИК-спектроскопии.

Структуру наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами можно представить в общем виде следующим образом:

^^^^-

-^^^^

где Sub:

3-замещенные пиразоло[3,4-с]пиридазинов

Ph

Ph

-»Ar" R ^

H

ГИНК: гидразид изоникотиновой кислоты

О

N

1 -изоникотинил-2-В-глюкозилгидразона дигидрат

он

сн,он

ОН -Ж-С—V ХЫ.2Н„0

# II 2

он

Глутаминовая кислота

НООССНСН2СН2СООН

Янтарная кислота п-Аминосалициловая кислота

НООССН2СН2СООН

ООН

Н2К ^ ОН

ТРР: триполифосфат натрия

ООО

№+0—Р- Р-Р—О №

о; 0+ 0+

N8 N8 N8

ВЫВОДЫ

1. Исследована возможность использования наночастиц хитозана в качестве носителей биологически активных веществ. Показано, что в присутствии триполифосфата натрия образуются наночастицы комплексов низкомолекулярного хитозана с модельными биологически активными веществами и известными лекарственными препаратами.

2. Изучена окислительная деструкция высокомолекулярного хитозана пероксидом водорода и получены его полимергомологи в широком диапазоне значений молекулярных масс. Установлена зависимость степени полимеризации хитозана от концентрации окислителя, температуры и продолжительности процесса. Найдено, что эффективным стоппером деструкции является водный раствор аммиака, не приводящий к понижению степени деацетилирования хитозана, как это происходит при использовании формалина.

3. Определены условия получения наночастиц низкомолекулярных хитозанов в присутствии триполифосфата натрия с узким распределением по размерам. Показано, что размер частиц зависит от величины молекулярной массы хитозана, его концентрации и концентрации триполифосфата натрия, рН среды.

4. Впервые синтезирован и идентифицирован ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

5. Получена водорастворимая форма известного противотуберкулезного препарата гидразона изоникотиновой кислоты - 1-изоникотинил-2-0-глюкозилгидразона дигидрат.

6. Показано, что низкомолекулярные гомологи хитозана образуют комплексы с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным, а также рядом производных пиридазина, на основе которых получены наноразмерные частицы с узким распределением по размерам.

7. Синтезированы наноразмерные частицы солей низкомолекулярного хитозана глутаминовой, янтарной и п-аминосалициловой кислот.

Материалы диссертации полностью опубликованы и доложены на всероссийских конференциях.

Статья, опубликованная в журнале, рекомендованном ВАК:

1. Deeb, A.Pyridazine derivatives and related compounds. 23*. Synthesis of 3-substituted pyrazolo[3,4-c]pyridazines and their application as disperse dyes / A.Deeb, F.Yassin, N. Ouf, W.Shehta. // Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 46, Number 2, June 2010, pp. 212-222(11).

Тезисы докладов и публикации в других изданиях:

2. Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб. Синтез нанокомпозитов на основе хитозана и биологически активных веществ / Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб, В.А. Кузнецов // Полимеры-2010 : V Всерос. Каргинская конференция, Москва, 21-25 июня 2010 г. : программа конф. и сб. тез. пленарных, устных и приглашенных докл. —М., 2010. — 1 с. — 0,1 п.л.

3. Купреев Н.И. Патент № 2417088 (Россия) Способ получения низкомолекулярного хитозана / Н.И. Купреев, Д.В. Быковский, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

4. Купреев Н.И. Патент №: 2428432 (Россия) Способ получения нано-частиц низкомолекулярного хитозана / Н.И. Купреев, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

5. Купреев Н.И. Положительное решение о выдаче патента № 2010148278/15(069722). Способ получения водорастворимого пара-аминосалицилата хитозана / Н.И. Купреев, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

6. Купреев Н.И. Положительное решение о выдаче патента № 2010119795/15(028178). Способ получения полимерного комплекса на основе

изоглюкозила / Н.И. Купреев, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсай-ед Елазаб.

7. Панков И.В. Комплексообразование низкомолекулярного хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты / И.В. Панков, Ваел Шехта Метвали, В.А. Кузнецов // 7-ая Санкт-Петербургская конференция молодых ученых, Санкт-Петербург, ИВС РАН, 17-20 октября 2011 г.: программа и тез. докл. -С-Пб., 2011.-С.101.

Подписано в печать 30.01.2012. Формат 60 х 84/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,3 Тираж 100 экз. Заказ №273

Отпечатано в типографии Воронежского ЦНТИ - филиала ФГБУ «РЭА» Минэнерго России 394036, г. Воронеж, пр. Революции, 30.

61 12-2/304

ФГБОУ ВПО « ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

Ваел Шехта Метвалли Эльсайед Елазаб

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАНА КАК НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальности: 02.00.06 - высокомолекулярные соединения 02.00.03 - органическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель

Доктор химических наук доцент Кузнецов В.А.

Москва- 2012

Содержание

Введение 3

1. Литературный обзор 6

1.1. Хитозан и его свойства 6

1.2. Иммобилизация биологически активных веществ 16

1.3. Аналоги хитозана 29

1.4. Сополимеры, комплексы 43

2. Экспериментальная часть 54

2.1. Деструкция хитозана 54

2.2. Определение молекулярной массы гомологов хитозана 56

2.3. Получение наночастиц хитозана 57

2.4. Синтез производных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов 58

2.5. Получение гидразида изоникотиновой кислоты 62

2.6. Синтез 1-изоникотинил-2-глюкозилгидразона дигидрата 63

2.7. Получение наночастиц комплексов хитозана с производными 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов 64

2.8. Получение наночастиц комплексов хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты 64

2.9. Получение наночастиц комплексов хитозана с1-изоникотинил-2-глюкозилгидразона дигидратом 64

2.10. Получение наночастиц солей хитозана с карбоновыми кислотами 65

3. Обсуждение результатов 77

3.1. Деструкция высокомолекулярных хитозанов 77

3.2. Получение наночастиц низкомолекулярного хитозана 83

3.3. Синтез производных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов 87

3.4. Синтез 1-изоникотинил-2-глюкозилгидразона дигидрата 92

3.5. Получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами 94

Выводы 113

Список литературы 114

Введение

Актуальность темы. В настоящее время значительное внимание многих исследователей приковано к проблеме выделения и химической модификации природных полимеров. Среди большого многообразия биополимеров особое место занимает хитозан. Уникальность хитозана обусловлена широким спектром проявляемых им свойств, среди которых следует особо выделить такие как биологическая активность, биосовместимость и нетоксичность. Это позволяет его использовать в химии, фармации, медицине, поэтому исследования, связанные с химией такого биополимера, как хитозан, является важной задачей полимерной химии. Учитывая его биологическую активность, биосовместимость и нетоксичность основным стратегическим направлением его использования является фармация и медицина, которая предъявляет определенные требования по величине молекулярной массы полимера. Задача получения низкомолекулярного хитозана, изучения механизма деструкции и управление процессом с целью синтеза продукта с необходимыми свойствами является актуальной как с теоретической, так и практической точек зрения. Помимо этого, наличие в макромолекулах хитозана реакционноспособных групп обуславливает его способность к комплексообразованию, позволяющая осуществлять иммобилизацию биологически активных веществ. Учитывая его биосовместимость и нетоксичность возможно получение новых гидрофильных лекарственных форм на основе известных препаратов и веществ потенциально биологически активных с пролонгированным действием, что указывает на актуальность проведенных исследований.

Цель работы - синтез наночастиц на основе хитозана с различной молекулярной массой и исследование их способности к комплексообразованию с биологически активными веществами для создания гидрофильных лекарственных форм.

Научная новизна.

Исследована возможность использования наночастиц хитозана в качестве носителей биологически активных веществ. Показано, что в присутствии триполифосфата натрия образуются наночастицы комплексов низкомолекулярного хитозана с модельными биологически активными веществами и известными лекарственными препаратами.

Изучена окислительная деструкция высокомолекулярного хитозана пероксидом водорода и получены его полимергомологи в широком диапазоне значений молекулярных масс. Установлена зависимость степени полимеризации хитозана от концентрации окислителя, температуры и продолжительности процесса. Найдено, что эффективным стоппером деструкции является водный раствор аммиака, не приводящий к понижению степени деацетилирования хитозана, как это происходит при использовании формалина.

Определены условия получения наночастиц низкомолекулярных хитозанов.с узким распределением по размерам. Показано, что размер частиц зависит от величины молекулярной массы хитозана, его концентрации и концентрации триполифосфата натрия, рН среды.

Впервые синтезирован и идентифицирован ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

Получена водорастворимая форма известного противотуберкулезного препарата гидразона изоникотиновой кислоты - 1-изоникотинил-2-В-глюкозилгидразона дигидрата.

Показано, что низкомолекулярные гомологи хитозана образуют комплексы с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным, а также рядом производных пиридазина, на основе которых получены наноразмерные частицы с узким распределением по размерам.

Получены наночастицы солей низкомолекулярного хитозана глутаминовой, янтарной и п-аминосалициловой кислот.

Практическая значимость работы.

Синтезированны полимерные комплексы хитозана с гидразидом изонико-тиновой кислоты и его углеводным производным. Исследования в бактериоста-тической лаборатории Белгородского областного противотуберкулезного диспансера ппоказали, что они перспективны для их применения в медицинской практике.

Получен ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

Личный вклад автора. Автор лично выполнил большинство этапов работ, включая постановку задач, проведение эксперимента, анализ и обсуждение результатов. Автор защищает:

Усовершенствованный способ получения низкомолекулярных полимергомоло-гов хитозана

Синтез наночастиц на основе хитозана с различной молекулярной массой Способы получения ряда 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов и 1-изоникотинил-2-0-глюкозилгидразона дигидрата

Получение комплексов наночастиц хитозана с низкомолекулярными биологически активными веществами.

Апробация работы. Результаты работы докладавались на V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2010» (Москва, 2010г.), 7-ой Санкт-Петербургской конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011 г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ: 4 патента, 1 статья, 2 тезисов докладов конференций различных уровней.

1. Литературный обзор

1.1. Хитозан и его свойства

Аминосодержащие биополимеры - гомо- и гетерогликаны, их различные аналоги и конъюгаты успешно используются в фармации и медицине. Расширение поисковых и практически внедряемых разработок характерно для утилизации хитозана, что объясняется сочетанием его ценных биохимических свойств с экономической доступностью. Химическая лабильность этого полимера позволяет, применяя относительно несложные технологические процессы, получать гомологи и аналоги с различными вариантами физико-химических и биологических свойств. Совместимость таких соединений с биосистемами, биоразлагаемость в организме с образованием безвредных низкомолекулярных соединений обеспечивают перспективность их практического использования. Установлена антибактериальная, противовирусная, и противовоспалительная активность хитозана и различных композиций на его основе при практическом отсутствии токсического действия на организм. Достоверно подтверждено иммуностимулирующее, адъювантное, адаптогенное, гемоста-тическое и холестрическое действие данных гликанов. Установлена зависимость указанных свойств от степени полимеризации основных макроцепей, концентрации первичных аминогрупп, вида и содержания различных функционалов. Изучаются процессы биологического действия хитозана и его производных в организме на молекулярном уровне.

Биологически активная композиция для медицинских и косметических целей, при лечении ожогов, в качестве пищевой добавки содержит хитозан-гель или хитозан-суспензию с размером наногранул не более 100 нм и ионы благородных металлов в количестве не более 10% (хитозан-гель 98,5; Ag 1,5.) Приведены результаты клинических испытаний. Композиция стимулирует заживление ран, снижает кожные раздражения [1]. Предложено хитозан-содержащее средство для лечения инфицированных ран и ожогов, проявляющее антибактериальные свойства, трансформируя их клиническое течение, и

ускоряет различные стадии заживления, включая развитие грануляционной ткани, фибриллогинез и эпителизацию [2].

Хитозан применяют для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Определена антибактериальная активность полимера по отношению ко всей микрофлоре, выделяемой из ульцерогенной зоны. Раствор хитозана (1%) с молекулярной массой (ММ) 320 кДа и степенью деацетилиро-вания (СД) 79.3% в 0.2% водном растворе НС1 вводился как аппликация на язвенную поверхность. Использовалась также таблетированная форма. Аминог-люкан оказывает выраженное бактериостатическое действие на все исследованные микроорганизмы. Отмечены ускоренные сроки рубцевания язв и резкое снижение явления рецидива [3].

Гелевые формы хитозана использовались для лечения хронического периодонтита. Отмечено их положительное влияние на развитие воспалительных процессов в тканях периодонта, определена активность различных препаратов мелкодисперсного хитозана в гелевой форме с СД 90-95% и ММ 10-15 и 120 кДа. Гели аминоглюкана (4, 6, 8%) проявляют антибактериальное действие в отношении микроорганизмов, этиологически значимых при периодонтите; активность проявляется в течение 24 часов. Снижение концентрации полимера дезактивирует процесс.

Применение пасты из геля хитозана и оксида цинка стимулирует новообразование костной ткани [4]. Предложен способ лечения пародонтита с применением электрофореза хитозана. Использован 0.5% водный раствор гидрохлорида хитозана с ММ 200 кДа, СД 80% и степенью кристалличности 75% (рН 4.5). Электрофорез проводили с анода при плотности тока 0.3-0.5 мА/см2. Предполагается образование полиэлектролитных комплексов между компонентами соединительной ткани и аминоглюканом, заполняющим межклеточное пространство, что ведет к нормализации циркуляции крови, реабилитации функций пародонта [5]. Обсуждается возможность использования хитозана для восстановления функции сухожилия после его повреждения и оперативного вмешательства [6].

Ряд исследований посвящено вопросу изучения антибактериальной активности полимера в зависимости от ММ и СД. Аминоглюканы со значительной степенью полимеризации в виде 1% растворов в 0.2% соляной кислоте проявляют антимикробное действие в отношении многих микроорганизмов

[7].

Изучена антибактериальная активность хитозана на двух раневых штаммах Е. coli и St. albus. Показано, что наибольшим антибактериальным эффектом обладает аминогликан с ММ=72 кДа в концентрации 20 мг/мл. Разработана технология приготовления лекарственных форм - гелей на метилцеллюлозе, содержащих хитозан в разных концентрациях. Наиболее эффективными по показателю времени полузаживления оказались гель, содержащий хитозан (ММ=72 кДа) в концентрации 2%, и гель, содержащий хитозан (ММ=10,7 кДа) в концентрации 0,1% [8].

Проведена оценка биологической активности аминоглюканов на серии микроорганизмов грамотрицательного и грамположительного типов. Использовавшиеся хитозаны с ММ 4-27 кДа были получены ферментативным гидролизом из исходных полимеров с различной СД (крабовый и пчелиный хитозаны). Была определена минимальная ингибирующая концентрация (МИК). Под действием хитозана усиливается проницаемость наружной мембраны клеток до пределов их жизнеспособности. Установлено, что для полимеров с ММ 527 кДа разница действия на грамотрицательные и грамположительные бактерии практически отсутствует. При тестировании хитозанов с ММ 4 кДа и СД 55%, 73%, 78% и 86%> установлена тенденция увеличения процента гибели клеток с увеличением СД полимера. Аминоглюкан с максимальной СД имеет более высокую концентрацию положительных зарядов на макроцепи, что приводит к образованию наиболее прочной связи с поверхностью клеточной стенки микроорганизмов. Дана оценка МИК для хитозанов с ММ 5-27 кДа и СД 85% в отношении к исследованной серии микроорганизмов [9]. Низкомолекулярные полисахариды, полученные из панцирей крабов, рекомендованы как эффективные препараты в борьбе с кандидозной инфекцией, развивающейся

от чрезмерного употребления антибиотиков. Их использование целесообразно также в качестве вещества, способствующего адсорбции лекарств и биологически-адгезивного реагента. Хитозаны используют в фармации для изготовления таблеток (грануляты), гелей, пленок, микросфер и капсул [10]. Антибактериальная активность аминоглюканов исследована в отношении Е. coli. Бактерицидная активность возрастает с увеличением ММ до ее максимального значения - 9.16хЮ4 Да (рН=5.6), далее наблюдается ее снижение. Эффективность действия хитозана возрастает с увеличением СД и концентрации. Клетки Е. Coli, в условиях воздействия аминоглюкана деформируются и подвергаются аутолизису [11]. Препараты на основе хитина и хитозана оказывают защитное действие при бактериальной септической инфекции (выживаемость достигает 90%).

Установлена способность полимера ингибировать вирусные инфекции в клетках животных организмов, а также предотвращать развитие фаговых инфекций в зараженной культуре микроорганизмов. Противовирусная активность аминоглюкана, как и его антибактериальные свойства, существенно зависит от степени полимеризации и от величины положительного заряда на макромолекулах. Механизм подавления фаговой инфекции заключается в инактивации соответствующих частиц и ингибировании репродукции бактериофагов. В животных организмах влияние хитозана на вирусные инфекции объясняется его воздействием на индуктивную фазу иммунного ответа и эф-фекторные механизмы иммунной системы. Важную роль играет способность аминоглюкана индуцировать в живом организме образование интерферона [12].

Определена способность полимера как иммуномодулятора для повышения резистентности животных, одновременно наблюдается стабилизация прироста массы тела (20-40%). Выраженный иммуностимулирующий эффект обусловлен, в основном, активацией фагоцитарной активности макрофагов. Этот механизм обеспечивает запуск реакций, ответственных за скорость формирования специфического гуморального иммунитета [13].

Сопоставлены антимикробная активность 2-х фракций хитозана с ММ равным 9300 (I) и 2200 (II) Да, полученных кислотным гидролизом хитозана и меченых флуоресцеинизотиоцианатом. Показано, что I является ингибитором роста клеток Escherichia coli и ассоциируется с клеточной МБ; II стимулирует рост и проникает внутрь клеток, не взаимодействуя с МБ. Высказано предположение, что ингибирующее действие I связано с блокированием проникновения питательных веществ внутрь клеток [14]. Исследована антибактериальная активность хитозана из вешенки обыкновенной. Гликан обладает высокой антибактериальной активностью в отношении грамотрицательных и грамполо-жительных условно-патогенных микроорганизмов [15].

Исследована противовирусная активность 4 фракции хитозана со средней молекулярной массой от 1.2 до 40.4 кДа. Степень индуцированной хитозаном устойчивости растений фасоли по отношению к вирусу мягкой мозаики, , возрастала с уменьшением молекулярной массы хитозана. Мономеры - глюкоза-мин и N-ацетилглюкозамин - противовирусной активностью не обладали [16].

Установлено выраженное адаптогенное действие хитозана на организм человека при высоких физических и эмоциональных нагрузках и неблагоприятных факторах внешней среды, использовавшегося в виде смеси с аминокислотами, производными ДНК и др. Защитное действие указанных препаратов отмечено также при угрозе поражения организма различными патологиями, в числе которых, инфекционный гепатит и туберкулез [17]. Хитозаны или их производные с ММ 25-500 кДа, СД 80-88%, вязкостью 1%-ного водного раствора менее 5000 мПа-с используют при профилактике воздействия на организм латексов и вулканизаторов в качестве антиаллергического средства [18]. Хитозан обладает свойствами радиопротектора. Установлено, что для хитозана характерна выраженная противолучевая активность, как в условиях профилактики, так и при лечении. Внутривенное его введение за 10-15 минут до облучения (385-365 рад), вызывающего костно-мозговую форму лучевой болезни, предотвращает гибель животных. При этом также изучен механизм действия монохлорацета�