Изучение взаимосвязи строения и свойств производных хитозана с ионогенными группами различных типов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 541.64:547.995.1

ол

- -

БУДОВСКАЯ Клавдия Эдуардовна

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ СТРОЕНИЯ И СВОЙСТВ ПРОИЗВОДНЫХ ХИТОЗА11А С ИОНОГЕННЫМИ ГРУППАМИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ

Специальность 02.00.06 - Химия высокомолекулярных соединений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандида: а химических наук

Москва-2000

Работа выполнена на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета им.А.Н.Косыгина.

• Научный руководитель: Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор Л.С. Гальбрайх

доктор химических наук ведущий научный сотрудник ИНЭОС РАН К.К.Бабиевский

кандидат химических наук ЗАО "АНИЦ ВИСКОЗА" Л.И.Барсова

Ведущая организация: Гематологический научный центр Минздрава РФ

Защита состоится "29" июня 2000 года в часов в аудитории 2211 на заседании диссертационного совета К.053.25.05. в Московском государственном .текстильном университете им.А.Н.Косыгина • по адресу: 117419, Москва, ул.Мал.Калужская,!.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного текстильного университета им.А.Н.Косыгина.

Автореферат разослан " ¿0" мая 2000 года Ученый секретарь диссертационного совета

проф. В.В.Сафонов

*—<чУо_0 О Г\

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Полисахариды хитин, хитозан и их производные находят широкое применение в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности благодаря наличию таких ценных свойств, как биологическая активность, биодеградируемость, биосовместимость, комплексообразующая и сорбционная способность. Значительное влияние на эти свойства оказывает химическое строение и состав макромолекул полимера. Так, в проявлении сульфатом хитозана (СХ) антикоагулянтной активности ' важную роль играют молекулярная масса, фракционный состав, степень замещения и характер распределения функциональных групп в элементарных звеньях макромолекул. Основные характеристики строения полимера закладываются в процессе его синтеза и выделения, поэтому актуальной является проблема изучения зависимости строения и свойств производных хитозана от способа их получения. Использование производных хитозана в качестве лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний предполагает применение в виде инъекционных форм. Поэтому для выявления закономерностей их поведения в крови и влияния на процессы, протекающие в организме, необходимо исследование реологических свойств разбавленных и концентрированных растворов этих полимеров.

Работа выполнялась в соответствии с ГНТ1Т "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" (направление "Атеросклероз") и межвузовской • НТП "Университеты России".

Целью работы являлось исследование возможности разработки усовершенствованного способа получения сульфата хитозана и способа получения низкомолекулярного сульфата хитозана, а также влияния химического строения производных хитозана на реологические свойства растворов и биологическую активность.

Для достижения поставленной цели в данной диссертационной работе решались следующие задачи:

-определение наиболее эффективного способа активации исходного хитозана на основании изучения кинетических и термодинамических характеристик реакции сульфатирования хитозана;

-определение оптимальных- условий проведения стадии сульфатирования хитозана (характер сульфатирующего комплекса, температура, газовая среда реакции) для получения образцов СХ с необходимыми характеристиками строения и свойствами;

-разработка способа получения низкомолекулярного сульфата хитозана и изучение его биологических свойств;

-исследование возможности упрощения технологического процесса производства сульфата хитозана путем применения новых способов выделения • сульфата хитозана;

-сравнительное изучение строения и свойств различных солевых форм сульфата хитозана;

-исследование возможности модификации хитозана и сульфата хитозана различными реагентами с целью расширения областей их применения.

Научная новизна работы -установлено влияние характера противокатиона на область растворимости солей сульфата хитозана;

-установлены особенности поведения разбавленных и концентрированных растворов Ва- и Са- солей сульфата хитозана;

-показан высокий уровень биологической активности Ва- и Са- солей сульфата хитозана, сопоставимый с активностью Ыа-соли сульфата хитозана; -получено новое производное сульфата хитозана модификацией глутаровым . альдегидом;

-осуществлена иммобилизация двух антибиотиков хинолинового ряда на сульфате хитозана;

-получены новые производные хитозана и сульфата хитозана взаимодействием с глицидиловым эфиром олигоэтиленоксида и хитозана взаимодействием с олигоэтиленоксидэпоксисульфонатом, изучены характеристики их строения и некоторые свойства.

Практическая значимость работы

Разработана методика сульфатирования хитозана с целью получения сульфата хитозана, обладающего необходимыми характеристиками химического строения.

Разработан новый способ выделения сульфата хитозана из реакционной среды в виде Ва- и Са- солей, применение которого позволяет существенно упростить и удешевить технологический процесс производства сульфата хитозана. Разработан технологический регламент на получение полупромышленных образцов низкомолекулярного сульфата хитозана. В лабораторных условиях получены образцы низкомолекулярного сульфата хитозана и определена их биологическая активность.

Разработана методика количественного определения состава технического сульфата хитозана методом кондуктометричеекого титрования. Апробация результатов работы

Результаты работы были апробированы в полупромышленных условиях в АО "Акрихин", г.Старая Купавна. В Гематологическом научном центре Минздрава РФ г.Москва, Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН г.Санкт-Петербург проведено определение антикоагулянтной активности, токсичности, гиполипидемической активности полученных производных, что позволило сделать вывод об их ■ перспективности как биологически активных соединений.

Основные результаты диссертационной работы обсуждены и доложены на 3-й Всероссийской конференции "Получение и применение хитина и хитозана" (г.Москва, 1995 г.) .

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, литературного обзора, методической часта, раздела, в котором приведены основные результаты экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 29 рисунков, библиография -111 наименований.

Содержание работы , Во введении обосновывается актуальность темы, формулируются цели и задачи исследований, научная новизна и практическая значимость работы. •

В литературном обзоре проведен анализ литературы по современному состоянию проблемы синтеза и изучения свойств биологически активных производных полисахаридов, в том числе гепариноидов. Показано, что наиболее перспективным для использования в качестве заменителя гепарина является сульфат хитозана. Проведен обзор методов получения сульфатированных производных полисахаридов. Описаны методы изучения реологических свойств растворов полисахаридов, обладающих свойствами полиэлектролитов.

В методическом разделе приведены характеристики объектов исследования и методы их модификации.

Раздел, содержащий основные результаты экспериментальных исследований, включает 5 подразделов.

Основные результаты и их обсуждение

1 .Изучение процесса получения и характеристика биологических свойств сульфатов хитозана

С целью повышения реакционной способности хитозана (ХТЗ) в реакции сульфатирования на основании изучения кинетических и термодинамических характеристик реакции сульфатирования было проведено сравнение эффективности различных способов активации хитозана: размол сухого .хитозана в экструдере, инклюдирование хитозана 5-21%-ным раствором уксусной кислоты (УК) в диметилформамиде (ДМФА) и размол хитозана, предварительно обработанного ДМФА (табл.1). Оценка структурных изменений, происходящих в процессе активации хитозана (табл.2), свидетельствует о наиболее существенном разрушении структуры полимера при размоле хитозана в среде ДМФА, действующего как адсорбционно-активный компонент, и при инклюдировании в смеси ДМФА-кислота.

Были рассчитаны порядок реакции по сульфатирующему реагенту (SO3) и хитозану, равные 0,92 и 0,91 соответственно (рис.1,а). В дальнейших

Таблица 1

Кинетические параметры реакции сульфатирования хитозана

№ Способ активации хитозана Температура сульфатирования, °С Степень замещения по сульфо-группам заЮ минут о. моль л.сек К Е, кДж моль

1 2 Сухой размол (А) 45 55 0,09 0,10 6,45-10"5 7,1610'5 8,71-Ю"5 9,78-Ю"5 11,1

3 4 Инклюдиро-вание в ДМФАи СНзСООН (Б) 45 55 0,15 . 0,20 10,35-10'5 14,33-Ю"5 1,44-10^ 1,95-10^ 37,0

5 Размол 45 0,50 35,83-Ю"5 4,90-10"4

6 в среде ДМФА 50 0,61 44,40-Ю-5 6,00-10"4 33,5

7 (В) 55 0,75 53,75-Ю"5 7,25-Ю"4

а) б)

■ Рис. 1 Зависимость степени замещения от условий проведения реакции

сульфатирования хитозана

Номера кривых соответствуют номерам табл.2(а) и табл. 1(6).

Таблица 2

Влияние условий активации хитозана на его структуру

• Вид активации Условия активации Размер частиц, мкм Степень крис-талли чно-сти, % Размер кристаллитов, max, А Удельная площадь по сорбции аргона м /г Раст-в-ть СХ в воде, %

Среда Температура, °С

(исх. ХТЗ) 400-500 73 50 0,75 <5,0

Размол 1 .Воздух 60 5-20 54 26 1,45 20,0

2.ДМФА- н2о 60 20-30 30 23 6,75 70,0

З.ДМФА 120 20-30 25 20 - 98,0

Инклю дирова -ние 4.ДМФА 18 400-500 52 40 1,00 82,5

5.ДМФА-УК(15%) 18 400-600 25 20 1,08 92,0

6.ДМФА-Н2804 (10%) . 18 500-600 25 22 - 89,5

Согласно данным, приведенным в табл.1, начальная скорость сульфатирования закономерно возрастает при , переходе от хитозана, активированного сухим размолом, к инклюдированному в смеси ■ (ДМФА+СНзСООН) и размолотому в экструдере в среде ДМФА.

С целью оценки влияния масштабирования на основные характеристики . сульфата хитозана - степень сульфатирования (содержание серы) и молекулярную массу (характеристическую вязкость раствора) было проведено изучение процесса сульфатирования в полупромышленных условиях (АО "Акрихин", г. Старая Купавна) в ходе наработки четырех укрупненных образцов технического сульфата хитозана. Полученные данные показали, что основные характеристики исследованных образцов соответствуют характеристикам образцов СХ, полученных в лабораторных условиях. Таким образом, масштабирование предложенного способа не оказывает влияния на основные характеристики строения получаемых продуктов.

Было проведено испытание биологической (антисклеротической) активности опытных полупромышленных образцов сульфатов хитозана в

тестах "in vitro" и "in vivo". Проведенное исследование показало существенное различие уровня активности образцов СХ, отличающихся по молекулярной массе (ММ). Так, способность СХ связывать атерогенные липопротеиды в опытах "in vitro" резко возрастает с увеличением в исследованном интервале ММ ([т]]) образцов СХ и превышает таковую гепарина и сульфата декстрана на 60-140 и 30-60%, соответственно. Показано положительное гиполипидеми-ческое действие в опытах " in vivo" препаратов СХ с ММ 10-30 кД и С3=13-14,5%, при этом низкомолекулярные образцы с [т|] = 0,1 дл/г вызывали также существенное (в 2 раза) снижение содержания триглицеридов в печени. Недостатком высокомолекулярных препаратов СХ (ММ > 90 кДа) является отмеченная в эксперименте худшая всасываемость в желудке.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о разном механизме проявления активности и разной способности проникать в кровь у образцов СХ, различающихся по молекулярной массе.

В связи с этим было проведено изучение фракционного состава образцов СХ и исследована возможность выделения наиболее низкомолекулярной фракции полимера методами ультрафильтрации на селективных мембранах и фракционирования дробным осаждением органическим растворителем. Экспериментальная проверка этих способов в лабораторных условиях показала, что несмотря на принципиальную возможность достаточно качественного фракционирования СХ, для практических целей эти методы неприемлемы, так как метод дробного осаждения требует большого расхода органического осадителя (150 г/г), а при ультрафильтрации на мембране с пределом удержания 300 кД выход низкомолекулярной фракции с [т|] = 0,15 дл/г •составляет лишь 8%. Отсутствие мембран с большим пределом удержания не позволяет осуществить качественное фракционирование относительно жесткоцепного сульфата хитозана.

Полупромышленные образцы СХ и их растворы имели различную степень окрашенности: от светло-кремового до светло-коричневого. Проведенное исследование растворов GX методом УФ-спектроскопии показало, что окраска образцов СХ обусловлена в основном наличием хромофорных групп типа С=0, сопряженных с С=С, в составе макромолекул, образующихся в результате побочных термоокислительных реакций в процессе сульфатирования. С целью определения оптимальных условий сульфатирования хитозана был проведен ряд экспериментов по сульфатированию хитозана в различных условиях и оценке влияния на интенсивность окраски полимера таких факторов, как снижение температуры .сульфатирования, использование вместо окрашенного сульфатирующего реагента хлорсулъфоновой кислоты (ХСК) бесцветного олеума, а также проведение реакции в среде инертного газа. Полученные результаты показали, что использование в качестве сульфатирующей системы комплекса ДМФА -олеум и проведение реакции при температуре 5 0-5 5 "С в среде воздуха

позволяют получать образцы, обладающие необходимыми характеристиками и степенью окрашенности.

На основании полученных результатов был разработан "Технологический - регламент на получение укрупненных образцов низкомолекулярного сульфата хитозана в лабораторных условиях" и было наработано 100 г продукта со следующими характеристиками строения: С3=1,08-1,65(12,5-15,8% S), [ri]=0,05-0,12 дл/г. Было проведено сравнительное изучение гиполипидемической и антикоагулянтной активностей препаратов СХ с ММ 10-30 кД, содержанием S=13-14,5%, а также образцов СХ с более высокой величиной ММ (40-120 кД). Проведенные исследования показали, что введение низкомолекулярного сульфата хитозана в кровь обеспечивает снижение содержания триглицерида в печени на 40-80 %, активность связывания атерогенных липопротеидов низкомолекулярным СХ на 18-20% превышает таковую гепарина. Исследованные препараты СХ увеличивают активность антитромбина III, тромбин-нейтрализующую активность плазмы, удлиняют все временные параметры тромбообразования, обладают способностью связывать атерогенные липопротеиды подобно гепарину, а также являются нетоксичными соединениями. Была также показана возможность стабилизации крови с помощью низкомолекулярного сульфата хитозана. При сравнении влияния СХ и гепарина на общую липолитическую активность "in vivo" наиболее активными оказались образцы низкомолекулярного СХ с наибольшей суммарной степенью замещения, равной 14,5%. Исследованные образцы низкомолекулярного СХ являются перспективными для возможного применения в клинике с целью профилактики и лечения атеросклероза.

2.Разработка новых способов выделения сульфата хитозана.

Исследование строения и свойств Ва- и Са-солей сульфата хитозана

Уровень биологической активности и токсичности полимерных лекарственных средств в значительной степени зависит от молекулярной массы и молекулярно-массового распределения полимера, а также степени его очистки. На названные показатели существенное влияние оказывают условия выделения СХ из реакционной среды.

С целью упрощения ранее разработанного процесса получения СХ была исследована возможность использования нового подхода к выделению СХ, основанного на осаждении из сульфомассы не полимера, а примесных низкомолекулярных сульфатов в виде нерастворимых Ва2+- или Са2+ - солей с использованием в качестве осадителей водных растворов гидроксидов бария или кальция. Самостоятельный интерес при этом представляет сопоставление свойств Ва- и Са- солей СХ со свойствами Na - соли СХ. Основные характеристики различных способов выделения СХ представлены в табл.3. Последовательность операций при очистке СХ этими способами схематически представлена на рис.2!

Осаждение полимера в органический осадитель с последующей нейтрализацией позволяет существенно сократить по сравнению со способом, предполагающим осаждение с одновременной нейтрализацией, объем сточных вод на стадии ультрафильтрации и продолжительность процесса выделения, а в случае использования Ва(ОН)2 - полностью исключить стадию ультрафильтрации. Это связано с тем, что кислые примесные сульфаты хорошо растворимы в органическом осадителе, и на этой стадии в осадительной ванне остается 90-100 % низкомолекулярных сульфатов и ДМФА.

Таблица 3

Сравнительные характеристики способов выделения _ сульфата хитозана __

№ способа Способ выделения СХ из сульфомассы Расход, г/г СХ Продолжительность выделения час Выход СХ, г/г ХЗ

Органический осадитель Н20 Гидро-ксид

1. Осаждение в ацетон с одновременной нейтрализацией N301-1 60 5000 1,20 13 1,20

2. Осаждение в ацетон с последующей нейтрализацией водного р-ра СХ ЫаОН Са(ОН)2 Ва(ОН)2 60 60 80 2000 1000 0,20 0,34 0,90 10 9 8 1,10 1,15 0,80

3. Осаждение примесных сульфат-ионов в раствор Ва(ОН)2 Са(ОН)2 - 4500 2500 10,0 12 10 0,55 0,75

Способ выделения СХ с использованием, только гидроксида бария, несмотря на практически полное отделение от СХ примесных сульфатов при нейтрализации сульфомассы раствором Ва(ОН)2, не позволяет существенно

Способ 2 Способ 3

Рис.2. Способы получения сульфата хитозана

сократить продолжительность и расход воды на стадии ультрафильтрации в связи с необходимостью дополнительной очистки продукта для удаления остатков ДМФА, который при данных условиях выделения остается с СХ в водной фазе. Низкий выход продуктов реакции при использовании данного способа связан с соосаждением высокомолекулярных фракций полимера на осадках ВаБО.) и СаБС^. Преимущество этого способа заключается в исключении использования органического растворителя, а возможность отделения токсичных высокомолекулярных фракций позволяет рассматривать этот способ как еще один метод получения низкомолекулярного сульфата хитозана.

Было осуществлено изучение некоторых характеристик строения различных солевых форм сульфата хитозана, полученных в результате применения рассмотренных ранее способов выделения (табл.4) и переводом Ш-соли СХ (через Н-СХ) в Ва- и Са-соли с использованием ионообменной смолы (табл.5), и их биологической активности. Полученные данные показывают, что ни по характеристикам строения, ни по уровню антикоагулянтной активности, образцы Ва- и Са-солей существенно не отличаются от образцов №-СХ.

Важно отметить, что при нейтрализации раствора Н-СХ гидроксвдом •бария при величине рН~6 появлялось устойчивое помутнение. Выпавшая

в осадок фракция Ва-СХ может быть выделена из полученной смеси центрифугированием после доведения рН до 8.

Таблица 4

Характеристики сульфатов хитозана в виде солей _с различными катионами_

Тип соли Способ N0614 Н», Степень АКА,

СХ выделения*) с N0614 замещения ед/мг

Ыа-СХ 1 0,18 0,62 1,5 28

Ыа-СХ 2 0,18 - 1,5 ■ -

Са-СХ 3 0,20 0,52 1,4 26

Са-СХ 2 ОД 8 0,66 1,4

Иа-СХ (через 3 0,18 0,59 1,3 33

Са-СХ)

Ва-СХ 3 0,18 0,59 1,3 30

№-СХ 3 0Д8 0,62 1,3 32

(через Ва-СХ)

*)- Способы выделения СХ:

1- осаждение полимера органическим осадителем с одновременной нейтрализацией ЫаОН;

2- осаждение полимера органическим осадителем с последующей нейтрализацией водного раствора СХ гидроксидами Са, Ва;

3- осаждение примесных сульфат-ионов в растворах Ва(ОН)2 или Са(ОН)2.

Таблица 5

Характеристики солей сульфата хитозана с различными протиеокатионами

Выход, % от .М, дл/г СЗ по

Соль СХ Титрант / V, мл теоретического в 0,5 М Б03-

№С1 группам

Иа-СХ 0,25М ИаОН / 7,2 95 0,30 1,35

Са-СХ 0,02М Са(ОН)2 / 50,0 91 0,30 1,20

Ва-СХ ОД 6М Ва(ОН)2 / 5,8 85*) 0,25 1,30

*)- выход нерастворимой фракции ~ 10%

Было, в частности, показано, что при переводе нефракционированного образца СХ, полученного в стандартных условиях ([л]= 0,25 ± 0,05 дл/г и С3= 1,3 ± ОД), в виде Ыа-соли растворимого в воде при любой величине рН с образованием раствора с концентрацией до '10%, в форму Са2+-соли, концентрация получаемого раствора не превышает 0,5%. В то же время Ва2+-соль при концентрации ~0,5% и степени нейтрализации > 0,5 (рН~6) лишь

частично выпадает в осадок, очевидно, в результате межмолекулярной сшивки наиболее высокомолекулярных фракций.

Данные, полученные при изучении растворимости Ва-СХ в воде (рис.3), позволяют сделать вывод, что в широком интервале рН могут быть получены лишь разбавленные растворы Ва-СХ (С < 0,5 %), а в более концентрированных системах область растворимости Ва-формы СХ сужается и, например, при 00,6 % и рН=6 фракция Ва-СХ, выпавшая в осадок, составляет до 20%.

Зависимость растворимости Ва-СХ от концентрации раствора связана с различным характером взаимодействия ионов Ва2+ с сульфатными группами полимера. В разбавленных растворах (С < 0,5 г/дл) имеет место преимущественно внутримолекулярное взаимодействие, приводящее к снижению вязкости раствора, но не оказывающее влияние на растворимость 'полимера. В более концентрированных растворах (С > 0,5 г/дл)

Рис.3. Диаграмма растворимости Ва-СХ

преобладает механизм межмолекулярного солеобразования, которое сопровождается выпадением в осадок нерастворимого Ва-СХ. При этом выпавшая в осадок фракция полимера имеет более высокую молекулярную массу, то есть происходит частичное фракционирование продукта. Именно поэтому СХ, получаемый с использованием гидроксида Ва в качестве осадителя низкомолекулярных примесей, характеризуется более низкой [г]] и, соответственно, ММ и пониженным выходом.

При сравнительном изучении зависимости вязкости разбавленных растворов СХ от степени нейтрализации гидроксидами ЫаОН и Ва(0Н)2 при условии постоянства концентрации полимера (рис.4) было показано, что при нейтрализации. раствором Ва(ОН)г происходит резкое падение вязкости 'раствора СХ в интервале изменения рН от 2 до 3,5, связанное, по-видимому, с взаимодействием ионов бария с двумя сульфатными группами полимера, приводящим к изменению (компактизации) конформации макромолекулы. По этой же причине в области разрушения внутрисолевых связей (при рН > 7)

возрастание вязкости раствора практически отсутствует. Что касается кривой зависимости вязкости от рН для Ыа-соли СХ, то ее характер меняется от небольшого снижения в интервале рН 2-3 до постепенного возрастания при рН> 5, что обусловлено набуханием' и увеличением асимметрии

Рис.4. Зависимость удельной вязкости растворов СХ-На (1), СХ-Ва (2) с концентрацией 0,3 г/дл и степени нейтрализации (1'и2/) от рН

макромолекулярных клубков из-за разрыва в этой области рН внутримолекулярных солевых связей, образованных сульфатными и аминогруппами.

Была изучена зависимость вязкости СХ от рН при ■ постоянной концентрации полимера и ионной силе. Характер кривых (рис.5) показывает, что для Na-CX характерно монотонное возрастание вязкости, связанное с

Рис.5. Зависимость степени нейтрализации а (1) и удельной вязкости %„ от рН растворов Ш-СХ (2) и Ва-СХ (3)

повышением степени ионизации сульфатных групп, обусловленным разрушением внутрисолевых связей между сульфатными и аминогруппами и увеличением электростатического отталкивания вследствие увеличения заряда на макромолекуле. У раствора Ва-СХ в этих условиях наблюдается монотонное снижение вязкости, что указывает на преобладание влияния компактизации макромолекул СХ при связывании с ионом Ва2+ его функциональных групп. Заметное снижение вязкости для Ва-СХ в интервале рН 2-4 связано также с переходом макромолекул в более компактную конформацию в результате взаимодействия ионов Ва2+ с сульфатными группами, находящимися в различных звеньях макромолекул полимера. Значения коэффициентов седиментации для Na-CX и Ва-СХ, равные 2,26 и 2,50, соответственно, подтверждают этот вывод.

Проведенные исследования стабильности растворов различных катионных форм СХ показали, что самым нестабильным является раствор Н-СХ, что можно объяснить происходящей в нем кислотной деструкцией (рНн-сх=1,8). В растворе Na-CX при рН 11, по-видимому, происходит щелочная деструкция и этот раствор менее стабилен, чем нейтральный Na-CX при рН 7. Сравнение стабильности растворов Na-CX и Ва-СХ при рН 7 показывает, что они находятся примерно на одном уровне.

Выявленные особенности строения Ва-соли СХ существенно не отражаются на антикоагулянтной активности этого образца, определенной в биологическом тесте "in vitro". Активность Na-CX и Ва-СХ оказалась равной 30 и 31 ед/мг, соответственно.

3. Исследование возможности получения нерастворимых производных

хитозана.

Наряду с водорастворимыми производными хитозана большой интерес представляют нерастворимые (сшитые) производные как самого хитозана, так и его эфиров, содержащие наряду с аминогруппами другие функциональные группы. Соединения этого типа могут быть использованы в качестве полимеров - матриц для иммобилизации биологически активных веществ, а также в качестве сорбентов.

Сульфат хитозана был использован для иммобилизации двух антибиотиков хинолинового ряда широкого спектра действия, содержащих в своем составе аминогруппы, один из которых нерастворим в воде. Полученные конъюгаты СХ с антибиотиками растворимы в воде, за исключением продукта, полученного в относительно кислой среде. Проведена наработка укрупненных образцов водорастворимых продуктов с содержанием антибиотиков около 1%.

Была исследована возможность получения гелевого сорбента на основе сульфата хитозана и изучены некоторые закономерности процесса сшивки СХ глутаровым альдегидом (ГА). Практически нерастворимый гель СХ (доля растворимой фракции в геле СХ после пяти промывок 1,5 М раствором NaCl, составляет ~ 10%) получен при проведении сшивки в 1%-ном водном растворе

СХ при соотношении СХ:ГА=1:0,2 с последующим высушиванием и термостатированием в течение 2 часов.

В работе исследована возможность алкилирования хитозана и сульфата хитозана олигомерными эпоксисоединениями с различной длиной цепи и разным функциональным составом, в качестве которых были использованы глицидиловый эфир олигоэтиленоксида (лапроксид-512) и олигоэтилен-оксидэпоксисульфонат (лапроксид-628).

Реакцию алкилирования хитозана проводили в гетерогенных условиях в среде инертного газа, при двукратном мольном избытке эпоксигрупп по отношению к количеству аминогрупп хитозана, температуре 70°С, в течение 4 часов. Очистку продукта по окончании реакции проводили промывкой его изопролиловым спиртом.

В зависиморти от рН реакционной среды, замещение может происходить как по гидроксильным, так и по аминогруппам хитозана. При этом при взаимодействии лапроксида с аминогруппами принципиально возможно ■ образование как moho-, так и дизамещенных производных, кроме того, не исключено присоединение олигоэтиленоксидной цепочки по ОН-группам полимера.

По данным ИК-спектроскопии (табл.6), наиболее существенным отличием спектров производных хитозана с глицидиловым эфиром олигоэтиленоксида (ОЭХ) от исходного хитозана является уменьшение интенсивности поглощения NH2-rpynn в области 1600 см"', а также увеличение интенсивности полос поглощения в областях 1000-1200 см"1 (поглощение связей С-О-С) и 2890 см"' (поглощение СН, СН2), что в целом подтверждает факт присоединения к хитозану олигоэтиленоксидных заместителей.

Таблица 6

Характеристика состава хитозана и его олигоэтиленоксидных

производных (ОЭХ)

Обра- Содержание азота по данным,% Соотношение Выход

зец Степень характер.полос ИК-спектров г/г ХТЗ*

Элемент. Потен ц. Ван-Слайка D2890 D)6io Дш»

анализа NO6ííí титров. NaM опыт. Расч. замещ. Di 650 Di650 Di650

ХТЗисх 7,55 7,14 7,10 - - 0,46 1Д2 3,15 -

ОЭХ-2 5,84 5,60 5,15 5,11 0,09 1,13 0,96 3,31 0,37

ОЭХ-3 4,80 4,34 3,41 3,60 0,18 0,58 0,84 3,20 0,75

ОЭХ-4 5,50 5,20 4,32 4,57 0,12 0,65 0,98 3,26 0,50

*) - рассчитан по данным элементного состава

Расчет степени замещения полученных продуктов по данным элементного анализа (табл.6) показал, что у олигоэтиленоксидных производных "степень замещения не превышает 0,1-0,2.

Оценка характера распределения олигоэтиленоксидных заместителей в полученных производных хитозана по данным об общем содержании азота и содержании азота первичных аминогрупп показала (табл.6), что во всех проанализированных образцах меньше Н,6щ, следовательно,

присоединение лапроксида идет по аминогруппам.

Известно, что введение в молекулу полисахарида гибких и объемных заместителей приводит к разрыхлению его структуры, снижению интенсивности межмолекулярного взаимодействия, повышению пористости и гидрофильности полимера и, как следствие, увеличению его растворимости:. Неожиданным, однако, оказался тот факт, что синтезированные производные не только не обладали растворимостью в более широком интервале рН водных растворов, чем исходный хитозан, но и утратили растворимость в кислых средах.

Таким образом, введение в макромолекулу хитозана даже небольшого количества (С3~0,1-0,2) олигоэтиленоксидных заместителей привело к резкому изменению растворимости полисахарида, в частности, полной потере им растворимости в кислых водных средах. Одной из возможных причин отсутствия растворимости полученных производных хитозана в водных и неводных средах является введение в структуру полимера заместителей с большим значением молекулярной массы, возможно, разветвленного строения, создающих пространственные затруднения для доступа растворителя, а также •возникновение большого числа меж- и внутримолекулярных водородных связей между гидроксильными и аминогруппами и дисперсионного взаимодействия между метиленовыми группами.

Как уже указывалось, нерастворимые производные хитозана представляют интерес как сорбенты с анионообменными свойствами, пригодные для сорбции биологически активных веществ. Можно предположить, что введение в состав таких производных сульфо- и сульфатных групп позволит придать сорбенту антикоагулянтные свойства, присущие гепарину.

С целью получения олигоэтиленоксидных производных хитозана,' содержащих сульфогруппы, была проведена реакция между сульфатом хитозана, содержащим сульфатные группы и обладающим антикоагулянтной активностью и лапроксидом (продукт реакции - СОЭХ-1), а также реакция .взаимодействия хитозана с олигоэтиленоксидэпоксисульфонатом (СОЭХ-2).

Реакции проводили в нейтральной среде при эквимольном соотношении реагирующих веществ, температуре 70°С, в инертной среде в течение 4 часов. Очистку продукта по окончании реакции проводили промывкой его изопропиловым спиртом.

Сравнение ИК-спектров СХ и СОЭХ-1 показывает, что все указанные полосы поглощения сульфатных групп имеются и в ИК-спектрах продуктов модификации лапроксидом, а изменение соотношения интенсивностей полос поглощения С-О-С (1000-1200 см'1) и сульфогрупп (с максимумом при 1250-

'1260 см"1) в пользу первой подтверждает факт присоединения олигоэтиленоксидных цепочек к сульфату хитозана.

В отличие от хитозана, СОЭХ-2 имеет более интенсивную полосу поглощения в области 2890 см"1 (поглощение СН2-групп), характеристические полосы сульфогрупп в области 1200-1250 и полосы поглощения группы С-О-Б в области 800 см"1, что говорит о присоединении олигоэтиленоксидэпоксисульфоната к хитозану.

Рассчитанные по данным элементного анализа и потенциометрического титрования (табл.7) степени замещения СОЭХ-1 и СОЭХ-2 равны 0,06 и 0,1 соответственно. Несмотря на столь низкие степени замещения, в результате реакции резко изменилась растворимость даже продукта модификации водорастворимого сульфата хитозана, которая составляет в щелочной среде 3,5%, в кислой и нейтральной -6,7% и 5,0%, соответственно. СОЭХ-2, несмотря • на присутствие в нем сульфогрупп вообще не растворяется в водной среде ни при каких значениях рН.

Таблица 7

Характеристика состава сульфосодержащих олигоэтиленоксидных производных хитозана_

Образец Содержание азота, % Степень Растворимость,%

по данным амещения

элемент. потенц. Ван- 0,1 Н 0,1 Н Н20

анализа, титров., ^ам Слайка, Иыш НС1 КаОН

СХ 3,60 2,70 2Д) - 100 100 100

СОЭХ-1 3,00 2,31 2,29 0,06 6,7 3,5 ' 5,0

хтз 7,55 7,14 7,10 - 100 0 0

СОЭХ-2 5,35 5,16 4,92 0,10 0 0 0

Таким образом, проведенное исследование показало возможность получения новых производных хитозана, содержащих большой набор функциональных групп: амино-, сульфо- и сульфатных, гидроксильных, а также олигоэтиленоксидные цепочки. Полученные производные хитозана в настоящее время переданы для оценки возможности использования их в качестве гемосорбентов.

Выводы

1. На основании изучения кинетических и термодинамических характеристик реакции сульфатирования хитозана показано,,что наиболее эффективным способом активации хитозана является размол хитозана в экструдере в среде ДМФА. Определен суммарный порядок реакции сульфатирования хитозана, равный 2.

2. Определены оптимальные условия сульфатирования хитозана, позволяющие получать производные с необходимыми характеристиками химического строения и уровнем биологической активности, - использование комплекса олеум-ДМФА в качестве сульфатирующей системы и проведение реакции при температуре 50-55°С в среде воздуха.

.3. Разработан новый способ выделения СХ, являющийся более экономичным и технологически выгодным, чем ранее разработанные, основанный на осаждении низкомолекулярных примесных солей гидроксидами бария и кальция с последующим получением Ва- и Са-солей сульфата хитозана.

4. На основании сравнительного изучения растворимости Na-, Са- и Ва -солей сульфата хитозана установлено, что ограниченная растворимость Са- и Ва-солей в водных растворах связана с особым характером взаимодействия двухвалентных металлов с сульфогруппами полимера, зависящим от рН и концентрации раствора. В разбавленных растворах имеет место преимущественно внутримолекулярное взаимодействие, в концентрированных - межмолекулярное.

5. Изучена биологическая активность синтезированных сульфатов хитозана. Показано, что низкомолекулярные образцы сульфата хитозана обладают гиполипидимическим действием, являются эффективными активаторами липопротеидлиполиза, обладают способностью связывать атерогенные липопротеиды подобно гепарину и являются нетоксичными соединениями. Установлено, что Ва- и Са-соли сульфата хитозана по уровню антикоагулянтной активности, определенной в тестах "in vitro" (около 30 ед/мг), не уступают Na-соли СХ.

6. Исследована возможность получения нерастворимых производных хитозана и сульфата хитозана взаимодействием этих соединений с глутаровым альдегидом, глицидиловым эфиром олигоэтиленоксида и олигоэтилен-оксидэпоксисульфонатом. Получены модифицированные нерастворимые производные хитозана и сульфата хитозана, содержащие различные функциональные группы: амино-, сульфо-, сульфато-, гидроксильные и олигоэтиленоксидные цепи, представляющие интерес как сорбенты с аниопообменными свойствами, пригодные для сорбции биологически активных веществ.

7. Иммобилизацией антибиотиков на сульфате хитозана получены соединения, перспективные для использования в медицине, в частности, в качестве сорбентов.

Основное содержание работы отражено в публикациях:

1. Степанова С.А., Будовская К.Э. Синтез сульфатов хитозана и исследование их строения // Межвуз. сб. науч. трудов "Повышение эффективности технологических процессов и оборудования в текстильной промышленности". -М.: МГТА. 1993.-С.62-65.

2. Будовская К.Э., Сафрина С.П., Горбачева И.Н., Вихорева ГЛ., Гальбрайх Л.С., Семиколенных JI.M. Разработка способа выделения очищенного сульфата хитозана // Тез. докл. III Всероссийской конференции "Получение и применение хитина и хитозана"..-ВНИРО. 1995. -С.37-40.

3. Будовская К.Э., Кузнецова Ю.Н., Вихорева Г.А., Горбачева И.Н., Гальбрайх JI.C. Исследование возможности применения новых способов выделения сульфата хитозана с целью упрощения технологического процесса его получения // Хим.волокна. 1995, -№5. -С.34-37.

4. K.E.Budovskaya, Yu.N.Kuznetsova, G.A.Vichoreva, I.N.Gorbacheva, and L.S.Gal'braikh. Use of New Methods of Separation of Chitosan Sulfate to Simplify Its Industrial Production // Fibre Chemistry. 1995. -Vol.27. -№5. -P.333-336.

•5. Будовская К.Э., Вихорева Г.А., Горбачева И.Н., Гальбрайх JI.C. Кондуктометрическое титрование полианионов сульфата хитозана в присутствие посторонних электролитов // Хим.волокна.1997. -№2. -С.21-23.

6. K.E.Budovskaya, I.N.Gorbacheva, G.AVichoreva, and L.S.Gal'braikh. Conductometric Titration of Chitosan Sulfate Polyanions in the Presence of Extraneous Electrolytes//Fibre chemistry. 1997. -Vol.29. -№2. -P. 106-109.

7.Енгибарян JI.Г., Будовская К.Э., Гальбрайх Л.С. Регулирование набухания, растворимости и проницаемости хитозановых пленок // Сб. науч. трудов аспирантов. Выпуск 2. -М.: МГТА. 1998. -С.69-74.

8. Будовская К.Э., Степанова С.А., Горбачева И.Н., Вихорева Г.А., Гальбрайх Л.С. Изучение влияния условий получения на основные характеристики полупромышленных образцов сульфата хитозана // Межвуз. сб. науч. трудов молодых иссл. "Перспективные направления развития техники, технологии и

. организации производства в текстильной промышленности". 1М.: МГТА. 1998. -С.82-84.

ЛР №020753 от 23.04.98 Подписано в печать 24.05.2000 Сдано в производство 24.05.2000 Формат бумаги 60x84/16 Бумага множ. Усл.печ.л. 1,25 Уч.-изд.л. 1,0 Заказ 274 Тираж 80 Электронный набор МГТУ, 117918, ул. Малая Калужская, 1

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Химическое строение и биологические свойства природных полисахаридов и их производных.

1.1.1. Химическое строение и биологические свойства гепарина.

1.1.2. Способы получения и биологические свойства полусинтетических аналогов гепарина.

1.1.3. Химическое строение и биологические свойства хитина, хитозана и их производных.

1.1.4. Химическое строение, биологические свойства и методы получения сульфата хитозана.

1.2. Гидродинамические свойства растворов полиэлектролитов с ионогенными группами различных типов.

2. МЕТОДИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

2.1. Объекты исследования и материалы.

2.2. Методы синтеза.

2.3. Методы исследований.

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение кинетических и термодинамических параметров реакции сульфатирования хитозана.

3.2. Разработка оптимальных условий сульфатирования хитозана.

3.3. Синтез и изучение биологических свойств низкомолекулярного сульфата хитозана.

3.4. Разработка новых способов выделения сульфата хитозана.

3.5. Исследование строения и свойств Ва- и Са-солей сульфата хитозана.

3.6. Исследование возможности получения нерастворимых производных хитозана как потенциальных носителей биологически активных веществ и сорбентов.

4. ВЫВОДЫ.

К числу наиболее важных представителей класса полисахаридов, наряду с целлюлозой, относятся хитин и его дезацетилированное производное хитозан. Эти полимеры и их производные находят широкое применение в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности благодаря наличию таких ценных свойств, как биологическая активность, биодеградируемость, биосовместимость, комплексообразующая и сорбционная способность. В настоящее время хитозан является наиболее изученным производным хитина. Исследованы и предложены методы получения хитозана на основе различных источников сырья. Промышленное производство хитозана налажено во многих странах мира, в том числе и в России. Модифицирование хитозана позволяет получать производные, содержащие в своем составе различные функциональные группы, придающие им особые специфические свойства. Большой интерес, в частности, представляет изучение методов получения и биологических свойств сернокислого эфира хитозана - сульфата хитозана (СХ). Благодаря наличию в составе макромолекулы одновременно сульфо-и аминогрупп, сульфат хитозана имеет строение, наиболее близкое по функциональному составу к природному антикоагулянту гепарину, и обладает ярко выраженной гепариноподобной активностью при низком уровне токсичности, что определяет перспективность использования препаратов на его основе в медицине.

Значительное влияние на биологические свойства полимера оказывает его химическое строение и состав макромолекул. Так, в проявлении сульфатом хитозана антикоагулянтной активности важную роль играют молекулярная масса, фракционный состав, степень замещения и характер распределения функциональных групп в элементарных звеньях макромолекул. Основные характеристики строения полимера закладываются в процессе его синтеза и выделения, поэтому актуальной является проблема изучения зависимости строения и свойств производных хитозана от способа их получения.

В настоящее время большой научный и практический интерес представляют биополимеры с низкой величиной молекулярной массы (ММ). Так, в литературе имеются многочисленные сведения о высокой эффективности медицинских препаратов на основе низкомолекулярного гепарина [1,2,3]. Благодаря небольшой молекулярной массе такие препараты легче проникают в кровь и оказывают более пролонгированное действие, чем аналогичные вещества со средней величиной молекулярной массы. Разработанный ранее на кафедре ТХВ МГТА способ получения сульфата хитозана позволяет получать образцы с ММ=40~115 кД и антикоагулянтной активностью (АКА) от 20 до 60 ед/мг [4]. Данный способ был апробирован в полупромышленных условиях с наработкой укрупненных образцов сульфата хитозана. Анализ отдельных стадий этого процесса, а также исследование характеристик строения и свойств образцов СХ, полученных в полупромышленных условиях, позволил сделать вывод о необходимости усовершенствования и оптимизации условий и методов проведения ряда стадий.

Использование производных хитозана в качестве лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний предполагает применение в виде инъекционных форм. Поэтому для выявления закономерностей их поведения в крови и влияния на процессы, протекающие в организме, необходимо исследование реологических свойств разбавленных и концентрированных растворов этих полимеров.

Наряду с водорастворимыми производными, большой интерес представляют нерастворимые производные хитозана и его эфиров, как потенциальные сорбенты или носители для иммобилизованных ферментов. Такие производные могут быть получены, например, взаимодействием полисахаридов с глутаровым альдегидом. Модификация полисахаридов эпоксисоединениями обычно приводит к расширению области их растворимости, однако в ряде случаев возможно образование нерастворимых продуктов реакции.

Целью работы являлось исследование возможности разработки усовершенствованного способа получения сульфата хитозана и способа получения низкомолекулярного сульфата хитозана, а также влияния химического строения производных хитозана на реологические свойства растворов и биологическую активность.

В связи с этим в данной диссертационной работе представляло интерес решить следующие задачи:

-определить наиболее эффективный способ активации исходного хитозана на основании изучения кинетических и термодинамических характеристик реакции сульфатирования хитозана;

-определить оптимальные условия проведения стадии сульфатирования хитозана (характер сульфатирующего комплекса, температура, газовая среда реакции) для получения образцов СХ с необходимыми характеристиками строения и свойствами;

-разработать способ получения низкомолекулярного сульфата хитозана и изучить его биологических свойств;

-исследовать возможность упрощения технологического процесса производства сульфата хитозана путем применения новых способов выделения сульфата хитозана;

-провести сравнительное изучение строения и свойств различных солевых форм сульфата хитозана;

-исследовать возможность модификации хитозана и сульфата хитозана различными реагентами с целью расширения областей их применения.

Работа выполнялась в соответствии с ГНТП "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" (направление "Атеросклероз") и межвузовской НТП "Университеты России".

Научная новизна работы -установлено влияние характера противокатиона на область растворимости солей сульфата хитозана;

-установлены особенности поведения разбавленных и концентрированных растворов Ва- и Са- солей сульфата хитозана;

-показан высокий уровень биологической активности Ва- и Са- солей сульфата хитозана, сопоставимый с активностью Ыа-соли сульфата хитозана;

-получено новое производное сульфата хитозана модификацией глутаровым альдегидом;

-осуществлена иммобилизация двух антибиотиков хинолинового ряда на сульфате хитозана;

-получены новые производные хитозана и сульфата хитозана взаимодействием с глицидиловым эфиром олигоэтиленоксида и хитозана взаимодействием с олигоэтиленоксидэпоксисульфонатом, изучены характеристики их строения и некоторые свойства. Практическая значимость работы

Разработана методика сульфатирования хитозана с целью получения сульфата хитозана, обладающего необходимыми характеристиками химического строения.

Разработан новый способ выделения сульфата хитозана из реакционной среды в виде Ва- и Са- солей, применение которого позволяет существенно упростить и удешевить технологический процесс производства сульфата хитозана. Разработан технологический регламент на получение полупромышленных образцов низкомолекулярного сульфата хитозана. В лабораторных условиях получены образцы низкомолекулярного сульфата хитозана и определена их биологическая активность

Разработана методика -- количественного определения состава технического сульфата хитозана методом кондуктометрического титрования.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения кинетических и термодинамических характеристик реакции сульфатирования хитозана показано, что наиболее эффективным способом активации хитозана является размол хитозана в экструдере в среде ДМФА. Определен суммарный порядок реакции сульфатирования хитозана, равный 2.

2. Определены оптимальные условия сульфатирования хитозана, позволяющие получать производные с необходимыми характеристиками химического строения и уровнем биологической активности, -использование комплекса олеум-ДМФА в качестве сульфатирующей системы и проведение реакции при температуре 50-55°С в среде воздуха.

3. Разработан новый способ выделения СХ, являющийся более экономичным и технологически выгодным, чем ранее разработанные, основанный на осаждении низкомолекулярных примесных солей гидроксидами бария и кальция с послед ующим получением В а- и Са-солей сульфата хитозана.

4. На основании сравнительного изучения растворимости Са- и Ва-солей сульфата хитозана установлено, что ограниченная растворимость Са- и Ва-солей в водных растворах связана с особым характером взаимодействия двухвалентных металлов с сульфогруппами полимера, зависящим от рН и концентрации раствора. В разбавленных растворах имеет место преимущественно внутримолекулярное взаимодействие, в концентрированных - межмолекулярное.

5. Изучена биологическая активность синтезированных сульфатов хитозана. Показано, что низкомолекулярные образцы сульфата хитозана обладают гиполипидимическим действием, являются эффективными активаторами липопротеидлиполиза, обладают способностью связывать атерогенные липопротеиды подобно гепарину и являются нетоксичными соединениями. Установлено, что Ва- и Са-соли сульфата хитозана- по

1. Monreal М., Galego G., Monreal L. Comparative study on the antithrombotic efficacy of hirudin, heparin and low-molecular weight heparin in preventing experimentally induced venous thrombosis // Haemostasis. 1993. -V.23. №3. -P.179-183.

2. Samama M.M., Bara L., Gerotziafas G.T. Mechanisms for the antithrombotic activity in man of low molecular weight heparins // Haemostasis. 1994. -V.24. -№2. -P.105-117.

3. Горбачева И.Н. Разработка способа получения водорастворимых сульфатов хитозана и хитина и исследование их свойств. -М.: Дисс.канд.хим.наук. МТИ им.А.Н.Косыгина. 1989. -236 с.

4. Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев В.А. и др. Химия углеводов,- М.:1. Химия. 1967,- 671 с.

5. Бычков С.М. Новые данные о гепарине // Вопросы мед.химии. 1981,-№6.-0.726-735.

6. Wolfrom M.L., Montgomesy R., Karabinos J.V., Rathgeb P. The structure of Heparin // J. Am.Chem.Soc. 1950.- V.72.- P.5796-5797.

7. Damus P.S., Hicks H., Rosenberg R.D. Anticoagulant action of heparin // Nature.- London. 1973,- V.246. -P.355-357.

8. Feinman R.D., Li E.H. Enteraction of heparin with thrombin and antithrombin // Fed.Pros. 1977,-V.36.-№1. -P.51-55.

9. Ю.Кожевникова И.В., Волковинская JI.П., Соколова Л.В. и др. в т.ч. Норейка Г.М. Способы получения гепарина // Обзорная информация, серия "Химико-фармацевтическая промышленность".-М.: ЦБНТИ. 1977. -№11.-28 с.

10. Mauzac M., Yozolonvicz Y. Anticoagulant activity of dextran derivatives. Part 1. Synthesis and characterization // Biomaterials. 1984. -№5. -P.301.

11. Yoshida, Takashi; Nakashima, Hideki; Yamamoto, Naoki; Uryu, Toshiyuki. Anti-AJDS virus activity in vitro of dextran sulfates obtained by sulfation on synthetic and natural dextrans // Polim. J. (Tokio). 1993.-№25(10).-P.1069-1077.

12. Попченко B.M., Марина JT.B., Золотарева Т.Н. Влияние гепариноида маннана на систему гемостаза, липидный обмен, микроциркуляции больных ишемической болезнью сердца // Тез.докл. II Всес. конф. по микробным полисахаридам. -НИИЭМ ЛХФИ.1984. -С.159.

13. Рыженков В.Е., Попов A.B., Никуличева Н.Г. и др. Действие модифицированного полиманиозида на развитие экспериментального склероза // Тез.докл. II Всес. конф. по микробным полисахаридам. -НИИЭМ, ЛХФИ.1984. -С.172.

14. Kunou, Megumi; Akaike, Teshihiro; Hatanaka, Kenichi. Effect of sulfated polysaccharides on hepatocyte adhesion // J.Biomater.Sci., Polym.Ed. 1993.-№5(3). -P.259-262.

15. Hoffman, Richard Michael; Paper, Diltrich Herbert Walter. Use of carrageenans as growth factor antagonists. PCT Int.Appl. WO 9405,267

16. С1.А61К31/00), 17 Маг 1994, GB Appl. 92/18, 510, 01 Sep 1992; 71 p.

17. Самокиш И.И., Зябшева Н.Ш., Васина T.M. и др. Разработка лечебно-профилактических средств на основе пектинов и альгинатов // Матер. 49 Регион, конф. по фармации, фармакол. и подгот. кадров. -Пятигорск. 1994. -С.69-70.

18. Средство для лечения ран: Пат.2104038 Россия, МПК6 А61 L 15/20; Ин-т хирургии им.Вишневского РАМН, Научно-произв. предпр. "КОПО". -№95112784/14; Заявл.26.7.95; Опубл. 10.2.98, Бюл.№4.

19. Машковский М.Д. Лекарственные средства. -М.: Медицина. 1967. -ч.1. -706 с.

20. Kenji Kamide, Kunihico Okajima, Toshihiko Matsui Masanao Ohnishi and Hidehiko Kobayashi. Roles of Molecular Characteristics in Blood Anticoagulant Activity and Acute Toxicity of Sodium Cellulose Sulfate // Polymer Journal. 1983.-V.15,-№4,-P.309-321.

21. Ciechanska D., Struszczyk Н., Guzinska К. Modificatoin of bacterial cellulose // Fibres and Text. East. Eur. 1998. -V.6. -№4. -P.61-65.

22. Brach H., Von Eurth. The chemical constitution of chitin // Biochem.z. 1912. -Bd.38. -P.468-491.

23. Knecht E., Hibbert E. Chitin. // J. Soc. Dyers Color. 1926. -Vol.42. -P.343-345

24. Muzarelli R.A.A. Chitin. Oxford, N.Y., Toronto, Sydney, Paris, Frankfurt. 1977. Pergamon Press. -309 p.

25. Немцев C.B. Способы получения хитина и хитозана // Тез. докл. III Всес. конф. по совершенст. произв. хитина и хитозана.-М.: ВНИРО. 1991. -С.7-15

26. Коваль Ю.Ф., Жоголев К.Д., Никитин В.Ю. и др. Медико-биологические аспекты использования хитина, хитозана и их производных // Тез. докл. Ш Всес. конф. по совершенст. произв. хитина и хитозана. -М.: ВНИРО. 1991. -С.30-36.

27. Дубинская A.M., Добротворская А.Е. Применение хитина и его производных в медицине // Хим.-Фармац. журнал. 1989. -т.23. -№5. -с.623-628.

28. Большаков И.Н., Насибов С.М. Связывание бактериального липополисахарида хитозаном при энтеросорбции в эксперименте // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО. 1999. -С. 120-122

29. Большаков И.Н., Насибов С.М. Иммунокорригирующий эффект хитозана при разлитом остром перитоните в эксперименте. // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.:ВНИРО. 1999. -С.175-178.

30. Прилуцкий А.И., Земсков B.C., Горовой Л.Ф., Бурдюкова Л.И. Антимикробные свойства нового хитинового препарата Микотон // Тез.докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана". -М.: ВНИРО. 1999. -С.181-186.

31. Сенюк О.Ф., Горовой Л.Ф., Трутнева И.А. Использование хитинового препарата Микотон в качестве радиопротектора // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО.1999.-С.193-197.

32. Нудьга Л.А. Биоматериалы на основе хитина и хитозана // Тез. докл. III Всес. конф. по совершенст. произв. хитина и хитозана.-М.: ВНИРО. 1991. -С.40-44.

33. Лившиц B.C. Полимерные покрытия на раны и ожоги // Хим.-фарм. журнал. 1988. -№7. -С.790-798.

34. Крафт Л.Ф., Гартман O.P., Костюченко А.Г., Раевских В.М., Иванов A.B. Изучение антимикробной активности гидрогеля, содержащего карбоксиметилхитозан. // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО. 1999. -С. 154.

35. Веселова И.А., Шеховцова Т.Н., Бадун Г.А. Использование хитозана и его производных для иммобилизации ферментов // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.:ВНИРО. 1999.-С.265-267.

36. Елфимова Г.С., Скокова И.Ф., Юданова Т.Н., Гальбрайх Л.С. Использование производных хитина и хитозана для модификации пртеолитических ферментов // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.:ВНИРО. 1999. -С.268-270.

37. Кайминь И.Ф., Озолиня Г.А. Применение композиций на основе хитозана в стоматологии // Тез. докл. IV Всеросс. конф. по произв. и применению хитина и хитозана.-М.: ВНИРО. 1995. -С.55-56

38. Тюпенко Г.И., Скорикова Е.Е., Зезин А.Б. Применение хитозана в комплексном лечении парадонтита // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.:ВНИРО. 1999. -С.199-201.

39. Giunchedi Р., Genta I., Conti, Muzzarelli R.A.A., Conte U. Preparation and characterization of ampicillin loaded methylpyrrolidinone chitosan and çhitosan microspheres//Biomaterials. 1998. -V.19. -№1-3. -P.157-161.

40. Счосланд JT., Стружчик Г. Некоторые аспекты модификации хитина и хитозана // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана". -М.:ВНИРО,1999. -С.69-74.

41. Мухина В.Р., Семчиков Ю.Д., Смирнова Л.А. Получение и некоторые свойства полиэлектролитных комплексов хитозана // Тез. докл. IV Всеросс. конф. по произв. и применению хитина и хитозана. -М.: ВНИРО. 1995. -С.42-43.

42. Hsien Tzu-Yang, Rorrer Gregory L. Heterogenous cross-linking of chitosan gel beads: kinetics, modeling, and influence on cadmium ion adsorbtion capacity // Ind. and Eng. Chem. Res. 1997. -V.36.- №9. -P.3631-3638.

43. Агафонов Ю.В., Быкова В.M., Кривошеина Л.И., Сидоров H.H. Белоцерковец В.M. Применение хитозана в сельскохозяйственном и декоративном растениеводстве // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.:ВНИРО. 1999. -С.79-81.

44. Васильева C.B., Глез В.М., Немцев C.B., Сушков И.В. Защитно-стимулирующее действие хитозанового препарата "Нарцисс" на картофеле // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.:ВНИРО. 1999. -С.83.

45. Албулов А.И., Симонова JI.B., Фролова М.А., Пилипейко Е.А., Фоменко

46. A.С. Перспективы применения хитозана в косметике // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО. 1999. -С.117-118.

47. Албулов А.И., Комаров Б.А., Самуйленко А .Я., Фоменко А.С., Шинкарев С.И. Разработка технологии получения натриевой соли сукцината хитозана // Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО. 1999. -С.7-9.

48. Hirano Shigehiro, Tanaka Yasahiro, Hasegawa Masahilo. Effect of sulfated derivatives of chitosan on some blood coagulant factors // Carbon. Res. 1985. -V.135. -P.205-215.

49. Стенка сосудов в атеро- и тромбогенезе. (Под ред.Чазова Е.И., Смирнова

50. B.Н.) -М.: Медицина. 1983. -207 с.

51. E.G. Yin, Tangeno. Heparin Chemistry and clinical usage (Ed. Kakker V.V.) -Jhomas Q.R.Z.M. -V.S.F. 1976. -P.121-124.

52. Hirano S., Kinngawwa J., Nishioka A. Sulfated derivatives of chitosan and their characterization with respect to biological activity // Int. Conf. of Chitin and chitosan, -3-rd Proceeding. -Ancoma, Italy. 1985. -P.461-467.

53. Hoffman F. -La Roche Inc. Polysulfuric acid esters of of N-formyl chitosan // Swet.Pat. 1958. -№283188.

54. Piper J. Influence of synthetic polysaccharide sulfuric acid ester on the thrombocytes "in vivo" and "in vitro" // Acta Physicl. Scand. 1945. -Bd.9. -P.28-38.

55. Nagasawa R., Tononra N. Reaction between carbohydrates and sulfation of chitosan by sulfuric acid// Chem. Pharm. Bull. 1972. -V.20. -P.157-162.

56. Upjohn Co. Sulfated Chitosan // Bnt.Pat. 1956. -№746870. 68.Robert Joel Samuels. Solid state characterization of the structure of chitosan films//J. Polym. Sci.: Polym. Physic. Ed. 1981. -V.19. -№7. -P.1081-1105.

57. Shrivastova S.C., Kurar R. and Rai S.D. Molecular structure of chitin in arthropod, cuticle // Int. Conf. of Chitin and Chitosan. -2-nd. Proceeding. -Sapporo. -Japan. 1982. -P.252-254.

58. Гении Я.В., Скляр A.M., Цванкин Д.Я. Рентгенографическое изучение пленок хитозана // Высокомолек. соединения. 1984. -т.А26. -№11. -С.2411-2416.

59. Барсова Л.И. Разработка методов синтеза смешанных полисахаридов, обладающих антикоагулянтной активностью: Дисс.канд. хим. наук. -М.: 1981. -138 с.

60. Моравец Г.М. Макромолекулы в растворе. -М.: Мир. 1967. -398 с.

61. Сказка B.C., Тарасова Г.В., Ямщиков В.М. и др. Гидродинамические свойства молекул натриевой соли сульфоэтилцеллюлозы в воде // Высокомол. соед. 1977. -том (А) XIX. -№10. -С.2247-2251.

62. Lin Xiquan, Qu Tingzhu. Установление относительной жесткости молекулярных цепей Na-соли сульфата целлюлозы // J.Taoфeньцзы cio36ao=Acta polym. Sin. 1988.-№1.-Р.12-16.

63. Афанасьев Н.И., Иванова М.И., Форофонтова С.Д. Гидродинамические свойства лигносульфонатов // Химия древесины. 1993. -№5.- С.52-61.

64. Brown C.J., Houghton А.А. // J. Chem. Soc. Ind. 1941. -V.60. -P.240.

65. Yebang Т., Liming Z., Zhuomei L. Synthesis and characterization of new amphoteric graft copolymer of sodium carboxymethyl cellulose with acrylamide and dimethylaminoethyl methylacrylate // J. Appl. Polym. Sci. 1988. -V.69. -№5. -P.879-885.

66. Zhang Liming, Li Zhuomei. Водорастворимые амфотерные производные целлюлозы // Chin. J. Appl. Chem. 1998. -V.15. -№4. -P.5-8.

67. Бельникевич Н.Г., Будтова Т.В., Николаева О.В., Френкель С.Я. Реологическое поведение водных растворов некоторых полиэлектролитов //Ж. прикл. химии. 1994. -т.67. -№7. -С.1223-1226.

68. Wang Wei, Xu Peshi, Li Suging, Qin Wen. Полиэлектролиты -реологические свойства концентрированных растворов хитозана // Gaofenzi Xuebao = Acta Polym. Sin. 1994,- №3 -C.328-334.

69. Симеонов H. и Димов К. Определение молекулярной массы сульфоэтилцеллюлозы // Cellul. chem. and technol. 1976. -V.10. -№4. -P.433-440.

70. Smidsrood O., Hang A. Estimation of the relative stiffness of the molecular chain in polyelectrolytes from measurements of viscosity at different ionic strengths//Biopolymers. 1971. -V.10. -P. 1213-1227.

71. Нудьга JT.А. Получение хитозана, его производных и исследование их свойств. Дисс.канд. хим. наук. -Л.: 1979. -170с.

72. Maria Terbogevich, Claudio Carraro, Alessandro Cosani. Solution studies of chitosan 6-O-sulfate // Macromol. Chem. 1989. -V.190. -P.2847-2855.

73. Рогачева В.Б., Рыжиков С.В., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Особенности фазовых превращений в водно-солевых растворах нестехиометричных полиэлектролитных комплексов // Высокомолек. соед., сер.Ф. 1984. -т.26. -№3. -С.1674-1680.

74. Сарогбаева Д.Т. и др. Гидрогелевая композиция на основе КМЦ и агар-агара //Химия прир.соед. 1998. -№3. -С.357-361.

75. Вихорева Г.А., Бабак В.Г., Галич Е.Ф., Гальбрайх Л.С. Комплексообразование в системе додецилсульфат натрия хитозан // Высокомолекул. соед. А-Б. 1997. -Т.39. -№6. -С.947-952.

76. Скорикова Е.Е., Отдельнова М.В. Синтез и свойства полимер-коллоидных комплексов хитозана и сульфата хитозана //Тез. докл. 5 конф. "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".-М.: ВНИРО. 1999. -С.68.

77. Evgenij E. Braudo, Vladimir P. Yuryev. Boundary conditions for ionotropic gelation of polyuronides // Macromol. Chem., Macromol. Symp. 45. 1991.-P.145-151.

78. J.Mattai and Jun C.T.Kwak. Mg and Ca binding to heparin in the presence of added univalent salt // Biochimica et Biophysica Acta, 677. 1981.- P.303-312.

79. Narh V.A., Keller A. The effect of counterions on the chain conformation of polyelectrolytes, as assessed by extensibility in elongational flow: the influence of multible valency//J. Polym. Sci. B. 1994. -V.32.- №10. -P. 16971706.

80. Петропавловский Г.А. Гидрофильные частично замещенные эфиры целлюлозы и их модификация путем химического сшивания. -Д.: Наука, 1988. -298 с.

81. Burkart Philipp, Wolfgang Wagenknecht. Cellulose sulphate half-ester. Synthesis, structure and properties. // Cellulose Chemistry and technology. 1983. -V.17. -№5. -P.443-459.

82. Foster A.B., Huggard A.Y. The Chemistry of Heparin // Carbohydr. Chem. 1955. -№10,- P.335-368.

83. Якубовский С.А., Булай А.Х., Орехова Т.Н., Чернухина А.И., Габриелян Г.А., Гальбрайх Л.С., Слоним И.Я. Синтез и строение олигомеров этиленоксида, содержащих сульфонатные группы // ВМС. 1990.-Том(А) 32. -№3.-С.597-603.

84. Практикум по высокомолекулярным соединениям под ред.Кабанова В.А.-М.: Химия. 1985. -223 с.

85. Павлов Г.М., Селюнин С.Г. Скоростная седиментация, молекулярная масса и конформационные параметры некоторых растворимых производных хитина//ВМС. 1986,-А28.-№8. -С.1727-1731.

86. Горшков В.П., Кузнецов И.А. Физическая химия.-М.:МГУ. 1986.-264 с.

87. Yao Shanjing. Sulfation kinetics in the preparation of cellulose sulfate // Chin.J.Chem.Eng. 1999. -V.7. -№1. -P.47-55.

88. Соловьева M.A. Сравнительная гиполипидемическая активность отечественных сульфатированных полисахаридов в эксперименте: Дисс.канд.хим.наук. Санкт-Петербург.: 1997. -135 с.

89. Suye S., Mizusawa A. Cross-linking of chitosan membrane with polyethylene glycol diglycidyl ether for immobilization of uricase.// Sen-i gakkaishi. 1999. -V.55. -№2, -P.73-77.

90. Qu Rongjunet et al. Синтез и адсорбционные свойства хитозана, сшитого диэтиленгликоль-бис-глицидиловым эфиром, по отношению к металлам типа Ni(II) // Huanjing huaxue=Environ. Chem. 1996. -V.15. -№3,-P.214-220.

91. Aly Aly Sayed et al. Preparation and evaluation of the chitin derivatives for wastewater treatments // J.Appl.Polym.Sci. 1997. -V.65. -№10. -P.1939-1946.

92. Boisson C., Jozefonvisz J., Brash J.J. Adsorption of thrombin from fuffer and modified plasma to polystyrene resins containg sulphonate and sulphaimide arginylmethyl ester groups // Biomaterials. 1988.-V.9.-P.47-52.1. ВВЕДЕНИЕ

93. ХАРАКТЕРИСТИКА ГОТОВОГО ПРОДУКТА

94. Основное фармакологическое действие антисклеротик, антикоагулянт крови.

95. Основные показатели продукта:

96. Массовая доля основного вещества не менее 85-90 %

97. Массовая доля воды не более 10-15 7>

98. Степень замещения по сульфатнымгруппам (содержание серы) 1,08-1.65 (12,5-15,8%)

99. Содержание общего азота 3,5-4,3 %

100. Содержание аминного азота 2,8-3,2 %

101. Характеристическая вязкость в 0,5 Н р-ре ИаС1 при Т-25 °С 0,05-0,12 дл/г1. Зольный остаток 28-35 %3. СЫРЬЕ И МАТЕРИАЛЫ

102. Требования к качеству применяемых в производстве сырья и материалов

103. Наименование Стандарт Квалификация, Содержание Удельныйили ТУсортосновного расход, вещества г/20 г СХ

104. Хитозан панцирей ракообразных низкомолекулярный

105. Опытные образцы получены по новой твердофазной технологии

106. Массовая доля воды ■<. 10 % Массовая доля минеральных ■ примесей1 ? \ 1 'О

107. Растворимость в 2% уксусной кислоте :> 95 % Степень дезацети-лирования 0.80 Характеристическая вязкость не более 1,5 дл/гл

108. Кислота хлорсульфоновая (ХСК)гост2124-73перегнанная1. ПС; П 47•1 ГЧГ1 , по/- . .3с! 1,77- (32 мл)1,79 тЛж1. Олеум1. МРТУ 609-1970641. Диметилфор-мамид (ДМФА)1. ГОСТ 20289-741. Массовая доля 60 %57,2 (32 мл)1. Массовая доля в-ва 99,7 %661,15 (700 мл)

109. Массовая доля воды х О Л 7.1. Ацетон1. ТУ 6-09 3513-861. Массовая доля воды 4 IX18962400 МЛ)

110. Натрий гидрат ГОСТ окиси 4328-66хч99,0 %7,832,7 МЛ 20%. р-ра)

111. Натрий хлорид ГОСТ 4233-77хч99,9 %620 мл р-ра 300 г/дл)

112. Вода дистилли- ГФК,ст.73 рованнаяоколо 8,5 л

113. Технологическая схема получения Иа-соли низкомолекулярного сульфата хитозана13o

114. Характеристика основного оборудования и приборов

115. Реактор, емк. 0,5 л. ( стекло или эмалированная сталь).2. Термостат на 20-100 °С

116. Центрифуга с корзиночной насадкой, емк. 2-5 л, К-26-Д, ГДР.

117. Реактор с рубашкой для охлаждения и обогрева, емк. 2 л ( эмалированная сталь с тефлоновой мешалкой).

118. Криостат для термостатирования реактора при температурах от -10 до +50 °С, МК-70, ГДР.

119. Термометр контрольный ТЛ2 (-30 70 °С ).

120. Капельная воронка типа УП, емк. 250 мл.8. Мешалка МР 25, ГДР.9. Гомогенизатор МР 324.

121. О. Ультрафильтрационная система с половолоконными мембранами.1. Распылительная сушилка.

122. Описание технологического процесса Активация исходного хитозана

123. Активацию исходного хитозана проводят 2-х-кратной обработкой ДМФА .ри 45-60 °С ( модуль 10 ). Продолжительность одной обработки 8-10 ча-:ов.

124. Расход реагентов: воздушно-сухого хитозана 20 г, ДМФА - 400 мл ( 1 стадия - 200 мл, 2 стадия - 200 мл).

125. Получение Nа-соли низкомолекулярного сульфата хитозана

126. Приготовление сульфатирующей смеси ХСК ( олеум ) и ДМФА проводят епосредственно в реакторе с рубашкой для охлаждения и обогрева, снаб-енном термометром.

127. Температуру реакционной смеси повышают до 55-60 °С и продолжают геремешивание 2,5 часа.

128. Раствор СХ осаждают в 1800 мл охлажденного ацетона. Осаждение )существляется в емкости объемом 3 л.

129. Расход реагентов: ШФА 300 мл КСК (олеум) - 32 мл МаОН -32,7мл 20 %-го р-ра Ацетон - 2400 мл

130. Очистка Иа-соли низкомолекулярного сульфата хитозана

131. Для сульфатирования хитозана и нейтрализации кислого раствора :х используют едкие вещества ( хлорсульфоновая кислота, НаОН ), вызы-¡ающие раздражение слизистых оболочек, при попадании на кожу дающие '.яжелые ожоги.

132. Защитные меры: резиновые перчатки, защитные очки, респиратор, работа должна проводиться в вытяжном шкафу. При попадании на кожу необ-одимо обильное промывание водой и слабыми растворами ИаНСОз или !Н3С00Н.

133. ДМФА оказывает раздражающее действие на слизистые оболочки дыха-ельных путей, глаз, кожу, общетоксическое и эмбриотоксическое дейс-вие. поражает печень, проникает через кожу. ПДКр.з.- 10 мг/м3.

134. При высоких концентрациях паров ДМФА в помещении применяют противогаз марки А, необходима защита кожи, периодические медицинские осмотры.

135. Ацетон раздражает верхние дыхательные пути. ПДКР.3.« мг/м3. Образует с воздухом взрывоопасные смеси, нижний предел 2,55 % об., верхний 12,8 % об.б. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ

136. Для контроля качества низкомолекулярного сульфата хитозана применяются стандартизированные методы контроля:

137. Характеристическую вязкость СХ СП. определяют в 0,5 М растворе МаС1 при 298 К (25 °С) в вискозиметре Уббелоде с1~0,34 мм. Исходная концентрация раствора СХ 1,5 - 1,0 г/дл. Молекулярная масса рассчитывается по уравнению:т)3 4,85 х 10~5 х М0'8

138. Содержание серы в сульфатах хитозана определяется по методу Шенигера (1).

139. Степень замещения СХ в Иа-форме рассчитывается на основании содержания серы (% Б) в образце СХ по формуле:

140. СЗ -172.6 х ( % Б ) , где 3200 - 102 х ( X Б )

141. СЗ ( х + у ) - общая степень замещения по серосодержащим группам.

142. Содержание общего азота в образцах определяют на С, Н, N -анализаторе.

143. Содержание аминного азота определяют по методу Ван-Слайка (2).

144. Содержание золы и массовую долю воды определяют по (3).1. Зав.кафедрой ТХВ

145. Старший научный сотрудник проблемной лаборатории каф.ТХВ1. Ассистент каф. ТХВ1. Аспирант каф. ТХВпроф. Гальбрайх Л.С.1. П. S