Регуляция активности иммобилизованных ферментов фазовым переходом полимерной матрицы-носителя тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ФАЗОВЫЙ ПЕРЕХОД СТИМУЛ-ЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ

МАТРИЦЫ

1.1. Теоретическое описание фазового перехода в гидрогелях.

1.2. Регуляция характеристик фазового перехода гидрогелей.

1.2.1. Влияние состава полимера и строения геля на критическую 20 температуру и фазовый переход в термочувствительных гелях.

1.2.2. Влияние состава среды на критическую температуру и фазовый 32 переход в термочувствительных гелях.

1.2.3. Мультирегуляция степени набухания и фазового перехода 40 температурно-чувствительных гидрогелей.

1.3. Фазовый переход в поли-1\[-изопропилакриламиде

1.3.1. Изменение системы внутри- и межмолекулярных взаимодействий 47 при фазовом переходе в поли-И-изопропилакриламиде.

1.3.2. Изменение гидрофильно-гидрофобного баланса в поли-НИПАА 51 при фазовом переходе полимера.

ГЛАВА II. ТЕМПЕРАТУРНЫЙ КОЛЛАПС ПОЛИ-НИПАА ГЕЛЯ И ЕГО

ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

11.1. Особенности кинетического поведения ферментов, иммобилизованных 61 на термочувствительных полимерах.

11.2. Влияние температурного коллапса поли-НИПАА матрицы на 82 кинетические и равновесные параметры ферментативных реакций.

11.2.1. а-Химотрипсин

11.2.2. Щелочная фосфатаза из кишечника тюленя.

II.2.3. Уреаза.

II. 3 Возможные причины аномального температурного поведения 119 ферментов в ходе коллапса термочувствительной матрицы

11.3.1. Изменение коэффициента распределения субстрата.

11.3.2. Уменьшение коэффициента диффузии субстратов

11.3.3. Диффузионные затруднения

11.3.4. Стерические ограничения

11.3.5. Уменьшение концентрации «свободной» воды в геле.

ГЛАВА III. КОЛЛАПС ПОЛИ-НИПАА ГЕЛЯ В СМЕСЯХ ВОДА/ДМСО И

ЕГО ВЛИЯНИЕ НА АКТИВНОСТЬ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

III. 1. Ферменты в водно-органических смесях. 142 III. 1.1. Влияние органического растворителя на спектральные свойства белков

III. 1.2. Влияние органического растворителя на наблюдаемую кинетику ферментативных реакций III. 1.3. Механизм влияния органического растворителя на кинетическое поведение а-химотрипсина. III. 1.4. Кинетическое описание гидролиза а-химотрипсином N-ацетилзамещенных субстратов в водно-органической смеси. III. 1.5. Концепция низко-барьерных водородных связей применительно к 183 функционированию нативных и иммобилизованных ферментов в водно-органических смесях.

111.2. Фазовый переход поли-НИПАА геля в водно-органических смесях.

111.3. Влияние изотермического коллапса поли-НИПАА геля в смесях 195 вода/ДМСО на кинетическое поведение иммобилизованного ахимотрипсина

111.3.1. Физические и кинетические характеристики фермент-содержащих полимерных матриц

111.3.2. Кинетическое поведение препаратов иммобилизованного а-химотрипсина

ГЛАВА IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОВЕРКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ПОЛОЖЕНИЙ

IVЛ. Температурное поведение нативного а-химотрипсина в смесях вода-ДМСО.

IV.2. Температурное поведение иммобилизованного в поли-НИПАА а-химотрипсина в смесях вода-ДМСО.

IV.3. Температурный коллапс поли-НИПАА матрицы и влияние N-ацильного заместителя на кинетическое поведение иммобилизованного химотрипсина.

IV.4. «Включение» иммобилизованного фермента независимой ферментативной реакцией

ГЛАВА V. ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ СТИМУЛ

ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ СИСТЕМ.

V. 1. Фоторегуляция НКТР водорастворимого линейного термочувствительного полимера

V.2. Разделение и концентрирование белков

V.3. Сокращение продолжительности аналитического цикла биосенсоров

V.4. Термоконтролируемое «включение-выключение» ферментативной реакции

V.5. Сопряжение ферментативной реакции с ответом стимул-чувствительной матрицы.

ГЛАВА VI. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

VI. 1. Исходные вещества

VI.2. Методы исследования

VI.2.1. Определение концентрации белка

VI.2.2. Титрование числа активных центров ферментов

VI.2.3. Определение активности нативных и иммобилизованных 270 ферментов

VI.2.3.1. а-Химотрипсин

VI.2.3.2. Трипсин

VI.2.3.3. Уреаза

VI.2.3.4. Щелочная фосфатаза

VI.2.3.5. Ангиотензин-превращающий фермент

VI.2.3.6 Глкжозооксидаза

VI.2.4. Определение коэффициентов экстинкции п-нитроанилина и пнитрофенола в водно-органических смесях

VI.2.5. Определение параметров уравнения Михаэлиса-Ментен

VI.2.6. Синтез полимерных препаратов

VI.2.6.1. Синтез линейного сополимера НИПАА и СП

VI.2.6.2. Синтез гелей, не содержащих ферменты

VI.2.6.3. Синтез фермент-содержащих гелей: метод физического 277 включения

VI.2.6.4. Синтез фермент-содержащих гелей: метод ковалентной 278 иммобилизации

VI.2.6.4. Синтез бифермент-содержащего геля

VI.2.7. Приготовление суспензии геля

VI.2.8. Подведение материального баланса при иммобилизации 284 ферментов

VI.2.9. Изучение относительной степени набухания препаратов гелей

ВЫВОДЫ

Конец двадцатого века характеризуется бурным развитием исследований в области наук о материалах. Особое внимание при этом уделяется материалам, способным к обратимой регуляции своих физико-химических свойств в ответ на тот или иной физический или химический сигнал-стимул (свет, температура, рН, ионная сила, электрические или магнитные поля и т.д.). Значительный интерес в плане конструирования подобных материалов представляют фермент-содержащие стимул-чувствительные полимерные матрицы. Активность ферментов, иммобилизованных в подобные полимерные материалы, может определяться изменениями свойств матрицы, вызываемых внешним сигналом, и, таким образом, становится зависимой от его интенсивности. В литературе появился даже термин «умные» (smart, intelligent) материалы. Своеобразным индикатором актуальности данной тематики служит тот факт, что первая международная конференция по «умным» материалам была организована в Японии в 1989 г., а в 1996 г. в мире проводилось восемнадцать конференций аналогичного содержания. Температурно-чувствительные полимеры (и гели на их основе) являются одним из интереснейших примеров стимул-чувствительных материалов, обратимо изменяющих свой объем в результате фазового перехода полимерных цепей.

Механизм фазового перехода термочувствительных гидрогелей на молекулярном уровне определяется переходом «клубок-глобула» молекул полимера. Конформация полимерной цепи определяется «качеством растворителя» % = AF/kT, где AF - свободная энергия взаимодействия полимер-растворитель, кТ - энергия собственного теплового движения полимерных цепей. В плохих растворителях (х>:>1) энергия собственного теплового движения полимерных цепей кТ много меньше, нежели чем энергия AF, связанная с взаимодействием полимер-растворитель. Для хороших растворителей (^«1) ситуация обратная. Таким образом, фазовый переход «клубок-глобула» полимерной цепи при переходе от «хорошего» растворителя к «плохому» может быть вызван путем изменения температуры и/или изменением состава растворителя (внешний стимул). В ответ на стимул происходит изменение гидрофильно-гидрофобного баланса матрицы в результате изменения энергетических характеристик взаимодействий полимера с растворителем. При этом отметим, что движущей силой фазового перехода синтетических термочувствительных полимеров (переход «клубок-глобула») является энтропийный фактор, и именно энтропийный фактор определяет процессы фолдинга природных полимеров - белков. Сходство физических причин, вызывающих эти два на первый взгляд разные процессы, уже привлекло внимание исследователей и позволило выдвинуть предположение о том, что фазовый переход в термочувствительных полимерах может рассматриваться как аналог «холодной» ренатурации небольших глобулярных белков [376, 377]. Но тогда каким образом будет реализоваться взаимодействие между полимерной матрицей, претерпевающей фазовый переход, и иммобилизованным в нее ферментом? Каковы будут кинетические проявления данного процесса? Понятно, что только понимание физических причин таких взаимодействий (в том случае, конечно, если они действительно реализуются) даст возможность практического использования фермент-содержащих стимул-чувствительных полимерных гидрогелей.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа была направлена на создание содержащих ферменты стимул-чувствительных полимерных гидрогелей с обратимо регулируемой активностью биокатализатора, а также на выявление механизмов такой регуляции. В этой связи изучались кинетические закономерности функционирования иммобилизованных гидролитических ферментов при фазовом переходе (коллапсе) матрицы-носителя под действием различных стимулов физической и/или химической природы.

Для достижения поставленной дели в работе было необходимо:

1. Исследовать взаимосвязь относительной степени гидратации стимул-чувствительной матрицы и активности иммобилизованных в ней ферментов под действием:

- температуры;

- концентрации органического растворителя в реакционной смеси;

- совместного действия этих стимулов.

2. Провести сравнительный анализ результатов по влиянию изучаемых стимулов на кинетическое поведение нативных ферментов и их иммобилизованных в стимул-чувствительную и неколлапсирующую полимерные матрицы препаратов.

3. Выявить роль структуры субстрата и жесткости конформации белка в наблюдаемом кинетическом ответе биокатализатора на интенсивность изучаемого стимула.

Особое внимание было уделено обратимости кинетических эффектов, проявляющихся при функционировании иммобилизованных ферментов в ходе фазового перехода полимера.

выводы

1. Процессы гидролиза под действием иммобилизованных в стимул-чувствительный поли-Ы-изопропилакриламидный гель ферментов с изменением температуры и/или содержания органического растворителя демонстрируют свойства, отличающиеся от свойств процессов, протекающих в растворе или неколлапсирующей полимерной матрице. Характер наблюдаемых кинетических изменений позволил уточнить ряд существенных деталей механизма ферментативного гидролиза.

2. Показано, что в водной среде в области температур ниже Ткр поли-НИПАА геля кинетические закономерности реакций гидролиза определяются температурными свойствами иммобилизованного фермента, а в области выше Ткр геля - свойствами поли-НИПАА матрицы. Имеется четкая связь между относительной степенью гидратации полимерной матрицы и ферментативной активностью. Факторы, регулирующие относительную степень гидратации гелевой матрицы, аналогичным образом регулируют активность иммобилизованного в ней фермента.

3. Продемонстрировано, что основной особенностью ферментов, иммобилизованных в поли-НИПАА гель, является аномальная зависимость скорости процесса гидролиза с изменением температуры - во всех случаях появляются температурные интервалы, в которых увеличение температуры приводит к уменьшению активности иммобилизованных препаратов. Показано, что фазовый переход поли-НИПАА геля слабо влияет на температурное поведение равновесных параметров ферментативной реакции иммобилизованного биокатализатора, и наблюдаемое поведение иммобилизованных препаратов связано исключительно с изменением кинетических характеристик ферментативного процесса (каталитической константы иммобилизованного фермента).

4. Установлено, что специфическое взаимодействие органического растворителя с нативным а-химотрипсином происходит в S2-catoe сорбционного центра фермента, что и сказывается на кинетике гидролиза. Закрепление конформации белка путем ковалентной иммобилизации, равно как и связывание гидрофобных N-заместителей субстрата в 82-сайте, протектирует активный центр а-химотрипсина от специфического влияния органического растворителя. Кинетическая схема, описывающая гидролиз N-ацетил замещенных производных L-тирозина «конформационным изомером» а-химотрипсина, удовлетворительно согласуется с экспериментальными данныим.

5. Продемонстрировано, что в изотермических условиях в смесях вода-ДМСО кинетические закономерности для иммобилизованных в поли-НИПАА ферментов сходны с закономерностями, полученными для нативных ферментов. На этом основании выдвинуто предположение о сходных причинах влияния органического растворителя и полимерных цепей стимул-чувствительной матрицы при ее коллапсе на активный центр биокатализатора.

6. Предложен механизм регуляции активности иммобилизованного в стимул-чувствительной полимерной матрице фермента фазовым переходом носителя, заключающийся в специфических взаимодействиях полимерных цепей геля, гидрофобизующихся в ходе коллапса, с активным центром биокатализатора (82-сайтом сорбционного участка в случае а-химотрипсина).

7. Показано, что в целом система стимул-чувствительная полимерная матрица/иммобилизованный фермент приобретает возможность регуляции активности иммобилизованного биокатализатора посредством изменения степени относительного водосодержания полимерной матрицы. Продемонстрирована обратимость всех наблюдаемых кинетических эффектов. На основании полученных данных предложен и реализован ряд практических применений стимул-чувствительных систем:

- синтезирован и охарактеризован свето- и термочувствительный полимер с фотоконтролируемой температурой преципитации/растворения для иммунодиагностических целей;

- с помощью термочувствительных гелей отработаны методики концентрирования высокомолекулярных белков и отделение их от низкомолекулярных фракций в мягких условиях с быстрой регенерацией полимерного сорбента;

- получены термочувствительные фермент-содержащие мембраны, обладающие стабильным и воспроизводимым ответом, применение которых позволяет резко сократить время аналитического цикла биосенсоров;

- разработана модель ферментных сенсорных элементов триггерного типа, дающих ответ только при превышении задаваемой условиями определения концентрации субстрата.

Считаю своим долгом выразить благодарность Л.В.Сиголаевой, П.А.Симакову, А.В.Кухтину, Ю.Г.Комаровской, Е.А.Беляевой, Е.В.Гусаровой, А.С.Журавлевой, Д.В.Гра - студентам и аспирантам, кропотливая работа которых позволила собрать фактический экспериментальный материал, лежащий в основе данной работы.

Автор признателен сотрудникам кафедры химической энзимологии С.Д.Вафоломееву, А.В.Левашову, Н.И.Ларионовой, О.А.Кост, И.И.Никольской за идейную и практическую помощь.

Благодарю группу органического синтеза кафедры за помощь в синтезе необходимых для работы реактивов и Д.Дейко за поддержание приборного парка лаборатории в работоспособном состоянии.

Особую благодарность выражаю Н.Ф.Казанской, под руководством которой (начиная со студенческой скамьи) прошла вся исследовательская деятельность автора.

1. Taylor L., Cerankowski L.D. Preparation of films exhibiting a balanced temperature dependence to permeation by aqueous solutions - a study of lower consolute behaviour. -J.Polym.Sci., Polym.Chem.Ed., 1975, v. 13, p.2551-2570.

2. Amiya Т., Tanaka T. Coil-globula transition in polymers. Macromolecules, 1987, v.12, p.l 162-1164.

3. Li Y., Tanaka T. Phase transition of gels. Ann.Rew.Mater.Sci., 1992, v.22, p.243277.

4. Dusek K., Patterson D. Transition in swollen polymer networks induced by intramolecular condensation. J.Polym.Sci., 1968, v.6, p.1209-1216.

5. Flory P.J. Principle of Polymer Chemistry. Cornel Univ.Press, Ithaca, New York,1953.

6. Khokhlov A. R. Swelling and collapse of polymer networks. Polymer, 1980, v.21, p.376-380.

7. Василевская В. В., Хохлов А. Р. О влиянии низкомолекулярной соли на коллапс заряженных полимерных сеток. Высокомол.Соед., 1986, т.28 (А), № 2, с. 316320.

8. Szleifer I. A new mean-field theory for dilute polymer solutions: phase diagram, conformational behavior, and interfacial properties. J.Chem.Phys., 1990, v.92, № 11, p.6940-6952.

9. Binder P.-M., Owczarek A. L„ Veal A. R., Yeomans J. M. Collapse transition in a simple polymer model: exact results. J.Polym.Phys. A: Math. Gen., Lett. Ed., 1990, v. 23, pp.975-979.

10. Василевская В. В., Крамаренко Е. Ю., Хохлов А. Р. Теория колласа полиэлектролитных сеток в растворе ионогенных поверхостно-активных веществ. -Высокомол.Соед., 1991, т.ЗЗ (А), № 5, с. 1061-1069.

11. Ilavsky M. Effect of phase transition on swelling and mechanical behavior of synthetic hydrogels. in Responsive Gels: Volume Transitions I (Dusek, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin, 1993, p.174-207.

12. Кленин В.И. Термодинамика систем с гибкоцепными полимерами. Саратов: Изд-во Саратовского Ун-та, 1995, 733 с.

13. Tanaka Т. Collapse of gels and the critical endpoint. Phys.Rev.Lett., 1978, v.40, p.820-823.

14. Tanaka T. Phase transition in gels and a single polymer. Polymer, 1979, v.20, p.1404-1412.

15. Tanaka Т., Fillmore D., Sun S. Т., Nishio I., Swislow G., Shah A. Phase transitions in ionic gels. Phys.Rev.Lett., 1980, v.45, p.1636-1638.

16. Ohmine I., Tanaka T. Salt effects on the phase transitions of ionic gels. -J.Chem.Phys., 1982, v.77, p.5725-5729

17. Otake K., Inomata H., Konno M., Saito Sh. A new model for the thermally induced volume phase transition of gels. J.Chem.Phys., 1989, v.91, № 2, p.1345-1350.

18. Hirokawa Y., Tanaka T. Volume phase transition in a nonionic gel. -J.Chem.Phys., 1984, v.81,№ 12, p.6379-6380.

19. Katayama S., Hirokawa Y., Tanaka T. Reentrant phase transition in acrylamide-derivative copolymer gels. Macromolecules, 1984, v. 17, № 12, p.2657-2663.

20. Hirotsu Sh. Phase transition of a polymer gel in pure and mixed solvent media. -J.Phys.Soc.Jpn., 1987, v.56, № 1, p.233-2423.

21. Lele A.K., Hirve M.M., Badiger M.V., Mashelkar R.A. Prediction of bound water content in poly(N-isopropylacrylamide) gel. Macromolecules, 1997, v.30, p.157-159.

22. Katakai R., Yoshida M., Hasegawa S., Iijima S., Yonezawa N. Phase transition of hydrogels by "pinpoint-variation''' of polymer side chains. Macromolecules, 1996, v.29, p. 1065-1066.

23. Katakai R., Saito K., Sorimachi M., Hiroki A., Kinuno Т., Nakajima Т., Shimizu M., Kubota H., Yoshida M. Hydrophobic site-specific control of the volume phase transition of hydrogels. -Macromolecules, 1998, v.31, p.3383-3384.

24. Ilavsky M., Hrouz J. Phase transition of swollen gels. 4. Effect of concentration of the cross-linking agent at network formation on the collapse and mechanical behaviour of polyacrylamide gels. Polym.Bull., 1982, v.8, p.782-788.

25. Дубровский С.А., Афанасьева M.B., Лагутина M.A., Казанский К.С. Измерение набухания слабосшитых гидрогелей. Высокомол.Соед., 1990, т.32 (А), с.165-169.

26. Sawai Т., Yamasaki S., Irariyama Y., Aizawa M. PH-Responsible swelling of the ultrafine microsphere. Macromolecules, 1991, v.24, p.2117-2118.

27. Li Y. Structure and critical behavior of polymer gels. Phys.Rew.Lett., 1989, v.38, p.760-763.

28. Shibayama M., Norisuye Т., Nomura S. Cross-link density dependence of spatial inhomogeneities and dynamic fluctuations of poly(N-isopropylacrylamide) gels. -Macromolecules, 1996, v.29, p.8746-8750.

29. Choi H.S., Kim J.M., Lee K.-J., Bae Y.C. Volume phase transition behavior of N-isopropylacrulamide-N-cyanomethyl acrylamide copolymer gel particles: The effect of crosslinking density. J.Appl.Polym.Sci., 1999, v.72, p.1091-1099.

30. Katayama S., Yamazaki F., Akahori Y. Specific volume phase transition of polymer gels of the same composition but different overall concentration. Focusing on a particular transition point. J.Chem.Phys., 1993, v.91, p.290-292.

31. ICang M.-S., Gupta V.K. Photochromic cross-links in thermoresponsive hydrogels of poly(N-isopropylacrylamide): enthalpic and entropic consequences on swelling behaviour. -J.Chem.Phys. B, 2002, v.106, p.4127-4132.

32. Ilavsky M. Phase transition in swollen gels. 2. Effect of charge concentration on the collapse and mechanical behavior of polyacrylamide networks. Macromolecules, 1987, v.15, p.782-788.

33. Kawasaki H., Mitou Т., Sasaki S., Maeda H. Partition of salts between N-isopropylacrylamide gels and aqueous solutions. Langmuir, 2000, v. 16, p.1444-1446.

34. Дубровский С. А., Афанасьев M. В., Рыжкии М. А., Казанский К. С. Термодинамика сильнонабухающих полимерных гидрогелей. Высокомол.Соед., 1989, т.31 (А), с.321-327

35. Kudo S., Kosaka N., Konno M., Saito S. Volume-phase transitions of cationic polyelectrolyte gels. Polymer, 1992, v.33, p.5040-5043.

36. Zhang X., Hu Zh., Li Y. The phase transition and shear modulus of ionic N-isopropylacrylamide gels in concentrated salt solutions. J.Appl.Polym.Sci., 1997, v.63, p.l 851-1856.

37. Василевская В. В., Хохлов А. Р. Набухание и коллапс полимерных сеток в растворе полимера. Высокомол.Соед., 1991, т.ЗЗ (А), с.885-893.

38. Стародубцев С. Г. Влияние топологического строения полиэлектролитных сеток на их взаимодействие с противоположно заряженными мицеллообразующими поверхостно-активными веществами. Высокомол.Соед., 1990, т.32 (Б), с.925-930.

39. Стародубцев С. Г. Коллапс слабозаряженных полимерных сеток полиметакриловой кислоты в присутствии полиэтиленгликоля. Высокомол.Соед., 1991, т.ЗЗ (Б), с.5-7.

40. Рябина В. Р., Стародубцев С. Г., Хохлов А. Р. Взаимодействие полиэлектролитных сеток с противоположно заряженными мицеллообразующими поверхостно-активными веществами. Высокомол.Соед., 1990, т.32 (А), с.969-974.

41. Wada N., Kajima Y., Yagi Y., Inomata H., Saito S. Effect of surfactant on the phase transition of N-alkylacrylamide gels. Langmuir, 1993, v.9, p.46-49.

42. Lehto J., Varamaa K., Vesterinen E., Tenhu H. Uptake of zinc, nickel, and chromium by N-isopropyl acrylamide polymer gels. J.Appl.Polym.Sci., 1998, v.68, p.355-362.

43. Sasaki S., Kawasaki H., Maeda H. Volume phase transition behaviour of N-isopropylacrylamide gels as a function of the chemical potential of water molecules. -Macromolecules, 1997, v.30, p.l847-1848.

44. Sasaki S., Kawasaki H., Maeda H. Effect of Donnan osmotic pressure on the volume phase transition of N-isopropylacrylamide gels. Langmuir, 1999, v. 15, p.4266-4269.

45. Тагер А. А., Сафронов А. П., Шарина С. В., Галаев И. Ю. Термодинамика водных растворов поливинилкапролактама. Высокомол.Соед., 1990, т.32 (А), с.529-534.

46. Тагер А. А., Сафронов А. П., Березюк Е. А., Галаев И. Ю. Гидрофобные взаимодействия и нижняя критическая температура водных растворов полимеров. -Высокомол.Соед., 1991, т.ЗЗ (Б), с.572-577.

47. Freitas R. F. S., Cussler Е. L. Temperature-sensitive gels as extraction solvents. -Chem.Eng.Sci., 1987, v.42,p.97-103.

48. Yoshida R., Okuyama Y., Sakai K., Okano Т., Sakurai Y. Sigmoidal swelling profiles for temperature-responsive poly(N-isopropylacrylamide-co-butyl methacrylate) hydrogels. J.Membr.Sci., 1994, v.89, p.267-277.

49. Kaneko Y., Sakai K., Kikuchi A., Yoshida R., Sakurai Y., Okano T. Influence of freely mobile grafted chain length on dynamic properties of comb-type grafted poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Macromolecules, 1995, v.28, p.7717-7723.

50. Beltran S., Baker J. P., Hooper H. H., Blanch H. W., Prausnitz J. M. Swelling equlibria for weakly ionizable, temperature-sensitive hydrogels. Macromolecules, 1991, v.24, p.549-551.

51. Ilavsky M., Hrouz J., Ulbrich K. Phase transition in swollen gels. 3. The temperature collapse and mechanical behavior of poly(N,N-diethylacrylamide) networks in water. Polymer Bull., 1982, v.7, p. 107-113.

52. Marchetti M., Prager S., Gussler E. L. Thermodynamic predictions of volume changes in temperature-sensitive gels. 2. Experiments. Macromolecules, 1990, v.23, p.3445-3450.

53. Bae Y. H., Okano Т., Kim S. W. Temperature dependence of swelling of crosslinked poly(N,N'-alkyl substituted acrylamides) in water. J.Polym.Sci., Part B: Polym.Phys., 1990, v.28, p.923-936.

54. Smets G. Photochromic phenomena in solid phase Adv.Polym.Sci., 1983, v.50, p. 17-44.

55. Irie M. Photoresponsive polymers. Pure Appl.Chern., 1990, v.62, p.1495-1502.

56. Irie M., Kungwatchakun D. Photoresponsive polymers. 8. Photo stimulated dilation of polyacrylamide gels having triphenylmethane leuco derivatives. Macromolecules, 1986, v.19, p.2476-2480.

57. Mamada A., Tanaka Т., Kungwatchakun D., Irie M. Photoinduced phase transition of gels. Macromolecules, 1990, v.23, p.1517-1519.

58. Irie M. Stimuli-responsive poly(N-isopropylacrylamide). Photo- and chemical-induced phase transitions. in Responsive Gels: Volume Transitions II (Dusek, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin, 1993, p. 50-65.

59. Kokufuta E., Zang Y.-Q., Tanaka T. Saccharide-sensitive phase transition of a lectin-loaded gel. Nature, 1991, v.351, p.302-304.

60. Suetoh Y., Shybayama M. Effects of non-uniform solvation on thermal response in poly(N-isopropylacrylamide) gels. Polymer, 2000, v.41, p.505-510.

61. Maeda Y., Higuchi Т., Ilceda I. Change in hydration state during the coil-globule transition of aqueous solutions of poly(N-isopropylacrylamide) as evidence by FTIR spectroscopy. Langmuir, 2000, v.16, p.7503-7509.

62. Lin Sh.Y., Chen K.-S., Run-Chu L. Thermal micro ATR/FT-IR spectroscopic system for quantitative study of the molecular structure of poly(N-isopropylacrylamide) in water. Polymer, 1999, v.40, p.2619-2624.

63. Shibayama M., Mizutani Sh., Nomura Sh. Thermal properties of copolymer gels containing N-isopropylacrylamide. Macromolecules, 1996, v.29, p.2019-2024.

64. Inomata H., Goto Sh., Saito Sh. Phase transition of N-substituted acrylamide gels. Macromolecules, 1990, v.23, p.4887-4888.

65. Iwai K., Hanasaki K., Yamamoto M. Fluorescencce label studies of thermo-responsive poly-(N-isopropylacrylamide) hydrogels. J.Luminescence, 2000, v.87-89, p.1289-1291.

66. Chee C.K., Rimmer S., Soutar I., Swanson L. Fluorescence investigations of the thermally induced conformational transition of poly(N-isopropylacrylamide). Polymer, 2001, v.42, p.5079-5087.

67. Ito K., Ujihira Y., Yamashita Т., Horie K. Change in free volume during phase transition of poly(N-isopropylacrylamide) gel as studied by positron annihilation lifetimes: temperature dependence. Polymer, 1999, v.40, p.4315-4323.

68. Tanaka N., Matsukawa Sh., Kurosu H., Ando I. A study on dynamics of water in cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gel by NMR-spectroscopy. Polymer, 1998, v.39, № 20, p.4703-4706.

69. Ganapathy S., Rajamohanan P.R., Badiger M.V., Mandhare A.B., Mashelkar R.A. Proton magnetic resonance imaging in hydrogels: volume phase transition in poly(N-isopropylacrylamide). Polymer, 2000, v.41, p.4543-4547.

70. Liang L„ Rielke P.C., Fryxell G.E., Young J.S., Engelhard M.H., Alford K.L. Surfaces with reversible hyrophilic/hydrophobic characteristics on cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) hydrogels. Langmuir, 2000, v. 16, p.8016-8023.

71. Takei Y.G., Aoki Т., Sanui K., Ogata N., Sakurai Y., Okano T. Dynamic contact angle measurement of temperature-responsive surface properties for poly(N-isopropylacrylamide) grafted surfaces. Macromolecules, 1994, v.27, p.6163-6166.

72. Hosoya K., Kimata K., Araki Т., Tanaka N., Frechet J.M. Temperature-controlled high-performance liqiud chromatography using a informly sized temperature-responsive polymer-based packing material. Anal.Chem., 1995, v.67, p.1907-1911.

73. Go H., Sudo Y., Hosoya K., Ikegami Т., Tanaka N. Effects of mobile-phase composition and temperature on the selectivity of poly(N-isopropylacrylamide)-bonded silica gel in reversed-phase liquid chromatography. Anal.Chem., 1999, v.70, p.4086-4093.

74. Winnik F., Ringsdorf H., Venzmer J. Methanol-water as a co-nonsolvent system for poly(N-isopropylacrylamide). Macromolecules, 1990, v.23, p.2415-2416.

75. Winnik F., Ottaviami M.F., Bosmann S.H., Pan W., Garcia-Garibay M., Turro N J. Cononsolvency of poly(N-isopropylacrylamide) in mixed water-methanol solutions: a look at spin-labeled polymers. Macromolecules, 1992, v.25, p.6007-6017.

76. Asano M., Winnik F.M., Yamashita Т., Horie K. Fluorescense studies of dansyl-labeled poly(N-isopropylacrylamide)gels and polymers in mixed water/methanol solutions. -Macromolecules, 1995, v.28, p.5861-5866.

77. Kanasawa H., Yamamoto K., Matsushima Y., Takai N., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Temperature-responsive chromatography using poly(N-isopropylacrylamide)-modified silica. Anal.Chem, 1996, c.68, p.100-105.

78. Kanasawa H, Kashiwase Y., Yamamoto K., Matsushima Y, Kikuchi A., Sakurai Y., Okano T. Temperature-responsive chromatography. 2. Effects of hydrophobic groups in N-isopropylacrylamide copolymer modified silica. Anal.Chem., 1997, v.69, p.823-830.

79. Kanasawa H, Matsushima Y., Okano T. Temperature-responsive chromatography. Trends in Anal.Chem., 1998, v. 17, №.7, p.435-440.

80. Ivanov A.E., Zhigis L.S, Kurganova E.V, Zubov V.P. Effect of temperature upon the chromatography of proteins on porous glass? chemically coated with N-isopropylacrylamide copolymer. J.Chromatogr, 1997, v.776 (A), p.75-80.

81. Stayton P.S., Shimboji Т., Long С., Chilkoti A., Chen G., Harris J.M., Hoffman A.S. Control of protein-ligand recognition using a stimuli-responsive polymer. Nature, 1995, v.378, p.472-474.

82. Ding Zh., Long C.J., Hayashi Y., Bulmus E.Y., Hoffman A.S., Stayton P.S. Temperature control of biotin binding and release with a streptavidin-poly(N-isopropylacrylamide) site-specific conjugate. Bioconjug.Chem., 1999, v.10, p.395-400.

83. Марквичева E.A., Бронин A.C., Кудрявцева H.E., Кузькина И.Ф., Пашкин И.И., Кирш Ю.Э., Румш Л.Д., Зубов В.П. Новый метод иммобилизации протеолитических ферментов в полимерных гидрогелях. Биоорган.Химия, 1994, т.20, № 3, с.257-262.

84. Markvicheva Е.А., Bronin A.S., Kudryavtseva N.E., Rumsh L.D., Kirsh Yu.E., Zubon V.P. Immobilization of proteases in composite hydrogel based on poly(N-vinylcaprolactam). Biotechnol.Techn., 1994, v.8,№ 3, p.143-148.

85. Кирш Ю.Э., Галаев И.Ю., Карапутадзе T.M., Марголин А.Л., Швядас В.К. Термоосаждаемые конъюгаты поливинилкапролактам-фермент. Биотехнология, 1987, №2, с. 104-108.

86. Matsukata М., Aoki Т., Sanui К., Ogata N., Kikuchi A., Sakurai Y., Okano Т. Effect of molecular architecture of poly(N-isopropylacrylamide)-trypsin conjugates on their solution and enzymatic properties. Bioconjug.Chem., 1996, v.7, p.96-101.

87. Chen G., Hoffman A.S. Preparation and properties of theroreversible, phase-separating enzyme-oligo(N-isopropylacrylamide) conjugates. Bioconjug.Chem., 1993, v.4, p.509-514.

88. Chen J.-P., Hsu M.-Sh. Preparations and properties of temperature-sensitive poly(N-isopropylacrylamide)-chymotrypsin conjugates. J.Mol.Catalysis, Part B: Enzymatic, 1997, v.2,p.233-241.

89. Валуев JI.И., Земфирова О.Н., Обыденнова И.В., Платэ Н.А. Водорастворимые полимеры с нижней критической температурой смешения для направленного транспорта лекарственных препаратов и других веществ. Высокомол.Соед., 1993, т.35, с.83-86.

90. Matsukata М., Takei Y, Aoki Т., Sanui К., Ogata N. Sakurai Y., Okano Т. Temperature modulated solubility-activity alterations for poly(N-isopropylacrylamide)-lipase conjugates. J.Biochem., 1994, v. 116, p.682-686.

91. Lee H., Park T.G. Conjugation of trypsin by temperature-sensitive polymers containing a carbohydrate moiety: thermal modulation of enzyme activity. Biotechnol.Prog., 1998, v,14,p.508-516.

92. Kim H.K., Park T.G. Synthesis and characterization of thermally reversible bioconjugates composed of a-chymotrypsin and poly(N-isopropylacrylamide-co-acrylamido-2-deoxy-D-glucose). Enz.Microb.Technol., 1999, v.25, p.31-37.

93. Dong L.C., Hoffman A.S. Thermally reversible hydrogels. 3. Immobolization of enzymes for feedback reaction control. J.Control.Release, 1986, v.4, p.223-227.

94. Hoffman A. S. Application of thermally reversible polymers and hydrogels in therapeutics and diagnostics. J. Control. Release, 1987, v.7, p.297-305.

95. Park T.G., Hoffman A.S. Effect of temperature cycling on the activity and productivity of immobilized 3-galactosidase in thermally reversible hydrogel bead reactor. -Appl.Biochem.Biotechnol., 1988, v,19,p.l-9.

96. Park T.G., Hoffman A.S. Immobilization and characterization of P-galactosidase in thermally reversible hydrogels beads. I.Biomed.Mat.Res., 1990, v.24, p.21-38.

97. Kato N., Oishi A., Takahashi F. Peptide synthesis catalyzed by a-chymotrypsin immobilized in the poly(N-isopropylacrylamide/acrylamide) gel. Mat.Sci.Eng., 2000, v.13 (C), № 1-2, p. 109-116.

98. Park T. G., Hoffman A. S. Immobilization of Arthrobacter simplex cells in thermally reversible hydrogels: comparative effect of organic solvent and polymeric surfactant on steroid conversion. Biotechnol.Lett, 1989, v.11, p.17-22.

99. Park T. G., Hoffman A. S. Immobilization of Arthrobacter simplex in thermally reversible hydrogel: effect of temperature on steroid conversion. Biotechnol.Bioeng., 1990, v.35, p.152-159.

100. Kokufuta E. Novel applications for stimulus-sensitive polymer gels in the preparation of functional immobilized biocatalysts. in: Responsive Gels: Volume Transitions II (Dusek, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin, 1993, p.159-177.

101. Hoffman A.S., Afrassiabi A., Dong L.C. Thermally reversible hydrogels. 2. Delivery and selective removal of substances from aqueous solutions. J.Control.Release, 1986, v.4, p.213-222.

102. Ю9.Клесов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. М.: Изд-во МГУ, 1980, т.1, с.107-109.

103. Berezin I.V., Kazanskaya N.F., Klyosov А.А. Determination of the individual rate constants of a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis with the added nucleophilic agent, 1,4-butanediol. FEBS Letters, 1971, v. 15, p. 121-124.

104. Клесов А.А., Березин И.В. Ферментативный катализ. M.: Изд-во МГУ, 1980, т.1, с.115.

105. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: Изд-во МГУ, 1975, с.225.

106. Gestrelius S., Matiasson В., Mosbach К. On the regulation of the activity of immobilized enzymes. Microenvironmental effects of enzyme-generated pH-changes. -Eur.J.Biochem., 1973, v.36, p.89-96.

107. Khight R., Light A. Sepharose-bound trypsin and activated Sepharose-bound trypsinogen. Arch.Biochem.Biophys., 1974, v. 160, p.377-386.

108. Сахаров И.Ю., Макарова И.Е., Ермолин Г.А. Физико-химические свойства щелочной фосфатазы из тонкого кишечника тюленя. Биохимия, 1988, т.53, № 6, с.974-979.

109. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты (пер. с англ.). М.: «Мир», 1982, г.1, с.228229.

110. Stadtman T.S., Halet F.M. Alkaline phosphatases. Enzymes, 1971, v.5, p.5571.

111. Саммир H. Каталитические и адсорбционные свойства щелочной фосфатазы. Дис.канд.хим.наук, М., МГУ, 1989.

112. Andrews R.K., Blakeley R.L., Zerner В. Urea and urease. in: Advances in Inorganic Chemistry (G.L.Eichhorn & L.G.Marzilli, Eds.), Elsevier Science Publishing, Inc., New York, 1984, v.6, p.245-283.

113. Zerner B. Recent advances in the chemistry of an old enzyme, urease. -Bioorg.Chem., 1991, v.19, p.116-131.

114. Jansen M, Blume A. A comparative study of diffusive and osmotic water permeation across bilayers composed of phospholipids with different head groups and fatty acyl chains. Biophys.J., 1995, v.68, p.997-1008.

115. Еремеев H.Jl., Сиголаева Л.В., Симаков П. А., Казанская Н.Ф. Температурное поведение равновесных и кинетических констант ферментативных реакций при фазовом переходе в термочувствительной матрице. Биохимия, 1995, т.60, с.991-999.

116. Palasis М., Gehrke S. Н. Permeability of responsive poly(N-isopropylacrylamide) gel to solutes. J. Control.Release, 1992, v,18,p.l-12.

117. Березин И.В, Клибанов A.M., Гольдмахер B.C., Мартинек К. Механохимия каталитических систем. Регулирование механическим воздействием ферментативной активности трипсина, иммобилизованного в полиакриламидном геле. ДАН СССР, 1974, т.218, с.367-370.

118. Гольдмахер B.C. Исследование стабилизации ферментов (на примере а-химотрипсина и трипсина). Дис.канд.хим.наук, М, МГУ, 1977

119. Иммобилизованные ферменты (под ред. Березина И.В., Антонова, В.К., Мартинека, К.), Москва, МГУ, 1976, т. 2, 358 с.

120. Erlanger В. F. Photoregulation of biologically active macromolecules.-Annu.Rev.Biochem, 1976, v.45, p.267-283.

121. Cicek H., Tuncel A. Immobilization of a-chymotrypsin in thermally reversible isopropylacrylamide-hydroxyethylmethacrylate copolymer gel. J.Polym.Sci, Part A: Polym.Chem, 1998, v.36. p.543-552.

122. Tuncel A. An engineering analysis for the continuous reactor behavior of a-chymotrypsin-immobilized thermosensitive gel cylinders. J.Biotechnol., 1998, v.63, p.41-54.

123. Щеголева Т.Ю. Гидратное окружение и структура макромолекул. Успехи современной биологии, 1996, т. 116, с.700-715.

124. Nakasako М. Large-scale networks of hydration water molecules around bovine P-trypsin revealed by cryogenic X-ray crystal structure analysis. J.Mol.Biol., 1999, v.289, p.547-564.

125. Абатуров JI.B., Файзуллин Д.А., Носова Н.Г. Вода как стабилизатор и пластификатор глобулярной структуры лизоцима. ДАН, 1997, т.355, с. 114-116.

126. Rousso I., Friedman N., Lewis A., Sheves M. Evidence for a controlling role of water in producing the native bacterirhodopsin structure. Biophys.J., 1997, v.73, p.2081-2089.

127. BaiTon L.D., Hecht L., Wilson G. The libricant of life: a proposal that solvent water promotes extremely fast conformational fluctuations in mobile heteropolypeptide structure. Biochemistry, 1997, v.36, p. 13143-13147.

128. Sundaralingam M., Shekarudu. Water-inserted alpha-helical segments implicate reverse turns as folding intermediates. Science, 1989, v.244, p. 1333-1337.

129. Takano K., Funahashi J., Yamagata Y., Fujii S., Yutani K. Contribution of water molecules in the interior of a protein to the conformational stability. J.Mol.Biol., 1997, v.274, p.132-142.

130. Shaltiel S., Cox S., Taylor S.S. Conversed water molecules contribute to the extensive network of interactions at the active site of protein kinase A. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1998, v.95, p.484-491.

131. Morton C.J., Ladbury J.E. Water-mediated protein-DNA interactions: the relationships of thermodynamics to structural detail. -Protein Sci., 1996, v.5, p.2115-2118.

132. Giorgione J.R., Epand R.M. Role of water in protein kinase С catalysis and its binding to membranes. Biochemistry, 1997, v.36, p.2250-2256.

133. Лукашева Е.В., Айсина Р.Б., Казанская Н.Ф., Еремеев Н.Л. Свойства а-химотрипсина, ковалентно включенного в сферические гранулы из иолиакриламида. -Биохимия, 1980, т.45, с.449-454.

134. Plate N.A., Valuev L.I., Chupov У.У. The chemistry of macromonomers based on physiologically active substances and some problems of the synthesis of polymers for biomedical applications. Pure Appl.Chem., 1984, v.56, p.1351-1370.

135. Платэ H.A., Валуев Л.И., Синани В.А., Чупов В.В. Особенности иммобилизации модифицированных белков с использованием реакции сополимеризации. Биотехнология, 1987, № 3, с. 173-178.

136. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: «Высшая школа», 1977, 280 с.

137. Bender M.L., Clement G.E., Gunter C.R., Kezdy F.J. The kinetics of a-chymotrypsin reaction in the presence of added nucleophiles. J.Am.Chern.Soc., 1968, v.86, p.3697-3711.

138. Juodkazis S., Mukai N., Wakati R., Yamaguchi A., Matsuo S., Misawa H. Reversible phase transitions in polymer gels unduced by radiation forces. Nature, 2000, v.408, p.178-181.

139. Ratner B.R., Horbett Т., Hoffman A.S., Hauschka S.D. Cell adhesion to polymeric materials: implications with respect to biocompatibility. J.Biomed.Mater.Res., 1975, v.9, p.407-422.

140. Yamada N., Okano Т., Sakai H., Karikusa F., Sawasaki Y., Sakurai Y. Thermo-responsive polymeric surfaces; control of attachment and detachment of cultured cells. -Makromol.Chem., Rapid Commun., 1990, v.11, p.571-576.

141. Takezawa Т., Mori Y., Yoshizato K. Cell culture on a thermo-responsive polymer surface. Biotechnology, 1990, v.8, p.854-856.

142. Окапо Т., Yamada N., Sakai H., Sakurai H. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly(N-isopropylacrylamide. -J.Biomed.Mater.Res., 1993, v.27, p.1243-1251.

143. Grainer D.W., Nojiri С., Окапо Т., Kim S.W. In vitro and ex vivo platelet interactions with hydrophilic-hydrophobic poly(ethylene oxide)-polystyrene multiblock copolymers. J.Biomed.Mater.Res., 1989, v.23, p.979-1005.

144. Uchida K., Sakai K., Ito E., Kwon O.H., Kikuchi A., Yamato M., Окапо T. Temperature-dependent modulation of blood platelet movement and morphology on poly(N-isopropylacrylamide)-grafted surfaces. Biomaterials, 2000, v.21, p.923-929.

145. Amya Т., Hirokawa Y., Hirose Y., Li Y., Tanaka T. Reentrant phase transition of N-isopropyl acryl amide gels in mixed solvents. J.Chem.Phys., 1987, v.86, № 4, p.2375-2379.

146. Hirotsu Sh. Critical points of volume phase transition in N-isopropylacrylamide gels. J.Chem.Phys., 1988, v.88, № 1, p.427-431.

147. Schild H.G., Muthukumar M., Tirell D.A. Cononsolvency in mixed aqueous solutions of poly(N-isoprolpylacrylamide). Macromolecules, 1991, v.24, p.948-952.

148. Otake K., Inomata H., Konno M., Saito Sh. Thermal analysis of the volume phase transition with N-isopropylacrylamide gels. Macromolecules, 1990, v.23, p.283-290.

149. Winnik F., Ottaviami M.F., Bosmann S.H., Pan W., Garcia-Garibay M., Turro N.J. Cononsolvency of poly(N-isopropylacrylamide): a look at spin-labeled polymers in mixtures of water and tetrahydrofuran. Macromolecules, 1993, v.26, p.4577-4585.

150. Durand A., Hourdet D. Thermoassociative graft copolymers based on poly(N-isopropylacrylamide): effect of added co-solutes on the rheological behaviour. Polymer, 2000, v.41,p.545-557.

151. Zhu P.W., Napper D.H. Volume phase transitions of poly(N-isopropylacrylamide) latex particles in mixed water-N,N-dimethylformamide solutions. -Chem.Phys.Lett., 1996, v.256, p.51-56.

152. Zhou Sh., Fan Sh., Steve C.F.A., Wu C. Light-scattering studies of poly(N-isopropylacrylamide) in tetrahydrofuran and aqueous solution. Polymer, 1995, v.36, p.1341-1346.

153. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. Москва: Высшая школа, 1998, 478 с.

154. Гладилин А.К., Левашов А.В. Стабильность ферментов в системах с органическими растворителями. Биохимия, 1998, т.63, № 3, с.408-421.

155. Guinn R.M., Blanch H.W., Clark D.S. Effect of a water-miscible organic solvent on the kinetic and structural properties of trypsin. Enz.Microb.Technol., 1991, v. 13, p.320-326.

156. Timasheff S.N. Protein-solvent interactions and protein conformation. -Acc.Chem.Res., 1970, v.3, № 1, p.62-68.

157. Herskovits Т.Т., Jaillet Н. Structural stability and solvent denaturation of myoglobin. Science, 1969, v. 163, p.282-285.

158. Herskovits T.T., Gadegbeku В., Jaillet H. On the structural stability and solvent denaturation of proteins. J.Biol.Chem., 1970, v.245, № 10, p.2588-2598.

159. Herskovits T.T., Behrens C.F., Siuta P.B., Pandolfelli E.R. Solvent denaturation of globular protein. Unfolging by the monoalkyl- and dialkyl-substituted formamides and ureas. Biochim.Biophys.Acta, 1977, v.490, p.192-199.

160. Simon L.M., Kotorman M., Garab G., Laczko I. Structure and activity of a-chymotrypsin and trypsin in aqueous-organic media. Biochem.Biophys.Res.Commun., 2001, v.280, p.1367-1371.

161. Mares-Guia M., Figueiredo A.F. Trypsin-organic solvent interactions. The simultaneous operation of competative inhibition and dielectric effect. Biochemistry, 1972, v.11, № 11, p.2091-2098.

162. Rosell C.M., Vaidya A.M., Hailing P.J. Prediction of denaturing tendency of organic solvents in mixtures with water by measurement of naphtalene solubility. -Biochim.Biophys.Acta, 1995, v.1252, p.158-164.

163. Gekko K., Onmae E., KameyamaK., Talcagi T. Acetonitrile-protein interactions: amino acids solubility and preferential solvation. Biochim.Biophys.Acta, 1998, v.1387, p.195-205.

164. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. A molecular dynamics and quantum mechanics analysis of the effect of DMSO on enzyme structure and dynamics: subtilisin. -J.Am.Chem.Soc., 1996, v.118, p.4175-4180.

165. Fink A.L. The trypsin-catalyzed hydrolysis of N-benzyloxycarbonyl-L-lysine p-nitrophenyl ester in dimethylsulfoxide at sub-zero temperatures. J.Biol.Chem., 1974, v.249, № 16, p.5027-5032.

166. Fernandez M.M., Clark D.S., Blanch H.W. Papain kinetics in the presence of a water-miscible organic solvent. Biotechnol.Bioeng., 1991, v.37, p.967-972.

167. Tomiuchi Y., Kijima Т., Kise H. Fluorescence spectroscopic study of a-chymotrypsin as relevant to catalytic activity in aqueous-organic media. -Bull.Chem.Soc.Jpn., 1993, v.66,№ 1, p. 1176-1181.

168. Kijima Т., Yamamoto Sh., Kise H. Study on tryptophan fluorescense and catalytic activity of a-chymotrypsin in aqueous-organic media. Enz.Microb.Technol., 1996, v.18, p.2-6.

169. Griebenow K., Klibanov A.M. On protein denaturation in aqueous-organic mixtures but not in pure ogranic solvent. J.Am.Chem.Soc., 1996, v.47, p. 11695-11700.

170. Шевченко A.A., Кост O.A. Метод расчета доступности растворителю ароматических аминокислотных остатков белков в водно-органических смесях. -Биохимия, 1996, т,61, № 12, с.2092-2098.

171. Клячко H.JL, Богданова Н.Г., Кольтовер В.К., Мартинек К., Левашов А.В. Взаимосвязь активности и конформационной подвижности а-химотрипсина в системах обращенных мицелл. Биохимия, 1989, т.54, № 7, с. 1224-1230.

172. Kidd R.S., Sears P., Huang D.H., Witte К., Wong C.H., Farber G.K. Breaking the low barrier hydrogen bond in a serine protease. Protein Sci., 1999, v.8, № 2, p.410-417.

173. Deschrevel В., Vincent J.C., Thellier M. Kinetic study of the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis and synthesis of a peptide bond in a monophasic aqueous/organic reaction medium. Arch.Biochem.Biophys., 1993, v.304, № 1, p.45-52.

174. Tanizawa K., Bender M.L. The application of insolubilized a-chymotrypsin to kinetic studies on the effect of aprotic dipolar organic solvents. J.Biol.Chem., 1974, v.249, № 7, p.2130-2134.

175. Faller L, Sturtevant J.M. The kinetics of the a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of p-nitrophenyl acetate in organic solvent-water mixtures. J.Biol.Chem., 1966, v.241, № 21, p.4825-4834.

176. Maurel P. Relevance of dielectric constant and solvent hydrophobicity to the organic solvent effect in enzymology. J.Biol.Chem., 1978, v.253, № 5, p.1677-1683.

177. Мосолов В.В., Соколова Е.В. Взаимодействие гликолей и глицерина с активным центром трипсина и химотрипсина. ДАН СССР, 1972, т.207, № 1, с.228-231.

178. Fink A.L. Effect of dimethyl sulfoxide on the interaction of proflavine with a-chymotrypsin. Biochemistry, 1974, v. 13, № 2, p.277-280.

179. Clement G.E., Bender M.L. The effect of aprotic dipolar organic solvents on the kinetics of a-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis. Biochemistry, 1963, v.2, N° 4, p.836-843.

180. Kassera H.P., Laidler K.J. Transient-phase studies of a trypsin-catalyzed reaction. Can.J.Chem., 1970,v.48,№ 12, p.1793-1802.

181. Seydoux F, Yon J. Competition nucleophile dans les reactions d'hydrolyse enzymatique. Analyse et application a l'hydrolyse trypsique de quelques esters. -Eur.J.Biochem., 1967, v.3, p.42-56.

182. Seydoux F., Yon J, Nemethy G. Hydrophobic interactions of some alcohols with acyl trypsins. Biochim.Biophys.Acta, 1969, v.171, № 1, p.145-156.

183. Seydoux F. Mise en evidence cinetique d'une transesteriflcation au cours de l'hydrolyse trypsique de Tester ethylique de la lysine en presence de divers alcools. -BiochimBiophys.Acta, 1967, v. 149, p.544-552.

184. Березин И.В., Казанская Н.Ф., Клесов А.А. Кинетика реакций гидролиза, катализируемых а-химотрипсином и трипсином в присутствии дополнительных нуклеофильных агентов. Биохимия, 1971, т.36, № 1, с. 108-117.

185. Tomiuchi Y., Ohishima K., Kise H. Enzymatic reactions in aqueous-organic media. XVII. Optical resolution of amino acids esters by enzymatic hydrolysis in organic solvents. BuIl.Chem.Soc.Jpn., 1992, v.65, p.2599-2603.

186. Будтов В. П. Физическая химия растворов полимеров. С.-П.: Химия, 1992,с. 53.

187. Шерстюк С.Ф., Галаев И.Ю., Савицкий А.П., Кирш Ю.Ф., Березин И.В. Поливинилкапролактам обратимо осаждаемый термополимер. Соосаждение белков. -Биотехнология, 1987, № .3, с. 179-183.

188. Home R.A., Almeida J.P., Day A.F., Yu N.-T. Macromolecule hydration and the effect of solutes on the cloud point of aqueous solutions of poly(vinyl-methyl) ester. -J.Coll.Interface Sci., 1971, v.35, p.77-85.

189. Bae Y.C., Lambert S.M., Soane D.S., Prausnitz J.M. Cloud point curves of polymer solutions from thermooptical measurements. Macromolecules, 1990, v.24, p.4403-4407.

190. Karlstrom G. A new model for upper and lower critical solution temperatures in poly(ethyleneoxide) solutions. J.Phys.Chem., 1985, v.89, p.4962-4964.

191. Afroze F., Nies E., Berghmans H. Phase transition in the system poly(N-isoropylacrylamide)/water and swelling behaviour of the corresponding networks. -J.Mol.Struct., 2000, v.554, p.55-68.

192. Hrouz J., Ilavsky M., Ulbrich K., Kopecek J. The photoelastic behavior of dry and swollen networks of poly(N,N'-diethylacrylamide) and its copolymer with N-tretbutylacrylamide. -Eur.Polym.J., 1981, v.17, p.361-366.

193. Eliassaf J. Aqueous solutions of poly(N-isopropylacrylamide). -J.Appl.Polym.Sci., 1978, v.22, p.873-874.

194. Chiantore O., Guaita M., Trossarelli L. Solution properties of poly(N-isopropylacrylamide). Macromoi.Chem., 1979, v.180, p.969-973.

195. Schild H.G., Tirrell D.A. Microcalorimetric detection of lower critical solution temperatures in aqueous polymer solutions. J.Phys.Chem., 1990, v.94, p.4352-4356.

196. Varga I., Gilanyi Т., Meszaros R., Filipcsei G., Zrinyl M. Effect of cross-link density on the internal structure of poly(N-isopropylacrylamide) microgels. J.Chem.Phys., 2001, v.105 (B), p.9071-9076.

197. Senff H., Richtering W. Influence of cross-link density on rheological properties of temperature-sensitive microgel suspensions. Coll.Polym.Sci., 2000, v.278, p.830-840.

198. Казанский K.C., Архипович M.B., Афанасьева M.B., Дубровский С.А., Кузнецова В.И. Особенности набухания гидрогелей полиэтиленоксида. -Высокомол.Соед., 1993, т.35 (А), с.850-856.

199. Sayil С., Okay О. The effect of preparation temperature on the swelling behavior of poly(N-isopropylacrylamide) gels. Polym.Bull., 2000, v.45, p. 175-182.

200. Kayaman N., Kazan D., Erarslan A., Okay O., Bayzal B. Structure and protein separation efficincy of poly(N-isopropylacrylamide) gels: effect of synthesis conditions. -J.Appl.Polym.Sci., 1998, v.67, p.805-814.

201. Shin-ichi Т., Suzuki K., Nirisuye Т., Shibayama M. Dependence of shrinking kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) gels on preparation temperature. Polymer, 2002, v.43, p.3101-3107.

202. Gong J.P., Kurokawa Т., Narita Т., Kagata G., Osada Y., Nishimura G., Kinjo M. Synthesis of hydrogels with extremely low surface friction. J.Am.Chem.Soc., 2001, v.123, p.5582-5583.

203. Ivanov A.E., Galaev I.Yu., Kazakov S.V., Mattiasson B. Thermosensitive copolymers of N-vinylimidazole as displacers in immobilized metal affinity chromatography. J.Chrom., 2001, v.907 (A), p.115-130.

204. Suwa K., Wada Y., Kishida A., Akashi M. Synthesis and functionalities of poly(N-vinylalkylamide). VI. A novel thermosensitive hydrogel crosslinked poly(N-vinylisobutyramide). J.Polym.Sci., Part A: Polym.Chem., 1997, v.35, p.3377-3384.

205. Seker F., Ellis A.B. Correlation of chemical structure and swelling behavior in N-alkylacrylamide hydrogels. J.Polym.Sci., Part A: Polym.Chem., 1998, v.36, p.2095-2102.

206. Ikehata A., Ushiki H. Effect of salt on the elastic modulus of poly(N-isopropylacrylamide) gels. Polymer, 2002, v.43, p.2089-2094.

207. Kato N., Sakai Y., Takahashi F. Saccharide effect on the deswelling process of the thermosensitive poly(N-isopropylacrylamide) gel. Bull.Chem.Soc.Jpn., 2001, v.74, p.2025-2030.

208. Kunugi S., Yamazaki Y., Takano K., Tanaka N., Akashi M. Effect of ionic additives and ionic comonomers on the temperature and pressure responsive behavior of thermosensitive polumers in aqueous solutions. Langmuir, 1999, v. 15, p.4056-4061.

209. Daly E., Saunders B.R. Study of the effect of electrolyte on the swelling and stability of poly(N-isopropylacrylamide) microgel dispersions. Langmuir, 2000, v. 16, p.5546-5552.

210. Annako M., Motokawa K., Sasaki S., Nakahira Т., Kawasaki H., Maeda H. Salt-induced volume phase transition of poly(bf-isopropylacrylamide) gel. J.Chem.Phys., 2000, v.113, p.5980-5985.

211. Fang Y., Qiang J.-C., Hu D.-D., Wang M.-Z., Cui Y.-L. Effect of urea on the conformational behavior of poly(N-isopropylacrylamide). Coll.Polym.Sci., 2001, v.279, p.14-21.

212. Cornish-Bowden A. Fundamentals of Enzyme Kinetics. Portland Press Ltd., London, 1999, 343 p.

213. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Фаир-Пресс, 1999, с.205-215.

214. Shechter I., Berger А. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1967, у.21, р.157-162.

215. Tozser J., Szabo G., Pozsgay M., Aurell L., Elodi P. Active center studies on bovine pancreatic chymotrypsin with tripeptidyl-p-nitroanilide substrates. Acta Biochim.Biophys.Hung., 1986, v.21, № 4, p.335-348.

216. Brady K., Abeles R.H. Inhibition of chymotrypsin by peptidyl trifluoromethylketones: determinants of slow-binding kinetics. Biochemistry, 1990, v.29, p.7608-7617.

217. Клесов А.А., Цетлин В.И. Роль структурных факторов в реакциях олигопептидных субстратов и ингибиторов с а-химотрипсином. Биоорган.Химия, 1977, т.З, с. 1523-1538.

218. Wells G.B., Mustafi D., Makinen M.W. Structure at the active site of an acylenzyme of a-chymotrypsin and implications for catalytic mechanism. An electron nuclear double resonance study. J.Biol.Chem., 1994, v.269, № 6, p.4577-4586.

219. Segal D.M., Powers J.C., Cohen G.H. Stereochemistry of substrate binding to chymotrypsin AY. Biochemistry, 1971, v. 10, p.3728-3737.

220. Desie G., Boens N., De Schryver F.C. Study of the time-resolved tryptophan fluorescence of crystalline a-chymotrypsin. Biochemistry, 1986, v.25, p.8301-8308.

221. Birktoft J.J., Blow D.M. Structure of crystalline a-chymotrypsin. V. The atomic structure of tosyl-a-chymotrypsin at 2 A resolution. J.Mol.Biol., 1972, v.68, p. 187-240.

222. Colleti-Preveiro M.A., Preveiro A., Zuckerlcandl E. Separation of the proteolytic and esterasic activity of trypsin by reversible structural modifications. J.Mol.Biol., 1969, x.39, p.493-501.

223. Клесов А.А. Природа субстратной специфичности трипсина. Роль заряда и гидрофобности боковой цепи в определении реакционной способности специфических субстратов. Биоорган.Химия, 1977, т.З, с.1100-1110.

224. Mares-Guia М., Shaw Е, Cohen W. Studies of the active center of trypsin. Further characterization of the hydrophobic binding site. J.Biol.Chem., 1967, v.242, p.5777-5781.

225. Krieger M., Kay L.M., Dickerson R.E. The structure and specific binding of trypsin: comparison of inhibited derivatives and a model for substrate binding. J.Mol.Biol., 1974, v.83, p.209-230.

226. Водородная связь (ред. Н.Д.Соколов). М.: Наука, 1989.

227. Frey Р.А, Whitt S.A., Tobin J.B. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases. Science, 1994, v.264, p.1927-1930.

228. Markley J.L., Westler W.M. Protonation-state dependence of hydrogen bond strengths and exchange rates in a serine proteases catalytic triads: bovine chymotrypsinogen A. Biochemistry, 1996, v.35, p. 11092-11097.

229. Cassidy C.S., Lin J., Frey P.A. The deuterium isotope effect on the NMR signal of the low-barrier hydrogen bond in a transition-state analog complex of chymotrypsin. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 2000, v.273, p.789-792.

230. Cleland W.W. Low-barrier hydrogen bonds and low fractionation factor bases in enzymatic reactions. Biochemistry, 1992, v.31, p.317-319.

231. Cleland W.W., Rreevoy M.M. Low-barrier hydrogen bonds and enzymic catalysis. Science, 1994, v.264, p. 1887-1890.

232. Ash E., Sudmeier J.L., De Fabo E.C, Bachovchin W.W. A low-barrier hydrogen bond in the catalytic triad of serine proteases? Theory versus experiment. Science, 1997, v.278, p.1128-1130.

233. Warshel A., Papazyan A., Kollman P.A. On low-barrier hydrogen bonds and enzyme catalysis. Science, 1995, v.269, p.102-105.

234. Cassidy C.S., Lin J., Frey P.A. A new concept for the mechanism of action of chymotrypsin: the role of the low-barrier hydrogen bond. Biochemistry, 1997, v.36, p.4576-4584.

235. Lin J., Cassidy C.S., Frey P.A. Correlations of the basicity of His57 with transition state analogue binding, substrate specificity, and the strength of the low-barrier hydrogen bond in chymotrypsin. Biochemistry, 1998, v.37, p. 11940-11948.

236. Голубев H.C., Гиндин В.А., Лигай С.С., Смирнов С.Н. Исследование водородных связей в "каталитической триаде" трипсина по спектрам ЯМР на ядрах

237. С и I5N. Биохимия, 1994, т.59, № 5, с.613-624.

238. Gerlt J.A., Gassman P.G. Understanding the rate of certain enzyme-catalyzed reactions: proton abstraction from carbon acids, acyl-transfer reactions and displacement reactions ofphosophodiesters. Biochemistry, 1993, v.32, p. 11943-11952.

239. Tsilikounas E., Rao Т., Gutheil W.G., Bachovchm W.W. 15N and 'Н spectroscopy of the catalytic histidine in chloromethyl ketone-inhibited complexes of serine proteases. Biochemistry, 1996, v.35, p.2437-2444.

240. Braxton S., Wells J.A. The importance of a distal hydrogen bonding group in stabilizing the transition state in subtilisin BPN\ J.Biol.Chem., 1991, v.266, № 18, p.l 179711800.

241. Mao Q., Walde P. Substrate effects on the enzymatic activity of a-chymotrypsin in reverse micelles. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1991,v.l78, № 3, p.1105-1112.

242. Simon L.M., Laszlo К., Vertesi A., Bagi K., Szajani B. Stability of hydrolytic enzymes in water-organic cosolvent system. J.Mol.Catalysis, Part B: Enzymology, 1998, v.4, p.41-45.

243. Marlcvicheva E.A., Tkachuk N.E., Kuptsova S.V., Dugina T.N., Strukova S.M., Kirsh Yu.E., Zubov V.P., Rumsh L.D. Stabilization of proteases by entrapment in a new composite hydrogel. Appl.Biochem.Biotechnol., 1996, v.61, p.75-84.

244. ICise H., Tomiuchi Y. Unusual solvent effect on protease activity and effective optical resolution of amino acids by hydrolytic reactions in organic solvents. -Biotechnol.Lett., 1991, v.13, p.317-322.

245. Miles J.L., Morey E., Crain F., Gross S., San Julian J., Canady W.J. Inhibition of a-chymotrypsin by diethyl ether and certain alcohols: a new type of competitive inhibition. -J.Biol.Chem., 1962, v.237, № 4, p. 1319-1322.

246. Stein B.R., Laidler K.J. Kinetics of the inhibition of a-chymotrypsin by methanol and DFP. Can.J.Chem., 1959, v.37, p.1272-1277.

247. Salvador D., Sinisterra J.Y., Guisan J.M. Organic reactions catalyzed by insolubilized enzymes; peptide synthesis catalyzed by insolubilized a-chymotrypsin. -J.Mol.Catalysis, 1990, v.62, p.93-105.

248. Lee A.G. Lipid phase transition and phase diagrams. I. Lipid phase transition. -Biochim.Biophys.Acta, 1977, v.472, p.237-281.

249. Froud R.C., Earl C.R.A., East J.M., Lee A.G. Effect of lipid fatty acyl chain structure on the activity of the (Ca2+ and Mg2+)-dependent ATPase. Biochim.Biophys.Acta, 1986, v.860, p.354-360.

250. Lee A.G. Fluorescence studies of chlorophyll incorporated into lipid mixture and the interpretation of "phase" diagrams. Biochim.Biophys.Acta, 1975, v.413, p.11-23.

251. East J.M., Lee A.G. Lipid selectivity of the (Ca2+ and Mg2+)-dependent Atpase studied with fluorescence quenching by a brominated phospholipid. Biochemistry, 1982, v.21,p.4144-4151.

252. Clark P.E., Moscarello M.A. The modulating effects of lipids on purified rat liver Golgi galactosyltransferase. Biochim.Biophys. Acta, 1986, v.859, p.143-150.

253. Blok M.C., Van Der Neut-Kok E.C.M., Van Deenen L.L.M., De Grier J. The effect of chain length and lipid phase transition on the selective permeability properties of liposomes. -Biochim.Biophys.Acta, 1975, v.406, p.187-196.

254. Lee A.G., Birdsall N.J.M., Metcalfe J.C., Toon P.A., Warren G.B. Clusters in lipid bilayers and the interpretation of thermal effects in biological membranes. -Biochemistry, 1974, v.13, p.3699-3705.

255. Warren G.B., Toon P.A., Birdsall N.J.M. Reversible lipid transitions of the activity of pure ATPase-lipid complexes. Biochemistry, 1974, v.13, p.5501-5510.

256. Upreti G.C., Jain M.K. Action of phospholipase A2 on unmodified phosphatidylcholine bilayers: organizational defects are preferred sites of action. -J.Membr.Biol., 1980, v.55, p. 113-121.

257. Mitranic M.M., Moscarello M.A. The influence of various lipids on the activity of bovine milk galactosyltransferase. Can.J.Biochem., 1980, v.58, p.809-814.

258. Raison J.K., Lions J.M., Tomson W.W. The influence of membranes on the temperature induced changes in the kinetics of some respiratory enzymes in mitochondria. -Arch.Biochem.Biophys., 1971, v.142, p.83-90.

259. Inesi G. Active transport of calcium ion in sarcoplasmic membranes. -Ann.Rev.Biophys.Bioeng., 1972, v.l,p.191-210.

260. Davis D.G., Inesi G., Gulik-Krzywiski T. Lipid molecular motion and enzyme activity in sarcoplasmic reticulum membrane. -Biochemistry, 1976, v.15, p.1271-1276.

261. East J.M., Jones O.T., Simmonds A.C., Lee A.G. Membrane fluidity is not an important physiological regulator of the (Ca2+ and Mg2+)-dependent ATPase of sarcoplasmic reticullum. J.Biol.Chem., 1984, v., p.8070-8071.

262. Mookerjea S. Effect of Lysolectine in solubilized membrane-bound glycosyltransferrase. Can.J.Biochem., 1979, v.57, p.66-71.

263. Wozniak M., Kossowska E., Purzycka-Preis J., Zydowo M.M. The influence of phosphatidate bilayers on pig heart AMP-deaminase. Biochem.J., 1988, v.255, p.977-981.

264. Ratnam S., Fraser I.H., Mookerjea S. Effect of phosphatidylinositol and phosphatidylserine on membrane-bound galactosyltransferase. Can.J.Biochem., 1980, v.58, p.58-66.

265. Watson K., Bertoli E., Griffiths D.E. Phase transition in yeast mitochondria membranes. The effect of temperature on the energies of activation of the respiratory enzymes of Saccharomices cerevisiae, Biochem.J., 1975, v. 146, p.401-407.

266. Grishan C.M., Barnett R.E. The role of lipid phase transition in the regulation of the (Na+ and K") adenosine triphosphatase. Biochemistry, 1973, v.12, p.2635-2637.

267. Mabrey S., Powis G., Schenlonan J.B., Tritton T.R. Calorimetric study of microsomal membrane. J.Biol.Chem., 1977, v.252, p.2929-2933.

268. Houselay M.D., Palmer R.W. Changes in the form of Arrhenius plots of the activity of glucagons-stimulated adenylate cyclase and other hamster liver plasma-membrane enzymes occurring on hibernation. Biochem.J., 1978, v. 174, p.909-919.

269. Хургин Ю.И., Максарева Е.Ю., Завизион В.А. Влияние мочевины на структуру и функциональную активность белков. Химотрипсиноген А и а-химотрипсин. Изв. АН, Сер. Хим., 1996, №4, с.998-1002.

270. Dhara D., Chatterji P.R. Effect of hydrotropes on the volume phase transition in poly(N-isopropylacrylamide) hydrogel. -Langmuir, 1999, v.15, p.930-935.

271. Aoki Т., Nishimura Т., Sanui K., Ogata N. Phase-transition changes of poly(N-(S)-sec-butylacrylamide-co-N-isopropylacrylamide) in response to amino acids and its chiral recognition. React.Func.Polym., 1998, v.37, p.299-303.

272. Yoo M.K., Sung Y.K., Lee Y.M., Cho C.S. Effect of polyelectrolyte on the lower critical solution temperature of poly(N-isopropyl acrylamide) in the poly(NIPAAM-co-acrylic acid) hydrogel. Polymer, 2000, v.41, p.5713-5719.

273. Mylonas Y., Staikos G., Lianos P. Investigation of the poly(N-isopropylacry;amide)-sodium dodecyl sulfate complexation with viscosity, dialysis, and time-resolved fluorescence-quenching measurements. Langmuir, 1999, v.15, p.7172-7175.

274. Jean В., Lee L.-T., Cabanca B. Interactions of sodium dodecyl sulfate with acrylamide-N-isopropylacrylamide statistical copolymer. Coll.Polym.Sci., 2000, v.278, p.764-770.

275. Garret-Flaudy F., Freitag R. Influence of small uncharged but amphiphilic molecules on the lower critical solution temperature of highly homogeneous N-alkylacrylamide oligomers. J.Polym.Sci, Part A: Polym.Chem., 2000, v.38, p.4218-4229.

276. Collier Т.О., Anderson J.M., Kikuchi A., Okano T. Adhesion of monocytes, macrophages and foreign body giant cells on poly(N-isopropylacrylamide) temperature-responsive surfaces. J.Biomed.Mat.Res., 2002, v.59, p. 136-143.

277. Cunhffe D„ Smart C.A, Tsibouklis J., Young S., Alexander C., Vulfson E.N. Bacterial adsorption to thermoresponsive polymer surfaces. Biotechnol.Lett, 2000, v.22, p.141-145.

278. Choi S.H., Yoon J.J., Park T.G. Galactosylated poly(N-isopropylacrylamide) hydrogel submicrometer particles for specific cellular uptake within hepatocytes. -J.Coll.Interface Sci., 2002, v.251, p.57-63.

279. Chen J.P, Yang H.J., Hoffman A.S. Polymer-protein conjugates. I. Effect of protein conjugation on the cloud point of poly(N-isopropylacrylamide). Biomaterials, 1990, v.l 1, p.625-630.

280. Dilgimen A.S., Mustafaeva Z, Demchenlco M., Kaneko Т., Osada Y., Mustafaev M. Water-soluble covalent conjugates of bovine serum albumin with anionic poly(N-isopropyl-acrylamide) and their immunogenecity. Biomaterials, 2001, v.22, p.2383-2392.

281. Chilkoti A., Chen G., Stayton P.S., Hoffman A.S. Site-specific conjugation of a temperature-sensitive polymer to a genetically-engineering protein. Bioconjug.Chem, 1994, v.5, p.504-507.

282. Ding Z., Chen G., Hoffman A.S. Synthesis and purification of thermally sensitive oligomer-enzyme conjugates of poly(N-isopropylacrilamide)-trypsin. Bioconjug.Chem,1996, v.7, p.121-125.

283. Bromberg L. Zein-poly(N-isopropylacrylamide) conjugates. J.Phys.Chem,1997, v.101 (B), p.504-507.

284. Zhu Q.-Z, Liu F, Li D.-H, Xu J.-G, Su W, Huang J. A novel polymer-mimetic enzyme immunoassay system based on thermal phase separating technique. -Anal.Chim.Acta, 1998, v.375, p.177-185.

285. Yang H.-Y, Zhu Q.-Z., Li D.-H., Chen L.-X., Ding M.-T., Xu J.-G. New mimetic enzymatic sandwich immunoassay system using oligo(N-isopropylacrylamide) with an active terminal group as a separating support. Anal.Chim.Acta, 2001, v.435, p.265-272.

286. Mi J., Gao J., Li Y., Chang W., Ci Y. Ricin determination by temperature controlled phase-separation immunoassay. Anal.Lett., 2001, v.34, p.1143-1151.

287. Valuev L.I, Zefirova O.N, Obydennova I.V, Plate N.A. Targeted delivery of drugs provided by water-soluble polymeric systems with low critical solution temperature. -J.Bioact.Compat.Polym, 1994, v.9, p.55-65.

288. Kato N, Samejima S, Takahashi F. Isomaltose synthesis in the reversed hydrolysis catalyzed by amyloglucosidase immobilized in the thermosensitive gel. -Mat.Sci.Eng, 2001, v.17 (C), p.155-160.

289. Lippard S.J. At last the crystal structure of urease. - Science, 1995, v.268, p.996-1004.

290. Linn K.R. Some properties and purifications of urease. Biochim,Biophys.Acta, 1967, v.146, p.205-218.

291. Mobley H.L.T, Hausinger R.P. Microbial ureases: significance, regulation, and molecular characterization. Microbiol.Rev, 1989, v.53, p.85-108.

292. Moyo C.C., Kissel D.E, Cabrera M.L. Temperature effects on soil urease activity. Soil Biol.Biochem, 1989, v.21, p.935-938.

293. Lakshminarayanaiah N. Transport Phenomena in Membranes. Academic Press, New York-London, 1969.

294. Demirel G., Akovali G., Tanyolac A., Hasirci N. A comparative study of the performance of solid supported and soluble urease for the enzymatic hydrolysis of urea. -J.Chem.Technol.Biotechnol., 1992, v.55, p.319-323.

295. Yonese M., Murabayashi H., Kishimoto H. Diffusion-reaction of urea through multimembrane containing urease effects of microenvironments around urease and asymmetry of the membrane. - J.Membr.Sci., 1990, v.54, p.145-162.

296. Хургин Ю.И., Росляков В.Я. Изучение твердофазного гидролиза циннамоилхимотрипсина. Биохимия, 1972, т.37, с.485-491.

297. Хургин Ю.И., Максарева Е.Ю. Твердофазные ферментативные реакции. IV. Гидролиз fi-индолилакрилоил-а-химотрипсина. Биоорган.Химия, 1993, т.19, с.961-967.

298. Dixit S., Crain J., Poon W.C.K., Finney J.L., Soper A.K. Molecular segregation observed in a concentrated alcohol-water solution. Nature, 2002, v.416, p.829-832.

299. Costa R.O.R., Freitas F.S. Phase behaviour of poly(N-isopropylacrylamide) in binary aqueous solutions. Polymer, 2002, v.43, p.5879-5885.

300. Купцова С.В. Получение, свойства и применение композитных полимерных гидрогелей с иммобилизованными белками и пептидами. Дис.канд.хим.наук, М., ИБХ РАН, 2000.

301. Cicelc Н., Tuncel A. Immobilization of a-chymotrypsin in thermally reversible isopropyl-acrylamide hydroxyethylmethacrylate copolymer gel. - J.Polym.Sci., Part A: Polym.Chem., 1998, v.36, p.543-552.

302. Responsive Gels: Volume Transitions I (Dusek, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin,1993.

303. Responsive Gels: Volume Transitions II (Dusek, K., ed.), Springer-Verlag, Berlin: 1993.

304. Галаев И.Ю. Термореактивные гели в биотехнологии и медицине. -Биохимия, 1994, т.59, с.1478-1482.

305. Hydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications (R.M.Ottenbrite, S J.Huang, K.Park, Eds.), ACS, Washington, USA, 1996.

306. Kaetsu I. Stimuli-sensitive hydrogels. in: Polysaccharides in Medical Applications (D.Severian, Ed.), Marcel Dekker, Inc., New-York, USA, 1996, p.243-262.

307. Galaev I.Y., Mattiasson B. 'Smart' polymers and what they could do in biotechnology and medicine. TIBTECH, 1999, v. 17, p.335-340.

308. Monji N., Hoffman A.S. A new diagnostic system based on polymer-antibody conjugates. Appl.Biochem.Biotechnol., 1987, v. 14, p. 107-112.

309. Monji H.J., Cole C.A., Tam M., Goldstein L., Nowinski R.C., Hoffman A.S. Application of thermally reversible polymer-antibody conjugate in a novel membrane-based immunoaasay. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1990, v. 172, p.652-660.

310. Morris J.E., Hoffman A.S., Fisher R.R. Affinity precipitation of proteins by polyligands. Biotechnol.Bioeng., 1993, v.41, p.991-997.

311. Chen J.P., Hoffman A.S. Polymer-protein conjugates. 2. Affinity precipitation of human immunogammaglobulin by a poly(N-isopropylacrylamide)-protein A conjugate. -Biomaterials, 1990, v.11, p.632-634.

312. Heligman-Rim R., Hirshberg Y., Fisher E. Photochromisrn in spiropyranes. IV. Evidence for the existence of several forms of the colored modification. J.Chem.Phys., 1962, v.66, p.2465-2470.

313. Heligman-Rim R., Hirshberg Y., Fisher E. Photochromism in spiropyranes. V. The mechanism of phototransformation. J.Chem.Phys., 1962, v.66, p.2470-2477.

314. Bertelson R.C. Photochromic processes involving heterogeneous cleavage. in: Photochromism (G.H.Brown, Ed.), Wiley-Interscience, New York, London, Sydney, Toronto, 1971, p.49-454.

315. Calvert J.C., Pitts J.N. Jr. Photochemistry. John Wiley and Sons, Inc., New York, London, Sydney, 1966,487 p.

316. Alonso M., Reboto V., Guisgardo L., San Martin A., Rodriguez-Cabello J.C. Spiropyran derivative of an elastin-like bioelastic polymer: photoresponsive molecular mashine to convert sunlight into mechanical work. Macromolecules, 2000, v.33, p.9480-9482.

317. Flodin P., Gelotte В., Porath J. A method of concentrating solutes of high molecular weight. Nature, 1960, v. 188, p.493-494.

318. Fewsett J.S., Morris C.J.O.R. Molecular-sieve chromatography of proteins on granulated polyacrylamide gels. Separ.Sci., 1966, v.l, p.9-17.

319. Cussler E.L., Stokar M.R., Vaaberg J.E. Gels as size selective extraction solvents. AIChEJ., 1984, v.30, p.578-582.

320. Gehrke S.H., Andrews G.P., Cussler E.L. Chemical aspects of gel extraction. -Chem.Eng.Sci., 1986, v.41, p.2153-2160.

321. Park C.H., Hoffman A.S. Concentrating cellulases using a temperature-sensitive hydrogel: effect of gel particle size and geometry. Biotechnol.Prog., 1993, v.9, p.640-646.

322. Trank S.J., Johnson D.W., Cussler E.L. Isolated soy protein production using temperature-sensitive gels. Food Technol., 1989, v.43, p.78-83.

323. Huang X., Akehata Т., Unno H., Hirasa O. Dewatering of biological slurry by using water-absorbent polymer gel. Biotechnol.Bioeng., 1989, v.34, p. 102-109.

324. Дубровский С.А., Казанский К.С. Термодинамические основы применения сильнонабухающих гидрогелей в качестве влагосорберов. Высокомол.Соед., 1993, т.35 (Б), № 10, с.1712-1721.

325. Richards E.G., Temple C.J. Some properties of polyacrylamide gels. -Natur.Phys.Sci., 1971, v.230, p.92-98.

326. Tse P.H.S., Gough D.A. Transient response of an enzyme electrode sensor for glucose. Anal.Chem., 1987, v.59, p.2339-2344.

327. Li J.R., Cai M., Chen T.F., Jiang L. Enzyme electrodes with conductive polymer membranes and Langmuir-Blodgett films. Thin Solid Films, 1989, v.180, p.205-210.

328. Galiatsatos G., Ikariyama Y., Mark J.E., Heineman W.R. Immobilization of glucose oxidase in a poly(vinyl alcohol) matrix on platinized graphite electrodes by gamma-radiation. Biosens.Bioelectron., 1990, v.5,p.47-61.

329. Gass A.E.G., Davie G., Francis G.D., Hill H.A.O. Ferrocene-mediated enzyme electrode for amperometric determination of glucose. Anal.Chem., 1984, v.56, p.667-671.

330. Abu Bakar I., Tetsuro H, Tatsuo Y, Hiroshi I, Schohning M.J., Luth H. Investigation of pulsed laser deposited AI2O3 as a high pH sensitive layer for LAPS based biosensing applications. Sensors & Actuators, Part В: Chem, 2000, v.71, p. 169-172.

331. Yicong W, Pung W, Xuesong Y, Qingtao Z,, Rong L, Wiemnin Y, Xiaoxiang Z. A novel microphysiometer based on MLAPS for drugs screening. Biosens.Bioelectron, 2001, v,16,p.277-286.

332. Pogossian A, Yoshinobu T, Simons A, Ecken H., Luth H., Schoning M.J. Penicillin detection by means of field-effect based sensors: EnFET, capacitive EIS sensors or LAPS? Sensors & Actuators, B: Chem, 2001, v.78, p.237-242.

333. Nicolini C. From neural chip and engineering biomacromolecules to bioelectronic devices: An overview. Biosens.Bioelectron, 1995, v.10, p.105-128.

334. Lipton R. DNA solutions of hard computational problems. Science, 1995, v.268, p.542-545.

335. Liu Q, Wang L, Frutos A.G, Condon A.E, Corn R.M, Smith L.M. DNA computing on surfaces. Nature, 2000, v.403, p. 175.

336. Benenson Y, Paz-Elizur T, Adar R, Keinan E., Livneh Z., Shapiro E. Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. Nature, 2001, v.414, p.430-434.

337. Adleman L. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. -Science, 1994, v.266, p.1021-1024.

338. Phadke P.S, Sonawat H.M, Govil G. Biomolecular electronics using coenzymes immobilized on solid supports- J.Mol.Electron., 1988, v.74, p.S67-S74.

339. Емельянов C.B, Рамбиди Н.Г, Максимычев A.B. Тенденции и пути развития средств переработки информации на молекулярном уровне. -Биомолекулярная информатика, М.: МНИИПУ, 1990, 133 с.

340. Ashkenasi G, Ripoll D.R, Lotan N, Scheraga H.A. A molecular switch for biochemical logic gates: conformational studies. Biosens.Bioelectrom, 1997, v. 12, p.85-95.

341. Taylor R.F. Protein Immobilization. Marcel Dekker, Inc., New York. 1992.

342. Karube I, Nakamoto Y, Suzuki S. Photocontrol of urease activity in spiropyran-collagen membrane Biochim.Biophys.Acta, 1976, v.445, p.774-779.

343. Nakamoto Y, Nishida M. Photocontrol of immobilized enzyme activity -Biotechnol.Bioeng, 1977, v. 19, p. 1115-1123.

344. Karube I, Matsuolca H, Yamazaki M, Suzuki S. Photocontrol of organic synthesis using immobilized enzyme. Nippon Kagaku Kaishi, 1983, v 9, p.1329-1335.

345. Valleton J.-M. Biophysico-chemical systems and information processing. -J.Mol.Electron, 1988, v.4, p.S75-S81.

346. Albin G.W, Horbett T.A, Miller S.R, Ricker N.L. Theoretical and experimental studies of glucose sensitive membranes. J.Control.Release, 1987, v.6, p.267-291.

347. Kost J, Horbett T.A, Ratner B.D, Singh M. Glucose sensitive membranes containing glucose oxidase: activity, swelling and permeability studies. J.Biomed.Mater.Res, 1985, v.19, p.l 117-1133.

348. Chung D.J, Ito Y, Imanishi Y. An insulin-releasing membrane system on the basis of oxidation reaction of glucose. J.Control.Release, 1992, v. 18, p.45-54.

349. Graziano G. On the temperature-induced coil to globule transition of poly-N-isopropylacrylamide in dilute aqueous solutions. Int.J.Biol.Macromol, 2000, v.27, p.89-97.

350. Bruscolini P., Buzano C., Pelizzola A., Pretti M. Lattice model for polymer hydration: collapse of poly(N-isopropylacrylamide. Macromol.Symp., 2002, v.181, p.261-273.

351. Shonbaum J.R., Lenner В., Bender N. The spectrophotometric determination of the operational normality of an a-chymotrypsin solution. J.Biol.Chem., 1961, v.236,p.2930-2938.

352. Neimann C., McCasland G.E. The synthesus of 2', 6'-diiodo-dl-thyronine. -J.Am.Chem.Soc., 1944, v.66, p. 1870.

353. Методы получения химических реактивов и препаратов, М: Химия, 1965,136 с.

354. Plaut Н., Ritter J.J. A new reactions of nitriles. VI. Unsaturated amides. -J.Am.Chem.Soc. 1951, v.73, p.4076-4077.

355. Вейганд К., Хильгетаг Г. Методы эксперимента в органической химии (пер. с. нем.). М.: Химия, 1968, с.387.

356. Кочетов Г.А. Практическое руководство по этимологии. М.: Высшая школа, 1980, с.224.

357. Knowles I.R., Preston I.M. A convenient titrant for a-chymotrypsin and trypsin. ~Biochim.Biophys.Acta, 1968, v.151, p.290-295.

358. Bender M.L., Kezdy F.J. Chymotrypsin: enzyme concentration and kinetics. -J.Chem.Educ., 1967, v.44, p.84-88.

359. Blakely R.L., Webb E.C., Zemer B. Jack bean urease (EC 3.5.3.1). A new method for purification and reliable rate assay. Biochemistry, 1969, v.8, p.1984-1990.

360. Jorota I. Purification of alkaline phosphatase from cultured rat liver cells. -J.Biochem., 1978, v.83, p.1293-1298.

361. Holmquist В., Bunning P., Roirdan J.S. A continuous spectrophotometric assay for angiotensin converting enzyme. Anal.Biochem., 1979, v.95, p.540-548.

362. Suzuki A., Tanaka T. Phase transition in polymer gels induced by visible light. -Nature, 1990, v.346, p.345-347.

363. Ishikawa M., Misawa H., Kitamura N., Fujisawa R., Masuhara H. Infrared laser-induced photo-thermal phase transition of an aqueous poly(N-isopropylacrylamide) solution in the micrometer dimension. Bull.Chem.Soc.Jpn, 1969, v.69, p.59-66.

364. Hofkens J., Hotta J., Sasaki K., Masuhara H., Iwai K. Molecular assembling by the radiation pressure of a focused laser beam: poly(N-isopropylacrylamide) in aqueous solution. Langmuir, 1997, v. 13, p.414-419.

365. Smith Т., Hotta J., Sasaki K., Masuhara H., Itoh Y. Photon pressure-induced assocoation of nanomer-sized polymer chains in solutions. J.Phys.Chem., Part B, 1999, v.103, p.1660-1663.

366. Shimoboji Т., Larenas E., Fowler Т., Kulkrni S., Hoffman A.S., Stayton P.S. Photoresponsive polymer-enzyme switches. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2002, v.99, № 26, p. 16592-16596.

367. Tarasevich M.R., Bogdanovskaya V.A. Principles of electrochemical biosensor development. Adv.Biosensors, 1995, v.3,p.5-29.