Бифункциональные полимерные реагенты на основе иммобилизованных В-эстераз и их реактиваторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

УДК 678.7-13

Осинкин Юрий Александрович

БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ РЕАГЕНТЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В-ЭСТЕРАЗ И ИХ РЕАКТИВАТОРОВ

02. 00.06 - химия высокомолекулярных соединений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1992

Табота выполнена в лаборатории химических превращений полимеров кафедры высокомолекулярных соединений Химического факультета МГУ иы. М.В.Ломоносова.

Научные руководители: к.х.н. А.К.Андрианов,

к.х.н. В.В.Чупов Научный консультант : академик Н.А.Плата Официальные оппоненты:

д.х.н. А.В.Левашов д.х.н. Л.Л.Стоцкая Ведущая организация: Военная краснознаменная ордена

Октябрьской Революции Академия химической защиты им. С.К.Тимошенко

Защита диссертации состоится *23. " 1992 г. в

15 часов на заседании специализированного Совета Д.053.05.43 при МГУ им. И.В.Ломоносова по адресу:

II9899 ГСП, Москва, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус А, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова. . Автореферат разослан "27" 1992 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА' РАБОТЫ

.Актуальность проблемы.

Создание синтетических полимерных аффинных адсорбентов, се-[ективно воздействующих на определенный круг соединений многоком-юнентных биологических смесей, представляет одну из актуальных 1адач современной химии медико-биологических полимеров. Болыпинст-ю подходов к синтезу аффинных сорбентов связаны с иммобилизацией шоспецифического лиганда на полимерном носителе имеющем соответс-:вующие физико-химические характеристики. Однако, использование нетода аффинной хроматографии обеспечивает, как правило, только )дну операцию: специфическое взаимодействие удаляемого вещества с мобилизованным физиологически активным веществом (ФАВ). Расшире-зие функциональных свойств сорбентов для осуществления на полимер-юм носителе последовательно нескольких реакций является принци-зиальным вопросом при создании сорСционно-детоксикационных систем. Решение этой задачи видится в совместной иммобилизации нескольких 5АВ, осуществляющих заданный ряд последовательных преобразований исходного субстрата в конечный продукт. Наряду с очевидными (в фактическом плане) преимуществами таких систем как материалов для гемосорбции, обеспечивающих удаление токсичных веществ и метаболи-гов, достаточно интересно их исследование с теоретической точки зрения, поскольку в данном случае поведение иммобилизованных многокомпонентных систем ФАВ может существенно отличаться от их поведения в растворе в нативных формах.

В качестве модельного токсина в работе использованы „фзсфорор-ганические соединения (ФОС). Их широкое использование как 'основы пестицидов, участившиеся случаи загрязнения окружающей среды и отравления людей диктуют необходимость разработки эффективных методов детоксикации водных растворов ФОС в мягких условиях, применительно к условиям гемосорбции. Механизм гайствия пргяноДогДатов на млекопитающих и человека заключается в инактивации ферментов класса В-эстераз, выпоштотоГ"вай5е~физиологические функции в организме? Реакция протекает практически необратимо и отличается высо-кой~специфичностью. Образующиеся фосфорилированйые ферменты восстанавливают функциональные каталитические свойства только под действием ряда нуклеофильных агентов. Можно полагать, что совмест-

ная иммобилизация В-эстераз и веществ - "реактиваторов" ингибирс ваншх ферментов - мокет привести к созданию полимерных ферменте подобных реагентов, отличающихся высокой эффективностью и, одно1 ременно, достаточно высокой селективностью в реакциях детоксикавд водных растворов фосфэрорганических соединений. В связи с этш, целью данной работы является разработка подходов к синтезу и ИЗJ чение свойств производных -гидрофильных полимеров с иммобилизоваг ними ферментами класса холинэстераз и высоконуклеофильными оксиь содержащими лигандами, являющимися реактиваторами ингиСированны ферментов, в реакциях с фосфорорганическими токсинами.

Научная новизна.

Впервые разработан метод синтеза ковалентно иммобилизованной в полиакриламидной матрице холинэстеразы, заключающийся в ради кальной сополимеризации "макромономера" фермента с акриламидом присутствии сшивающего агента. Показано, что иммобилизация фермен та в сшитом сополимере не влияет на совокупность его свойств : реакциях со специфическим субстратом, фосфорорганическим ингибито ром и реактиваторами.

Впервые синтезирован ряд оксимсодержащих мономеров ] исследовано их влияние на элементарные стадии радикально! полимеризации. Установлен факт ингибирования полимеризацш вследствии взаимодействия нитрозосоединений как таутомерной форм! оксима с радикалами роста и предложены методы пониженш ингибирущего действия.

Выявлена определяющая роль микроокружения функциональных ок-симных групп, иммобилизованных в матрице гидрогеля, на их реакционную способность в реакциях сольволиза сложноэфирных субстратов. Определена совокупность структурно-химических параметров сополимеров, позволяющая регулировать их нуклеофильную активность, и показано, что механизм реакции сольволиза органофосфатов оксимсо-держащими сополимерами включает в себя образование промежуточного комплекса.

Впервые показано, что оксимсодержащие сополимеры обладают активностью в реакциях дефосфорилирования ингибированной холинэстеразы.

Впервые, в результате радикальной сополимеризации макромономеров В-эстераз, оксимсодержащего мономера и акриламида в присутст-

вии бифункционального сшивающего агента получены сильнонабухающие системы с соиммобилизованными оксимными грушами и холинэстеразой, обладающие высокой активностью в реакциях сольволиза фосфорорганических соединений. На основании кинетических данных предложен механизм реактивации ингибированного фермента в бинарной системе и установлено определяющее влияние формирования на стадии синтеза устойчивых промежуточных комплексов активный центр фермента -реактиватор на скорость вышеупомянутой реакции.

Проверена возможность использования оксимсодержалю сополимеров в качестве основы покрытий датчиков пьезоэлектрического типа.

Практическая значимость работы состоит в том, что результаты выполненного исследования позволяют существенно повысить эффективность полимерных реагентов, воздействующих на определенный компонент биологической смеси путем подбора соответствующей системы фермент - реактиватор. Синтезированные в данной работе сшитые сополимеры на основе холинэстеразы и оксимсодержащего ли-ганда могут представлять также интерес и как потенциальные гемо-сорбенты для удаления фосфорорганических соединений, а также как покрытия сенсоров для их обнаружения.

Автор защищает:

- обнаруженное явление дефосфорилирования (реактивации) иммобилизованной холинэстеразы низкомолекулярными и соиммобилизован-ными с ней оксимсодержащими соединениями.

- вывод о механизме реакций сольволиза органофосфатов под действием оксимсодержащих и бинарных (фермент - реактиватор) сополимеров, заключающийся в образовании сложных промежуточных комплексов с фосфорорганическиы квазисубстратом и оксшом.

- рбзультаты сравнительного анализа реакционной способности нативной, иммобилизованной в полиакриламидный гель и соиммобилизо-ванной с оксимсодержащим реактиватором холинэстеразы в реакции сольволиза фосфорорганических соединений.

- результаты испытаний оксимсодержащих сополимеров в качестве основы покрытий датчиков пьезоэлектрического типа для обнаружения паров фосфорорганических соединений в воздухе.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на vin Всесоюзном научном симпозиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Киев 1989), на гх Всесоюзном научном симпо-

зиуме "Синтетические полимеры медицинского назначения" (Звените род, 1991), на международной школе-семинаре "Нетрадиционные метод синтеза полимеров" (Алма-Ата, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей 5 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения обзора литературы, экспериментальной части,- результате исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списк литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста иллюстрирована 39 рисунками и 13 таблицами. Список -цитируемо литературы включает 121 наименование.

Обзор литературы состоит из двух глав. В первой главе проана лизированы известные литературные данные по гидролизу эфиров фос форорганических кислот под действием ферментов и синтетических по лимеров. Особое внимание уделено процессам фосфорилирования и де фосфорилирования холинэстераз нуклеофильными реагентами. Втора глава посвящена многокомпонентным системам физиологически активны веществ, иммобилизованным совместно или раздельно на полимерну матрицу.

В экспериментальной части приведена характеристика объекто исследования, описаны метода синтеза оксимсодержащих мономеров "макромономеров" холинэстераз и их полимерных производных, предст лены методики физико-химических исследований, охарактеризованы ве щества и реагенты, использованные в работе.

В последующих главах изложены и обсуждены экспериментальны результаты.

I. КОВАЛЕНТНАЯ ИММОБИЛИЗАЦИЯ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

Для ковалентной иммобилизации холинэстераз (ХЭ) и ацетилхо линэстераз (АХЭ) в матрицах водонабуханщих полимеров использова; подход, заключающийся в активации фермента путем введения в еп молекулы ненасыщенных С=С связей и последующей сополимеризации не насыщенного производного фермента с гидрофильным неионогенным мономером и бифункциональным сомономером-сшивателем. "Макромономеры" АХЭ получали посредством ацилирования белковой молекулы ! растворах хлорангидридом акриловой кислоты в мягких условиях (р] 8.0, Т=0-4°С). Условия реакции ацилирования и характеристики син-

ззированных'макромономеров приведены в табл. I. Данные, представ-знные в таблице, свидетельствуют о том, что модифицированный фер-внт сохраняет совокушость субстратспецифичных свойств.

Таблица I.

словия ацилирования водных растворов некоторых холинэстераз крилоилхлоридом и их влияние на ферментативную активность.

Фермент мольное соотношение среднее . число вве- Ферментативная активность по а-нафтилацетату

[фермент]: [ХАЮ денных С=С-связей на моль белка начальная, ед/мг ± 0.03 ' остаточная, % от исходи. - А%

Сывороточная Оутирилхолин-эстераза человека (ХЭ) 1:20 1:40 0 II 20 0.70 0.70 0.70 100 100 100

1:100 28 0.69 99

1:400 28 0.62 89

Эритроцитар-ная ацетилхо-линэстераза лошади (АХЭ I) 1:50 0 18 2.43* 2.41* 100 99

* активность по ацетилтиохолину

Иммобилизация ацилированной АХЭ (АсАХЭ) в матрицу гидрогеля эсуществлена радикальной сополимеризацией модифицированного фермента с акриламидом (АА) и и^'-метиленбисакриламидом (БИС) в вод-¡юй среде при комнатной температуре под действием окислительно-восстановительной инициирующей системы персульфат аммония -NiN,h',n'—тетраметилэтилендиамин. Ферментативная активность гелей с иммобилизованными АХЗ, определенная по специфическому субстрату - ацетилтиохолину (АТХ), уменьшается с ростом количества иммобилизованного фермента в геле (рис.1, кривая 2). Причиной такого понижения активности, являются, по-видимому, стерические препятствия для реакции субстрата с белком, возникающие в результате белок-белковых взаимодействий при увеличении концентрации белка в гидрогеле. Аналогичное снижение активности фермента с ростом концентрации характерно и для его водных растворов (рис.1, кривая I). При

невысоких концентрациях фермента в сшитом сополимере (менее I мг/мл) эффективность иммобилизации, определяемая по остаточной активности, приближается к 100%.

Изучение взаимодействия АХЭ-содержащих гидрогелей с молекулами некоторых ФОС - о,о'-даэтил-о-п-нитрофенилфэсфатом - "параоксо-ном" (ПО) и о,о'-диметил-о-2,2'-дихлорвинилфосфатом - "дихлофосом" (ДДВФ) показало, что иммобилизованный фермент инактивируется этими субстратами также как и нативный, при этом максимальное количество органофосфатов, связываемых гелями, содержащими I мг бежа в I мл (емкость гелей по органофосфагу), составляет 5 мкг/мл для ПО и 10 мкг/мл для ДДВФ. Для раствора нативного фермента той же концентрации соответствующие величины равны 4,5 и II мкг/мл.

Рис.I.Зависимость остаточной ферментативной активности натив-ной эритроцитарной АХЭ электрического угря (I) и гидрогеля с иммобилизованной АХЭ (2) от концентрации фермента. Состав гидрогелей: [АА+асАХЭ]= 95.03 масс.%, [БИС]=4,97масс. %. рН=8.0.

С целью проверки возможности реактивации инактивированной иммобилизованной АХЭ было проведено изучение взаимодействия АХЭ- гелей с 1,3-пропилен-(5иг-4-альдоксимпиридиний) дибромидом (ТМБ- 4). Введение в реакционную систему оксима вызывает возрастание остаточной активности фосфорилированного иммобилизованноного фермента. Так, при концентрации ТМБ-4 равной 5-10 моль/л активность восстанавливается в течении 0,5 часа на 40%. Следовательно, реактивация иммобилизованной АХЭ, инактивированной токсичными ФОС, действительно может быть осуществлена при использовании низкомоле-

100

0. 2 4 6 8

САХЭ' МГ/'МЛ геля

:улярных оксимсодержащих соединений в растворах.

2. синтез и свойства оксшсодершшшх гидрогелей.

Синтез оксимсодержащих сополимеров осуществляли сополимериза-даей специально синтезированных оксимсодержащих мономеров с акрил-змидом (АА) (линейные сополимеры) или с АА и сшивающим агентом зИС (гидрогели). В некоторых случаях оксимсодержащие гидрогели :интезировали методом полимераналогичных превращений.

При проведении радикальной сополимеризации оксимсодержащих юномеров с АА был обнаружен факт ингибирования полимеризации. 1зучение влияния оксимной группы на элементарные стадии радикаль-юй полимеризации акриламида в присутствии 4-альдоксим-н-(4'- (3-¡крилоиламияопропил)-4',4'- -диметиламмонийбутил)пиридиний дибро-шда (ААПБ): сн=сн

I 2

с=о

N4 СН, 2Вг ИОН

I +| 3 II

с снз >3-Я-(сн ) -ио) -сн

СН3

ТМБ-4: ном=сн сн=шн

2Вг~

юд действием окислительно-восстановительной инициирующей систеш герсульфат аммония - пиросульфит калия при 20°С. показало, что при введении оксимсодержащих соединений в реакционную смесь наблюдается существенное понижение скорости полимеризации акриламида, неизменность скорости инициирования в исследованных системах позволяет сделать вывод о том, что наблюдаемый эффект связан с участием ок-;имных групп в реакции гибели макрорадикалов.

Механизм ингиОирувдего действия заключается, по-видимому, во взаимодействии таутомерной формы оксимов - нитрозосоединений с ра-цссалами роста. Кинетический анализ такой схемы приводит к выражениям, аналогичным когда в системе присутствует малоэффективный

7

ингибитор в больших количествах. В рамках этого подхода изучено влияние рН водного раствора на скорость полимеризации акриламида в присутствии оксимов (рис. 2). Минимальный ингибирующий эффект, реализующийся в кислых средах связан с образованием солей оксимов, приводящему к уменьшению концентрации их свободной формы, и, следовательно, к уменьшению концентрации нитрозосоединений в растворе.

V10 •

моль/л-с

3 -

моль/л-с

амид

I -

4 8 рН

Рис.2. Зависимость скорости полимеризации в системе акрил- ТМБ-4 (I), акриламид - ААЛБ (2) и скорости инициирования в

,оР

этих системах (3) от рН при 20 С.

Константы сополимеризации, определенные в условиях, практически исключающих ингибирующий эффект, представлены в табл.2. Как видно, линейные сополимеры, полученные в условиях глубоких конверсии, обладают относительно высокой композиционной неоднородностью, что (вследствие чувствительности оксимных груш к своему микроокружению) приводит к снижению их каталитической активности, определенной по скорости гидролиза п-нитрофенилацетата (НФА) в бикарбонатом буферном растворе при рН = 8,0.

Реакционная способность оксимных групп сшитых сополимеров зависит от структурно-химических параметров гидрогелей. На примере сшитых сополимеров АА, 4-винилпиридина (ВП), ы-фенацилоксим4-ви-нилпиридиний бромида установлено, что увеличение полярности микроокружения функциональных групп при введении положительных зарядов

Таблица 2.

Константы сополимеризации ненасыщенных производных карбонилпириди-нийбромидоксимов и акриламида и дисперсия композиционной неоднородности сополимеров, полученных при конверсии 80%.

Мономер I Моно-мер-2 Г1 Г2 Содержание мономера-1 в смеси, мол.% Дисперсия композиционной неоднородности, о о х 10^

ААПБ АА 0.0 х.б^о.г I 10 I 14

2-метил-5-винил-м-фенацилоксимпири-диний дибромид АА 0.0 5,5-0,2 I 10 3 58

уо-ю , моль/л-с

• 10

12

срН0-Ю

15

, моль/л

моль/л•с

2 А-

I -

СИГ10

Рис. 3. Зависимости-скоростей реакции сшитого сополимера 4-винилпиридина, н-фенацилоксим-4-винилпиридиний бромида и акриламида с НФА от концентрации м-фенацилоксимных групп (РНО) (I) и от концентрации ы-фенацильных групп (РН) при концентрации оксимных групп 8-Ю-4 моль/л (2). (3) - степень набухания гидрогеля.

в полимерную матрицу, приводит к резкому снижению скорости реакции сольволиза НФА (рис. 3). Аналогичный эффект наблюдается и при увеличении концентрации звеньев ВП или БИС в составе сополимера (при

постоянном содержании оксимных групп), что связано как с концент рированием положительно заряженного лиганда, так и с эксперимен тально обнаруженным уменьшением неспецифического связывания субст рата гидрогелем.

С учетом сорбционной природы взаимодействий предложен следую пдай механизм сольволиза ПО оксимсодержащими сополимерами, анало гичный механизму рН-зависимой двухсгадийной ферментативной реакци с одной ионогенной группой:

ЕН + Б <_ ЕНБ

к,т1 к8 Т1 V к

Е + Б ^^ ЕБ -Р

1 + л!

к Е Б к К V = Кат 0 0 к --2— К=К-:

к +Б кат , . н' н'

1 + 1Г 1 + -к"'

а а

где ен и е - соответствующие формы оксима, б - органофосфат, р -фосфорилированный оксим, еб - каталитический комплекс, к_ ,к2 -константа его диссоциации и константа скорости первого порядка егс распада, соответственно, к' ,к - константы диссоциации оксимнш групп, связанных и несвязанных с субстратом.

Кинетическая обработка этой схемы с последующим определение! констант (табл.3) позволяет сделать следующие вывода:

1) реакция протекает преимущественно через образование комплекса енб, поскольку, в данном случае константа диссоциации оксим-ной группы к' , и, следовательно, ее нуклеофильные свойства, выше.

2) уменьшение кажущейся константы Михаэлиса кт при возрастании рН свидетельствует о том, что оксимная группа входит в состаь не только каталитического, но и сорбционного активного центра.

3) эффективность реакции может быть увеличена путем гидрофо-бизации полимерной матрицы, т.к. более низкие значения ке и несколько более высокие значения к2 , наблюдаемые для сшитого сополимера по сравнению с линейным, по-видимому, связаны с гидрофобиза-цией зоны реакции при ее проведении в гетерогенной структуре полимерного геля.

Таблица 3.

Кинетические параметры реакции сольволиза параоксона оксимсодержа-щими сополимерами (рк = 8.4, рк '= 7.8, 20°С).

рн Ох о, моль ' к кат - 1 с к , т моль К , г моль

л ' л л

линейный сополимер 7.5 1.0- •ю-5 1.4- •ю"6 1.9 • •КГ3 4.4-•ю"6 1.8-•10"3

8.0 1.0- ■ ю~5 2.6 • 10" 6 5. 3 • •ю"4

сшитый сополимер 7.5 7.6- •ю-4 1.6-•ю"6 2.8-•10"4 5.0- •ю"6 2.7-•ю"4

8.0 7.6- •ю"4 3.0- •ю"6 7.8- • ю"5

Экспериментально обнаруженный факт дефосфорилирования оксимной группы, т.е. катализа реакции сольволиза ФОС по схеме

0 0 н о 0

II II Н2° II

НОХ + (ИО) Р-Х -» Ох-Р(ОН) -—» НОР(ОИ) + НОх

2 - нх

где нох - оксимная группа, значительно повышает общую эффективность полимерных реагентов при детоксикации водных растворов фосфорорганических соединений и расширяет возможные области их использования.

Помимо реакции взаимодействия оксимсодержащих гидрогелей с органофосфатами, изучено их поведение в реакциях дефосфорилирования АХЭ. Установлено, что эффективность реакции в данном случае несколько ниже, чем при использовании низкомолекулярного аналога -ТМБ-4: скорости реактивации при концентрации оксимных-групп 1-Ю-3 моль/л равны О,7-Ю-11 и 1,6-ГО"11 моль/л-с, соответственно. Вероятно, это связано с диффузионными затруднениями, возникающими при реакции субъединичного фермента с "макромолекулярным" оксимом, т.е. доступностью активных центров фермента только для функцио-

нальных груш, расположенных вблизи поверхности гранул гидрогеля. Тем не менее, полученные результаты позволяют рассматривать полимерные нуклеофильные агенты как потенциальные реактиваторы В-эсгераз.

3. синтез и свойства бинарных полимерных систем ацетилхолинэctepa3a - реактиватор.

Метод синтеза бинарной полимерной системы заключается в сопо-лимеризации ацилированной АХЭ с ААПБ, акриламидом и сшивающим агентом в условиях окислительно - восстановительного инициирования. Реакция возможна лишь в узком интервале значений рН (4.5-5.0), определяющимся , с одной стороны, отсутствием ингибирования полимеризации оксимными группами (рис.2), и, сохранением каталитической активности фермента в процессе радикальной полимеризации.

Сравнительными экспериментами по титрованию активных центров фермента параоксоном показано, что в соиммбилизованной системе оксимные группы не влияют на ферментативную активность АХЭ, .определяемую по специфическому субстрату - АТХ. Следовательно, совместная иммобилизация фермента с соединениями - реактиваторами сохраняет его функциональные свойства в реакциях с субстратами и фосфорорганическиыи ингибиторами.

Таблица 4.

Скорости реактивации АХЭ-1 при рН=8,0 и 20°С для гидрогелей с различными иммобилизованными компонентами. СщС = 2 мольн.%, САХЭ = 100 мг/л, Соксш =1-Ю_3м/л.

Иммобилизованный компонент Компонент в растворе Скорость реактивации, •1011моль/л-с

АХЭ ААПБ АХЭ + ААПБ АХЭ, ТМЕ-4 ТМБ-4 АХЭ 2,2 - 0,1 21,0 - 3,5 1,6 - 0,9 96,8 - 7,5

С целью выявления закономерностей процесса реактивации АХЭ в гетерогенной системе бинарный" гидрогель - раствор был проведен сравнительный анализ скоростей дефосфорилирования АХЭ в различных

системах (табл.4.). Повышение скорости реактивации низкомолекулярным ТМБ-4 при иммобилизации АХЭ связано, по-видимому, с более высокой стабильностью иммобилизованного фермента по сравнению с нативным, т.е. с замедлением процессов необратимой инактивации. С другой стороны, диффузионные затруднения, возникающие при реакции нативного фермента со сшитым полимерным оксимом являются причиной низкой скорости реакции в системе АХЭ - иммобилизованный реактива-тор. Максимальная эффективность реакции наблюдается в случае соиммобилизовэнной системы.

Исходя из экспериментальных результатов, предполагающих независимость скорости реактивации от концентрации фосфорорганического ингибитора, а также на основании первого порядка реакции по концентрации фермента предложена следующая схема процесса, описывающаяся кинетикой Михаэлиса-Ментен:

Е + 4Р —^ ЕР д

к1 ™ „ к2 ,

ЕР4+4Б ЕР £4

к-1

где Е - АХЭ (аллостерический фермент: 4 активных центра на I молекулу), р - органофосфат, Б - пиридинийальдоксим, ЕР £4- каталитический комплекс.

Зависимость скорости дефосфорилирования АХЭ от концентрации субстрата (оксима) носит параболический характер, причем эта тенденция наблюдается как для линейных сополимеров, так и для гидрогелей. Обработка экспериментальных результатов позволяет определить кинетические константы V и к , полностью описывающие пове-

МАХ М

дение системы в реакции дефосфорилирования ингибированной АХЭ (табл.5).

Наблюдаемое снижение к при переходе от нативных к иммобили-

м

зованным формам в предположении заведомых дифузионных затруднений для молекул субстрата (оксима), может быть обусловлено формированием на стадии синтеза устойчивых комплексов нековале'нтной природа между активными центрами фермента и оксимсодержащими группами за счет электростатических, гидрофобных и/или других взаимодействий. 1иксация их полимерной матрицей существенно не влияет на функцио-яальные свойства АХЭ в реакциях с ацетилтиохолином и параоксоном, зри этом значительно увеличивая эффективность процесса реактива-

ции, что доказывается возрастанием параметров v для соиммобили-

МАХ

зованных компонентов. Кроме того, дополнительным фактором, влияющим на скорость дефосфорилирования ингибированного фермента, является стабилизация его конформационного состояния при ковалентной иммобилизации на полимерной матрице, замедляющая процессы необратимой инактивации (что следует из сравнения результатов, представленных для нативных форм и системы иммобилизованная в геле АХЭ - ТМБ-4). Более высокие значения v и пониженные значения к ,

МАХ М

наблюдаемые для сшитого сополимера по сравнению с линейным, могут быть связаны с гидрофобизацией зоны реакции при переходе к структуре полимерного гидрогеля, приводящей к увеличению субстратсвязы-ваюцей способности и скорости внутрикомплексной реакции.

Таблица 5.

Кинетические параметры реакции дефосфорилирования ацетилхолинэсте-раз пиридинийальдоксимамн.

Фермент; концентрация, мкмоль/л v мкмоль МАХ* Л С „ моль4 л4 Нативные формы АХЭ—ТМБ Фермент.иммобилизованный в гидрогеле — ТМБ Соиимобилизованные АХЭ и ААПБ

линейный сополимер гидрогель

АХЭ I O.I3 V МАХ 2.1-Ю-5 1.3-ГО-2 8.3-Ю-5 8.4-Ю-2

Км 2.3- Ю~10 3.0-Ю-10 5.7- Ю-11 I.0-I0"12

АХЭ 2 * 0.024 у МАХ 4.3-Ю-5 1.7-Ю-4

Км 4.1- Ю-17 8.5-Ю-22

* эритроцитарная ацетилхолинэстераза электрического угря

Таким образом, процесс реактивации. ингибированной ацетилхо-линэстеразы, включающий стадию образования промежуточного комплекса, может быть значительно ускорен при иммобилизации компонентов бимолекулярной реакции на полимерных носителях. Возрастание реакционной способности бинарных систем, обнаруженное ранее для соим-мобилизованных пар гепарин - трипсин и пероксидаза - сывороточный

альбумин, носит вполне закономерный характер и связано со стабилизацией гидрогелевой матрицей переходного состояния фермент -субстрат или фермент- реактиватор, образование. которого является необходимым условием осуществления соответствующей реакции.

Предложенный в работе подход к созданию высокоэффективных аффинных сорбентов .на токсичные органофосфаты может быть проиллюстрирован следующей схемой:

токсичное ФОС нетоксичный продукт

На первой стадии фермент селективно реагирует с находящимися з растворе фосфорорганическими соединениями, в результате чего голинэстераза теряет каталитическую активность. Вторая стадия гроцесса заключается во взаимодействии соиммобилизованных оксимных тэупп с ингибированным активным центром: продуктами реакции являйся фосфорилированный оксим и активная холинэстераза. В результате гидролиза фосфорилированных оксимных групп система возвращается 5 исходное состояние, а в раствор из объема полимерного гидрогеля одмываются нетоксичные продукты, имеющие низкое сродство к голи-герной гидрогелевой матрице.

Разработанный подход к синтезу высокоэффективных аффинных сор-¡ентов, заключающийся в совместной иммобилизации специфического шганда (фермента), обеспечивающего реакции чувствительность, и функциональных нуклеофильных групп, востанавливающих исходное сос-'ояние системы, может быть успешно использован для получения >еагентов практически на любой тип определяемого и извлекаемого ;ещества путем подбора соответствующей системы фермент (специфи-

ческий лиганд) - реактиватор. Дополнительные преимущества, достигаемые при использовании таких полимерных систем дают основания для их применения и дальнейшего изучения.

4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОКСИМСОДЕРЯАЩИХ СОПОЛИМЕРОВ В СЕНСОРНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРОВ ФОС В ВОЗДУХЕ.

Оценка возможностей практического использования оксимсодержа-щих сополимеров в качестве основы чувствительных покрытий датчиков пьезоэлектрического типа была проведена на примере пленкообразующих линейных сополимеров АА-ААПБ.

Таблица 6.

Состав сополимеров и чувствительность покрытий на их основе к парам ДДВФ в концентрации 5-Ю-4 мг/л.

n Состав сополимера, иол.% Регистрируемый

ААПБ АА сигнал, Гц

I 0,3 99,7 360

2 1,6 98,4 600

3 4,6 95,4 1350

РеакционноспосоОные химические интерфейсы получали на основе 2% растворов оксимсодержащих сополимеров в 0,1М бикарбонатном буфере. В таблице 6 приведены составы исследованных полимеров и чувствительность покрытий на их основе к парам ДДВФ.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что исследованные реагенты обладают значительной "емкостью" по ДДВФ, позволяющей использовать их для определения органофосфатов в нескольких циклах (значимый регистрируемый сигнал 10 - 20 Гц). Кроме того, высокая стабильность и устойчивость к воздействиям окружающей среды дают основания рассматривать покрытия на основе оксимсодержащих сополимеров как перспективные материалы при разработке дозиметров ФОС.

ВЫВОДЫ

I. Синтезированы акрилоильные производные холинэстераз, способные вступать в реакцию радикальной полимеризации с акриламидом.

Показано, что модификация фермента не влияет на совокупность его субстратспецифичных свойств.

„,2. Методами, не приводящими к потере ферментативной активности, получены полимерные производные В-эстераз и показано, что в полимерном виде' сохраняются закономерности реакций с фосфорорганическими ингибиторами и реактиваторами.

3. Разработаны подходы к созданию высоконуклеофильных оксимсодержащих линейных и сшитых сополимеров. Изучено влияние структурных и физико-химических характеристик полимеров на их реакционную способность в реакциях сольволиза сложных эфнров. На основании сорбционной природы взаимодействия показано, что механизм сольволиза эфиров фэсфорорганических кислот оксимсодержащими сополимерами включает стадию образования промежуточного комплекса.

4. Исследовано взаимодействие фосформированных В-эстераз с рядом оксимсодержащих сополимеров и показано, что последние обладают активностью в реакциях реактивации.

5. Разработаны экспериментальные подходы к синтезу полимерных бинарных систем холинэстераза - оксимсодержащий реактиватор. Показано, что полученные полимеры способны катализировать гидролиз фосфорорганических соединений до нетоксичных продуктов, исследован механизм гидролиза. На основании кинетических параметров реакции дефосфорилирования ацетилхолинзстеразы установлено, что определяющую роль в возрастании эффективности действия таких систем играет формирование единого каталитического центра на стадии сополимеризации.

6. Проведены испытания ряда реакционноспособных сополимеров в качестве чувствительных покрытий датчиков пьезоэлектрического типа и показано, что химические интерфейсы на их основе обладают достаточной чувствительностью при определении паров органофосфатов в воздухе.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

I. А.К.Андрианов, Ю.А.Осинкин, Н.А.Платэ. Биоспецифичные полимерные сорбенты с иммобилизованной .холинэстеразой. // VIII Всесоюзный научный симпозиум "Синтетические полимеры медицинского назначения": Тез. докл.- Киев.- 1989,- с.28

2. А.К.Андрианов, Ю.А.Осинкин, H.А.Плата. О механизме ингиби-рования радикальной полимеризации акриламида карбонилпиридинийбро-мидоксимами. // Деп. в ВИНИТИ, N 5094-В90 от 19.09.90 г.- 7с.

3. Yu.A.Osinkin, I.A.Buravchenko, N.M.Nepomnyashchaya. Polymeric reagents - Catalysts of Nucleophilic Reactions in organi Chemistry. International school-seminar "Non-traditional methods с polymer synthesis". // Programme and Abstract.- .26 March - € April.- Alma-Ata, USSR.- 1990.- p.84

4. А.К.Андрианов, Ю.А.Осинкин, H.M.Непомнящая, В.Б.Чупов, H.А.Плата. Кинетические особенности радикальной сополимеризации ненасыщенных производных карбонилпиридинийбромидоксимов и акрил-амида. // Высокомол. соед.- 1991.- т.32 Б.- и 4.- с.266-270.

5. А.К.Андрианов, Ю-.А.Осинкин, В.Е.Игонин, Н.А.Плата. Особенности кинетического поведения оксимсодержащих полимерных гидрогелей в реакции сольволиза О.О'-диэтил-О-п-нигрофенилфэсфата. // Высокомол. соед.- 1991.- т.33 А.- N 5.- C.I093-I099.

6. А.К.Андрианов, Ю.А.Осинкин, В.Б.Чупов, Н.А.Плата. Реакционная способность оксимсодержащих полимерных гидрогелей. // Высокомол. соед.- 1991.- т.32 В.- N 4.- с.270-274. I

7. A.K.Andrianov, Yu.A.Osinkin, V.V.Chupov, N.A.Plate. Polymeric hydrogen system for the determination of reactive organic compounds. // Polym.Networks: Synthethis, structure and Properties: Programme and Abstract - Moscow [and] Suzdal, USSR.- 21-26 Apr.- 1991.- p.40

8. А.К.Андрианов, Ю.А.Осинкин, В.Е.Игошш, H.A.Плата. Синтетические детоксиканты на основе гидрофильных оксимсодержащих сополимеров и их коньюгатов с ацетилхолинэстеразой. // ix Всесоюзный научный симпозиум "Синтетические, полимеры медицинского назначения": Тез. докл.- Звенигород.- 1991.- с.135

9. Yu.A.Osinkin, A.K.Andrianov. Synthetic oximecontaining copolymers as a models of A-esterases. // International school-seminar "Modern problems of physical chemistry of macromolecules": Programme and Abstract.- Pushchino, USSR.-24-29 June.- 1991.-p. 142

10. Ю.А.Осинкин, В.Б.Чупов, H.А.Плата. О реактивации ацетил-холинэстеразы пиридинийальдоксюгами при их совместной ковалентной иммобилизации в полимерных гидрогелях. // Докл.АН СССР.- 1992.18